WO2008004610A1 - Méthode de traitement de maladie génétique provoquée par une mutation non sens - Google Patents

Méthode de traitement de maladie génétique provoquée par une mutation non sens Download PDF

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WO2008004610A1 PCT/JP2007/063436 JP2007063436W WO2008004610A1 WO 2008004610 A1 WO2008004610 A1 WO 2008004610A1 JP 2007063436 W JP2007063436 W JP 2007063436W WO 2008004610 A1 WO2008004610 A1 WO 2008004610A1
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independently
amino
hydrogen atom
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Ryoichi Matsuda
Masataka Shiozuka
Jr. Alexander Mackerell
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The University Of Tokyo
University Of Maryland, Baltimore
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Definitions

  • the present invention relates to nonsense mutation-type inherited diseases (for example, muscular dystrophy, Dushanne muscular dystrophy, multiple sclerosis, infantile neuronal ceroid lipofuscinosis, Arno-Ima-Imai disease, tea sax disease, neural tissue degeneration, Parkinson Disease, rheumatoid arthritis, graft-versus-host disease, arthritis, hemophilia, von Willebrand disease, telangiectasia ataxia, thalassemia, kidney stones, bone dysplasia, cirrhosis, neurofibromatosis, bullous disease Lysosomal storage disease, Hurler disease, familial cholesterolemia, cerebellar ataxia, nodular sclerosis, familial erythrocytosis, immunodeficiency, kidney disease, lung disease, cystic fibrosis, familial high cholesterol , Retinopathy of the pigment, amyloidosis, atherosclerosis, giantism, dwarfism, hypothyroidism, thyroid
  • a nonsense mutation-type inherited disease is a disease caused by inhibition of protein expression due to an immature stop codon caused by a point mutation on a gene.
  • Duchenne muscular dystrophy is a disease caused by a lack of dystrophin protein in the muscle fiber sheath.
  • a stop codon is formed by a mutation that occurs on the muscular dystrophy gene present in the X chromosome (immature stop codon), and the translation is interrupted at the mutation site to terminate normal dystrophin and Dystrophin-related protein expression is inhibited, resulting in a lack of dystrophin protein.
  • nonsense mutations result in premature stop codons and lack of specific proteins
  • the compound acts on the ribosome, and the ribosome reads and translates the stop codon (hereinafter also referred to as read-through), resulting in the synthesis of wild-type normal protein.
  • read-through As a compound having such read-through activity, for example, gentamicin, which is an aminoglycoside antibiotic, is known.
  • gentamicin which is an aminoglycoside antibiotic
  • Non-patent Document 2 it has been reported that typical electrophysiological abnormalities can be normalized by locally administering gentamicin to the respiratory epithelium of cystic fibrosis patients.
  • the administration of gentamicin is in clinical trials in the United States as a therapy for inherited diseases.
  • the read-through activity of negamycin, a dipeptide antibiotic has been reported, and it has been confirmed that the expression of dystrophin is restored by administering the compound to muscular dystrophy model mice (Patent Document 1). .
  • Patent Document 1 International Publication WO2002Z102361 Pamphlet.
  • Non-Patent Document 1 Acta. Myol. 22nd pp. 15-21, 2003.
  • Non-Patent Document 2 N. Engl. J. Med. 349, pp. 1433-1441, 2003.
  • An object of the present invention is to provide a compound having read-through activity for use as a method for treating a nonsense mutant genetic disease, to provide a pharmaceutical composition containing the compound, and to provide the compound It is intended to provide a method of treating a nonsense mutant hereditary disease comprising administering.
  • the present inventor conducted extensive research to achieve the above-mentioned problems, and as a result, found a compound having read-through activity and completed the present invention.
  • the present invention is a method for producing a wild-type normal protein from a gene in which an immature stop codon has been generated by mutation, which comprises the following formulas (I) to (V):
  • R 1 is C alkyl
  • R 2 and R 3 are independently a hydrogen atom and a substituent
  • R 4 and R 5 are independently hydrogen atom
  • X 1 may be carboxy, optionally substituted
  • Lower alkoxy carbo, Or may have rubamoyl or a substituent, and may be hydrazinocarbol]
  • X 2 , X 3 and X 4 independently represent carboxy, optionally substituted alkoxy carbo yl, optionally substituted! /, Or rubamoyl or Have a substituent! /, An optional hydrazinocarbonyl; R 6 is a hydrogen atom or an optionally substituted C alkyl; A is an optionally substituted alkylene]
  • [X 5 and X 6 are independently selected from carboxy, an optionally substituted alkoxy carbonyl and an optionally substituted rubamoly dolphin; R 7 is a hydrogen atom or Or may be substituted and may be C alkyl; R 8 may be substituted! /
  • R 9 , R 1G and R 13 are each independently a hydrogen atom or an optionally substituted C
  • R 11 and R 12 are independently a hydrogen atom, an optionally substituted C alkyl, a carbonyl substituted with an aromatic compound, or R 11. And R 12
  • the present invention also relates to the above-mentioned method for producing a wild-type normal protein, wherein the production of a wild-type normal protein is carried out in a mammalian body and the compound is administered to the mammal.
  • the present invention relates to the above-mentioned method for producing a wild-type normal protein, comprising administering the compound to a patient with a nonsense mutant genetic disease.
  • the present invention provides a muscular dystrophy, Dushanne muscular dystrophy, multiple hard Dermatosis, infant neuronal ceroid lipofuscinosis, Arno-Ima-Ichi disease, teasack disease, neurodegeneration, Parkinson's disease, rheumatoid arthritis, graft-versus-host disease, arthritis, hemophilia, von Willebrand disease , Capillary dilatation ataxia, thalassemia, kidney stones, bone dysplasia, cirrhosis, neurofibromatosis, bullous disease, lysosomal storage disease, Halar disease, familial cholesterolemia, cerebellar ataxia, tuberous sclerosis Disease, familial erythrocytosis, immunodeficiency, kidney disease, lung disease, cystic fibrosis, familial hypercholesterolemia, chromatic retinopathy, amyloidosis, atherosclerosis, giantism, dwarfism , Hypothyroidism, hyperthyroidism,
  • the present invention also relates to the above-described method for producing a wild-type normal protein comprising administering to a muscular dystrophy patient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of a nonsense mutant genetic disease, the compound represented by any one of the formulas (I) to (V): Relates to a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention also relates to muscular dystrophy, Dushanne muscular dystrophy, multiple sclerosis, infantile neuronal ceroid lipofuscinosis, Arno-i-maima disease, tysax disease, neural tissue degeneration, Parkinson's disease, rheumatoid arthritis, Graft disease, arthritis, hemophilia, von Willebrand disease, telangiectasia ataxia, thalassemia, kidney stones, osteogenesis imperfecta, cirrhosis, neurofibromatosis, bullous disease, lysosomal storage disease , Harler disease, familial cholesterolemia, cerebellar ataxia, tuberous sclerosis, familial erythrocytosis, immunodeficiency, kidney disease, lung disease, cystic fibrosis, familial hypercholesterolemia, chromatic retina Disease, amyloidosis, atherosclerosis, giantism, dwarfism, hypothyroidism, hyperthyroidism, aging, obesity, diabetes
  • the present invention also relates to the pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of muscular dystrophy.
  • the present invention provides an assembly method for a compound having read-through activity, comprising: a) the following: i) a promoter, ii) a first translation initiation codon located downstream of the promoter, and a first Iii) a second translation initiation codon and a second reporter gene located downstream of the first reporter gene, iv) between the first reporter gene and the second translation initiation codon
  • a host cell or vector introduced with a vector comprising a sequence containing a premature stop codon from a causative gene of the nonsense mutant hereditary disease and V) a translation stop codon located downstream of the second reporter gene Preparing a recombinant animal;
  • the present invention provides a lead-through agent of an immature termination codon formed by a nonsense mutation, the compound represented by any one of the formulas (I) to (V), and a hydrate thereof , Solvates thereof, or any of these lead-through agents.
  • the present invention also provides a method for producing a wild-type normal protein from a gene in which an immature stop codon has been generated by mutation, wherein the following formulas (VI) to (X):
  • R 1 is C alkyl
  • R 2 and R 3 are independently a hydrogen atom, C
  • R 4 and R 5 are independently hydrogen
  • X 1 is hydroxy, ami-substituted C alkoxy
  • C is a quinolequinolamino or di (C arnolequinole) amino]
  • R 6 is a hydrogen atom or C
  • [ ⁇ 5 , ⁇ 6 and ⁇ 7 are independently hydroxy, amino-c-alkoxy, c-alkyl
  • R 7 is a hydrogen atom or C
  • [X 8 is hydroxy, amino-containing C alkoxy, C alkylamino and di (C
  • R 8 and R 9 are independently a hydrogen atom or C alkyl.
  • R 1G and R 11 independently represent a hydrogen atom, C alkyl and C alkyl carbo
  • R 12 , R 13 and R 14 are independently water
  • X 11 is hydroxy, amino-containing C alkoxy, alkylamino and di
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of a nonsense mutant genetic disease, wherein the compound represented by any one of the formulas (VI) to (X) Relates to the pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • a compound that reads through an immature stop codon formed by mutation a read-through agent comprising the compound, and a pharmaceutical composition containing the compound
  • a wild-type normal protein can be produced from a gene in which such an immature termination codon has occurred, and as a result, a disease caused by a nonsense mutation that produces an immature termination codon. Can be treated or prevented.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating that all of Compounds 1 to 5 showed marked read-through activity compared to a physiological saline solution (Saline) as a control.
  • Saline physiological saline solution
  • compounds 1 to 5 are labeled I, II, III, IV, and V, respectively, and the readthrough activity is labeled Readthrough Efficiency.
  • a method for producing a wild type normal protein from a gene in which an immature stop codon is generated by mutation which comprises the following formulas (I) to (V):
  • R 1 is C alkyl
  • R 2 and R 3 are independently a hydrogen atom and a substituent
  • R 4 and R 5 are independently hydrogen atom
  • X 1 may be carboxy, optionally substituted
  • Lower alkoxy carbo, Or may have rubamoyl or a substituent, and may be hydrazinocarbol]
  • X 2 , X 3 and X 4 independently represent carboxy, optionally substituted alkoxy carbo yl, optionally substituted! /, Or rubamoyl or Have a substituent! /, An optional hydrazinocarbonyl; R 6 is a hydrogen atom or an optionally substituted C alkyl; A is an optionally substituted alkylene]
  • [X 5 and X. Is independently selected from carboxy, optionally substituted alkoxy carboxy, and optionally substituted! /, May! /, Force ruby dolphins;
  • R 7 is With a hydrogen atom or a substituent, it is C alkyl;
  • R 8 has a substituent;
  • R 9 , R 1C> and R 13 are each independently a hydrogen atom or an optionally substituted C
  • R 11 and R 12 are independently a hydrogen atom, an optionally substituted C alkyl, a force substituted with an aromatic compound, or R 11 and R 12 and
  • X 7 and X 8 are independently selected from carboxy, optionally substituted alkoxy carbo yl or substituted substituents, and forceful ruby dolphins are also selected; R 14 , R 15 And R 16 independently has a hydrogen atom or a substituent, and may be C alkyl]
  • 1-10 1-10 alkyl is preferably C alkyl or optionally substituted C alkyl
  • C alkyl or optionally substituted C alkyl More preferably, C alkyl or optionally substituted C alkyl, more preferably
  • the C alkyl optionally having a substituent represented by R 2 or R 3 is preferably a substituent.
  • Lower alkoxy carbonyl lower alkyl such as methoxycarbonylmethyl, methoxycarbonylethyl, methoxycarbonyl propyl, methoxycarbonylbutyl, ethoxycarbonylmethyl, ethoxycarbonylethyl, ethoxycarbonylpropyl, ethoxycarbonylbutyl, etc. Is mentioned.
  • C 4 alkyl represented by R 4 and R 5 or optionally substituted C alkyl is preferred.
  • C alkyl or optionally substituted C alkyl Preferably C alkyl or optionally substituted C alkyl, more preferably C
  • 1-6-1-4 or a substituted group may be c alkyl, and suitable examples thereof include, for example, methoxy.
  • Examples include lower alkyl such as til, ethyl, propyl, and butyl, with isopropyl and isobutyl being particularly preferred.
  • alkoxycarbol include lower groups such as methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, propylcarbonyl, butoxycanoleboninole and the like.
  • Alkyl carbo yl may be mentioned, which may have a substituent, carbamoyl or a substituent, and the substituent of hydrazino carbo- valent may be mono-substituted, di-substituted or fully substituted.
  • lower alkyl groups such as methyl, ethyl, propyl, butyl and the like can be mentioned.
  • X 2 , X 3 and X 4 may have a substituent.
  • Preferred examples of the alkoxycarbol include methoxycarbol and ethoxy. Examples thereof include lower alkyl carbo ls such as carbo yl, propyl carbonyl, butoxy carbo yl and the like, and may have a substituent, may have rubamoyl and a substituent, and may be hydrazino carbo-
  • substituents for thiols include mono-, di-, and total substitutions, and examples thereof include lower alkyl groups such as methyl, ethyl, propyl, and butyl.
  • the C alkyl optionally having a substituent represented by R 6 preferably has a substituent.
  • X 5 and X 6 may have a substituent.
  • Preferred examples of the alkoxy carbocycle include methoxy carbo yl and ethoxy carbo ol.
  • Carbcarbonyl which may have a substituent, may be mono-substituted or di-substituted, for example, lower groups such as methinole, ethynole, propyl, butyl, etc. An alkyl group is mentioned.
  • the C alkyl optionally having a substituent represented by R 7 preferably has a substituent.
  • An optionally substituted C alkyl more preferably an optionally substituted C alkyl,
  • lower alkyl such as methyl, ethyl, propyl, and butyl.
  • a substituent represented by R 8, I also, suitable examples of substituents of Amino, methyl, Echirupuropiru, lower alkyl and butyl; hydroxymethyl, hydroxyethyl E chill, hydrin Rokishipuropiru, hydroxybutyl Substituents such as lower alkoxyalkyl such as methoxymethyl, methoxyetchyl, methoxypropyl, methoxybutyl and the like. With substituents, with C alkyl or with substituents,
  • the C-alkenyl substituent is preferably a C alkyl which may have a substituent.
  • Preferred examples thereof include hydroxy, methoxy, and ether.
  • alkoxy such as Si.
  • C may have a substituent represented by R 9 , R 10 and R 13
  • 1-10 alkyl is preferably optionally substituted C alkyl, more preferably substituted
  • 1-6 1 -alkyl and preferred examples thereof include lower groups such as methyl, ethylpropyl, and butyl.
  • Alkyl such as hydroxymethyl, hydroxyethyl, hydroxypropyl, hydroxybutyl; methoxymethyl, methoxyethyl, methoxypropyl, methoxy And lower alkoxyalkyl such as butyl.
  • the C alkyl optionally having a substituent represented by R 11 and R 12 is preferably substituted.
  • a substituent may be C alkyl, more preferably may have a substituent! /, C
  • Examples include carboxy lower alkyl such as carboxymethyl, carboxyethyl, carboxypropyl, and carboxybutyl, and lower alkoxy lower alkyl such as methoxycarbomethyl, methoxycarboxyl, methoxycarboxypropyl, and methoxycarbobutyl. It is done.
  • Preferable examples of the carbonyl substituted with an aromatic compound include phenol and naphthyl carbonate.
  • the C alkyl represented by R 17 and R 18 is preferably C alkyl, more preferably
  • C alkyl more preferably C alkyl, preferred examples include methyl
  • Lower alkyl such as ethyl, propyl, butyl and the like.
  • the strong rubamoyl alkyl which may have a substituent include lower alkyl strength rubamoyl lower alkyl such as methylcarbamoylmethyl, ethyl strength rubamoylmethyl, propyl strength rubamoylmethyl, butylcarbamoylmethyl, cycloptylcarbamoylmethyl, cyclo Cyclo C-alkyl such as pentylcarbamoylmethyl, cyclohexylcarbamoylmethyl, etc.
  • alkoxy group having the substituents represented by X 7 and X 8 include methoxycarbol, ethoxycarbo- , Propyl-strength carbonyl, butoxycarbol and the like, and optionally substituted rubamoyl may be mono- or di-substituted.
  • methyl, ethyl, propyl, butyl, etc. Of lower alkyl groups.
  • the C alkyl optionally having a substituent represented by R 14 , R 15 and R 16 is preferably
  • a substituent may be a C alkyl, and more preferably may have a substituent! / ⁇
  • Preferable examples include lower alkyl such as methyl, ethyl, propyl and butyl, carboxy lower alkyl such as carboxymethyl, carboxyethyl, carboxypropyl and carboxybutyl; lower alkyl carbo lower alkyl; ! /, Even! /, Power And rubamoyl lower alkyl.
  • R 1 is C alkyl
  • R 2 and R 3 are independently a hydrogen atom, C
  • R 4 and R 5 are independently hydrogen
  • X 1 is hydroxy, ami-substituted C alkoxy
  • C is a quinolequinolamino or di (C arnolequinole) amino]
  • R 6 is a hydrogen atom or C
  • [ ⁇ 5 , ⁇ 6 and ⁇ 7 are independently hydroxy, amino-c-alkoxy, c-alkyl
  • R 7 is a hydrogen atom or C_al
  • [x 8 represents hydroxy, amino-containing C alkoxy, C alkylamino and di (C
  • R 8 and R 9 are independently a hydrogen atom or C alkyl.
  • R 1G and R 11 independently represent a hydrogen atom, C alkyl and C alkyl carbo
  • [X 9 and X 1 . are independently hydroxy, ami-c-c alkoxy, c-alkyl ami
  • R 12 , R 13 and R 14 are independently water
  • X 11 is hydroxy, amino-containing C alkoxy, c alkylamino and di (C
  • a protein comprising an amino acid sequence encoded by a normal gene and an amino acid sequence that is substantially identical to the amino acid sequence are also present. Proteins that have the same function as proteins consisting of amino acid sequences encoded by normal genes are included.
  • a protein having an amino acid sequence substantially the same as an amino acid sequence encoded by a normal gene and having the same function as a protein consisting of an amino acid sequence encoded by a normal gene is limited as long as it has this function. It does not have to be a full-length protein.
  • a protein having substantially the same amino acid sequence ability as the amino acid sequence encoded by a normal gene is at least 80 %, preferably 85% or more, more than the amino acid sequence encoded by the normal gene force S.
  • it means a protein having a homology of 90% or more, more preferably 95% or more, and also having an amino acid sequence ability.
  • It means a protein consisting of an amino acid sequence in which there are mutated or modified amino acids.
  • the number of mutated amino acids and modified amino acids is, for example, 1 to 100, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, further preferably 1 to 10, and particularly preferably 1 to several. is there.
  • the method of the invention may be performed in vivo in a mammal, in which case the compound may be administered to the mammal.
  • the mammal is a patient with a nonsense mutant genetic disease, and the method is used as a method for treating a nonsense mutant genetic disease.
  • a nonsense mutation-type inherited disease is a protein having a normal function due to a stop codon (mature stop codon) in the middle of a gene caused by point mutation, deletion, or insertion in the gene. It is a disease resulting from the inhibition of protein expression associated with the degradation of quality due to the inhibition of quality expression or degradation of mRNA containing immature stop codons.
  • the nonsense mutation-type inherited disease is not particularly limited, for example, muscular dystrophy, Dushanne muscular dystrophy, multiple sclerosis, infant neuroceroid lipofuscinosis, Arno, Imah's disease, tea sax disease, neural tissue degeneration.
  • central nervous system diseases such as Parkinson's disease, autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and graft-versus-host disease, inflammatory diseases such as arthritis, hemophilia, von Willebrand disease, telangiectasia ataxia, Blood diseases such as thalassemia, familial erythrocytosis and kidney stones, collagen diseases such as osteogenesis imperfecta and cirrhosis, and neurofibromatosis, bullous diseases, lysosomal storage diseases, Illness disease, familial cholesterolemia, cerebellar ataxia, tuberous sclerosis, immunodeficiency, kidney disease, lung disease, cystic fibrosis, familial hypercholesterolemia, retinitis pigmentosa, amyloidosis, atheroma Atherosclerosis, giantism, dwarfism, hypothyroidism, hyperthyroidism, aging, obesity, diabetes, Niemann-Pick disease, Marfan syndrome, cancer, etc.
  • Parkinson's disease autoimmune diseases such as rhe
  • Cancers associated with nonsense mutations in the lesser gene include lung cancer, colorectal cancer, gastric cancer, esophageal cancer, renal cancer, spleen cancer, liver cancer, prostate cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, skin cancer and brain tumor. Any type of cancer is included.
  • a specific nonsense mutation type genetic disease includes muscular dystrophy.
  • the above compound may be used together with other compounds, or may be used as a mixture of two or more compounds selected from the above compounds.
  • a pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of a nonsense mutant genetic disease wherein any one of the formulas (I) to (V) Or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Preferred examples of the compound contained in the pharmaceutical composition include compounds represented by any one of the formulas (VI) to (X) or a pharmaceutically acceptable salt thereof. .
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable simple substance or excipient, and the amount of the compound used in the pharmaceutical composition is therapeutically effective.
  • the amount is not particularly limited as long as it is an amount.
  • the nonsense mutation type hereditary disease is not particularly limited, for example, muscular dystrophy, Dushanne muscular dystrophy, multiple sclerosis, infantile neuronal ceroid lipofuscinosis, Alzheimer's disease, tissack disease, Central nervous system diseases such as neural tissue degeneration and Parkinson's disease, autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and graft-versus-host disease, inflammatory diseases such as arthritis, hemophilia, von Willebrand disease, capillary dilatation exercise Ataxia, thalassemia, familial erythrocytosis and blood diseases such as kidney stones, collagen diseases such as bone dysplasia and cirrhosis, and God Transfibromatosis, bullous disease, lysosomal storage disease, Hurler disease, familial cholesterol disease, cerebellar ataxia, tuberous sclerosis, immunodeficiency, kidney disease, lung disease, cystic fibrosis, family Hypercholesterolemia, retinopathy of the pigment, amyloidosis, at
  • Cancers related to nonsense mutations in the 53 genes such as lung cancer, lung cancer, colorectal cancer, gastric cancer, esophageal cancer, renal cancer, spleen cancer, liver cancer, prostate cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, skin Any of cancer types such as cancer and brain tumor are included.
  • a specific nonsense mutant hereditary disease is muscular dystrophy.
  • composition of the above aspect of the present invention may contain, in addition to the above compound, other compounds as active ingredients, or a mixture of two or more of the above compounds.
  • the "pharmaceutically acceptable salt” in the present specification is not particularly limited as long as it is a salt that can be used as a pharmaceutical product.
  • Salts formed by the compounds of the present invention with bases include salts with inorganic bases such as sodium, strength rhodium, magnesium, calcium and aluminum; salts with organic bases such as methylamine, ethylamine and ethanolamine; lysine, Examples thereof include salts with basic amino acids such as ortin and ammonium salts.
  • the salt may be an acid addition salt.
  • the salt may be a mineral acid such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid; formic acid, Organic acids such as acetic acid, propionic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, lactic acid, malic acid, tartaric acid, citrate, methanesulfonic acid and ethanesulfonic acid; acidic acids such as aspartic acid and glutamic acid Examples include acid addition salts with amino acids.
  • a mineral acid such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid
  • Organic acids such as acetic acid, propionic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, lactic acid, malic acid, tartaric acid, citrate, methanesulfonic acid and ethanes
  • the compounds of the present invention include hydrates, various pharmaceutically acceptable solvates, crystal polymorphs, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used in various dosage forms, such as tablets, capsules, powders, granules, pills, solutions, emulsions, suspensions, solutions, for oral administration.
  • Alcoholic, syrup, exemplar, and elixirs include parenteral agents such as subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections; Transdermal administration or patch, ointment or lotion; sublingual for oral administration, oral patch; and nasal administration Forces that can be aerosolized for, but not limited to.
  • These preparations can be produced by known methods usually used in the preparation process.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be administered as an injection (eg, an intramuscular injection for direct administration to muscle) for the treatment of muscular dystrophy.
  • the pharmaceutical composition may contain various commonly used components, such as one or more pharmaceutically acceptable excipients, disintegrants, diluents, lubricants, and flavoring agents. , Coloring agents, sweeteners, flavoring agents, suspending agents, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents, adjuvants, preservatives, buffering agents, binders, stabilizers, coating agents and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be a sustained or sustained release dosage form! /
  • the dosage range of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and the effectiveness of the ingredients, mode of administration, route of administration, type of disease, nature of the subject (weight, age, medical condition, and use of other medicines) Or the like) and the judgment of the doctor in charge.
  • a suitable dose is, for example, in the range of about 0.01 ⁇ g to lOOmg, preferably about 0.1: g to lmg per kg of the subject's body weight.
  • these dosage changes can be made using general routine experimentation for optimization well known in the art.
  • the above dose can be administered once to several times a day, and may be administered intermittently at a rate of once every several days or weeks.
  • the pharmaceutical composition should be administered to a patient from which the biological sample from which the immature stop codon was detected is examined for the presence or absence of the immature stop codon in a desired gene contained in the biological sample collected from the patient in advance.
  • the biological sample may be any cell, blood, cerebrospinal fluid, bronchoalveolar lavage fluid, sputum, or other body fluid, biopsy tissue, etc. as long as the nucleic acid is contained.
  • a nucleic acid sample can also be prepared from a biological sample.
  • the nucleic acid sample can be prepared by a nucleic acid preparation method known per se.
  • the nucleic acid sample may be DNA or RNA.
  • the prepared nucleic acid sample may be used for direct detection or may be amplified enzymatically by using PCR or other amplification methods prior to analysis.
  • Premature stop codon detection can include Southern blot, polymerase chain reaction (PCR), short tandem repeat (STR), or restriction fragment length polymorphism (RFLP), It can be carried out by a known gene mutation analysis method.
  • the detection method is not limited to the method exemplified above, and any method can be used as long as it can detect an immature stop codon.
  • the amount of mRNA derived from a desired gene in a biological sample is measured, and it is detected that the amount of mRNA is decreased compared to the amount of mRNA derived from the gene in a biological sample derived from a healthy person.
  • the amount of mRNA can be measured by a known analysis method, for example, Northern plot.
  • the administration route of the pharmaceutical composition can be selected from systemic administration or local administration.
  • an appropriate administration route is selected according to the disease, symptoms and the like.
  • parenteral routes can include normal intravenous administration, intraarterial administration, subcutaneous, intradermal, intramuscular administration, and the like.
  • it can be administered by the oral route.
  • transmucosal administration or transdermal administration can be performed.
  • the first reporter gene and the second reporter gene are selected from, for example, / 3 galactosidase gene, luciferase gene, GFP (Green Fluorescent Protein) gene, CAT (Chroramphenicol Ac etyl Transferase) gene, and the like.
  • a galactosidase gene and a luciferase gene are used.
  • the first As a reporter gene—a galactosidase gene is used, and as a second reporter gene, a luciferase gene is used.
  • the read-through means that the ribosome reads and translates the immature stop codon or suppresses degradation of mRNA containing the immature stop codon.
  • the sequence containing the immature stop codon derived from the gene causing nonsense disease in the above aspect of the present invention is not particularly limited as long as it contains a stop codon (TAA, TAG or TGA) in the reading frame.
  • the length of the sequence is preferably about 20 to 150 bp.
  • the sequence may be a sequence comprising a sequence containing a premature stop codon of a human and an animal (including a disease model animal) of a nonsense mutant genetic disease, for example, the mdx mouse dystrophin gene A gene containing an immature stop codon may be used.
  • CMV promoter for example, CMV promoter, 13-actin promoter, SV40 promoter, CMVZ JS-actin hybrid promoter and the like can be used.
  • CMVZ JS-actin hybrid promoter is used as the promoter.
  • the assembly method according to the present invention can be performed using a host cell or a recombinant animal into which the above vector has been introduced.
  • the above-described method can be performed using a transgenic mouse.
  • Introduction of the vector into a host cell or a recombinant animal can be performed based on methods known to those skilled in the art of gene recombination.
  • a read-through agent for an immature termination codon formed by a nonsense mutation comprising a compound represented by any one of the formulas (I) to (V). Provided.
  • the premature termination codon read-through agent formed by the nonsense mutation means an agent that causes or promotes the premature termination codon read-through.
  • Examples of the lead-through agent include a lead-through agent composed of a compound represented by any one of the formulas (VI) to (X).
  • Preferred examples of the lead-through agent include the compounds shown in the above table.
  • Example 1
  • Compound 3 purchased from Nanosyn Inc. (California, USA);
  • Compound 4 purchased from Nanosyn Inc. (California, USA); and
  • Compound 5 Purchased from Nanosyn Inc. (California, USA).
  • Rinose primer 5 ' ⁇ cccTTCGAA— gtactcagcgtaagtgatgtccacc ⁇ 3' (Toki column number 2)
  • the PCR product thus obtained was cleaved with Hind II / Nsp V and ligated to the Hind II / Nsp V site of pGL3-Basic Vector.
  • the resulting vector was used to transform E. coli JM109, followed by plasmid DNA extraction.
  • the obtained plastic The DNA was cleaved with Hind II / Nsp V, and a plasmid in which a DNA fragment of a predetermined size was detected was selected.
  • the selected plasmid was subjected to DNA sequence analysis, and it was confirmed that the sequence was subjected to a predetermined correction.
  • the selected plasmid should be subjected to DNA sequence analysis, and must be a base sequence in which a synthetic DNA fragment is inserted between Eco RI at position 6814 and Pst I at position 4169 in the base sequence of j8-galactosidase. It was confirmed.
  • the confirmed plasmid was digested with Eco RI, ligated to the EcoRI site of j8-galactosidase Control Vector (about 3.7 kb), E. coli JM109 was transformed, and plasmid DNA was extracted. The obtained plasmid DNA was cleaved with Hind Ill / Pst I, and a plasmid ligated in a predetermined direction was selected.
  • the plasmid containing the modified ⁇ -galatatosidase gene (prepared in step b above) was ligated to the Hind Ill / Pst I site of the plasmid containing the modified luciferase gene (prepared in step a above). Plasmid DNA was extracted after transformation of E. coli JM109. The obtained plasmid DNA was cleaved with Hind Ill / Pst I / Bam HI, and a plasmid in which a DNA fragment of the desired size was detected was selected. [0080] d) Link to pCAGGS
  • the blunted DNA fragment and pCAGGS (Oriental Yeast) were cleaved with Eco RI and blunted, and the dephosphorylated plasmid DNA was ligated. did.
  • the E. coli DH5 a was plasmid DNA extraction.
  • the obtained plasmid DNA was cut with Sal I / Eco RI, and a plasmid in which a DNA fragment of a predetermined size (1.8 kb, 3. Okb, 5. Okb) was detected was selected.
  • the DNA sequence analysis of the Blunting part was performed, and it was confirmed that it had a predetermined base sequence.
  • mice were performed according to the method of Gordon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 7380-7384).
  • Female mice for egg collection C57BLZ6J Jcl strain
  • mice of the same strain Thereafter, a DNA fragment (having a stop codon of “TAA”) prepared in the male pronucleus of the collected fertilized egg (pronuclear stage embryo) was microinjected.
  • the fertilized egg was then transplanted into the oviduct of a pseudopregnant female (CD-1 (ICR) strain) mouse and allowed to deliver naturally.
  • TAA stop codon of “TAA”
  • mice prepared by the above method were injected subcutaneously with a physiological saline solution of the above compounds 1-5 (Otsuka Pharmaceutical, 100 gZlOO / zL) every 24 hours for 7 days.
  • the mice were euthanized on the 8th day by excess ether aspiration, and the thigh and shin skeletal muscles were excised, fragmented with ophthalmic scissors, and then 3 times the wet weight of Reporter Lysis Buffer (Promega , USA), and the tissue was destroyed by Hiscotron (Nisson Science Instruments Co., Ltd.) with a glass strip.
  • Compound 2 was administered by gavage to mdx mice for 7 days at a dose of 4 or 400 mgZkgZday, followed by biochemical and immunohistochemical analysis. As a result, a decrease in serum creatine kinase activity and accumulation of dystrophin in muscles such as hind limbs were confirmed. Compared to the positive control gentamicin subcutaneous administration group, the compound 2 administration group showed better results.
  • Compound 2 was injected subcutaneously into C57BLZ6 mice at a dose of 4 or 400 mg ZkgZday for 14 days. No body weight loss was observed during the administration period. Auditory test by auditory brainstem reaction and biochemical examination of 18 items of serum (total protein, albumin, aspartate transferase, alanine aminotransferase, alkaline phosphatase, ⁇ — Glutamyl transpeptidase, Creathun, Glucose, Tridalycelide, Phospholipid, Total cholesterol , Sodium, potassium, chlor, calcium, inorganic phosphorus, total bilirubin, albumin / glucose ratio).
  • serum total protein, albumin, aspartate transferase, alanine aminotransferase, alkaline phosphatase, ⁇ — Glutamyl transpeptidase, Creathun, Glucose, Tridalycelide, Phospholipid, Total cholesterol , Sodium, potassium, chlor, calcium
  • SEQ ID NO: 1 Oligo DNA designed for primer
  • SEQ ID NO: 2 Oligo DNA designed for primer
  • SEQ ID NO: 3 Oligo DNA designed for primer
  • SEQ ID NO: 4 Oligo DNA designed for primer
  • SEQ ID NO: 5 Oligo DNA designed for primer

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Description

ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療方法
技術分野
[0001] 本発明は、ナンセンス変異型遺伝性疾患 (例えば、筋ジストロフィー、デュシャンヌ 型筋ジストロフィー、多発性硬化症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルッノヽ イマ一病、ティーサックス病、神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対 宿主性移植片病、関節炎、血友病、フォンヴイレブラント病、毛細管拡張性運動失調 、サラセミア、腎結石、骨形成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾー ム性蓄積症、ハーラー疾患、家族性コレステロール血症、小脳運動失調、結節性硬 化症、家族性赤血球増加症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性 高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイド一シス、ァテローム性動脈硬化症、 巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、二 一マン ピック病、マルファン症候群、および癌等）の治療方法、および当該方法に ぉ 、て使用される医薬組成物に関する。
背景技術
[0002] ナンセンス変異型遺伝性疾患は、遺伝子上の点変異により生じる未熟終止コドンの ためにタンパク質の発現が阻害されることに起因する疾患である。例えば、デュシャ ンヌ型筋ジストロフィーは、筋繊維鞘におけるジストロフィンタンパク質の欠如に起因 する疾患である。当該疾患においては、 X染色体中に存在する筋ジストロフィー遺伝 子上に生じた変異により終止コドンが形成され (未熟終止コドン）、翻訳がその変異部 位で中断'終了してしまうことにより正常なジストロフィンおよびジストロフィン関連タン ノ ク質の発現が阻害され、結果としてジストロフィンタンパク質が欠如することとなる。
[0003] ナンセンス遺伝子疾患の治療方法としては、外部からの遺伝子導入による（ 、わゆ る遺伝子治療）が考えられる力 ウィルスベクターの安全性やそれに代わるベクター の遺伝子導入効率の低さが問題となっており、現在のところ現実的手段とはいえない
[0004] 一方、ナンセンス変異により未熟終止コドンが生じ特定のタンパク質が欠如している 患者に特定の化合物を投与した際に、当該化合物がリボソームに作用し、リボソーム が終止コドンを読み越え翻訳を行い (以下、リードスルーとも称する）、その結果野生 型正常タンパク質が合成されるという現象が確認されている。このようなリードスルー 活性を有する化合物としては、例えばアミノグリコシド系抗生物質であるゲンタマイシ ンが知られている。 Politanoらは、デュシャンヌ型筋ジストロフィー患者へのゲンタマ イシンの投与によりジストロフィンタンパク質の蓄積を確認している（非特許文献 1)。 また、嚢胞性線維症患者の気道上皮にゲンタマイシンを局所投与することにより、典 型的な電気生理学的異常を正常化できることが報告されて ヽる (非特許文献 2)。さら に、ゲンタマイシンの投与については、遺伝性疾患の療法として米国での臨床試験 が行われている。また、ジペプチド系抗生物質であるネガマイシンのリードスルー活 性についても報告されており、当該化合物を筋ジストロフィーモデルマウスに投与す ることによりジストロフィンの発現が回復することを確認している（特許文献 1)。
[0005] 特許文献 1：国際公開 WO2002Z102361パンフレット。
非特許文献 1 : Acta. Myol.第 22卷、第 15〜21頁、 2003年。
非特許文献 2 :N. Engl. J. Med.第 349卷、第 1433〜1441頁、 2003年。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の目的は、ナンセンス変異型遺伝性疾患の処置方法として使用するための リードスルー活性を有する化合物を提供すること、当該化合物を含む医薬組成物を 提供すること、および当該化合物を投与することを含むナンセンス変異型遺伝性疾 患の処置方法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者は、上記課題を達成するために鋭意研究を進めたところ、リードスルー活 性を有する化合物を見いだし、本発明を完成させた。
[0008] すなわち、本発明は、変異により未熟終止コドンが生じた遺伝子から野生型正常タ ンパク質を生産させる方法であって、以下の式 (I)〜(V)：
[化 1]
Figure imgf000005_0001
[式中、 R1は C アルキルであり； R2および R3は、独立して、水素原子および置換
1 - 10
基を有していてもよい C アルキル力も選択され; R4および R5は、独立して、水素原
1 - 10
子および C アルキル力も選択され; X1は、カルボキシ、置換基を有していてもよい
1 - 10
低級アルコキシカルボ-ル、
Figure imgf000005_0002
、てもよ 、力ルバモイルまたは置換基を 有して 、てもよ 、ヒドラジノカルボ-ルである]
[化 2]
Figure imgf000005_0003
[式中、 X2、 X3および X4は、独立して、カルボキシ、置換基を有していてもよいアルコ キシカルボ-ル、置換基を有して!/、てもよ 、力ルバモイルまたは置換基を有して！/、て もよいヒドラジノカルボニルであり； R6は、水素原子または置換基を有していてもよい C アルキルであり； Aは、置換基を有していてもよいアルキレンである]
[化 3]
Figure imgf000005_0004
[X5および X6は、独立して、カルボキシ、置換基を有していてもよいアルコキシカルボ -ルおよび置換基を有していてもよい力ルバモイルカも選択され; R7は、水素原子ま たは置換基を有して 、てもよ 、C アルキルであり； R8は、置換基を有して!/、てもよ
1 - 10
V、ァミノ、置換基を有して!/、てもよ!/、C アルキルまたは置換基を有して!/、てもよ!/ヽ
Figure imgf000006_0001
[R9、 R1Gおよび R13は、独立して、水素原子、または置換基を有していてもよい C
1 - 10 アルキルであり； R11および R12は、独立して、水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル、芳香族化合物で置換されているカルボニルであるカゝ、または R11と R12
1 - 10
とが一緒になつて二重結合を形成し = CR17R18となることもあり、 R17および R18は、独 立して、水素原子、 C アルキル、および置換基を有して 、てもよ 、力ルバモイルァ
1 - 10
ルキルカ 選択される]
[化 5]
Figure imgf000006_0002
[X7および X。は、独立して、カルボキシ、置換基を有していてもよいアルコキシカルボ -ルおよび置換基を有して 、てもよ 、力ルバモイルカも選択され; R14、 R15および R16 は、独立して、水素原子、または置換基を有して 、てもよ 、C アルキルである]
1 - 10
のいずれかの式により表される化合物または医薬として許容なその塩の存在下でリボ ソームによる翻訳が行われる、前記方法に関する。
[0009] また本発明は、野生型正常タンパク質の生産が哺乳類の生体内で行われ、前記化 合物を前記哺乳類に投与することを含む、野生型正常タンパク質を生産させる前記 方法に関する。
[0010] さらに本発明は、前記化合物をナンセンス変異型遺伝性疾患の患者に投与するこ とを含む、野生型正常タンパク質を生産させる前記方法に関する。
[0011] さらにまた本発明は、筋ジストロフィー、デュシャンヌ型筋ジストロフィー、多発性硬 化症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルッノヽイマ一病、ティーサックス病、 神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、関節炎、 血友病、フォンヴイレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、腎結石、骨形 成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾 患、家族性コレステロール血症、小脳運動失調、結節性硬化症、家族性赤血球増加 症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色 素性網膜症、アミロイド一シス、ァテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺 機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン ピック病、マルフ アン症候群、および癌力 選択される疾患の患者に投与することを含む、野生型正 常タンパク質を生産させる前記方法に関する。
[0012] また本発明は、筋ジストロフィー患者に投与することを含む、野生型正常タンパク質 を生産させる前記方法に関する。
[0013] さらに本発明は、ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療または予防に使用するため の医薬組成物であって、前記式 (I)〜 (V)のいずれかの式により表される化合物また は医薬として許容なその塩を有効成分として含む医薬組成物に関する。
[0014] さらにまた本発明は、筋ジストロフィー、デュシャンヌ型筋ジストロフィー、多発性硬 化症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルッノヽイマ一病、ティーサックス病、 神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、関節炎、 血友病、フォンヴイレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、腎結石、骨形 成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾 患、家族性コレステロール血症、小脳運動失調、結節性硬化症、家族性赤血球増加 症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色 素性網膜症、アミロイド一シス、ァテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺 機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン ピック病、マルフ アン症候群、および癌力 選択される疾患の治療または予防に使用するための前記 医薬組成物に関する。
[0015] また本発明は、筋ジストロフィーの治療または予防に使用するための前記医薬組成 物に関する。 [0016] さらに本発明は、リードスルー活性を有する化合物のアツセィ方法であって、 a)以下のもの： i)プロモーター、 ii)当該プロモーターの下流に位置する第 1の翻訳開 始コドンおよび第 1のレポーター遺伝子、 iii)当該第 1のレポーター遺伝子の下流に 位置する第 2の翻訳開始コドンおよび第 2のレポーター遺伝子、 iv)当該第 1のレポ一 ター遺伝子および第 2の翻訳開始コドンの間に位置し、ナンセンス変異型遺伝性疾 患の原因遺伝子由来の未熟終止コドンを含む配列、および V)当該第 2のレポーター 遺伝子の下流に位置する翻訳終止コドン、を含むベクターを導入した宿主細胞また は組み替え動物を調製する工程；
b)前記宿主細胞または組み替え動物に、試験化合物を投与する工程;および c)第 1のレポーター遺伝子に対する第 2のレポーター遺伝子の発現量の比を、試験 化合物の添加時および非添加時において比較する工程
を含む、前記アツセィ方法に関する。
[0017] さらにまた本発明は、ナンセンス変異により形成される未熟終止コドンのリードスル 一剤であって、前記式 (I)から (V)のいずれかの式により表される化合物、その水和 物、その溶媒和物、またはそれらいずれかの塩力もなる、前記リードスルー剤に関す る。
[0018] また本発明は、変異により未熟終止コドンが生じた遺伝子から野生型正常タンパク 質を生産させる方法であって、以下の式 (VI)〜(X)：
[化 6]
Figure imgf000008_0001
[式中、 R1は C アルキルであり； R2および R3は、独立して、水素原子、 C アル
1 - 10 1 - 10 キルおよび C アルキルカルボ-ルカ 選択され; R4および R5は、独立して、水素
1 - 10
原子および C アルキルから選択され; X1は、ヒドロキシ、アミ入 C アルコキシ、
1 - 10 1 - 10
C ァノレキノレアミノまたはジ（C ァノレキノレ）ァミノである]
1 - 10 1 - 10
Figure imgf000009_0001
[式中、 X、Xおよび Xは、独立して、ヒドロキシ、アミ入 C アルコキシ、 C ァ
1-10 1-10 ルキルァミノおよびジ (C アルキル)ァミノ力 選択され; R6は、水素原子または C
1-10
ァノレキノレである]
-10
[化 8]
Figure imgf000009_0002
[χ5、 χ6および χ7は、独立して、ヒドロキシ、アミ入 c アルコキシ、 c アルキル
1-10 1-10 ァミノおよびジ (C アルキル)アミノカも選択され; R7は、水素原子または C アル
1-10 1-10 キノレである]
[化 9]
Figure imgf000009_0003
[X8は、ヒドロキシ、アミ入 C アルコキシ、 C アルキルァミノおよびジ（C ァ
1-10 1-10 1-10 ルキル)ァミノであり； R8および R9は、独立して、水素原子または C アルキルであり
1-10
； R1Gおよび R11は、独立して、水素原子、 C アルキルおよび C アルキルカルボ
1-10 1-10
二ルカ 選択される]
[化 10]
〇 R12 R14 〇
R13 (X) [X9および X1。は、独立して、ヒドロキシ、アミ入 c アルコキシ、
1 - 10 c アルキルアミ
1 - 10
ノおよびジ (C アルキル)ァミノ力 選択され; R12、 R13および R14は、独立して、水
1 - 10
素原子、 C アルキル、 C アルキルカルボニルおよび—CH COX11から選択さ
1 - 10 1 - 10 2 れ; X11は、ヒドロキシ、アミ入 C アルコキシ、 ルキルァミノおよびジ（
1 - 10 c ア
1 - 10 C 1 - 10 アルキル）ァミノである]
のいずれかの式により表される化合物または医薬として許容なその塩の存在下でリボ ソームによる翻訳が行われる、前記方法に関する。
[0019] さらに本発明は、ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療または予防に使用するため の医薬組成物であって、前記 (VI)〜 (X)の 、ずれかの式により表される化合物また は医薬として許容なその塩を有効成分として含む、前記医薬組成物に関する。
発明の効果
[0020] 本発明により、変異により形成される未熟終止コドンをリードスルーさせる化合物、 該化合物からなるリードスルー剤、該化合物を含む医薬組成物を提供できる。また、 該化合物、リードスルー剤、または医薬組成物の使用により、そのような未熟終止コド ンが生じた遺伝子から野生型正常タンパク質を生産でき、ひいては、未熟終止コドン を生じるナンセンス変異に起因する疾患の治療または予防を実施できる。
図面の簡単な説明
[0021] [図 1]化合物 1〜5がいずれも、対照である生理食塩水溶液 (Saline)と比較して、著 しいリードスルー活性を示したことを説明する図である。図中、化合物 1〜5をそれぞ れ I、 II、 III、 IVおよび Vと表示し、リードスルー活性を Readthrough Efficiencyと 表示する。（実施例 1)
発明を実施するための最良の形態
[0022] 本発明の一つの側面によれば、変異により未熟終止コドンが生じた遺伝子から野 生型正常タンパク質を生産させる方法であって、以下の式 (I)〜(V)：
[化 11]
Figure imgf000011_0001
[式中、 R1は C アルキルであり； R2および R3は、独立して、水素原子および置換
1 - 10
基を有していてもよい C アルキル力も選択され; R4および R5は、独立して、水素原
1 - 10
子および C アルキル力も選択され; X1は、カルボキシ、置換基を有していてもよい
1 - 10
低級アルコキシカルボ-ル、
Figure imgf000011_0002
、てもよ 、力ルバモイルまたは置換基を 有して 、てもよ 、ヒドラジノカルボ-ルである]
[化 12]
Figure imgf000011_0003
[式中、 X2、 X3および X4は、独立して、カルボキシ、置換基を有していてもよいアルコ キシカルボ-ル、置換基を有して!/、てもよ 、力ルバモイルまたは置換基を有して！/、て もよいヒドラジノカルボニルであり； R6は、水素原子または置換基を有していてもよい C アルキルであり； Aは、置換基を有していてもよいアルキレンである]
[化 13]
Figure imgf000011_0004
[X5および X。は、独立して、独立して、カルボキシ、置換基を有していてもよいアルコ キシカルボ-ルおよび置換基を有して!/、てもよ!/、力ルバモイルカ 選択され; R7は、 水素原子または置換基を有して 、てもよ 、C アルキルであり； R8は、置換基を有
1 - 10
して 、てもよ 、ァミノ、置換基を有して!/、てもよ 、c アルキルまたは置換基を有し ていてもよい C ァルケ-ルである]
1-10
[化 14]
Figure imgf000012_0001
(I )
[R9、 R1C>および R13は、独立して、水素原子、または置換基を有していてもよい C
-10 アルキルであり； R11および R12は独立して、水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル、芳香族化合物で置換されているカルボ-ルである力、または R11と R12と
10
が一緒になつて二重結合を形成し = CR17R18となることもあり、 R17および R18は、独 立して、水素原子、 C アルキル、および置換基を有して 、てもよ 、力ルバモイルァ
1-10
ルキルカ 選択される]
[化 15]
Figure imgf000012_0002
[X7および X8は、独立して、カルボキシ、置換基を有していてもよいアルコキシカルボ -ルまたは置換基を有して 、てもよ 、力ルバモイルカも選択され; R14、 R15および R16 は、独立して、水素原子、または置換基を有して 、てもよ 、C アルキルである]
1-10
のいずれかにより表される化合物または医薬として許容なその塩の存在下でリボソ一 ムによる翻訳が行われる、前記方法が提供される。
上記一般式 (I)中、 R1で示される C アルキルまたは置換基を有してもよ!、C
1-10 1-10 アルキルは、好ましくは C アルキルまたは置換基を有してもよい C アルキル、よ
1-8 1-8
り好ましくは C アルキルまたは置換基を有してもよい C アルキル、さらに好ましく
1-6 1-6
は置 C アルキルまたは換基を有してもよい C アルキルであり、その好適な例とし
1-4 1-4
ては、例えば、メチル、ェチル、プロピル、ブチル等の低級アルキルが挙げられ、特 にイソプロピル、イソブチルが好ましい。 [0024] R2、 R3で示される置換基を有していてもよい C アルキルは、好ましくは置換基を
1 - 10
有して!/、てもよ!/、C アルキル、より好ましくは置換基を有して!/、てもよ!/、C アルキ
1 -8 1 -6 ル、さらに好ましくは置換基を有していてもよい C アルキルであり、その好適な例と
1 -4
しては、メトキシカルボニルメチル、メトキシカルボニルェチル、メトキシカルボニルプ 口ピル、メトキシカルボニルブチル、エトキシカルボニルメチル、エトキシカルボニルェ チル、エトキシカルボ-ルプロピル、エトキシカルボ-ルブチル等の低級アルコキシ カルボ-ル低級アルキルが挙げられる。
[0025] R4、R5で示される C アルキルまたは置換基を有してもよい C アルキルは、好
1—10 1—10
ましくは C アルキルまたは置換基を有してもよい C アルキル、より好ましくは C
1 -8 1 -8 1 -6 アルキルまたは置換基を有してもよい C アルキル、さらに好ましくは置 C アルキ
1 -6 1 -4 ルまたは換基を有してもょ 、c アルキルであり、その好適な例としては、例えば、メ
1 -4
チル、ェチル、プロピル、ブチル等の低級アルキルが挙げられ、特にイソプロピル、ィ ソブチルが好ましい。
[0026] X1で示される置換基を有して!/、てもよ!/、アルコキシカルボ-ルの好適な例としては 、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロピルカルボニル、ブトキシカノレボニノレ 等の低級アルキルカルボ-ルが挙げられ、置換基を有して ヽてもよ ヽカルバモイル および置換基を有して 、てもよ 、ヒドラジノカルボ-ルの置換基は、一置換でも二置 換でも全置換でもよぐ例えばメチル、ェチル、プロピル、ブチル等の低級アルキル 基が挙げられる。
[0027] 上記一般式 (Π)中、 X2、 X3および X4で示される置換基を有して 、てもよ 、アルコキ シカルボ-ルの好適な例としては、メトキシカルボ-ル、エトキシカルボ-ル、プロピ ルカルボニル、ブトキシカルボ-ル等の低級アルキルカルボ-ルが挙げられ、置換 基を有して 、てもよ 、力ルバモイルおよび置換基を有して 、てもよ 、ヒドラジノカルボ -ルの置換基としては、一置換でも二置換でも全置換でもよぐ例えばメチル、ェチ ル、プロピル、ブチル等の低級アルキル基が挙げられる。
[0028] R6で示される置換基を有していてもよい C アルキルは、好ましくは置換基を有し
1 - 10
て！/、てもよ!/、C アルキル、より好ましくは置換基を有して!/、てもよ!/、C アルキル、
1 -8 1 -6 さらに好ましくは置換基を有していてもよい C アルキルであり、その好適な例として は、メチル、ェチル、プロピル、ブチル等の低級アルキルが挙げられる。
Aで示される置換基を有していてもよいアルキレンの好適な例としては、メチレン、ェ チレン、プロピレン等の低級アルキレンが挙げられる。
[0029] 上記一般式 (ΠΙ)中、 X5および X6で示される置換基を有して 、てもよ 、アルコキシ カルボ-ルの好適な例としては、メトキシカルボ-ル、エトキシカルボ-ル、プロピル カルボニル、ブトキシカルボ-ル等が挙げられ、置換基を有していてもよいカルバモ ィルの置換基としては、一置換でも二置換でもよぐ例えばメチノレ、ェチノレ、プロピル 、ブチル等の低級アルキル基が挙げられる。
[0030] R7で示される置換基を有していてもよい C アルキルは、好ましくは置換基を有し
1 - 10
ていてもよい C アルキル、より好ましくは置換基を有していてもよい C アルキル、
1 -8 1 -6 さらに好ましくは置換基を有していてもよい C アルキルであり、その好適な例として
1 -4
は、メチル、ェチル、プロピル、ブチル等の低級アルキルが挙げられる。
R8で示される置換基を有して 、てもよ 、ァミノの置換基の好適な例としては、メチル、 ェチルプロピル、ブチル等の低級アルキル；ヒドロキシメチル、ヒドロキシェチル、ヒド ロキシプロピル、ヒドロキシブチル等のヒドロキシ低級アルキル;メトキシメチル、メトキ シェチル、メトキシプロピル、メトキシブチル等の低級アルコキシアルキル等の置換基 が挙げられる。置換基を有して 、てもよ 、C アルキルまたは置換基を有して 、て
1 - 10
もよい C ァルケ-ルの置換基は、好ましくは置換基を有していてもよい C アル
1 - 10 1 -8 キルまたは C ァルケ-ル、より好ましくは置換基を有していてもよい C アルキル
1 -8 1 -6 または C ァルケ-ル、さらに好ましくは置換基を有していてもよい C アルキルま
1 -6 1 -4
たは C ァルケ-ルであり、その好適な例としては、ヒドロキシまたはメトキシ、ェトキ
1 -4
シ等のアルコキシが挙げられる。
[0031] 上記一般式 (IV)中、 R9、 R10および R13で示される置換基を有していてもよい C
1 - 10 アルキルは、好ましくは置換基を有していてもよい C アルキル、より好ましくは置換
1 -8
基を有していてもよい C アルキル、さらに好ましくは置換基を有していてもよい C
1 -6 1 - アルキルであり、その好適な例としては、メチル、ェチルプロピル、ブチル等の低級
4
アルキル；ヒドロキシメチル、ヒドロキシェチル、ヒドロキシプロピル、ヒドロキシブチル等 のヒドロキシ低級アルキル;メトキシメチル、メトキシェチル、メトキシプロピル、メトキシ ブチル等の低級アルコキシアルキル等が挙げられる。
[0032] R11および R12で示される置換基を有していてもよい C アルキルは、好ましくは置
1 - 10
換基を有して 、てもよ 、C アルキル、より好ましくは置換基を有して 、てもよ!/、c
1 -8 1 - 6 アルキル、さらに好ましくは置換基を有していてもよい C アルキルであり、その好適
1 -4
な例としては、カルボキシメチル、カルボキシェチル、カルボキシプロピル、カルボキ シブチル等のカルボキシ低級アルキル、メトキシカルボ-ルメチル、メトキシカルボ- ルェチル、メトキシカルボキシプロピル、メトキシカルボ-ルブチル等の低級アルコキ シ低級アルキルが挙げられる。芳香族化合物で置換されて!ヽるカルボニルの好適な 例としては、フエ-ルカルポ-ル、ナフチルカルボ-ルが挙げられる。
[0033] R17および R18で示される C アルキルは、好ましくは C アルキル、より好ましくは
1 - 10 1 -8
C アルキル、さらに好ましくは C アルキルであり、その好適な例としては、メチル
1 -6 1 -4
、ェチル、プロピル、ブチル等の低級アルキルが挙げられる。置換基を有していても よい力ルバモイルアルキルの好適な例としては、メチルカルバモイルメチル、ェチル 力ルバモイルメチル、プロピル力ルバモイルメチル、ブチルカルバモイルメチル等の 低級アルキル力ルバモイル低級アルキル、シクロプチルカルバモイルメチル、シクロ ペンチルカルバモイルメチル、シクロへキシルカルバモイルメチル等のシクロ C ァ
3- 8 ルキルカルバモイルメチルが挙げられる。
[0034] 上記一般式 (V)中、 X7および X8で示される置換基を有して 、てもよ 、アルコキシ力 ルポ-ルの好適な例としては、メトキシカルボ-ル、エトキシカルボ-ル、プロピル力 ルボニル、ブトキシカルボ-ル等が挙げられ、置換基を有していてもよい力ルバモイ ルの置換基としては、一置換でも二置換でもよぐ例えばメチル、ェチル、プロピル、 ブチル等の低級アルキル基が挙げられる。
[0035] R14、 R15および R16で示される置換基を有していてもよい C アルキルは、好ましく
1 - 10
は置換基を有して 、てもよ 、C アルキル、より好ましくは置換基を有して 、てもよ!/ヽ
1 -8
C アルキル、さらに好ましくは置換基を有していてもよい C アルキルであり、その
1 -6 1 -4
好適な例としては、メチル、ェチル、プロピル、ブチル等の低級アルキル、カルボキシ メチル、カルボキシェチル、カルボキシプロピル、カルボキシブチル等のカルボキシ 低級アルキル；低級アルキルカルボ-ル低級アルキル；置換基を有して!/、てもよ!/、力 ルバモイル低級アルキルが挙げられる。
上記方法にぉ 、て用いられる好ま 、ィ匕合物として、以下の式 (VI) · (X)
[化 16]
Figure imgf000016_0001
I)
[式中、 R1は C アルキルであり； R2および R3は、独立して、水素原子、 C アル
-10 -10 キルおよび C アルキルカルボ-ルカ 選択され; R4および R5は、独立して、水素
-10
原子および C アルキルから選択され; X1は、ヒドロキシ、アミ入 C アルコキシ、
1-10 1-10
C ァノレキノレアミノまたはジ（C ァノレキノレ）ァミノである]
[化 17]
Figure imgf000016_0002
[式中、 X2、X°および X4は、独立して、ヒドロキシ、アミ入 C アルコキシ、 C ァ
1-10 1-10 ルキルァミノおよびジ (C アルキル)ァミノ力 選択され; R6は、水素原子または C
1-10
ァノレキノレである]
-10
[化 18]
Figure imgf000016_0003
[χ5、 χ6および χ7は、独立して、ヒドロキシ、アミ入 c アルコキシ、 c アルキル
1-10 1-10 ァミノおよびジ (C —アルキル)ァミノから選択され; R7は、水素原子または C _アル
-10 -10 キノレである] [化 19]
Figure imgf000017_0001
[x8は、ヒドロキシ、アミ入 C アルコキシ、 C アルキルァミノおよびジ（C ァ
1-10 1-10 1-10 ルキル)ァミノであり； R8および R9は、独立して、水素原子または C アルキルであり
1-10
； R1Gおよび R11は、独立して、水素原子、 C アルキルおよび C アルキルカルボ
1-10 1-10
二ルカ 選択される]
[化 20]
R14 〇
Figure imgf000017_0002
R13 (X)
[X9および X1。は、独立して、ヒドロキシ、アミ入 c アルコキシ、 c アルキルアミ
1-10 1-10
ノおよびジ (C アルキル)ァミノ力 選択され; R12、 R13および R14は、独立して、水
1-10
素原子、 C アルキル、 C アルキルカルボニルおよび—CH COX11から選択さ
1-10 1-10 2 れ; X11は、ヒドロキシ、アミ入 C アルコキシ、 c アルキルァミノおよびジ（C
1-10 1-10 1-10 アルキル）ァミノである]
のいずれかの式により表される化合物を挙げることができる。
[0037] 上記方法にぉ 、て用いられるより好ま ヽ具体的な化合物として下表のような化合 物を挙げることができる。
[0038] [表 1]
5
7 11
Figure imgf000018_0001
ここで、野生型正常タンパク質というときには、正常な遺伝子がコードするアミノ酸配 列からなるタンパク質、および該アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列力もなる タンパク質であって正常な遺伝子がコードするアミノ酸配列からなるタンパク質と同じ 機能を有するタンパク質が含まれる。正常な遺伝子がコードするアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質であって正常な遺伝子がコードするァミノ 酸配列からなるタンパク質と同じ機能を有するタンパク質は、該機能を有する限りに おいて完全長のタンパク質でなくともよい。より具体的には、正常な遺伝子がコードす るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列力もなるタンパク質は、正常な遺伝子 力 Sコードするアミノ酸配列と少なくとも 80%以上、好ましくは 85%以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列力もなるタンパ ク質を意味し、例えば、正常な遺伝子がコードするアミノ酸配列において、置換、欠 失、挿入、付加といったアミノ酸の変異や修飾されたアミノ酸が存するアミノ酸配列か らなるタンパク質を意味する。変異アミノ酸や修飾されたアミノ酸の数は、例えば 1〜1 00個、好ましくは 1〜30個、より好ましくは 1〜20個、さらに好ましくは 1〜10個、特 に好ましくは 1〜数個である。
[0040] 本発明の上記側面において、本発明の方法は哺乳類における生体内で行われて もよぐその場合前記化合物は前記哺乳類に投与されてもよい。本発明の 1つの態様 において、前記哺乳類がナンセンス変異型遺伝性疾患の患者であって、ナンセンス 変異型遺伝性疾患の処置方法として行われる。
[0041] ここで、ナンセンス変異型遺伝性疾患とは、遺伝子上の点変異、欠損、挿入等によ り生じる遺伝子の中途の終止コドン (未熟終止コドン)のために正常な機能を持つタ ンパク質の発現が阻害されることに起因する力、または、未熟終止コドンを含む mRN Aの分解に伴ないタンパク質の発現が阻害されることに起因する疾患である。前記ナ ンセンス変異型遺伝性疾患は、特には限定されないが、例えば、筋ジストロフィー、 デュシャンヌ型筋ジストロフィー、多発性硬化症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着 症、アルッノ、イマ一病、ティーサックス病、神経組織変性およびパーキンソン病等の 中枢神経疾患、慢性関節リウマチおよび対宿主性移植片病等の自己免疫疾患、関 節炎等の炎症性疾患、血友病、フォンヴイレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サ ラセミア、家族性赤血球増加症および腎結石等の血液疾患、骨形成不全および肝 硬変等の膠原病、並びに、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハ 一ラー疾患、家族性コレステロール血症、小脳運動失調、結節性硬化症、免疫不全 、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、 アミロイド一シス、ァテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、 甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン ピック病、マルファン症候群や 癌等が挙げられ、癌、例えば p53遺伝子等のサブレッサー遺伝子のナンセンス変異 に関連する癌には、肺癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、腎癌、脾臓癌、肝臓癌、前 立腺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、皮膚癌および脳腫瘍等、癌種を問わずいずれも含 まれる。具体的なナンセンス変異型遺伝性疾患としては、筋ジストロフィーが挙げられ る。
[0042] 本発明の上記側面において、上記化合物は、その他の化合物と共に使用されても よぐまた上記化合物より選ばれる 2以上の化合物の混合物として使用されてもよい。
[0043] 本発明の別の側面によれば、ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療または予防に 使用するための医薬組成物であって、上記式 (I)〜 (V)の 、ずれかの式により表され る化合物または医薬として許容なその塩を有効成分として含む、前記医薬組成物が 提供される。
[0044] 上記医薬組成物に含まれる好ま 、ィ匕合物として、上記式 (VI)〜 (X)の 、ずれか の式により表される化合物または医薬として許容なその塩を挙げることができる。
[0045] 上記医薬組成物に含まれるより好ましい化合物として、上記表に示したィ匕合物を挙 げることができる。
[0046] 本発明の上記側面において、本発明の医薬組成物は医薬として許容な単体また は賦形剤を含んでいてもよぐまた当該医薬組成物に使用される上記化合物の量は 治療有効量であれば特には限定されない。ここで、前記ナンセンス変異型遺伝性疾 患は、特には限定されないが、例えば、筋ジストロフィー、デュシャンヌ型筋ジストロフ ィー、多発性硬化症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、ティ サックス病、神経組織変性およびパーキンソン病等の中枢神経疾患、慢性関節リ ゥマチおよび対宿主性移植片病等の自己免疫疾患、関節炎等の炎症性疾患、血友 病、フォンヴイレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、家族性赤血球増加 症および腎結石等の血液疾患、骨形成不全および肝硬変等の膠原病、並びに、神 経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾患、家族性コレステロ ール血症、小脳運動失調、結節性硬化症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線 維症、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイド一シス、ァテローム性 動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥 満、糖尿病、ニーマン ピック病、マルファン症候群や癌等が挙げられ、癌、例えば P
53遺伝子等のサブレッサー遺伝子のナンセンス変異に関連する癌には、肺癌、結 腸直腸癌、胃癌、食道癌、腎癌、脾臓癌、肝臓癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、卵巣 癌、皮膚癌および脳腫瘍等、癌種を問わずいずれも含まれる。具体的なナンセンス 変異型遺伝性疾患としては、筋ジストロフィーが挙げられる。
[0047] 本発明の上記側面の医薬組成物は、上記化合物の他に、その他の化合物を活性 成分として含んで 、てもよく、また 2以上の上記化合物の混合物を含んで 、てもよ ヽ
[0048] 本明細書における「医薬として許容な塩」とは、医薬品として使用されうる塩であれ ば特に限定されない。本発明化合物が塩基と形成する塩としては、ナトリウム、力リウ ム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基との塩;メチルァミン、ェチ ルァミン、エタノールァミン等の有機塩基との塩；リジン、オル-チン等の塩基性ァミノ 酸との塩およびアンモ-ゥム塩が挙げられる。当該塩は、酸付加塩であってもよぐか 力る塩としては、具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸 等の鉱酸；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シユウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレ イン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クェン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の 有機酸；ァスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との酸付加塩が挙げられる。
[0049] 更に、本発明化合物には、水和物、医薬として許容な各種溶媒和物や結晶多形等 も含まれる。
[0050] 本発明の医薬組成物は、種々の剤形、例えば、経口投与のためには、錠剤、カブ セル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、ェ キス剤、エリキシル剤とすることができ、非経口剤としては、例えば、皮下注射剤、静 脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤等の注射剤;経皮投与または貼付剤、 軟膏またはローション；口腔内投与のための舌下剤、口腔貼付剤;ならびに経鼻投与 のためのエアゾール剤とすることができる力 これらには限定されない。これらの製剤 は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。本発 明の 1つの態様において、筋ジストロフィーの処置のために本発明の医薬組成物を 注射剤 (例えば、筋肉への直接投与のための筋肉内注射剤）として投与することがで きる。
[0051] 当該医薬組成物は、一般に用いられる各種成分を含みうるものであり、例えば、 1 種以上の薬学的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤 、甘味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、 結合剤、安定剤、コーティング剤等を含みうる。また本発明の医薬組成物は、持続性 または徐放性剤形であってもよ!/、。
[0052] 当該医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与 形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質 (体重、年齢、病状および他の医薬の使 用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な 用量は、例えば対象の体重 lkgあたり約 0. 01 μ g乃至 lOOmg程度、好ましくは約 0 .： g乃至 lmg程度の範囲であることが好ましい。し力しながら、当該分野において よく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行 うことができる。上記投与量は 1日 1回乃至数回に分けて投与することができ、数日ま たは数週間に 1回の割合で間欠的に投与してもよ 、。
[0053] 当該医薬組成物は、事前に患者から採取した生体試料に含まれる所望の遺伝子 における未熟終止コドンの有無を検査し、未熟終止コドンが検出された生体試料が 由来した患者に投与することができる。生体試料は、核酸が含まれる限りにおいてい ずれでもよぐ細胞、血液、髄液、気管支肺胞洗浄液、痰、または他の体液、あるい は生検組織等を例示できる。生体試料カゝら核酸試料を調製して用いることもできる。 核酸試料の調製は、自体公知の核酸調製法により実施できる。核酸試料は、 DNA であっても RNAであってもよい。調製した核酸試料は直接検出に使用してもよぐあ るいは分析前に所望の領域を PCRまたはその他の増幅法を用いることにより酵素的 に増幅してもよい。未熟終止コドンの検出は、サザンブロット、ポリメラーゼ連鎖反応（ PCR)、ショートタンデムリピート（STR)、または制限酵素断片長多型 (RFLP)等の、 公知の遺伝子変異解析法により実施できる。検出方法は上記例示した方法に限定さ れず、未熟終止コドンを検出し得る方法である限りにおいて、いずれを使用することも できる。また、生体試料中の所望の遺伝子由来の mRNA量の測定を行い、該 mRN A量が健常人由来の生体試料中の該遺伝子由来の mRNA量と比較して減少して ヽ ることを検出することにより未熟終止コドンの存在を検出することができる。 mRNA量 の測定は、公知の分析方法、例えば、ノーザンプロットにより実施できる。
[0054] 当該医薬組成物の投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択すること ができる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非 経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への 投与を挙げることができる。あるいは経口経路で投与することができる。さらに、経粘 膜投与または経皮投与を実施することができる。
[0055] さらに本発明の別の側面によれば、リードスルー活性を有する化合物のアツセィ方 法であって、
a)以下のもの： i)プロモーター、 ii)当該プロモーターの下流に位置する第 1の翻訳開 始コドンおよび第 1のレポーター遺伝子、 iii)当該第 1のレポーター遺伝子の下流に 位置する第 2の翻訳開始コドンおよび第 2のレポーター遺伝子、 iv)当該第 1のレポ一 ター遺伝子および第 2の翻訳開始コドンの間に位置し、ナンセンス変異型遺伝性疾 患の原因遺伝子由来の未熟終止コドンを含む配列、および V)当該第 2のレポーター 遺伝子の下流に位置する翻訳終止コドン、を含むベクターを導入した宿主細胞また は組み替え動物を調製する工程；
b)前記宿主細胞または組み替え動物に、試験化合物を投与する工程;および c)第 1のレポーター遺伝子に対する第 2のレポーター遺伝子の発現量の比を、試験 化合物の添加時および非添加時において比較する工程
を含む、前記アツセィ方法が提供される。ここで、第 1のレポーター遺伝子および第 2 のレポーター遺伝子は、例えば、 /3 ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝 子、 GFP (Green Fluorescent Protein)遺伝子、 CAT (Chroramphenicol Ac etyl Transferase)遺伝子等カゝら選択され、好ましくは、 ガラクトシダーゼ遺伝 子およびルシフェラーゼ遺伝子が使用される。本発明の 1つの態様において、第 1の レポーター遺伝子として —ガラクトシダーゼ遺伝子、第 2のレポーター遺伝子として ルシフェラーゼ遺伝子が使用される。
[0056] ここで、リードスルーとは、リボソームが未熟終止コドンを読み越え翻訳をする、また は、未熟終止コドンを含む mRNAの分解を抑制することを意味する。
[0057] 本発明の上記の側面におけるナンセンス型疾患の原因遺伝子由来の未熟終止コ ドンを含む配列は、リーディングフレーム中に終止コドン (TAA、 TAGまたは TGA) を含む配列であれば特に限定されず、配列の長さとしては、 20〜150bp程度の配列 が好ましい。 1つの態様において、当該配列は、ナンセンス変異型遺伝性疾患のヒト および動物（疾患モデル動物を含む）の未熟終止コドンを含む配列を含む配列であ つてもよく、例えば、 mdxマウスのジストロフィン遺伝子の未熟終止コドンを含む遺伝 子を使用してもよい。
[0058] プロモーターとしては、例えば、 CMVプロモーター、 13ーァクチンプロモーター、 S V40プロモーター、 CMVZ JS—ァクチンハイブリッドプロモーター等が使用されうる 。好ましくは、プロモーターとして CMVZ JS—ァクチンハイブリッドプロモーターが使 用される。
[0059] 本発明に係るアツセィ方法は、上記ベクターを導入した宿主細胞または組み替え 動物を使用して行われうる。本発明の上記側面の 1つの態様において、前記アツセィ 方法は遺伝子組み替えマウスを用いて行われうる。宿主細胞または組み替え動物へ の上記ベクターの導入は、遺伝子組み替えの技術分野における当業者に既知の方 法に基づ 、て行うことができる。
[0060] 本発明の別の側面によれば、上記式 (I)〜 (V)のいずれかの式により表される化合 物からなる、ナンセンス変異により形成された未熟終止コドンのリードスルー剤が提供 される。
[0061] ナンセンス変異により形成された未熟終止コドンのリードスルー剤とは、該未熟終止 コドンのリードスルーを起こすまたは促進する薬剤を意味する。
[0062] 当該リードスルー剤として、上記式 (VI)〜 (X)のいずれかの式により表される化合 物からなるリードスルー剤を挙げることができる。
[0063] 当該リードスルー剤として、上記表に示したィ匕合物をより好ましく挙げることができる 実施例 1
[0064] 本発明は以下の実施例により説明されるが、当該実施例は本発明を限定的に解釈 されることを意図するものではな 、。
[0065] 1.試薬
以下に示す 5つの化合物を購入により入手し、そのリードスルー活性にっ 、てアツ セィを行った。
[0066] 化合物 l : ChemBridge Corp. (米、カリフォルニア州）より購入；
[化 21] H
Figure imgf000025_0001
[0067] ィ匕合物 2 : Maybridge (Fisher scientific International Inc.、英国）より購入
[化 22]
Figure imgf000025_0002
[0068] 化合物 3 :Nanosyn Inc. (米、カリフォルニア州）より購入;
[化 23]
Figure imgf000025_0003
[0069] 化合物 4 :Nanosyn Inc. (米、カリフォルニア州）より購入；および
Figure imgf000026_0001
[0070] 化合物 5 : Nanosyn Inc. (米、カリフォルニア州）より購入。
[化 25]
Figure imgf000026_0002
[0071] 2.アツセィ系の構築
1)発現プラスミドの構築
a)ルシフヱラーゼ遺伝子の修正
β ガラクトシダーゼ遺伝子とルシフェラーゼ遺伝子を連結するために制限酵素サ イト（Pst I)をルシフェラーゼの開始コドンの前に付加するために下記プライマーを 作成した。
[0072] フォヮ 1 ~~卜ゾフィマ1 ~~： 5 ― CCCAALJC I ΓΟ F CALJ― atggaagacgccaaaaacataa ag— 3 ' (配列番号 1)
リノ ースプライマー： 5 '― cccTTCGAA— gtactcagcgtaagtgatgtccacc― 3 ' (酉己 列番号 2)
[0073] PCR断片クローユングにはルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミド DNAである p GL3 - Basic Vector (Promega、米国）の Hind IIIサイトと Nsp Vサイトを利用し た。 PCRは、ァニール温度 60°C、伸長速度 30秒、 35サイクルの条件で実施した。 D NAポリメラーゼは KOD Plus DNA Polymerase (東洋紡）を使用した。その結 果、所定の増幅 DNA (約 0. 17kb)が検出された。
[0074] こうして得られた PCR産物を Hind IIl/Nsp Vで切断し、 pGL3— Basic Vecto rの Hind IIl/Nsp Vサイトにライゲーシヨンした。得られたベクターを使用して、 E . coli JM109を形質転換し、その後プラスミド DNA抽出を行った。得られたプラスミ ド DNAを Hind IIl/Nsp Vで切断し、所定のサイズの DNA断片が検出されたプ ラスミドを選択した。選択したプラスミドについては DNAシークェンス解析を行い、配 列に所定の修正が施されて 、ることを確認した。
[0075] b)ガラクトシダーゼ遺伝子の修飾
β ガラクトシダーゼ遺伝子の終止コドンを除去し、終止コドン (ΤΑΑ)を含むナン センス変異配列を挿入し、さらにルシフェラーゼ遺伝子と連結するための Pst Iサイト を付加するために、プライマーとして下記の配列、およびその相補配列のオリゴ DN Aを合成した。
CTGGTGTC AAAAA - AAAGAGCAATAAAATGGC CTGCAG 3 ' (配 列番号 3)
[0077] 上記配列をァニール後、 j8— galactosidase Control Vector (Promega、米国 ) (約 2. 7kb)の EcoRlZPst Iサイトにライゲーシヨンした。得られたベクターを使用 して、 E. coli JM109を形質転換し、その後プラスミド DNA抽出を行った。得られた プラスミド DNAを Eco Rl/Pst Iで切断し、所定のサイズの DNA断片が検出され たプラスミドを選択した。選択したプラスミドにつ ヽては DNAシークェンス解析を行 ヽ 、 j8—ガラクトシダーゼ塩基配列中の 6814塩基目の Eco RIと 4169塩基目の Pst Iの間に合成 DNA断片が挿入された塩基配列であることを確認した。
[0078] 確認後のプラスミドを Eco RIで切断し、 j8— galactosidase Control Vector ( 約 3. 7kb)の EcoRIサイトにライゲーシヨンし、 E. coli JM 109を形質転換後、プラス ミド DNA抽出を行った。得られたプラスミド DNAを Hind Ill/Pst Iで切断し、所定 の方向で連結されたプラスミドを選択した。
[0079] c)修正 /3 ガラクトシダーゼ遺伝子と修正ルシフェラーゼ遺伝子の連結
修正 β—ガラタトシダーゼ遺伝子を含むプラスミド (上記工程 bで調製)を修正ルシ フェラーゼ遺伝子を含むプラスミド（上記工程 aで調製)の Hind Ill/Pst Iサイトに ライゲーシヨンした。 E. coli JM109を形質転換後、プラスミド DNA抽出を行った。 得られたプラスミド DNAを Hind Ill/Pst I/Bam HIで切断し、 目的のサイズの DNA断片が検出されたプラスミドを選択した。 [0080] d) pCAGGSへの連結
工程 cで得られたプラスミドを Hind Ill/Xba Iで切断後、 Blunting処理を行った DNA断片と、 pCAGGS (オリエンタル酵母）を Eco RIで切断し Blunting処理後、 脱リン酸処理したプラスミド DNAをライゲーシヨンした。 E. coli DH5 aを形質転換 後、プラスミド DNA抽出を行った。得られたプラスミド DNAを Sal I/Eco RIで切 断し、所定のサイズ（1. 8kb、 3. Okb、 5. Okb)の DNA断片が検出されたプラスミド を選択した。選択したプラスミドを用いて Blunting部分の DNAシークェンス解析を 行い、所定の塩基配列であることを確認した。
[0081] e)終止コドンとして「TGA」または「TAG」を含む発現プラスミドの構築
β ガラクトシダーゼ遺伝子の修飾の際に使用したオリゴ DNA (配列番号 3)に代 わりに以下の配列およびその相補配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ使用して、上 記 a)〜d)の工程と同様の手法により、終止コドンとして「TGA」を含む発現プラスミド (配列番号 4を使用）および終止コドンとして「TAG」を含む発現プラスミド (配列番号 5を使用）を構築した。
CTGGTGTC AAAAA - AAAGAGCAATGAAATGGC CTGCAG 3 ' (配 列番号 4)
CTGGTGTC AAAAA AAAGAGCAATAGAATGGC CTGCAG 3 ' (配 列番号 5)。
[0083] 2)トランスジエニックマウスの作製
トランスジェニックマウスは Gordonらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci.第 77卷、第 7380〜7384頁）に基づいて実施した。採卵用の雌マウス（C57BLZ6J Jcl系統） を過剰排卵させ、同系統マウスと交配させた。その後、採取した受精卵 (前核期胚） の雄性前核に調製した DNA断片（終止コドンが「TAA」のもの）を顕微注入した。当 該受精卵を、その後偽妊娠の雌 (CD— l (ICR)系統)マウスの卵管内に移植し、自 然分娩させた。
[0084] 3.リードスルー活性のアツセィ 上記の方法により作製したトランスジエニックマウスに、上記化合物 1〜5の生理食 塩水溶液 (大塚製薬、 100 gZlOO /z L)を、 24時間毎に 7日間にわたり腹部皮下 に注射した。前記マウスを 8日目にエーテル過剰吸引により安楽死させ、大腿部と脛 部の骨格筋を摘出し、眼科用ハサミで細片化した後、湿重量の 3倍量の Reporter Lysis Buffer (Promega、米国）を加え、ガラス細片と共にヒスコトロン（日音理科器 械製作所）により組織を破壊した。凍結融解後、遠心上清を 96穴プレートに移し、 Be ta-Glo Assay System (Promega、米国）により j8—ガラクトシダーゼ活性を、 B right -Glo Assay System (Promega、米国）によりルシフェラーゼ活性を、ルミノ メータ (ATTO)で測定した。ルシフェラーゼ活性を統一化するため、 j8—ガラクトシ ダーゼ活性の値でルシフェラーゼ活性の値を割り、 104を掛けた値をリードスルー効 率として表記した。結果を図 1に示す。
[0085] 化合物 1〜5のいずれを投与した系においても、対照（生理食塩水）を大きく上回る リードスルー活性が確認された。
実施例 2
[0086] 筋ジストロフィーモデルマウスへの上記化合物 2の投与効果を検討した。筋ジストロ フィーモデルマウスとして、 mdxマウスを使用した。
[0087] 化合物 2を 4または 400mgZkgZdayの用量で mdxマウスに 7日間強制胃内投与 した後、生化学的および免疫組織化学的な解析を行った。その結果、血清クレアチ ンキナーゼ活性の減少と後肢等の筋肉内におけるジストロフィンの蓄積を確認した。 陽性対照のゲンタマイシン皮下投与群に比べ、化合物 2投与群のほうが良好な結果 を示した。
実施例 3
[0088] 上記化合物 2のマウスにおける副作用を検討した。
[0089] 化合物 2を 4または 400mgZkgZdayの用量で C57BLZ6マウスに 14日間皮下 注射した。投与期間中の体重減少は認められず、聴性脳幹反応による聴力検査や 1 8項目の血清の生化学検査（総タンパク質、アルブミン、ァスパラギン酸トランスフェラ ーゼ、ァラニンアミノトランスフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、 γ—グルタミルトラ ンスぺプチターゼ、クレアチュン、グルコース、トリダリセライド、リン脂質、総コレステロ ール、ナトリウム、カリウム、クロール、カルシウム、無機リン、総ビリルビン、アルブミン zグルコース比）にお 、ても異常値は認められな力つた。
配列表フリーテキスト
配列番号 1：プライマー用に設計されたオリゴ DNA
配列番号 2：プライマー用に設計されたオリゴ DNA
配列番号 3：プライマー用に設計されたオリゴ DNA
配列番号 4：プライマー用に設計されたオリゴ DNA
配列番号 5：プライマー用に設計されたオリゴ DNA

Claims

請求の範囲 変異により未熟終止コドンが生じた遺伝子から野生型正常タンパク質を生産させる 方法であって、以下の式 (I)〜(V)：
[化 1]
Figure imgf000031_0001
）
[式中、 R1は C アルキルであり； R2および R3は、独立して、水素原子および置換
1 - 10
基を有していてもよい C アルキル力も選択され; R4および R5は、独立して、水素原
1 - 10
子および C アルキル力も選択され; X1は、カルボキシ、置換基を有していてもよい
1 - 10
低級アルコキシカルボ-ル、
Figure imgf000031_0002
、てもよ 、力ルバモイルまたは置換基を 有して 、てもよ 、ヒドラジノカルボ-ルである]
[化 2]
Figure imgf000031_0003
[式中、 x2、 x3および x4は、独立して、カルボキシ、置換基を有していてもよいアルコ キシカルボ-ル、置換基を有して!/、てもよ 、力ルバモイルまたは置換基を有して！/、て もよいヒドラジノカルボニルであり； R6は、水素原子または置換基を有していてもよい C アルキルであり； Aは、置換基を有していてもよいアルキレンである]
[化 3]
Figure imgf000031_0004
(in) [x5および x6は、独立して、カルボキシ、置換基を有していてもよいアルコキシカルボ -ルおよび置換基を有していてもよい力ルバモイルカも選択され; R7は、水素原子ま たは置換基を有して 、てもよ 、C アルキルであり； R8は、置換基を有して!/、てもよ
1 - 10
V、ァミノ、置換基を有して!/、てもよ!/、C アルキルまたは置換基を有して!/、てもよ!/ヽ
1 - 10
Figure imgf000032_0001
[R9、 R1Gおよび R13は、独立して、水素原子、または置換基を有していてもよい C
1 - 10 アルキルであり； R11および R12は、独立して、水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル、芳香族化合物で置換されているカルボニルであるカゝ、または R11と R12
1 - 10
とが一緒になつて二重結合を形成し = CR17R18となることもあり、 R17および R18は、独 立して、水素原子、 C アルキル、および置換基を有して 、てもよ 、力ルバモイルァ
1 - 10
ルキルカ 選択される]
[化 5]
R14 R16
(V)
[X7および X8は、独立して、カルボキシ、置換基を有していてもよいアルコキシカルボ -ルおよび置換基を有して 、てもよ 、力ルバモイルカも選択され; R14、 R15および R16 は、独立して、水素原子、または置換基を有して 、てもよ 、C アルキルである]
1 - 10
のいずれかの式により表される化合物または医薬として許容なその塩の存在下でリボ ソームによる翻訳が行われる、前記方法。
野生型正常タンパク質の生産が哺乳類の生体内で行われ、前記化合物を前記哺 乳類に投与することを含む請求項 1に記載の方法。 [3] 前記哺乳類がナンセンス変異型遺伝性疾患の患者である、請求項 2に記載の方法
[4] 前記ナンセンス変異型遺伝性疾患が、筋ジストロフィー、デュシャンヌ型筋ジストロ フィ一、多発性硬化症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テ ィーサックス病、神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植 片病、関節炎、血友病、フォンヴイレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア 、腎結石、骨形成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積 症、ハーラー疾患、家族性コレステロール血症、小脳運動失調、結節性硬化症、家 族性赤血球増加症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステ ロール血症、色素性網膜症、アミロイド一シス、ァテローム性動脈硬化症、巨人症、 小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン ピック病、マルファン症候群、および癌から選択される疾患である、請求項 3に記載の 方法。
[5] 前記ナンセンス変異型遺伝性疾患が筋ジストロフィーである請求項 3に記載の方法
[6] ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療または予防に使用するための医薬組成物で あって、請求項 1に記載の式 (I)〜 (V)の 、ずれかの式により表される化合物または 医薬として許容なその塩を有効成分として含む、前記医薬組成物。
[7] 前記ナンセンス変異型遺伝性疾患が、筋ジストロフィー、デュシャンヌ型筋ジストロ フィ一、多発性硬化症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テ ィーサックス病、神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植 片病、関節炎、血友病、フォンヴイレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア 、腎結石、骨形成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積 症、ハーラー疾患、家族性コレステロール血症、小脳運動失調、結節性硬化症、家 族性赤血球増加症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステ ロール血症、色素性網膜症、アミロイド一シス、ァテローム性動脈硬化症、巨人症、 小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン ピック病、マルファン症候群、および癌から選択される疾患である、請求項 6に記載の 医薬組成物。
[8] 前記ナンセンス変異型遺伝性疾患が筋ジストロフィーである請求項 6に記載の医薬 組成物。
[9] リードスルー活性を有する化合物のアツセィ方法であって、
a)以下のもの： i)プロモーター、 ii)当該プロモーターの下流に位置する第 1の翻訳開 始コドンおよび第 1のレポーター遺伝子、 iii)当該第 1のレポーター遺伝子の下流に 位置する第 2の翻訳開始コドンおよび第 2のレポーター遺伝子、 iv)当該第 1のレポ一 ター遺伝子および第 2の翻訳開始コドンの間に位置し、ナンセンス変異型遺伝性疾 患の原因遺伝子由来の未熟終止コドンを含む配列、および V)当該第 2のレポーター 遺伝子の下流に位置する翻訳終止コドン、を含むベクターを導入した宿主細胞また は組み替え動物を調製する工程；
b)前記宿主細胞または組み替え動物に、試験化合物を投与する工程;および c)第 1のレポーター遺伝子に対する第 2のレポーター遺伝子の発現量の比を、試験 化合物の添加時および非添加時において比較する工程
を含む、前記アツセィ方法。
[10] ナンセンス変異により形成される未熟終止コドンのリードスルー剤であって、請求項 1に記載の式 (I)から (V)のいずれかの式により表される化合物、その水和物、その 溶媒和物、またはそれらいずれかの塩力もなる、前記リードスルー剤。
[11] 変異により未熟終止コドンが生じた遺伝子から野生型正常タンパク質を生産させる 方法であって、以下の式 (VI)〜 (X)：
[化 6]
Figure imgf000034_0001
[式中、 R1は C アルキルであり； R2および R3は、独立して、水素原子、 C アル
1 - 10 1 - 10 キルおよび C アルキルカルボ-ルカ 選択され; R4および R5は、独立して、水素
1 - 10
原子および C アルキルから選択され; X1は、ヒドロキシ、アミ入 C アルコキシ、 c アルキルアミノまたはジ（c アルキル）ァミノである]
[化 7]
Figure imgf000035_0001
[式中、 X、X°および Xは、独立して、ヒドロキシ、アミ入 C アルコキシ、 C ァ
1-10 1-10 ルキルァミノおよびジ (C アルキル)ァミノ力 選択され; R6は、水素原子または C
-10
ァノレキノレである]
-10
[化 8]
Figure imgf000035_0002
[χ5、 χ6および χ7は、独立して、ヒドロキシ、アミ入 c アルコキシ、 c アルキル
1-10 1-10 ァミノおよびジ (C —アルキル)ァミノから選択され; R7は、水素原子または C _アル
-10 -10 キノレである]
Figure imgf000035_0003
[Χ。は、ヒドロキシ、アミ入 C アルコキシ、 c アルキルァミノおよびジ（C ァ
-10 -10 -10 ルキル)ァミノであり； R8および R9は、独立して、水素原子または C アルキルであり
1-10
； R1Gおよび R11は、独立して、水素原子、 C アルキルおよび C アルキルカルボ
1-10 1-10
二ルカ 選択される]
[化 10]
Figure imgf000036_0001
[Xおよび X は、独立して、ヒドロキシ、アミ入 c アルコキシ、 c アルキルアミ
1-10 1-10
ノおよびジ (C アルキル)ァミノ力 選択され; R12、 R13および R14は、独立して、水
1-10
素原子、 C アルキル、 C アルキルカルボニルおよび—CH COX11から選択さ
1-10 1-10 2
れ; X11は、ヒドロキシ、アミ入 C アルコキシ、 c アルキルァミノおよびジ（C
1-10 1-10 1-10 アルキル）ァミノである]
のいずれかの式により表される化合物または医薬として許容なその塩の存在下でリボ ソームによる翻訳が行われる、前記方法。
ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療または予防に使用するための医薬組成物で あって、請求項 11に記載の式 (VI)〜 (X)の 、ずれかの式により表される化合物また は医薬として許容なその塩を有効成分として含む、前記医薬組成物。
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