JP2022510673A

JP2022510673A - アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａｂｃａ４の異常スプライシングをレスキューする

Info

Publication number: JP2022510673A
Application number: JP2021531751A
Authority: JP
Inventors: ロバートウィルヘルムスジョアンナコリン，; イグレシアス，アレハンドロガラント; フランシスカスピーターマリアクレマース，
Original assignee: Stichting Katholieke Universiteit
Current assignee: Stichting Katholieke Universiteit
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2019-12-04
Publication date: 2022-01-27
Also published as: US20220049250A1; EP3891282A1; WO2020115106A1; EA202191469A1

Abstract

本発明は、医薬の分野に関する。特に、本発明は、スターガルト病の処置、予防及び／又は遅延において使用することができる新規アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。【選択図】なし

Description

［発明の分野］
本発明は、医学及び免疫学の分野に関する。特に、本発明は、ＡＢＣＡ４関連の状態の処置、予防及び／又は遅延において使用することができる新規アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

［発明の背景］
ＡＢＣＡ４における常染色体劣性変異は、中心視力喪失によって特徴付けられ、全盲に至ることが多い進行性障害である、スターガルト病を引き起こす。スターガルト病の典型的な特質は、患者の眼底全体にわたり分布した多くの黄色の点（斑点）の存在である。ＡＢＣＡ４遺伝子は、５０個のエクソンで構成され、２２７３個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする。このタンパク質は、錐体及び杆体視細胞の外節において発現され、光伝達後の老廃物の除去において重要な役割を果たす。

ＳＴＧＤ１の他に、ＡＢＣＡ４におけるバリアントは、アレルの重症度に応じて、標的黄斑症から常染色体劣性錐体杆体ジストロフィー（ａｒＣＲＤ；Ｃｒｅｍｅｒｓら、１９９８；Ｍａｕｇｅｒｉら、２０００）及び汎網膜ジストロフィー（Ｃｒｅｍｅｒｓら、１９９８；Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍｉｒら、１９９８）に及ぶ、網膜疾患の他のサブタイプをもたらす場合もある。

両アレルＡＢＣＡ４バリアントは、コード領域及びフランキングスプライス部位を配列決定した後に、ＳＴＧＤ１による症例のおよそ８０％（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓら、１９９７；Ｆｕｊｉｎａｍｉら、２０１３；Ｌｅｗｉｓら、１９９９；Ｍａｕｇｅｒｉら、１９９９；Ｒｉｖｅｒａら、２０００；Ｓｃｈｕｌｚら、２０１７；Ｗｅｂｓｔｅｒら、２００１；Ｚｅｒｎａｎｔら、２０１１；Ｚｅｒｎａｎｔら、２０１７）及びａｒＣＲＤによる症例の３０％（Ｍａｕｇｅｒｉら、２０００）において同定することができる。一般に、ａｒＣＲＤ又は汎網膜ジストロフィーを有する個体は、２個の重度ＡＢＣＡ４アレルを保有する一方、ＳＴＧＤ１を有する個体は、２個の中等度重度バリアント、又は軽度バリアント及び重度バリアントの組合せを保有する（Ｍａｕｇｅｒｉら、１９９９；ｖａｎＤｒｉｅｌら、１９９８）。ＳＴＧＤ１患者における不明のＡＢＣＡ４バリアントの大部分は、遺伝子のイントロン領域に存すると仮定され、実際に、ここ数年にわたり、いくつかのグループが、斯かるディープイントロンバリアントの存在を実証した（Ｂａｕｗｅｎｓら、２０１５；Ｂａｘら、２０１５；Ｂｒａｕｎら、２０１３；Ｌｅｅら、２０１６；Ｓｃｈｕｌｚら、２０１７）。ＳＴＧＤＩ患者に高頻度で存在する変異（西洋諸国における全ＳＴＧＤＩ症例の約２～３％が、この変異を保有する）は、エクソン６の最後のヌクレオチドに影響を与えるバリアントである、ｃ．７６８Ｇ＞Ｔである。この変異は、エクソン６のスプライスドナー部位を弱め、イントロン６における下流の代替のスプライスドナー部位の使用及び３５ヌクレオチドによる転写物のその後の伸長をもたらす。よって、この伸長は、フレームシフト内に、ＡＢＣＡ４タンパク質合成の中途終結をもたらすことが予測される。

相当な量のＳＴＧＤ１症例がｃ．７６８Ｇ＞Ｔバリアントを保有するという事実は、このバリアントを、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に基づくスプライス調整療法のための魅力的な標的にする。従って、特にｃ．７６８Ｇ＞Ｔ変異に関して、スターガルト病を患う対象における機能的ＡＢＣＡ４タンパク質の発現を可能にするための、ＡＢＣＡ４遺伝子のスプライス調整のためのＡＯＮを開発することが要請される。

［発明の概要］
第１の態様では、本発明は、配列番号４に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに結合する、及び／又は配列番号４に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的である、スプライシングを制御する（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ）ためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、好ましくは、配列番号５を有するポリヌクレオチドに結合するか、又は配列番号５を有するポリヌクレオチドと相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド、より好ましくは、配列番号８０を有するポリヌクレオチドに結合するか、又は配列番号８０を有するポリヌクレオチドと相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド、さらにより好ましくは、配列番号７、８、９；１１、１２、１３；１５、１６、１７；１９、２０及び２１からなる群から選択されるポリヌクレオチドに結合するか、又は配列番号７、８、９；１１、１２、１３；１５、１６、１７；１９、２０及び２１からなる群から選択されるポリヌクレオチドと相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

第２の態様では、本発明は、当該分子の発現を促す条件下に置かれると、本明細書に定義されているスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現する、ウイルスベクターを提供する。

第３の態様では、本発明は、本明細書に定義されているスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本明細書に定義されているウイルスベクター及び薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

第４の態様では、本発明は、医薬としての使用のための、好ましくはＡＢＣＡ４のスプライシングを調整することを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態を処置するための医薬としての使用のための、本明細書に定義されているスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

［発明の詳細な説明］
定義により、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）は、その標的に対して実質的に相補的（アンチセンス）であり、ＡＯＮが、対応するプレｍＲＮＡ分子に結合することを可能にし、これにより、理論に制約されることは望まないが、スプライシングに必須なタンパク質の結合を防止する。本発明者らが、ＡＢＣＡ４におけるいくつかの変異について以前に示した通り（国際公開第２０１８／１０９０１１号）、通常、このような結合の欠如は、標的化されたエクソンのスキッピングをもたらす。

いくつかの変異は、新規スプライスアクセプター、スプライスドナー又はエクソンスプライスエンハンサー結合部位を作製し、これは、対応する遺伝子のｍＲＮＡへの偽エクソン（ｐｓｅｕｄｏｅｘｏｎ）の包含をもたらす。ｃ．７６８Ｇ＞Ｔ変異により、エクソン６のスプライスドナー部位が弱まり、イントロン６における下流にある代替のスプライスドナー部位が使用され、続いて転写物が３５ヌクレオチド伸長する。ｃ．７６８Ｇ＞Ｔ変異を保有する個体におけるスプライシングを回復させるために、本発明者らは、イントロン６における新たに使用されるようになった代替のスプライスドナー部位を特異的に遮断し、これにより、本来の部位であるｃ．７６８の位置に戻るようにスプライシング機構を制御する、ＡＯＮを設計した。

従って、第１の態様では、本発明は、配列番号４に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに結合する、及び／又はそれと相補的である、スプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５を有するポリヌクレオチドに結合するか、又はそれと相補的である。より好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号８０を有するポリヌクレオチドに結合するか、又はそれと相補的である。さらにより好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号７、８、９；１１、１２、１３；１５、１６、１７；１９、２０及び２１からなる群から選択されるポリヌクレオチドに結合するか、又はそれと相補的である。

用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「ＡＯＮ」は、本明細書で互換的に使用されており、プレｍＲＮＡ分子、ｈｎＲＮＡ（ヘテロ核ＲＮＡ）又はｍＲＮＡ分子における標的ヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド分子を指すことが理解される。アンチセンス配列の相補性（又は実質的な相補性）の程度は、好ましくは、アンチセンス配列を含む分子が、生理的条件下で、ＲＮＡ分子における標的ヌクレオチド配列と安定したハイブリッドを形成することができるような程度である。その標的へのＡＯＮの結合は、当業者であれば、ＥＰ１６１９２４９に記載されているゲル移動度シフトアッセイ等の当分野で既知の技法を使用して容易に評価することができる。

本発明の文脈で使用される用語「相補的」は、機能性、すなわち、スプライシングを制御することが達成される限りにおいて、アンチセンス配列におけるいくつかのミスマッチが許容されることを指し示す。好ましくは、相補性は、９０％～１００％である。一般に、これは、２０ヌクレオチドのＡＯＮにおける１若しくは２個のミスマッチ、又は４０ヌクレオチドのＡＯＮにおける１、２、３若しくは４個のミスマッチ、又は６０ヌクレオチドのＡＯＮにおける１、２、３、４、５若しくは６個のミスマッチ、等を許容する。任意選択で、前記ＡＯＮは、患者の網膜細胞へのトランスフェクションによりさらに検査することができる。相補的領域は、好ましくは、組み合わされると、プレｍＲＮＡにおけるエクソンに特異的となるように設計することができる。斯かる特異性は、この系における他の（プレ）ｍＲＮＡ分子における実際の配列に依存するため、様々な長さの相補的領域により作製することができる。ＡＯＮが、１種又は複数の他のプレｍＲＮＡ分子にハイブリダイズしかねないというリスクは、ＡＯＮのサイズの増加と共に減少する。相補性の領域にミスマッチを含むが、プレｍＲＮＡにおける標的化された領域（複数可）にハイブリダイズ及び／又は結合する能力を保持するＡＯＮを本発明において使用することができることが明らかである。しかし、相補的部分におけるミスマッチを欠如するＡＯＮは、１個又は複数の相補的領域に斯かるミスマッチを有するＡＯＮよりも高い効率及び高い特異性を典型的に有するため、好ましくは、少なくとも相補的部分は、斯かるミスマッチを含まない。より高いハイブリダイゼーション強度（すなわち、対向鎖との相互作用の数の増加）が、この系のスプライシング機構に干渉するプロセスの効率増加において有利であると考えられる。

用語「スプライシングを調整する」及び「スプライシングを制御する」は、本明細書で互換的に使用されており、ｃ．７６８Ｇ＞Ｔ変異に対するＡＯＮに基づくスプライス調整療法を包含する。用語「スプライシングを制御する」は、ＡＢＣＡ４プレｍＲＮＡスプライシングを制御して、本来の転写物を得ることと本明細書において定義される。

本発明に係るＡＯＮは、好ましくは、ＣｐＧのストレッチを含有しない、より好ましくは、いかなるＣｐＧも含有しない。オリゴヌクレオチドにおけるＣｐＧ又はＣｐＧのストレッチの存在は通常、前記オリゴヌクレオチドの免疫原性増加に関連する（Ｄｏｒｎ及びＫｉｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ、２００８）。この免疫原性増加は、処置されるべき組織、すなわち、眼の損傷を誘導し得るため、望ましくない。免疫原性は、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋細胞、及び／又は炎症性単核細胞浸潤の存在を評価することにより、動物モデルにおいて評価することができる。免疫原性は、当業者に既知の標準イムノアッセイを使用して中和抗体及び／又は前記ＡＯＮを認識する抗体の存在を検出することにより、本発明に係るＡＯＮで処置されている動物又はヒトの血液において評価することもできる。炎症性反応、Ｉ型様インターフェロン産生、ＩＬ－１２産生及び／又は免疫原性増加は、標準イムノアッセイを使用して、中和抗体又は前記ＡＯＮを認識する抗体の存在又は増加量を検出することにより評価することができる。本発明に係るＡＯＮは、さらにより好ましくは、許容できるＲＮＡ結合動態及び／又は熱力学的特性を有する。ＲＮＡ結合動態及び／又は熱力学的特性は、少なくとも一部には、オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ；基本のＴｍ及び最近傍モデルを使用して、一本鎖ＲＮＡのためのオリゴヌクレオチド特性計算機（ｗｗｗ．ｕｎｃ．ｅｄｕ／－ｃａｉｌ／ｂｉｏｔｏｏｌ／ｏｌｉｇｏ／ｉｎｄｅｘ）により計算される）及び／又はＡＯＮ－標的エクソン複合体の自由エネルギー（ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅバージョン４．５を使用して）によって決定される。Ｔｍが高過ぎる場合、ＡＯＮは、特異性が低いと予想される。許容できるＴｍ及び自由エネルギーは、ＡＯＮの配列に依存する。従って、これらのパラメータのそれぞれについて好ましい範囲を与えることは困難である。許容できるＴｍは、３５～７０℃の間に及び得、許容できる自由エネルギーは、１５～４５ｋｃａｌ／ｍｏｌの間に及び得る。

あらゆる実施形態では、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドは、ＲＮＡ残基、ＤＮＡ残基、又はヌクレオチドアナログ若しくは等価物であり得る。

本発明に係るスプライシングを制御するための好ましいＡＯＮは、約８～約４０ヌクレオチド、好ましくは、約１０～約４０ヌクレオチド、より好ましくは、約１４～約３０ヌクレオチド、より好ましくは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチド等の約１６～約２４ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、本発明に係るＡＯＮは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０ヌクレオチドの長さを有する。

好ましい実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号３４、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、７３、７５又は７７を含むか、又は配列番号３４、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、７３、７５又は７７からなる。これらのＡＯＮが、ｃ．７６８Ｇ＞Ｔ変異によって引き起こされるＡＢＣＡ４の異常スプライシングを制御することにおいて非常に効率的であったことが見出された。これらの好ましいＡＯＮは、好ましくは、約８～約４０ヌクレオチド、好ましくは、約１０～約４０ヌクレオチド、より好ましくは、約１４～約３０ヌクレオチド、より好ましくは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４ヌクレオチド等の約１６～約２４ヌクレオチドを含む、又は好ましくは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０ヌクレオチドを含むか、若しくはこれらからなる。

本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮが、ヌクレアーゼ抵抗性を増加させるように及び／又は標的配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの親和性を増加させるように修飾された１個又は複数の残基を含むことが好ましい。従って、好ましい実施形態では、ＡＯＮは、少なくとも１個のヌクレオチドアナログ又は等価物を含み、ヌクレオチドアナログ又は等価物は、修飾された塩基及び／又は修飾された骨格及び／又は非天然ヌクレオシド間連結、又はこれらの修飾の組合せを有する残基として定義される。

好ましい実施形態では、ヌクレオチドアナログ又は等価物は、修飾された骨格を含む。斯かる骨格の例は、モルフォリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート、スルホネート及びスルホンアミド骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、並びにアミド骨格によってもたらされる。ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーは、アンチセンス薬剤として以前に調査された、修飾された骨格のオリゴヌクレオチドである。

モルフォリノオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのデオキシリボース糖が六員環によって置き換えられ、ホスホジエステル連結がホスホロジアミデート連結によって置き換えられた、無電荷骨格を有する。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、酵素分解に対して抵抗性であり、ＲＮａｓｅＨを活性化することによるのではなく、翻訳を抑止するか、又はプレｍＲＮＡスプライシングに干渉することにより、アンチセンス薬剤として機能すると思われる。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、細胞膜を物理的に破壊する方法によって、組織培養細胞に送達されることに成功し、これらの方法のうちいくつかを比較する一研究は、スクレイプローディングが、最も効率的な送達方法であることを見出した；しかし、モルフォリノ骨格は無電荷であるため、カチオン性脂質は、細胞におけるモルフォリノオリゴヌクレオチド取込みの有効なメディエーターではない。近年の報告は、モルフォリノオリゴヌクレオチドによる三重鎖形成を実証し、非イオン性骨格のため、これらの研究は、モルフォリノオリゴヌクレオチドが、マグネシウムの非存在下で三重鎖形成が可能であることを示した。

骨格における残基間の連結は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合型ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、又は１個若しくは複数の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環ヌクレオシド間連結によって形成される連結等、リン原子を含まないことがさらに好ましい。

好ましいヌクレオチドアナログ又は等価物は、修飾されたポリアミド骨格を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１）。ＰＮＡに基づく分子は、塩基対認識の観点から、ＤＮＡ分子の真の模倣物である。ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結されたＮ－（２－アミノエチル）－グリシン単位で構成され、核酸塩基は、メチレンカルボニル結合によって骨格に連結される。代替骨格は、一炭素延長されたピロリジンＰＮＡ単量体（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ及びＫｕｍａｒ、２００５）を含む。ＰＮＡ分子の骨格は、荷電リン酸基を含有しないため、ＰＮＡ－ＲＮＡハイブリッドは通常、それぞれＲＮＡ－ＲＮＡ又はＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドよりも安定している（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）。さらに好ましい骨格は、リボース又はデオキシリボース糖が６員モルフォリノ環によって置き換えられた、モルフォリノヌクレオチドアナログ又は等価物を含む。最も好ましいヌクレオチドアナログ又は等価物は、リボース又はデオキシリボース糖が６員モルフォリノ環によって置き換えられ、隣接モルフォリノ環間のアニオン性ホスホジエステル連結が非イオン性ホスホロジアミデート連結によって置き換えられた、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）を含む。

またさらに別の実施形態では、本発明に係るヌクレオチドアナログ又は等価物は、ホスホジエステル連結における非架橋性酸素のうちの１個の置換を含む。この修飾は、塩基対形成を僅かに不安定化するが、ヌクレアーゼ分解に対する有意な抵抗性を加える。好ましいヌクレオチドアナログ又は等価物は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、Ｈ－ホスホネート、３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート又はボラノホスフェートを含む。

本発明に係るさらに好ましいヌクレオチドアナログ又は等価物は、－ＯＨ；－Ｆ；１個又は複数のヘテロ原子によって中断され得る、置換又は未置換の、直鎖状又は分枝状の低級（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリル又はアラルキル；Ｏ－、Ｓ－又はＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－又はＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－又はＮ－アルキニル；Ｏ－、Ｓ－又はＮ－アリル；Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、－メトキシ、－アミノプロポキシ；メトキシエトキシ；ジメチルアミノオキシエトキシ；及び－ジメチルアミノエトキシエトキシ等、２’、３’及び／又は５’位において一又は二置換された１個又は複数の糖部分を含む。糖部分は、ピラノース若しくはその誘導体、又はデオキシピラノース若しくはその誘導体、好ましくは、リボース若しくはその誘導体、又はデオキシリボース若しくはその誘導体となることができる。好ましい誘導体化糖部分は、２’－炭素原子が糖環の３’又は４’炭素原子に連結され、これにより二環式糖部分を形成した、ロックト核酸（ＬＮＡ）を含む。好ましいＬＮＡは、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン－架橋核酸を含む（Ｍｏｒｉｔａら、２００１）。これらの置換は、ヌクレオチドアナログ又は等価物をＲＮａｓｅＨ及びヌクレアーゼ抵抗性にし、標的ＲＮＡに対する親和性を増加させる。

別の実施形態では、本発明に係るヌクレオチドアナログ又は等価物は、１個又は複数の塩基修飾又は置換を含む。修飾された塩基は、当技術分野で既知の又は既知となるであろう、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、並びにピリミジン及びプリン塩基の他の－アザ、デアザ、－ヒドロキシ、－ハロ、－チオ、チオール、－アルキル、－アルケニル、－アルキニル、チオアルキル誘導体等、合成及び天然塩基を含む。

当業者であれば、ＡＯＮにおける全ての位置が、均一に修飾されている必要はないことが理解される。加えて、単一のＡＯＮにおいて、又はさらにはＡＯＮ内の単一の位置に、上述のアナログ又は等価物のうちの２個以上を取り込むことができる。ある特定の実施形態では、本発明に係るＡＯＮは、少なくとも２種の異なる型のアナログ又は等価物を有する。

従って、好ましい実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）、２’Ｏ－エチル修飾されたリボース、２’Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース、２’－Ｏ－プロピル修飾されたリボース及び／又はこれらの修飾を有するハロゲン化された誘導体等の置換された誘導体等、２’－Ｏアルキルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。

好ましい実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号３４、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、７３、７５又は７７を含むか、又は配列番号３４、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、７３、７５又は７７からなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。別の好ましい実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号３４、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、７３、７５又は７７を含むか、又は配列番号３４、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、７３、７５又は７７からなり、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号６を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号１０を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号１４を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号１８を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号２２を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号２６を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号３０を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号４７を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号４８を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号４９を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号５０を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号５１を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号５２を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号５３を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号５４を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号５５を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号５６を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号５７を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号５８を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号５９を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号６０を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号６１を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号６２を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号６３を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号６４を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号６５を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号６６を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号６７を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号６８を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号６９を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号７０を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号７１を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号７２を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号７３を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号７４を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号７５を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号７６を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

ある実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、配列番号７７を含むか、又はこれからなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）及びホスホロチオエート骨格を含む。

本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、当技術分野で既知の適した手段を使用して、間接的に投与することができる。ＡＯＮは、例えば、いわゆる「ネイキッド」ＡＯＮ等として、個体又は前記個体の細胞、組織若しくは臓器に与えることができる。ＡＯＮは、発現ベクターの形態で投与することもでき、この発現ベクターは、本発明に係る前記ＡＯＮの配列を含むＲＮＡ転写物をコードする。発現ベクターは、好ましくは、遺伝子送達媒体により細胞、組織、臓器又は個体中に導入される。好ましい実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮの発現又は転写を駆動する発現カセット又は転写カセットを含むウイルスに基づく発現ベクターが提供される。従って、本発明は、当該分子の発現を促す条件下に置かれると、本発明に係るスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現するウイルスベクターを提供する。

アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスに基づくベクターによってもたらされるプラスミド由来のアンチセンスオリゴヌクレオチド発現又はウイルス発現によって、細胞に、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮを与えることができる。発現は、Ｕ７ＲＮＡプロモーター等のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（ＰｏｌＩＩ）、又はＵ６ＲＮＡプロモーター等のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）プロモーターによって駆動され得る。好ましい送達媒体は、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、又はレンチウイルスベクターその他等のレトロウイルスベクター等、ウイルスベクターである。また、細胞のヒトゲノムにおける標的化された相同組換え及び組込みに使用可能なプラスミド、人工染色体、プラスミドを、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮの送達のために適宜適用することができる。ＰｏｌＩＩＩプロモーターから転写が駆動されるベクター、及び／又は転写物が、小型の転写物を送達するための優れた結果を生じるＵ１若しくはＵ７転写物との融合の形態であるベクターが本発明に好ましい。適した転写物を設計することは、当業者の技能範囲内である。好ましくは、Ｕ１又はＵ７転写物との融合転写物の形態の、ＰｏｌＩＩＩ駆動転写物が好ましい。斯かる融合は、以前に記載された通りに作製することができる（Ｇｏｒｍａｎら、１９９８）。

本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮに好ましい発現系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターである。高度に効率的にスプライシングを制御するためのアンチセンスヌクレオチド配列の遷延された発現に使用することができる、単鎖及び二重鎖のＡＡＶに基づくベクターが開発された。好ましいＡＡＶに基づくベクターは、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（ＰｏｌＩＩＩ）又はＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（ＰｏｌＩＩ）によって駆動される発現カセットを含む。好ましいＲＮＡプロモーターは、例えば、ＰｏｌＩＩＩＵ６ＲＮＡプロモーター又はＰｏｌＩＩＵ７ＲＮＡプロモーターである。

従って、本発明は、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮの発現のためのＰｏｌＩＩ又はＰｏｌＩＩＩプロモーター駆動発現カセットを含む、ウイルスに基づくベクターを提供する。

本発明に係るＡＡＶベクターは、組換えＡＡＶベクターであり、本明細書の他の箇所に描写されているＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質のタンパク質シェル中にカプシド形成された、本発明に係るスプライシングを制御するためのコードされたＡＯＮを含むＡＡＶゲノムの一部を含むＡＡＶベクターを指す。ＡＡＶゲノムの一部は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びその他等のアデノ随伴ウイルス血清型に由来する逆位末端配列（ＩＴＲ）を含有することができる。カプシドタンパク質で構成されたタンパク質シェルは、ＡＡＶ１、２、３、４、５、８、９及びその他等のＡＡＶ血清型に由来することができる。タンパク質シェルは、カプシドタンパク質シェルと命名することもできる。ＡＡＶベクターは、１種の又は好ましくは全種の野生型ＡＡＶ遺伝子を欠失させることができるが、依然として、機能的ＩＴＲ核酸配列を含むことができる。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製、レスキュー及びパッケージングに必要である。ＩＴＲ配列は、機能性を維持する限りにおいて、野生型配列となることができるか、又は野生型配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５若しくは１００％配列同一性を有することができるか、又は例えば、ヌクレオチドの挿入、変異、欠失若しくは置換によって変更することができる。この環境で、機能性は、カプシドシェルへのゲノムのパッケージングを方向付け、次いで、感染させるべき宿主細胞又は標的細胞における発現を可能にする能力を指す。本発明の環境で、カプシドタンパク質シェルは、ＡＡＶベクターゲノムＩＴＲとは異なる血清型のものとなることができる。よって、本発明に係るＡＡＶベクターは、ある１種のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３）を含む、カプシドタンパク質シェル、すなわち、正二十面体カプシドで構成され得る一方で、このＡＡＶ５ベクターに含有されるＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２ベクターを含む上に記載されているＡＡＶ血清型のいずれかとなることができる。よって、「ＡＡＶ２ベクター」は、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、一方、例えば、「ＡＡＶ５ベクター」は、ＡＡＶ血清型５のカプシドタンパク質シェルを含み、それによって、どちらが、本発明に係るいずれのＡＡＶベクターゲノムＩＴＲをカプシド形成してもよい。

好ましくは、本発明に係る組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２、５、８又はＡＡＶ血清型９のカプシドタンパク質シェルを含み、前記ＡＡＶベクター中に存在するＡＡＶゲノム又はＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２、５、８又はＡＡＶ血清型９に由来する；斯かるＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ５／２、ＡＡＶ５／５、ＡＡＶ５／８、ＡＡＶ５／９、ＡＡＶ８／２、ＡＡＶ８／５、ＡＡＶ８／８、ＡＡＶ８／９、ＡＡＶ９／２、ＡＡＶ９／５、ＡＡＶ９／８又はＡＡＶ９／９ベクターと称される。

より好ましくは、本発明に係る組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、前記ベクター中に存在するＡＡＶゲノム又はＩＴＲは、ＡＡＶ血清型５に由来する；斯かるベクターは、ＡＡＶ２／５ベクターと称される。

より好ましくは、本発明に係る組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、前記ベクター中に存在するＡＡＶゲノム又はＩＴＲは、ＡＡＶ血清型８に由来する；斯かるベクターは、ＡＡＶ２／８ベクターと称される。

より好ましくは、本発明に係る組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、前記ベクター中に存在するＡＡＶゲノム又はＩＴＲは、ＡＡＶ血清型９に由来する；斯かるベクターは、ＡＡＶ２／９ベクターと称される。

より好ましくは、本発明に係る組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質シェルを含み、前記ベクター中に存在するＡＡＶゲノム又はＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２に由来する；斯かるベクターは、ＡＡＶ２／２ベクターと称される。

選ばれた核酸配列によって表される、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮをコードする核酸分子は、好ましくは、上に同定されたＡＡＶゲノム又はＩＴＲ配列、例えば、コード配列及び３’終結配列に作動可能に連結された発現調節エレメントを含む発現構築物の間に挿入される。

「ＡＡＶヘルパー機能」は一般に、トランスでＡＡＶベクターに供給される、ＡＡＶ複製及びパッケージングに要求される対応するＡＡＶ機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターに欠けているＡＡＶ機能を補完するが、ＡＡＶＩＴＲを欠如する（これは、ＡＡＶベクターゲノムによって提供される）。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶの２種の主要ＯＲＦ、すなわち、ｒｅｐコード領域及びｃａｐコード領域、又はそれらの機能的な実質的に同一の配列を含む。Ｒｅｐ及びＣａｐ領域は、当技術分野でよく知られており、例えば、参照により本明細書に組み込む（Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、１９９９）又は米国特許第５，１３９，９４１号を参照されたい。ＡＡＶヘルパー機能は、プラスミドであり得るＡＡＶヘルパー構築物において供給され得る。宿主細胞へのヘルパー構築物の導入は、本明細書に同定されているＡＡＶベクター中に存在するＡＡＶゲノムの導入に先立ち又はそれと同時発生的に、例えば、形質転換、トランスフェクション又は形質導入によって起こり得る。よって、本発明に係るＡＡＶヘルパー構築物は、一方ではＡＡＶベクターのカプシドタンパク質シェルのための血清型、また、他方では前記ＡＡＶベクター複製及びパッケージング中に存在するＡＡＶゲノムのための血清型の所望の組合せを産生するように選ぶことができる。

「ＡＡＶヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ複製及びパッケージングに要求される追加的な機能を提供する。適したＡＡＶヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１及び２型等）及びワクシニアウイルスを含む。ヘルパーウイルスによって提供される追加的な機能は、参照により本明細書に組み込む米国特許第６，５３１，４５６号に記載されている通り、ベクターを介して宿主細胞に導入することもできる。

好ましくは、本発明に係る組換えＡＡＶベクター中に存在するＡＡＶゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ（複製）又はｃａｐ（カプシド）遺伝子等、ウイルスタンパク質をコードするいかなるヌクレオチド配列も含まない。ＡＡＶゲノムは、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子、蛍光タンパク質（例えば、ｇｆｐ）をコードする遺伝子、又は当技術分野で既知の化学的に、酵素により若しくは他の方法で検出可能な及び／若しくは選択可能な産物（例えば、ｌａｃＺ、ａｐｈ等）をコードする遺伝子等のマーカー又はレポーター遺伝子をさらに含むことができる。

好ましくは、本発明に係るＡＡＶベクターは、参照により本明細書に組み込むＧａｒａｎｔｏら、２０１６による方法に従って構築及び産生される。

本発明に係る好ましいＡＡＶベクターは、次に記す配列を含むか又は好ましくはこれらからなるＡＯＮである本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮを発現する、ＡＡＶベクター、好ましくは、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９又はＡＡＶ２／２ベクターである：
配列番号４からなるヌクレオチド配列に対して相補的又は実質的に相補的な配列、好ましくは、ＡＯＮは、配列番号５を有するポリヌクレオチドに対して相補的であり、より好ましくは、ＡＯＮは、配列番号８０を有するポリヌクレオチドに対して相補的であり、さらにより好ましくは、配列番号７、８、９；１１、１２、１３；１５、１６、１７；１９、２０及び２１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに対して相補的又は実質的に相補的な配列。さらにより好ましくは、ＡＯＮは、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６及び配列番号３０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７からなる群から選択されるか、又は最も好ましくは、配列番号３４、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、７３、７５及び７７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、又はこれからなる。

現在までに既に達成された進行を考慮して、個体又は前記個体の細胞、組織、臓器に、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮを与えるための手段における改善が期待される。当然ながら、斯かる将来の改善が取り込まれて、本発明に係る方法を使用したｍＲＮＡの再構築において言及された効果を達成することができる。本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、「ネイキッド」ＡＯＮ等として、個体、前記個体の細胞、組織又は臓器に送達することができる。本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮを投与する場合、この分子が、送達方法と適合性である溶液に溶解されることが好ましい。プラスミドを水溶液中に用意することにより、網膜細胞に、アンチセンスオリゴヌクレオチド発現のためのプラスミドを与えることができる。

或いは、スプライシングを制御するためのＡＯＮ又は斯かるＡＯＮの発現のためのプラスミドに好ましい送達方法は、ウイルスベクター又はナノ粒子である。好ましくは、ウイルスベクター又はナノ粒子は、網膜又は他の関連する細胞に送達される。網膜細胞又は他の関連する細胞への斯かる送達は、ｉｎｖｉｖｏ、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏとなることができる；例えば、参照により本明細書に組み込むＧａｒａｎｔｏら、２０１６を参照されたい。

或いは、プラスミドは、知られているトランスフェクション薬剤を使用したトランスフェクションによって与えることができる。静脈内、皮下、筋肉内、くも膜下腔内及び／又は脳室内投与のため、溶液が生理的塩類溶液であることが好ましい。好ましくは網膜細胞である細胞への及び／又は細胞内への本明細書に定義されている構成物のそれぞれの送達に役立つであろう賦形剤又はトランスフェクション薬剤の使用が、本発明において特に好ましい。細胞膜を介して小胞又はリポソーム中に複合体形成又は捕捉された、本明細書に定義されている各構成物を送達する複合体、ナノ粒子、ミセル、小胞及び／又はリポソームを形成することができる賦形剤又はトランスフェクション薬剤が好ましい。これらの賦形剤の多くは、当技術分野で知られている。適した賦形剤又はトランスフェクション薬剤は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ＥｘＧｅｎ５００（ＭＢＩＦｅｒｍｅｎｔａｓ））、リポフェクタミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）若しくはこれらの誘導体、又はポリプロピレンイミン若しくはポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）及び誘導体を含む同様のカチオン性ポリマー、合成両親媒性物質（ａｍｐｈｉｐｈｉｌ）（ＳＡＩＮＴ－１８）、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（商標）、ＤＯＴＡＰ、及び／又は本明細書に定義されている各構成物を細胞、好ましくは、網膜細胞に送達することができる粒子へと自己集合することができるウイルスカプシドタンパク質を含む。斯かる賦形剤は、ＡＯＮ等のオリゴヌクレオチドを、網膜細胞を含む多種多様な培養細胞に効率的に送達することが示された。それらの高いトランスフェクション潜在力は、全体的な細胞生存の観点から、予想される低～中等度の毒性と組み合わされる。構造修飾の容易さを使用することができ、それらのさらなる（ｉｎｖｉｖｏ）核酸移入特徴及び毒性のさらなる修飾及び解析することができる。

リポフェクチンは、リポソームトランスフェクション薬剤の例を表す。リポフェクチンは、２種の脂質構成成分である、カチオン性脂質Ｎ－［１－（２，３ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－塩化トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）（ｃｐ．ＤＯＴＡＰ、これはメチル硫酸塩である）及び中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる。中性構成成分は、細胞内放出を媒介する。送達系の別の群は、ポリマーナノ粒子である。

ＤＮＡトランスフェクション試薬としてよく既知のジエチルアミノエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－デキストラン等のポリカチオンを、ブチルシアノアクリレート（ＰＢＣＡ）及びヘキシルシアノアクリレート（ＰＨＣＡ）と組み合わせて、細胞膜を越えて細胞内へと本明細書に定義されている各構成物、好ましくは本発明に係るＡＯＮを送達することができるカチオン性ナノ粒子を製剤化することができる。

これらの一般的なナノ粒子材料に加えて、カチオン性ペプチドプロタミンは、コロイドによりオリゴヌクレオチドを製剤化するための代替アプローチを提供する。このコロイドナノ粒子系は、単純な自己集合プロセスによって調製されて、オリゴヌクレオチドをパッケージングしその細胞内放出を媒介することができる、いわゆるプロティクル（ｐｒｏｔｉｃｌｅ）を形成することができる。当業者は、上述又は他の市販の代替賦形剤及び送達系のいずれかを選択及び適応させて、本発明における使用のためのエクソン保持分子をパッケージング及び送達して、ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の予防、処置又は遅延のためにこれを送達することができる。「ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の予防、処置又は遅延」は、本明細書において好ましくは、ＡＢＣＡ４遺伝子における遺伝的欠損によって引き起こされる部分的又は完全な視力障害又は失明を予防する、それを停止させる、その進行を終止する又はそれを反転することとして定義される。

加えて、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、細胞、細胞質及び／又はその核内への取込みを容易にするように特異的に設計された、標的化リガンドに共有結合又は非共有結合により連結することができる。斯かるリガンドは、（ｉ）細胞取込みを容易にする、細胞、組織若しくは臓器特異的エレメントを認識する化合物（ペプチド（様）構造を含むがこれらに限定されない）、及び／又は（ｉｉ）小胞、例えば、エンドソーム若しくはリソソームにおけるオリゴヌクレオチドの細胞内への取込み及び／又はその小胞、例えば、エンドソーム若しくはリソソームからの細胞内放出を容易にすることができる化学物質を含むことができる。

従って、好ましい実施形態では、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮは、少なくとも賦形剤及び／又は送達のための標的化リガンド及び／又は細胞へのその送達デバイス及び／又はその細胞内送達を増強するものを備えた組成物又は医薬又は組成物へと製剤化される。

組成物が、本明細書の後の方で定義されている補助化合物等の追加的な構成物を含む場合、組成物の各構成物は、ある単一の組合せ又は組成物又は調製物において適宜製剤化されていなくてよいことを理解されたい。それらの同一性及び特異的な特色に応じて、当業者であれば、いずれの型の製剤が、本明細書に定義されている各構成物に最も適切であるか分かるであろう。好ましい実施形態では、本発明は、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮと、本明細書の後の方で定義されているさらに別の補助化合物とを含むキットオブパーツの形態の組成物又は調製物を提供する。

要求される場合及び／又は要望される場合、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮ、又は本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮを発現する本発明に係るベクター、好ましくは、ウイルスベクターは、薬学的に許容できる担体を添加することにより、薬学的に活性がある混合物へと取り込むことができる。

従って、本発明は、本発明に係るスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明に係るウイルスベクター及び薬学的に許容できる賦形剤を含む組成物、好ましくは、医薬組成物も提供する。斯かる組成物は、本発明に係るスプライシングを制御するための単一のＡＯＮ又はウイルスベクターを含むことができるが、本発明に係るスプライシングを制御するための複数の別個のＡＯＮ又はウイルスベクターを含むこともできる。斯かる医薬組成物は、担体、フィラー、保存料、アジュバント、可溶化剤及び／又は希釈剤を含む、いずれかの薬学的に許容できる賦形剤を含むことができる。斯かる薬学的に許容できる担体、フィラー、保存料、アジュバント、可溶化剤及び／又は希釈剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、２０００に見出すことができる。前記組成物の各特色は、本明細書の前の方に定義されている。

好ましい投与経路は、眼球内投与のための水溶液又は特別に適応された製剤の硝子体内注射による。ＥＰ２４２５８１４は、ペプチド又は核酸薬物の眼球内（硝子体内）投与に特に適応された水中油型エマルションを開示する。このエマルションは、硝子体液よりも低密度であるため、エマルションは、硝子体の上を浮遊し、注射された薬物が視覚を損なうことを回避する。従って、一実施形態では、硝子体内投与に適し、片眼当たり０．０１～２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．０５～２０ｍｇ／ｋｇの範囲の総アンチセンスオリゴヌクレオチドの量で投薬される医薬組成物が提供される。適した硝子体内用量が与えられ、片眼当たり０．０５ｍｇ～５ｍｇの間、好ましくは、０．１～１ｍｇの間の総アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば片眼当たり約：０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９又は１．０ｍｇを含む。

本発明に係るスプライシングを制御するための好ましいＡＯＮは、個体のＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の処置のためのものである。本発明のあらゆる実施形態では、用語「処置」は、ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の予防及び／又は遅延を含むものと理解される。本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮを使用して処置することができる個体は、ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態を有すると既に診断されていてよい。

或いは、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮを使用して処置することができる個体は、ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態を有すると未だ診断されていなくてよいが、個体の遺伝的背景を考慮して、将来にＡＢＣＡ４関連疾患又は状態を発症する増加したリスクを有する個体となることができる。好ましい個体は、人間である。本発明のあらゆる実施形態では、ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態は、好ましくは、スターガルト病である。

従って、本発明は、医薬としての、好ましくは、ＡＢＣＡ４のスプライシングを調整することを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の処置のための医薬としての使用のための、及びＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の予防、処置又は遅延のための医薬としての使用のための、本発明に係るスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明に係るウイルスベクター又は本発明に係る（医薬）組成物をさらに提供する。本明細書におけるあらゆる医学的使用の実施形態の各特色は、本明細書の前の方に定義されており、好ましくは、本明細書の前の方に定義されている斯かる特色である。

本発明は、ＡＢＣＡ４のスプライシングを調整することを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態を処置するための、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮ、本発明に係るベクター又は本発明に係る（医薬）組成物の使用をさらに提供する。本明細書におけるあらゆる医学的使用の実施形態の各特色は、本明細書の前の方に定義されており、好ましくは、本明細書の前の方に定義されている斯かる特色である。

本発明は、ＡＢＣＡ４のスプライシングを調整することを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の処置の方法であって、前記個体の細胞を、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮ、本発明に係るベクター又は本発明に係る（医薬）組成物と接触させるステップを含む方法をさらに提供する。本明細書におけるあらゆる医学的使用の実施形態の各特色は、本明細書の前の方に定義されており、好ましくは、本明細書の前の方に定義されている斯かる特色である。

本発明は、ＡＢＣＡ４のスプライシングを調整することを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態の処置のための医薬の調製のための、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮ、本発明に係るベクター又は本発明に係る（医薬）組成物の使用をさらに提供する。本明細書におけるあらゆる医学的使用の実施形態の各特色は、本明細書の前の方に定義されており、好ましくは、本明細書の前の方に定義されている斯かる特色である。

本発明は、ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態がスターガルト病である、本発明に係るスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、本発明に係る使用又は本発明に係る方法をさらに提供する。

本発明に係る使用又は方法における処置は、好ましくは、少なくとも１回であり、好ましくは、少なくとも１週間、１ヶ月間、数ヶ月間、１年間、２、３、４、５、６年間又はそれ以上一生涯持続する。本発明に係る使用のための本明細書に定義されている本発明に係るスプライシングを制御するための各ＡＯＮ又はその等価物は、ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態に既に罹患した又はこれを発症するリスクがある個体のｉｎｖｉｖｏでの細胞、組織及び／又は臓器への直接的投与に適することができ、ｉｎｖｉｖｏ、ｅｘｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏで直接的に投与することができる。本発明に係るＡＯＮ、組成物、化合物又は補助化合物の投与頻度は、疾患の重症度、患者の年齢、患者の変異、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮの数（すなわち、用量）、本発明に係るＡＯＮ、組成物、化合物又は補助化合物の製剤、投与経路等々のいくつかのパラメータに応じる場合がある。投与頻度は、毎日、毎週、２週間又は３週間又は４週間又は５週間又はより長い期間に少なくとも１回の間で変動し得る。

本発明に係るＡＯＮ、組成物、化合物又は補助化合物の用量範囲は、好ましくは、厳密なプロトコール要求が存在する臨床治験（ｉｎｖｉｖｏ使用）における上昇用量研究に基づいて設計される。本発明に係るＡＯＮは、０．０１～２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．０５～２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で使用することができる。適した硝子体内用量は、片眼当たり約：片眼当たり０．０５ｍｇ～５ｍｇの間、好ましくは、０．１～１ｍｇの間、例えば０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９又は１．０ｍｇとなるであろう。

好ましい実施形態では、０．１ｎＭ～１μＭの範囲の、本明細書に定義されているオリゴヌクレオチドの濃度が使用される。好ましくは、この範囲は、網膜細胞又は網膜組織等の細胞モデルにおけるｉｎｖｉｔｒｏ使用のためのものである。より好ましくは、使用される濃度は、１～４００ｎＭ、さらにより好ましくは、１０～２００ｎＭ、さらにより好ましくは、５０～１００ｎＭの範囲である。複数の別個のＡＯＮが使用される場合、この濃度又は用量は、ＡＯＮの総濃度若しくは用量、又は加えられた各ＡＯＮの濃度若しくは用量を指すことができる。

好ましい実施形態では、本発明に係る分子のための送達媒体としての、本明細書の前の方に記載されているウイルスベクター、好ましくは、ＡＡＶベクターは、１注射当たり１×１０^９～１×１０^１７個のウイルス粒子、より好ましくは、１注射当たり１×１０^１０～１×１０^１２個のウイルス粒子の範囲の用量で投与される。

上に描写されるＡＯＮの濃度又は用量の範囲は、ｉｎｖｉｖｏ、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏ使用に好ましい濃度又は用量である。当業者であれば、使用されるＡＯＮ、処置されるべき標的細胞、遺伝子標的及びその発現レベル、使用される培地、並びにトランスフェクション及びインキュベーション条件に応じて、使用されるＡＯＮの濃度又は用量は、さらに変動する場合があり、さらなる最適化が為されることを必要とする場合があることを理解するであろう。

本発明に係る使用のための、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮ又は本発明に係るウイルスベクター又は本発明に係る組成物は、ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態に既に罹患した又はこれを発症するリスクがある個体のｉｎｖｉｖｏでの細胞、組織及び／又は臓器に投与することができ、ｉｎｖｉｖｏ、ｅｘｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏで投与することができる。本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮ又は本発明に係るウイルスベクター又は本発明に係る組成物は、ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態に既に罹患した又はこれを発症するリスクがある個体のｉｎｖｉｖｏでの細胞、組織及び／又は臓器に直接的に又は間接的に投与することができ、ｉｎｖｉｖｏ、ｅｘｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏで直接的に又は間接的に投与することができる。スターガルト病は、網膜細胞における顕著な表現型を有するため、前記標的化された細胞が網膜細胞であることが好ましく、前記組織が網膜であることがさらに好ましく、前記臓器が、眼を含むか、又はこれからなることがさらに好ましい。

本発明は、細胞におけるＡＢＣＡ４のスプライシングを調整するための方法であって、細胞、好ましくは、網膜細胞を、本発明に係るスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、本発明に係るベクター又は本発明に係る医薬組成物と接触させるステップを含む方法をさらに提供する。この態様の特色は、好ましくは、本明細書の前の方に定義される特色である。細胞を、本発明に係るスプライシングを制御するためのＡＯＮ又は本発明に係るウイルスベクター又は本発明に係る組成物と接触させるステップは、当業者に既知のいずれかの方法によって行うことができる。本明細書の前の方に記載されているスプライシングを制御するためのＡＯＮ、ウイルスベクター及び組成物の送達のための方法の使用が含まれる。接触させるステップは、直接的又は間接的となることができ、ｉｎｖｉｖｏ、ｅｘｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏとなることができる。

他に断りがなければ、本明細書に記載されている各実施形態は、本明細書に記載されている別の実施形態と組み合わせることができる。

［定義］
本文書及びその特許請求の範囲において、動詞「を含む」及びその活用は、その限定されない意味において、この単語の前にある項目が含まれるが、特に言及されていない項目が除外されないことを意味するように使用される。加えて、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」による要素の参照は、要素のうち唯一のものが存在すると文脈が明らかに要求しない限り、要素のうち２つ以上が存在する可能性を除外しない。よって、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は通常、「少なくとも１つ」を意味する。

単語「約」又は「およそ」は、数値（例えば、約１０）に関連して使用される場合、好ましくは、値が、与えられた値（１０）の５％多い又は少ない値であり得ることを意味する。

本明細書に提供される配列情報は、誤って同定された塩基の包含を要求するほど狭く解釈されるべきではない。当業者は、斯かる誤って同定された塩基を同定することができ、斯かる誤りを補正する方法が分かる。配列の誤りの場合、ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する配列番号１に存在する遺伝子の発現によって入手可能なポリペプチドの配列が優先されるべきである。

本明細書に引用されているあらゆる特許及び文献参照は、これにより、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Ａ）本来のエクソン６スプライスドナー部位、及びイントロン６における代替のスプライスドナー部位に関するスプライスドナー部位強度のバイオインフォマティクス予測であり、両者共に、野生型（上の配列）及びｃ．７６８Ｇ＞Ｔ変異体（下の配列）状況に関する。変異体状況における代替のスプライス部位の使用は、ＡＢＣＡ４転写物の３５－ｎｔ拡張（灰色で示す、カラーバージョンでは赤色）をもたらすと予測される。Ｂ）対照（ｃｔｒｌ）個体、ｃ．７６８Ｇ＞Ｔ変化が複合ヘテロ接合型（ｃｏｍｐ．ｈｅｔ．）のＳＴＧＤ１患者、及びｃ．７６８Ｇ＞Ｔ変異がホモ接合型（ｈｏｍ．）のＳＴＧＤ１患者の線維芽細胞に由来するＲＮＡにおけるＡＢＣＡ４のＲＴ－ＰＣＲ解析。－又は＋は、シクロヘキシミドの非存在又は存在を指し示す。Ｍ：１００－ｂｐラダー。ＭＱ：ｍｉｌｌｉＱ水。ｃ．７６８Ｇ＞Ｔバリアント、本来の及び代替のスプライスドナー部位、並びに設計されたＡＯＮの相対的位置の配置の略図。ＡＯＮ送達後のホモ接合型ｃ．７６８Ｇ＞Ｔ患者由来線維芽細胞のＲＮＡ解析。（Ａ）ＡＯＮ２～ＡＯＮ８で処置した又は無処置の（ＮＴ）患者由来線維芽細胞のＲＴ－ＰＣＲ及びネステッドＰＣＲによるＡＢＣＡ４転写物の解析。対照として野生型線維芽細胞（ＷＴ）を使用した。ローディング対照としてＡＣＴＢを使用した。ＭＱは、１回目及び２回目（ネステッド）のＰＣＲ反応の陰性対照を表す。ＡＯＮ１は、ＡＯＮ２と同様の結果を生じた（データ図示せず）。ＡＯＮ送達後のホモ接合型ｃ．７６８Ｇ＞Ｔ患者由来線維芽細胞のＲＮＡ解析。（Ｂ）ゲル１～３において強調されたバンドのクロマトグラム。配列が、バンド１中と同様にＧを表すピークしか示さず、患者が、ｃ．７６８Ｇ＞Ｔ変異をホモ接合型で保有するため、アスタリスクを有するバンドは、コンタミネーションであることが判明した。ＡＯＮ８は、バンド２中の配列によって示される通り、スプライシングを補正することができた。標的領域と比較したＡＯＮ位置。標的領域に相対的なＡＯＮの位置。ＡＯＮ１０～３４は、ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格による２’－ＯＭｅ修飾を含有した一方、ＡＯＮ３５～４０は、ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格による２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾を含有した。エクソン部分は、灰色のボックスにより描写される。ｃ．７６８Ｇ＞Ｔ変異は、矢印及び太字で指し示される。ＳＴＧＤ１症例において見出された３５ヌクレオチド拡張は、斜体で収載される。ｃ．７６８Ｔバリアントを有するミディジーンを使用した、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＯＮスクリーニング。ｃ．７６８Ｔバリアント（ＭＵＴ）を保有するミディジーンと、ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格による２’－ＯＭｅ修飾を有するＡＯＮ（Ａ＃）又はセンスオリゴ（ＳＯＮ）のいずれかとをコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＲＴ－ＰＣＲ解析。対照としてｃ．７６８Ｇ（ＷＴ）を保有する野生型ミディジーンを使用した。陰性対照として非トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ）を使用した。ＭＱは、ＰＣＲの陰性対照を指し示す。下のパネルにおいて、条件毎に正しい（ＷＴ）及び異常な（ＭＵＴ）転写物の間の比（パーセンテージで表現）の半定量化を提示する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における２’－Ｏ－ＭＯＥＡＯＮのスクリーニング。変異体ミディジーン（ＭＵＴ）と、２’－ＭＯＥ化学修飾及びＰＳ骨格を有するいくつかのＡＯＮ（Ａ＃）又はセンスオリゴ（ＳＯＮ）とをコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＲＴ－ＰＣＲ解析。陽性対照として野生型ミディジーン（ＷＴ）を使用し、一方、陰性対照として非トランスフェクト細胞（ＨＥＫ）を使用した。ＭＱレーンは、ＰＣＲの陰性対照に対応する。下のパネルは、正しい（ＷＴ）及び異常な（ＭＵＴ）転写物のパーセンテージで表現されたバンドの半定量化を表す。ＡＯＮ濃度：１μＭ。患者由来線維芽細胞におけるＡＯＮ有効性解析。ｃ．７６８Ｇ＞Ｔバリアントをホモ接合型で保有する患者由来線維芽細胞株（ＨＯＭ）におけるＰＳ骨格による、２’－ＯＭｅ又は２’－ＭＯＥのいずれかで化学修飾されたいくつかのＡＯＮ（Ａ＃）の有効性の解析。対照（ＣＯＮ）として健康な個体に由来する線維芽細胞を使用した。異常な転写物は、ナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）に付されるため、ＣＯＮ及びＨＯＭ細胞の両方を、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）の非存在（－）又は存在（＋）下で培養した。ＡＯＮ送達が関与する全条件は、ＣＨＸの存在下で行われる。ＭＱは、ＰＣＲの陰性対照を指し示す。ローディング対照としてＡＣＴＢを使用した。条件毎にパーセンテージで表現された正しい（ＷＴ）及び異常な（ＭＵＴ）転写物の比の半定量的解析。ＡＯＮ濃度：１μＭ。

［配列の説明］

スターガルト病（ＳＴＧＤ１）の根底にあるＡＢＣＡ４における再発性変異は、ｃ．７６８Ｇ＞Ｔである。この変異は、エクソン６の最後のヌクレオチドを変化させるが、アミノ酸配列を変更しない、すなわち、対応するコドンによってコードされるバリン残基はバリンのままである（ｐ．Ｖａｌ２５６Ｖａｌ）。代わりに、エクソン６のスプライスドナー部位の強度は、Ｇの代わりのＴの存在によって減少する（図１Ａ、図４）。結果として、イントロン６における３５ｎｔ下流の代替のスプライス部位が、スプライシング機構によって使用されており、患者由来線維芽細胞において実証される通り、エクソン６の３５ｎｔ拡張をもたらす（図１Ｂ）。この転写物は、シクロヘキシミド（ナンセンス変異依存分解機構の阻害剤）の非存在下で検出されなかったため、この異常な転写物は、細胞内で分解される可能性が最も高い。或いは、変異体ＲＮＡが翻訳される場合、３５－ｎｔ拡張は、タンパク質合成の中途終結をもたらすと予測されるフレームシフトを引き起こす。

本出願人らは、イントロン６における代替のスプライスドナー部位を遮断するであろうＡＯＮを設計し、これにより、本来のスプライスドナー部位に戻るようスプライシング機構を制御することを目標とすることにより、ＡＯＮ投与が、ＡＢＣＡ４におけるｃ．７６８Ｇ＞Ｔ変異に関連するスプライス欠損を回復させることができるか評価した。

実施例１
先ず、材料と方法セクションにおいて、実験の詳細について記載する一方、結果は、さらに下の結果セクションにおいて記載及び説明する。

材料と方法
ＡＯＮ設計及び検査
ＡＯＮを設計するために、より小型の２５７ｂｐの目的の領域を選択した（配列番号５）。その後、約２０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを設計した。全オリゴヌクレオチドを、ｉｎｓｉｌｉｃｏＲＮＡ構造予測に付した。予測される構造の差を示した及び／又は最良の到達性を有した８種のＡＯＮを設計し、異なるケミストリーにおいて注文した（表２及び図２を参照）。

ＡＯＮ検査
ｃ．７６８Ｇ＞Ｔをホモ接合型で保有するＳＴＧＤ１患者由来の皮膚生検を得て、線維芽細胞株を作製した。次に、線維芽細胞株に、シクロヘキシミドの存在下で８種の異なるＡＯＮ（表２に記載）をトランスフェクトした。次に、トランスフェクトされた細胞をＲＴ－ＰＣＲ解析に付した。

ＲＴ－ＰＣＲ解析
製造業者のプロトコールに従ってヌクレオスピンＲＮＡクリーンアップ（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＲＮＡＣｌｅａｎ－ｕｐ）キット（カタログ番号７４０９５５－５０；Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することにより、全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを定量化し、製造業者の説明書に従ってアイスクリプト（ｉＳｃｒｉｐｔ）ｃＤＮＡ合成キット（カタログ番号１７０８８９１；Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用することにより、１μｇＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。最後に、次のＡＢＣＡ４プライマーを使用してネステッドＰＣＲを行うことにより、ＡＯＮの有効性を評価した：ＰＣＲ１（エクソン４＿Ｆｗ：５’－ＣＡＣＣＣＧＧＡＧＡＧＡＡＴＴＧＣＡＧ－３’（配列番号３８）及びエクソン８＿Ｒｖ：５’－ＣＣＴＧＣＡＴＡＣＴＣＧＧＣＣＧＡＴＧ－３’（配列番号３９））；ＰＣＲ２又はネステッドＰＣＲ（エクソン５＿Ｆｗ：５’－ＧＧＡＡＴＡＣＧＡＡＴＡＡＧＧＧＡＴＡＴＣＴＴＧ－３’（配列番号４０）及びエクソン７＿Ｒｖ：５’－ＣＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＣＡＴＡＴＣＡＧ－３’（配列番号４１））。

結果
ＡＯＮ８は、イントロン６における代替のスプライス部位を遮断し、ｃ．７６８Ｇ＞Ｔ変異により弱められてはいるが依然として用いることができる、本来のスプライスドナー部位に戻るようにスプライス部位を制御することができた（図３Ａ及び図３Ｂ）。結果として、ＡＢＣＡ４プレｍＲＮＡスプライシングを回復させることができる。

実施例２
次に、本出願人らは、より多くのＡＯＮ（配列とケミストリーの観点から異なる）を使用し、複数の細胞系（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び患者由来線維芽細胞）を用いた、実施例１の拡大について報告する。

材料と方法
ＡＯＮ設計
ＡＯＮを設計するために、２３５ｂｐの小型のＡＢＣＡ４領域を選択した；ＡＢＣＡ４ｃ．６６９～ｃ．７６８＋１３５。その後、総計２６種のＡＯＮ（それぞれ２１ヌクレオチドの長さ）を設計し、ＡＯＮ１０～ＡＯＮ３５と表示した。ＡＯＮ１０～ＡＯＮ３４は、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）化学修飾により設計し、ＡＯＮ３５は、２’Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）ケミストリーにより設計した。最初の結果の後に、２’－Ｏ－ＭＯＥケミストリーを有するさらに５種のＡＯＮを注文し、ＡＯＮ３６～ＡＯＮ４０と表示し、これらは、それぞれＡＯＮ１４、１５、１６、１９及び２３の配列に対応する。ケミストリー毎に、それぞれＡＯＮ２２及び３５に相補的な配列を有するセンスオリゴヌクレオチドを注文した。全ＡＯＮ（及びＳＯＮ）は、表３に収載されている。収載されているＡＯＮは全て、ホスホロチオエート骨格を有する。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＯＮウォーク
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞トランスフェクション
全検査を２回繰り返して行った。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに播種し、野生型ＡＢＣＡ４エクソン６及びイントロン６（ＢＡ４＿ＷＴ）を含有するミディジーン、並びにｃ．７６８Ｇ＞Ｔ変異を含有する以外は同じミディジーン（ＢＡ４＿ＭＵＴ）を６μｇトランスフェクトした。一晩インキュベーション後に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトリプシンで消化し、１２ウェルプレートに蒔いた。細胞は、付着するようになったら、ヒュージーン（ＦｕＧＥＮＥ）（カタログ番号Ｅ２３１１；Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して１μＭ濃度のＡＯＮ又はＳＯＮをトランスフェクトし、４８時間インキュベートした。トランスフェクトされた細胞は、ＲＴ－ＰＣＲによりＲＮＡレベルで解析した。

ＲＴ－ＰＣＲ解析
製造業者のプロトコールに従ってヌクレオスピンＲＮＡクリーンアップキット（カタログ番号７４０９５５２５０；Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することにより、全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを定量化し、製造業者の説明書に従ってスーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）ＶＩＬＯｃＤＮＡ合成キット（カタログ番号１１７５５０５０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することにより、１μｇＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、その後、２０ｎｇ／μｌの作業濃度となるようにＨ_２Ｏで希釈した。次のＢＡ４ミディジーン特異的プライマーを使用して逆転写ＰＣＲを行うことにより、ＡＯＮの有効性を評価した：ＡＢＣＡ４ｅｘ６＿Ｆｗ：５’－ＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＣＧＣＧＧＧＧＣ－３’（配列番号８１）及びｐＣＩ－Ｎｅｏ－Ｒｈｏｅｘ５＿Ｒｅｖ：５’－ＡＧＧＴＧＴＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣ－３’（配列番号８２）。ＲＨＯエクソン５を標的とするプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲは、ミディジーントランスフェクション有効性を評価するための対照として使用した（ｐＣＩ－Ｎｅｏ－Ｒｈｏｅｘ５＿Ｆｗ：５’－ＡＴＣＴＧＣＴＧＣＧＧＣＡＡＧＡＡＣ－３’（配列番号８３）及びｐＣＩ－Ｎｅｏ－Ｒｈｏｅｘ５＿Ｒｅｖ：５’－ＡＧＧＴＧＴＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣ－３’（配列番号８４））。２５μｌの総反応物における１０μＭの各プライマー、２μＭのｄＮＴＰ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１Ｕのタック（Ｔａｑ）ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及び４０ｎｇのｃＤＮＡにより、次のＰＣＲ条件を使用して、ＲＴ－ＰＣＲ解析を行った：９４℃で３分間、続いて、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間及び７２℃で２分間を３５サイクルと、７２℃で３分間の最終伸長。ＰＣＲ産物は、２．５％アガロースゲルにおいて分離し、選択されたバンドは、サンガー配列決定により確認した。観察された非特異的バンドは、解析に考慮しなかった。フィジー（Ｆｉｊｉ）ソフトウェアを使用して、ヘテロ二重鎖、変異体及び野生型バンドの半定量的解析を行った。ヘテロ二重鎖バンドは、グラフ表示のため、正しい転写物と異常な転写物の間で等しく分布した。

線維芽細胞におけるＡＯＮ有効性の比較
線維芽細胞トランスフェクション
健康な個体及びＡＢＣＡ４ｃ．７６８Ｇ＞Ｔがホモ接合型のＳＴＧＤ１患者由来の皮膚生検を得て、２種の線維芽細胞の細胞株を作製した。線維芽細胞を６ウェルプレートに蒔き、シクロヘキシミドの存在下でヒュージーン（カタログ番号Ｅ２３１１；Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して１μＭ濃度のＡＯＮをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、ＲＴ－ＰＣＲによりＲＮＡレベルで解析した。

ＲＴ－ＰＣＲ解析
製造業者のプロトコールに従ってヌクレオスピンＲＮＡクリーンアップキット（カタログ番号７４０９５５２５０；Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することにより、全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを定量化し、製造業者の説明書に従ってスーパースクリプトＶＩＬＯｃＤＮＡ合成キット（カタログ番号１１７５５０５０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することにより、１μｇＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、その後、２０ｎｇ／μｌの作業濃度となるようにＨ_２Ｏで希釈した。次のＡＢＣＡ４プライマー：エクソン５＿Ｆｗ：５’ＧＧＡＡＴＡＣＧＡＡＴＡＡＧＧＧＡＴＡＴＣＴＴＧ－３’（配列番号８５）及びエクソン７＿Ｒｅｖ：５’－ＣＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＣＡＴＡＴＣＡＧ－３’（配列番号８６）を使用した線維芽細胞対照細胞株におけるＲＴ－ＰＣＲ、並びに次のＡＢＣＡ４プライマー：ＰＣＲ１エクソン４＿Ｆｗ：５’－ＣＡＣＣＣＧＧＡＧＡＧＡＡＴＴＧＣＡＧ－３’（配列番号８７）及びエクソン８＿Ｒｅｖ：５’－ＣＣＴＧＣＡＴＡＣＴＣＧＧＣＣＧＡＴＧ－３’（配列番号８８）並びにＰＣＲ２エクソン５＿Ｆｗ：５’ＧＧＡＡＴＡＣＧＡＡＴＡＡＧＧＧＡＴＡＴＣＴＴＧ－３’（配列番号８９）及びエクソン７＿Ｒｅｖ：５’－ＣＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＣＡＴＡＴＣＡＧ－３’（配列番号９０）を使用したＡＢＣＡ４ｃ．７６８Ｇ＞Ｔを保有する線維芽細胞におけるネステッドＰＣＲを行うことにより、ＡＯＮの有効性を評価した。２５μｌの総反応物における１０μＭのエクソン５＿Ｆｗ及びエクソン７＿Ｒｗプライマー、２μＭのｄＮＴＰ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１Ｕのタックポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）並びに８０ｎｇのｃＤＮＡにより、次のＰＣＲ条件を使用して、線維芽細胞対照細胞株におけるＲＴ－ＰＣＲを行った：９４℃で３分間、続いて、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間及び７２℃で２分間を３５サイクルと、７２℃で３分間の最終伸長。２５μｌの総反応物における１０μＭのエクソン４＿Ｆｗプライマー及びエクソン８＿Ｒｗプライマー、２μＭのｄＮＴＰ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１Ｕのタックポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）並びに８０ｎｇのｃＤＮＡにより、次のＰＣＲ条件を使用して、ＡＢＣＡ４ｃ．７６８Ｇ＞Ｔ変異を保有する線維芽細胞におけるＲＴ－ＰＣＲを行った：９４℃で３分間、続いて、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間及び７２℃で２分間を４０サイクルと、７２℃で３分間の最終伸長。上に記載されている通りにネステッドＰＣＲを行い、０．５μｌのＰＣＲ１産物を、次の条件を使用したネステッドＰＣＲのためのＰＣＲ鋳型として使用した：９４℃で３分間、続いて、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間及び７２℃で２分間を３５サイクルと、７２℃で３分間の最終伸長。全ＰＣＲ産物は、２．５％アガロースゲルにおいて分離し、選択されたバンドは、サンガー配列決定により確認した。フィジーソフトウェアを使用して、変異体及び野生型バンドの半定量的解析を行った。アクチン（ＡＣＴＢ）を増幅して、ローディング対照とした。プライマー：Ｐ４９７５０＿Ｆｗ＿ＡＣＴＢエクソン３：５’－ＡＣＴＧＧＧＡＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧ－３’（配列番号９１）プライマー：Ｐ４９７５１＿Ｒｅｖ＿ＡＣＴＢエクソン４：５’－ＴＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧ－３’（配列番号９２）。

結果と考察
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＯＮレスキュー
ｃ．７６８Ｇ＞Ｔ変異（３５－ｎｔ拡張）に関連するスプライス欠損をレスキューすることができる最も強力なＡＯＮを同定するために、「オリゴ－ウォーク」を行い、それによると、代替のスプライス部位（位置ｃ．７６８＋３５における）前後の領域を標的とするＡＯＮ配列は、次から次に１個又は２個のヌクレオチドのみ異なる（図４）。位置ｃ．７６８にＧ（ＷＴ）又はＴ（ＭＵＴ）のいずれかを有するＡＢＣＡ４のゲノム断片を有するミディジーンを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へとトランスフェクトし、その後、異なるＡＯＮなし又はありでコトランスフェクトした。最初のシリーズにおいて、ＡＯＮの大部分は、ホスホロチオエート骨格及び２’－Ｏ－メチル修飾（２’－ＯＭｅ）による以前に使用されたケミストリーを含有し、ＡＯＮ３５のみが異なり、２’－ＯＭｅの代わりに２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）を有し、ＡＯＮ２２と同じ配列を有した。図５から観察できるように、全ＡＯＮは、ある程度まで、ＭＵＴミディジーンをトランスフェクトした場合に観察されるスプライシング欠損を制御することができた。ＡＯＮ１４、１５、１６、１９、２２及び２３は、２’－ＯＭｅケミストリーを有する場合に最も強力であると思われた。興味深いことに、近年「発表された」２’－Ｏ－ＭＯＥケミストリーを有するＡＯＮ３５は、定量化及びサンガー配列決定によって確認される通り、正常なＡＢＣＡ４転写物に向けてスプライシングを制御することを最も可能とした。全実験を２回繰り返して行った。ＷＴミディジーンを有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＡＯＮ投与の結果は、いかなるスプライシング欠損も示さなかった（データ図示せず）。

２’－Ｏ－ＭＯＥケミストリーによる有望な結果を考慮して、本出願人らは、ＡＯＮ１４、１５、１６、１９及び２３（ＡＯＮ３５は、ＡＯＮ２２に既に対応した）の配列を有する、２’－Ｏ－ＭＯＥケミストリーも有するＡＯＮを注文することを決断した。これらのＡＯＮは、作られたＡＯＮ３６～４０であり、これらの潜在的有効性をＨＥＫ２９３Ｔ細胞において同じ様式で評価した。図６において観察できるように、以前に有効なＡＯＮ３５、ただし同様にＡＯＮ３６、３８及び４０も、異常スプライシングプロセスを補正することを高度に可能とした。ＡＯＮ３９は、有効性がやや低かったが、ＡＯＮ３７は、レスキューをかろうじて示した。
線維芽細胞におけるＡＯＮレスキュー

次に、ケミストリー毎に６種の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における最も有効なＡＯＮのため、本出願人らは、患者由来線維芽細胞におけるそれらのスプライス制御能を評価することを目標としたが、その理由として、患者由来線維芽細胞が、ゲノムＤＮＡにｃ．７６８Ｇ＞Ｔ変異を有し、よって、内在性ＡＢＣＡ４発現による関連するスプライス欠損の評価を可能にすることが挙げられる。ホモ接合型状態でｃ．７６８Ｇ＞Ｔ変異を有するＳＴＧＤ１個体由来の線維芽細胞に、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｏ－ＭＯＥケミストリーのいずれかを有する最も強力なＡＯＮをトランスフェクトした。図７に示す通り、ある程度のスプライシング補正が測定されたが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において得られる結果と比較して有効性は低かった。全ＡＯＮのうち、両者共に２’－Ｏ－ＭＯＥケミストリーを有するＡＯＮ３５及び４０は、最も強い効果を有すると思われた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較して線維芽細胞において有効性が低いことの理由は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＡＢＣＡ４転写物のごく一部が発現される一方、線維芽細胞において、ｍＲＮＡ全体が存在するという事実によって説明される可能性が最も高い。よって、プレｍＲＮＡ分子のフォールディングが完全に異なる可能性があり、ＡＯＮアクセスにも影響を与える。加えて、ＡＢＣＡ４プレｍＲＮＡの安定性のみならず、トランスフェクション有効性が、細胞毎に異なる可能性がある。

結論
ｃ．７６８Ｇ＞Ｔ変異が原因の異常ＡＢＣＡ４スプライシングを潜在的に制御することができるＡＯＮの数を拡大することにより、多数の興味深い知見が得られた。先ず、「オリゴ－ウォーク」と組み合わせたＡＢＣＡ４ミディジーン系を使用した場合、本出願人らは、ほぼ全てのＡＯＮが、ある程度まで、スプライシングを制御することができたが、ＡＯＮ間に有意差が観察されたことを発見した。ＡＯＮ１４、１５、１６、１９、２２及び２３は全て２’－ＯＭｅケミストリーを有し、最も効果的であった。興味深いことに、２’－Ｏ－ＭＯＥケミストリーを有したＡＯＮ３５は、全ての２’－ＯＭｅケミストリーよりも優れていた。全て２’－Ｏ－ＭＯＥケミストリーを有する多数の追加的なＡＯＮ（ＡＯＮ３６～ＡＯＮ４０）に関して同様の観察が得られたが、この場合もやはり、ＡＯＮ配列間で異なる有効性を有した。線維芽細胞において、ＡＯＮは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較したほど有効ではなく、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔミディジーン系においては問題ではない何かしらの、内在性環境におけるＡＢＣＡ４プレｍＲＮＡのフォールディングが原因で、これらの細胞によるＡＯＮの取込みの有効性が低いこと、及び／又はＡＯＮに対する標的転写物の到達性が低いことのいずれかを示唆する。

まとめると、本出願人らは、ｃ．７６８Ｇ＞Ｔに起因するスプライス欠損を標的とするための最も強力なＡＯＮ配列を同定し、本出願人らは、２’－Ｏ－ＭＯＥケミストリーを有するＡＯＮが、２’－ＯＭｅケミストリーを有するＡＯＮと比較して、より有効であると思われることを示した。

参考文献
ＡｌｂｅｒｔＳ，ＧａｒａｎｔｏＡ，ＳａｎｇｅｒｍａｎｏＲ，ＫｈａｎＭ，ＢａｘＮＭ，ＨｏｙｎｇＣＢ，ＺｅｒｎａｎｔＪ，ＬｅｅＷ，ＡｌｌｉｋｍｅｔｓＲ，ＣｏｌｌｉｎＲＷＪ，ＣｒｅｍｅｒｓＦＰＭ（２０１８）．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＲｅｓｃｕｅｏｆＳｐｌｉｃｅＤｅｆｅｃｔｓＣａｕｓｅｄｂｙＴｗｏＮｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇＤｅｅｐ－ＩｎｔｒｏｎｉｃＡＢＣＡ４ＭｕｔａｔｉｏｎｓＵｎｄｅｒｌｙｉｎｇＳｔａｒｇａｒｄｔＤｉｓｅａｓｅ．ＡｍＪＨｕｍＧｅｎｅｔ，１０２：５１７－５２７．

Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ，Ｒ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｎ．，Ｓｕｎ，Ｈ．，Ｓｈｒｏｙｅｒ，Ｎ．Ｆ．，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ａ．，Ｃｈｉｄａｍｂａｒａｍ，Ａ．，Ｇｅｒｒａｒｄ，Ｂ．，Ｂａｉｒｄ，Ｌ．，Ｓｔａｕｆｆｅｒ，Ｄ．，Ｐｅｉｆｆｅｒ，Ａ．，Ｒａｔｔｎｅｒ，Ａ．，Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ，Ｐ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ａ．，Ｎａｔｈａｎｓ，Ｊ．，Ｌｅｐｐｅｒｔ，Ｍ．，Ｄｅａｎ，Ｍ．＆Ｌｕｐｓｋｉ，Ｊ．Ｒ．Ａｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ（ＡＢＣＲ）ｉｓｍｕｔａｔｅｄｉｎｒｅｃｅｓｓｉｖｅＳｔａｒｇａｒｄｔｍａｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５，２３６－２４６（１９９７），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ０３９７－２３６．

Ｂａｕｗｅｎｓ，Ｍ．，ＤｅＺａｅｙｔｉｊｄ，Ｊ．，Ｗｅｉｓｓｃｈｕｈ，Ｎ．，Ｋｏｈｌ，Ｓ．，Ｍｅｉｒｅ，Ｆ．，Ｄａｈａｎ，Ｋ．，Ｄｅｐａｓｓｅ，Ｆ．，ＤｅＪａｅｇｅｒｅ，Ｓ．，ＤｅＲａｖｅｌ，Ｔ．，ＤｅＲａｄｅｍａｅｋｅｒ，Ｍ．，Ｌｏｅｙｓ，Ｂ．，Ｃｏｐｐｉｅｔｅｒｓ，Ｆ．，Ｌｅｒｏｙ，Ｂ．Ｐ．＆ＤｅＢａｅｒｅ，Ｅ．ＡｎａｕｇｍｅｎｔｅｄＡＢＣＡ４ｓｃｒｅｅｎｔａｒｇｅｔｉｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｓｒｅｖｅａｌｓａｄｅｅｐｉｎｔｒｏｎｉｃｆｏｕｎｄｅｒｖａｒｉａｎｔｉｎＢｅｌｇｉａｎＳｔａｒｇａｒｄｔｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．３６，３９－４２（２０１５），ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｕｍｕ．２２７１６．

Ｂａｘ，Ｎ．Ｍ．，Ｓａｎｇｅｒｍａｎｏ，Ｒ．，Ｒｏｏｓｉｎｇ，Ｓ．，Ｔｈｉａｄｅｎｓ，Ａ．Ａ．，Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔ，Ｌ．Ｈ．，ｖａｎｄｅｎＢｏｒｎ，Ｌ．Ｉ．，Ｐｈａｎ，Ｍ．，Ｋｌｅｖｅｒｉｎｇ，Ｂ．Ｊ．，Ｗｅｓｔｅｎｅｎｇ－ｖａｎＨａａｆｔｅｎ，Ｃ．，Ｂｒａｕｎ，Ｔ．Ａ．，Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ－Ｖｒｉｅｌｉｎｇ，Ｍ．Ｎ．，ｄｅＷｉｊｓ，Ｉ．，Ｍｕｔｌｕ，Ｍ．，Ｓｔｏｎｅ，Ｅ．Ｍ．，ｄｅｎＨｏｌｌａｎｄｅｒ，Ａ．Ｉ．，Ｋｌａｖｅｒ，Ｃ．Ｃ．，Ｈｏｙｎｇ，Ｃ．Ｂ．＆Ｃｒｅｍｅｒｓ，Ｆ．Ｐ．Ｍ．Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓｄｅｅｐ－ｉｎｔｒｏｎｉｃｖａｒｉａｎｔｓａｎｄｄｅｌｅｔｉｏｎｓｉｎＡＢＣＡ４ｉｎｐｅｒｓｏｎｓｗｉｔｈｒｅｔｉｎａｌｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓａｎｄｏｎｅｅｘｏｎｉｃＡＢＣＡ４ｖａｒｉａｎｔ．Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．３６，４３－４７（２０１５），ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｕｍｕ．２２７１７．

Ｂｒａｕｎ，Ｔ．Ａ．，Ｍｕｌｌｉｎｓ，Ｒ．Ｆ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ａ．Ｈ．，Ａｎｄｏｒｆ，Ｊ．Ｌ．，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｂａｋａｌｌ，Ｂ．Ｂ．，Ｄｅｌｕｃａ，Ａ．Ｐ．，Ｆｉｓｈｍａｎ，Ｇ．Ａ．，Ｌａｍ，Ｂ．Ｌ．，Ｗｅｌｅｂｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｃｉｄｅｃｉｙａｎ，Ａ．Ｖ．，Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｓ．Ｇ．，Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ，Ｖ．Ｃ．，Ｔｕｃｋｅｒ，Ｂ．Ａ．＆Ｓｔｏｎｅ，Ｅ．Ｍ．Ｎｏｎ－ｅｘｏｍｉｃａｎｄｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓｖａｒｉａｎｔｓｉｎＡＢＣＡ４ａｒｅａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｃａｕｓｅｏｆＳｔａｒｇａｒｄｔｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２２，５１３６－５１４５（２０１３），ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｔ３６７．

ＣｏｌｌｉｎＲＷＪ，ｄｅｎＨｏｌｌａｎｄｅｒＡＩ，ｖａｎｄｅｒＶｅｌｄｅ－ＶｉｓｓｅｒＳ，ＢｅｎｎｉｃｅｌｌｉＪ，ＢｅｎｎｅｔｔＪ，ＣｒｅｍｅｒｓＦＰＭ（２０１２）．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＡＯＮ）－ｂａｓｅｄｔｈｅｒａｐｙｆｏｒＬｅｂｅｒＣｏｎｇｅｎｉｔａｌＡｍａｕｒｏｓｉｓｃａｕｓｅｄｂｙａｆｒｅｑｕｅｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｉｎＣＥＰ２９０．ＭｏｌＴｈｅｒＮｕｃｌＡｃｉｄｓ，ｅ１４．

Ｃｒｅｍｅｒｓ，Ｆ．Ｐ．Ｍ．，ｖａｎｄｅＰｏｌ，Ｄ．Ｊ．，ｖａｎＤｒｉｅｌ，Ｍ．，ｄｅｎＨｏｌｌａｎｄｅｒ，Ａ．Ｉ．，ｖａｎＨａｒｅｎ，Ｆ．Ｊ．，Ｋｎｏｅｒｓ，Ｎ．Ｖ．，Ｔｉｊｍｅｓ，Ｎ．，Ｂｅｒｇｅｎ，Ａ．Ａ．，Ｒｏｈｒｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｋ．，Ｂｌａｎｋｅｎａｇｅｌ，Ａ．，Ｐｉｎｃｋｅｒｓ，Ａ．Ｊ．，Ｄｅｕｔｍａｎ，Ａ．Ｆ．＆Ｈｏｙｎｇ，Ｃ．Ｂ．Ａｕｔｏｓｏｍａｌｒｅｃｅｓｓｉｖｅｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａａｎｄｃｏｎｅ－ｒｏｄｄｙｓｔｒｏｐｈｙｃａｕｓｅｄｂｙｓｐｌｉｃｅｓｉｔｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅＳｔａｒｇａｒｄｔ’ｓｄｉｓｅａｓｅｇｅｎｅＡＢＣＲ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．７，３５５－３６２（１９９８）．

Ｆｕｊｉｎａｍｉ，Ｋ．，Ｚｅｒｎａｎｔ，Ｊ．，Ｃｈａｎａ，Ｒ．Ｋ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．Ａ．，Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｋ．，Ｏｚａｗａ，Ｙ．，Ｔｓｕｂｏｔａ，Ｋ．，Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ａ．Ｒ．，Ｍｏｏｒｅ，Ａ．Ｔ．，Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ，Ｒ．＆Ｍｉｃｈａｅｌｉｄｅｓ，Ｍ．ＡＢＣＡ４ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｂｙｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｉｎａＢｒｉｔｉｓｈｃｏｈｏｒｔ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．５４，６６６２－６６７４（２０１３），ｄｏｉ：１０．１１６７／ｉｏｖｓ．１３－１２５７０．

ＧａｒａｎｔｏＡ，ＣｈｕｎｇＤＣ，ＤｕｉｊｋｅｒｓＬ，Ｃｏｒｒａｌ－ＳｅｒｒａｎｏＪＣ，ＭｅｓｓｃｈａｅｒｔＭ，ＸｉａｏＲ，ＢｅｎｎｅｔｔＪ，ＶａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅＬＨ，ＣｏｌｌｉｎＲＷＪ（２０１６）．ＩｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏｒｅｓｃｕｅｏｆａｂｅｒｒａｎｔｓｐｌｉｃｉｎｇｉｎＣＥＰ２９０－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＬＣＡｂｙａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｄｅｌｉｖｅｒｙ．ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ，２５：２５５２－２５６３．

ＧａｒａｎｔｏＡ＆ＣｏｌｌｉｎＲＷＪ（２０１８）．Ｄｅｓｉｇｎａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｕｓｅｏｆａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｔｏｃｏｒｒｅｃｔｐｒｅ－ｍＲＮＡｓｐｌｉｃｉｎｇｄｅｆｅｃｔｓｉｎｉｎｈｅｒｉｔｅｄｒｅｔｉｎａｌｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ，１７１５：６１－７８．

Ｇａｒａｎｔｏ，Ａ．，ｅｔａｌ．，ＩｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏｒｅｓｃｕｅｏｆａｂｅｒｒａｎｔｓｐｌｉｃｉｎｇｉｎＣＥＰ２９０－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＬＣＡｂｙａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｄｅｌｉｖｅｒｙ．ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ，２０１６．２５（１２）：ｐ．２５５２－２５６３．

Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ａ．，Ｓｈｒｏｙｅｒ，Ｎ．Ｆ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｎ．，Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ，Ｒ．，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ａ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｌｕｐｓｋｉ，Ｊ．Ｒ．，Ｌｅｐｐｅｒｔ，Ｍ．＆Ｄｅａｎ，Ｍ．Ｇｅｎｏｔｙｐｅ／Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇｃａｓｓｅｔｔｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ，ＡＢＣＲ，ｉｎＳｔａｒｇａｒｄｔｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６４，４２２－４３４（１９９９），ｄｏｉ：１０．１０８６／３０２２５１．

Ｍａｕｇｅｒｉ，Ａ．，ｖａｎＤｒｉｅｌ，Ｍ．Ａ．，ｖａｎｄｅＰｏｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｋｌｅｖｅｒｉｎｇ，Ｂ．Ｊ．，ｖａｎＨａｒｅｎ，Ｆ．Ｊ．，Ｔｉｊｍｅｓ，Ｎ．，Ｂｅｒｇｅｎ，Ａ．Ａ．，Ｒｏｈｒｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｋ．，Ｂｌａｎｋｅｎａｇｅｌ，Ａ．，Ｐｉｎｃｋｅｒｓ，Ａ．Ｊ．，Ｄａｈｌ，Ｎ．，Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｈ．Ｇ．，Ｄｅｕｔｍａｎ，Ａ．Ｆ．，Ｈｏｙｎｇ，Ｃ．Ｂ．＆Ｃｒｅｍｅｒｓ，Ｆ．Ｐ．Ｍ．Ｔｈｅ２５８８Ｇ－－＞ＣｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＡＢＣＲｇｅｎｅｉｓａｍｉｌｄｆｒｅｑｕｅｎｔｆｏｕｎｄｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＷｅｓｔｅｒｎＥｕｒｏｐｅａｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎａｎｄａｌｌｏｗｓｔｈｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡＢＣＲｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＳｔａｒｇａｒｄｔｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６４，１０２４－１０３５（１９９９）．

Ｍａｕｇｅｒｉ，Ａ．，Ｋｌｅｖｅｒｉｎｇ，Ｂ．Ｊ．，Ｒｏｈｒｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｋ．，Ｂｌａｎｋｅｎａｇｅｌ，Ａ．，Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｈ．Ｇ．，Ｄｅｕｔｍａｎ，Ａ．Ｆ．，Ｈｏｙｎｇ，Ｃ．Ｂ．＆Ｃｒｅｍｅｒｓ，Ｆ．Ｐ．Ｍ．ＭｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅＡＢＣＡ４（ＡＢＣＲ）ｇｅｎｅａｒｅｔｈｅｍａｊｏｒｃａｕｓｅｏｆａｕｔｏｓｏｍａｌｒｅｃｅｓｓｉｖｅｃｏｎｅ－ｒｏｄｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６７，９６０－９６６（２０００），ｄｏｉ：１０．１０８６／３０３０７９．

Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍｉｒ，Ａ．，Ｐａｌｏｍａ，Ｅ．，Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ，Ｒ．，Ａｙｕｓｏ，Ｃ．，ｄｅｌＲｉｏ，Ｔ．，Ｄｅａｎ，Ｍ．，Ｖｉｌａｇｅｌｉｕ，Ｌ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｄｕａｒｔｅ，Ｒ．＆Ｂａｌｃｅｌｌｓ，Ｓ．ＲｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａｃａｕｓｅｄｂｙａｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＳｔａｒｇａｒｄｔｄｉｓｅａｓｅｇｅｎｅＡＢＣＲ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１８，１１－１２（１９９８），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ０１９８－１１．

Ｒｉｖｅｒａ，Ａ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｋ．，Ｓｔｏｈｒ，Ｈ．，Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｋ．，Ｈｅｍｍｒｉｃｈ，Ｎ．，Ｇｒｉｍｍ，Ｔ．，Ｊｕｒｋｌｉｅｓ，Ｂ．，Ｌｏｒｅｎｚ，Ｂ．，Ｓｃｈｏｌｌ，Ｈ．Ｐ．，Ａｐｆｅｌｓｔｅｄｔ－Ｓｙｌｌａ，Ｅ．＆Ｗｅｂｅｒ，Ｂ．Ｈ．ＡｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｓｕｒｖｅｙｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＡＢＣＡ４（ＡＢＣＲ）ｇｅｎｅｉｎＳｔａｒｇａｒｄｔｄｉｓｅａｓｅａｎｄａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６７，８００－８１３（２０００），ｄｏｉ：１０．１０８６／３０３０９０．

ＳａｎｇｅｒｍａｎｏＲ，ＢａｘＮＭ，ＢａｕｗｅｎｓＭ，ｖａｎｄｅｎＢｏｒｎＬＩ，ｄｅＢａｅｒｅＥ，ＧａｒａｎｔｏＡ，ＣｏｌｌｉｎＲＷＪ，Ｇｏｅｒｃｈａｒｎ－ＲａｍｌａｌＡＳ，ｄｅｎＥｎｇｅｌｓｍａｎ－ｖａｎＤｉｊｋＡＨ，ＲｏｈｒｓｃｈｎｅｉｄｅＫ，ＨｏｙｎｇＣＢ，ＣｒｅｍｅｒｓＦＰＭ，ＡｌｂｅｒｔＳ（２０１６）．ＰｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｍＲＮＡａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｓｅｘｏｎｓｋｉｐｐｉｎｇｒｅｓｕｌｔｉｎｇｆｒｏｍｔｈｅＡＢＣＡ４ｃ．５４６１－１０Ｔ＞ＣｍｕｔａｔｉｏｎｉｎＳｔａｒｇａｒｄｔｄｉｓｅａｓｅ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，１２３：１３７５－１３８５．

ＳａｎｇｅｒｍａｎｏＲ，ＫｈａｎＭ，ＣｏｒｎｅｌｉｓＳＳ，ＲｉｃｈｅｌｌｅＶ，ＡｌｂｅｒｔＳ，ＧａｒａｎｔｏＡ，ＥｌｍｅｌｉｋＤ，ＱａｍａｒＲ，ＬｕｇｔｅｎｂｅｒｇＤ，ｖａｎｄｅｎＢｏｒｎＬＩ，ＣｏｌｌｉｎＲＷＪ，ＣｒｅｍｅｒｓＦＰＭ（２０１８）．ＡＢＣＡ４ｍｉｄｉｇｅｎｅｓｒｅｖｅａｌｔｈｅｆｕｌｌｓｐｌｉｃｅｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆａｌｌｒｅｐｏｒｔｅｄｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌｓｐｌｉｃｅｓｉｔｅｖａｒｉａｎｔｓｉｎＳｔａｒｇａｒｄｔｄｉｓｅａｓｅ．ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ，２８：１００－１１０．

Ｓｃｈｕｌｚ，Ｈ．Ｌ．，Ｇｒａｓｓｍａｎｎ，Ｆ．，Ｋｅｌｌｎｅｒ，Ｕ．，Ｓｐｉｔａｌ，Ｇ．，Ｒｕｔｈｅｒ，Ｋ．，Ｊａｇｌｅ，Ｈ．，Ｈｕｆｅｎｄｉｅｋ，Ｋ．，Ｒａｔｉｎｇ，Ｐ．，Ｈｕｃｈｚｅｒｍｅｙｅｒ，Ｃ．，Ｂａｉｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｂ．Ｈ．＆Ｓｔｏｈｒ，Ｈ．ＭｕｔａｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｔｈｅＡＢＣＡ４ｇｅｎｅｉｎ３３５ＳｔａｒｇａｒｄｔｄｉｓｅａｓｅｐａｔｉｅｎｔｓｆｒｏｍａｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒＧｅｒｍａｎｃｏｈｏｒｔ－ｉｍｐａｃｔｏｆｓｅｌｅｃｔｅｄｄｅｅｐｉｎｔｒｏｎｉｃｖａｒｉａｎｔｓａｎｄｃｏｍｍｏｎＳＮＰｓ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．５８，３９４－４０３（２０１７），ｄｏｉ：１０．１１６７／ｉｏｖｓ．１６－１９９３６．

ｖａｎＤｒｉｅｌ，Ｍ．Ａ．，Ｍａｕｇｅｒｉ，Ａ．，Ｋｌｅｖｅｒｉｎｇ，Ｂ．Ｊ．，Ｈｏｙｎｇ，Ｃ．Ｂ．＆Ｃｒｅｍｅｒｓ，Ｆ．Ｐ．Ｍ．ＡＢＣＲｕｎｉｔｅｓｗｈａｔｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｓｔｓｄｉｖｉｄｅ（ｓ）．ＯｐｈｔｈａｌｍｉｃＧｅｎｅｔ．１９，１１７－１２２（１９９８）．

Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ａ．Ｒ．，Ｈｅｏｎ，Ｅ．，Ｌｏｔｅｒｙ，Ａ．Ｊ．，Ｖａｎｄｅｎｂｕｒｇｈ，Ｋ．，Ｃａｓａｖａｎｔ，Ｔ．Ｌ．，Ｏｈ，Ｋ．Ｔ．，Ｂｅｃｋ，Ｇ．，Ｆｉｓｈｍａｎ，Ｇ．Ａ．，Ｌａｍ，Ｂ．Ｌ．，Ｌｅｖｉｎ，Ａ．，Ｈｅｃｋｅｎｌｉｖｅｌｙ，Ｊ．Ｒ．，Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｓ．Ｇ．，Ｗｅｌｅｂｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ，Ｖ．Ｃ．＆Ｓｔｏｎｅ，Ｅ．Ｍ．ＡｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｌｌｅｌｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＡＢＣＡ４ｇｅｎｅ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４２，１１７９－１１８９（２００１）．

Ｚｅｒｎａｎｔ，Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｗ．，Ｃｏｌｌｉｓｏｎ，Ｆ．Ｔ．，Ｆｉｓｈｍａｎ，Ｇ．Ａ．，Ｓｅｒｇｅｅｖ，Ｙ．Ｖ．，Ｓｃｈｕｅｒｃｈ，Ｋ．，Ｓｐａｒｒｏｗ，Ｊ．Ｒ．，Ｔｓａｎｇ，Ｓ．Ｈ．＆Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ，Ｒ．ＦｒｅｑｕｅｎｔｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃａｌｌｅｌｅｓａｃｃｏｕｎｔｆｏｒａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｆｒａｃｔｉｏｎｏｆＡＢＣＡ４ｄｉｓｅａｓｅａｎｄｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｔｆｒｏｍａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．５４，４０４－４１２（２０１７），ｄｏｉ：１０．１１３６／ｊｍｅｄｇｅｎｅｔ－２０１７－１０４５４０．

Ｚｅｒｎａｎｔ，Ｊ．，Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｃ．，Ｉｍ，Ｋ．Ｍ．，Ｂｕｒｋｅ，Ｔ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｆｉｓｈｍａｎ，Ｇ．Ａ．，Ｔｓａｎｇ，Ｓ．Ｈ．，Ｇｏｕｒａｓ，Ｐ．，Ｄｅａｎ，Ｍ．＆Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ，Ｒ．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＡＢＣＡ４ｇｅｎｅｂｙｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．５２，８４７９－８４８７（２０１１），ｄｏｉ：１０．１１６７／ｉｏｖｓ．１１－８１８２．

Ｚｈｏｕ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｏｃｏｎｅｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓｔｈｒｏｕｇｈｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＢＭＰ，ＴＧＦｂｅｔａａｎｄＷｎｔｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１５．１４２（１９）：ｐ．３２９４－３０６．

Claims

配列番号４に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに結合する、及び／又は配列番号４に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的である、スプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、好ましくは、配列番号５を有するポリヌクレオチドに結合するか、又は配列番号５を有するポリヌクレオチドと相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド、より好ましくは、配列番号８０を有するポリヌクレオチドに結合するか、又は配列番号８０を有するポリヌクレオチドと相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド、さらにより好ましくは、配列番号７、８、９；１１、１２、１３；１５、１６、１７；１９、２０及び２１からなる群から選択されるポリヌクレオチドに結合するか、又は配列番号７、８、９；１１、１２、１３；１５、１６、１７；１９、２０及び２１からなる群から選択されるポリヌクレオチドと相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドが、ＲＮＡ残基、ＤＮＡ残基、又はヌクレオチドアナログ若しくは等価物であり得る、請求項１に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
約８～約４０ヌクレオチド、好ましくは、約１０～約４０ヌクレオチド、より好ましくは、約１４～約３０ヌクレオチド、より好ましくは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチド等の約１６～約２４ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
配列番号３４、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、７３、７５又は７７を含むか、又は配列番号３４、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、７３、７５又は７７からなる、請求項１～３のいずれか一項に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）、２’－Ｏ－エチル修飾されたリボース、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース、２’－Ｏ－プロピル修飾されたリボース及び／又はこれらの修飾を有するハロゲン化された誘導体等の置換された誘導体等の、２’－Ｏアルキルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
配列番号３４、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、７３、７５又は７７を含むか、又は配列番号３４、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、７３、７５又は７７からなり、２’－Ｏ－メチル修飾されたリボース（ＲＮＡ）又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボース及びホスホロチオエート骨格を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
当該分子の発現を促す条件下に置かれると、請求項１～４のいずれか一項に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現する、ウイルスベクター。
請求項１～４のいずれか一項に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項７に記載のウイルスベクター及び薬学的に許容できる賦形剤を含む、医薬組成物。
硝子体内投与のためのものであり、０．０５ｍｇ～５ｍｇの範囲の総アンチセンスオリゴヌクレオチドの量で投与される、請求項８に記載の医薬組成物。
硝子体内投与のためのものであり、片眼当たり０．１～１ｍｇの範囲の、スプライシングを制御するための総アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば片眼当たり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９又は１．０ｍｇのスプライシングを制御するための総アンチセンスオリゴヌクレオチドの量で投与される、請求項８及び９に記載の医薬組成物。
医薬としての使用のための、好ましくはＡＢＣＡ４のスプライシングを調整することを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態を処置するための医薬としての使用のための、請求項１～４のいずれか一項に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項７に記載のベクター又は請求項８～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
ＡＢＣＡ４のスプライシングを調整することを必要とするＡＢＣＡ４関連疾患又は状態を処置するための、請求項１～４のいずれか一項に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項７に記載のベクター又は請求項８～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
細胞におけるＡＢＣＡ４のスプライシングを調整するための方法であって、前記細胞を、請求項１～４のいずれか一項に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項７に記載のベクター又は請求項８～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む方法。
前記ＡＢＣＡ４関連疾患又は状態が、スターガルト病である、請求項１１に記載の使用のためのスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項１２に記載の使用又は請求項１３に記載の方法。