JPWO2008004610A1

JPWO2008004610A1 - ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療方法

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Publication number: JPWO2008004610A1
Application number: JP2008523723A
Authority: JP
Inventors: 良一松田; 政孝塩塚; ジュニア，アレグザンダーマケレル
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2006-07-05
Filing date: 2007-07-05
Publication date: 2009-12-03
Also published as: US20100093867A1; EP2047848A1; EP2047848A4; WO2008004610A1

Abstract

本発明の目的は、ナンセンス変異型遺伝性疾患の処置方法として使用するためのリードスルー活性を有する化合物を提供すること、当該化合物を含む医薬組成物を提供すること、および当該化合物を投与することを含むナンセンス変異型遺伝性疾患の処置方法を提供することである。本発明により、変異により未熟終止コドンが生じた遺伝子から野生型正常タンパク質を哺乳類における生体内で生産させる方法であって、下記式（ＶＩ）：［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＸ１は、明細書中に定義したとおりである］の化合物等を、前記哺乳類に投与することを含む前記方法が提供される。

Description

本発明は、ナンセンス変異型遺伝性疾患（例えば、筋ジストロフィー、デュシャンヌ型筋ジストロフィー、多発性硬化症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テイ−サックス病、神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、関節炎、血友病、フォンヴィレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、腎結石、骨形成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾患、家族性コレステロール血症、小脳運動失調、結節性硬化症、家族性赤血球増加症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン−ピック病、マルファン症候群、および癌等）の治療方法、および当該方法において使用される医薬組成物に関する。

ナンセンス変異型遺伝性疾患は、遺伝子上の点変異により生じる未熟終止コドンのためにタンパク質の発現が阻害されることに起因する疾患である。例えば、デュシャンヌ型筋ジストロフィーは、筋繊維鞘におけるジストロフィンタンパク質の欠如に起因する疾患である。当該疾患においては、Ｘ染色体中に存在する筋ジストロフィー遺伝子上に生じた変異により終止コドンが形成され（未熟終止コドン）、翻訳がその変異部位で中断・終了してしまうことにより正常なジストロフィンおよびジストロフィン関連タンパク質の発現が阻害され、結果としてジストロフィンタンパク質が欠如することとなる。

ナンセンス遺伝子疾患の治療方法としては、外部からの遺伝子導入による（いわゆる遺伝子治療）が考えられるが、ウイルスベクターの安全性やそれに代わるベクターの遺伝子導入効率の低さが問題となっており、現在のところ現実的手段とはいえない。

一方、ナンセンス変異により未熟終止コドンが生じ特定のタンパク質が欠如している患者に特定の化合物を投与した際に、当該化合物がリボソームに作用し、リボソームが終止コドンを読み越え翻訳を行い（以下、リードスルーとも称する）、その結果野生型正常タンパク質が合成されるという現象が確認されている。このようなリードスルー活性を有する化合物としては、例えばアミノグリコシド系抗生物質であるゲンタマイシンが知られている。Ｐｏｌｉｔａｎｏらは、デュシャンヌ型筋ジストロフィー患者へのゲンタマイシンの投与によりジストロフィンタンパク質の蓄積を確認している（非特許文献１）。また、嚢胞性線維症患者の気道上皮にゲンタマイシンを局所投与することにより、典型的な電気生理学的異常を正常化できることが報告されている（非特許文献２）。さらに、ゲンタマイシンの投与については、遺伝性疾患の療法として米国での臨床試験が行われている。また、ジペプチド系抗生物質であるネガマイシンのリードスルー活性についても報告されており、当該化合物を筋ジストロフィーモデルマウスに投与することによりジストロフィンの発現が回復することを確認している（特許文献１）。

国際公開ＷＯ２００２／１０２３６１パンフレット。Ａｃｔａ．Ｍｙｏｌ．第２２巻、第１５〜２１頁、２００３年。Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．第３４９巻、第１４３３〜１４４１頁、２００３年。

本発明の目的は、ナンセンス変異型遺伝性疾患の処置方法として使用するためのリードスルー活性を有する化合物を提供すること、当該化合物を含む医薬組成物を提供すること、および当該化合物を投与することを含むナンセンス変異型遺伝性疾患の処置方法を提供することである。

本発明者は、上記課題を達成するために鋭意研究を進めたところ、リードスルー活性を有する化合物を見いだし、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、変異により未熟終止コドンが生じた遺伝子から野生型正常タンパク質を生産させる方法であって、以下の式（Ｉ）〜（Ｖ）：

［式中、Ｒ^１はＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^３は、独立して、水素原子および置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルから選択され；Ｒ^４およびＲ^５は、独立して、水素原子およびＣ_１−１０アルキルから選択され；Ｘ^１は、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよいカルバモイルまたは置換基を有していてもよいヒドラジノカルボニルである］

［式中、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４は、独立して、カルボキシ、置換基を有していてもよいアルコキシカルボニル、置換基を有していてもよいカルバモイルまたは置換基を有していてもよいヒドラジノカルボニルであり；Ｒ^６は、水素原子または置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルであり；Ａは、置換基を有していてもよいアルキレンである］

［Ｘ^５およびＸ^６は、独立して、カルボキシ、置換基を有していてもよいアルコキシカルボニルおよび置換基を有していてもよいカルバモイルから選択され；Ｒ^７は、水素原子または置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^８は、置換基を有していてもよいアミノ、置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルまたは置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルケニルである］

［Ｒ^９、Ｒ^１０およびＲ^１３は、独立して、水素原子、または置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^１１およびＲ^１２は、独立して、水素原子、置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキル、芳香族化合物で置換されているカルボニルであるか、またはＲ^１１とＲ^１２とが一緒になって二重結合を形成し＝ＣＲ^１７Ｒ^１８となることもあり、Ｒ^１７およびＲ^１８は、独立して、水素原子、Ｃ_１−１０アルキル、および置換基を有していてもよいカルバモイルアルキルから選択される］

［Ｘ^７およびＸ^８は、独立して、カルボキシ、置換基を有していてもよいアルコキシカルボニルおよび置換基を有していてもよいカルバモイルから選択され；Ｒ^１４、Ｒ^１５およびＲ^１６は、独立して、水素原子、または置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルである］
のいずれかの式により表される化合物または医薬として許容なその塩の存在下でリボソームによる翻訳が行われる、前記方法に関する。

また本発明は、野生型正常タンパク質の生産が哺乳類の生体内で行われ、前記化合物を前記哺乳類に投与することを含む、野生型正常タンパク質を生産させる前記方法に関する。

さらに本発明は、前記化合物をナンセンス変異型遺伝性疾患の患者に投与することを含む、野生型正常タンパク質を生産させる前記方法に関する。

さらにまた本発明は、筋ジストロフィー、デュシャンヌ型筋ジストロフィー、多発性硬化症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テイ−サックス病、神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、関節炎、血友病、フォンヴィレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、腎結石、骨形成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾患、家族性コレステロール血症、小脳運動失調、結節性硬化症、家族性赤血球増加症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン−ピック病、マルファン症候群、および癌から選択される疾患の患者に投与することを含む、野生型正常タンパク質を生産させる前記方法に関する。

また本発明は、筋ジストロフィー患者に投与することを含む、野生型正常タンパク質を生産させる前記方法に関する。

さらに本発明は、ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療または予防に使用するための医薬組成物であって、前記式（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれかの式により表される化合物または医薬として許容なその塩を有効成分として含む医薬組成物に関する。

さらにまた本発明は、筋ジストロフィー、デュシャンヌ型筋ジストロフィー、多発性硬化症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テイ−サックス病、神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、関節炎、血友病、フォンヴィレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、腎結石、骨形成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾患、家族性コレステロール血症、小脳運動失調、結節性硬化症、家族性赤血球増加症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン−ピック病、マルファン症候群、および癌から選択される疾患の治療または予防に使用するための前記医薬組成物に関する。

また本発明は、筋ジストロフィーの治療または予防に使用するための前記医薬組成物に関する。

さらに本発明は、リードスルー活性を有する化合物のアッセイ方法であって、
ａ）以下のもの：ｉ）プロモーター、ｉｉ）当該プロモーターの下流に位置する第１の翻訳開始コドンおよび第１のレポーター遺伝子、ｉｉｉ）当該第１のレポーター遺伝子の下流に位置する第２の翻訳開始コドンおよび第２のレポーター遺伝子、ｉｖ）当該第１のレポーター遺伝子および第２の翻訳開始コドンの間に位置し、ナンセンス変異型遺伝性疾患の原因遺伝子由来の未熟終止コドンを含む配列、およびｖ）当該第２のレポーター遺伝子の下流に位置する翻訳終止コドン、を含むベクターを導入した宿主細胞または組み替え動物を調製する工程；
ｂ）前記宿主細胞または組み替え動物に、試験化合物を投与する工程；および
ｃ）第１のレポーター遺伝子に対する第２のレポーター遺伝子の発現量の比を、試験化合物の添加時および非添加時において比較する工程
を含む、前記アッセイ方法に関する。

さらにまた本発明は、ナンセンス変異により形成される未熟終止コドンのリードスルー剤であって、前記式（Ｉ）から（Ｖ）のいずれかの式により表される化合物、その水和物、その溶媒和物、またはそれらいずれかの塩からなる、前記リードスルー剤に関する。

また本発明は、変異により未熟終止コドンが生じた遺伝子から野生型正常タンパク質を生産させる方法であって、以下の式（ＶＩ）〜（Ｘ）：

［式中、Ｒ^１はＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^３は、独立して、水素原子、Ｃ_１−１０アルキルおよびＣ_１−１０アルキルカルボニルから選択され；Ｒ^４およびＲ^５は、独立して、水素原子およびＣ_１−１０アルキルから選択され；Ｘ^１は、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルアミノまたはジ（Ｃ_１−１０アルキル）アミノである］

［式中、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４は、独立して、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルアミノおよびジ（Ｃ_１−１０アルキル）アミノから選択され；Ｒ^６は、水素原子またはＣ_１−１０アルキルである］

［Ｘ^５、Ｘ^６およびＸ^７は、独立して、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルアミノおよびジ（Ｃ_１−１０アルキル）アミノから選択され；Ｒ^７は、水素原子またはＣ_１−１０アルキルである］

［Ｘ^８は、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルアミノおよびジ（Ｃ_１−１０アルキル）アミノであり；Ｒ^８およびＲ^９は、独立して、水素原子またはＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^１０およびＲ^１１は、独立して、水素原子、Ｃ_１−１０アルキルおよびＣ_１−１０アルキルカルボニルから選択される］

［Ｘ^９およびＸ^１０は、独立して、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルアミノおよびジ（Ｃ_１−１０アルキル）アミノから選択され；Ｒ^１２、Ｒ^１３およびＲ^１４は、独立して、水素原子、Ｃ_１−１０アルキル、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルおよび−ＣＨ_２ＣＯＸ^１１から選択され；Ｘ^１１は、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルアミノおよびジ（Ｃ_１−１０アルキル）アミノである］
のいずれかの式により表される化合物または医薬として許容なその塩の存在下でリボソームによる翻訳が行われる、前記方法に関する。

さらに本発明は、ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療または予防に使用するための医薬組成物であって、前記（ＶＩ）〜（Ｘ）のいずれかの式により表される化合物または医薬として許容なその塩を有効成分として含む、前記医薬組成物に関する。

本発明により、変異により形成される未熟終止コドンをリードスルーさせる化合物、該化合物からなるリードスルー剤、該化合物を含む医薬組成物を提供できる。また、該化合物、リードスルー剤、または医薬組成物の使用により、そのような未熟終止コドンが生じた遺伝子から野生型正常タンパク質を生産でき、ひいては、未熟終止コドンを生じるナンセンス変異に起因する疾患の治療または予防を実施できる。

化合物１〜５がいずれも、対照である生理食塩水溶液（Ｓａｌｉｎｅ）と比較して、著しいリードスルー活性を示したことを説明する図である。図中、化合物１〜５をそれぞれＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶと表示し、リードスルー活性をＲｅａｄｔｈｒｏｕｇｈＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙと表示する。（実施例１）

本発明の一つの側面によれば、変異により未熟終止コドンが生じた遺伝子から野生型正常タンパク質を生産させる方法であって、以下の式（Ｉ）〜（Ｖ）：

［Ｘ^５およびＸ^６は、独立して、独立して、カルボキシ、置換基を有していてもよいアルコキシカルボニルおよび置換基を有していてもよいカルバモイルから選択され；Ｒ^７は、水素原子または置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^８は、置換基を有していてもよいアミノ、置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルまたは置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルケニルである］

［Ｒ^９、Ｒ^１０およびＲ^１３は、独立して、水素原子、または置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^１１およびＲ^１２は独立して、水素原子、置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキル、芳香族化合物で置換されているカルボニルであるか、またはＲ^１１とＲ^１２とが一緒になって二重結合を形成し＝ＣＲ^１７Ｒ^１８となることもあり、Ｒ^１７およびＲ^１８は、独立して、水素原子、Ｃ_１−１０アルキル、および置換基を有していてもよいカルバモイルアルキルから選択される］

［Ｘ^７およびＸ^８は、独立して、カルボキシ、置換基を有していてもよいアルコキシカルボニルまたは置換基を有していてもよいカルバモイルから選択され；Ｒ^１４、Ｒ^１５およびＲ^１６は、独立して、水素原子、または置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルである］
のいずれかにより表される化合物または医薬として許容なその塩の存在下でリボソームによる翻訳が行われる、前記方法が提供される。

上記一般式（Ｉ）中、Ｒ^１で示されるＣ_１−１０アルキルまたは置換基を有してもよいＣ_１−１０アルキルは、好ましくはＣ_１−８アルキルまたは置換基を有してもよいＣ_１−８アルキル、より好ましくはＣ_１−６アルキルまたは置換基を有してもよいＣ_１−６アルキル、さらに好ましくは置Ｃ_１−４アルキルまたは換基を有してもよいＣ_１−４アルキルであり、その好適な例としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル等の低級アルキルが挙げられ、特にイソプロピル、イソブチルが好ましい。

Ｒ^２、Ｒ^３で示される置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルは、好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−８アルキル、より好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−６アルキル、さらに好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−４アルキルであり、その好適な例としては、メトキシカルボニルメチル、メトキシカルボニルエチル、メトキシカルボニルプロピル、メトキシカルボニルブチル、エトキシカルボニルメチル、エトキシカルボニルエチル、エトキシカルボニルプロピル、エトキシカルボニルブチル等の低級アルコキシカルボニル低級アルキルが挙げられる。

Ｒ^４、Ｒ^５で示されるＣ_１−１０アルキルまたは置換基を有してもよいＣ_１−１０アルキルは、好ましくはＣ_１−８アルキルまたは置換基を有してもよいＣ_１−８アルキル、より好ましくはＣ_１−６アルキルまたは置換基を有してもよいＣ_１−６アルキル、さらに好ましくは置Ｃ_１−４アルキルまたは換基を有してもよいＣ_１−４アルキルであり、その好適な例としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル等の低級アルキルが挙げられ、特にイソプロピル、イソブチルが好ましい。

Ｘ^１で示される置換基を有していてもよいアルコキシカルボニルの好適な例としては、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロピルカルボニル、ブトキシカルボニル等の低級アルキルカルボニルが挙げられ、置換基を有していてもよいカルバモイルおよび置換基を有していてもよいヒドラジノカルボニルの置換基は、一置換でも二置換でも全置換でもよく、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル等の低級アルキル基が挙げられる。

上記一般式（ＩＩ）中、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４で示される置換基を有していてもよいアルコキシカルボニルの好適な例としては、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロピルカルボニル、ブトキシカルボニル等の低級アルキルカルボニルが挙げられ、置換基を有していてもよいカルバモイルおよび置換基を有していてもよいヒドラジノカルボニルの置換基としては、一置換でも二置換でも全置換でもよく、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル等の低級アルキル基が挙げられる。

Ｒ^６で示される置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルは、好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−８アルキル、より好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−６アルキル、さらに好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−４アルキルであり、その好適な例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等の低級アルキルが挙げられる。
Ａで示される置換基を有していてもよいアルキレンの好適な例としては、メチレン、エチレン、プロピレン等の低級アルキレンが挙げられる。

上記一般式（ＩＩＩ）中、Ｘ^５およびＸ^６で示される置換基を有していてもよいアルコキシカルボニルの好適な例としては、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロピルカルボニル、ブトキシカルボニル等が挙げられ、置換基を有していてもよいカルバモイルの置換基としては、一置換でも二置換でもよく、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル等の低級アルキル基が挙げられる。

Ｒ^７で示される置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルは、好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−８アルキル、より好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−６アルキル、さらに好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−４アルキルであり、その好適な例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等の低級アルキルが挙げられる。
Ｒ^８で示される置換基を有していてもよいアミノの置換基の好適な例としては、メチル、エチルプロピル、ブチル等の低級アルキル；ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、ヒドロキシブチル等のヒドロキシ低級アルキル；メトキシメチル、メトキシエチル、メトキシプロピル、メトキシブチル等の低級アルコキシアルキル等の置換基が挙げられる。置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルまたは置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルケニルの置換基は、好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−８アルキルまたはＣ_１−８アルケニル、より好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−６アルキルまたはＣ_１−６アルケニル、さらに好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−４アルキルまたはＣ_１−４アルケニルであり、その好適な例としては、ヒドロキシまたはメトキシ、エトキシ等のアルコキシが挙げられる。

上記一般式（ＩＶ）中、Ｒ^９、Ｒ^１０およびＲ^１３で示される置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルは、好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−８アルキル、より好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−６アルキル、さらに好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−４アルキルであり、その好適な例としては、メチル、エチルプロピル、ブチル等の低級アルキル；ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、ヒドロキシブチル等のヒドロキシ低級アルキル；メトキシメチル、メトキシエチル、メトキシプロピル、メトキシブチル等の低級アルコキシアルキル等が挙げられる。

Ｒ^１１およびＲ^１２で示される置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルは、好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−８アルキル、より好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−６アルキル、さらに好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−４アルキルであり、その好適な例としては、カルボキシメチル、カルボキシエチル、カルボキシプロピル、カルボキシブチル等のカルボキシ低級アルキル、メトキシカルボニルメチル、メトキシカルボニルエチル、メトキシカルボキシプロピル、メトキシカルボニルブチル等の低級アルコキシ低級アルキルが挙げられる。芳香族化合物で置換されているカルボニルの好適な例としては、フェニルカルボニル、ナフチルカルボニルが挙げられる。

Ｒ^１７およびＲ^１８で示されるＣ_１−１０アルキルは、好ましくはＣ_１−８アルキル、より好ましくはＣ_１−６アルキル、さらに好ましくはＣ_１−４アルキルであり、その好適な例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等の低級アルキルが挙げられる。置換基を有していてもよいカルバモイルアルキルの好適な例としては、メチルカルバモイルメチル、エチルカルバモイルメチル、プロピルカルバモイルメチル、ブチルカルバモイルメチル等の低級アルキルカルバモイル低級アルキル、シクロブチルカルバモイルメチル、シクロペンチルカルバモイルメチル、シクロヘキシルカルバモイルメチル等のシクロＣ_３−８アルキルカルバモイルメチルが挙げられる。

上記一般式（Ｖ）中、Ｘ^７およびＸ^８で示される置換基を有していてもよいアルコキシカルボニルの好適な例としては、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロピルカルボニル、ブトキシカルボニル等が挙げられ、置換基を有していてもよいカルバモイルの置換基としては、一置換でも二置換でもよく、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル等の低級アルキル基が挙げられる。

Ｒ^１４、Ｒ^１５およびＲ^１６で示される置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルは、好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−８アルキル、より好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−６アルキル、さらに好ましくは置換基を有していてもよいＣ_１−４アルキルであり、その好適な例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等の低級アルキル、カルボキシメチル、カルボキシエチル、カルボキシプロピル、カルボキシブチル等のカルボキシ低級アルキル；低級アルキルカルボニル低級アルキル；置換基を有していてもよいカルバモイル低級アルキルが挙げられる。

上記方法において用いられる好ましい化合物として、以下の式（ＶＩ）〜（Ｘ）：

［Ｘ^９およびＸ^１０は、独立して、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルアミノおよびジ（Ｃ_１−１０アルキル）アミノから選択され；Ｒ^１２、Ｒ^１３およびＲ^１４は、独立して、水素原子、Ｃ_１−１０アルキル、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルおよび−ＣＨ_２ＣＯＸ^１１から選択され；Ｘ^１１は、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルアミノおよびジ（Ｃ_１−１０アルキル）アミノである］
のいずれかの式により表される化合物を挙げることができる。

上記方法において用いられるより好ましい具体的な化合物として下表のような化合物を挙げることができる。

ここで、野生型正常タンパク質というときには、正常な遺伝子がコードするアミノ酸配列からなるタンパク質、および該アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質であって正常な遺伝子がコードするアミノ酸配列からなるタンパク質と同じ機能を有するタンパク質が含まれる。正常な遺伝子がコードするアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質であって正常な遺伝子がコードするアミノ酸配列からなるタンパク質と同じ機能を有するタンパク質は、該機能を有する限りにおいて完全長のタンパク質でなくともよい。より具体的には、正常な遺伝子がコードするアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質は、正常な遺伝子がコードするアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質を意味し、例えば、正常な遺伝子がコードするアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加といったアミノ酸の変異や修飾されたアミノ酸が存するアミノ酸配列からなるタンパク質を意味する。変異アミノ酸や修飾されたアミノ酸の数は、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜数個である。

本発明の上記側面において、本発明の方法は哺乳類における生体内で行われてもよく、その場合前記化合物は前記哺乳類に投与されてもよい。本発明の１つの態様において、前記哺乳類がナンセンス変異型遺伝性疾患の患者であって、ナンセンス変異型遺伝性疾患の処置方法として行われる。

ここで、ナンセンス変異型遺伝性疾患とは、遺伝子上の点変異、欠損、挿入等により生じる遺伝子の中途の終止コドン（未熟終止コドン）のために正常な機能を持つタンパク質の発現が阻害されることに起因するか、または、未熟終止コドンを含むｍＲＮＡの分解に伴ないタンパク質の発現が阻害されることに起因する疾患である。前記ナンセンス変異型遺伝性疾患は、特には限定されないが、例えば、筋ジストロフィー、デュシャンヌ型筋ジストロフィー、多発性硬化症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テイ−サックス病、神経組織変性およびパーキンソン病等の中枢神経疾患、慢性関節リウマチおよび対宿主性移植片病等の自己免疫疾患、関節炎等の炎症性疾患、血友病、フォンヴィレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、家族性赤血球増加症および腎結石等の血液疾患、骨形成不全および肝硬変等の膠原病、並びに、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾患、家族性コレステロール血症、小脳運動失調、結節性硬化症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン−ピック病、マルファン症候群や癌等が挙げられ、癌、例えばｐ５３遺伝子等のサプレッサー遺伝子のナンセンス変異に関連する癌には、肺癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、腎癌、膵臓癌、肝臓癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、皮膚癌および脳腫瘍等、癌種を問わずいずれも含まれる。具体的なナンセンス変異型遺伝性疾患としては、筋ジストロフィーが挙げられる。

本発明の上記側面において、上記化合物は、その他の化合物と共に使用されてもよく、また上記化合物より選ばれる２以上の化合物の混合物として使用されてもよい。

本発明の別の側面によれば、ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療または予防に使用するための医薬組成物であって、上記式（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれかの式により表される化合物または医薬として許容なその塩を有効成分として含む、前記医薬組成物が提供される。

上記医薬組成物に含まれる好ましい化合物として、上記式（ＶＩ）〜（Ｘ）のいずれかの式により表される化合物または医薬として許容なその塩を挙げることができる。

上記医薬組成物に含まれるより好ましい化合物として、上記表に示した化合物を挙げることができる。

本発明の上記側面において、本発明の医薬組成物は医薬として許容な単体または賦形剤を含んでいてもよく、また当該医薬組成物に使用される上記化合物の量は治療有効量であれば特には限定されない。ここで、前記ナンセンス変異型遺伝性疾患は、特には限定されないが、例えば、筋ジストロフィー、デュシャンヌ型筋ジストロフィー、多発性硬化症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テイ−サックス病、神経組織変性およびパーキンソン病等の中枢神経疾患、慢性関節リウマチおよび対宿主性移植片病等の自己免疫疾患、関節炎等の炎症性疾患、血友病、フォンヴィレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、家族性赤血球増加症および腎結石等の血液疾患、骨形成不全および肝硬変等の膠原病、並びに、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾患、家族性コレステロール血症、小脳運動失調、結節性硬化症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン−ピック病、マルファン症候群や癌等が挙げられ、癌、例えばｐ５３遺伝子等のサプレッサー遺伝子のナンセンス変異に関連する癌には、肺癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、腎癌、膵臓癌、肝臓癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、皮膚癌および脳腫瘍等、癌種を問わずいずれも含まれる。具体的なナンセンス変異型遺伝性疾患としては、筋ジストロフィーが挙げられる。

本発明の上記側面の医薬組成物は、上記化合物の他に、その他の化合物を活性成分として含んでいてもよく、また２以上の上記化合物の混合物を含んでいてもよい。

本明細書における「医薬として許容な塩」とは、医薬品として使用されうる塩であれば特に限定されない。本発明化合物が塩基と形成する塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基との塩；メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン等の有機塩基との塩；リジン、オルニチン等の塩基性アミノ酸との塩およびアンモニウム塩が挙げられる。当該塩は、酸付加塩であってもよく、かかる塩としては、具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の有機酸；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との酸付加塩が挙げられる。

更に、本発明化合物には、水和物、医薬として許容な各種溶媒和物や結晶多形等も含まれる。

本発明の医薬組成物は、種々の剤形、例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができ、非経口剤としては、例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤等の注射剤；経皮投与または貼付剤、軟膏またはローション；口腔内投与のための舌下剤、口腔貼付剤；ならびに経鼻投与のためのエアゾール剤とすることができるが、これらには限定されない。これらの製剤は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。本発明の１つの態様において、筋ジストロフィーの処置のために本発明の医薬組成物を注射剤（例えば、筋肉への直接投与のための筋肉内注射剤）として投与することができる。

当該医薬組成物は、一般に用いられる各種成分を含みうるものであり、例えば、１種以上の薬学的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤、コーティング剤等を含みうる。また本発明の医薬組成物は、持続性または徐放性剤形であってもよい。

当該医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ乃至１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１回乃至数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。

当該医薬組成物は、事前に患者から採取した生体試料に含まれる所望の遺伝子における未熟終止コドンの有無を検査し、未熟終止コドンが検出された生体試料が由来した患者に投与することができる。生体試料は、核酸が含まれる限りにおいていずれでもよく、細胞、血液、髄液、気管支肺胞洗浄液、痰、または他の体液、あるいは生検組織等を例示できる。生体試料から核酸試料を調製して用いることもできる。核酸試料の調製は、自体公知の核酸調製法により実施できる。核酸試料は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。調製した核酸試料は直接検出に使用してもよく、あるいは分析前に所望の領域をＰＣＲまたはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。未熟終止コドンの検出は、サザンブロット、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、または制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）等の、公知の遺伝子変異解析法により実施できる。検出方法は上記例示した方法に限定されず、未熟終止コドンを検出し得る方法である限りにおいて、いずれを使用することもできる。また、生体試料中の所望の遺伝子由来のｍＲＮＡ量の測定を行い、該ｍＲＮＡ量が健常人由来の生体試料中の該遺伝子由来のｍＲＮＡ量と比較して減少していることを検出することにより未熟終止コドンの存在を検出することができる。ｍＲＮＡ量の測定は、公知の分析方法、例えば、ノーザンブロットにより実施できる。

当該医薬組成物の投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与を挙げることができる。あるいは経口経路で投与することができる。さらに、経粘膜投与または経皮投与を実施することができる。

さらに本発明の別の側面によれば、リードスルー活性を有する化合物のアッセイ方法であって、
ａ）以下のもの：ｉ）プロモーター、ｉｉ）当該プロモーターの下流に位置する第１の翻訳開始コドンおよび第１のレポーター遺伝子、ｉｉｉ）当該第１のレポーター遺伝子の下流に位置する第２の翻訳開始コドンおよび第２のレポーター遺伝子、ｉｖ）当該第１のレポーター遺伝子および第２の翻訳開始コドンの間に位置し、ナンセンス変異型遺伝性疾患の原因遺伝子由来の未熟終止コドンを含む配列、およびｖ）当該第２のレポーター遺伝子の下流に位置する翻訳終止コドン、を含むベクターを導入した宿主細胞または組み替え動物を調製する工程；
ｂ）前記宿主細胞または組み替え動物に、試験化合物を投与する工程；および
ｃ）第１のレポーター遺伝子に対する第２のレポーター遺伝子の発現量の比を、試験化合物の添加時および非添加時において比較する工程
を含む、前記アッセイ方法が提供される。ここで、第１のレポーター遺伝子および第２のレポーター遺伝子は、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、ＣＡＴ（ＣｈｒｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌＡｃｅｔｙｌＴｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子等から選択され、好ましくは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子が使用される。本発明の１つの態様において、第１のレポーター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、第２のレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子が使用される。

ここで、リードスルーとは、リボソームが未熟終止コドンを読み越え翻訳をする、または、未熟終止コドンを含むｍＲＮＡの分解を抑制することを意味する。

本発明の上記の側面におけるナンセンス型疾患の原因遺伝子由来の未熟終止コドンを含む配列は、リーディングフレーム中に終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）を含む配列であれば特に限定されず、配列の長さとしては、２０〜１５０ｂｐ程度の配列が好ましい。１つの態様において、当該配列は、ナンセンス変異型遺伝性疾患のヒトおよび動物（疾患モデル動物を含む）の未熟終止コドンを含む配列を含む配列であってもよく、例えば、ｍｄｘマウスのジストロフィン遺伝子の未熟終止コドンを含む遺伝子を使用してもよい。

プロモーターとしては、例えば、ＣＭＶプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶ／β−アクチンハイブリッドプロモーター等が使用されうる。好ましくは、プロモーターとしてＣＭＶ／β−アクチンハイブリッドプロモーターが使用される。

本発明に係るアッセイ方法は、上記ベクターを導入した宿主細胞または組み替え動物を使用して行われうる。本発明の上記側面の１つの態様において、前記アッセイ方法は遺伝子組み替えマウスを用いて行われうる。宿主細胞または組み替え動物への上記ベクターの導入は、遺伝子組み替えの技術分野における当業者に既知の方法に基づいて行うことができる。

本発明の別の側面によれば、上記式（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれかの式により表される化合物からなる、ナンセンス変異により形成された未熟終止コドンのリードスルー剤が提供される。

ナンセンス変異により形成された未熟終止コドンのリードスルー剤とは、該未熟終止コドンのリードスルーを起こすまたは促進する薬剤を意味する。

当該リードスルー剤として、上記式（ＶＩ）〜（Ｘ）のいずれかの式により表される化合物からなるリードスルー剤を挙げることができる。

当該リードスルー剤として、上記表に示した化合物をより好ましく挙げることができる。

本発明は以下の実施例により説明されるが、当該実施例は本発明を限定的に解釈されることを意図するものではない。

１．試薬
以下に示す５つの化合物を購入により入手し、そのリードスルー活性についてアッセイを行った。

化合物１：ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅＣｏｒｐ．（米、カリフォルニア州）より購入；

化合物２：Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ（ＦｉｓｈｅｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｎｃ．、英国）より購入；

化合物３：ＮａｎｏｓｙｎＩｎｃ．（米、カリフォルニア州）より購入；

化合物４：ＮａｎｏｓｙｎＩｎｃ．（米、カリフォルニア州）より購入；および

化合物５：ＮａｎｏｓｙｎＩｎｃ．（米、カリフォルニア州）より購入。

２．アッセイ系の構築
１）発現プラスミドの構築
ａ）ルシフェラーゼ遺伝子の修正
β−ガラクトシダーゼ遺伝子とルシフェラーゼ遺伝子を連結するために制限酵素サイト（ＰｓｔＩ）をルシフェラーゼの開始コドンの前に付加するために下記プライマーを作成した。

フォワードプライマー：５’−ｃｃｃＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧ−ａｔｇｇａａｇａｃｇｃｃａａａａａｃａｔａａａｇ−３’（配列番号１）
リバースプライマー：５’−ｃｃｃＴＴＣＧＡＡ−ｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔａａｇｔｇａｔｇｔｃｃａｃｃ−３’（配列番号２）

ＰＣＲ断片クローニングにはルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡであるｐＧＬ３−ＢａｓｉｃＶｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）のＨｉｎｄＩＩＩサイトとＮｓｐＶサイトを利用した。ＰＣＲは、アニール温度６０℃、伸長速度３０秒、３５サイクルの条件で実施した。ＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤＰｌｕｓＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）を使用した。その結果、所定の増幅ＤＮＡ（約０．１７ｋｂ）が検出された。

こうして得られたＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｓｐＶで切断し、ｐＧＬ３−ＢａｓｉｃＶｅｃｔｏｒのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｓｐＶサイトにライゲーションした。得られたベクターを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換し、その後プラスミドＤＮＡ抽出を行った。得られたプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｓｐＶで切断し、所定のサイズのＤＮＡ断片が検出されたプラスミドを選択した。選択したプラスミドについてはＤＮＡシークエンス解析を行い、配列に所定の修正が施されていることを確認した。

ｂ）ガラクトシダーゼ遺伝子の修飾
β−ガラクトシダーゼ遺伝子の終止コドンを除去し、終止コドン（ＴＡＡ）を含むナンセンス変異配列を挿入し、さらにルシフェラーゼ遺伝子と連結するためのＰｓｔＩサイトを付加するために、プライマーとして下記の配列、およびその相補配列のオリゴＤＮＡを合成した。

５’−ＧＡＡＴＴＣ−ＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＧＧＴＣＧＣＴＡＣＣＡＴＴＡＣＣＡＧＴＴＧＧＴＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＡＡＡ−ＡＡＡＧＡＧＣＡＡＴＡＡＡＡＴＧＧＣ−ＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号３）

上記配列をアニール後、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅＣｏｎｔｒｏｌＶｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）（約２．７ｋｂ）のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩサイトにライゲーションした。得られたベクターを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換し、その後プラスミドＤＮＡ抽出を行った。得られたプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断し、所定のサイズのＤＮＡ断片が検出されたプラスミドを選択した。選択したプラスミドについてはＤＮＡシークエンス解析を行い、β−ガラクトシダーゼ塩基配列中の６８１４塩基目のＥｃｏＲＩと４１６９塩基目のＰｓｔＩの間に合成ＤＮＡ断片が挿入された塩基配列であることを確認した。

確認後のプラスミドをＥｃｏＲＩで切断し、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅＣｏｎｔｒｏｌＶｅｃｔｏｒ（約３．７ｋｂ）のＥｃｏＲＩサイトにライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換後、プラスミドＤＮＡ抽出を行った。得られたプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩで切断し、所定の方向で連結されたプラスミドを選択した。

ｃ）修正β−ガラクトシダーゼ遺伝子と修正ルシフェラーゼ遺伝子の連結
修正β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミド（上記工程ｂで調製）を修正ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミド（上記工程ａで調製）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩサイトにライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換後、プラスミドＤＮＡ抽出を行った。得られたプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩで切断し、目的のサイズのＤＮＡ断片が検出されたプラスミドを選択した。

ｄ）ｐＣＡＧＧＳへの連結
工程ｃで得られたプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで切断後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ処理を行ったＤＮＡ断片と、ｐＣＡＧＧＳ（オリエンタル酵母）をＥｃｏＲＩで切断しＢｌｕｎｔｉｎｇ処理後、脱リン酸処理したプラスミドＤＮＡをライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αを形質転換後、プラスミドＤＮＡ抽出を行った。得られたプラスミドＤＮＡをＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、所定のサイズ（１．８ｋｂ、３．０ｋｂ、５．０ｋｂ）のＤＮＡ断片が検出されたプラスミドを選択した。選択したプラスミドを用いてＢｌｕｎｔｉｎｇ部分のＤＮＡシークエンス解析を行い、所定の塩基配列であることを確認した。

ｅ）終止コドンとして「ＴＧＡ」または「ＴＡＧ」を含む発現プラスミドの構築
β−ガラクトシダーゼ遺伝子の修飾の際に使用したオリゴＤＮＡ（配列番号３）に代わりに以下の配列およびその相補配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ使用して、上記ａ）〜ｄ）の工程と同様の手法により、終止コドンとして「ＴＧＡ」を含む発現プラスミド（配列番号４を使用）および終止コドンとして「ＴＡＧ」を含む発現プラスミド（配列番号５を使用）を構築した。

５’−ＧＡＡＴＴＣ−ＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＧＧＴＣＧＣＴＡＣＣＡＴＴＡＣＣＡＧＴＴＧＧＴＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＡＡＡ−ＡＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧＣ−ＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号４）
５’−ＧＡＡＴＴＣ−ＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＧＧＴＣＧＣＴＡＣＣＡＴＴＡＣＣＡＧＴＴＧＧＴＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＡＡＡ−ＡＡＡＧＡＧＣＡＡＴＡＧＡＡＴＧＧＣ−ＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号５）。

２）トランスジェニックマウスの作製
トランスジェニックマウスはＧｏｒｄｏｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第７７巻、第７３８０〜７３８４頁）に基づいて実施した。採卵用の雌マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌ系統）を過剰排卵させ、同系統マウスと交配させた。その後、採取した受精卵（前核期胚）の雄性前核に調製したＤＮＡ断片（終止コドンが「ＴＡＡ」のもの）を顕微注入した。当該受精卵を、その後偽妊娠の雌（ＣＤ−１（ＩＣＲ）系統）マウスの卵管内に移植し、自然分娩させた。

３．リードスルー活性のアッセイ
上記の方法により作製したトランスジェニックマウスに、上記化合物１〜５の生理食塩水溶液（大塚製薬、１００μｇ／１００μＬ）を、２４時間毎に７日間にわたり腹部皮下に注射した。前記マウスを８日目にエーテル過剰吸引により安楽死させ、大腿部と脛部の骨格筋を摘出し、眼科用ハサミで細片化した後、湿重量の３倍量のＲｅｐｏｒｔｅｒＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を加え、ガラス細片と共にヒスコトロン（日音理科器械製作所）により組織を破壊した。凍結融解後、遠心上清を９６穴プレートに移し、Ｂｅｔａ−ＧｌｏＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）によりβ−ガラクトシダーゼ活性を、Ｂｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）によりルシフェラーゼ活性を、ルミノメータ（ＡＴＴＯ）で測定した。ルシフェラーゼ活性を統一化するため、β−ガラクトシダーゼ活性の値でルシフェラーゼ活性の値を割り、１０^４を掛けた値をリードスルー効率として表記した。結果を図１に示す。

化合物１〜５のいずれを投与した系においても、対照（生理食塩水）を大きく上回るリードスルー活性が確認された。

筋ジストロフィーモデルマウスへの上記化合物２の投与効果を検討した。筋ジストロフィーモデルマウスとして、ｍｄｘマウスを使用した。

化合物２を４または４００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量でｍｄｘマウスに７日間強制胃内投与した後、生化学的および免疫組織化学的な解析を行った。その結果、血清クレアチンキナーゼ活性の減少と後肢等の筋肉内におけるジストロフィンの蓄積を確認した。陽性対照のゲンタマイシン皮下投与群に比べ、化合物２投与群のほうが良好な結果を示した。

上記化合物２のマウスにおける副作用を検討した。

化合物２を４または４００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量でＣ５７ＢＬ／６マウスに１４日間皮下注射した。投与期間中の体重減少は認められず、聴性脳幹反応による聴力検査や１８項目の血清の生化学検査（総タンパク質、アルブミン、アスパラギン酸トランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、γ−グルタミルトランスペプチターゼ、クレアチニン、グルコース、トリグリセライド、リン脂質、総コレステロール、ナトリウム、カリウム、クロール、カルシウム、無機リン、総ビリルビン、アルブミン／グルコース比）においても異常値は認められなかった。

配列番号１：プライマー用に設計されたオリゴＤＮＡ
配列番号２：プライマー用に設計されたオリゴＤＮＡ
配列番号３：プライマー用に設計されたオリゴＤＮＡ
配列番号４：プライマー用に設計されたオリゴＤＮＡ
配列番号５：プライマー用に設計されたオリゴＤＮＡ

Claims

変異により未熟終止コドンが生じた遺伝子から野生型正常タンパク質を生産させる方法であって、以下の式（Ｉ）〜（Ｖ）：

［式中、Ｒ^１はＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^３は、独立して、水素原子および置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルから選択され；Ｒ^４およびＲ^５は、独立して、水素原子およびＣ_１−１０アルキルから選択され；Ｘ^１は、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよいカルバモイルまたは置換基を有していてもよいヒドラジノカルボニルである］

［式中、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４は、独立して、カルボキシ、置換基を有していてもよいアルコキシカルボニル、置換基を有していてもよいカルバモイルまたは置換基を有していてもよいヒドラジノカルボニルであり；Ｒ^６は、水素原子または置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルであり；Ａは、置換基を有していてもよいアルキレンである］

［Ｘ^５およびＸ^６は、独立して、カルボキシ、置換基を有していてもよいアルコキシカルボニルおよび置換基を有していてもよいカルバモイルから選択され；Ｒ^７は、水素原子または置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^８は、置換基を有していてもよいアミノ、置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルまたは置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルケニルである］

［Ｒ^９、Ｒ^１０およびＲ^１３は、独立して、水素原子、または置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^１１およびＲ^１２は、独立して、水素原子、置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキル、芳香族化合物で置換されているカルボニルであるか、またはＲ^１１とＲ^１２とが一緒になって二重結合を形成し＝ＣＲ^１７Ｒ^１８となることもあり、Ｒ^１７およびＲ^１８は、独立して、水素原子、Ｃ_１−１０アルキル、および置換基を有していてもよいカルバモイルアルキルから選択される］

［Ｘ^７およびＸ^８は、独立して、カルボキシ、置換基を有していてもよいアルコキシカルボニルおよび置換基を有していてもよいカルバモイルから選択され；Ｒ^１４、Ｒ^１５およびＲ^１６は、独立して、水素原子、または置換基を有していてもよいＣ_１−１０アルキルである］
のいずれかの式により表される化合物または医薬として許容なその塩の存在下でリボソームによる翻訳が行われる、前記方法。
野生型正常タンパク質の生産が哺乳類の生体内で行われ、前記化合物を前記哺乳類に投与することを含む請求項１に記載の方法。
前記哺乳類がナンセンス変異型遺伝性疾患の患者である、請求項２に記載の方法。
前記ナンセンス変異型遺伝性疾患が、筋ジストロフィー、デュシャンヌ型筋ジストロフィー、多発性硬化症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テイ−サックス病、神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、関節炎、血友病、フォンヴィレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、腎結石、骨形成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾患、家族性コレステロール血症、小脳運動失調、結節性硬化症、家族性赤血球増加症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン−ピック病、マルファン症候群、および癌から選択される疾患である、請求項３に記載の方法。
前記ナンセンス変異型遺伝性疾患が筋ジストロフィーである請求項３に記載の方法。
ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療または予防に使用するための医薬組成物であって、請求項１に記載の式（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれかの式により表される化合物または医薬として許容なその塩を有効成分として含む、前記医薬組成物。
前記ナンセンス変異型遺伝性疾患が、筋ジストロフィー、デュシャンヌ型筋ジストロフィー、多発性硬化症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テイ−サックス病、神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、関節炎、血友病、フォンヴィレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、腎結石、骨形成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾患、家族性コレステロール血症、小脳運動失調、結節性硬化症、家族性赤血球増加症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン−ピック病、マルファン症候群、および癌から選択される疾患である、請求項６に記載の医薬組成物。
前記ナンセンス変異型遺伝性疾患が筋ジストロフィーである請求項６に記載の医薬組成物。
リードスルー活性を有する化合物のアッセイ方法であって、
ａ）以下のもの：ｉ）プロモーター、ｉｉ）当該プロモーターの下流に位置する第１の翻訳開始コドンおよび第１のレポーター遺伝子、ｉｉｉ）当該第１のレポーター遺伝子の下流に位置する第２の翻訳開始コドンおよび第２のレポーター遺伝子、ｉｖ）当該第１のレポーター遺伝子および第２の翻訳開始コドンの間に位置し、ナンセンス変異型遺伝性疾患の原因遺伝子由来の未熟終止コドンを含む配列、およびｖ）当該第２のレポーター遺伝子の下流に位置する翻訳終止コドン、を含むベクターを導入した宿主細胞または組み替え動物を調製する工程；
ｂ）前記宿主細胞または組み替え動物に、試験化合物を投与する工程；および
ｃ）第１のレポーター遺伝子に対する第２のレポーター遺伝子の発現量の比を、試験化合物の添加時および非添加時において比較する工程
を含む、前記アッセイ方法。
ナンセンス変異により形成される未熟終止コドンのリードスルー剤であって、請求項１に記載の式（Ｉ）から（Ｖ）のいずれかの式により表される化合物、その水和物、その溶媒和物、またはそれらいずれかの塩からなる、前記リードスルー剤。
変異により未熟終止コドンが生じた遺伝子から野生型正常タンパク質を生産させる方法であって、以下の式（ＶＩ）〜（Ｘ）：

［式中、Ｒ^１はＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^２およびＲ^３は、独立して、水素原子、Ｃ_１−１０アルキルおよびＣ_１−１０アルキルカルボニルから選択され；Ｒ^４およびＲ^５は、独立して、水素原子およびＣ_１−１０アルキルから選択され；Ｘ^１は、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルアミノまたはジ（Ｃ_１−１０アルキル）アミノである］

［式中、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４は、独立して、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルアミノおよびジ（Ｃ_１−１０アルキル）アミノから選択され；Ｒ^６は、水素原子またはＣ_１−１０アルキルである］

［Ｘ^５、Ｘ^６およびＸ^７は、独立して、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルアミノおよびジ（Ｃ_１−１０アルキル）アミノから選択され；Ｒ^７は、水素原子またはＣ_１−１０アルキルである］

［Ｘ^８は、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルアミノおよびジ（Ｃ_１−１０アルキル）アミノであり；Ｒ^８およびＲ^９は、独立して、水素原子またはＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^１０およびＲ^１１は、独立して、水素原子、Ｃ_１−１０アルキルおよびＣ_１−１０アルキルカルボニルから選択される］

［Ｘ^９およびＸ^１０は、独立して、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルアミノおよびジ（Ｃ_１−１０アルキル）アミノから選択され；Ｒ^１２、Ｒ^１３およびＲ^１４は、独立して、水素原子、Ｃ_１−１０アルキル、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルおよび−ＣＨ_２ＣＯＸ^１１から選択され；Ｘ^１１は、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルアミノおよびジ（Ｃ_１−１０アルキル）アミノである］
のいずれかの式により表される化合物または医薬として許容なその塩の存在下でリボソームによる翻訳が行われる、前記方法。
ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療または予防に使用するための医薬組成物であって、請求項１１に記載の式（ＶＩ）〜（Ｘ）のいずれかの式により表される化合物または医薬として許容なその塩を有効成分として含む、前記医薬組成物。