WO2021182517A1 - －１フレームシフトを誘導するための１本鎖核酸分子及び組成物 - Google Patents

－１フレームシフトを誘導するための１本鎖核酸分子及び組成物 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a single-stranded nucleic acid molecule for inducing a -1 frameshift and a composition containing the single-stranded nucleic acid molecule.
  • a hereditary disease is a disease caused by abnormal expression of a gene, such as a decrease in the expression level of the gene or an increase in the expression level of the gene due to some abnormality in the gene.
  • Hereditary diseases include, for example, muscular dystrophy, cancer, multiple sclerosis, spinal muscle atrophy, Let syndrome, muscular atrophic lateral sclerosis, fragile X syndrome, Prader Willy syndrome, pigmented dry skin disease, porphyrin.
  • nonsense mutant hereditary diseases are diseases caused by inhibition of protein expression due to an early stop codon (PTC) formed by a point mutation on a gene. be.
  • PTC early stop codon
  • PTC can also be caused by frameshift mutations.
  • PTC is formed by the deletion or insertion of a number of bases other than a multiple of 3 in the gene, and the shift of the reading frame at the time of translation (frame shift).
  • Duchenne muscular dystrophy which is one of the out-of-frame mutant hereditary diseases, is caused by a mutation in the dystrophin gene on the X chromosome.
  • DMD Duchenne muscular dystrophy
  • the deletion of a part of the exon of the dystrophin gene on the X chromosome causes the formation of PTC on the mRNA, and the translation is interrupted or terminated, resulting in the expression of normal dystrophin and dystrophin-related proteins. It will not be done normally. This leads to the development of DMD due to a deficiency of functional dystrophin protein in muscle tissue.
  • Exon skipping is a technique that allows exons containing out-of-frame mutations to be skipped to convert out-of-frame mutations into in-frame mutations to obtain proteins encoded by mRNAs lacking some exons.
  • the protein obtained by exon skipping is a protein (trancate type protein) having an amino acid length shorter than that of a normal protein.
  • a protein trancate type protein having an amino acid length shorter than that of a normal protein.
  • the compounds and antisense nucleic acids described in the following Patent Documents 1 and 2 (the entire description of the document is incorporated herein by reference) are known.
  • the read-through activity refers to an activity that acts on the ribosome and causes the ribosome to read over the PTC formed by an out-of-frame mutation and perform translation.
  • normal proteins can be synthesized.
  • a compound described in the following Patent Document 3 (the entire description of the document is incorporated herein by reference) is known.
  • Non-Patent Document 1 (the entire description of the document is incorporated herein by reference) describes a method for identifying a frameshift gene in the genome and circular code information used in the method.
  • PTC can be skipped by using a substance having read-through activity such as the compound described in Patent Document 3.
  • a substance having read-through activity such as the compound described in Patent Document 3.
  • the shifted reading frame is not returned, so that the obtained protein has a problem that the amino acid composition is different from that of a normal protein.
  • whether or not read-through occurs depends largely on probability theory, and there is a problem that protein synthesis is often not continued because other amino acids are not incorporated into PTC.
  • arbekacin which is a compound described in Patent Document 3 is an antibiotic and has a problem of being highly toxic to a living body.
  • the present invention has a length of a protein having an amino acid sequence more similar to that of a normal protein even from a gene in which an out-of-frame mutation has occurred, as compared with a method using a substance having exon skipping and read-through activity. It is an object of the present invention to provide a substance that is safe for a living body and a composition containing the substance, which can be expressed in a state in which the deletion of protein is suppressed.
  • the present inventor has accumulated intensive research on correcting the disorder of reading genetic information without skipping exons.
  • the reading frame can be shifted by 1 base in the 5'direction or 3'direction or 2 bases in the 3'direction in or around the mutated portion, it is normal while keeping the length of the expressed protein as long as possible.
  • the present inventor surprisingly contains a single-stranded nucleic acid containing a sequence complementary to the target sequence of the gene of interest and a sequence forming a specific stem loop structure.
  • a molecule we have succeeded in correcting the disorder of reading genetic information without skipping exons by inducing a -1 frame shift around the mutated portion and shifting the reading frame.
  • the single-stranded nucleic acid molecule can be decomposed by a nucleic acid-degrading enzyme in the living body, it is safer to the living body than a synthetic compound.
  • the present inventor has succeeded in creating a composition containing the above-mentioned single-stranded nucleic acid molecule and the above-mentioned single-stranded nucleic acid molecule as active ingredients.
  • the present invention has been completed based on such successful examples and findings.
  • the following single-stranded nucleic acid molecules and compositions are provided.
  • Nucleic acid molecule [2] The single-stranded nucleic acid molecule according to [1], wherein the terminal of the stem portion of the stem loop structure is cytosine and guanine. [3] The single-stranded nucleic acid molecule according to any one of [1] to [2], wherein the stem-loop structure is a stem-loop structure in which the loop portion is mainly composed of cytosine.
  • [4] The single-stranded nucleic acid molecule according to any one of [1] to [3], wherein the stem-loop structure is a stem-loop structure having a stem portion of 4 base pairs to 20 base pairs.
  • the second sequence is the sequence set forth in SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18.
  • the first sequence is a sequence having a length of 8 bases to 16 bases.
  • the composition is a pharmaceutical composition for normalizing the expression of the gene by inducing a -1 frameshift and preventing and / or treating a hereditary disease caused by abnormal expression of the gene.
  • the hereditary diseases include muscular dystrophy, cancer, multiple sclerosis, spinal muscle atrophy, Let syndrome, muscular atrophic lateral sclerosis, fragile X syndrome, Prader Willy syndrome, pigmented dry skin disease, etc.
  • the single-stranded nucleic acid molecule according to any one of [1] to [8] or the composition according to [9] has a hereditary disease caused by abnormal expression of a gene of interest.
  • a method for treating and / or preventing a hereditary disease which comprises administering to an individual organism at risk thereof.
  • the hereditary diseases include muscular dystrophy, cancer, multiple sclerosis, spinal muscle atrophy, Let syndrome, muscular atrophic lateral sclerosis, fragile X syndrome, Prader Willy syndrome, pigmented dry skin disease, etc. Porphyllinosis, Werner syndrome, progressive ossifying fibrous dysplasia, infantile neuroseloid lipofustin deposits, Alzheimer's disease, Teesax's disease, neural tissue degeneration, Parkinson's disease, rheumatoid arthritis, hostile transplantation piece disease, Arthritis, hemophilia, von Willebrand's disease, capillary diastolic dyskinesia, salacemia, renal stones, bone dysplasia, liver cirrhosis, neurofibromatosis, bullous disease, lysosome accumulation disease, Harler's disease, cerebral dyskinesia, nodules Sclerosis, familial erythrocytosis, immunodeficiency, kidney disease, lung disease, cystic fibrosis
  • a protein having an amino acid sequence more similar to that of a normal protein is expressed from a gene in which an out-of-frame mutation has occurred, while maintaining a longer overall length. be able to. Therefore, according to the present invention, expression of a functional protein is expected from a mutated gene.
  • a hereditary disease caused by an abnormality in which the expression of a target gene is normalized and the expression of the gene is reduced or increased for example, muscular dystrophy, cancer, multiple sclerosis, spinal muscle Atrophy, Let's Syndrome, Muscle Atrophic Lateral Sclerosis, Vulnerable X Syndrome, Prader Willy Syndrome, Pigmented Dry Dermatosis, Porphyrinopathy, Werner Syndrome, Progressive Osteoplastic Fibrosis, Infant Neuroseloid Lipofustin Deposition, Alzheimer's disease, Teesax's disease, neural tissue degeneration, Parkinson's disease, rheumatoid arthritis, hostile graft disease, arthritis, hemophilia, von Willebrand's disease, capillary diastolic dyskinesia, salacemia, renal stones , Bone dysplasia, liver cirrhosis, neurofibromatosis, bullous disease, lysosome accumulation, Harler's disease, cerebral ataxia, nod
  • FIG. 1 is a diagram showing a coding region (CDS) of EGFP-Human ⁇ -Tubulin as described in Examples described later.
  • FIG. 2 is a diagram showing the imaging results of the fluorescence microscope of Example 1 as described in Examples described later.
  • FIG. 3 is a diagram showing the CDS of the DHFR gene as described in Examples described later.
  • FIG. 4A is a diagram showing the nucleotide sequence of the reverse primer used in Example 2, as described in Examples described later.
  • FIG. 4B is a diagram showing the amino acid sequence of the DHFR protein and the amino acid sequence of the DHFR-His protein as described in Examples described later.
  • FIG. 5A is a photograph of the entire gel after electrophoresis and staining in Example 2, as described in Examples described later.
  • FIG. 5B is an enlarged view of the portion of FIG. 5A where the His-tagged DHFR protein of TEST2 Elution 1 and Elution 2 appeared.
  • FIG. 5C is an enlarged view of the portion of FIG. 5A where the DHFR protein and the DHFR protein fragment of NC, PC and TEST1 appeared.
  • FIG. 6A is a diagram showing the target sequence of Position 1 set around the breakpoint between exon 44 and exon 51 of the mutant dystrophin gene, as described in Examples described later.
  • FIG. 6B is a diagram showing the target sequence of Position 2 set around the breakpoint between exon 44 and exon 51 of the mutant dystrophin gene, as described in Examples described later.
  • FIG. 6A is a diagram showing the target sequence of Position 1 set around the breakpoint between exon 44 and exon 51 of the mutant dystrophin gene, as described in Examples described later.
  • FIG. 6B is a diagram showing the target sequence of Position 2 set around the breakpoint between exon 44 and exon 51 of the mutant dystrophin gene,
  • FIG. 6C is a diagram showing the target sequence of Position 3 set around the breakpoint between exon 44 and exon 51 of the mutant dystrophin gene, as described in Examples described later.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of the relative amount of dystrophin mRNA expression level to the mRNA expression level of GAPDH described in Example 3, as described in Examples described later.
  • composition is not particularly limited as having a commonly used meaning, and examples thereof include a combination of two or more kinds of components.
  • Active ingredient means an ingredient that characterizes the use of the composition.
  • the term “and / or” means any one, or any combination of two or more, or all combinations of a plurality of related items listed.
  • Constent is synonymous with concentration and added amount and means the ratio of the amount of the component to the total amount of the composition. However, the total content of the components does not exceed 100%.
  • Effective amount means an amount at which the action of the active ingredient or composition is exhibited.
  • the “ ⁇ ” in the numerical range is a range including the numerical values before and after the numerical range, and for example, “0% to 100%” means a range of 0% or more and 100% or less.
  • “Excess” and “less than” mean the lower limit and the upper limit, respectively, without including the preceding numerical value. For example, “1 excess” is a numerical value larger than 1, and “less than 100” is a numerical value less than 100.
  • “Including” means that elements other than those specified as being included can be added (synonymous with “at least including”), but includes “consisting of" and “essentially consisting of”. .. That is, "contains” can mean that it includes an explicit element and any one or more elements, consists of an explicit element, or essentially consists of an explicit element. .. Elements include restrictions such as components, processes, conditions, and parameters.
  • the "stem-loop structure” is also referred to as a hairpin loop, and is not particularly limited as having a commonly used meaning, but for example, the first and second sequences having a complementary relationship with each other and the first and second sequences thereof. Refers to the structure formed in the third sequence between the sequences of. In this case, the first and second sequences form a base pair to form a double-stranded portion (stem portion), and the third sequence forms a loop portion without forming a base pair, and the whole is formed. It exhibits a stem-loop structure.
  • “Complementary base pairs” or simply “base pairs” means Watson-Crick base pairs and wobble base pairs, which are combinations of adenine (A) with timine (T) or uracil (U) and guanine (G). Means the combination of guanine (G) and uracil (U), as well as the combination of guanine (G) and uracil (U).
  • adenine, thymine, uracil, guanine and cytosine, and A, T, U, G and C representing them, respectively are referred to as “base” or “nucleotide”.
  • base and “nucleotide” are treated as mutually substitutable terms.
  • the “end of the stem portion” refers to the sequence of the two ends of the stem portion that are not bound to the sequence forming the loop portion.
  • -1 frame shift means a frame shift that shifts the codon reading frame by 1 base to the 5'side among the frame shifts that mean the shift of the codon reading frame.
  • the mRNA shown as the scheme (I) is generated by ribosomal RNA in order of 3 bases each from the start codon (AUG) to CGU, GCU, and GUG. It can be read (Flame 0).
  • the reading frame shifts by 1 base to the 5'side at the frameshift site also referred to as the slippage site
  • the last G of the GUG is set as the head.
  • GGC is read, then GAA and AUA are read (Frame 2).
  • a frame shift that occurs so as to shift one base to the 5'side at the frame shift site in this way is called a -1 frame shift.
  • Out-of-frame mutation means a mutation in which the reading frame of the open reading frame (ORF) of mRNA shifts.
  • ORF open reading frame
  • PTC early stop codon
  • Nucleic acid molecule also simply referred to as nucleic acid, means, as is usually meant, a polymer in which nucleotides consisting of ribonucleotides, deoxyribonucleotides and their analogs are linked by phosphodiester bonds. Nucleotides are sometimes called bases, and nucleotide sequences and base sequences are synonymous. Nucleobase sequences and base sequences may be referred to simply as sequences of nucleic acid molecules. Typical examples of nucleic acid molecules include ribonucleic acid (RNA) composed of ribonucleotides and deoxyribonucleic acid (DNA) composed of deoxyribonucleotides.
  • RNA ribonucleic acid
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • Single-stranded nucleic acid molecule means one nucleic acid molecule that does not form a complementary base pair with another nucleic acid molecule.
  • the single-stranded nucleic acid molecule may have a stem portion formed by forming complementary base pairs between sequences in the molecule.
  • “Expression” means synthesis of mRNA from a gene (transcription), synthesis of protein from mRNA (translation), or both.
  • "Upstream” with respect to a sequence means the 5'side for a nucleotide sequence and the N-terminal side for an amino acid sequence.
  • Downstream for a sequence means the 3'side for a nucleotide sequence and the C-terminal side for an amino acid sequence.
  • the number of digits of the integer value and the number of digits of the significant figures match. For example, 1 significant digit is 1 digit and 10 significant digit is 2 digits. In addition, the number of digits after the decimal point matches the number of significant digits in the decimal value. For example, 0.1 significant digit is 1 digit and 0.10 significant digit is 2 digits.
  • the single-stranded nucleic acid molecule of one aspect of the present invention forms a stem-loop structure with a first sequence complementary to the target sequence of the gene of interest in the direction from the 5'end side to the 3'end side. Includes a second sequence.
  • a single-stranded nucleic acid molecule it is possible to induce a -1 frameshift when the mRNA of the target gene is translated. That is, the single-stranded nucleic acid molecule has a -1 frameshift inducing action.
  • the mechanism of the -1 frameshift inducing action of a single-stranded nucleic acid molecule will be described using a schematic diagram of the mRNA of the target gene shown as scheme (II).
  • the first sequence in the single-stranded nucleic acid molecule forms a complementary base pair with the target sequence in the mRNA of the target gene and binds to it.
  • a -1 frame shift occurs in which the reading frame shifts 1 base before the upstream 14 bases of the target sequence.
  • the sense codon N 36 N 35 N 34 starting from N 36, which is 14 bases upstream of the target sequence is shifted one base forward by -1 frameshift, and the sense codon N 37 N 36 N 35 Shift to.
  • the -1 frame shift occurs after the amino acids corresponding to the first sense codon N 36 N 35 N 34 and the subsequent second sense codon N 33 N 32 N 31 are added. It is believed that the ribosome slips at the positions of sense codons N 37 N 36 N 35 and sense codons N 34 N 33 N 32.
  • the amino acid sequence of the synthesized protein includes the amino acid encoded by the first sense codon N 36 N 35 N 34 , the amino acid encoded by the second sense codon N 33 N 32 N 31 , and the sense codon N 31 N 26 N 25. It is presumed that the sequence is the amino acid encoded by the amino acid encoded by the sense codon N 24 N 23 N 22.
  • the base (nucleotide) upstream of a certain sequence means a base (nucleotide) located 5'on the 5'end of the sequence as a reference.
  • the base (nucleotide) downstream of a certain sequence means a base (nucleotide) located 3'on the 3'end of the sequence as a reference.
  • the target sequence can be appropriately determined depending on the site where a -1 frameshift is desired to occur. That is, the target sequence can be a site starting from 14 bases downstream of the site (N 36 in scheme (II)) in which a -1 frameshift is desired to occur. However, in the upstream 9 bases to upstream 15 bases of the target sequence (N 37 N 36 N 35 N 34 N 33 N 32 N 31 in the scheme (II)), the same bases such as CC, AA, UU or GG are 2 It is preferable that the number is continuous. Further, in the upstream 9 bases to the upstream 15 bases of the target sequence, it is preferable that there are two or more portions in which two or more of the same bases are continuous.
  • upstream 9 bases to upstream 15 bases of the target sequence is the number of bases when the sequence N 26 N 25 N 24 N 23 N 22 N 21 (called a spacer sequence) in the scheme (II) is 6 bases.
  • the spacer sequence may be 3 to 8 bases.
  • the above “9 bases upstream to 15 bases upstream of the target sequence” is "11 bases upstream to 17 bases upstream of the target sequence”. Read as ".
  • the first sequence may be a sequence containing a sequence complementary to the target sequence.
  • the length of the first sequence may be long enough to bind to the target sequence and is not particularly limited, but is, for example, 5 to 25 bases in length, considering the binding force to the target sequence. Therefore, it is preferably 6 to 20 bases long, more preferably 8 to 16 bases long, and even more preferably 11 to 13 bases long.
  • the first sequence may be completely complementary or partially complementary to the target sequence, but it should be completely complementary considering the binding force to the target sequence. Is preferable.
  • the first sequence can be determined based on the nucleotide sequence, which is a sequence of nucleotides in the target sequence.
  • the second sequence forms a stem-loop structure.
  • the end of the stem portion of the stem loop structure is an intramolecular double strand. It maintains its structure and does not form complementary base pairs with the mRNA of the gene of interest. This will be described by exemplifying the scheme (III) showing the single-stranded nucleic acid molecule of one aspect of the present invention in a non-limiting manner.
  • the length of the stem portion may be long enough to form an intramolecular double-stranded structure, and is not particularly limited, but is, for example, 3 base pairs to 50 bases. It is the length to form a pair, and considering that the double-stranded structure in the molecule is stably maintained, it is preferably the length to form 4 base pairs to 20 base pairs, and 5 base pairs to 10 It is more preferably a length that forms base pairs, and even more preferably a length that forms about 8 base pairs.
  • the stem portion may be either a complete intramolecular double-stranded structure or a double-stranded structure having a portion having a single-stranded structure in the middle, but the intramolecular double-stranded structure is stable. It is preferable to have a complete intramolecular double-stranded structure in consideration of maintaining the ratio. Even in a double-stranded structure having a portion having a single-stranded structure in the middle, it is preferable that the two sequences at the ends of the stem portion form complementary base pairs.
  • the nucleotide sequence of the stem portion is not particularly limited as long as it is a sequence that forms an intracellular double-stranded structure.
  • the two nucleotides at the end of the stem portion are preferably a combination of cytosine and guanine, a combination of adenine and uracil, and more preferably a combination of cytosine and guanine.
  • a specific example of the nucleotide sequence of one of the stem portions is, but is not limited to, the sequence shown in SEQ ID NO: 15 (5'-CCGCAUUA-3').
  • the sequence that forms a complementary base pair with the sequence shown in SEQ ID NO: 15 and has a complete intramolecular double-stranded structure is the sequence shown in SEQ ID NO: 16 (5'-UAGUGUGG-3').
  • the length of the loop portion may be long enough to maintain the single-stranded structure, and is not particularly limited, but is, for example, 3 bases to 25 bases. In consideration of maintaining a stable single-stranded structure, the length is preferably 5 to 20 bases, more preferably 8 to 15 bases, and about 11 bases. It is more preferable to have.
  • the loop portion may be either a complete single-stranded structure or a single-stranded structure having a portion having a double-stranded structure in the middle, but the single-stranded structure should be stably maintained. In consideration of the above, a complete single-stranded structure is preferable.
  • the nucleotide sequence of the loop portion is not particularly limited as long as it is a sequence that maintains a single-stranded structure, but examples thereof include sequences that do not form an intramolecular double-stranded structure, preferably cytosine and adenine or uridine.
  • Specific examples of the nucleotide sequence of the loop portion are, but are not limited to, a sequence consisting of 11 cytosines.
  • the length of the second sequence may be the sum of the length of the stem portion and the length of the loop portion, for example, 9 bases to 65 bases, and the stem loop structure is stably maintained.
  • the length is preferably 15 to 50 bases, more preferably 18 to 35 bases, and even more preferably about 27 bases.
  • the length of the loop portion can be longer, shorter, or the same as the length of the stem portion, but given the efficiency of -1 frameshift induction,
  • the length of the loop portion is preferably longer or the same as the length of the stem portion, more preferably longer, further preferably 1.2 to 8 times longer, and 1.3 times longer. It is even more preferable that it is ⁇ 1.5 times longer.
  • the second sequence may be any sequence that forms a stem-loop structure composed of the above-mentioned stem portion and loop portion, and specific examples thereof include the sequence shown in SEQ ID NO: 17 and the sequence shown in SEQ ID NO: 18.
  • the single-stranded nucleic acid molecule may include the first sequence and the second sequence in the direction from the 5'end side to the 3'end side, and the 5'end side and the second sequence of the first sequence may be included. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9 nucleotides between the 3'end side and / or the first sequence and the second sequence of Although it may be added, it is preferably composed of a first sequence and a second sequence.
  • the length of the single-stranded nucleic acid molecule consisting of the first sequence and the second sequence may be the sum of the length of the first sequence and the length of the second sequence. For example, It is 14 to 90 bases long, preferably 21 to 70 bases long, more preferably 26 to 51 bases long, and even more preferably 38 to 40 bases long. ..
  • the length of the second sequence is preferably longer than the length of the first sequence, but the length of the first sequence is longer than the length of the stem portion in the second sequence. Is preferable.
  • Each nucleotide constituting the single-stranded nucleic acid molecule may be either a natural nucleotide (natural nucleotide) or a modified nucleotide (modified nucleotide). Further, the single-stranded nucleic acid molecule may be composed of a natural nucleotide, a modified nucleotide, or a combination of a natural nucleotide and a modified nucleotide. ..
  • the modified nucleotide is not particularly limited, but for example, a sugar-modified nucleotide (D-ribofuranose is 2'-O-alkylated nucleotide, D-ribofuranose is 2'-O, 4'-C-alkyleneized. Nucleotides, etc.); Nucleotides modified with phosphodiester bonds (thioated modified nucleotides); Nucleotides modified with bases; Nucleotides in which these modifications are combined, and the like can be mentioned.
  • D-ribofuranose is 2'-O-alkylated nucleotide
  • D-ribofuranose is 2'-O, 4'-C-alkyleneized.
  • Nucleotides, etc. Nucleotides modified with phosphodiester bonds (thioated modified nucleotides)
  • Nucleotides modified with bases Nucleotides in which these modifications are combined, and the like can be mentioned.
  • a single-stranded nucleic acid molecule having a modified nucleotide is superior to a single-stranded nucleic acid molecule consisting of a natural nucleotide because it can have advantages such as high binding force to RNA and high resistance to nuclease. -1 Frame shift inducing action may be expected.
  • the modified nucleotide may be a peptide nucleic acid (PNA).
  • sugar modifications of nucleotides include 2'-O-alkylation of D-ribofuranose (eg, 2'-O-methylation, 2'-O-aminoethylation, 2'-O-propylation, 2'-O-allylation, 2'-O-methoxyethylation, 2'-O-butylation, 2'-O-pentylation, 2'-O-propargylation, etc.), 2'of D-ribofuranose -O, 4'-C-alkyleneation (eg, 2'-O, 4'-C-ethyleneation, 2'-O, 4'-C-methyleneation, 2'-O, 4'-C-propylene 2'-O, 4'-C-tetramethyleneation, 2'-O, 4'-C-pentamethyleneation, etc.), 3'-deoxy-3'-amino-2'-deoxy-D-ribo Furanose, 3'-deoxy-3'-amino-2'-deoxy
  • Examples of modification of the phosphate diester bond of nucleotides include phosphorothioate bond, methylphosphonate bond, methylthiophosphonate bond, phosphorodithioate bond, phosphoramidate bond and the like.
  • nucleotide base modifications include 5-methylation, 5-fluorolation, 5-bromolation, 5-iodolation, N4-methylation of cytosine, 5-demethylation of thymidine (uracil), 5-fluoro. Cytosine, 5-bromolation, 5-iodolation, N6-methylation of adenine, 8-bromolation, N2-methylation of guanine, 8-bromolation and the like.
  • the single-stranded nucleic acid molecule may be in the form of a salt, that is, a pharmaceutically acceptable salt of the single-stranded nucleic acid molecule.
  • the salt include alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt and lithium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt; aluminum salt, iron salt, zinc salt, copper salt and nickel salt.
  • Metal salts such as cobalt salts; inorganic salts such as ammonium salts; t-octylamine salts, dibenzylamine salts, morpholinic salts, glucosamine salts, phenylglycine alkyl ester salts, ethylenediamine salts, N-methylglucamine salts, guanidine salts , Diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N, N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocine salt, prokine salt, diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylamine salt, piperazine salt, tetramethylammonium salt, tris (hydroxymethyl) )
  • Organic salts such as aminomethane salts; halogen atomized hydrides such as hydrofluorates, hydrochlorides, hydrobromates, hydroiodide; nitrates, perchlorates, sulfates
  • the single-stranded nucleic acid molecule may be in the form of a solvate such as hydrate.
  • the single-stranded nucleic acid molecule may be in the form of a prodrug.
  • the prodrug include amides, esters, carbamates, carbonates, ureides, phosphates and the like.
  • Single-stranded nucleic acid molecules can be synthesized using previously known methods and devices. For example, DNA according to the method described in the literature of Sinha et al. (ND Sinha et al., Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984); the entire description of the literature is incorporated herein by reference). Can be synthesized. In addition, RNA can be synthesized by incorporating the DNA synthesized in this manner into a vector and using this as a template by a transcription reaction using RNA polymerase such as T7 RNA Polymerase.
  • RNA polymerase such as T7 RNA Polymerase.
  • the single-stranded nucleic acid molecule may be synthesized in vivo or in vitro, but since the product can be easily purified and a modified nucleotide can be used as the nucleotide to be used, the single-stranded nucleic acid molecule may be synthesized in vivo. It is preferable to synthesize with in vitro.
  • nucleotide used when synthesizing the single-stranded nucleic acid molecule in vitro a commercially available nucleotide may be used, or a nucleotide synthesized from a commercially available nucleotide according to a method known so far may be used. May be good.
  • various modified nucleotides are described in the literature of Bloommers et al. (Blommers et al., Biochemistry (1998), 37, 17714-17725.), The literature of Lessnik et al. (Lesnik, EA et al., Biochemistry (1993), Biochemistry (1993), 32,7832-7838.), Patent Documents (US6261840), Martin Documents (Martin, P.
  • Patent Documents (WO99 / 14226), Patent Documents (WO99 / 14226), Patent Documents (WO99 / 14226), Patent Documents (WO99 / 14226) WO00 / 47599), Huynh et al. (Huynh Vu et al., Tetrahedron Letters, 32,3005-3008 (1991)), Radhakrishanan et al. (Radhaklishnan P. Iyer et Al.
  • Patent Documents PCT / WO98 / 54198
  • References Oligosaccharide Synthesis, Edited by MJ Gait, Oxford University Press, 1984
  • Patent Documents Japanese Patent Laid-Open No. 7-8798, etc. It can be manufactured according to the method described.
  • all the descriptions of the above-mentioned documents mentioned here are incorporated herein by reference.
  • the synthesized single-stranded nucleic acid molecule may be purified using previously known methods and devices such as extraction, precipitation, electrophoresis, and chromatography using a solvent or resin.
  • a contract manufacturing service using a contract manufacturing company such as Gene Design, Dharmacon, QIAGEN, or Sigma-Aldrich may be used.
  • the single-stranded nucleic acid molecule is preferably RNA because it binds to mRNA which is a transcript of the target gene.
  • the single-stranded nucleic acid molecule When the single-stranded nucleic acid molecule is RNA, it may be designed to be synthesized within the target to be applied. For example, a gene (DNA fragment) encoding the single-stranded nucleic acid molecule may be applied. It may be inserted into a vector suitable for. When such a vector is introduced into the application target and transcribed for the gene encoding the single-stranded nucleic acid molecule, the single-stranded nucleic acid molecule is synthesized in the application target.
  • Vectors that can be used for such purposes include, but are not limited to, viral vectors such as retrovirus, lentivirus, adenovirus, and adeno-associated virus (AAV).
  • the single-stranded nucleic acid molecule can be used in vivo or in vitro.
  • the target to which the single-stranded nucleic acid molecule is applied in vivo is not particularly limited, and any individual organism such as an animal, a plant, or a microorganism may be used. Examples of the animal include mammals, and examples of mammals include humans, dogs, cats, cows, horses, pigs, sheep, and the like, and among these, humans are preferable.
  • the target of application may be a healthy individual, but it may be an individual for which prevention or treatment of a hereditary disease is desired, such as an individual having a hereditary disease described later and an individual at risk thereof. preferable. Further, the application target may be an individual organism itself, or may be a part of an individual organism, and may be, for example, a cell, a tissue, an organ, or the like.
  • single-stranded nucleic acid molecules in vitro can be used as a reagent, regardless of its purpose, such as experiments, research, or medical treatment.
  • stem cells collected from a person suffering from a hereditary disease are modified so that a single-stranded nucleic acid molecule is constantly synthesized, cultured, and then transplanted to a person suffering from a hereditary disease. can do.
  • the single-stranded nucleic acid molecule of one aspect of the present invention can be used for medical purposes such as regenerative medicine and cell therapy.
  • the single-stranded nucleic acid molecule is preferably used together with a nucleic acid introduction aid so that it can be easily transferred into the cell to be applied.
  • a nucleic acid introduction aid include, but are not limited to, lipofectamine, oligofectamine, liposomes, polyamines, DEAE dextran, calcium phosphate, dendrimers, lipid nanoparticles and the like.
  • the amount of the single-stranded nucleic acid molecule used is not particularly limited as long as it induces a -1 frame shift when the single-stranded nucleic acid molecule is applied.
  • 0.001 nmol / examples include kg / day to 100 mmol / kg / day, and considering the excellent -1 frame shift inducing action and the cost of synthesizing a single-stranded nucleic acid molecule, 500 nmol / kg / day to 500 mmol / kg. It is preferably 40 nmol / kg / day to 500 ⁇ mol / kg / day, more preferably 40 nmol / kg / day.
  • the method for evaluating the -1 frameshift-inducing effect of a single-stranded nucleic acid molecule is not particularly limited, and for example, the amount of mRNA of the target gene and the target gene are encoded by the presence or absence of application of the single-stranded nucleic acid molecule. Examples thereof include a method of confirming an increase / decrease in the amount of protein to be produced or the amount of both of them. In addition, it may be confirmed by examining and / or examining that the disease of the person to whom the single-stranded nucleic acid molecule has been applied has been prevented or treated, or the symptoms have been alleviated.
  • the degree of -1 frameshift-inducing action of the single-stranded nucleic acid molecule is not particularly limited, and for example, the amount of mRNA and / or protein related to the target gene is compared with the case where the single-stranded nucleic acid molecule is not used (control). It suffices as long as the amount of fluctuation (increase or decrease) is observed.
  • compositions Single-stranded nucleic acid molecules are used in the form of compositions, either alone or in admixture with other components.
  • Another aspect of the invention is a composition used to induce a -1 frameshift that comprises the single-stranded nucleic acid molecule of one aspect of the invention as an active ingredient.
  • Specific embodiments of the composition include pharmaceutical compositions, food and drink compositions, quasi-drug compositions, cosmetic compositions, animal feed compositions and the like.
  • the composition may be an oral preparation such as a tablet, a capsule, a granule, a powder, a syrup, or a parenteral preparation such as an injection, a suppository, a patch, or an external preparation.
  • the other components are not particularly limited as long as the -1 frame shift is induced when the single-stranded nucleic acid molecule is applied, and examples thereof include components used in the production of pharmaceuticals.
  • Examines eg, sugar derivatives such as lactose, sucrose, grape sugar, mannitol, sorbitol; starch derivatives such as corn starch, bailesho starch, ⁇ -starch, dextrin; cellulose derivatives such as crystalline cellulose; Arabia Rubber; dextran; organic excipients such as pullulan; silicate derivatives such as light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, calcium silicate, magnesium aluminometasilicate; phosphates such as calcium hydrogen phosphate; such as calcium carbonate Carbonate; inorganic excipients such as sulfate such as calcium sulfate), lubricants (eg, metal stearate such as stearic acid, calcium stearate, magnesium stearate; starch;
  • binders eg, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropylmethyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, macrogol, compounds similar to the excipients, etc.
  • disintegrants Cellulose derivatives such as, for example, low-substituted hydroxypropyl cellulose, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, internally crosslinked sodium carboxymethyl cellulose; chemically modified starch cellulose such as carboxymethyl starch, sodium carboxymethyl starch, crosslinked polyvinylpyrrolidone.
  • emulsifiers eg, colloidal clays such as bentonite, bee gum; metal hydroxides such as magnesium hydroxide, aluminum hydroxide; anionic surfactants such as sodium lauryl sulfate, calcium stearate; benza chloride Cationic surfactants such as luconium; nonionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, etc.), stabilizers (paraoxy such as methylparaben, propylparaben) Starch acid ester Classes; alcohols such as chlorobutanol, benzyl alcohol, phenylethyl alcohol; benzalkonium chloride; phenols, phenols such as cresol; thimerosal; dehydroacetic acid; sorbic acid, etc.), flavoring agents (eg, commonly used). Sweeteners, acidulants, fragrances, etc.), diluents, etc.
  • the composition may be supplied in a solution state.
  • the composition is preferably stored under refrigerated conditions, frozen conditions, or lyophilized.
  • the lyophilized composition may be dissolved in a solution (distilled water for injection or the like) at the time of use and returned to a solution state before use.
  • the amount of the composition applied is not particularly limited as long as it exhibits a -1 frameshift-inducing effect, but for example, when applied to an adult (60 kg), it is about 0.1 mg / day to 10,000 mg / day. Yes, preferably 1 mg / day to 1,000 mg / day.
  • the composition of one aspect of the present invention can be applied once a day or divided into a plurality of times. If it is desired to continuously express the -1 frameshift-inducing action of the composition of one aspect of the present invention, the composition of one aspect of the present invention may be applied for several days to several weeks to several months to several years. It is preferably applied continuously or intermittently.
  • composition of one aspect of the present invention are appropriately determined depending on the type of the individual organism to be applied, the type and degree of the disease or symptom that the individual organism has or is at risk of, the age, the administration method, and the like. Can be changed.
  • the composition of one aspect of the invention is to prevent and / or treat various hereditary diseases by inducing a -1 frameshift to increase or decrease the expression of a gene of interest. Can be done.
  • the composition of one aspect of the invention normalizes the expression of a gene containing the target sequence, preferably by inducing a -1 frameshift, to prevent and / or prevent hereditary diseases caused by abnormal expression of the gene. Alternatively, it is a pharmaceutical composition for treatment.
  • Hereditary diseases are not particularly limited, but for example, muscular dystrophy, cancer, multiple sclerosis, spinal muscle atrophy, Let syndrome, muscular atrophic lateral sclerosis, fragile X syndrome, Prader Willy syndrome, pigmented dry skin.
  • an organism having or at risk of having a hereditary disease caused by abnormal expression of a gene of interest by administering an effective amount of the single-stranded nucleic acid molecule and composition according to one aspect of the present invention.
  • a hereditary disease can be treated and / or prevented for an individual.
  • gene expression is performed in cells, tissues, organs or organisms in which abnormal expression of the target gene is observed. It is possible to improve the abnormality.
  • hereditary diseases in hereditary diseases caused by out-of-frame mutations in genes, exons with out-of-frame mutations are not partially or wholly expressed due to the shift of the exon reading frame. As a result, NMD often occurs and the expression level of the gene decreases. In such a case, if the composition of one aspect of the present invention is used, a -1 frame shift is induced to correct the deviation of the exon reading frame of the gene to generate an in-frame mutation, and an out-of-frame mutation is generated. The mutated exons can be partially or wholly expressed, resulting in reduced effects of NMD and increased gene expression. Examples of hereditary diseases caused by a decrease in the expression level of such genes include muscular dystrophy, cystic fibrosis, xeroderma pigmentosum, ⁇ -thalassemia, and colorectal cancer.
  • a mutant gene that was not originally expressed or whose expression level was low may be expressed, and as a result, a hereditary disease may occur.
  • a -1 frame shift is induced to shift the reading frame of the exon of the gene to generate an out-of-frame mutation, and the exon is partially produced.
  • NMD can be totally absent and, as a result, NMD can be induced to reduce the expression level of harmful mutant genes.
  • Hereditary diseases caused by the synthesis of abnormal proteins due to the expression of such mutant genes include cancer, advanced ossifying fibrodysplasia, familial Alzheimer's disease, and familial amyloid poly. Frequently dominant hereditary diseases such as neuropathy and Huntington's disease can be mentioned.
  • the dystrophin gene is a gene consisting of 79 exons.
  • the dystrophin gene of Duchenne muscular dystrophy (DMD) patients with an out-of-frame mutation lacks any exon or multiple exons of exons 45 to 55 (exons 45 to 55).
  • this deleted 6 exon consists of 871 bases and is a multiple of 3 bases + 1 base
  • the sense strand is in a state where 2 bases are insufficient for in-frame formation. That is, when a 1-base deletion occurs, the frame shifts to +1 backward (3'direction) because 2 bases are insufficient for 3 bases. To eliminate this, the frame must be shifted to -1 (5'direction) or shifted to +2 and back in the 3'direction to be a multiple of 3. This is illustrated in Scheme (IV).
  • scheme (IV) it is considered that -1 frameshift occurs and ribosome slipping occurs by using the composition of one aspect of the present invention with the underlined portion as the target sequence. Be done. That is, a -1 frameshift results in a sense codon GCU after the last sense codon (AAG) of exon 44, after which a triplet codon is formed. As a result, the second sense codon (CCU) of exon 51 encodes the same amino acid as the mRNA of the normal dystrophin gene.
  • the mRNA of the mutant dystrophin gene with a -1 frameshift is the mRNA of the normal dystrophin gene between the last base of exon 50 and the two bases at the tip of exon 51.
  • alanine corresponding to the sense codon (GCU) generated by a -1 frameshift is added.
  • the amino acid sequence of the mutant dystrophin protein expressed by the mutant dystrophin gene is the amino acid encoded by exon 45-exon 50 and the last of exon 50. Only the amino acid (serine ⁇ alanine) corresponding to the sense codon formed by the base and the two bases at the tip of the exon 51 is different, and the rest has the same amino acid sequence as that of the normal dystrophin protein. Therefore, using the composition of one aspect of the present invention, a mutant dystrophin protein having an amino acid sequence different from that of a normal dystrophin protein by only one amino acid can be obtained except for the deletion portion of exon.
  • the amino acid sequence of the expression product of an oncogene such as the c-myc gene can be changed or the expression of the oncogene can be reduced, it is expected that the progression of the cancer will be stagnant or alleviated. Therefore, targeting mRNA, which is a transcript of an oncogene, and inducing a -1 frame shift using the composition of one embodiment of the present invention, the structure of the expression product of the oncogene is changed to reduce the activity. , Oncogene expression products can be prevented and / or treated by reducing the expression level of the expression product.
  • the c-myc gene is also used in the production of so-called "induced pluripotent stem cells" (iPS cells).
  • composition of one aspect of the present invention targeting the c-myc gene used in producing iPS cells at the same time as or at the same time as the introduction and expression of the c-myc gene, iPS cells can be used. While producing, it is expected to prevent iPS cells from becoming cancerous.
  • the method for producing the composition according to one aspect of the present invention is not particularly limited, and for example, a method in which a single-stranded nucleic acid molecule as an active ingredient is optionally mixed with another component and molded into a desired dosage form is used. Can be mentioned.
  • the packaging form of the composition of one aspect of the present invention is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the applicable form and dosage form, and for example, a glass container such as a vial or an ampoule; a metal such as glass or aluminum, or a coating. Examples thereof include vials, ampoules, bottles, cans, pouches, blister packs, strips, and one-layer or laminated film bags made of plastic such as paper and PET.
  • composition of one aspect of the present invention when applied to a DMD patient, it can be carried out as follows. That is, a single-stranded nucleic acid molecule as an active ingredient is produced by a method known so far, and this is sterilized by a conventional method to prepare, for example, 1 ml of an injection containing the single-stranded nucleic acid molecule. This injection is intravenously administered by infusion so that the dose of the single-stranded nucleic acid molecule is 0.1 mg to 100 mg per 1 kg of body weight.
  • Administration is repeated several times, for example, at intervals of 1 to 2 weeks, and thereafter, medical examination; imaging of X-ray, CT, MRI, etc.; observation with an endoscope, laparoscope, etc.; Repeat administration as appropriate while confirming the enhancing effect.
  • test cell line pEGFP-Tub vector (CLONTECH Laboratories; 6.0 kb) was used in 143 Btk-osteosarcoma cells cultured in DMEM supplemented with 10% FCS, and transfection reagent “Lipofectamine 2000” (Thermo Fisher Scientific) was used. Transfected. By selecting a drug using G418 sulfate (Cosmo Bio Co., Ltd.), 143 Btk-bone in which EGFP fluorescent protein (Human ⁇ -Tubulin protein) fused with human ⁇ -Tubulin protein at the C-terminal is highly expressed in a stable manner. A clone of sarcoma cells was selected as a test cell line.
  • the coding region (CDS) of EGFP-Human ⁇ -Tubulin is shown in FIG.
  • the EGFP gene (SEQ ID NO: 7) is linked to the Human ⁇ -Tubulin gene (SEQ ID NO: 9) via a linker (5'-TCCGACTCAGATCTCGA-3'; SEQ ID NO: 8).
  • the molecular design was designed based on the position of the target sequence (Target sequence). Specifically, a dozen or so bases of the target sequence were designed after the 2 bases corresponding to the bottom of the Axis of the stem loop with a spacer base of 6 bases sandwiched from the position of the last original codon that causes slipping.
  • the target sequence shall have sufficient binding to the frameshift nucleic acid molecule, which inhibits the progression of the migrating ribosome and dynamically causes one-base slipping in the anterior sequence, and is -1 directional. After inducing the slipping of the base, translation was resumed, and the binding was loose enough to pull the frameshift molecule from the mRNA.
  • the target sequence is preferably a dozen or so bases, and the length is such that the portion that binds to the target sequence binds to and interacts with other parts of the frame shift nucleic acid molecule so as not to disrupt the stem-loop structure.
  • the target sequence was set to a length of about 10 to 13 bases, and the chain length was adjusted while confirming that the basic structure of the stem loop was not disrupted by CentroidFold, which is a secondary structure prediction program for RNA. It was designed as the most structurally stable nucleic acid molecule for frame shifting. As a result, it was speculated that the frameshift nucleic acid molecule with respect to the target sequence had a more stable molecular structure.
  • the designed frame-shifting nucleic acid molecule causes a frame-shifting of -1 near the target sequence, so that PTC is generated near the boundary between the EGFP gene sequence and the human ⁇ -Tubulin gene sequence, resulting in 143 Btk-bone.
  • Only the EGFP fluorescent protein that has lost the ⁇ -Tubulin protein is expressed in the sarcoma cells.
  • NMD Nonsense-mediated mRNA decay: nonsense
  • nonsense is an intracellular mRNA quality control system
  • Stem38egfp (CG) (SEQ ID NO: 1) was designed as a frameshift nucleic acid molecule for the target sequence.
  • acGFP2 (SEQ ID NO: 6), which is similar in sequence and structure to Stem38egfp (CG) and does not target the EGFP gene.
  • the structures of Stem38egfp (CG) and acGFP2 are shown in Schemes (V) and (VI), respectively.
  • Each nucleic acid molecule was prepared to 100 ⁇ M using a TE buffer to prepare a nucleic acid molecule solution.
  • the test group using only Opti-MEM without adding each nucleic acid molecule and the transfection reagent was defined as an untreated (Unt) group; Opti with only the transfection reagent added without adding each nucleic acid molecule.
  • -The test group using MEM is the Mock group; the test group using the molecule "Stem39egfp (GC)" that targets the target sequence is the P group; and "acGFP2" that does not target the EGFP gene is used.
  • Five test groups were prepared by using the test group as the NC (Negative Control) group. In the P group and the NC group, the final concentration of each nucleic acid molecule in Opti-MEM was set to 40 nM.
  • Induction evaluation of frameshift Figure 2 shows the results of observing the cells of each test group with a fluorescence microscope.
  • FIG. 2 in the Unt group, Mock group and NC group, fluorescence due to the orientation of the human ⁇ -Tubulin protein fusion EGFP protein along the cytoskeleton was confirmed in the cytoplasm excluding the nucleus in the cell. ..
  • the P group weak fluorescence that diffused and smeared was confirmed in the cells.
  • the nucleic acid molecule Stem38egfp (CG) used in the P group induced a -1 frame shift; this changed the reading frame and was a scaffold protein from the EGFP-human ⁇ -Tubulin fusion protein.
  • Human ⁇ -Tubulin deficient and unoriented EGFP protein diffused randomly into the cell; weak fluorescence caused the expressed EGFP protein to shift ORF from the normal amino acid sequence. It was found that the amino acid sequence was changed from the part, and the protein had an amino acid sequence that weakened the fluorescence as a whole.
  • Example 2. -1 frameshift evaluation of ORF of DHFR gene
  • 1. Summary of Evaluation Using a DNA fragment containing two dihydrofolate reductase (DHFR) genes, an in vitro cell-free translation system was used to verify a -1 frameshift of ORF.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • the CDS of the DHFR gene (SEQ ID NO: 10) derived from Escherichia coli is shown in FIG.
  • the first DNA fragment, DHFR contains a T7 promoter and a ribosome binding site (SD sequence) located upstream of the start codon (ATG) of the DHFR gene.
  • SD sequence ribosome binding site located upstream of the start codon (ATG) of the DHFR gene.
  • the second DNA fragment, DHFR-His uses the first DNA fragment as a template and is a forward primer "Primer DHFR-His_Fw" (sequence) that is complementary to a part of the sequence upstream of the T7 promoter and a part of the T7 promoter sequence.
  • the nucleotide sequence of the reverse primer is shown in FIG. 4A.
  • Primer DHFR-His_Rv has an array configuration such that a His tag is generated by a -1 frame shift.
  • translation proceeds to the stop codons (TAA, TAG) on the 3'side of the reverse primer, and a protein containing no histidine (His) tag is obtained.
  • TAA stop codons
  • His histidine
  • FIG. 4B shows the amino acid sequence of the DHFR protein (SEQ ID NO: 13) and the amino acid sequence of the DHFR-His protein (SEQ ID NO: 14).
  • FIG. 3 shows the position (Target sequence) of the target sequence on the DHFR gene.
  • DHFR-His was obtained by performing PCR using DHFR-His_Fw and DHFR-His_Rv as a template according to a conventional method and purifying the obtained PCR product.
  • Table 1 shows the composition of the reaction solution of the kit used.
  • sample solution the one shown in Table 2 was used.
  • Distilled water (ddH 2 O) was used as a sample solution for the Negative Control (NC) (test group 1).
  • a solution containing DHFR having the full length of the DHFR gene was used as a sample solution (test group 2).
  • a solution containing both the frameshift nucleic acid molecules Stem39dhfr (GC) and DHFR was used as a sample solution (test group 3).
  • a solution containing Stem39dhfr (GC) as a sample solution and both a part of the DHFR gene and DHFR-His designed to have a His tag by -1 frameshift was used ( Test group 4).
  • PN Positive Negative Control
  • a solution containing only DHFR-His was used as a sample solution (Test Group No. 5).
  • GC Stem39dhfr
  • DHFR and DHFR-His were prepared so that the amounts in the reaction solution (20 ⁇ l) were 20 ⁇ g and 60 ⁇ g, respectively.
  • Each reaction solution was placed in a tube for a thermal cycler and subjected to a protein synthesis reaction using a thermal cycler at 37 ° C. for 4 hours.
  • solution A was prepared by adding 275 ⁇ L of xTractor buffer attached to the His- tag fusion protein purification kit “Capturem TM His-tagged Preparation Miniprep Kit” (Clontech) to 20 ⁇ L of the reacted solutions of test groups 4 and 5. bottom.
  • the prepared solution A was added to an equilibrated His-tag fusion protein adsorption column. Equilibration of the column was carried out by adding xTractor buffer and centrifuging at 9,800 g for 1 minute and 45 seconds.
  • the entire amount (45 ⁇ L) of the recovered concentrated protein sample was applied to each well of a polyacrylamide gel for protein electrophoresis "10-20% Criterion TM TGX TM Precast Gel” (Bio-Rad). Similarly, the entire amount of heat-modified protein samples from test groups 1-3 were applied to each well. The gel to which each protein sample was applied was subjected to an electrophoresis treatment at 200 V for 50 minutes. Table 3 shows the arrangement of the protein samples applied to each well. As the molecular weight marker (M), "Precision Plus Protein Dual Extra Standard" (Bio-Rad Laboratories, Inc.; product number 16137) was used.
  • M molecular weight marker
  • the gel after electrophoresis was stained with the Kumashi chromoprotein gel staining reagent "Simply Blue Safe Stein” (Thermo Fisher Scientific) to visualize the band.
  • FIGS. 5A to 5C are shown in FIGS. 5A to 5C.
  • FIG. 5A is a photograph of the entire gel after staining.
  • FIG. 5B is an enlarged view of the portion of FIG. 5A where the His-tagged DHFR proteins of TEST2 Elution 1 and Elution 2 appeared.
  • FIG. 5C is an enlarged view of the portion of FIG. 5A where the DHFR protein and the DHFR protein fragment of NC, PC and TEST1 appeared.
  • a band of His tag fusion protein was observed in Lane6 (TEST2 Elution1) and Lane7 (TEST2 Elution2) by the reaction solution (TEST2) to which DHFR-His and the nucleic acid molecule for frameshift Stem39dhfr (GC) were added. In particular, a clear band was observed in Lane6.
  • the His tag fusion protein was synthesized in Lane 11 (PN Elution 1) and Lane 12 (PN Extension 2) using a reaction solution (PN) in which only DHFR-His was added and the frameshift nucleic acid molecule Stem39dhfr (GC) was not added. No band was found at the position where it would have appeared if it had been.
  • the frameshift nucleic acid molecule Stem39dhfr (GC) molecule caused a -1 frameshift of ORF, and a stop codon that did not exist in the original DHFR gene sequence, that is, PTC, appeared, and the translation was intermediate. It was proven to have stopped.
  • DMD Duchenne muscular dystrophy
  • HGNC ID HGNC: 2928, Chromosomal location: Xp21.2-p21.1 having 79 exons, and mRNA having PTC.
  • the dystrophin protein is not synthesized and develops because it is degraded. Therefore, if a frameshift nucleic acid molecule can be used to artificially induce a -1 frameshift of ORF in living cells derived from a patient with a genetic disease such as DMD, comparison will be made so that NMD is avoided and degraded. It is possible to synthesize a long-term dystrophin protein.
  • a frameshift nucleic acid molecule that is a therapeutic molecule designed to target dystrophin mRNA in fibroblasts derived from patients with Duchenne muscular dystrophy lacking exons 45 to 50.
  • GM05118 a fibroblast derived from a healthy subject, has a normal dystrophin gene.
  • GM03429 and GM05118 were obtained from the Corriell Institute for Medical Research.
  • the mutant dystrophin gene lacks exon 45 to exon 50, so that the 3'end of exon 44 (AAG) and the 5'end of exon 51 (CTC) are directly connected. It is a concatenated sequence. A breakpoint was set between the AAG and CTC at both ends.
  • Position1, Position2, and Position3 are set as three types of target sequences near the breakpoint between exon 44 and exon 51 of the mutant dystrophin gene, and the frameshift nucleic acid molecule "P1Stem38dmd45-50 (GC)" is set for each of them.
  • ) (SEQ ID NO: 3),“ P2Stem39dmd45-50 (CG) ”(SEQ ID NO: 4) and“ P3Stem39dmd45-50 (CG) ”(SEQ ID NO: 5) were designed and produced.
  • the designed frameshift nucleic acid molecule was calculated by "CentroidFold” and its stability was confirmed.
  • the target sequences of Position 1, Position 2 and Position 3 are shown in FIGS. 6A to 6C.
  • the structures of P1Stem38dmd45-50 (GC), P2Stem39dmd45-50 (CG) and P3Stem39dmd45-50 (CG) are shown in Schemes (VIII) to (X), respectively.
  • Cell culture test cell lines (GM03429 and GM05118) were subcultured in DMEM supplemented with 15% FCS and Antibiotic Antimycotic under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 in a 6-well plate. After culturing, each cell was collected.
  • the cells in each of the collected wells were lysed using the cDNA synthesis kit "SuperScript TM III CellsDirect cDNA Synthesis System” (Thermo Fisher Scientific), and the total RNA in the obtained lysate was reverse-transcribed.
  • the reaction produced cDNA.
  • Quantification of dystrophin mRNA by qPCR The quantification of dystrophin mRNA is performed by real-time PCR "TaqMan (registered trademark) Gene Expression Master Mix” and “TaqMan (registered trademark) Gene Expression Assay” (both by Thermo Fisher System). Using “Thermal Cycler Dice Real Time System II", qPCR was performed by the ⁇ CT method. For the endogenous control, the GAPDH gene was used, and the expression level of dystrophin mRNA was calculated as a relative amount with respect to the expression level.
  • Induction evaluation of frameshift Figure 7 shows a graph of the relative amount of dystrophin mRNA expression level to the mRNA expression level of GAPDH for each test group.
  • the expression level of dystrophin gene mRNA in the untreated group was lower than that in the WT group using normal fibroblasts. Similarly, the expression level was very low in the Mock group in which only the transfection reagent was added to the medium. In these test groups, it is suggested that the dystrophin mRNA that resulted in PTC due to the exon deletion was captured by the mRNA quality control mechanism and degraded by NMD.
  • Increased dystrophin mRNA expression was also observed in DMD patient-derived fibroblasts into which nucleic acid molecules were introduced. From these results, it is considered that NMD was avoided by in-frame the out-of-frame of the ORF when the frameshift nucleic acid molecule binds to and acts on the mRNA and the ORF is translated by the ribosome.
  • dystrophin mRNA was maintained without degradation by avoiding NMD by using a frameshift nucleic acid molecule.
  • very low expression levels of dystrophin gene mRNA are now expressed by frameshift nucleic acid molecules in DMD patient-derived fibroblasts. And this event is directly linked to the usefulness of frameshift nucleic acid molecules in the treatment of DMD.
  • a frameshift nucleic acid molecule artificially designed to induce a -1 frameshift with respect to DMD caused by degradation of dystrophin mRNA and almost no production of dystrophin protein is DMD, that is, Duchenne. It can be an effective treatment for muscular dystrophy.
  • NMD is activated by shifting the ORF of the mRNA of the target gene functioning in the cell by -1 frame to generate an incorrect translation, and by intentionally generating PTC on the mRNA.
  • the expression of mRNA is reduced, the functional gene product is converted into a fragmented gene product with lost function (truncated protein), and as a result, the target in the cell is used. It is possible to nullify the function of a gene.
  • Nucleic acid molecules for frame shifting that can be designed for various genes in this way can be used for cancer treatment and proteins that are harmful to the living body, for example, by invalidating the functions of genes that are specifically expressed in cancer cells. It can also be used to treat dominant genetic diseases caused by expression.
  • sequences listed in the sequence listing are: [SEQ ID NO: 1] Stem38egfp (CG) CGCUGCCGUCCCCGCAUUACCCCCCCCCCCUAGUGUGG [SEQ ID NO: 2] Stem39dhfr (GC) CCGAUUGAUUCCGCGCAUUACCCCCCCCCCCUAGUGUGC [SEQ ID NO: 3] P1Stem38dmd45-50 (GC) GUAACAGUCUGGCGCAUUACCCCCCCCCCCUAGUGUGC [SEQ ID NO: 4] P2Stem39dmd45-50 (CG) CUGAGUAGGAGCCCGCAUUACCCCCCCCCCCUAGUGUGG [SEQ ID NO: 5] P3Stem39dmd45-50 (CG) UACCAUUUGUAUGCGCAUUACCCCCCCCCCCUAGUGUGC [SEQ ID NO: 6] acGFP2 CGAUGCCGGUGCCGCAUUACCCCCCCCCCCUAGUGUGG [SEQ ID NO: 7]
  • the single-stranded nucleic acid molecule and composition of one aspect of the present invention are used to normalize gene expression through induction of a -1 frame shift to prevent and / or treat hereditary diseases caused by genetic abnormalities. It is available.

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Abstract

本発明の目的は、アウトオブフレーム変異が生じた遺伝子からも、正常なタンパク質とより近似したアミノ酸配列を有するタンパク質を、その長さが欠失することを抑えた状態で発現することができる、生体に対して安全性のある物質及び該物質を含む組成物を提供することにある。上記目的は、５'末端側から３'末端側への方向に、対象となる遺伝子の標的配列に相補的な第１の配列と、ステムループ構造を形成する第２の配列とを含む１本鎖核酸分子；及び該１本鎖核酸分子を有効成分として含む組成物などにより解決される。

Description

－１フレームシフトを誘導するための１本鎖核酸分子及び組成物
　本発明は、－１フレームシフトを誘導するための１本鎖核酸分子及び該１本鎖核酸分子を含む組成物に関する。
　遺伝性疾患は、遺伝子になんらかの異常が生じて、遺伝子の発現量が低減すること、又は遺伝子の発現量が増加することといった、遺伝子が正常に発現しないことにより生じる疾患である。遺伝性疾患としては、例えば、筋ジストロフィー、癌、多発性硬化症、脊髄性筋萎縮症、レット症候群、筋萎縮性側索硬化症、脆弱Ｘ症候群、プラダー・ウィリー症候群、色素性乾皮症、ポルフィリン症、ウェルナー症候群、進行性骨化性線維異形成症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テイ－サックス病、神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、関節炎、血友病、フォンヴィレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、腎結石、骨形成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾患、小脳運動失調、結節性硬化症、家族性赤血球増加症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン－ピック病、マルファン症候群などが知られている。
　遺伝性疾患のうち、ナンセンス変異型の遺伝性疾患は、遺伝子上の点変異により形成される早期終止コドン（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｃｏｄｏｎ：ＰＴＣ）のためにタンパク質の発現が阻害されることに起因する疾患である。
　遺伝子の転写により得られるｍＲＮＡ上において、本来の終止コドンより上流側（５’末端側）に出現した終止コドンであるＰＴＣが形成されると、翻訳して得られるタンパク質が短くなって機能的なタンパク質が得られない場合がある。また、ｍＲＮＡに不正な翻訳が起こることによりＰＴＣが生じると、細胞内ｍＲＮＡ品質管理システムであるＮＭＤ（Ｎｏｎｓｅｎｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｍＲＮＡ　ｄｅｃａｙ：ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構）が発動し、細胞内でＰＴＣを有するｍＲＮＡが積極的に分解されて、タンパク質の発現が低下又は消失する場合がある。このような、遺伝子発現の異常によって、遺伝性疾患が表出する。
　ＰＴＣは、フレームシフト変異によっても生じ得る。遺伝子中に３の倍数以外の数の塩基の欠失、挿入などが生じて、翻訳時の読み枠がずれること（フレームシフト）によりＰＴＣが形成される。
　したがって、ナンセンス変異及びフレームシフト変異といったアウトオブフレーム変異によってＰＴＣが形成されると、正常なタンパク質が得られなくなる。これに対して、インフレーム変異は、読み枠が維持される変異であり、正常なタンパク質とは異なる部分が一部あっても、タンパク質が発現される可能性は高くなる。したがって、一般的には、インフレーム変異型遺伝性疾患よりも、アウトオブフレーム変異型遺伝性疾患の方が重篤になる傾向にある。
　アウトオブフレーム変異型遺伝性疾患の一つであるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ　ｍｕｓｃｕｌａｒ　ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ＤＭＤ）は、Ｘ染色体上のジストロフィン遺伝子の変異によって発症する。例えば、Ｘ染色体上のジストロフィン遺伝子のエクソンの一部が欠失することにより、ｍＲＮＡ上にＰＴＣが形成されて、翻訳が中断又は終了してしまうことにより正常なジストロフィン及びジストロフィン関連タンパク質などの発現が正常に行われなくなる。これにより、筋組織における機能性のジストロフィンタンパク質が欠乏して、ＤＭＤが発症することになる。
　ＤＭＤのようなアウトオブフレーム変異型遺伝性疾患の治療法として、エクソンスキッピングを誘導する物質及びリードスルー活性を有する物質などを投与することによる化学療法が期待されている。
　エクソンスキッピングは、アウトオブフレーム変異を含むエクソンがスキッピングされることによって、アウトオブフレーム変異をインフレーム変異に変換して、一部のエクソンを欠いたｍＲＮＡがコードするタンパク質を得ることができる手法である。エクソンスキッピングにより得られるタンパク質は、正常なタンパク質よりもアミノ酸長が短いタンパク質（トランケート型タンパク質）である。例えば、エクソンスキッピングを誘導する物質としては、下記特許文献１及び２（該文献の全記載はここに開示として援用される。）に記載の化合物及びアンチセンス核酸が知られている。
　一方、リードスルー活性は、リボソームに作用し、リボソームがアウトオブフレーム変異により形成されるＰＴＣを読み越えて翻訳を行うようにする活性をいう。リードスルーの結果として、正常なタンパク質が合成され得る。例えば、リードスルー活性を有する物質としては、下記特許文献３（該文献の全記載はここに開示として援用される。）に記載の化合物が知られている。
　下記非特許文献１（該文献の全記載はここに開示として援用される。）には、ゲノムにおけるフレームシフト遺伝子を特定する方法及び該方法に使用される円形コード情報が記載されている。
特許第５９５０８１８号公報 特許第５３６３６５５号公報 特許第５７０５１３６号公報
J Comput Sci Syst Biol, 2011, Vol.4(1), pp.7-15
　特許文献１及び２に記載の化合物及びアンチセンス核酸などを用いたエクソンスキッピングを用いれば、変異のあるエクソンを読み飛ばすことで、ＰＴＣを発生させることなく、遺伝子情報を最後まで読むことが可能になる。しかし、変異のあるエクソンだけを読み飛ばすだけでは遺伝子情報の読みの乱れを修正することができないことから、エクソンスキッピングには、変異のあるエクソン及びその周辺の複数のエクソンを読み飛ばさなければならないという問題がある。さらに、読み飛ばしたエクソンの分だけタンパク質が短くなり、結果として機能的なタンパク質が得られないという問題がある。
　特許文献３に記載の化合物などのリードスルー活性を有する物質を用いれば、ＰＴＣを読み飛ばすことができる。しかし、リードスルー活性を有する物質を用いても、ずれた読み枠は戻らないことから、得られるタンパク質は正常のタンパク質とはアミノ酸構成が異なるタンパク質になるという問題がある。また、リードスルーが生じるか否かは、確率論によるところが大きく、ＰＴＣに対して他のアミノ酸が取り込まれずに、タンパク質合成が引き続き行われないことが多いという問題がある。さらに、特許文献３に記載の化合物であるアルベカシンは抗生物質であり、生体に対して毒性が強いという問題がある。
　また、アウトオブフレーム変異が生じた遺伝子から、正常なタンパク質とより近似したアミノ酸配列を有するタンパク質を、その長さが欠失することを可能な限りに抑えた状態で発現するための方法についての報告例は少ない。
　そこで、本発明は、エクソンスキッピング及びリードスルー活性を有する物質を使用する方法と比べて、アウトオブフレーム変異が生じた遺伝子からも、正常なタンパク質とより近似したアミノ酸配列を有するタンパク質を、その長さが欠失することを抑えた状態で発現することができる、生体に対して安全性のある物質及び該物質を含む組成物を提供することを、本発明が解決しようとする課題とする。
　本発明者は、上記課題を解決するために、エクソンを読み飛ばすことなく遺伝子情報の読みの乱れを正すことについて鋭意研究を積み重ねた。その結果、変異のある部分又はその周辺において読み枠を５’方向若しくは３’方向に１塩基又は３’方向に２塩基ずらすことができれば、発現するタンパク質の長さをできる限り長く保ちつつ、正常なタンパク質とより近似したアミノ酸配列を有するタンパク質を発現することができるのではないかという考えに至った。
　上記考えの下、本発明者は、試行錯誤を重ねた結果、驚くべきことに、対象となる遺伝子の標的配列に相補的な配列及び特定のステムループ構造を形成する配列を含む１本鎖核酸分子を用いることによって、変異のある部分周辺において－１フレームシフトを誘導して読み枠をずらすことにより、エクソンを読み飛ばすことなく、遺伝子情報の読みの乱れを正すことに成功した。また、該１本鎖核酸分子は、生体内の核酸分解酵素によって分解可能なものであることから、合成化合物に比べて生体に対してより安全なものである。
　そして、本発明者は、遂に、上記１本鎖核酸分子及び上記１本鎖核酸分子を有効成分として含む組成物を創作することに成功した。本発明はこのような成功例及び知見に基づいて完成するに至った発明である。
　したがって、本発明の一態様によれば、以下の１本鎖核酸分子及び組成物が提供される。
［１］５’末端側から３’末端側への方向に、対象となる遺伝子の標的配列に相補的な第１の配列と、ステムループ構造を形成する第２の配列とを含む１本鎖核酸分子。
［２］前記ステムループ構造のステム部分の末端は、シトシン及びグアニンである、［１］に記載の１本鎖核酸分子。
［３］前記ステムループ構造は、ループ部分が主としてシトシンからなるステムループ構造である、［１］～［２］のいずれか１項に記載の１本鎖核酸分子。
［４］前記ステムループ構造は、ステム部分が４塩基対～２０塩基対のステムループ構造である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の１本鎖核酸分子。
［５］前記第２の配列は、配列番号１７又は配列番号１８に記載の配列である、［１］～［４］のいずれか１項に記載の１本鎖核酸分子。
［６］前記第１の配列は、８塩基長～１６塩基長の配列である、［１］～［５］のいずれか１項に記載の１本鎖核酸分子。
［７］前記遺伝子は、前記標的配列の上流９塩基～上流１５塩基において同一の塩基が２個以上連続する、［１］～［６］のいずれか１項に記載の１本鎖核酸分子。
［８］前記遺伝子は、前記標的配列の上流９塩基～上流１５塩基において同一の塩基が２個以上連続している部分が２箇所以上ある、［１］～［６］のいずれか１項に記載の１本鎖核酸分子。
［９］［１］～［８］のいずれか１項に記載の１本鎖核酸分子を有効成分として含む、－１フレームシフト誘導用組成物。
［１０］前記組成物は、－１フレームシフトを誘導することにより、前記遺伝子の発現を正常化して、該遺伝子の発現異常により発症する遺伝性疾患を予防及び／又は治療するための医薬品用組成物である、［９］に記載の組成物。
［１１］前記遺伝性疾患は、筋ジストロフィー、癌、多発性硬化症、脊髄性筋萎縮症、レット症候群、筋萎縮性側索硬化症、脆弱Ｘ症候群、プラダー・ウィリー症候群、色素性乾皮症、ポルフィリン症、ウェルナー症候群、進行性骨化性線維異形成症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テイ－サックス病、神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、関節炎、血友病、フォンヴィレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、腎結石、骨形成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾患、小脳運動失調、結節性硬化症、家族性赤血球増加症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン－ピック病、及びマルファン症候群からなる群から選ばれる遺伝性疾患である、［１０］に記載の組成物。
［１２］［１］～［８］のいずれか１項に記載の１本鎖核酸分子又は［９］に記載の組成物を、対象となる遺伝子の発現異常により発症する遺伝性疾患を有する、又はその危険性がある生物個体に投与することを含む、遺伝性疾患を治療及び／又は予防する方法。
［１３］［１］～［８］のいずれか１項に記載の１本鎖核酸分子又は［９］に記載の組成物の有効量を、対象となる遺伝子の発現異常が認められる細胞、組織、臓器又は生物個体に投与することを含む、遺伝子の発現異常を改善する方法。
［１４］前記遺伝性疾患は、筋ジストロフィー、癌、多発性硬化症、脊髄性筋萎縮症、レット症候群、筋萎縮性側索硬化症、脆弱Ｘ症候群、プラダー・ウィリー症候群、色素性乾皮症、ポルフィリン症、ウェルナー症候群、進行性骨化性線維異形成症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テイ－サックス病、神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、関節炎、血友病、フォンヴィレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、腎結石、骨形成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾患、小脳運動失調、結節性硬化症、家族性赤血球増加症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン－ピック病、及びマルファン症候群からなる群から選ばれる遺伝性疾患である、［１２］又は［１３］に記載の方法。
　本発明によれば、－１フレームシフトを誘導することによって、アウトオブフレーム変異が生じた遺伝子から、全長をより長く維持しつつも、正常なタンパク質とより近似したアミノ酸配列を有するタンパク質を発現することができる。これにより、本発明によれば、変異のある遺伝子から機能性のあるタンパク質の発現が期待される。
　したがって、本発明によれば、対象とする遺伝子の発現を正常化して、該遺伝子の発現が低減又は増加する異常により発症する遺伝性疾患、例えば、筋ジストロフィー、癌、多発性硬化症、脊髄性筋萎縮症、レット症候群、筋萎縮性側索硬化症、脆弱Ｘ症候群、プラダー・ウィリー症候群、色素性乾皮症、ポルフィリン症、ウェルナー症候群、進行性骨化性線維異形成症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テイ－サックス病、神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、関節炎、血友病、フォンヴィレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、腎結石、骨形成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾患、小脳運動失調、結節性硬化症、家族性赤血球増加症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン－ピック病、マルファン症候群などの遺伝性疾患を治療及び／又は予防することが期待される。
図１は、後述する実施例に記載のとおりの、ＥＧＦＰ－Ｈｕｍａｎ　α－Ｔｕｂｕｌｉｎのコーディング領域（ＣＤＳ）を示した図である。 図２は、後述する実施例に記載のとおりの、例１の蛍光顕微鏡の撮影結果を示した図である。 図３は、後述する実施例に記載のとおりの、ＤＨＦＲ遺伝子のＣＤＳを示した図である。 図４Ａは、後述する実施例に記載のとおりの、例２で使用したリバースプライマーのヌクレオチド配列を示した図である。 図４Ｂは、後述する実施例に記載のとおりの、ＤＨＦＲタンパク質のアミノ酸配列及びＤＨＦＲ－Ｈｉｓタンパク質のアミノ酸配列を示した図である。 図５Ａは、後述する実施例に記載のとおりの、例２における電気泳動及び染色した後のゲル全体を撮影した図である。 図５Ｂは、図５Ａのうち、ＴＥＳＴ２　Ｅｌｕｔｉｏｎ１及びＥｌｕｔｉｏｎ２のＨｉｓタグ化ＤＨＦＲタンパク質が現れた箇所を拡大した図である。 図５Ｃは、図５Ａのうち、ＮＣ、ＰＣ及びＴＥＳＴ１のＤＨＦＲタンパク質及びＤＨＦＲタンパク質断片が現れた箇所を拡大した図である。 図６Ａは、後述する実施例に記載のとおりの、変異ジストロフィン遺伝子のエクソン４４とエクソン５１との間のブレイクポイントの周辺に設定したＰｏｓｉｔｉｏｎ１のターゲット配列を示した図である。 図６Ｂは、後述する実施例に記載のとおりの、変異ジストロフィン遺伝子のエクソン４４とエクソン５１との間のブレイクポイントの周辺に設定したＰｏｓｉｔｉｏｎ２のターゲット配列を示した図である。 図６Ｃは、後述する実施例に記載のとおりの、変異ジストロフィン遺伝子のエクソン４４とエクソン５１との間のブレイクポイントの周辺に設定したＰｏｓｉｔｉｏｎ３のターゲット配列を示した図である。 図７は、後述する実施例に記載のとおりの、例３に記載のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量に対するジストロフィンｍＲＮＡ発現レベルの相対量の結果を表したグラフである。
　以下、本発明の各態様の詳細について説明するが、本発明は、本項目の事項によってのみに限定されず、本発明の目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。
　本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、医薬分野、生物学分野といった技術分野の当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。また、本明細書においてなされている推測及び理論は、本発明者のこれまでの知見及び経験によってなされたものであることから、本発明はこのような推測及び理論のみによって拘泥されるものではない。
　「組成物」は、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、２種以上の成分が組み合わさってなる物が挙げられる。
　「有効成分」は、組成物の用途を特徴付ける成分を意味する。
　「及び／又は」との用語は、列記した複数の関連項目のいずれか１つ、又は２つ以上の任意の組み合わせ若しくは全ての組み合わせを意味する。
　「含有量」は、濃度及び添加量と同義であり、組成物の全体量に対する成分の量の割合を意味する。ただし、成分の含有量の総量は、１００％を超えることはない。「有効量」は、有効成分又は組成物が有する作用が発現する量を意味する。
　数値範囲の「～」は、その前後の数値を含む範囲であり、例えば、「０％～１００％」は、０％以上であり、かつ、１００％以下である範囲を意味する。「超過」及び「未満」は、その前の数値を含まずに、それぞれ下限及び上限を意味し、例えば、「１超過」は１より大きい数値であり、「１００未満」は１００より小さい数値を意味する。
　「含む」は、含まれるものとして明示されている要素以外の要素を付加できることを意味する（「少なくとも含む」と同義である）が、「からなる」及び「から本質的になる」を包含する。すなわち、「含む」は、明示されている要素及び任意の１種若しくは２種以上の要素を含み、明示されている要素からなり、又は明示されている要素から本質的になることを意味し得る。要素としては、成分、工程、条件、パラメーターなどの制限事項などが挙げられる。
　「ステムループ構造」は、ヘアピンループとも称され、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、互いに相補的な関係にある第１及び第２の配列と該第１及び第２の配列の間にある第３の配列とにおいて形成される構造をいう。この場合、第１及び第２の配列は塩基対を形成して二本鎖部分（ステム部分）を形成し、かつ第３の配列は塩基対を形成せずにループ部分を形成して、全体としてステムループ構造を呈する。
　「相補的塩基対」又は単なる「塩基対」は、ワトソン・クリック型塩基対及びゆらぎ塩基対を意味し、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）との組合せ及びグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）との組合せ、並びにグアニン（Ｇ）とウラシル（Ｕ）との組合せを意味する。なお、本明細書では、アデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンを、並びにこれらをそれぞれ表すＡ、Ｔ、Ｕ、Ｇ及びＣを、「塩基」又は「ヌクレオチド」とよぶ。本明細書では、「塩基」と「ヌクレオチド」とは互いに代替可能な用語として扱う。
　「ステム部分の末端」は、ステム部分が有する２個の末端のうち、ループ部分を形成する配列に結合していない末端の配列をいう。
　「－１フレームシフト」は、コドンの読み枠のずれを意味するフレームシフトのうち、コドンの読み枠を５’側へ１塩基ずらすフレームシフトを意味する。例えば、非特許文献１のＦｉｇｕｒｅ　２を引用するスキーム（Ｉ）を例証すると、スキーム（Ｉ）として示されたｍＲＮＡはリボソームＲＮＡにより開始コドン（ＡＵＧ）からＣＧＵ、ＧＣＵ、ＧＵＧと３塩基ずつ順番に読み取られる（Ｆｒａｍｅ　０）。しかし、図示されているフレームシフト部位（Ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ　ｓｉｔｅ）（スリッピング部位（Ｓｌｉｐｐａｇｅ　ｓｉｔｅ）ともいう。）にて、読み枠が５’側へ１塩基ずれると、上記ＧＵＧの最後のＧを先頭として、ＧＧＣが読み取られ、次いでＧＡＡ、ＡＵＡが読み取られる（Ｆｒａｍｅ　２）。このように、フレームシフト部位にて、５’側へ１塩基ずらすように生じたフレームシフトを－１フレームシフトとよぶ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　スキーム（Ｉ）
　「アウトオブフレーム変異」は、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ　Ｒｅａｄｉｎｇ　Ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）の読み枠がずれる変異を意味する。アウトオブフレーム変異が生じると、変異のない正常なタンパク質と異なるアミノ酸配列を有するタンパク質が合成されること、本来の終止コドンよりも５’（上流）側に早期終止コドン（ＰＴＣ）が生じて変異のない正常なタンパク質よりも長さが短いタンパク質が合成されることなどが生じる。
　「核酸分子」は、単に核酸ともよび、通常意味されるとおりに、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド及びそれらの類縁体からなるヌクレオチドがホスホジエステル結合で連なった重合体を意味する。ヌクレオチドは塩基とよぶ場合があり、ヌクレオチド配列と塩基配列とは同義である。ヌクレオチド配列及び塩基配列を、単に核酸分子の配列とよぶ場合がある。核酸分子の代表的なものとして、リボヌクレオチドからなるリボ核酸（ＲＮＡ）及びデオキシリボヌクレオチドからなるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が挙げられる。
　「１本鎖核酸分子」は、他の核酸分子と相補的塩基対を形成していない、１個の核酸分子を意味する。１本鎖核酸分子は、分子内の配列どうしが相補的塩基対を形成してなるステム部分を有してもよい。
　「発現」は、遺伝子からのｍＲＮＡの合成（転写）、ｍＲＮＡからのタンパク質の合成（翻訳）又はその両方を意味する。
　配列に関する「上流」は、ヌクレオチド配列については５’側を意味し、アミノ酸配列についてはＮ末端側を意味する。配列に関する「下流」は、ヌクレオチド配列については３’側を意味し、アミノ酸配列についてはＣ末端側を意味する。
　整数値の桁数と有効数字の桁数とは一致する。例えば、１の有効数字は１桁であり、１０の有効数字は２桁である。また、小数値は小数点以降の桁数と有効数字の桁数とは一致する。例えば、０．１の有効数字は１桁であり、０．１０の有効数字は２桁である。
［１本鎖核酸分子］
　本発明の一態様の１本鎖核酸分子は、５’末端側から３’末端側への方向に、対象となる遺伝子の標的配列に相補的な第１の配列と、ステムループ構造を形成する第２の配列とを含む。
　１本鎖核酸分子を用いると、対象遺伝子のｍＲＮＡが翻訳される際に、－１フレームシフトを誘導することができる。すなわち、１本鎖核酸分子は、－１フレームシフト誘導作用を有する。１本鎖核酸分子が有する－１フレームシフト誘導作用のメカニズムを、スキーム（ＩＩ）として示した対象遺伝子のｍＲＮＡの模式図を用いて説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 スキーム（ＩＩ）
　１本鎖核酸分子における第１の配列は、対象遺伝子のｍＲＮＡにおける標的配列と相補的塩基対を形成して結合する。１本鎖核酸分子が結合した状態で対象遺伝子のｍＲＮＡが翻訳される場合、標的配列の上流１４塩基前で読み枠が１塩基前にずれる－１フレームシフトが生じる。スキーム（ＩＩ）を用いて説明すると、標的配列の上流１４塩基前にあたるＮ３６からはじまるセンスコドンＮ３６Ｎ３５Ｎ３４は、－１フレームシフトにより１塩基前にずれて、センスコドンＮ３７Ｎ３６Ｎ３５へとシフトする。ただし、－１フレームシフトは、１番目のセンスコドンＮ３６Ｎ３５Ｎ３４及びその後の２番目のセンスコドンＮ３３Ｎ３２Ｎ３１に対応するアミノ酸が付加された後に、－１フレームシフトが発生して、リボソームがセンスコドンＮ３７Ｎ３６Ｎ３５及びセンスコドンＮ３４Ｎ３３Ｎ３２の位置にスリッピングすると考えられる。これにより、合成されるタンパク質のアミノ酸配列は、第１のセンスコドンＮ３６Ｎ３５Ｎ３４がコードするアミノ酸、第２のセンスコドンＮ３３Ｎ３２Ｎ３１がコードするアミノ酸、センスコドンＮ３１Ｎ２６Ｎ２５がコードするアミノ酸、センスコドンＮ２４Ｎ２３Ｎ２２がコードするアミノ酸・・・という配列になると推測される。なお、ある配列の上流にある塩基（ヌクレオチド）とは、該配列の５’末端を基準として、それよりも５’側にある塩基（ヌクレオチド）を意味する。また、ある配列の下流にある塩基（ヌクレオチド）とは、該配列の３’末端を基準として、それよりも３’側にある塩基（ヌクレオチド）を意味する。
　標的配列は、－１フレームシフトを発生させたい部位に応じて適宜決定することができる。すなわち、－１フレームシフトを発生させたい部位（スキーム（ＩＩ）におけるＮ３６）の下流１４塩基からはじまる部位を標的配列とすることができる。ただし、標的配列の上流９塩基～上流１５塩基（スキーム（ＩＩ）におけるＮ３７Ｎ３６Ｎ３５Ｎ３４Ｎ３３Ｎ３２Ｎ３１）では、ＣＣ、ＡＡ、ＵＵ又はＧＧというように同一の塩基が２個以上連続していることが好ましい。また、標的配列の上流９塩基～上流１５塩基では、同一の塩基が２個以上連続している部分が２箇所以上あることが好ましい。なお、上記「標的配列の上流９塩基～上流１５塩基」は、スキーム（ＩＩ）における配列Ｎ２６Ｎ２５Ｎ２４Ｎ２３Ｎ２２Ｎ２１（スペーサー配列とよぶ）が６塩基の場合の塩基の数である。スペーサー配列は３塩基～８塩基である場合があり、例えば、スペーサー配列が８塩基の場合は、上記「標的配列の上流９塩基～上流１５塩基」は「標的配列の上流１１塩基～上流１７塩基」と読み替える。
　第１の配列は、標的配列に相補的な配列を含む配列であればよい。第１の配列の長さは、標的配列に結合するのに十分な長さであればよく、特に限定されないが、例えば、５塩基長～２５塩基長であり、標的配列との結合力を考慮すれば、６塩基長～２０塩基長であることが好ましく、８塩基長～１６塩基長であることがより好ましく、１１塩基長～１３塩基長であることがさらに好ましい。
　第１の配列は、標的配列と完全に相補的であっても、部分的に相補的であってもどちらでもよいが、標的配列との結合力を考慮すれば、完全に相補的であることが好ましい。
　第１の配列は、標的配列のヌクレオチドの並びであるヌクレオチド配列に基づいて決定することができる。
　第２の配列は、ステムループ構造を形成する。１本鎖核酸分子と対象遺伝子のｍＲＮＡとが、標的配列及び第１の配列の間で相補的塩基対を形成して結合する場合、ステムループ構造のステム部分の末端は、分子内２本鎖構造を維持し、対象遺伝子のｍＲＮＡと相補的塩基対を形成しない。このことを本発明の一態様の１本鎖核酸分子を非限定的に示したスキーム（ＩＩＩ）を例証して説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 スキーム（ＩＩＩ）
　スキーム（ＩＩＩ）において、「○」（白丸）は１ヌクレオチドを表す。実線は相補的塩基対の関係（水素結合）を示し、点線は隣り合うヌクレオチド間の結合（ホスホジエステル結合）を示す。スキーム（ＩＩＩ）に示すとおり、黒矢印で示されるとおりのステム部分の末端の２個のヌクレオチドは、白矢印で示されるとおりの相対する対象遺伝子のｍＲＮＡの配列（Ｎ１２、Ｎ１１）と相補的塩基対を形成しない。このように、第２の配列において、ステムループ構造の末端は、ステム部分として、分子内２本鎖構造を維持する。
　第２の配列のステムループ構造において、ステム部分の長さは、分子内２本鎖構造を形成するのに十分な長さであればよく、特に限定されないが、例えば、３塩基対～５０塩基対を形成する長さであり、分子内２本鎖構造を安定的に維持することを考慮すれば、４塩基対～２０塩基対を形成する長さであることが好ましく、５塩基対～１０塩基対を形成する長さであることがより好ましく、約８塩基対を形成する長さであることがさらに好ましい。
　ステム部分は、完全な分子内２本鎖構造であっても、途中で１本鎖構造をとる部分がある２本鎖構造であってもどちらでもよいが、分子内２本鎖構造を安定的に維持することを考慮すれば、完全な分子内２本鎖構造であることが好ましい。なお、途中で１本鎖構造をとる部分がある２本鎖構造であっても、ステム部分の末端の２個の配列は相補的塩基対を形成することが好ましい。
　ステム部分のヌクレオチド配列は、分子内２本鎖構造を形成する配列であれば特に限定されない。ただし、ステム部分の末端の２個のヌクレオチドは、シトシン及びグアニンの組合せ、並びにアデニン及びウラシルの組合せであることが好ましく、シトシン及びグアニンの組合せであることがより好ましい。ステム部分の一方のヌクレオチド配列の具体例は、配列番号１５に示す配列（５’－ＣＣＧＣＡＵＵＡ－３’）であるが、これに限定されない。なお、配列番号１５に示す配列と相補的塩基対を形成して、完全な分子内２本鎖構造をとる配列は配列番号１６に示す配列（５’－ＵＡＧＵＧＵＧＧ－３’）である。
　第２の配列のステムループ構造において、ループ部分の長さは、１本鎖構造を維持するのに十分な長さであればよく、特に限定されないが、例えば、３塩基長～２５塩基長であり、１本鎖構造を安定的に維持することを考慮すれば、５塩基長～２０塩基長であることが好ましく、８塩基長～１５塩基長であることがより好ましく、約１１塩基長であることがさらに好ましい。
　ループ部分は、完全な１本鎖構造であっても、途中で２本鎖構造をとる部分がある１本鎖構造であってもどちらでもよいが、１本鎖構造を安定的に維持することを考慮すれば、完全な１本鎖構造であることが好ましい。
　ループ部分のヌクレオチド配列は、１本鎖構造を維持する配列であれば特に限定されないが、例えば、分子内２本鎖構造を形成しないような配列などが挙げられ、好ましくはシトシンとアデニン又はウリジンとからなる配列、グアニンとアデニンとからなる配列、シトシン、グアニン、アデニン又はウリジンからなる配列であり、より好ましくは８０％以上がシトシンである主としてシトシンからなる配列であり、さらに好ましくは完全にシトシンからなる配列である。ループ部分のヌクレオチド配列の具体例は、１１個のシトシンからなる配列であるが、これに限定されない。
　第２の配列の長さは、ステム部分の長さ及びループ部分の長さを足し合わせたものであればよく、例えば、９塩基長～６５塩基長であり、ステムループ構造を安定的に維持することを考慮すれば、１５塩基長～５０塩基長であることが好ましく、１８塩基長～３５塩基長であることがより好ましく、約２７塩基長であることがさらに好ましい。
　第２の配列において、ループ部分の長さは、ステム部分の長さと比較して、長いこと、短いこと、又は同一であることがあり得るが、－１フレームシフト誘導の効率を考慮すれば、ループ部分の長さは、ステム部分の長さと比較して、長いこと、又は同一であることが好ましく、長いことがより好ましく、１．２倍～８倍長いことがさらに好ましく、１．３倍～１．５倍長いことがなおさらに好ましい。
　第２の配列は、上記したステム部分及びループ部分からなるステムループ構造を形成する配列であればよく、具体例としては配列番号１７に示す配列、配列番号１８に示す配列などが挙げられる。
　１本鎖核酸分子は、５’末端側から３’末端側への方向に、第１の配列と第２の配列とを含めばよく、第１の配列の５’末端側、第２の配列の３’末端側及び／又は第１の配列と第２の配列との間に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又は９個のヌクレオチドが付加されていてもよいが、第１の配列と第２の配列とからなることが好ましい。
　第１の配列と第２の配列とからなる１本鎖核酸分子の長さは、第１の配列の長さと第２の配列の長さとを足し合わせた長さであればよいが、例えば、１４塩基長～９０塩基長であり、２１塩基長～７０塩基長であることが好ましく、２６塩基長～５１塩基長であることがより好ましく、３８塩基長～４０塩基長であることがさらに好ましい。１本鎖核酸分子において、第２の配列の長さは第１の配列の長さよりも長いことが好ましいが、第１の配列の長さは第２の配列におけるステム部分の長さよりも長いことが好ましい。
　１本鎖核酸分子を構成する各ヌクレオチドは、天然型のヌクレオチド（天然ヌクレオチド）であっても、修飾型のヌクレオチド（修飾ヌクレオチド）であっても、いずれであってもよい。また、１本鎖核酸分子は、天然ヌクレオチドからなるものであっても、修飾ヌクレオチドからなるものであっても、天然ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドの組合せからなるものであっても、いずれであってもよい。
　修飾ヌクレオチドは特に限定されないが、例えば、糖が修飾されたヌクレオチド（Ｄ－リボフラノースが２’－Ｏ－アルキル化したヌクレオチド、Ｄ－リボフラノースが２’－Ｏ，４’－Ｃ－アルキレン化したヌクレオチドなど）；リン酸ジエステル結合が修飾されたヌクレオチド（チオエート化修飾ヌクレオチド）；塩基が修飾されたヌクレオチド；これらの修飾が組み合わさったヌクレオチドなどを挙げることができる。修飾ヌクレオチドを有する１本鎖核酸分子は、ＲＮＡに対する結合力が高いこと、ヌクレアーゼに対する耐性が高いことなどの利点を有し得ることから、天然ヌクレオチドからなる１本鎖核酸分子と比べて、優れた－１フレームシフト誘導作用が期待できる場合がある。修飾ヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であってもよい。
　ヌクレオチドの糖の修飾の例としては、Ｄ－リボフラノースの２’－Ｏ－アルキル化（例えば、２’－Ｏ－メチル化、２’－Ｏ－アミノエチル化、２’－Ｏ－プロピル化、２’－Ｏ－アリル化、２’－Ｏ－メトキシエチル化、２’－Ｏ－ブチル化、２’－Ｏ－ペンチル化、２’－Ｏ－プロパルギル化など）、Ｄ－リボフラノースの２’－Ｏ，４’－Ｃ－アルキレン化（例えば、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン化、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン化、２’－Ｏ，４’－Ｃ－プロピレン化、２’－Ｏ，４’－Ｃ－テトラメチレン化、２’－Ｏ，４’－Ｃ－ペンタメチレン化など）、３’－デオキシ－３’－アミノ－２’－デオキシ－Ｄ－リボフラノース、３’－デオキシ－３’－アミノ－２’－デオキシ－２’－フルオロ－Ｄ－リボフラノースなどを挙げることができる。
　ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の修飾の例としては、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、メチルチオホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロアミデート結合などを挙げることができる。
　ヌクレオチドの塩基の修飾の例としては、シトシンの５－メチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、Ｎ４－メチル化、チミジンの５－デメチル化（ウラシル）、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、アデニンのＮ６－メチル化、８－ブロモ化、グアニンのＮ２－メチル化、８－ブロモ化などを挙げることができる。
　１本鎖核酸分子は、塩の形態、すなわち、１本鎖核酸分子の医薬的に許容される塩であってもよい。塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩；ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩などの無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンルスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩；酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩などを挙げることができるが、これらに限定されない。
　１本鎖核酸分子は、水和物などの溶媒和物の形態であってもよい。
　１本鎖核酸分子は、プロドラッグの形態であってもよい。プロドラッグとしては、アミド、エステル、カルバミン酸塩、炭酸塩、ウレイド、リン酸塩などを挙げることができる。
　１本鎖核酸分子は、これまでに知られている方法及び装置を使用して、合成することができる。例えば、Ｓｉｎｈａらの文献（Ｎ．Ｄ．Ｓｉｎｈａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，４５３９（１９８４）；該文献の全記載はここに開示として援用される。）に記載の方法に準じてＤＮＡを合成することができる。また、このようにして合成したＤＮＡをベクターに組み込み、これを鋳型としてＴ７　ＲＮＡ　ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどのＲＮＡポリメラーゼを用いた転写反応により、ＲＮＡを合成することができる。１本鎖核酸分子は、ｉｎ　ｖｉｖｏで合成してもよく、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで合成してもよいが、生産物の精製が容易であること、使用するヌクレオチドとして修飾ヌクレオチドを用いることができることから、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで合成することが好ましい。
　１本鎖核酸分子をｉｎ　ｖｉｔｒｏで合成する際に使用するヌクレオチドは、市販されているものを用いてもよく、市販されているヌクレオチドからこれまでに知られている方法に従って合成したものを用いてもよい。例えば、各種修飾ヌクレオチドは、Ｂｌｏｍｍｅｒｓらの文献（Ｂｌｏｍｍｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８），３７，１７７１４－１７７２５．）、Ｌｅｓｎｉｋらの文献（Ｌｅｓｎｉｋ，Ｅ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９３），３２，７８３２－７８３８．）、特許文献（ＵＳ６２６１８４０）、Ｍａｒｔｉｎの文献（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．（１９９５）７８，４８６－５０４．）、特許文献（ＷＯ９９／１４２２６）、特許文献（ＷＯ００／４７５９９）、Ｈｕｙｎｈらの文献（Ｈｕｙｎｈ　Ｖｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，３２，３００５－３００８（１９９１））、Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎらの文献（Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ　Ｐ．Ｉｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２，１２５３　（１９９０））、特許文献（ＰＣＴ／ＷＯ９８／５４１９８）、参考文献（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８４）、特許文献（特開平７－８７９８２）などに記載の方法に従って製造することができる。なお、ここで挙げた上記文献の全記載はここに開示として援用される。
　合成した１本鎖核酸分子は、溶媒又は樹脂を用いる抽出、沈降、電気泳動、クロマトグラフィーなどのこれまでに知られている方法及び装置を用いて、精製してもよい。１本鎖核酸分子の取得に際しては、ジーンデザイン、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＱＩＡＧＥＮ、シグマアルドリッチなどの受託製造会社を利用した受託製造サービスを利用してもよい。
　１本鎖核酸分子は、対象となる遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡに結合するものであることから、ＲＮＡであることが好ましい。
　１本鎖核酸分子がＲＮＡである場合は、適用する対象内で合成されるようにデザインされたものであってもよく、例えば、１本鎖核酸分子をコードする遺伝子（ＤＮＡ断片）を適用対象に適したベクターに挿入したものであってもよい。このようなベクターを適用対象内に導入して、１本鎖核酸分子をコードする遺伝子について転写されると、１本鎖核酸分子が適用対象内で合成されることになる。このような目的で使用し得るベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　１本鎖核酸分子はｉｎ　ｖｉｖｏでもｉｎ　ｖｉｔｒｏでも使用できる。ｉｎ　ｖｉｖｏで１本鎖核酸分子を適用する対象は特に限定されず、動物、植物、微生物などのいずれの生物個体であってもよい。動物としては、例えば、哺乳類が挙げられ、哺乳類としてはヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどが挙げられ、これらの中でもヒトであることが好ましい。適用対象は、健常な生物個体であってもよいが、後述する遺伝性疾患を有する生物個体及びその危険性がある生物個体など、遺伝性疾患の予防又は治療が望まれる生物個体であることが好ましい。また、適用対象は生物個体そのものであってもよいが、生物個体の一部であってもよく、例えば、細胞、組織、臓器などであってもよい。
　１本鎖核酸分子のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの使用は、試薬などとして、実験、研究、医療など、その目的は問わない。例えば、医療目的としては、遺伝性疾患に罹患した者から採取した幹細胞を、１本鎖核酸分子が定常的に合成するように改変し、培養した上で、遺伝性疾患に罹患した者へ移植することができる。このように、本発明の一態様の１本鎖核酸分子は、再生医療、細胞治療などの医療目的で使用することができる。
　１本鎖核酸分子は、適用対象の細胞内に移行され易いように、核酸導入補助剤とともに使用されることが好ましい。核酸導入補助剤としては、例えば、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、リポソーム、ポリアミン、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム、デンドリマー、脂質ナノ粒子などが挙げられるが、これらに限定されない。
　１本鎖核酸分子の使用量は、１本鎖核酸分子を適用した場合に－１フレームシフトが誘導される量であれば特に限定されず、例えば、成人に適用する場合は、０．００１ｎｍｏｌ／ｋｇ／日～１００ｍｍｏｌ／ｋｇ／日などが挙げられ、優れた－１フレームシフト誘導作用を得ること、１本鎖核酸分子の合成のコストなどを考慮すれば、５００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日～５００ｍｍｏｌ／ｋｇ／日であることが好ましく、４０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日～５００μｍｏｌ／ｋｇ／日であることがより好ましい。
　１本鎖核酸分子の－１フレームシフト誘導作用を評価する方法は特に限定されず、例えば、１本鎖核酸分子の適用の有無における、対象とする遺伝子のｍＲＮＡの量、対象とする遺伝子がコードするタンパク質の量又はそれらの両方の量の増減を確認する方法などが挙げられる。また、１本鎖核酸分子を適用した者の疾患が予防又は治療されたこと、又は症状が緩和されたことを診察及び／又は検査することにより、確認してもよい。
　１本鎖核酸分子の－１フレームシフト誘導作用の程度は特に限定されず、例えば、１本鎖核酸分子を用いない場合（コントロール）と比べて、対象とする遺伝子に関するｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の量に変動（増加量又は減少量）が認められる程度であればよい。
［組成物］
　１本鎖核酸分子は、単独で、又はその他の成分と混合して組成物の形態で用いられる。本発明の別の態様は、本発明の一態様の１本鎖核酸分子を有効成分として含む、－１フレームシフトを誘導するために用いられる組成物である。組成物の具体的な態様は、医薬品用組成物、飲食品用組成物、医薬部外品用組成物、化粧品用組成物、動物飼料用組成物などが挙げられる。組成物は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口製剤；注射剤、坐剤、貼付剤、外用剤などの非経口製剤などの製剤であり得る。
　その他の成分は、１本鎖核酸分子が適用された場合に－１フレームシフトが誘導される限りにおいて特に限定されないが、例えば、医薬品を製造する際に使用される成分などが挙げられ、具体的には、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バイレショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩などの無機系賦形剤など）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩：無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；上記澱粉誘導体など）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、前記賦形剤と同様の化合物など）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類など）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤など）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；ソルビン酸など）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される甘味料、酸味料、香料など）、希釈剤などが挙げられる。
　組成物は、溶液状態で供給してもよい。この場合、１本鎖核酸分子の保存安定性を考慮すれば、組成物は、冷蔵条件下で、冷凍条件下で、又は凍結乾燥にして保存することが好ましい。凍結乾燥した組成物は、用時に溶解液（注射用蒸留水など）で溶かして、溶液状態に戻して用いればよい。
　組成物の適用量は、－１フレームシフト誘導作用が発現する量であれば特に限定されないが、例えば、成人（６０ｋｇ）に適用する場合は、約０．１ｍｇ／日～１０，０００ｍｇ／日であり、好ましくは１ｍｇ／日～１，０００ｍｇ／日である。本発明の一態様の組成物は、１日に１回又は複数回に分けて適用することができる。本発明の一態様の組成物による－１フレームシフト誘導作用を持続的に発現させたい場合は、本発明の一態様の組成物を数日間～数週間～数ヵ月間～数年間に渡って、継続的又は断続的に適用することが好ましい。本発明の一態様の組成物の具体的な用法及び用量は、適用する生物個体の種類、生物個体が有する、若しくはその危険性がある疾患又は症状の種類及び程度、年齢、投与方法などにより適宜変更し得る。
　本発明の一態様の組成物は、－１フレームシフトを誘導して、対象遺伝子の発現を増加すること、又は低減することにより、種々の遺伝性疾患を予防すること、及び／又は治療することができる。本発明の一態様の組成物は、好ましくは－１フレームシフトを誘導することにより、前記標的配列を含む遺伝子の発現を正常化して、該遺伝子の発現異常により発症する遺伝性疾患を予防及び／又は治療するための医薬品用組成物である。遺伝性疾患は特に限定されないが、例えば、筋ジストロフィー、癌、多発性硬化症、脊髄性筋萎縮症、レット症候群、筋萎縮性側索硬化症、脆弱Ｘ症候群、プラダー・ウィリー症候群、色素性乾皮症、ポルフィリン症、ウェルナー症候群、進行性骨化性線維異形成症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テイ－サックス病、神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、関節炎、血友病、フォンヴィレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、腎結石、骨形成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾患、小脳運動失調、結節性硬化症、家族性赤血球増加症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン－ピック病、マルファン症候群などを挙げることができる。上記のとおり、本発明の一態様の１本鎖核酸分子及び組成物の有効量を投与することにより、対象となる遺伝子の発現異常により発症する遺伝性疾患を有する、又はその危険性がある生物個体に対して、遺伝性疾患を治療及び／又は予防することができる。さらに、本発明の一態様の１本鎖核酸分子及び組成物の有効量を投与することにより、対象となる遺伝子の発現異常が認められる細胞、組織、臓器又は生物個体に対して、遺伝子の発現異常を改善することなどができる。
　遺伝性疾患のうち、遺伝子のエクソンのアウトオブフレーム変異に起因する遺伝性疾患は、エクソンの読み枠がずれることにより、アウトオブフレーム変異が生じたエクソンが部分的に又は全体的に発現されず、結果としてＮＭＤが生じて遺伝子の発現量が低下する場合が多い。このような場合に、本発明の一態様の組成物を用いれば、－１フレームシフトを誘導して、遺伝子のエクソンの読み枠のずれを訂正してインフレーム変異を発生させて、アウトオブフレーム変異が生じたエクソンを部分的に、又は全体的に発現して、結果としてＮＭＤの影響を低減して遺伝子の発現量を増加することができる。このような遺伝子の発現量が低下することにより生じる遺伝性疾患としては、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、色素性乾皮症、βサラセミア、大腸癌などが挙げられる。
　一方、なんらかの原因により、本来発現していなかった、又は発現量が低かった変異型遺伝子が発現することがあり、結果として遺伝性疾患が生じる場合がある。このような場合に、本発明の一態様の組成物を用いれば、－１フレームシフトを誘導して、遺伝子のエクソンの読み枠をずらしてアウトオブフレーム変異を発生させて、エクソンを部分的に、又は全体的に発現させず、結果としてＮＭＤを誘導して有害な変異型遺伝子の発現量を低減することができる。このような変異型の遺伝子が発現することによって異常なタンパク質が合成されることにより発症する遺伝性疾患としては、癌、進行性骨化性線維異形成症、家族性アルツハイマー病、家族性アミロイドポリニューロパチー、ハンチントン病といった頻度の高い優性遺伝性疾患などが挙げられる。
　例えば、ジストロフィン遺伝子が発現しないこと、又は発現量が少ないことにより、筋ジストロフィーが発症する。ジストロフィン遺伝子は７９個のエクソンからなる遺伝子である。このうち、アウトオブフレーム変異が生じたデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者のジストロフィン遺伝子は、第４５番～第５５番のエクソン（エクソン４５～５５）のいずれかのエクソン又は複数のエクソンが欠失している場合が多い。後述する実施例で用いているＤＭＤ患者由来の線維芽細胞であるＧＭ０３４２９は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５からエクソン５０までの６エクソン（８７１塩基＝２９０×３＋１塩基）を欠失した変異ジストロフィン遺伝子を有する。この欠失した６エクソンは、８７１塩基からなり、３の倍数の塩基＋１塩基であるために、センスストランドでインフレーム化に２塩基足りない状態となる。すなわち、１塩基欠失が生じると、３塩基に２塩基足りないので、後方（３’方向）にフレームが＋１にシフトする。これを解消させるには、フレームを－１（５’方向）にずらすか、＋２にシフトして３’方向に後戻りさせ、３の倍数にしなくてはならない。これを図示したのがスキーム（ＩＶ）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 スキーム（ＩＶ）
　正常なジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡは、エクソン５０の最後の塩基であるＵとエクソン５１の先端部のＣＵとが一つのセンスコドンＵＣＵ（セリンに対応）を形成し、その後はエクソン５１のＣＣＵが一つのセンスコドン（プロリンに対応）を形成する。しかし、エクソン４５～エクソン５０が欠失した変異ジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡは、エクソン５０の最後の塩基であるＵが失われ、読み枠がずれることにより、エクソン５１の先端部のＣＵＣが一つのセンスコドン（ロイシンに対応）を形成し、その後はエクソン５１のＣＵＡが一つのセンスコドン（ロイシンに対応）を形成し、以後正常なジストロフィンタンパク質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列をコードすることになる。
　それに対して、スキーム（ＩＶ）において、下線部で示した箇所を標的配列として、本発明の一態様の組成物を用いることにより、－１フレームシフトが生じるとともに、リボソームのスリッピングが発生すると考えられる。すなわち、エクソン４４の最後のセンスコドン（ＡＡＧ）の後に－１フレームシフトによってセンスコドンＧＣＵが生じて、以後トリプレットコドンが形成される。その結果、エクソン５１の２番目のセンスコドン（ＣＣＵ）からは正常なジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡと同一のアミノ酸をコードすることになる。
　この場合、結果として、－１フレームシフトが生じた変異ジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡは、正常なジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡとは、エクソン５０の最後の塩基とエクソン５１の先端部の２個の塩基との間で形成されるセンスコドン（ＵＣＵ）に対応するセリンの代わりに、－１フレームシフトによって生じたセンスコドン（ＧＣＵ）に対応するアラニンが付加されたものになる。なお、これらの推測は、実験により得られた推測であり、標的配列と－１フレームシフト発生部位との間のヌクレオチド数は適宜変更できる場合がある。また、このような－１フレームシフトの理論は、ＦＡＲＡＢＡＵＧＨの文献（ＰＨＩＬＩＰ　Ｊ．ＦＡＲＡＢＡＵＧＨ、ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＲＥＶＩＥＷＳ，Ｍａｒ．１９９６，ｐ．１０３－１３４；該文献の全記載はここに開示として援用される。）のＦＩＧ．４に記載されている、－１フレームシフトに関するＪａｃｋｓらのモデル及びＷｅｉｓｓらのモデルとよく合致する。
　上記推測に基づけば、本発明の一態様の組成物を用いることにより、変異ジストロフィン遺伝子によって発現される変異ジストロフィンタンパク質のアミノ酸配列は、エクソン４５～エクソン５０によってコードされるアミノ酸及びエクソン５０の最後の塩基とエクソン５１の先端部の２個の塩基とによって形成されるセンスコドンに対応するアミノ酸（セリン→アラニン）のみが異なり、その余は正常なジストロフィンタンパク質のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列になる。したがって、本発明の一態様の組成物を用いれば、エクソンの欠失部分を除けば、正常なジストロフィンタンパク質とは１アミノ酸のみが異なるアミノ酸配列を有する変異ジストロフィンタンパク質を得ることができる。
　別の例として、ｃ－ｍｙｃ遺伝子などの癌遺伝子の発現産物のアミノ酸配列を変えること、癌遺伝子の発現を低減することなどができれば、癌の進行を停滞又は緩和することが期待される。そこで、癌遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡをターゲットとして、本発明の一態様の組成物を用いて－１フレームシフトを誘導することにより、癌遺伝子の発現産物の構造を変えて活性を低下すること、癌遺伝子の発現産物の発現量を低減することなどを通じて、癌を予防及び／又は治療することが可能である。また、ｃ－ｍｙｃ遺伝子は、いわゆる「人工多能性幹細胞」（ｉＰＳ細胞）を製造する際に使用される。そこで、ｉＰＳ細胞を製造する際に使用するｃ－ｍｙｃ遺伝子をターゲットとした本発明の一態様の組成物を、ｃ－ｍｙｃ遺伝子の導入及び発現と同時に、又は異時に用いることにより、ｉＰＳ細胞を製造しつつ、ｉＰＳ細胞が癌化することを防ぐことが期待される。
　本発明の一態様の組成物の製造方法は特に限定されず、例えば、有効成分である１本鎖核酸分子と、任意に他の成分とを混合して、所望の剤形に成形する方法などが挙げられる。本発明一態様の組成物の包装形態は特に限定されず、適用される形態及び剤形などに応じて適宜選択できるが、例えば、バイアル、アンプルなどのガラス容器；ガラス、アルミなどの金属、コーティング紙、ＰＥＴなどのプラスチックなどを素材とするバイアル、アンプル、瓶、缶、パウチ、ブリスターパック、ストリップ、１層又は積層（ラミネート）のフィルム袋などが挙げられる。
　非限定的な具体例として、本発明の一態様の組成物をＤＭＤ患者に適用する場合は、以下のようにして行うことができる。すなわち、有効成分である１本鎖核酸分子をこれまでに知られている方法で製造し、これを常法により滅菌処理し、例えば、１本鎖核酸分子を含む１ｍｌの注射剤を調製する。この注射剤を、患者静脈内に１本鎖核酸分子の投与量が体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ～１００ｍｇとなるように、輸液により点滴投与する。投与は、例えば、１週間～２週間の間隔で数回繰り返し、その後も、診察；Ｘ線、ＣＴ、ＭＲＩなどの撮像；内視鏡、腹腔鏡などによる観察；細胞診、組織診などにより筋力増強効果を確認しつつ、適宜投与を繰り返す。
　以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
［例１．ＥＧＦＰ－Ｈｕｍａｎ　α－Ｔｕｂｕｌｉｎ遺伝子のＯＲＦの－１フレームシフト評価］
１．評価の概要
　人工的に作製した核酸分子を使用して、１４３Ｂｔｋ－骨肉腫細胞に導入したｐＥＧＦＰ－ＴｕｂベクターにおけるＥＧＦＰ－Ｈｕｍａｎ　α－ＴｕｂｕｌｉｎのＯＲＦ（Ｏｐｅｎ　Ｒｅａｄｉｎｇ　Ｆｒａｍｅ）を－１だけ人為的にフレームシフトさせた。上記核酸分子のターゲット配列の近傍にてＯＲＦが－１フレームシフトすることにより、ＥＧＦＰ蛍光タンパク質のアミノ酸配列を途中から変えて、更にＥＧＦＰ遺伝子配列とα－Ｔｕｂｕｌｉｎ遺伝子配列との連結部分の境界に最初の終止コドン（ＴＧＡ）として、早期終止コドン（Ｐｒｅｍａｔｕｒｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　Ｃｏｄｏｎ：ＰＴＣ）を発生させた。
２．試験細胞株の作製
　１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭで培養した１４３Ｂｔｋ－骨肉腫細胞に、ｐＥＧＦＰ－Ｔｕｂベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社；６．０ｋｂ）を、トランスフェクション試薬「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００」（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてトランスフェクションした。Ｇ４１８硫酸塩（コスモ・バイオ社）を用いて薬剤選択することにより、Ｃ末端にヒトα－Ｔｕｂｕｌｉｎタンパク質が融合したＥＧＦＰ蛍光タンパク質（Ｈｕｍａｎ　α－Ｔｕｂｕｌｉｎタンパク質）がステイブルに高発現している１４３Ｂｔｋ－骨肉腫細胞のクローンを試験細胞株として選抜した。
３．フレームシフト用核酸分子の作製
　－１フレームシフトを引き起こす核酸分子について、本明細書に記載の諸条件に基づいて、該核酸分子の数種類を分子設計した。反応液におけるコンフォメーションを、ＲＮＡ　２次構造予測プログラム「ＣｅｎｔｒｏｉｄＦｏｌｄ」（入手先：ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｓａｔｏｋｅｎ／ｃｅｎｔｒｏｉｄ－ｒｎａ－ｐａｃｋａｇｅ）にてシュミレーションし、安定性の高いものをカスタム合成した。
　ＥＧＦＰ－Ｈｕｍａｎ　α－Ｔｕｂｕｌｉｎのコーディング領域（ＣＤＳ）を図１に示す。図１に示すとおり、ＥＧＦＰ遺伝子（配列番号７）は、リンカー（５’－ＴＣＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡ－３’；配列番号８）を介して、Ｈｕｍａｎ　α－Ｔｕｂｕｌｉｎ遺伝子（配列番号９）と連結している。
　分子設計は、ターゲット配列の位置（Ｔａｒｇｅｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に基づいて設計した。具体的には、スリッピングを起こす最後の元のコドンの位置から６塩基のスペーサー塩基を挟んで、ステムループのＡｘｉｓの底に当たる２塩基以降に、ターゲット配列を十数塩基設計した。ターゲット配列は、移動してきたリボソームの進行を阻害し、力学的に１塩基のスリッピングを前方の配列で起こす、十分な結合をフレームシフト用核酸分子との間に有するものとし、－１方向の塩基のスリッピングを引き起こした後は、翻訳を再開し、フレームシフト分子をｍＲＮＡから引き剥がす位の結合の緩さも同時に有するものとした。このために、ターゲット配列は十数塩基であることが好ましく、ターゲット配列に結合する部分がフレームシフト用核酸分子の他の部分と結合及び相互作用してステムループ構造を崩さない位の長さに設定した。実験的に、ターゲット配列は１０塩基から１３塩基程度の長さにし、ＲＮＡの２次構造予測プログラムであるＣｅｎｔｒｏｉｄＦｏｌｄにて、ステムループの基本構造が崩れていないことを確認しながら、鎖長を調整し、最も構造的に安定したフレームシフト用核酸分子として設計した。結果として、ターゲット配列に対するフレームシフト用核酸分子は、より安定した分子構造を有すると推測された。
　理論的には、設計したフレームシフト用核酸分子が－１のフレームシフトをターゲット配列近傍で引き起こすことにより、ＥＧＦＰ遺伝子配列とヒトα－Ｔｕｂｕｌｉｎ遺伝子配列との境界付近にＰＴＣが発生し、１４３Ｂｔｋ－骨肉腫細胞内でα－Ｔｕｂｕｌｉｎタンパク質を失ったＥＧＦＰ蛍光タンパク質のみが発現する。ただし、ｐＥＧＦＰ－Ｔｕｂベクターから発現する蛍光タンパク質のｐｒｅ－ｍＲＮＡの構造はシングルエクソンであるので、後述する例３にあるように、細胞内ｍＲＮＡ品質管理システムであるＮＭＤ（Ｎｏｎｓｅｎｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｍＲＮＡ　ｄｅｃａｙ：ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構）を作動させることはない。すなわち、ＥＧＦＰ遺伝子のｍＲＮＡ発現は依然として存在する。
　ターゲット配列に対するフレームシフト用核酸分子として「Ｓｔｅｍ３８ｅｇｆｐ（ＣＧ）」（配列番号１）を設計した。また、Ｓｔｅｍ３８ｅｇｆｐ（ＣＧ）に配列及び構造が類似しており、かつＥＧＦＰ遺伝子をターゲットとしない「ａｃＧＦＰ２」（配列番号６）を設計した。Ｓｔｅｍ３８ｅｇｆｐ（ＣＧ）及びａｃＧＦＰ２の構造をそれぞれスキーム（Ｖ）及び（ＶＩ）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　スキーム（Ｖ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　スキーム（ＶＩ）
　各核酸分子について、ＴＥバッファーを用いて１００μＭに調製して、核酸分子溶液を作製した。
４．フレームシフトの誘導
　６ウェルプレートの各ウェルに、試験細胞株を播いた後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、２日間培養した。コンフルエンシー８０％に達した後、各ウェルの培地を、各核酸分子及びトランスフェクション試薬（「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００」）を混合して添加したＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に置換した。このＯｐｔｉ－ＭＥＭで細胞を６時間のトランスフェクション処理に供した後、６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２条件下で、４８時間インキュベートする薬剤処理に供した後、アッセイに供した。
　なお、各核酸分子及びトランスフェクション試薬を添加せずにＯｐｔｉ－ＭＥＭのみを用いた試験群を無処理（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ：Ｕｎｔ）群とし；各核酸分子を添加せずにトランスフェクション試薬のみを添加したＯｐｔｉ－ＭＥＭを用いた試験群をモック（Ｍｏｃｋ）群とし；ターゲット配列を標的とする分子「Ｓｔｅｍ３９ｅｇｆｐ（ＧＣ）」を用いた試験群をＰ群とし；及びＥＧＦＰ遺伝子を標的としない「ａｃＧＦＰ２」を用いた試験群をＮＣ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）群として、５つの試験群を用意した。Ｐ群及びＮＣ群において、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中の各核酸分子の最終濃度は４０ｎＭとなるようにした。
　トランスフェクション処理後、各ウェルの培地を１５％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭに置換して、６ウェルプレートを、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、４８時間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルの細胞を蛍光顕微鏡「ＢＺ－Ｘ９０００」（キーエンス社）を用いて観察して、ｐＥＧＦＰ－Ｔｕｂベクターから転写及び翻訳して、ステイブルに発現する緑色の蛍光タンパク質を確認した。
５．フレームシフトの誘導評価
　各試験群の細胞について、蛍光顕微鏡により観察した結果を図２に示す。図２に示すとおり、Ｕｎｔ群、Ｍｏｃｋ群及びＮＣ群においては、細胞内において、核を除く細胞質にて、ヒトα－Ｔｕｂｕｌｉｎタンパク質融合ＥＧＦＰタンパク質が細胞骨格に沿って配向したことによる蛍光を確認した。それに対して、Ｐ群では、細胞内において、拡散して滲んだような弱い蛍光を確認した。
　以上の観察結果より、Ｐ群で用いた核酸分子Ｓｔｅｍ３８ｅｇｆｐ（ＣＧ）は、－１フレームシフトを誘導したこと；これにより読み枠が変わって、ＥＧＦＰ－ヒトα－Ｔｕｂｕｌｉｎ融合タンパク質から、足場タンパク質であるヒトα－Ｔｕｂｕｌｉｎが欠損し、配向性を失ったＥＧＦＰタンパク質が細胞内にランダムに拡散したこと；蛍光が弱かったことから、発現したＥＧＦＰタンパク質は、正常なアミノ酸配列から、ＯＲＦのシフトが生じた部分からアミノ酸配列が変わり、全体として蛍光が弱くなるようなアミノ酸配列を有するものになったことがわかった。
［例２．ＤＨＦＲ遺伝子のＯＲＦの－１フレームシフト評価］
１．評価の概要
　２種類のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ無細胞翻訳系により、ＯＲＦの－１フレームシフトを検証した。
　大腸菌由来のＤＨＦＲ遺伝子（配列番号１０）のＣＤＳを図３に示す。第１のＤＮＡ断片であるＤＨＦＲは、ＤＨＦＲ遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）の上流にＴ７プロモーター及びリボソーム結合サイト（ＳＤ配列）を配置して含む。
　ＤＨＦＲを用いて転写及び翻訳すると、正常なＤＨＦＲタンパク質が得られる。一方、－１フレームシフトが起きた場合、読み枠が変わり、図３において示した－１ストップコドン（ＰＴＣ）が生じて翻訳が終了し、ＰＴＣ前までの不完全な長さのＤＨＦＲタンパク質が得られる。
　第２のＤＮＡ断片であるＤＨＦＲ－Ｈｉｓは、第１のＤＮＡ断片を鋳型として、Ｔ７プロモーター上流の配列の一部及びＴ７プロモーター配列の一部に相補的なフォワードプライマー「Ｐｒｉｍｅｒ　ＤＨＦＲ－Ｈｉｓ＿Ｆｗ」（配列番号１１）と、ＤＨＦＲ遺伝子の途中の「３’Ｒｅｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｉｔｅ」（図３）に相補的なリバースプライマー「Ｐｒｉｍｅｒ　ＤＨＦＲ－Ｈｉｓ＿Ｒｖ」（配列番号１２）とを用いたＰＣＲにより得られるＤＮＡ断片である。リバースプライマーのヌクレオチド配列を図４Ａに示す。
　図４Ａに示すとおり、Ｐｒｉｍｅｒ　ＤＨＦＲ－Ｈｉｓ＿Ｒｖには、－１フレームシフトによってＨｉｓタグが生じるような配列構成をしている。通常、ＤＨＦＲ－Ｈｉｓを用いて転写及び翻訳すると、リバースプライマーの３’側にあるストップコドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ）まで翻訳が進み、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグを含まないタンパク質が得られる。一方、－１フレームシフトが起きた場合、読み枠が変わり、－１ストップコドン（ＴＡＡ）にて翻訳が終了し、Ｃ末端にＨｉｓタグを有するタンパク質が得られる。
　以上のとおり、ＤＨＦＲ及びＤＨＦＲ－Ｈｉｓを用いれば、－１フレームシフトの有無により、それぞれ異なるタンパク質が得られる。図４Ｂに、ＤＨＦＲタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３）及びＤＨＦＲ－Ｈｉｓタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。このようなＤＮＡ断片を用いて、再構成無細胞翻訳系により、人工的に設計した核酸分子がＤＨＦＲ遺伝子中のターゲット配列に結合し、本来のＯＲＦを－１だけシフトすると、合成されるタンパク質のアミノ酸配列が変化し、－１フレームシフトが検出可能となる。
２．フレームシフト用核酸分子の作製
　ターゲット配列の設定は、容易に－１のｓｌｉｐｐａｇｅを起こすと予測された場所の近傍を選択した。図３にＤＨＦＲ遺伝子上のターゲット配列の位置（Ｔａｒｇｅｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を示す。
　上記したとおり、ＤＨＦＲ－Ｈｉｓが転写及び翻訳された場合、－１フレームシフトが起これば、最初に現れる終止コドン（－１　Ｓｔｏｐ　ｃｏｄｏｎ（ＰＴＣ））の位置の直前から、Ｃ末端にてＨｉｓタグが融合した約９．６ｋＤａのタンパク質が合成されると推測される。安定した分子構造を有するフレームシフト用核酸分子を「Ｓｔｅｍ３９ｄｈｆｒ（ＧＣ）」（配列番号２）とした。Ｓｔｅｍ３９ｄｈｆｒ（ＧＣ）の構造をスキーム（ＶＩＩ）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　スキーム（ＶＩＩ）
３．フレームシフトの誘導
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ無細胞翻訳キットとして、「ＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標）２．０」（コスモ・バイオ社）を用いた。ＤＨＦＲは、キットに付属する「ＤＨＦＲ　ＤＮＡ」を用いた。ＤＨＦＲ－Ｈｉｓは、ＤＨＦＲを鋳型として、ＤＨＦＲ－Ｈｉｓ＿Ｆｗ及びＤＨＦＲ－Ｈｉｓ＿Ｒｖを用いて、常法に従ってＰＣＲを実施し、得られたＰＣＲ産物を精製することにより得られた。
　使用したキットの反応液の組成を表１に示す。ここで、サンプル溶液は、表２に示すものを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＣ）には、サンプル溶液として蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）を用いた（試験群１）。Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＰＣ）には、サンプル溶液としてＤＨＦＲ遺伝子の全長を有するＤＨＦＲを含む溶液を用いた（試験群２）。フレームシフト反応系１には、サンプル溶液としてフレームシフト用核酸分子であるＳｔｅｍ３９ｄｈｆｒ（ＧＣ）及びＤＨＦＲの両方を含む溶液を用いた（試験群３）。フレームシフト反応系２には、サンプル溶液としてＳｔｅｍ３９ｄｈｆｒ（ＧＣ）、並びにＤＨＦＲ遺伝子の一部及び－１フレームシフトによってＨｉｓタグを有するように設計されているＤＨＦＲ－Ｈｉｓの両方を含む溶液を用いた（試験群４）。Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＰＮ）には、サンプル溶液としてＤＨＦＲ－Ｈｉｓのみを含む溶液を用いた（試験群号５）。サンプル溶液において、Ｓｔｅｍ３９ｄｈｆｒ（ＧＣ）は、反応液（２０μｌ）中の濃度が５００ｎＭとなるように調製した。同様に、サンプル溶液において、ＤＨＦＲ及びＤＨＦＲ－Ｈｉｓは、反応液（２０μｌ）中の量がそれぞれ２０μｇ及び６０μｇとなるように調製した。
　各反応液をサーマルサイクラー用のチューブに入れて、４時間、３７℃にて、サーマルサイクラーを用いてタンパク質合成反応に供した。
　試験群１～３の反応済み溶液２０μＬに、ｄｄＨ２Ｏ　２０μＬを加えて２倍希釈した。得られた希釈溶液に、１０ｖｏｌ％　β－メルカプトエタノールの入った４×ＳＤＳサンプルバッファー　１３．３μＬを添加したものを、９５℃、５分間で加熱して、タンパク質を熱変性させた。
　試験群４及び５の反応済み溶液　２０μＬには、Ｈｉｓタグ融合タンパク質精製キット「ＣａｐｔｕｒｅｍＴＭ　Ｈｉｓ－ｔａｇｇｅｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ」（クロンテック社）に付属のｘＴｒａｃｔｏｒバッファー　２７５μＬを加えて、約３００μＬの溶液Ａを調製した。調製した溶液Ａを、平衡化したＨｉｓタグ融合タンパク質吸着カラムに加えた。カラムの平衡化は、ｘＴｒａｃｔｏｒバッファーを入れ、９，８００ｇにて、１分４５秒間遠心することにより実施した。
　溶液Ａを加えたカラムを、９，８００ｇにて、１分４５秒間遠心し、得られた上清を「Ｌｙｓａｔｅ」として回収した。次いで、カラムにｗａｓｈバッファー　３００μＬを入れて、９，８００ｇにて、１分４５秒間遠心し、得られた上清を「Ｗａｓｈ」として回収した。次いで、カラムからＨｉｓタグ融合タンパク質を溶出させるために、カラムにｅｌｕｔｉｏｎバッファー　３００μＬを入れて、９，８００ｇ、１分４５秒間にて遠心し、得られた上清を「Ｅｌｕｔｉｏｎ１」として回収した。次いで、同様の操作を実施することにより、「Ｅｌｕｔｉｏｎ２」を回収した。
　回収した各溶液　１５０μＬあたり、４×ＳＤＳサンプルバッファー　４５μＬを加えて混合し、次いで５０μＬごとに分注した。分注した溶液をチューブに入れて、サーマルサイクラーにて９５℃、５分間にてタンパク質を熱変成させた。熱変成させたタンパク質サンプルを－２０℃にて保存した。
　試験当日、凍結保存していた熱変成させたタンパク質サンプルを、「Ｌｙｓａｔｅ」、「Ｗａｓｈ」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ１」及び「Ｅｌｕｔｉｏｎ２」ごとに１．５ｍＬチューブにまとめた。次いで、各サンプル溶液の全量を、フィルターカラム「Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）　Ｕｌｔｒａ－０．５（３ｋ）」（Ｍａｘ　Ｖｏｌｕｍｅ　５００μＬ；メルク・ミリポア社）に入れて、１２，０００ｇ、約４５分間にて遠心した。次いで、フィルターカラムを逆さまにして、１２，０００ｇ、２分間にて遠心し、濃縮されたタンパク質サンプルをフィルターカラムから回収した。回収した濃縮タンパク質サンプルの全量（４５μＬ）を、タンパク質電気泳動用ポリアクリルアミドゲル「１０－２０％　ＣｒｉｔｅｒｉｏｎＴＭ　ＴＧＸＴＭプレキャストゲル」（バイオ・ラッド社）の各ウェルにアプライした。同様に、試験群１～３の熱変成タンパク質サンプルの全量を各ウェルにアプライした。各タンパク質サンプルをアプライしたゲルを、２００Ｖ、５０分間の電気泳動処理に供した。各ウェルにアプライしたタンパク質サンプルの配置は表３のとおりになる。なお、分子量マーカー（Ｍ）には、「プレシジョンＰｌｕｓプロテインデュアルエクストラスタンダード」（バイオ・ラッド社；製品番号１６１０３７７）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　電気泳動後のゲルを、クマシー色素タンパク質ゲル染色試薬「Ｓｉｍｐｌｙ　Ｂｌｕｅ　Ｓａｆｅ　Ｓｔｅｉｎ」（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて染色し、バンドを可視化した。
４．フレームシフトの誘導評価
　ゲル染色後の結果を図５Ａ～図５Ｃに示す。図５Ａは、染色後のゲル全体を撮影した図である。図５Ｂは、図５Ａのうち、ＴＥＳＴ２　Ｅｌｕｔｉｏｎ１及びＥｌｕｔｉｏｎ２のＨｉｓタグ化ＤＨＦＲタンパク質が現れた箇所を拡大した図である。図５Ｃは、図５Ａのうち、ＮＣ、ＰＣ及びＴＥＳＴ１のＤＨＦＲタンパク質及びＤＨＦＲタンパク質断片が現れた箇所を拡大した図である。
　ＤＨＦＲ－Ｈｉｓ及びフレームシフト用核酸分子Ｓｔｅｍ３９ｄｈｆｒ（ＧＣ）を加えた反応液（ＴＥＳＴ２）によるＬａｎｅ６（ＴＥＳＴ２　Ｅｌｕｔｉｏｎ１）及びＬａｎｅ７（ＴＥＳＴ２　Ｅｌｕｔｉｏｎ２）にて、Ｈｉｓタグ融合タンパク質のバンドが認められた。特に、Ｌａｎｅ６にて、明瞭なバンドが認められた。それに対して、ＤＨＦＲ－Ｈｉｓのみを加えて、フレームシフト用核酸分子Ｓｔｅｍ３９ｄｈｆｒ（ＧＣ）を加えなかった反応液（ＰＮ）によるＬａｎｅ１１（ＰＮ　Ｅｌｕｔｉｏｎ１）及びＬａｎｅ１２（ＰＮ　Ｅｌｕｔｉｏｎ２）では、Ｈｉｓタグ融合タンパク質が合成されているならば出現したであろう位置にバンドは認められなかった。
　以上の結果から、フレームシフト用核酸分子Ｓｔｅｍ３９ｄｈｆｒ（ＧＣ）は、ＤＨＦＲ－Ｈｉｓが翻訳される際に、ＯＲＦの－１フレームシフトが起こり、その結果としてＨｉｓタグ融合タンパク質が合成されたことが実証された。
　一方、ＤＨＦＲのみを加えた反応液（ＰＣ）によるＬａｎｅ２と同様に、フレームシフト用核酸分子Ｓｔｅｍ３９ｄｈｆｒ（ＧＣ）分子の両方を加えた反応液（ＴＥＳＴ１）によるＬａｎｅ３（ＴＥＳＴ１）では、ＤＨＦＲタンパク質の全長によるバンドが認められた。しかし、Ｌａｎｅ３では、ＤＨＦＲタンパク質の部分断片（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ＤＨＦＲタンパク質）によるバンドが色濃く認められた。
　以上の結果より、フレームシフト用核酸分子Ｓｔｅｍ３９ｄｈｆｒ（ＧＣ）分子によって、ＯＲＦの－１フレームシフトが生じ、本来のＤＨＦＲ遺伝子配列に存在しない終止コドン、すなわち、ＰＴＣが出現したことによって、翻訳が途中で停止したことが実証された。
　これらの結果は、人工的に設計したフレームシフト用核酸分子によって、人工的に－１フレームシフトを起こすことが可能であることが証明された。
［例３．ジストロフィン遺伝子のＯＲＦの－１フレームシフト評価］
１．評価の概要
　エクソンなどを欠失したことによりＯＲＦがずれ、アウトオブフレームになったｍＲＮＡのＯＲＦの途中にＰＴＣ（早期終止コドン）が発生することで、ｍＲＮＡの品質管理システムであるＮＭＤ（Ｎｏｎｓｅｎｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｍＲＮＡ　ｄｅｃａｙ：ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構）が誘導され、ＰＴＣを有するｍＲＮＡが積極的に分解される。
　デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）では、エクソンの数が７９個あるジストロフィン遺伝子（ＨＧＮＣ　ＩＤ　ＨＧＮＣ：２９２８，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｌｏｃａｔｉｏｎ：Ｘｐ２１．２－ｐ２１．１）について、一部のエクソンが欠失し、ＰＴＣを有するｍＲＮＡが生じて分解されるために、ジストロフィンタンパク質が合成されずに発症する。そこで、ＤＭＤなどの遺伝子疾患患者由来の生細胞内において、フレームシフト用核酸分子を用いて、ＯＲＦの－１フレームシフトを人為的に引き起こすことができれば、ＮＭＤを回避して分解されないような、比較的長大なジストロフィンタンパク質を合成できる。
　本例では、ジストロフィン遺伝子のうち、エクソン４５～エクソン５０を欠失したデュシェンヌ型筋ジストロフィーの患者由来の線維芽細胞に、ジストロフィンｍＲＮＡをターゲットとするように分子設計した治療分子であるフレームシフト用核酸分子をトランスフェクションし、ＯＲＦの－１フレームシフトを誘発した。－１フレームシフトが生じたことで、ジストロフィンｍＲＮＡのリボソーム翻訳時のアウトオブフレームをインフレームに修正し、ジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡの発現量の増大を確認することにより、生細胞内における－１フレームシフト及びそれによる遺伝病の治療の可能性を実証した。
２．試験細胞株
　ＤＭＤ患者由来の線維芽細胞であるＧＭ０３４２９は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５からエクソン５０までの６エクソン（８７１塩基＝２９０×３＋１塩基）を欠失した変異ジストロフィン遺伝子を有する。健常者由来の線維芽細胞であるＧＭ０５１１８は、正常なジストロフィン遺伝子を有する。ＧＭ０３４２９及びＧＭ０５１１８は、Ｃｏｒｉｅｌｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手した。
３．フレームシフト用核酸分子の作製
　変異ジストロフィン遺伝子は、エクソン４５～エクソン５０を欠失していることにより、エクソン４４の３’末端（ＡＡＧ）とエクソン５１の５’末端（ＣＴＣ）とが直接的に連結した配列となっている。この両末端のＡＡＧとＣＴＣとの間をブレイクポイント（Ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）とした。
　変異ジストロフィン遺伝子のエクソン４４とエクソン５１との間のブレイクポイントの近傍にて、３種類のターゲット配列としてＰｏｓｉｔｉｏｎ１、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ２及びＰｏｓｉｔｉｏｎ３を設定し、それぞれに対してフレームシフト用核酸分子「Ｐ１Ｓｔｅｍ３８ｄｍｄ４５－５０（ＧＣ）」（配列番号３）、「Ｐ２Ｓｔｅｍ３９ｄｍｄ４５－５０（ＣＧ）」（配列番号４）及び「Ｐ３Ｓｔｅｍ３９ｄｍｄ４５－５０（ＣＧ）」（配列番号５）を設計及び作製した。設計したフレームシフト用核酸分子について、「ＣｅｎｔｒｏｉｄＦｏｌｄ」にて計算し、安定性を確認した。Ｐｏｓｉｔｉｏｎ１、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ２及びＰｏｓｉｔｉｏｎ３のターゲット配列を図６Ａ～図６Ｃに示す。また、Ｐ１Ｓｔｅｍ３８ｄｍｄ４５－５０（ＧＣ）、Ｐ２Ｓｔｅｍ３９ｄｍｄ４５－５０（ＣＧ）及びＰ３Ｓｔｅｍ３９ｄｍｄ４５－５０（ＣＧ）の構造をそれぞれスキーム（ＶＩＩＩ）～（Ｘ）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 　スキーム（ＶＩＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 スキーム（ＩＸ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　スキーム（Ｘ）
４．細胞培養
　試験細胞株（ＧＭ０３４２９及びＧＭ０５１１８）は、１５％ＦＣＳ及びＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを添加したＤＭＥＭにて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、６ウェルプレートにて継代培養した。培養後、それぞれの細胞を回収した。
５．フレームシフトの誘導及びｃＤＮＡの合成
　回収した試験細胞株を、９６ウェルプレートの各ウェルに播いた後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、２日間培養した。コンフルエンシー９０％を確認後、各ウェルの培地を、各核酸分子及びトランスフェクション試薬（「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００」）を混合して添加したＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に置換した。６時間後、通常のＤＭＥＭに交換し、トランスフェクション処理後、９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２条件下で、４８時間の薬剤処理に供した。
　なお、試験細胞株をＧＭ０３４２９として、各核酸分子及びトランスフェクション試薬を添加せずにＯｐｔｉ－ＭＥＭのみを用いた試験群を無処理（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ：Ｕｎｔ）群（ｎ＝１）とし；各核酸分子を添加せずにトランスフェクション試薬のみを添加したＯｐｔｉ－ＭＥＭを用いた試験群をモック（Ｍｏｃｋ）群（ｎ＝６）とし；Ｐｏｓｉｔｉｏｎ１を標的とする分子「Ｐ１Ｓｔｅｍ３８ｄｍｄ４５－５０（ＧＣ）」を用いた試験群をＰ１群（ｎ＝３）とし；Ｐｏｓｉｔｉｏｎ２を標的とする分子「Ｐ２Ｓｔｅｍ３９ｄｍｄ４５－５０（ＣＧ）」を用いた試験群をＰ２群（ｎ＝３）とし；及びＰｏｓｉｔｉｏｎ３を標的とする分子「Ｐ３Ｓｔｅｍ３９ｄｍｄ４５－５０（ＣＧ）」を用いた試験群をＰ３群（ｎ＝３）として、５つの試験群を用意した。また、試験細胞株をＧＭ０５１１８として、各核酸分子及びトランスフェクション試薬を添加せずにＯｐｔｉ－ＭＥＭのみを用いた試験群を野生株（Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ：ＷＴ）群（ｎ＝２）とした。Ｐ１群、Ｐ２群及びＰ３群において、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中の各核酸分子の最終濃度は４０ｎＭとなるようにした。
　トランスフェクション終了後、回収した各ウェルの細胞について、ｃＤＮＡ合成キット「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ　ＩＩＩ　ＣｅｌｌｓＤｉｒｅｃｔ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、細胞を溶解し、得られたライセートにおけるｔｏｔａｌ　ＲＮＡを逆転写反応に供して、ｃＤＮＡを生成した。
６．ｑＰＣＲによるジストロフィンｍＲＮＡの定量
　ジストロフィンｍＲＮＡの定量は、リアルタイムＰＣＲ「ＴａｑＭａｎ（登録商標）　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ」及び「ＴａｑＭａｎ（登録商標）　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙ」（ともにＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及びリアルタイムＰＣＲ装置「ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＩＩ」を使用して、ΔΔＣＴ法によりｑＰＣＲを行なった。内在性コントロールはＧＡＰＤＨ遺伝子を使用して、その発現量に対するジストロフィンｍＲＮＡの発現量を相対量として算出した。
４．フレームシフトの誘導評価
　各試験群について、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量に対するジストロフィンｍＲＮＡ発現レベルの相対量をグラフ化したものを図７に示す。
　無処理群（Ｕｎｔ）のジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、正常線維芽細胞を用いたＷＴ群に比べ、低い発現レベルであった。同様に、トランスフェクション試薬のみを培地に加えたＭｏｃｋ群では、非常に低い発現レベルであった。これらの試験群では、エクソンの欠失によりＰＴＣを有することになったジストロフィンｍＲＮＡが、ｍＲＮＡの品質管理機構によって捕捉され、ＮＭＤにより分解されたことを示唆する。
　それに対して、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ１、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ２及びＰｏｓｉｔｉｏｎ３に対するフレームシフト用核酸分子Ｐ１Ｓｔｅｍ３８ｄｍｄ４５－５０（ＧＣ）、Ｐ２Ｓｔｅｍ３９ｄｍｄ４５－５０（ＣＧ）及びＰ３Ｓｔｅｍ３９ｄｍｄ４５－５０（ＣＧ）を用いたＰ１群、Ｐ２群及びＰ３群では、いずれの核酸分子を導入したＤＭＤ患者由来線維芽細胞においても、ジストロフィンｍＲＮＡ発現の増加が認められた。これらの結果から、フレームシフト用核酸分子がｍＲＮＡに結合及び作用して、ＯＲＦがリボソームで翻訳される際に、ＯＲＦのアウトオブフレームをインフレームにしたことにより、ＮＭＤが回避されたと考えられる。なお、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ２に対するフレームシフト用核酸分子Ｐ２Ｓｔｅｍ３９ｄｍｄ４５－５０（ＣＧ）を用いる場合、軸（Ａｘｉｓ）の前でＵＡＡの早期終止コドン（ＰＴＣ）が生じる。また、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ３に対するフレームシフト用核酸分子Ｐ３Ｓｔｅｍ３９ｄｍｄ４５－５０（ＣＧ）を用いる場合、軸（Ａｘｉｓ）の前及びターゲット配列の後にＵＡＡのＰＴＣが生じる。これにより、Ｐ１群に比べると、Ｐ２群及びＰ３群のｍＲＮＡ量が減った可能性がある。しかし、Ｐ２群及びＰ３群は、Ｍｏｃｋ群に比べると、ｍＲＮＡ量が多かったことから、これらの群で用いたフレームシフト用核酸分子によってＮＭＤを回避することができたと考えられる。ＮＭＤはＰＴＣの発生のみによって誘導されるわけではない、という知見は、本発明者によって初めて見出された驚くべき知見である。
　以上の結果より、フレームシフト用核酸分子を用いることにより、ＮＭＤを回避するなどして、ジストロフィンｍＲＮＡが分解することなく発現が維持されたことがわかる。このように、ＤＭＤ患者由来線維芽細胞において、非常に低い発現レベルのジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡが、フレームシフト用核酸分子により発現がみられるようになったということは、非常に驚くべきことである。そして、この事象は、フレームシフト用核酸分子がＤＭＤの治療に有用であることに直結する。
　以上のとおり、ジストロフィンｍＲＮＡが分解され、ジストロフィンタンパク質がほとんど産生されないことで起こるＤＭＤに対して、－１フレームシフトを誘導するように人工的に設計したフレームシフト用核酸分子は、ＤＭＤ、すなわち、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの有効な治療法となり得る。
　また、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５～エクソン５０が欠失したことに起因するデュシェンヌ型筋ジストロフィーように、＋１のＯＲＦのずれによって引き起こされるその他の遺伝子疾患もまた、－１フレームシフトを誘導するフレームシフト用核酸分子を用いれば治療することができる。
　その一方で、細胞内で機能しているターゲット遺伝子のｍＲＮＡのＯＲＦを－１フレームシフトさせて、不正な翻訳を発生させ、さらにＰＴＣを意図的にｍＲＮＡ上に発生させることによって、ＮＭＤを発動させてｍＲＮＡの分解を促すことにより、ｍＲＮＡの発現を低減すること、機能的な遺伝子産物を機能が消失した断片的な遺伝子産物（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）に変換すること、これらの結果として細胞内でのターゲット遺伝子の機能を無効化することが可能である。
　このように様々な遺伝子に対して設計可能なフレームシフト用核酸分子は、例えば、癌細胞に特異的に発現する遺伝子の機能を無効化することなどにより、癌の治療、生体に有害なタンパク質が発現することで引き起こされる優性遺伝病などの治療にも使用可能である。
　配列表に記載の配列は以下のとおりである：
［配列番号１］Ｓｔｅｍ３８ｅｇｆｐ（ＣＧ）
CGCUGCCGUCCCCGCAUUACCCCCCCCCCCUAGUGUGG
［配列番号２］Ｓｔｅｍ３９ｄｈｆｒ（ＧＣ）
CCGAUUGAUUCCGCGCAUUACCCCCCCCCCCUAGUGUGC
［配列番号３］Ｐ１Ｓｔｅｍ３８ｄｍｄ４５－５０（ＧＣ）
GUAACAGUCUGGCGCAUUACCCCCCCCCCCUAGUGUGC
［配列番号４］Ｐ２Ｓｔｅｍ３９ｄｍｄ４５－５０（ＣＧ）
CUGAGUAGGAGCCCGCAUUACCCCCCCCCCCUAGUGUGG
［配列番号５］Ｐ３Ｓｔｅｍ３９ｄｍｄ４５－５０（ＣＧ）
UACCAUUUGUAUGCGCAUUACCCCCCCCCCCUAGUGUGC
［配列番号６］ａｃＧＦＰ２
CGAUGCCGGUGCCGCAUUACCCCCCCCCCCUAGUGUGG
［配列番号７］ＥＧＦＰ遺伝子
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
［配列番号８］リンカー
TCCGGACTCAGATCTCGA
［配列番号９］α－Ｔｕｂｕｌｉｎ遺伝子（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ）
GTGCGTGAGTGCATCTCCATCCACGTTGGCCAGGCTGGTGTCCAGATTGGCAATGCCTGCTGGGAGCTCTACTGCCTGGAACACGGCATCCAGCCCGATGGCCAGATGCCAAGTGACAAGACCATTGGGGGAGGAGATGACTCCTTCAACACCTTCTTCAGTGAGACGGGCGCTGGCAAGCACGTGCCCCGGGCTGTGTTTGTAGACTTGGAACCCACAGTCATTGATGAAGTTCGCACTGGCACCTACCGCCAGCTCTTCCACCCTGAGCAGCTCATCACAGGCAAGGAAGATGCTGCCAATAACTATGCCCGAGGGCACTACACCATTGGCAAGGAGATCATTGACCTTGTGTTGGACCGAATTCGCAAGCTGGCTGACCAGTGCACCGGTCTTCAGGGCTTCTTGGTTTTCCACAGCTTTGGTGGGGGAACTGGTTCTGGGTTCACCTCCCTGCTCATGGAACGTCTCTCAGTTGATTATGGCAAGAAGTCCAAGCTGGAGTTCTCCATTTACCCAGCACCCCAGGTTTCCACAGCTGTAGTTGAGCCCTACAACTCCATCCTCACCACCCACACCACCCTGGAGCACTCTGATTGTGCCTTCATGGTAGACAATGAGGCCATCTATGACATCTGTCGTAGAAACCTCGATATCGAGCGCCCAACCTACACTAACCTTAACCGCCTTATTAGCCAGATTGTGTCCTCCATCACTGCTTCCCTGAGATTTGATGGAGCCCTGAATGTTGACCTGACAGAATTCCAGACCAACCTGGTGCCCTACCCCCGCATCCACTTCCCTCTGGCCACATATGCCCCTGTCATCTCTGCTGAGAAAGCCTACCATGAACAGCTTTCTGTAGCAGAGATCACCAATGCTTGCTTTGAGCCAGCCAACCAGATGGTGAAATGTGACCCTCGCCATGGTAAATACATGGCTTGCTGCCTGTTGTACCGTGGTGACGTGGTTCCCAAAGATGTCAATGCTGCCATTGCCACCATCAAAACCAAGCGCAGCATCCAGTTTGTGGATTGGTGCCCCACTGGCTTCAAGGTTGGCATCAACTACCAGCCTCCCACTGTGGTGCCTGGTGGAGACCTGGCCAAGGTACAGAGAGCTGTGTGCATGCTGAGCAACACCACAGCCATTGCTGAGGCCTGGGCTCGCCTGGACCACAAGTTTGACCTGATGTATGCCAAGCGTGCCTTTGTTCACTGGTACGTGGGTGAGGGGATGGAGGAAGGCGAGTTTTCAGAGGCCCGTGAAGATATGGCTGCCCTTGAGAAGGATTATGAGGAGGTTGGTGTGGATTCTGTTGAAGGAGAGGGTGAGGAAGAAGGAGAGGAATACTAA
［配列番号１０］ＤＨＦＲ遺伝子（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）
ATGATCAGTCTGATTGCGGCGTTAGCGGTAGATCGCGTTATCGGCATGGAAAACGCCATGCCGTGGAACCTGCCTGCCGATCTCGCCTGGTTTAAACGCAACACCTTAAATAAACCCGTGATTATGGGCCGCCATACCTGGGAATCAATCGGTCGTCCGTTGCCAGGACGCAAAAATATTATCCTCAGCAGTCAACCGGGTACGGACGATCGCGTAACGTGGGTGAAGTCGGTGGATGAAGCCATCGCGGCGTGTGGTGACGTACCAGAAATCATGGTGATTGGCGGCGGTCGCGTTTATGAACAGTTCTTGCCAAAAGCGCAAAAACTGTATCTGACGCATATCGACGCAGAAGTGGAAGGCGACACCCATTTCCCGGATTACGAGCCGGATGACTGGGAATCGGTATTCAGCGAATTCCACGATGCTGATGCGCAGAACTCTCACAGCTATTGCTTTGAGATTCTGGAGCGGCGGTAA
［配列番号１１］Ｐｒｉｍｅｒ　ＤＨＦＲ－Ｈｉｓ＿Ｆｗ
GAAATTAATACGACTC
［配列番号１２］Ｐｒｉｍｅｒ　ＤＨＦＲ－Ｈｉｓ＿Ｒｖ
ATCCATTTAATTAGTGGTGATGGTGATGATGTCCACCGACTTCACCCACG
［配列番号１３］ＤＨＦＲタンパク質
MISLIAALAVDRVIGMENAMPWNLPADLAWFKRNTLNKPVIMGRHTWESIGRPLPGRKNIILSSQPGTDDRVTWVKSVDEAIAACGDVPEIMVIGGGRVYEQFLPKAQKLYLTHIDAEVEGDTHFPDYEPDDWESVFSEFHDADAQNSHSYCFEILERR
［配列番号１４］ＤＨＦＲ－Ｈｉｓタンパク質
MISLIAALAVDRVIGMENAMPWNLPADLAWFKRNTLNKPVIMGRPYLGINRSSVARTQKYYPQQSTGYGRSRNVGEVGGHHHHHH
［配列番号１５］第１のステム部分
CCGCAUUA
［配列番号１６］第２のステム部分
UAGUGUGG
［配列番号１７］ステムループ構造１
CCGCAUUACCCCCCCCCCCUAGUGUGG
［配列番号１８］ステムループ構造２
GCGCAUUACCCCCCCCCCCUAGUGUGC
　本発明の一態様の１本鎖核酸分子及び組成物は、－１フレームシフトの誘導を通じて、遺伝子の発現を正常化して、遺伝子の異常により発症する遺伝性疾患を予防及び／又は治療するために利用可能である。
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月１１日出願の日本特願２０２０－０４１６３７号の優先権を主張し、その全記載は、ここに開示として援用される。

Claims (14)

  1. 　５’末端側から３’末端側への方向に、対象となる遺伝子の標的配列に相補的な第１の配列と、ステムループ構造を形成する第２の配列とを含む１本鎖核酸分子。
  2. 　前記ステムループ構造のステム部分の末端は、シトシン及びグアニンである、請求項１に記載の１本鎖核酸分子。
  3. 　前記ステムループ構造は、ループ部分が主としてシトシンからなるステムループ構造である、請求項１～２のいずれか１項に記載の１本鎖核酸分子。
  4. 　前記ステムループ構造は、ステム部分が４塩基対～２０塩基対のステムループ構造である、請求項１～３のいずれか１項に記載の１本鎖核酸分子。
  5. 　前記第２の配列は、配列番号１７又は配列番号１８に記載の配列である、請求項１～４のいずれか１項に記載の１本鎖核酸分子。
  6. 　前記第１の配列は、８塩基長～１６塩基長の配列である、請求項１～５のいずれか１項に記載の１本鎖核酸分子。
  7. 　前記遺伝子は、前記標的配列の上流９塩基～上流１５塩基において同一の塩基が２個以上連続する、請求項１～６のいずれか１項に記載の１本鎖核酸分子。
  8. 　前記遺伝子は、前記標的配列の上流９塩基～上流１５塩基において同一の塩基が２個以上連続している部分が２箇所以上ある、請求項１～６のいずれか１項に記載の１本鎖核酸分子。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の１本鎖核酸分子を有効成分として含む、－１フレームシフト誘導用組成物。
  10. 　前記組成物は、－１フレームシフトを誘導することにより、前記遺伝子の発現を正常化して、該遺伝子の発現異常により発症する遺伝性疾患を予防及び／又は治療するための医薬品用組成物である、請求項９に記載の組成物。
  11. 　前記遺伝性疾患は、筋ジストロフィー、癌、多発性硬化症、脊髄性筋萎縮症、レット症候群、筋萎縮性側索硬化症、脆弱Ｘ症候群、プラダー・ウィリー症候群、色素性乾皮症、ポルフィリン症、ウェルナー症候群、進行性骨化性線維異形成症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テイ－サックス病、神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、関節炎、血友病、フォンヴィレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、腎結石、骨形成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾患、小脳運動失調、結節性硬化症、家族性赤血球増加症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン－ピック病、及びマルファン症候群からなる群から選ばれる遺伝性疾患である、請求項１０に記載の組成物。
  12. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の１本鎖核酸分子又は請求項９に記載の組成物の有効量を、対象となる遺伝子の発現異常により発症する遺伝性疾患を有する、又はその危険性がある生物個体に投与することを含む、遺伝性疾患を治療及び／又は予防する方法。
  13. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の１本鎖核酸分子又は請求項９に記載の組成物の有効量を、対象となる遺伝子の発現異常が認められる細胞、組織、臓器又は生物個体に投与することを含む、遺伝子の発現異常を改善する方法。
  14. 　前記遺伝性疾患は、筋ジストロフィー、癌、多発性硬化症、脊髄性筋萎縮症、レット症候群、筋萎縮性側索硬化症、脆弱Ｘ症候群、プラダー・ウィリー症候群、色素性乾皮症、ポルフィリン症、ウェルナー症候群、進行性骨化性線維異形成症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テイ－サックス病、神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、関節炎、血友病、フォンヴィレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、腎結石、骨形成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾患、小脳運動失調、結節性硬化症、家族性赤血球増加症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン－ピック病、及びマルファン症候群からなる群から選ばれる遺伝性疾患である、請求項１２又は１３に記載の方法。
     
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