EA043834B1 - Антисмысловые олигонуклеотиды для лечения болезни штаргардта - Google Patents
Антисмысловые олигонуклеотиды для лечения болезни штаргардта Download PDFInfo
- Publication number
- EA043834B1 EA043834B1 EA201991460 EA043834B1 EA 043834 B1 EA043834 B1 EA 043834B1 EA 201991460 EA201991460 EA 201991460 EA 043834 B1 EA043834 B1 EA 043834B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- aoh
- pseudoexon
- seq
- abca4
- nucleotides
- Prior art date
Links
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 19
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 title description 57
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 title description 57
- 208000027073 Stargardt disease Diseases 0.000 title description 24
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 title description 4
- 101000801643 Homo sapiens Retinal-specific phospholipid-transporting ATPase ABCA4 Proteins 0.000 claims description 114
- 102100033617 Retinal-specific phospholipid-transporting ATPase ABCA4 Human genes 0.000 claims description 114
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 32
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 9
- 206010048843 Cytomegalovirus chorioretinitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001763 cytomegalovirus retinitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims description 2
- XCWFZHPEARLXJI-UHFFFAOYSA-N fomivirsen Chemical compound C1C(N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OC(CO)C1OP(O)(=S)OCC1OC(N(C)C(=O)\N=C(\N)C=C)CC1OP(O)(=S)OCC1OC(N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)CC1OP(O)(=S)OCC1OC(N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)CC1OP(O)(=S)OCC1OC(N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)CC1OP(O)(=S)OCC1OC(N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)CC1OP(O)(=S)OCC1OC(N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)CC1OP(O)(=S)OCC1OC(N2C(N=C(N)C=C2)=O)CC1OP(O)(=S)OCC(C(C1)OP(S)(=O)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)O)OC1N1C=C(C)C(=O)NC1=O XCWFZHPEARLXJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960001447 fomivirsen Drugs 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 180
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 169
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 99
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 96
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 82
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 80
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 78
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 52
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 52
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 40
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 32
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 32
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 description 27
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 26
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 26
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 26
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 26
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 23
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical group C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 19
- 101150006240 AOX2 gene Proteins 0.000 description 17
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 17
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 16
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 16
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 16
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 16
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 16
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 15
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 14
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 14
- -1 OPN1M/LW Proteins 0.000 description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- 102220089984 rs869320785 Human genes 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 101150008289 Aox4 gene Proteins 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 10
- 101000587430 Homo sapiens Serine/arginine-rich splicing factor 2 Proteins 0.000 description 10
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 10
- 102100029666 Serine/arginine-rich splicing factor 2 Human genes 0.000 description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 10
- 102100035673 Centrosomal protein of 290 kDa Human genes 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 102100029143 RNA 3'-terminal phosphate cyclase Human genes 0.000 description 9
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 9
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 9
- 101710198317 Centrosomal protein of 290 kDa Proteins 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 8
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 7
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 7
- 101150039555 ABCA4 gene Proteins 0.000 description 6
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 6
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 6
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 230000037423 splicing regulation Effects 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 102100029362 Cone-rod homeobox protein Human genes 0.000 description 4
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 4
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 4
- 101001120990 Homo sapiens Short-wave-sensitive opsin 1 Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 102100026557 Short-wave-sensitive opsin 1 Human genes 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 102200111939 rs61750158 Human genes 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 3
- 101000710137 Homo sapiens Recoverin Proteins 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 3
- 201000003533 Leber congenital amaurosis Diseases 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N Pyrrolidine Chemical compound C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100034572 Recoverin Human genes 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 2
- 241000649044 Adeno-associated virus 9 Species 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100310637 Arabidopsis thaliana SON1 gene Proteins 0.000 description 2
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 2
- 101710135281 DNA polymerase III PolC-type Proteins 0.000 description 2
- 108020004996 Heterogeneous Nuclear RNA Proteins 0.000 description 2
- 101000652433 Homo sapiens Protein SON Proteins 0.000 description 2
- 101000984042 Homo sapiens Protein lin-28 homolog A Proteins 0.000 description 2
- 208000032578 Inherited retinal disease Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 102100030232 Protein SON Human genes 0.000 description 2
- 102100025460 Protein lin-28 homolog A Human genes 0.000 description 2
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 2
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 2
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 2
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 2
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 208000007400 Relapsing-Remitting Multiple Sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 101100417245 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RPN4 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 2
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- XDZLHTBOHLGGCJ-UHFFFAOYSA-N hexyl 2-cyanoprop-2-enoate Chemical compound CCCCCCOC(=O)C(=C)C#N XDZLHTBOHLGGCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 102220000558 rs281865192 Human genes 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 2
- 125000000008 (C1-C10) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 11-cis-retinal Chemical compound O=C/C=C(\C)/C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 0.000 description 1
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical group NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 208000036443 AIPL1-related retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 description 1
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 1
- 102100034082 Alkaline ceramidase 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710085003 Alpha-tubulin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710085461 Alpha-tubulin N-acetyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 108700031308 Antennapedia Homeodomain Proteins 0.000 description 1
- 208000005229 Autosomal recessive Robinow syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000020941 Benign concentric annular macular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N Carbamic acid Chemical group NC(O)=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102100032025 ETS homologous factor Human genes 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000798828 Homo sapiens Alkaline ceramidase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000715664 Homo sapiens Centrosomal protein of 290 kDa Proteins 0.000 description 1
- 101000921245 Homo sapiens ETS homologous factor Proteins 0.000 description 1
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000713275 Homo sapiens Solute carrier family 22 member 3 Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- 208000035719 Maculopathy Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 229920002730 Poly(butyl cyanoacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010039259 RNA Splicing Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015097 RNA Splicing Factors Human genes 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 1
- 102100040756 Rhodopsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000820 Rhodopsin Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710175714 Tyrosine aminotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010047571 Visual impairment Diseases 0.000 description 1
- QGNJRVVDBSJHIZ-QJZZLBIKSA-N [2H]C([2H])([2H])\C(=C/COC(C)=O)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C Chemical compound [2H]C([2H])([2H])\C(=C/COC(C)=O)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C QGNJRVVDBSJHIZ-QJZZLBIKSA-N 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 229940127024 acid based drug Drugs 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002877 alkyl aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229940077731 carbohydrate nutrients Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 description 1
- 239000010415 colloidal nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 201000006754 cone-rod dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- RTINQKRHLKCKBZ-UHFFFAOYSA-N diaminophosphinic acid;morpholine Chemical compound NP(N)(O)=O.C1COCCN1 RTINQKRHLKCKBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- JJJFUHOGVZWXNQ-UHFFFAOYSA-N enbucrilate Chemical compound CCCCOC(=O)C(=C)C#N JJJFUHOGVZWXNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950010048 enbucrilate Drugs 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010921 in-depth analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007257 malfunction Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- WDWDWGRYHDPSDS-UHFFFAOYSA-N methanimine Chemical compound N=C WDWDWGRYHDPSDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- IDBOAVAEGRJRIZ-UHFFFAOYSA-N methylidenehydrazine Chemical group NN=C IDBOAVAEGRJRIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 231100001224 moderate toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002780 morpholines Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-M phosphinate Chemical compound [O-][PH2]=O ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000608 photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 150000003214 pyranose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001945 resonance Rayleigh scattering spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 210000000964 retinal cone photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000844 retinal pigment epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 101150079354 rho gene Proteins 0.000 description 1
- 102220089983 rs761188244 Human genes 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- JRPHGDYSKGJTKZ-UHFFFAOYSA-N selenophosphoric acid Chemical compound OP(O)([SeH])=O JRPHGDYSKGJTKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-M sulfamate Chemical compound NS([O-])(=O)=O IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical group 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical group 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 125000004001 thioalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- PBKWZFANFUTEPS-CWUSWOHSSA-N transportan Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CN)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 PBKWZFANFUTEPS-CWUSWOHSSA-N 0.000 description 1
- 108010062760 transportan Proteins 0.000 description 1
- 230000014567 type I interferon production Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 208000029257 vision disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Description
Область изобретения
Изобретение относится к области медицины. В частности, оно относится к новым антисмысловым олигонуклеотидам, которые можно использовать для лечения, профилактики и/или замедления болезни
Штаргардта.
Предшествующий изобретению уровень техники
Аутосомно-рецесивные мутации в АВСА4 вызывают болезнь Штаргардта, прогрессирующее нарушение, которое характеризуется потерей центрального зрения и часто приводит к полной слепоте. Типичным признаком болезни Штаргардта является наличие множества желтых пятен (крапинок), распределенных на всем протяжении сетчатки пациентов. Ген АВСА4 состоит из 50 экзонов и кодирует белок, состоящий из 2273 аминокислот. Этот белок экспрессируется во внешних сегментах колбообразных и палочкообразных рецепторных клеток и играет важную роль в удалении побочных продуктов после фотопреобразования.
Помимо STGD1, варианты АВСА4 могут также приводить к другим подтипам заболевания сетчатки в диапазоне от макулопатии в виде бычьего глаза до аутосомно-рецессивной колбочково-палочковой дистрофии (arCRD; Cremers et al., 1998; Maugeri et al., 2000) и панретинальных дистрофий (Cremers et al., 1998; Martinez-Mir et al., 1998; Shroyer et al., 2001; Duncker et al., 2014), в зависимости от тяжести аллелей.
Двухаллельные варианты АВСА4 можно выявить приблизительно в 80% случаев STGD1 (Allikmets et al., 1997; Fujinami et al., 2013; Lewis et al., 1999; Maugeri et al., 1999; Rivera et al., 2000; Schulz et al., 2017; Webster et al., 2001; Zernant et al., 2011; Zernant et al., 2017), и 30% случаев arCRD (Maugeri et al., 2000), после секвенирования кодирующих областей и прилегающих сайтов сплайсинга. В основном, индивидуумы с arCRD или панретинальной дистрофией имеют два тяжелых аллеля АВСА4, в то время как индивидуумы с STGD1 имеют два умеренно тяжелых варианта или сочетание легкого и тяжелого вариантов (Maugeri et al., 1999; van Driel et al., 1998). Было выдвинуто предположение, что большинство утраченных вариантов ABCA4 у пациентов с STGD1 расположены в интронных областях гена, и фактически, за последние несколько лет, несколько групп показали присутствие таких вариантов в глубине интрона (Bauwens et al., 2015; Вах et al., 2015; Braun et al., 2013; Lee et al., 2016; Schulz et al., 2017; Zernant et al., 2014). В 2013, Браун с коллегами (Braun et al., 2013) описали два варианта в интроне 30 (c.4539+2001G>A и с.4539+2028С>Т, далее обозначенные M1 и М2, соответственно), которые предположительно могли влиять на сплайсинг пре-мРНК ABCA4, пока без предоставления экспериментальных данных. До настоящего времени М2 был выявлен в 13 случаях (Bauwens et al., 2015; Вах et al., 2015; Braun et al., 2013; Lee et al., 2016; Schulz et al., 2017; Zernant et al., 2014). M1 был обнаружен в 31 случае и, что интересно, особенно часто встречался в голландской и бельгийской популяциях (Bauwens et al., 2015; Вах et al., 2015; Braun et al., 2013; Lee et al., 2016; Zernant et al., 2014). Кроме того, мы идентифицировали несколько дополнительных мутаций ABCA4 в глубине интрона, которые приводят к вставке псевдоэкзонов, либо за счет активации криптического акцепторного или донорного сайтов сплайсинга, или за счет усиления мотивов ESE, которые расположены внутри псевдоэкзонов. Эти дополнительные мутации включают c.769-784C>T, c.859-540C>G, c.859-506G>C, c.1937 + 435C>G, c.4539+1100A>G, c.4539+1106C>T, c.5197-557G>T.
В настоящее время проводятся несколько клинических испытаний для STGD1, использующих различных терапевтические стратегии (http://www.clinicaltrials.gov): i) генозаместительную терапию за счет доставки полной кДНК ABCA4 (~6,8 т.п.н.) при помощи лентивирусного вектора (NCT01367444 и NCT01736592); ii) субретинальную тренсплантацию клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека (hESC-RПЭ) (NCT02445612 и NCT02941991) и iii) введение C20-D3-ретинилацетата (NCT02402660). Каждый из этих подходов имеет ограничения, и до сих пор не было получено данных об эффективности этих клинических испытаний.
Поскольку значительное количество мутаций в ABCA4 влияет на сплайсинг пре-мРНК ABCA4, они представляют собой привлекательную мишень для регуляции сплайсинга путем терапии на основе антисмысловых олигонуклеотидов (AOH). Таким образом, существует необходимость в разработке АОН для регуляции сплайсинга гена ABCA4, чтобы обеспечить экспрессию функционального белка ABCA4 у индивидуумов, страдающих от болезни Штаргардта.
Сущность изобретения
Изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду для перенаправления сплайсинга, который:
комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SEQ ID NO: 261, или их части;
предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 162, 181, 82, 102, 122, 142 или SEQ ID NO: 262, или их части;
более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 160, 180, 80, 100, 120, 140 или SEQ ID NO: 260, или их части более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинук- 1 043834 леотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 31, или их части;
более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 32, или их части;
более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, 16, 19, 163, 166, 169, 33, 36, 39, 42, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251, 254, 257, 83, 86, 89, 103, 106, 109, 123, 126, 129, 143, 146, 149, 263, 266 и SEQ ID NO: 269, или их части; и более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 17, 20, 164, 167, 170, 34, 37, 40, 43, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 84, 87, 90, 104, 107, 110, 124, 127, 130, 144, 147, 150, 264, и SEQ ID NO: 270, или их части.
Изобретение дополнительно относится к антисмысловому олигонуклеотиду для перенаправления сплайсинга по любому из предшествующих пунктов, где указанный антисмысловой олигонуклеотид содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 18, 21, 165, 168, 171, 35, 38, 41, 44, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259, 85, 88, 91, 105, 108, 111, 125, 128, 131, 145, 148, 151, 265, 268 и SEQ ID NO: 271.
Изобретение дополнительно относится к вирусному вектору, экспрессирующему антисмысловой олигонуклеотид по изобретению для перенаправления сплайсинга, в условиях, которые способствуют экспрессии антисмыслового олигонуклеотида для пропуска экзонов.
Изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, содержащей антисмысловой олигонуклеотид по изобретению для перенаправления сплайсинга или вирусный вектор по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.
Изобретение дополнительно относится к антисмысловому олигонуклеотиду по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектору по изобретению и композиции по изобретению для применения в качестве лекарственного средства.
Изобретение дополнительно относится к антисмысловому олигонуклеотиду по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектору по изобретению и композиции по изобретению для применения для лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4 и требующего модуляции сплайсинга ABCA4.
Изобретение дополнительно относится к применению антисмыслового олигонуклеотида по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектора по изобретению и композиции по изобретению для получения лекарственного средства.
Изобретение дополнительно относится к применению антисмыслового олигонуклеотида по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектора по изобретению и композиции по изобретению для лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4 и требующего модуляции сплайсинга ABCA4.
Изобретение дополнительно относится к способу модуляции сплайсинга ABCA4 в клетке, включающему контакт указанной клетки с антисмысловым олигонуклеотидом по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектором по изобретению и композицией по изобретению.
Изобретение дополнительно относится к способу лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4 и требующего модуляции сплайсинга ABCA4, у нуждающегося в этом индивидуума, при этом указанный способ включает контакт клетки указанного индивидуума с антисмысловым олигонуклеотидом по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектором по изобретению и композицией по изобретению.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 показывает результаты примера А, где восстановление дефектов сплайсинга, вызванных мутацией ABCA4 c.4539+1100A>G и с.4539+1106С>Т, проводили путем доставки АОН в анализе минигенов.
Фиг. 2 показывает результаты примера С, где восстановление при помощи АОН дефектов сплайсинга, вызванных мутацией ABCA4 c.4539+2001G>A, проводили путем доставки АОН к культивируемым клеткам-предшественникам фоторецепторов, полученным от пациента.
Фиг. 3 показывает результаты примера В; восстановление при помощи АОН дефектов сплайсинга, вызванных мутацией ABCA4 c.4539+2001G>A, проводили путем доставки АОН в анализе минигенов.
Фиг. 4А показывает результаты примера С, где идентифицировали дефекты сплайсинга, вызванные мутациями ABCA4 с.4539+2001С>А (M1) и c.4539+2028C>T (М2). Были выявлены полосы с нарушенным сплайсингом, в частности, после обработки (+) циклогексимидом (СНХ). В качестве контроля использовали ОТ-ПЦР для актина (АСТВ). (В) Количественная оценка соотношения правильно и неправильно сплайсированных транскриптов ABCA4 для каждой клеточной линии с СНХ и без СНХ.
Фиг. 5 - характеристика in silico воздействия, вызванного внутриинтронными вариантами M1
- 2 043834 (c.4539+2001G>A) и М2 (с.4539+2028С>Т). Схематически представлены границы псевдоэкзона размером 345 п.н. с расположением M1 и М2, геномные положения сайтов сплайсинга, выявленные события сплайсинга, и предсказания для сайтов сплайсинга и для акцепторных, и для донорных сайтов. Точечная линия показывает сплайсинг от криптического сайта донора сплайсинга в экзоне 30 в положении g.94495074 (GRCh37/hg19) до обычного сайта акцептора сплайсинга в экзоне 31 (r.4467_4539del, р.Cys1490Glufs*12). Предсказанные величины сайтов акцептора и донора сплайсинга в ситуациях контроля и мутации не показали никаких различий. На средних панелях показаны воздействия вариантов, создающих или усиливающих новые мотивы ESE. SSFL: SpliceSiteFinder-like и HSF: Human Splicing Finder.
Фиг. 6А - схематическое изображение псевдоэкзона, указывающее на расположение вариантов, мотивы SC35 с наивысшими оценками и антисмысловые олигонуклеотиды (AOH). (В) - анализ РНК клеток, обработанных AOH. ОТ-ПЦР от экзона 30 до экзона 31 ABCA4 у контроля, M1- (c.4539+2001G>A) иМ2(с. 4539+2028C>T) содержащих клеток-предшественников фоторецепторов (РРС) после доставки AOH. Для нормализации образцов использовали амплификацию мРНК актина (АСТВ). NT-: необработанные и в отсутствие циклогексимида (СНХ); NT+: неообработанные в присутствии СНХ; А1: АОН1; А2: АОН2; A3: AOH3; А4: АОН4; S: SON и MQ: отрицательный контроль для ПЦР. (С) - полуколичественное соотношение правильно и неправильно сплайсированных транскриптов во всех образцах с M1 и М2. (D) процент коррекции каждого АОН по сравнению с NT+, на основании соотношения, наблюдаемого на фиг. 3С. Статистические различия по эффективности АОН для M1 и М2 показаны звездочкой (*: р<0,05 с использованием критерия Манна-Уитни).
Фиг. 7А - профиль экспрессии генов в одной контрольной и M1/M2-полученных индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (iPSC) по сравнению с соответствующими родительскими линиями фибробластов. (В) - профиль экспрессии генов в одной контрольной и М1/М2-полученных клеткахпредшественниках фоторецепторов (РРС) после месяца дифференцировки по сравнению с iPSC. Появление РРС можно установить по увеличению экспрессии CRX. Дифференцировку в фоторецепторподобные клетки показывают путем повышенной экспрессии OPN1SW, OPN1M/LW, RCV1 и ABCA4 по сравнению с геном плюрипотентности ОСТ3/4. Результаты показаны в виде среднего ±SD. Все данные наносили на график относительно экспрессии АСТВ.
Фиг. 8 - анализ с помощью ОТ-ПЦР от экзона 2 до экзона 5 ABCA4 на контрольных (CON), M1 (с. 4539+2001C>A) и М2 (с.4539+2028С>Т) клетках-предшественниках фоторецепторов в отсутствие (-) и в присутствии (+) СНХ. РНК сетчатки взрослого человека использовали в качестве контроля, в то время как MQ представлял собой отрицательный контроль реакции.
На фиг. 9 представлен скрининг 26 последовательностей АОН на их способность исправлять дефекты сплайсинга, вызванные мутацией c.4539+2001G>A. (А) Типичная картина электрофореза ОТ-ПЦР для детеции с 30 по 31 экзоны ABCA4 у РРС, полученных у пациента. Нижняя полоса показывает правильный транскрипт, в то время как верхние полосы представляют транскрипты с нарушениями. Полосы с нарушениями были выявлены после обработки циклогексимидом (СНХ), что указывает на то, что эти транскрипты подвергаются нонсенс-опосредованной деградации (NMD). В клетки были доставлены вместе 26 различных молекул AOH, а также два SON (отрицательные контроли, которые называются SON1 и SON2). Результаты сравнивали с необработанными клетками (NT) в присутствии СНХ (+СНХ). В качестве контроля нагрузки применяли актин. MQ использовали в качестве отрицательного контроля ПЦР.
Представлен процент (В) правильных/исправленных транскриптов и (С) неправильных транскриптов после полуколичественной оценки двух независимых повторов. На основании процента молекулы АОН были классифицированы на эффективные (сплошной серый), умеренно эффективные (точечный рисунок), мало эффективные (рисунок в плоску) и неэффективные (рисунок в крестик). Сплошные, точечные и пунктирные линии указывают на пороги для определения эффективности различных AOH. Белым показаны контроли, указывающие на базовые уровни неправильных транскриптов. Черным показан образец, который не обрабатывали АОН и СНХ.
Фиг. 10 показывает скрининг АОН по семи мутациям в гене ABCA4, которые приводят к включению псевдоэкзона. Мидигены, содержащие геномную область, подвергали мутагенезу для вставки мутации, которая встречается у людей. Затем этими мидигенами трансфицировали клетки HEK293T и через 24 ч доставляли в эти клетки различные AOH. Анализ проводили путем ОТ-ПЦР. Для всех вариантов были разработаны три AOH, а в качестве отрицательного контроля доставляли SON. NT указывал на необработанные и представлял собой трансфицированные клетки без обработки AOH. Линия НЕК представляла собой дополнительный отрицательный контроль, состоящий из нетрансфицированных клеток HEK293T.
Описание последовательностей.
SEQ ID NO.
Название.
1. Геномная ДНК ABCA4.
2. кДНК ABCA4.
- 3 043834
3. Белок ABCA4.
10. Псевдоэкзон 30-31(68) РНК.
11. Псевдоэкзон 30-31(68) РНК; меньшая мишень.
12. Псевдоэкзон 30-31 (68) РНК; меньшая мишень (область АОН + 10).
13. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
14. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
15. AOH-1 для псевдоэкзона 30-31 (68).
16. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
17. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
18. AOH-2 для псевдоэкзона 30-31 (68).
19. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
20. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
21. AOH-3 для псевдоэкзона 30-31 (68).
30. Псевдоэкзон 30-31 (345) РНК.
31. Псевдоэкзон 30-31 (345) РНК; меньшая мишень.
32. Псевдоэкзон 30-31 (345) РНК; меньшая мишень (область АОН + 10).
33. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
34. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
35. AOH-1 для псевдоэкзона 30-31 (345).
36. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
37. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+5 н.)
38. AOH-2 для псевдоэкзона 30-31 (345).
39. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
40. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+5 н.)
41. AOH-3 для псевдоэкзона 30-31 (345).
42. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-4 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
43. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-4 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
44. AOH-4 для псевдоэкзона 30-31 (345).
45. SON-1 для псевдоэкзона 30-31 (345).
смысловая версия SEQ ID NO: 35.
- 4 043834
| 50 pCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31 дикого типа |
| 51 pCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31 C.4539+1100G |
| 52 pCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31 С.4539+1106Т |
| 53 pCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31 С.4539+2001А |
| 54 АВСА4_ех2 Fw |
| 55 АСТВ_ехЗ Fw |
| 56 АВСА4_ех30 Fw |
| 57 АВСА4_ех20/21 Fw |
| 58 CRX Fw |
| 59 LIN28 Fw |
| 60 NANOG Fw |
| 61 OCT4 Fw |
| 62 OPN1M/LW Fw |
| 63 OPN1SW Fw |
| 64 RCV1 Fw |
| 65 S0X2 Fw |
| 66 ABCA4_ex5 Rv |
| 67 ACTB_ex4 Rv |
| 68 ABCA4_ex31 Rv |
| 69 ABCA4_ex21 Rv |
| 70 CRX Rv |
| 71 LIN28 Rv |
| 72 NANOG Rv |
| 73 OCT4 Rv |
| 7 4 OPN1M/LW Rv |
| 75 OPN1SW Rv |
| 76 RCV1 Rv |
| 77 S0X2 Rv |
80. Псевдоэкзон 6-7 (162).
81. Увеличенная мишень псевдоэкзона 6-7 (162)+фланкирующие последовательности (+50 н.).
82. Увеличенная мишень псевдоэкзона 6-7 (162)+фланкирующие последовательности (+20 н.).
83. Сайт-мишень псевдоэкзона 6-7 (162) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
84. Сайт-мишень псевдоэкзона 6-7 (162) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
85. AOH-1 для псевдоэкзона 6-7 (162).
86. Сайт-мишень псевдоэкзона 6-7 (162) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
87. Сайт-мишень псевдоэкзона 6-7 (162) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
88. AOH-2 для псевдоэкзона 6-7 (162).
89. Сайт-мишень псевдоэкзона 6-7 (162) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
90. Сайт-мишень псевдоэкзона 6-7 (162) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
91. AOH-3 для псевдоэкзона 6-7 (162).
100. Псевдоэкзон 7-8 (141).
101. Увеличенная мишень псевдоэкзона 7-8 (141)+фланкирующие последовательности (+50 н.).
102. Увеличенная мишень псевдоэкзона 7-8 (141)+фланкирующие последовательности (+20 н.).
103. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (141) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
104. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (141) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
105. AOH-1 для псевдоэкзона 7-8 (141).
106. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (141) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
107. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (141) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
108. AOH-2 для псевдоэкзона 7-8 (141).
109. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (141) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
110. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (141) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
111. AOH-3 для псевдоэкзона 7-8 (141).
120. Псевдоэкзон 7-8 (56).
121. Увеличенная мишень псевдоэкзона 7-8 (56)+фланкирующие последовательности (+50 н.).
- 5 043834
122. Увеличенная мишень псевдоэкзона 7-8 (56)+фланкирующие последовательности (+20 н.).
123. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (56) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
124. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (56) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
125. AOH-1 для псевдоэкзона 7-8 (56).
126. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (56) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
127. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (56) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
128. AOH-2 для псевдоэкзона 7-8 (56).
129. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (56) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
130. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (56) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
131. AOH-3 для псевдоэкзона 7-8 (56).
140. Псевдоэкзон 13-14 (134).
141. Увеличенная мишень псевдоэкзона 13-14 (134)+фланкирующие последовательности ( + 50 н.).
142. Увеличенная мишень псевдоэкзона 13-14 (134)+фланкирующие последовательности (+20 н.).
143. Сайт-мишень псевдоэкзона 13-14 (134) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
144. Сайт-мишень псевдоэкзона 13-14 (134) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
145. AOH-1 для псевдоэкзона 13-14 (134).
146. Сайт-мишень псевдоэкзона 13-14 (134) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
147. Сайт-мишень псевдоэкзона 13-14 (134) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
148. AOH-2 для псевдоэкзона 13-14 (134).
149. Сайт-мишень псевдоэкзона 13-14 (134) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
150. Сайт-мишень псевдоэкзона 13-14 (134) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
151. AOH-3 для псевдоэкзона 13-14 (134).
160. Псевдоэкзон 30-31 (68).
161. Увеличенная мишень псевдоэкзона 30-31 (68)+фланкирующие последовательности (+50 н.).
162. Увеличенная мишень псевдоэкзона 30-31 (68)+фланкирующие последовательности (+20 н.).
163. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
164. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
165. AOH-1 для псевдоэкзона 30-31 (68).
166. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
167. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
168. AOH-2 для псевдоэкзона 30-31 (68).
169. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+10 н.)
170. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
171. AOH-3 для псевдоэкзона 30-31 (68).
180. Псевдоэкзон 30-31 (345).
181. Увеличенная мишень псевдоэкзона 30-31 (345)+фланкирующие последовательности (+20 н.).
182. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
183. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
184. AOH-1 для псевдоэкзона 30-31 (345).
185. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
186. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
187. AOH-2 для псевдоэкзона 30-31 (345).
188. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
189. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
190. AOH-3 для псевдоэкзона 30-31 (345).
191. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-4 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
- 6 043834
192. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-4 и фланкирующие последовательности (+5
н.).
193. AOH-4 для псевдоэкзона 30-31 (345).
194. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-5 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
195. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-5 и фланкирующие последовательности (+5 н.)
196. AOH-5 для псевдоэкзона 30-31 (345).
197. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-б и фланкирующие последовательности (+10 н.).
198. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-б и фланкирующие последовательности (+5 н.).
199. AOH-6 для псевдоэкзона 30-31 (345).
200. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-7 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
201. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-7 и фланкирующие последовательности (+5 н.)
202. AOH-7 для псевдоэкзона 30-31 (345).
203. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-8 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
204. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-8 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
205. AOH-8 для псевдоэкзона 30-31 (345).
206. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-9 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
207. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-9 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
208. AOH-9 для псевдоэкзона 30-31 (345).
209. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-10 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
210. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-10 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
211. AOH-10 для псевдоэкзона 30-31 (345).
212. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-11 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
213. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-11 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
214. AOH-11 для псевдоэкзона 30-31 (345).
215. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-12 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
216. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-12 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
217. AOH-12 для псевдоэкзона 30-31 (345).
218. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-13 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
219. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-13 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
220. AOH-13 для псевдоэкзона 30-31 (345).
221. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-14 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
222. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-14 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
223. AOH-14 для псевдоэкзона 30-31 (345).
224. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-15 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
225. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-15 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
226. AOH-15 для псевдоэкзона 30-31 (345).
227. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-16 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
228. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-16 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
- 7 043834
229. AOH-16 для псевдоэкзона 30-31 (345).
230. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-17 и фланкирующие последовательности (+10
н.).
231. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-17 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
232. AOH-17 для псевдоэкзона 30-31 (345).
233. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-18 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
234. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-18 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
235. AOH-18 для псевдоэкзона 30-31 (345).
236. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-19 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
237. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-19 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
238. AOH-19 для псевдоэкзона 30-31 (345).
239. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-20 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
240. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-20 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
241 AOH-20 для псевдоэкзона 30-31 (345).
242 Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-21 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
243. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-21 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
244. AOH-21 для псевдоэкзона 30-31 (345).
245. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-22 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
246. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-22 и фланкирующие последовательности (+5 н.)
247. AOH-22 для псевдоэкзона 30-31 (345).
248. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-23 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
249. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-23 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
250. AOH-23 для псевдоэкзона 30-31 (345).
251. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-24 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
252 Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-24 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
253 AOH-24 для псевдоэкзона 30-31 (345).
254 Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-25 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
255. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-25 и фланкирующие последовательности (+5 н.)
256. AOH-25 для псевдоэкзона 30-31 (345).
257. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-26 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
258. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-26 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
259. AOH-26 для псевдоэкзона 30-31 (345).
260. Псевдоэкзон 36-37 (188).
261. Увеличенная мишень псевдоэкзона 36-37 (188)+фланкирующие последовательности (+50 н.).
262. Увеличенная мишень псевдоэкзона 36-37 (188)+фланкирующие последовательности (+20 н.).
263. Сайт-мишень псевдоэкзона 36-37 (188) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
264. Сайт-мишень псевдоэкзона 36-37 (188) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+5 н.).
265. AOH-1 для псевдоэкзона 36-37 (188).
266. Сайт-мишень псевдоэкзона 36-37 (188) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+10 н.).
267. Сайт-мишень псевдоэкзона 36-37 (188) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+5
- 8 043834
н.).
н.).
н.).
268. AOH-2 для псевдоэкзона 36-37 (188).
269. Сайт-мишень псевдоэкзона 36-37 (188) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+10
270. Сайт-мишень псевдоэкзона 36-37 (188) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+5
271. AOH-3 для псевдоэкзона 36-37 (188).
280. SON-1 (c.4539+2001C>A, смысловая версия АОН1 30-31 (345)).
281. SON-2 (c.4539+2001C>A, смысловая версия АОН4 30-31 (345)).
282. SON-3 (c.1937+435C>G, смысловая версия АОН2 13-14 (134)).
290 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6-intron7 дикого типа
291 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6-intron7 С.769-784Т
292 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6-intronl1 дикого типа 293 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6-intronl1 C.859-540G 294 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6-intronl1 С.859-506С 295 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intronll-intronl5 дикого типа 296 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intronll-intronl5 C.1937+435G 297 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron29-intron32 дикого типа 298 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron29-intron32 C.4539+1100G 299 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron29-intron32 C.4539+1106T 300 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron31-intron37 дикого типа 301 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron31-intron37 C.5197-557T 302 RHO_ex3 fw
303 ABCA4_exl rev
304 ABCA4_exl fw
305 ABCA4_ex8 rev
306 ABCA4_exl3 fw
307 ABCA4_exl4 rev
308 ABCA4_ex30 fw
309 ABCA4_ex32 rev
310 ABCA4_ex32 fw
311 ABCA4 ex37 rev
Таблица 1
Характеристики антисмысловых олигонуклеотидов (AOH)
| Название | SEQ ID NO: | Последовательность 5'—>3' | Длина | % GC | Тш (°C) |
| АОН-1 для псевдоэкзона 30-31 (68) | 15/165 | GUAAUCUGUUCUGGACUU | 18 | 39 | 43,5 |
| АОН-2 для псевдоэкзона 30-31 (68) | 18/168 | UAGAACUCCCAGGACAGG | 18 | 56 | 50,3 |
| АОН-3 для псевдоэкзона 30-31 (68) | 21/171 | CUAAAUC С С С CAGGAGAU | 18 | 50 | 48 |
- 9 043834
| АОН-1 для псевдоэкзона 6-7 (162) | 85 | GAUGGAAUCACUGAUCCUAG | 20 | 45 | 49, 7 |
| АОН-2 для псевдоэкзона 6-7 (162) | 88 | AGCUCCAGAGACUGAUGUGA | 20 | 50 | 51,8 |
| АОН-3 для псевдоэкзона 6-7 (162) | 91 | CUCACCACUGCUCCUGC | 17 | 65 | 51,9 |
| АОН-1 для псевдоэкзона 7-8 (141) | 105 | CCCACCAAGAUGGGGAUACU | 20 | 55 | 53, 8 |
| АОН-2 для псевдоэкзона 7-8 (141) | 108 | GGUUCUGUUGUC С САС CAAG | 20 | 55 | 53, 8 |
| АОН-3 для псевдоэкзона 7-8 (141) | 111 | CAAAUCACAGACUGACССCU | 20 | 50 | 51,8 |
| АОН-1 для псевдоэкзона 7-8 (56) | 125 | GACUGAGCAAUACUCCGUC | 19 | 53 | 51,1 |
| АОН-2 для псевдоэкзона 7-8 (56) | 128 | AUCACAGAGUGACCCCUAG | 19 | 53 | 51,1 |
| АОН-3 для псевдоэкзона 7-8 (56) | 131 | CUGAGCAAUACUCCGUCUG | 19 | 53 | 51,1 |
| АОН-1 для псевдоэкзона 13-14 (134) | 145 | CUCСCAGGAACCAGACCUA | 19 | 58 | 53,2 |
| АОН-2 для псевдоэкзона 13-14 (134) | 148 | GCUCAUCCAACACAUUCCUC | 20 | 50 | 51,8 |
| АОН-3 для псевдоэкзона | 151 | CCUGGGAUGGGAGUGUC | 17 | 65 | 51,9 |
- 10 043834
| 13-14 (134) | |||||
| АОН-1 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 35/184 | ACAGGAGUCCUCAGCAUUG | 19 | 53 | 51,1 |
| АОН-2 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 38/187 | UUUUGUCCAGGGACCAAGG | 19 | 53 | 51,1 |
| АОН-3 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 41/190 | CUGUUACAUUUUGUCCAGG | 19 | 42 | 46, 8 |
| АОН-4 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 44/193 | GGGGCACAGAGGACUGAGA | 19 | 63 | 55, 4 |
| АОН-5 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 196 | GAGAGAAAAUAUUGCUUGAG АА | 22 | 32 | 47,4 |
| АОН-6 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 199 | GCAGAUGAGCUGUGAUUCAA | 20 | 45 | 49, 7 |
| АОН-7 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 202 | UAUGAUGCAGCAGAUGAGCU G | 21 | 48 | 52,4 |
| АОН-8 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 205 | UGGGAUCCCUAUGAUGCAGC | 20 | 55 | 53, 8 |
| АОН-9 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 208 | AGAGGACUGAGACAAGUUCC | 20 | 50 | 51,8 |
| АОН-10 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 211 | GCUUCCUCUUGGGGCACAGA | 20 | 60 | 55, 9 |
| АОН-11 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 214 | CCUCAGCAUUGACAGCAA | 18 | 50 | 48 |
| АОН-12 для | 217 | ACAGGAGCCCUCAGCAUUG | 19 | 58 | 53,2 |
- 11 043834
| псевдоэкзона 30-31 (345) АОН-13 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 220 | UGGAGGCAGCCACAGGAG | 18 | 67 | 54, 9 |
| АОН-14 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 223 | GAUGCUGGAGGGUUUUGAGU G | 21 | 52 | 54,4 |
| АОН-15 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 226 | GAUGCUGGAGAGUUUUGAGU G | 21 | 48 | 52,4 |
| АОН-16 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 229 | GCCUUGACGUCCUGAUGCU | 19 | 58 | 53,2 |
| АОН-17 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 232 | GCCAAGAGCUCAGGGUACAG | 20 | 60 | 55, 9 |
| АОН-18 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 235 | CUUGGCCUCCCCUCCCUC | 18 | 72 | 57,2 |
| АОН-19 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 238 | AACACCAUGUAGGUAGGC | 18 | 50 | 48 |
| АОН-20 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 241 | GUUUAGGAAAUGAAACACCA UG | 22 | 36 | 49, 2 |
| АОН-21 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 244 | GACCGCGUGGAAGUAAGG | 18 | 61 | 52, 6 |
| АОН-22 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 247 | AUAAGUUUCUAAGCUGGACA G | 21 | 38 | 48,5 |
| АОН-23 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 250 | GGACCAAGGACCAACACUAC | 20 | 55 | 53, 8 |
| АОН-24 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 253 | GGCUGUUACAUUUUGUCCAG G | 21 | 48 | 52,4 |
| АОН-25 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 256 | GGCAGGAACUGGCUUGCCUU | 20 | 60 | 55, 9 |
| АОН-26 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 259 | AGAAGUGAAAGAAAAUGGCA GG | 22 | 41 | 51,1 |
| АОН-1 для псевдоэкзона 36-37 (188) | 265 | CAGAGUUGGGCACUGUUC | 18 | 56 | 50,3 |
| АОН-2 для псевдоэкзона 36-37 (188) | 268 | GGCUGAUCUGGUGCAGG | 17 | 65 | 51,9 |
| АОН-3 для псевдоэкзона 36-37 (188) | 271 | CUUACAGGAGGCUGAUCUG | 19 | 53 | 51,1 |
| SON-1 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 45/280 | CAAUGCUGAGGACUCCUGU Смысловая версия АОН-1 (SEQ ID NO: 35/184) | 19 | 53 | 51,1 |
| SON-2 для псевдоэкзона 30-31 (345) | 281 | UCUCAGUCCUCUGUGCCCC Смысловая версия АОН-4 (SEQ ID NO: 44/193) | 19 | 63 | 55, 4 |
| SON-3 для псевдоэкзона 13-14 (134) | 282 | GAGGAAUGUGUUGGAUGAGC Смысловая версия АОН-2 (SEQ ID NO: 148) | 20 | 50 | 51,8 |
Некоторые мутации расположены внутри псевдоэкзона (например, когда мутация создает экзонный
- 12 043834 энхансер сплайсинга (ESE), который в свою очередь создает псевдоэкзон, мутация будет частью псевдоэкзона) AOH, сконструированные для перенаправления сплайсинга, будут иметь нарушение комплементарности в сайте мутации относительно последовательности дикого типа. Это касается AOH с SEQ ID
NO: 35/184, 131 и 226 и SON с SEQ ID NO: 45/280; мутация относительно последовательности дикого типа выделена жирным шрифтом и подчеркнута.
Таблица 2
Дополнительная информация по AOH для псевдоэкзона 30-31 (345)
| АОН # | Областьмишень | SF2 | SC35 | SRp40 | SRp55 | Тип области | Другие примеч ания |
| 5 | интрон | 0 | 0 | 1 | 0 | Смешанная | |
| 6 | акцептор | 1 | 1 | 1 | 2 | Смешанная | |
| 7 | акцептор | 1 | 1 | 2 | 2 | Смешанная | |
| 8 | Псевдоэкз он (ПЭ) | 0 | 2 | 2 | 2 | Смешанная | |
| 9 | ПЭ | 0 | 1 | 2 | 0 | Смешанная | Частично перекрывается с АОН4 |
| 4 | ПЭ | 1 | 3 | 3 | 0 | Смешанная | |
| 10 | ПЭ | 2 | 3 | 1 | 0 | Смешанная | Частично перекрывается с АОН4 |
| 11 | ПЭ | 1 | 1 | 1 | 1 | Смешанная | Частично перекрывается с АОН1 |
| 1 | ПЭ | 1 | 1 | 2 | 2 | Смешанная | Специфичный ДЛЯ с. 4539+2001G >А |
| 12 | ПЭ | 1 | 1 | 2 | 1 | Смешанная | Версия дикого типа для АОН1 |
| 13 | ПЭ | 0 | 2 | 2 | 2 | Смешанная | Частично перекрывается с АОН1 |
| 14 | ПЭ | 1 | 1 | 2 | 1 | Закрытая/0т крытая | Версия дикого типа для АОН15 |
| 15 | ПЭ | 1 | 1 | 2 | 1 | Закрытая/От | Специфичный |
- 13 043834
лонка 2 показывает положение относительно ПЭ. Колонки с 3 до 6 показывают число предсказанных мотивов экзонных энхансеров сплайсинга, т.е. SF2, SC35, SRp40 и SRp55, которые перекрываются соответствующими AOH. Колонка 7 показывает конфигурацию РНК в положении AOH, т.е. открытую, закрытую или смешанную конфигурацию.
Подробное описание изобретения.
По определению, AOH по существу являются комплементарными (антисмысловыми) по отношению к мишени, что позволяет им связываться с соответствующей молекулой пре-мРНК, таким образом предотвращая связывание белков, необходимых для сплайсинга. Как правило, такое отсутствие связывания приводит к пропуску целевого экзона, как было показано ранее авторами настоящего изобретения для мутации c.2991+1655A>G в СЕР290 (Collin et al., 2012; Garanto et al., 2016). Кроме того, AOH могут перенаправлять аппарат сплайсинга по направлению к соседним сайтам акцептора или донора сплайсинга. Это привело авторов изобретения к отбору мутаций ABCA4, которые также могут поддаваться терапии путем регуляции сплайсинга на основе AOH. Эти мутации представляют собой варианты глубоко в интронных областях, которые создают новые участки связывания акцептора сплайсинга, донора сплайсинга или экзонного энхансера сплайсинга, и приводят к включению псевдоэкзонов в мРНК соответствующего гена. AOH будут использоваться для блокирования распознавания псевдоэкзона (и следовательно индуцировать его пропуск), таким образом полностью восстанавливая транскрипт дикого типа и функцию соответствующего белка. Были отобраны следующие мутации:
c.769-784C>T. Эта мутация приводит к вставке псевдоэкзона размером 162 н. между экзонами 6 и 7 ABCA4.
c.859-540C>G. Эта мутация приводит к вставке псевдоэкзона размером 141 н. между экзонами 7 и 8 ABCA4.
c.859-506G>C. Эта мутация приводит к вставке псевдоэкзона размером 56 н. между экзонами 7 и 8 ABCA4.
C.1937+435OG. Эта мутация приводит к вставке псевдоэкзона размером 134 н. между экзонами 13 и 14 ABCA4.
c.4539+1100A>G и c.4539+1106C>T. Эти мутации приводят к одинаковой вставке псевдоэкзона размером 68 н. между экзонами 30 и 31 ABCA4 и их можно, таким образом, подвергать воздействию одинаковых AOH.
c.4539+2001G>A и c.4539+2028C>T. Эти мутации приводят к одинаковой вставке псевдоэкзона размером 345 н. между экзонами 30 и 31 ABCA4 и их можно, таким образом, подвергать воздействию одинаковых AOH.
c.5197-557G>T. Эта мутация приводит к вставке псевдоэкзона размером 188 н. между экзонами 36 и 37 ABCA4.
Авторы изобретения предлагают AOH для регуляции сплайсинга для вышеперечисленных классов
- 14 043834 мутаций; термины регуляция сплайсинга и перенаправить сплайсинг используются в настоящем изобретении взаимозаменяемо и включают в себя терапию путем регуляции сплайсинга на основе AOH для вышеперечисленных мутаций.
Таким образом, настоящее изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду для перенаправления сплайсинга, который:
комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SEQ ID NO: 261, или их части;
предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 162, 181, 82, 102, 122, 142 или SEQ ID NO: 262, или их части;
более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 160, 180, 80, 100, 120, 140 или SEQ ID NO: 260, или их части более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 31, или их части;
более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 32, или их части;
более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, 16, 19, 163, 166, 169, 33, 36, 39, 42, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251, 254, 257, 83, 86, 89, 103, 106, 109, 123, 126, 129, 143, 146, 149, 263, 266 и SEQ ID NO: 269, или их части; и более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 17, 20, 164, 167, 170, 34, 37, 40, 43, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 84, 87, 90, 104, 107, 110, 124, 127, 130, 144, 147, 150, 264, 268 и SEQ ID NO: 270, или их части.
В настоящем изобретении упоминается SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 и SEQ ID NO: 261, или их части.
В контексте изобретения:
SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 16, 17, 19, 201, 60, 162, 163, 164, 166, 167, 169 и 170 или их части, каждая является предпочтительной частью SEQ ID NO: 10 и 161;
SEQ ID NO: 181, 180, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251, 254, 257, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255 и 258 или их части, каждая является предпочтительной частью SEQ ID NO: 30;
SEQ ID NO: 82, 80, 83, 86, 89, 84, 87 и 90 или их части, каждая является предпочтительной частью SEQ ID NO: 81;
SEQ ID NO: 102, 100, 103, 106, 109, 104, 107 и 110 или их части, каждая является предпочтительной частью SEQ ID NO: 10;
SEQ ID NO: 122, 120, 123, 126, 129, 124, 127 и 130 или их части, каждая является предпочтительной частью SEQ ID NO: 121;
SEQ ID NO: 142, 140, 143, 146, 149, 144, 147 и 150 или их части, каждая является предпочтительной частью SEQ ID NO: 141;
SEQ ID NO: 262, 260, 263, 266, 269, 264, 267 и 270 или их части, каждая является предпочтительной частью SEQ ID NO: 261.
Термин пропуск экзона в настоящем изобретении определяют как индукцию, выработку или повышенную выработку в клетке зрелой мРНК, не содержащей конкретный экзон, который мог бы присутствовать в зрелой мРНК без пропуска экзона. Пропуск экзона получают путем снабжения клетки, экспрессирующей пре-мРНК указанной зрелой мРНК, молекулой, способной создавать помехи для последовательностей, таких как, например, последовательность (криптического) донора сплайсинга или (криптического) акцептора сплайсинга, необходимая для ферментативного процесса сплайсинга, или молекулой, которая способна создавать помехи для сигнала включения экзона, необходимого для распознавания участка нуклеотидов как экзона, который должен быть включен в зрелую мРНК; такие молекулы в настоящем изобретении обозначают как молекулы для пропуска экзона. Термин пре-мРНК относится к непроцессированному или частично процессированному предшественнику мРНК, который синтезируется путем транскрипции с матрицы ДНК в клетке, а именно, в ядре.
Термин сохранение экзона в настоящем изобретении в настоящем изобретении определяют как индукцию, выработку или повышенную выработку в клетке зрелой мРНК, содержащей конкретный экзон, который должен присутствовать в зрелой мРНК без удаления (неправильного) экзона. Сохранение экзона получают путем снабжения клетки, экспрессирующей пре-мРНК, указанной зрелой мРНК, молекулой АОН, способной создавать помеху последовательностям, таким как, например, альтернативные
- 15 043834 сайты сплайсинга, расположенные до или после обычных сайтов сплайсинга. Термин антисмысловой олигонуклеотид или АОН понимают, как относящийся к олигонуклеотидной молекуле, содержащей нуклеотидную последовательность, которая по существу комплементарна нуклеотидной последовательности-мишени в молекуле пре-мРНК, гяРНК (гетерогенной ядерной РНК) или молекуле мРНК. Степень комплементарности (или комплементарность по существу) антисмысловой последовательности предпочтительно такова, что молекула, содержащая антисмысловую последовательность, может формировать стабильный гибрид с нуклеотидной последовательностью-мишенью в молекуле РНК в физиологических условиях.
Термины антисмысловой олигонуклеотид, АОН и олигонуклеотид в настоящем изобретении используют взаимозаменяемо и понимают, как относящиеся к олигонуклеотиду, содержащему антисмысловую последовательность. Специалист в данной области может с легкостью оценить связывание AOH со своей мишенью при помощи способов, известных в данной области, таких как анализ изменения подвижности геля, описанный в EP1619249. Термин по существу комплементарный при использовании в контексте изобретения указывает, что допускаются некоторые нарушения комплементарности в антисмысловой последовательности при условии сохранения функциональности, т.е. индуцирования пропуска экзона или сохранения экзона. Предпочтительно, комплементарность составляет от 90 до 100%. В основном допускается 1 или 2 нарушения комплементарности в AOH из 20 нуклеотидов или 1, 2, 3 или 4 нарушения комплементарности в AOH из 40 нуклеотидов, или 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нарушения комплементарности в AOH из 60 нуклеотидов, и т.д. Необязательно, указанный AOH можно дополнительно тестировать путем трансфекции клеток сетчатки пациентов. Пропуск экзона или сохранение экзона можно оценивать путем ОТ-ПЦР (такой, например, как описанная в EP 1619249). Комплементарные области предпочтительно сконструированы таким образом, что в сочетании они являются специфичными для экзона пре-мРНК. Такую специфичность можно создать при помощи различных длин комплементарных областей, поскольку она зависит от фактических последовательностей в других молекулах (пре-)мРНК в системе. Риск того, что AOH будет также способен гибридизироваться с одной или несколькими другими молекулами пре-мРНК снижается с увеличением размера AOH. Очевидно, что AOH, содержащие нарушения комплементарности в области комплементарности, но сохраняющие способность гибридизироваться и/или связываться с целевой областью/областями в пре-мРНК, можно использовать в изобретении. Однако, предпочтительно, по меньшей мере, комплементарные части не содержат такие нарушения комплементарности, поскольку AOH без нарушений комплементарности комплементарной части, как правило, имеют более высокую эффективность и более высокую специфичность, чем AOH с такими нарушениями комплементарности в одной или нескольких областях комплементарности. Считается, что более высокие силы гибридизации (т.е. увеличение числа взаимодействий с противоположной цепью) благоприятны для повышения эффективности вмешательства в аппарат сплайсинга системы.
АОН по изобретению предпочтительно не содержит участка CpG, более предпочтительно, не содержит никаких CpG. Присутствие CpG или фрагмента CpG в олигонуклеотиде, как правило, связано с повышенной иммуногенностью указанного олигонуклеотида (Dorn и KipnSnberger, 2008). Повышенная иммуногенность нежелательна, поскольку она может вызвать повреждение ткани, которую лечат, т.е. глаза. Иммуногенность можно оценивать на модели на животных путем оценки присутствия клеток CD4+ и/или CD8+ и/или воспалительной инфильтрации мононуклеарами. Иммуногенность можно также оценивать в крови животного или человека, которого лечат AOH по изобретению, выявляя присутствие нейтрализующего антитела и/или антитела, распознающего указанный AOH, при помощи стандартного иммунологического анализа, известного специалисту. Воспалительную реакцию, выработку интерферона типа I, выработку IL-12 и/или повышение иммуногенности можно оценивать, выявляя наличие или повышенное количество нейтрализующего антитела или антитела, распознающего указанный AOH, при помощи стандартного иммунологического анализа. AOH по изобретению еще более предпочтительно имеет приемлемую кинетику связывания с РНК и/или термодинамические свойства. Кинетика связывания с РНК и/или термодинамические свойства, по меньшей мере, частично определяются температурой плавления олигонуклеотида (Tm; рассчитывается при помощи калькулятора свойств олигонуклеотида (www.unc.edu/-cail/biotool/oligo/index) для одноцепочечной РНК с использованием базовой Tm и модели ближайшего соседа), и/или свободной энергией комплекса AOH-целевой экзон (при помощи RNA structure, версии 4.5). Если Tm слишком высокая, ожидается, что AOH будет менее специфичным. Приемлемая Tm и свободная энергия зависят от последовательности AOH. Таким образом, сложно получить предпочтительные диапазоны для каждого из этих параметров. Приемлемая Tm может находиться в диапазоне между 35 и 7 0°С, а приемлемая свободная энергия может находиться в диапазоне между 15 и 45 кКал/моль. Специалист, таким образом, может сначала выбрать AOH в качестве потенциального терапевтического соединения, который связывается и/или комплементарен SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SEQ ID NO: 261, или их частям, как определено далее в настоящем изобретении. Специалист может проверить, что указанный AOH способен связываться с указанными последовательностями, как ранее определено в настоящем изобретении. Необязательно на втором этапе, он может использовать изобретение для дополнительной оптимизации указанного AOH, проверяя его на отсутствие CpG и/или оптимизируя его Tm и/или свободную энергию комплекса AOH-мишень. Он может пытаться сконструи
- 16 043834 ровать AOH с несколькими CpG, предпочтительно, с отсутствием CpG и/или с более приемлемой Tm и/или свободной энергией, получая его путем выбора определенной последовательности ABCA4 (включая SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 и SEQ ID NO: 261, или их части), которой комплементарен AOH. Альтернативно, если AOH комплементарен указанному фрагменту в пределах SEQ ID NO: 10 или 30, содержит CpG, и/или не имеет приемлемой Tm и/или свободной энергии, специалист может улучшить любые из этих параметров, уменьшая длину AOH, и/или выбирая определенный фрагмент в SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SEQ ID NO: 261, которому комплементарен AOH, и/или изменяя химию AOH.
Считается, что AOH по изобретению индуцирует пропуск экзона, если процент пропуска при измерении количественной ОТ-ПЦР в реальном времени составляет, по меньшей мере, 30, или, по меньшей мере, 35, или, по меньшей мере, 40, или, по меньшей мере, 45, или, по меньшей мере, 50, или, по меньшей мере, 55, или, по меньшей мере, 60, или, по меньшей мере, 65, или, по меньшей мере, 70, или, по меньшей мере, 75, или, по меньшей мере, 80, или, по меньшей мере, 85, или, по меньшей мере, 90, или, по меньшей мере, 95, или 100%.
Считается, что AOH по изобретению индуцирует сохранение экзона, если процент сохранения при измерении количественной ОТ-ПЦР в реальном времени составляет, по меньшей мере, 30, или, по меньшей мере, 35, или, по меньшей мере, 40, или, по меньшей мере, 45, или, по меньшей мере, 50, или, по меньшей мере, 55, или, по меньшей мере, 60, или, по меньшей мере, 65, или, по меньшей мере, 70, или, по меньшей мере, 75, или, по меньшей мере, 80, или, по меньшей мере, 85, или, по меньшей мере, 90, или, по меньшей мере, 95, или 100%.
Предпочтительно, AOH по изобретению, содержащий часть, которая (по существу) комплементарна SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SeQ ID NO: 261, или их части, представляет собой AOH, где (по существу) комплементарная часть составляет, по меньшей мере, 50 длины AOH по изобретению, более предпочтительно, по меньшей мере, 60, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 70, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 80, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90 или даже более предпочтительно, по меньшей мере, 95, или даже более предпочтительно 98 или даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99, или даже более предпочтительно 100%.
Предпочтительно, AOH по изобретению содержит или включает последовательность, которая комплементарна или по существу комплементарна части SEQ ID NO: 10 или 30. В качестве примера, AOH может содержать последовательность, которая комплементарна или по существу комплементарна части SEQ ID NO: 10 или 30 и содержит дополнительные фланкирующие последовательности.
Предпочтительно, AOH по изобретению представляет собой AOH, где часть, которая (по существу) комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 30, или их части, содержит, по меньшей мере, один мотив ESE (экзонный энхансер сплайсинга), предпочтительно два, три, четыре или более мотивов ESE. Мотивы ESE известны специалисту в данной области. Выявление и определение ESE предпочтительно проводят так же, как и в примерах в настоящем изобретении. В варианте осуществления, AOH по изобретению не содержит мотив ESE.
Предпочтительно, AOH по изобретению представляет собой AOH, где часть, которая (по существу) комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SEQ ID NO: 261, или их части, имеет длину приблизительно от 8 до приблизительно 40 нуклеотидов, а именно, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотида.
Предпочтительно, AOH по изобретению представляет собой AOH, где часть, которая (по существу) комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SEQ ID NO: 261, или их части, имеет длину от 8 до 40, а именно, предпочтительно от 10 до 40, более предпочтительно от 14 до 30, более предпочтительно от 16 до 24 нуклеотидов, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотида.
Предпочтительно, AOH по изобретению представляет собой AOH, где часть, которая (по существу) комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SEQ ID NO: 261, или их части, имеет длину, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, или 40 нуклеотидов, и указанная часть, которая (по существу) комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SeQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SEQ ID NO: 261, или их части, или их части, имеет длину не более 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, или 40 нуклеотидов.
Дополнительные последовательности (по существу) комплементарной части можно использовать для модификации связывания белка, такого как фактор, способствующий сплайсингу, с AOH, или для модификации термодинамического свойства AOH, а именно, для модификации аффинности связывания с целевой РНК.
Предпочтительный AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга имеет длину приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более
- 17 043834 предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до 24 нуклеотидов, такую как 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов.
Более предпочтительный AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга имеет длину от 8 до 100, предпочтительно от 10 до 40, более предпочтительно от 14 до 30, более предпочтительно от 16 до нуклеотидов, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов.
Предпочтительно, AOH по изобретению имеет длину, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов.
Предпочтительно, AOH по изобретению имеет длину не более чем 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,
18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,
48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,
78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 нуклеотидов.
В варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 18, 21, 165, 168, 171, 35, 38, 41, 44, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259, 85, 88, 91, 105, 108, 111, 125, 128, 131, 145, 148, 151, 265, 268 и SEQ ID NO: 271.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 15, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 18, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 21, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 35. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 35, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 38. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 38, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24 нуклеотидов, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,
- 18 043834
38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,
68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,
98, 99 или 100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 41, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 44. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 44, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 165. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 165, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 168. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 168, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 171. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 171, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 184. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 184, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
- 19 043834
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 187. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 187, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 190. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 190, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 193. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 193, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 196. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 196, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 199. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 199, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, или 100 нуклеотиды.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 202. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 202, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает
- 20 043834 последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 205. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 205, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 208. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 208, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 211 Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 211, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 214. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 214, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 217. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 217, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, или 100 нуклеотиды.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 220. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 220, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 223. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 223, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100,
- 21 043834 предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 226. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 226, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 229. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 229, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 232. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 232, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 235. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 235, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, или 100 нуклеотиды.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 238. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 238, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 241. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 241, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а
- 22 043834 именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 244. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 244, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 247. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 247, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 250. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 250, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100 нуклеотидов, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40 нуклеотидов, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24 нуклеотидов, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,
26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55,
56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,
86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 253. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 253, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 256. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 256, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 259. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 259, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
- 23 043834
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 85. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 85, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 88. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 88, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 91. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 91, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 105. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 105, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 108. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 108, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 111. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 111, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
- 24 043834
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 125. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 125, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 128. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 128, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, или 100 нуклеотиды.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 131. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 131, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 145. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 145, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 148. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 148, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 151. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 151, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает
- 25 043834 последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 265. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 265, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 268. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 268, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 271. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 271, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или
100 нуклеотидов.
АОН по изобретению для перенаправления сплайсинга может содержать один или несколько остатков РНК (рибонуклеотида), или один или несколько остатков ДНК (дезоксирибонуклеотида), и/или один или несколько аналогов или эквивалентов нуклеотида, как будет подробно описано далее в настоящем изобретении.
Предпочтительно, чтобы АОН по изобретению для перенаправления сплайсинга содержал один или несколько остатков, которые модифицированы для того чтобы повысить устойчивость к нуклеазам, и/или чтобы увеличить аффинность антисмыслового олигонуклеотида к целевой последовательности. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления AOH содержит, по меньшей мере, один нуклеотидный аналог или эквивалент, где нуклеотидный аналог или эквивалент определяют как остаток с модифицированным основанием, и/или модифицированным остовом, и/или с неприродной межнуклеозидной связью, или с комбинацией этих модификаций.
В предпочтительном варианте осуществления нуклеотидный аналог или эквивалент содержит модифицированный остов. Примеры таких остовов представлены морфолиновыми остовами, карбаматными остовами, силоксановыми остовами, сульфидными, сульфоксидными и сульфоновыми остовами, формаацетиловыми и тиоформацетиловыми остовами, метиленформацетиловыми остовами, рибоацетиловыми остовами, алкен-содержащими остовами, сульфаматными, сульфонатными и сульфонамидными остовами, метилениминовыми и метиленгидразиновыми остовами, и амидными остовами.
Фосфородиамидатморфолиновые олигомеры представляют собой олигонуклеотиды с модифицированным остовом, которые ранее были исследованы как антисмысловые агенты.
Морфолиновые олигонуклеотиды имеют незаряженный остов, в котором дезоксирибозный сахар ДНК замещен шестичленным кольцом, а фосфодиэфирная связь замещена фосфороамидатной связью. Морфолиновые олигонуклеотиды устойчивы к ферментативному разрушению и, по-видимому, функционируют как антисмысловые агенты путем ареста трансляции или препятствуя сплайсингу пре-мРНК, а не путем активации РНКазы Н. Морфолиновые олигонуклеотиды успешно доставляли в тканевую культуру клеток при помощи способов, которые физически разрушают клеточную мембрану, и одно исследование, в котором сравнивали эти способы, выявило, что введение при соскабливании является наиболее эффективным способом доставки; однако, поскольку морфолиновый остов не заряжен, катионные липиды не являются эффективными медиаторами захвата морфолиновых олигонуклеотидов в клетки. Недавняя статья показала формирование триплекса морфолиновым олигонуклеотидом, и, из-за неионного остова, эти исследования показали, что морфолиновый олигонуклеотид был способен формировать триплекс в отсутствие магния.
Еще более предпочтительно, чтобы связь между остатками остова не включала атом фосфора, а именно, связь, которая образована межнуклеозидными связями короткоцепочечного алкила или цикло- 26 043834 алкила, межнуклеозидными связями смешанного гетероатома и алкила или циклоалкила, или межнуклеозидными связями одного или нескольких короткоцепочечных гетероатомов или гетероциклов.
Предпочтительный нуклеотидный аналог или эквивалент содержит пептид-нуклеиновую кислоту (ПНК), с модифицированным полиамидным остовом (Nielsen et al., 1991). Молекулы на основе ПНК являются истинными миметиками молекул ДНК в отношении распознавания по парам оснований. Остов ПНК состоит из единиц №(2-аминоэтил)-глицина, связанных пептидными связями, где нуклеиновые основания связаны с остовом метиленкарбонильными связями. Альтернативный остов содержит одноуглеродный протяженный пирролидиновый мономер ПНК (Govindaraju и Kumar, 2005). Поскольку остов молекулы ПНК не содержит заряженных фосфатных групп, гибриды ПНК-РНК, как правило, более стабильны, чем гибриды РНК-РНК или РНК-ДНК, соответственно (Egholm et al., 1993). Еще более предпочтительный остов содержит морфолиновый нуклеотидный аналог или эквивалент, в котором сахар рибозы или дезоксирибозы замещен шестичленным морфолиновым кольцом. Наиболее предпочтительный нуклеотидный аналог или эквивалент содержит фосфороамидатморфолиновый олигомер (РМО), в котором сахар рибозы или дезоксирибозы замещен шестичленным морфолиновым кольцом, а анионная фосфодиэфирная связь между соседними морфолиновыми кольцами замещена неионной фосфороамидатной связью.
Еще в одном дополнительном варианте осуществления нуклеотидный аналог или эквивалент по изобретению содержит замену одного не-мостиковых кислородов в фосфодиэфирной связи. Такая модификация слегка дестабилизирует спаривание, но добавляет дополнительную устойчивость к разрушению нуклеазами. Предпочтительный нуклеотидный аналог или эквивалент содержит тиофосфат, хиральный тиофосфат, фосфородитиоат, фосфотриэфир, аминоалкилфосфотриэфир, Н-фосфонат, метил и другой алкилфосфонат, включая 3'-алкилен фосфонат, 5'-алкилен фосфонат и хиральный фосфонат, фосфинат, фосфорамидат, включая 3'-амино фосфорамидат и аминоалкилфосфорамидат, тионофосфорамидат, тионоалкилфосфонат, тионоалкилфосфотриэфир, селенофосфат или боранофосфат.
Еще более предпочтительный нуклеотидный аналог или эквивалент по изобретению содержит один или несколько сахарных групп, которые являются моно- или дизамещенными по 2', 3' и/или 5' положению, такие как -ОН; -F; замещенный или незамещенный, линейный или разветвленный низший (С1-С10) алкил, алкенил, алкинил, алкарил, аллил, или аралкил, которые могут прерываться одним или несколькими гетероатомами; O-, S-, или N-алкил; O-, S-, или N-алкенил; O-, S-или N-алкинил; O-, S-, или Nаллил; O-алкил-O-алкил, -метокси, -аминопропокси; метоксиэтокси; диметиламинооксиэтокси; и диметиламиноэтоксиэтокси. Сахарная группа может быть пиранозой или ее производным, или дезоксипиранозой или ее производным, предпочтительно рибозой или ее производным, или дезоксирибозой или ее производным. Предпочтительно производное сахарной группы содержит замкнутую нуклеиновую кислоту (ЗНК), в которой 2'-атом углерода связан с 3'- или 4'-атомом углерода сахарного кольца, таким образом, формируя бициклическую сахарную группу. Предпочтительная ЗНК содержит 2'-О, 4'-Сэтилен-мостиковую нуклеиновую кислоту (Morita et al., 2 001). Эти замены придают нуклеотидному аналогу или эквиваленту устойчивость к РНКазе Н и нуклеазам и повышают аффинность к РНК-мишени.
В другом варианте осуществления нуклеотидный аналог или эквивалент по изобретению содержит одну или несколько модификаций или замен оснований. Модифицированные основания включают синтетические и природные основания, такие как инозин, ксантин, гипоксантин и другие аза-, деаза-, гидрокси, -гало, -тио, тиол, -алкил, -алкенил, -алкинил, тиоалкил производные пиримидиновых и пуриновых оснований, которые известны или будут известны в данной области.
Специалисту следует понимать, что необязательно все положения в AOH должны быть модифицированы единообразно. Кроме того, в один AOH можно вводить более чем один вышеуказанный аналог или эквивалент или даже в одно положение в AOH. В определенных вариантах осуществления AOH по изобретению имеет, по меньшей мере, два различных типа аналогов или эквивалентов.
Таким образом, предпочтительный AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга содержит а 2'-О алкилтиофосфатный антисмысловой олигонуклеотид, такой как 2'-О-метил модифицированная рибоза (РНК), 2'-О-этил модифицированная рибоза, 2'-О-пропил модифицированная рибоза, и/или замещенные производные этих модификаций, такие как галогенированные производные.
Специалисту следует также понимать, что для эффективной терапии можно комбинировать различные AOH по изобретению. В варианте осуществления, применяют комбинацию, по меньшей мере, из двух AOH по изобретению, а именно, двух различных AOH по изобретению, трех различных AOH по изобретению, четырех различных AOH по изобретению, или пяти AOH по изобретению.
АОН по изобретению для перенаправления сплайсинга может быть связан с группой, которая усиливает захват антисмыслового олигонуклеотида в клетки, предпочтительно клетки сетчатки. Примеры таких групп представляют собой холестерины, углеводы, витамины, биотин, липиды, фосфолипиды, пептиды, проникающие в клетки, включая в качестве неограничивающих примеров антеннапедию, ТАТ, транспортан и положительно заряженные аминокислоты, такие как олигоаргинин, полиаргинин, олиголизин или полилизин, антигенсвязывающие домены, представленные антителом, Fab-фрагментом антитела, или одноцепочечным антигенсвязывающим доменом, таким как верблюжий однодоменный антигенсвязывающий домен.
- 27 043834
АОН по изобретению для перенаправления сплайсинга можно вводить непрямым образом при помощи подходящих способов, известных в данной области. Его можно, например, вводить индивидууму или в клетку, ткань или орган указанного индивидуума как таковые, в виде так называемого голого
AOH. Его также можно вводить в форме экспрессирующего вектора, где экспрессирующий вектор кодирует транскрипт РНК, содержащий последовательность указанного АОН по изобретению.
Экспрессирующий вектор предпочтительно вводят в клетку, ткань, орган или индивидууму при помощи носителя для доставки генов. В предпочтительном варианте осуществления предлагается экспрессирующий вектор на основе вируса, содержащий экспрессирующую кассету или транскрипционную кассету, которая управляет экспрессией или транскрипцией AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга. Таким образом, изобретение относится к вирусному вектору, экспрессирующему антисмысловой олигонуклеотид по изобретению для перенаправления сплайсинга, который помещен в условия, способствующие экспрессии антисмыслового олигонуклеотида для перенаправления сплайсинга. Клетку можно обеспечивать AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга путем экспрессии антисмыслового олигонуклеотида на основе плазмиды или вирусной экспрессии, которая обеспечивается векторами на основе аденовируса или аденоассоциированного вируса. Экспрессия может управляться промотором РНК-полимеразы II (Pol II), таким как РНК-промотор U7 или промотор РНК-полимеразы III (Pol III), такой как РНК-промотор U6. Предпочтительным носителем для доставки является вирусный вектор, такой как вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), или ретровирусный вектор, такой как лентивирусный вектор и т.п. Также для доставки AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга можно соответствующим образом применять плазмиды, искусственные хромосомы, плазмиды, используемые для направленной гомологичной рекомбинации и интеграции в геном человека в клетках. Предпочтительными для изобретения являются такие векторы, где транскрипция управляется промоторами PolIII, и/или где транскрипты находятся в форме слияний с транскриптами U1 или U7, которые дают хорошие результаты для доставки небольших транскриптом. Они известны специалистам в данной области для разработки подходящих транскриптов. Предпочтительными являются транскрипты под управлением PolIII, предпочтительно, в форме слитого транскрипта с транскриптом U1 или U7. Такие слияния можно получать, как описано ранее (Gorman et al., 1998).
Предпочтительная экспрессирующая система для AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV). Были разработаны одноцепочечные и двухцепочечные векторы на основе AAV, которые можно использовать для длительной экспрессии антисмысловых нуклеотидных последовательностей для высокоэффективного перенаправления сплайсинга. Предпочтительный вектор на основе AAV, например, содержит экспрессирующую кассету, которой управляет промотор РНК-полимеразы III (Pol III) или промотор РНК-полимеразы II (Pol II). Предпочтительным РНК-промотором является, например, РНК-промотор U6 Pol III или РНКпромотор U7 Pol II U7.
Изобретение, таким образом, относится к вектору на основе вируса, содержащему промотор Pol II или Pol III, управляющий экспрессирующей кассетой для экспрессии AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга.
Вектор на основе AAV по изобретению представляет собой рекомбинантный вектор на основе AAV и относится к вектору на основе AAV, содержащему часть генома AAV с кодируемым AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, инкапсидированному в белковую оболочку из белка капсида, полученного из серотипа AAV, как описано в другом месте в настоящем изобретении. Часть генома AAV может содержать инвертированные концевые повторы (ITR), полученные из серотипа аденоассоциированного вируса, такого как AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9 и другие. Белковая облочка, состоящая из белка капсида, может быть получена из серотипа AAV, такого как AAV1, 2, 3, 4, 5, 8, 9 и другие. Белковую оболочку можно также называть капсидной белковой оболочкой. У вектора на основе AAV может быть удален один ген или предпочтительно все гены AAV дикого типа, но он может все еще содержать функциональные ITR-последовательности нуклеиновой кислоты. Функциональные ITRпоследовательности необходимы для репликации, спасения и упаковки вирионов AAV. ITRпоследовательности могут быть последовательностями дикого типа или могут иметь, по меньшей мере, 80, 85, 90, 95 или 100% идентичности последовательности с последовательностями дикого типа или могут быть изменены, например, путем вставки, мутации, делеции или замены нуклеотидов, при условии, что они остаются функциональными. В этом контексте, функциональность относится к способности непосредственно упаковывать геном в капсидную оболочку, а затем обеспечивать экспрессию в инфицированной клетке-хозяине или клетке-мишени. В контексте по изобретению капсидная белковая оболочка может быть из иного серотипа, чем геномные ITR вектора на основе AAV. Вектор на основе AAV в соответствии с настоящим изобретением может, таким образом, состоять из капсидной белковой оболочки, т.е. капсида в виде икосаэдра, который содержит белки капсида (VP1, VP2, и/или VP3) одного из серотипов AAV, например, серотипа 2 AAV, в то время как ITR-последовательности, содержащиеся в этом векторе на основе AAV5, могут быть из любого вышеописанного серотипа AAV, включая вектор на основе AAV2. Вектор на основе AAV2, таким образом, содержит капсидную белковую оболочку серотипа 2 AAV, в то время как, например, вектор на основе AAV5 содержит капсидную белковую оболочку серо- 28 043834 типа 5 AAV, посредством чего любой из них может инкапсидировать любую геномную ITR вектора на основе AAV.
Предпочтительно, рекомбинантный вектор на основе AAV по изобретению содержит капсидную белковую оболочку серотипа 2, 5, 8 AAV или серотипа 9 AAV, где геном или ITR AAV, присутствующие в указанном векторе на основе AAV, получены из серотипа 2, 5, 8 AAV или серотипа 9 AAV; такой вектор на основе AAV обозначают как вектор AAV2/2, AAV 2/5, AAV2/8, AAV2/9, AAV5/2, AAV5/5, AAV5/8, AAV 5/9, AAV8/2, AAV 8/5, AAV8/8, AAV8/9, AAV9/2, AAV9/5, AAV9/8, или AAV9/9.
Более предпочтительно, рекомбинантный вектор на основе AAV по изобретению содержит капсидную белковую оболочку серотипа 2 AAV и геном или ITR AAV, присутствующие в указанном векторе на основе AAV, получены из серотипа 5 AAV; такой вектор обозначают как вектор AAV 2/5.
Более предпочтительно, рекомбинантный вектор на основе AAV по изобретению содержит капсидную белковую оболочку серотипа 2 AAV и геном или ITR AAV, присутствующие в указанном векторе на основе AAV, получены из серотипа 8 AAV; такой вектор обозначают как вектор AAV 2/8.
Более предпочтительно, рекомбинантный вектор на основе AAV по изобретению содержит капсидную белковую оболочку серотипа 2 AAV и геном или ITR AAV, присутствующие в указанном векторе на основе AAV, получены из серотипа 9 AAV; такой вектор обозначают как вектор AAV 2/9.
Более предпочтительно, рекомбинантный вектор на основе AAV по изобретению содержит капсидную белковую оболочку серотипа 2 AAV и геном или ITR AAV, присутствующие в указанном векторе на основе AAV, получены из серотипа 2 AAV; такой вектор обозначают как вектор AAV 2/2.
Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, представленная предпочтительной последовательностью нуклеиновой кислоты, предпочтительно вставлена между геномом или ITR-последовательностями AAV, такой как последовательности, указанные выше, например, экспрессирующая конструкция, содержащая регуляторный элемент экспрессии, функционально связанный с кодирующей последовательностью и 3'-терминирующей последовательностью.
Хелперные функции AAV, в основном, относится к соответствующим функциям AAV, необходимым для репликации и упаковки AAV, которые предоставлены в векторе на основе AAV in trans. Хелперные функции AAV дополняют функции AAV, которые утрачены в векторе на основе AAV, но у них отсутствуют ITR AAV (которые предоставлены геномом вектора на основе AAV). Хелперные функции AAV включают две главные ORF (открытые рамки считывания) AAV, а именно, кодирующую область rep и кодирующую область cap или по существу функционально идентичные им последовательности.
Области Rep и Сар хорошо известны в данной области, см., например, (Chiorini et al., 1999) или US 5139941, включенные в настоящее изобретение в качестве ссылки. Хелперные функции AAV могут быть предоставлены в хелперной конструкции AAV, которая может быть плазмидой. Введение хелперной конструкции в клетку-хозяина может происходить, например, путем трансформации, трансфекции или трансдукции до или одновременно с введением генома AAV, присутствующего в векторе на основе AAV, как указано в настоящем изобретении. Хелперные конструкции AAV по изобретению можно выбирать таким образом, что они производят желаемую комбинацию серотипов для капсидной белковой оболочки вектора на основе AAV с одной стороны и для репликации и упаковки генома AAV, присутствующего в указанном векторе на основе AAV, с другой стороны.
Вирус-помощник AAV обеспечивает дополнительные функции, необходимые для репликации и упаковки AAV. Подходящие вирусы-помощники AAV включают аденовирусы, вирусы простого герпеса (такие как HSV типов 1 и 2) и вирусы осповакцины. Дополнительные функции, обеспечиваемые вирусом-помощником, можно также вводить в клетку-хозяина посредством векторов, как описано в US 6531456, включенном в настоящее изобретение в качестве ссылки.
Предпочтительно, геном AAV, который присутствует в рекомбинантном векторе на основе AAV по изобретению, не содержит никаких нуклеотидных последовательностей, кодирующих вирусные белки, такие как гены rep (репликация) или cap (capsid) AAV. Геном AAV может дополнительно содержать маркер или репортерный ген, такой как ген, например, кодирующий ген устойчивости к антибиотику, флуоресцентный белок (например, gfp) или ген, кодирующий химически, ферментативно или иным способом выявляемый и/или селектируемый продукт (например, lacZ, aph и т.д.), известный в данной области.
Предпочтительно, вектор на основе AAV по изобретению конструируют и производят в соответствии со способом, согласно Garanto et al., 2016, который включен в настоящее изобретение в качестве ссылки.
Предпочтительный вектор на основе AAV по изобретению представляет собой вектор на основе AAV, предпочтительно вектор AAV2/5, AAV2/8, AAV2/9 или AAV2/2, экспрессирующий AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, при этом AOH содержит или предпочтительно включает последовательность, которая:
комплементарна или по существу комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SEQ ID NO: 261, или их части;
предпочтительно комплементарна или по существу комплементарна полинуклеотиду с нуклеотид- 29 043834 ной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 162, 181, 82, 102, 122, 142 или SEQ ID NO: 262, или их части;
более предпочтительно комплементарна или по существу комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 160, 180, 80, 100, 120, 140 или SEQ ID NO: 260, или их части более предпочтительно комплементарна или по существу комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 31, или их части;
более предпочтительно комплементарна или по существу комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 32, или их части;
более предпочтительно комплементарна или по существу комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, 16, 19, 163, 166, 169, 33, 36, 39, 42, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251, 254, 257, 83, 86, 89, 103, 106, 109, 123, 126, 129, 143, 146, 149, 263, 266 и SEQ ID NO: 269, или их части; и более предпочтительно комплементарна или по существу комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 17, 20, 164, 167, 170, 34, 37, 40, 43, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 84, 87, 90, 104, 107, 110, 124, 127, 130, 144, 147, 150, 264, 268 и SEQ ID NO: 270, или их части.
Еще более предпочтительный вектор на основе AAV по изобретению представляет собой вектор на основе AAV, предпочтительно вектор AAV2/5, AAV2/8, AAV2/9 или AAV2/2, экспрессирующий молекулу для пропуска экзона или молекулу по изобретению для сохранения экзона 12, которая экспрессирует AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, который содержит, или предпочтительно включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 18, 21, 165, 168, 171, 35, 38, 41, 44, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259, 85, 88, 91, 105, 108, 111, 125, 128, 131, 145, 148, 151, 265, 268 и SEQ ID NO: 271.
Ожидается улучшение способов обеспечения индивидуума или клетки, ткани, органа указанного индивидуума AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, учитывая прогресс, который уже был достигнут к настощему времени. Такие будущие улучшения, конечно, могут быть включены для достижения упомянутого эффекта реструктурирования мРНК при помощи способа по изобретению. AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга можно доставлять в виде голого AOH индивидууму, клетке, ткани или органу указанного индивидуума. При введении AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, предпочтительно, чтобы молекула растворялась в растворе, который совместим со способом доставки. Клетки сетчатки можно снабжать плазмидой для экспрессии антисмыслового олигонуклеотида, доставляя плазмиду в водном растворе.
Альтернативно, предпочтительным способом доставки для AOH для перенаправления сплайсинга или плазмиды для экспрессии такого AOH является вирусный вектор или наночастицы. Предпочтительно, вирусные векторы или наночастицы доставляют в сетчатку или в другие соответствующие клетки. Такая доставка в клетки сетчатки или в другие соответствующие клетки может происходить in vivo, in vitro или ex vivo; см. например, Garanto et al., 2016, который включен в настоящее изобретение в качестве ссылки.
Альтернативно, плазмиду можно доставлять путем трансфекции при помощи известных агентов для транфекции. Для внутривенного, подкожного, внутримышечного, интратекального и/или внутрижелудочкового введения предпочтительно, чтобы раствор представлял собой физиологический солевой раствор. Особенно предпочтительным в изобретении является применение эксципиентов или агентов для транфекции, которые будут помогать доставке каждого из компонентов, определенных в настоящем изобретении, к клетке и/или в клетку, предпочтительно клетку сетчатки. Предпочтительными являются эксципиенты или агенты для транфекции, способные формировать комплексы, наночастицы, мицеллы, везикулы и/или липосомы, которые доставляют каждый компонент, определенный в настоящем изобретении, в составе комплекса или захваченный в везикулу или липосому, через мембрану клетки. Множество таких эксципиентов известно в данной области. Подходящие эксципиенты или агенты для транфекции включают полиэтиленимин (ПЭ1; ExGen500 (MBI Fermentas)), Липофектамин™ 2000 (Invitrogen) или их производные, или аналогичные катионные полимеры, в том числе полипропиленимин или сополимеры полиэтиленимина (ПЭС) и производные, синтетические амфифилы (SAINT-18), липофектин™, DOTAP и/или белки вирусного капсида, которые способны к самосборке в частицы, которые могут доставить каждый компонент, определенный в настоящем изобретении, к клетке, предпочтительно, клетке сетчатки. Было показано, что такие эксципиенты эффективно доставляют олигонуклеотид, такой как AOH, к широкому спектру культивируемых клеток, включая клетки сетчатки. Их высокий трансфекционный потенциал сочетается с токсичностью от исключительно низкой до умеренной в отношении общей выживаемости клеток. Можно использовать легкость структурной модификации, чтобы проводить даль- 30 043834 нейшие модификации и анализ их дополнительных (in vivo) характеристик переноса нуклеиновых кислот и токсичности.
Липофектин представляет собой пример агента для липосомальной трансфекции. Он состоит из двух липидных компонентов, катионного липида N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N, N,Nтриметилхлорид аммония (DOTMA) (ср. DOTAP, который представляет собой метилсульфатную соль) и нейтрального липида липид диолеоилфосфатидилэтаноламина (DОПЭ). Нейтральный компонент опосредует внутриклеточное высвобождение. Другая группа систем доставки представляет собой полимерные наночастицы.
Поликатионы, такие как диэтиламиноэтиламиноэтил (DEAE)-декстран, которые хорошо известны как реагенты для трансфекции ДНК, можно комбинировать с бутилцианоакрилатом (РВСА) и гексилцианоакрилатом (РНСА) для формирования катионных наночастиц, которые могут доставлять каждый из компонентов, определенных в настоящем изобретении, предпочтительно AOH по изобретению, через клеточную мембрану в клетки.
В дополнение к этим распространенным материалам наночастиц, катионный пептид протамин предлагает альтернативный подход для формирования состава олигонуклеотида с коллоидами. Эта система коллоидных наночастиц может формировать так называемые прочастицы, которые можно получать путем простого процесса самосборки, для упаковки и внутриклеточного высвобождения олигонуклеотида. Специалист может выбрать и адаптировать любые из вышеуказанных или другие коммерчески доступные альтернативные эксципиенты и системы доставки для упаковки и доставки молекулы для пропуска экзонов для применения в настоящем изобретении для ее доставки для профилактики, лечения или замедления заболевания или состояния, связанного с ABCA4. Профилактику, лечение или замедление заболевания или состояния, связанного с ABCA4 в настоящем изобретении предпочтительно определяют как предотвращение, остановку, прекращение прогрессирования, или обращение вспять частичного или полного нарушения зрения или слепоты, которая вызвана генетическим дефектом в гене ABCA4.
Кроме того, AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга может быть ковалентно или нековалентно связан с нацеливающим лигандом, разработанным специально для облегчения захвата в клетку, цитоплазму и/или ядро. Такой лиганд мог бы включать (i) соединение (включая в качестве неограничивающих примеров пептид(-подобные) структуры), распознающее специфические элементы клетки, ткани или органа, облегчающие клеточный захват и/или (ii) химическое соединение, способное облегчить захват в клетки и/или внутриклеточное высвобождение олигонуклеотида из везикул, например, эндосом или лизосом.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга формулируют в состав, или лекарственное средство, или композицию, которая обеспечивает, по меньшей мере, эксципиент и/или нацеливающий лиганд для доставки и/или средство его доставки к клетке и/или улучшение его внутриклеточной доставки.
Следует понимать, что если композиция содержит дополнительный компонент, такой как вспомогательное соединение, как далее определено в настоящем изобретении, каждый компонент композиции может не быть надлежащим образом сформулирован в одной единственной комбинации, или композиции, или препарате. В зависимости от их индивидуальности и характерных особенностей, специалист будет знать, какой тип состава является наиболее подходящим для каждого компонента, определенного в настоящем изобретении. В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к композиции или препарату, который находится в форме набора частей, содержащих AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, а также дополнительное вспомогательное соединение, как далее определено в настоящем изобретении.
Если необходимо и/или при желании, AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга или вектор, предпочтительно вирусный вектор по изобретению, экспрессирующий AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, можно вводить в фармацевтически активную смесь путем добавления фармацевтически приемлемого носителя.
Таким образом, изобретение также относится к композиции, предпочтительно, фармацевтической композиции, содержащей AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, или вирусный вектор по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент. Такая композиция может содержать один AOH для перенаправления сплайсинга или вирусный вектор по изобретению, но может также содержать несколько различных AOH для перенаправления сплайсинга или вирусных векторов по изобретению. Такая фармацевтическая композиция может содержать любой фармацевтически приемлемый эксципиент, включая носитель, наполнитель, консервант, адъювант, растворитель и/или разбавитель. Такой фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель, консервант, адъювант, растворитель и/или разбавитель можно найти, например в Remington, 2000. Каждая отличительная черта указанной композиции была ранее определена в настоящем изобретении.
Предпочтительным путем введения является инъекция в стекловидное тело водного раствора или специально адаптированного состава для внутриглазного введения. ЕР2425 814 описывает эмульсию масло в воде, специально адаптированную для внутриглазного (интравитреального) введения лекарственных средств на основе пептида или нуклеиновой кислоты. Эта эмульсия менее плотная, чем жидкость
- 31 043834 стекловидного тела, так что эмульсия плавает наверху стекловидного тела, что позволяет избежать того, что введенное лекарственное средство нарушит зрение.
Если используют несколько AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, концентрация или доза, определенные в настоящем изобретении, могут относиться к общей концентрации или дозе всех использованных олигонуклеотидов или к концентрации или дозе каждой использованной или добавленной молекуле для пропуска экзонов. Таким образом, в варианте осуществления, предлагается композиция, где количество каждого или общее количество использованных AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга дозируют в количестве в диапазоне от 0,01 и до 20, предпочтительно от 0,05 и до 20 мг/кг на глаз. Предлагается подходящая интравитреальная доза и она составляет от 0,05 мг и до 5 мг, предпочтительно в пределах от 0,1 до 1 мг на глаз, а именно, приблизительно на глаз: 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 мг.
Предпочтительный AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга предназначен для лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4, у индивидуума. Во всех вариантах осуществления изобретения, термин лечение понимают как предотвращение или замедление заболевания или состояния, связанного с ABCA4. Индивидуум, которого можно бы было лечить при помощи AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, уже был диагностирован как имеющий заболевание или состояние, связанное с ABCA4.
Альтернативно, индивидуум, которого можно бы было лечить при помощи AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, еще не был диагностирован как имеющий заболевание или состояние, связанное с ABCA4, но он может быть индивидуумом с повышенным риском развития заболевания или состояния, связанного с ABCA4, в будущем с учетом его или ее генотипа. Предпочтительный индивидуум является человеком. Во всех вариантах осуществления изобретения, заболевание или состояние, связанное с ABCA4, предпочтительно является болезнью Штаргардта.
Таким образом, изобретение дополнительно относится к AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, или вирусному вектору по изобретению, или (фармацевтической) композиции по изобретению для применения в качестве лекарственного средства, предпочтительно в качестве лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4, требующего регуляции сплайсинга ABCA4, и для применения в качестве лекарственного средства для профилактики, лечения или замедления заболевания или состояния, связанного с ABCA4. Каждый признак всех вариантов осуществления медицинского применения в данном изобретении был ранее определен в данном изобретении и предпочтительно является таким признаком, как определено ранее в данном изобретении.
Изобретение дополнительно относится к способу лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4, требующего регуляции сплайсинга ABCA4, указанный способ, включает контакт клетки указанного индивидуума с AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектором по изобретению или (фармацевтической) композицией по изобретению. Каждый признак всех вариантов осуществления медицинского применения в данном изобретении был ранее определен в данном изобретении и предпочтительно является таким признаком, как определено ранее в данном изобретении.
Изобретение дополнительно относится к применению AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектора по изобретению или (фармацевтической) композиции по изобретению для получения лекарственного средства. Каждый признак всех вариантов осуществления медицинского применения в данном изобретении был ранее определен в данном изобретении и предпочтительно является таким признаком, как определено ранее в данном изобретении.
Изобретение дополнительно относится к применению AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектора по изобретению или (фармацевтической) композиции по изобретению для получения лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4, требующего регуляции сплайсинга ABCA4. Каждый признак всех вариантов осуществления медицинского применения в данном изобретении был ранее определен в данном изобретении и предпочтительно является таким признаком, как определено ранее в данном изобретении.
Изобретение дополнительно относится к применению AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектора по изобретению или (фармацевтической) композиции по изобретению для лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4, требующего регуляции сплайсинга ABCA4. Каждый признак всех вариантов осуществления медицинского применения в данном изобретении был ранее определен в данном изобретении и предпочтительно является таким признаком, как определено ранее в данном изобретении.
Лечение при применении или при способе по изобретению проводят предпочтительно, по меньшей мере, однократно, и предпочтительно оно длится, по меньшей мере, одну неделю, один месяц, несколько месяцев, один год, 2, 3, 4, 5, 6 лет или дольше, а именно, всю жизнь. Каждый AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга или его эквивалент, как определено в настоящем изобретении, для применения по изобретению может быть подходящим для прямого введения in vivo в клетку, ткань и/или орган индивидуумов, уже заболевших или с риском развития заболевания или состояния, связанного с ABCA4, и его можно вводить in vivo, ex vivo или in vitro. Частота введения AOH, композиции, соединения или вспомогательного соединения по изобретению может зависеть от нескольких параметров, таких как тя- 32 043834 жесть заболевания, возраст пациента, мутация пациента, количество AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга (т.е. доза), состав AOH, композиции, соединения или вспомогательного соединения по изобретению, путь введения и т.д. Частота введения может варьировать в пределах ежедневной, еженедельной, по меньшей мере, раз в две недели, или три недели, или четыре недели, или пять недель или в течение более долгого периода времени.
Диапазон доз АОН, композиции, соединения или вспомогательного соединения по изобретению предпочтительно разрабатывают на основании исследований с повышающимися дозами в клинических испытаниях (применение in vivo), для которых существуют строгие требования протокола. AOH по изобретению можно использовать в дозе, которая находится в диапазоне от 0,01 до 20, предпочтительно, от 0,05 до 20 мг/кг. Подходящая интравитреальная доза будет находиться между 0,05 и 5 мг, предпочтительно, между 0,1 и 1 мг на глаз, а именно, приблизительно на глаз: 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 мг.
В предпочтительном варианте осуществления используют концентрацию олигонуклеотида, определенного в настоящем изобретении, которая находится в диапазоне от 0,1 до 1 мкМ. Предпочтительно, этот диапазон предназначен для применения in vitro на клеточной модели, такой как клетки сетчатки или ткань сетчатки. Более предпочтительно, применяемая концентрация находится в диапазоне от 1 до 400, даже более предпочтительно, от 10 до 200, даже более предпочтительно, от 50 до 100 нМ. Если применяют несколько различных AOH, эта концентрация или доза может относиться к общей концентрации или дозе AOH или к концентрации или дозе каждого из добавленных AOH.
В предпочтительном варианте осуществления вирусный вектор, предпочтительно, вектор на основе AAV, описанный ранее в настоящем изобретении, в качестве носителя для доставки молекулы по изобретению, вводят в дозе в диапазоне от 1х109-1х1017 вирусных частиц на инъекцию, более предпочтительно, от 1х1010-1х1012вирусных частиц на инъекцию.
Диапазоны концентрации или дозы AOH, показанные выше, представляют собой предпочтительные концентрации или дозы для применений in vivo, in vitro или ex vivo. Специалисту будет понятно, что в зависимости от использованных AOH, клетки-мишени, которую обрабатывают, гена-мишени и его уровней экспрессии, использованной среды и условий транфекции и инкубации, концентрация или доза использованных AOH может дополнительно варьировать и потребовать дальнейшей оптимизации.
АОН по изобретению для перенаправления сплайсинга, или вирусный вектор по изобретению, или композицию по изобретению для применения по изобретению можно вводить in vivo в клетку, ткань и/или орган индивидуумов, уже заболевших или с риском развития заболевания или состояния, связанного с ABCA4, и можно вводить in vivo, ex vivo или in vitro. AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, или вирусный вектор по изобретению, или композицию по изобретению можно вводить in vivo напрямую или опосредованно в клетку, ткань и/или орган индивидуума, уже заболевшего или с риском развития заболевания или состояния, связанного с ABCA4, и можно вводить напрямую или опосредованно in vivo, ex vivo или in vitro. Поскольку болезнь Штаргардта имеет ярко выраженный фенотип в клетках сетчатки, предпочтительно, чтобы указанные клетки-мишени представляли собой клетки сетчатки, еще более предпочтительно, что указанная ткань представляет собой сетчатку, и еще более предпочтительно, что указанный орган содержит или включает в себя глаз.
Изобретение дополнительно относится к способу модуляции сплайсинга ABCA4 в клетке, включающему контакт клетки, предпочтительно, клетки сетчатки, с AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, или вирусным вектором по изобретению, или (фармацевтической) композицией по изобретению. Отличительные признаки этого аспекта предпочтительно являются признаками, ранее определенными в настоящем изобретении. Контакт клетки с AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, или вирусным вектором по изобретению, или композицией по изобретению можно проводить любым способом, известным специалисту в данной области. Включено применение способов для доставки AOH для перенаправления сплайсинга, вирусных векторов и композиций, как описано ранее в настоящем изобретении. Контакт может быть прямым или опосредованным и может быть in vivo, ex vivo или in vitro.
Если не указано иначе, каждый вариант осуществления, описанный в настоящем изобретении, можно комбинировать с другим вариантом осуществления, описанным в настоящем изобретении.
Определения.
В этом изобретении и в его формуле изобретения глагол содержать и его спряжения в его неограничивающем смысле означают, что элементы, следующие за словом, включены, но элементы, конкретно не упомянутые, не исключены. Кроме того, ссылка на элемент неопределенным артиклем a или an не исключает возможности присутствия более чем одного элемента, если контекст явно не требует наличия одного и только одного из элементов. Неопределенный артикль а или an, таким образом, как правило, означает по меньшей мере один.
Слово приблизительный или приблизительно при использовании в сочетании с числовым значением (например, приблизительно 10) предпочтительно означает, что значением может быть заданное значение (из 10) на 5% больше или меньше от значения.
- 33 043834
Информация о последовательностях, представленная в данном изобретении, не должна толковаться так узко, чтобы требовать включения ошибочно идентифицированного основания. Специалист способен выявить такие ошибочно идентифицированные основания и знает, как исправить такие ошибки. В случае ошибок последовательности преимущество будет иметь последовательность полипептида, которую можно получить путем экспрессии гена, присутствующего в SEQ ID NO: 1, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид.
Все патентные и литературные ссылки, процитированные в настоящем описании, таким образом, включены в качестве ссылки в полном объеме.
Варианты осуществления изобретения.
1. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга, который:
комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 30, или их части;
предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 31, или их части;
более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 32, или их части;
более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 42, или их части; и более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 43, или их части.
2. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с вариантом осуществления 1, где часть, которая комплементарна или по существу комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 30, или их части, имеет длину приблизительно от 8 до приблизительно 40, предпочтительно, приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно, приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно, приблизительно от 16 до приблизительно 24 нуклеотидов, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов.
3. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, который имеет длину приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно, приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно, приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно, приблизительно от 16 до приблизительно 24 нуклеотидов, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов.
4. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанный антисмысловой олигонуклеотид содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 44.
5. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, содержащий, по меньшей мере, один рибонуклеотид.
6. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, содержащий, по меньшей мере, один мотив ESE (экзонного энхансера сплайсинга).
7. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, содержащий 2'-О алкилтиофосфатный антисмысловой олигонуклеотид, такой как 2'-O-метил модифицированная рибоза (РНК), 2'-О-этил модифицированная рибоза, 2'-О-пропил модифицированная рибоза, и/или замещенные производные этих модификаций, такие как галогенированные производные.
8. Вирусный вектор, экспрессирующий антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, в условиях, способствующих экспрессии антисмыслового олигонуклеотида для пропуска экзона.
9. Фармацевтическая композиция, содержащая антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-7, или вирусный вектор в соответствии с вариантом осуществления 7 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
10. Фармацевтическая композиция в соответствии с вариантом осуществления 9, где фармацевтическая композиция предназначена для интравитреального введения и вводится в дозе от 0,05 до 5 мг для общего количества антисмысловых олигонуклеотидов для перенаправления сплайсинга на глаз.
11. Фармацевтическая композиция в соответствии с вариантом осуществления 10, где фармацевтическая композиция предназначена для интравитреального введения и вводится в дозе от 0,1 до 1 мг для общего количества антисмысловых олигонуклеотидов для перенаправления сплайсинга на глаз, а именно, приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 мг общего количества антисмысловых олигонуклеотидов для перенаправления сплайсинга на глаз.
- 34 043834
12. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-7, вектор в соответствии с вариантом осуществления 8 или композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 9-11 для применения в качестве лекарственного средства.
13. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-7, вектор в соответствии с вариантом осуществления 9 или композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 9-11 для применения для лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4, требующего регуляции сплайсинга ABCA4.
14. Применение антисмыслового олигонуклеотида для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-7, вектор в соответствии с вариантом осуществления 8 или композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 9-11 для получения лекарственного средства.
15. Применение антисмыслового олигонуклеотида для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1 -6, вектор в соответствии с вариантом осуществления 7 или композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 8-10 для получения лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4, требующего регуляции сплайсинга ABCA4.
16. Применение антисмыслового олигонуклеотида для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1 -7, вектор в соответствии с вариантом осуществления 7 или композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 9-11 для лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4, требующего регуляции сплайсинга ABCA4.
17. Способ регуляции сплайсинга ABCA4 в клетке, указанный способ включает контакт указанной клетки с антисмысловым олигонуклеотидом для перенаправления сплайсинга, определенным в любом из вариантов осуществления 1-7, вектором в соответствии с вариантом осуществления 7 или композицией в соответствии с любым из вариантов осуществления 9-11.
18. Способ лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4, требующего регуляции сплайсинга ABCA4, у нуждающегося в этом индивидуума, указанный способ включает контакт клетки указанного с антисмысловым олигонуклеотидом для перенаправления сплайсинга, определенным в любом из вариантов осуществления 1-7, вектором в соответствии с вариантом осуществления 7 или композицией в соответствии с любым из вариантов осуществления 9-11.
19. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга для применения в соответствии с вариантом осуществления 12 или 13, применение в соответствии с вариантом осуществления 15 или 16 или способ в соответствии с вариантом осуществления 18, где заболевание или состояние, связанное с ABCA4, представляет собой болезнь Штаргардта.
Примеры
Сначала мы оценивали in vitro эффективность ряда AOH по перенаправлению дефектов сплайсинга, вызванных мутациями c.4539+1100A>G, с.4539+1106С>Т и c.4539+2001C>A в ABCA4, на клетках эмбриональной почки человека (HEK293T). Для этого мы использовали конструкции минигенов, т.е. плазмиды, которые несут последовательность части гена ABCA4, как правило, интересующую область с наличием или отсутствием мутации, фланкированную с каждой стороны, по меньшей мере, 500 п.н. последовательности ABCA4 дикого типа. Плазмида также содержит последовательности экзонов и границы экзон-интрон экзонов 3 и 5 гена RHO на каждой стороне последовательности ABCA4, соответственно. Таким образом, можно легко измерить воздействие варианта ABCA4 на сплайсинг соответствующего экзона или псевдоэкзонов. Затем, мы использовали более крупные конструкции (называемые мидигенами) для оценки характера других вариантов глубоко в интроне, которые были обнаружены, в том числе с.769-784С>Т, c.859-540C>G, c.859-506G>C, c.1937+435C>G, c.4539+1100A>G, c.4539+1106C>T и c.5197-557G>T. Получение этих мидигенов описано в Sangermano et al. (2018) Наконец, в дополнение к анализу минигенов, мы также использовали клетки-предшественники фоторецепторов (РРС) от пациента с комбинацией мутаций ABCA4, а именно мутации c.4539+2001G>A вместе с с.4892Т>С (р.Leu1631Pro) на другом аллеле, для оценки потенциала AOH по избеганию дефектов сплайсинга. Также для оценки потенциала AOH по избеганию дефектов сплайсинга использовали РРС от пациента с комплексным аллелем, содержащим с.302+68>>Т и с.4539+2028С>Т (М2), и делецией с.6148698_6670delinsTGTGCACCTCCCTAG на другом аллеле (Lee et al., 2016). Сначала в разделе Материалы и способы описаны детали эксперимента, в то время как результаты описаны и проиллюстрированы далее в разделе Результаты.
Материалы и способы.
А. Мутации: c.4539+1100A>G & с.4539+1106С>Т - минигены.
Получение минигена для каждой мутации.
Был создан миниген, включающий часть интрона 29, полностью экзон 30, интрон 30 и экзон 31, и часть интрона 31. Эту геномную область клонировали в вектор pCI-Neo-Rhodopsin при помощи Gateway System. Полученный вектор (называемый pCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31 дикого типа, SEQ ID NO: 50) использовали для введения мутаций c.4539+1100A>G и с.4539+1106С>Т путем сайт-специфического мута- 35 043834 генеза (новый вектор назвали pCI-Neo-Rho-ABCA4-c.4539+1100G, SEQ ID NO: 51 и pCI-Neo-RhoABCA4-c.4539+1106T, SEQ ID NO: 52). Контрольный и мутированный векторы подтверждали секвенированием по Сэнгеру. Минигенами затем трансфицировали клетки HEK293T, которые собирали через 48 ч после трансфекции и проводили анализ ОТ-ПЦР для того чтобы выявить дефект сплайсинга.
Конструирование и тестирование АОН.
Анализ РНК клеток HEK293T, трансфицированных минигенами, показал дефект сплайсинга премРНК, который заключается во вставке псевдоэкзона. Были сконструированы несколько AOH с использованием последовательности этого псевдоэкзона. Затем, AOH трансфицировали HEK293T совместно с минигенами. Для подтверждения эффективности AOH, проводили анализ ОТ-ПЦР на клетках. Эффективность каждого из AOH оценивали, доставляя одинаковые количества минигена и различные концентрации AOH и проводя после этого анализ ОТ-ПЦР.
Анализ ОТ-ПЦР.
Выделяли тотальную РНК с использованием набора NucleoSpin RNA Clean-up (каталожный № 740955-50; Macherey-Nagel, Duren, Germany) no протоколу производителя. Определяли количество РНК и синтезировали кДНК из 1 мкг РНК с использованием набора iScript cDNA synthesis (каталожный №, 1708891; Bio-Rad, Hercules, CA) по инструкциям производителя. Наконец, оценивали эффективность AOH, проводя ПЦР от экзона 30 до экзона 31 или ПЦР, покрывающую область от экзона 29 до 34.
В. Мутация: c.4539+2001C>A - миниген.
Получение минигена.
Был создан миниген, включающий часть интрона 29, полностью экзон 30, интрон 30 и экзон 31, и часть интрона 31. Эту геномную область клонировали в вектор pCI-Neo-Rhodopsin при помощи Gateway System. Полученный вектор (называемый pCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31 дикого типа, SEQ ID NO: 50) использовали для введения мутации c.4539+2001G>A мутация путем сайт-специфического мутагенеза (новый вектор назвали pCI-Neo-Rho-ABCA4-c.4539+2001A, SEQ ID NO: 53). Контрольный и мутированный векторы подтверждали секвенированием по Сэнгеру. Минигенами затем трансфицировали клетки HEK293T, которые собирали через 48 ч после трансфекции и проводили анализ ОТ-ПЦР для того чтобы выявить дефект сплайсинга.
Конструирование и тестирование АОН.
Трансфекция минигеном pCI-Neo-Rho-ABCA4-c.4539+2001A клеток HEK293T показала вставку псевдоэкзона. Были сконструированы несколько AOH с использованием последовательности этого псевдоэкзона. AOH доставляли в клетки HEK293T вместе с минигеном. Проводили анализ РНК трансфицированных клеток.
Анализ РНК.
Выделяли тотальную РНК с использованием набора NucleoSpin RNA Clean-up (каталожный № 740955-50; Macherey-Nagel, Duren, Germany) по протоколу производителя. Определяли количество РНК и синтезировали кДНК из 1 мкг РНК с использованием набора iScript cDNA synthesis (каталожный №, 1708891; Bio-Rad, Hercules, CA) по инструкциям производителя. Наконец, оценивали эффективность AOH, проводя ПЦР от экзона 30 до экзона 31 или ПЦР, покрывающую область от экзона 29 до 34.
С. Мутации: c.4539+2001C>A и c.4539+2028C>T - оценка РРС.
Получение клеток-предшественников фоторецепторов (РРС).
Получали биопсию кожи пациента с гетерозиготной мутацией c.4539+2001G>A (M1) и пациента с гетерозиготной мутацией c.4539+2028C>T (М2), и получали клеточные линии фибробластов. Затем, перепрограммировали индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), как описано ранее (Sangermano et al. 2016), и дифференцировали в клетки-предшественники фоторецепторов (РРС) с использованием способа, адаптированного Sangermano et al. (2016) или Flamier et al. (2016). Проводили анализ ОТ-ПЦР на дифференцированных клетках.
Анализ транскрипта ABCA4.
Через тридцать суток дифференцировки, собирали контрольные и полученные от пациентов РРС. Проводили анализ путем ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с использованием праймеров, расположенных в экзоне 2 (прямой) и экзоне 5 (обратный) или экзоне 30 (прямой) и экзоне 31 (прямой) гена ABCA4. В качестве контроля использовали праймеры актина (АСТВ). Последовательности праймеров представлены в SEQ ID NO: 54-77. Все реакционные смеси (50 мкл) содержали 10 мкМ каждой пары праймеров, Taq ДНК-полимеразу, 1 Ед/мкл (каталожный номер 11647679001, Roche, Basel, Switzerland), 10χ буфер для ПЦР без MgCl2, 25 мМ MgCl2, 10 мМ dNTPs, и 50 нг кДНК. Условия ПЦР представляли собой первый этап денатурации при 94°С в течение 5 мин с последующими 35 циклами с этапами плавления (94°С в течение 30 с), отжига (58°С в течение 30 с), и удлинения (72°С в течение 1 мин), с финальным этапом элонгации при 72°С в течение 5 мин. Продукты ПЦР разделяли на 1 мас./об.% агарозном геле и полученные полосы вырезали и очищали с помощью набора NucleoSpin®Gel&PCR cleanup (каталожный номер 740609,250, Macherey-Nagel) по протоколу производителя. Наконец, 100 нг очищенного продукта ПЦР анализировали путем секвенирования по Сэнгеру на анализаторе ДНК 3100 или 3730 (Thermo Fisher Scientific).
- 36 043834
Конструирование антисмыслового олигонуклеотида (AOH).
Последовательность ПЭ плюс 50 пар оснований, фланкирующих обе стороны, анализировали, как описано ранее (Aartsma-Rus et al., 2012). В кратком изложении, в целом структуру РНК интерсующей области анализировали при помощи программы mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/PHKFolding-Form, последний доступ 23-07-2017), для того чтобы выявить частично открытые и закрытые области. Мотивы энхансера сплайсинга определяли при помощи ESE finder 3.0 (http://krainer01.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi?process=home, последний доступ 23-07-2017). Особое внимание уделяли областям SC35, поскольку было показано, что существует положительная корреляция между присутствием таких мотивов и эффективностью AOH (Aartsma-Rus et al., 2012). Сначала, этот анализ привел к разработке четырех AOH, двух, которые перекрывали мотив SC35 с наивысшей оценкой (АОН2 и AOH3), одному на 5'-конце ПЭ (АОН4) и одному, который перекрывался с мутацией c.4539+2001G>A (AOH1). На последующем этапе, были разработаны 22 дополнительных AOH, для поиска корреляций между эффективностью AOH и их положением относительно псевдоэкзона, их перекрытием с определенными мотивами ESE, и их специфичностью (т.е. могут ли нарушения комплементарности единичных нуклеотидов аннулировать их эффективность).
Окончательные последовательности AOH также оценивали по свободной энергии молекулы отдельно, возможности образования димеров, и их взаимодействие с интересующей областью. Для этого, применяли инструмент для вторичной структуры РНК (http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb, последний доступ 23-07-2017), используя инструменты для вторичной структуры РНК и предсказания двойного складывания. Мы убедились, что все AOH имели значение свободной энергии выше -4 по отдельности, выше -14 в виде димера и между 21 и 28 для AOH-область связывания. Рассчитывали с использованием расчетной энергии интересующей области минус энергия AOH, связавшегося с областью. Все последовательности AOH имели длину 19 нуклеотидов с Tm выше 46°С и содержанием GC между 40% и 65%. Последовательности и свойства AOH перечислены в табл. 1; дополнительные свойства AOH для псевдоэкзона 30-31 (345) перечислены в табл. 2. AOH были химически модифицированы добавлением тиофосфатного остова и 2-O-метильной модификации сахара 2OMe/PS к каждому нуклеотиду, и их приобретали у Eurogentec (Liege, Belgium). AOH растворяли в PBS 1х (дважды автоклавированном) до конечной концентрации 100 мкМ. Были заказаны два смысловых олигонуклеотида (SON-1 [SEQ ID NO: 280] и SON-2 [SEQ ID NO: 281]) с такой же химией для использования в качестве отрицательного контроля.
Обработка АОН.
После дифференцировки, РРС обрабатывали AOH (0,5 и 1 мкМ), смешивая голые AOH непосредственно со средой для культивирования. Через 24 ч, добавляли циклогексимид (СНХ, каталожный номер С4859, Sigma Aldrich) в конечной концентрации 0,1 мг/мл и инкубировали клетки еще 24 ч. Через 48 ч после доставки AOH клетки собирали, промывали PBS и выделяли РНК. Синтез кДНК проводили с использованием 1 мкг РНК, как описано выше. Все реакции разбавляли до 20 нг/мкл, добавляя 30 мкл дистиллированной воды. Для анализа ОТ-ПЦР, использовали 80 нг кДНК для всех реакций с ABCA4, и 40 нг для анализа с АСТВ. Все реакционные смеси (25 мкл) содержали 10 мкМ каждой пары праймеров, Taq ДНК-полимеразу, 1 Ед/мкл (каталожный номер 11647679001, Roche), 10х буфер для ПЦР с MgCl2, дополненный 1 мМ MgCl2, 2 мкМ dNTPs, и 80 или 40 нг кДНК. Условия ПЦР для фрагментов ABCA4 с экзона 30 до 31 были следующими: 94°С в течение 2 мин, 35 циклов из 30 секунд при 94°С, 30 с при 58°С и 90 с при 72°С, с последующим финальным этапом из 2 мин при 72°С. Для амплификации актина ПЦР проводили в тех же условиях, за исключением времени элонгации 30 с. Полный объем продуктов ПЦР для ABCA4 и 10 мкл ампликона актина разделяли на 2 мас./об.% агарозном геле. Полученные полосы анализировали с использованием Секвенирования по Сэнгеру. Соотношение между правильно и неправильно сплайсированными вариантами оценивали с использованием программы Fiji (Schindelin et al., 2012).
D. Мутации: c.769-784C>T, c.859-540C>G, c.859-506G>C, c.1937+435C>G, c.4539+1100A>G, c.4539+1106c>T и c.5197-557C>T - мидигены.
Получение мидигена для каждой мутации.
Был создан мидиген для каждой мутации (Sangermano et al., 2018). Эти мидигены включали существенный фрагмент геномной ДНК ABCA4 на каждой стороне соответствующих мутаций, часто охватывающий один или несколько фланкирующих экзонов. Эту геномную область клонировали в вектор pCINeo-Rhodopsin с использованием Gateway System. Полученные векторы (pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6intron7 дикого типа (SEQ ID NO: 290), pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6-intronll дикого типа (SEQ ID NO: 292), pCI-Neo-Rho-ABCA4-intronll-intronl5 дикого типа (SEQ ID NO: 295), pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron29intron32 дикого типа (SEQ ID NO: 297), pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron31-intron37 дикого типа (SEQ ID NO: 300)) применяли для введения мутаций c.769-784C>T, c.859-540C>G, c.859-506G>C, c.1937+435C>G, c.4539+1100A>G, c.4539+1106C>T и c.5197-557G>T в соответствующий вектор путем сайтспецифического мутагенеза (новые векторы назвали
- 37 043834 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6Intron7 C.769-784T (SEQ ID NO: 291), pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6intronll C.859-540G (SEQ ID NO: 293), pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6intronll C.859-506C (SEQ ID NO: 294), pCI-Neo-Rho-ABCA4intronll-intronl5 C.1937+435G (SEQ ID NO: 296), pCI-Neo-RhoABCA4-intron29-intron32 C.4539+1100G (SEQ ID NO: 298), pCI-NeoRho-ABCA4-intron29-intron32 C.4539+1106T (SEQ ID NO: 299) и pCINeo-Rho-ABCA4-lntron31-lntron37 C.5197-557T (SEQ ID NO: 301)).
Контрольный и мутированный векторы подтверждали секвенированием по Сэнгеру. Мидигенами затем трансфицировали клетки HEK293T, которые собирали через 48 ч после трансфекции и проводили анализ ОТ-ПЦР для того чтобы выявить дефект сплайсинга.
Конструирование и тестирование АОН.
Анализ РНК клеток HEK293T, трансфицированных мидигенами, показал дефект сплайсинга премРНК, который заключается во вставке псевдоэкзона. Были сконструированы несколько AOH с использованием последовательности этого псевдоэкзона. Затем, AOH трансфицировали HEK293T совместно с мидигенами. Для подтверждения эффективности AOH, проводили анализ ОТ-ПЦР на клетках. Эффективность каждого из AOH оценивали, доставляя одинаковые количества мидигена и различные концентрации AOH и проводя после этого анализ ОТ-ПЦР. В каждый эксперимент был включен один SON в качестве отрицательного контроля. Во время окончательной проверки мы обнаружили, что АОН1, который был разработан для мутации c.859-540C>G был заказан неправильно, и вместо него была введена и получена последовательность AOH3 для мутации c.5197-557G>T. Это также повлияло на интерпретацию результатов.
Анализ ОТ-ПЦР.
Выделяли тотальную РНК с использованием набора NucleoSpin RNA Clean-up (каталожный № 740955-50; Macherey-Nagel, Duren, Germany) по протоколу производителя. Определяли количество РНК и синтезировали кДНК из 1 мкг РНК с использованием набора iScript cDNA synthesis (каталожный №, 1708891; Bio-Rad, Hercules, CA) по инструкциям производителя. Наконец, оценивали эффективность AOH, проводя ПЦР с использованием соответствующих праймеров ABCA4 (SEQ ID NO: 302, родопсин ехЗ fw; SEQ ID NO: 303, ABCA4 ex7 rev;
SEQ ID NO: 304, ABCA4 ex7 fw; SEQ ID NO: 305, ABCA4 ex8 rev; SEQ ID NO: 306, ABCA4 exl3 fw; SEQ ID NO: 307, ABCA4 exl4 rev; SEQ ID NO: 308, ABCA4 ex30 fw; SEQ ID NO: 309, ABCA4 ex32 rev; SEQ ID NO: 310, ABCA4 ex32 tw; SEQ ID NO: 311, ABCA4 ex37 rev).
Результаты.
A. Минигенными конструкциями с мутацией c.4539+1100A>G или с. 4539+1106С>Т трансфицировали клетки НЕК293Т вместе с конструкцией с последовательностью ABCA4 дикого типа. Как показано на фиг. 1, обе мутации приводят к вставке псевдоэкзона размером 86 п.н. в транскрипт (дорожки, помеченные NT), хотя были также выявлены некоторые оставшиеся транскрипты дикого типа. Трансфекция тремя различными AOH показала, что для обеих мутаций вставка псевдоэкзона была полностью отменена в присутствии АОН1 (AOH-1 для псевдоэкзона 30-31(68), SEQ ID NO: 15), и АОН2 (AOH-2 для псевдоэкзона 30-31(68), SEQ ID NO: 18), в то время как AOH3 (AOH-3 для псевдоэкзона 30-31(68), SEQ ID NO: 21) привел к частичному перенаправлению событий сплайсинга (фиг. 1). Эти данные демонстрируют способность АОН перенаправлять события нарушенного сплайсинга, вызванные мутациями c.4539+1100A>G или c.4539+1 106C>T.
B. Минигенной конструкцией с мутацией c.4539+2001A>G (A) трансфицировали клетки HEK293T вместе с конструкцией с последовательностью ABCA4 дикого типа (G). Минигенной конструкцией с мутацией c.4539+2001G>A трансфицировали клетки HEK293T вместе с конструкцией с последовательностью ABCA4 дикого типа. Анализ ОТ-ПЦР с использованием РНК, полученной из этих клеток выявил включение псевдоэкзона, соответствующего последовательности размером 345 п.н. в интрон 30, но только когда клетки культивировали в присутствии циклогексимида (+СНХ), вещества, которое постоянно используют для подавления нонсенс-опосредованной деградации неправильных транскриптов. Как показано на фиг. 3, все четыре AOH (AOH1=А0Н-1 для псевдоэкзона 30-31(345), SEQ ID NO: 35, АОН2= AOH-2 для псевдоэкзона 30-31(345), SEQ ID NO: 38, AOH3=AOH-3 для псевдоэкзона 30-31(345), SEQ ID NO: 41, АОН4= AOH-4 для псевдоэкзона 30-31(345), SEQ ID NO: 44),) полностью перенаправляли сплайсинг ABCA4 в отличие от SON. При использовании конструкции WT (левая дорожка), как и ожидалось, был выявлен только интактный продукт без псевдоэкзона. В настоящем изобретении AOH взаимозаменяемо обозначены как AOH-n и AOHn, где n представляет собой целое число; AOH могут быть показаны с - или без -.
С. В клетках-предшественниках фоторецепторов, полученных от пациента, гетерозиготного по мутации c.4539+2001G>A (M1) ABCA4, анализ ОТ-ПЦР с использованием РНК, полученной из этих клеток выявил включение псевдоэкзона, соответствующего последовательности размером 345 п.н. в интрон 30,
- 38 043834 но только когда клетки культивировали в присутствии циклогексимида (+СНХ), вещества, которое постоянно используют для подавления нонсенс-опосредованной деградации неправильных транскриптов. Как показано на фиг. 2, после трансфекции четырьмя различными AOH, нацеленными на этот псевдоэкзон (АОН1=АОН-1 для псевдоэкзона 30-31(345), SEQ ID NO: 35, АОН2= AOH-2 для псевдоэкзона 3031(345), SEQ ID NO: 38, AOH3=AOH-3 для псевдоэкзона 30-31(345), SEQ ID NO: 41, AOH4=AOH-4 для псевдоэкзона 30-31(345), SEQ ID NO: 44), вставка псевдоэкзона полностью исчезла после введения АОН1 и АОН4. Этого не произошло в случае отрицательного контроля олиго SON (SEQ ID NO: 45), который имеет последовательность, комплементарную АОН1, что демонстрирует, что АОН1 и АОН4 эффективно и специфически перенаправляют события нарушенного сплайсинга, вызванные мутацией c.4539+2001G>A.
Чтобы определить, приводят ли варианты c.4539+2001G>A (M1) и с. 4539+2028C>T (М2) к нарушению сплайсинга пре-мРНК ABCA4, получали клеточные линии фибробластов от двух неродственных пациентов с болезнью Штаргардта (STGD1). Пациент с STGD1 с M1 имел миссенс-вариант с.4892Т>С (р.Leu1631Pro) в транс-ориентации (Webster et al., 2001). Пациент с STGD1 с М2 имел вариант в глубине интрона с.302+68С>Т в цис-ориентации, в то время как делеция с.6148-698_6670delinsTGTGCACCTCCCTAG (р.?) присутствовала на другом аллеле. Кроме того, получали линию фибробластов от здорового контроля. Все клетки культивировали в отсутствие и присутствии циклогексимида (СНХ), соединения, которое обычно используют для подавления нонсенсопосредованного разрушения продуктов РНК, несущих мутации, укорачивающие белок. Анализ ОТ-ПЦР с праймерами, расположенными в экзонах 30 и 31, выявил только чисты продукт, соответствующий ожидаемому продукту с экзонами 30 и 31 (фиг. 4). Никаких продуктов с нарушениями сплайсинга не было выявлено в фибробластах от пациентов с STGD1.
Для исследования потенциально специфических для сетчатки дефектов сплайсинга, которые вызваны двумя мутациями ABCA4 глубоко в интроне, контрольные фибробласты и фибробласты пациентов были перепрограммированы в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) при помощи лентивирусной трансдукции факторами Яманаки (Takahashi et al., 2006). Количественная ПЦР (q-ПЦР) (фиг. 7) и иммунофлуоресцентный анализ (данные не показаны) подтвердили плюрипотентность iPSC. Затем, эти iPSCs дифференцировали в течение одного месяца в клетки-предшественники фоторецепторов (PPCs). Мы использовали протокол, описанный ранее Flamier и коллегами (Flamier et al., 2016), для получения относительно гомогенной популяции колбочковых клеток, поскольку клетки, которые в первую очередь поражаются при STGD1, представляют собой колбочковые фоторецепторные клетки. Характеристика РРС, полученных от контроля и пациентов, выявила значимо повышенную экспрессию ABCA4, которая была приблизительно в 40 раз выше у РРС, чем у контрольных iPSC, но только приблизительно в три раза выше у М1-и М2-РРС по сравнению с M1- и M2-iPSC. Дополнительная характеристика РРС выявила, что все три клеточных линии дифференцировали в направлении S-колбочек, хотя контрольные РРС экспрессировали более высокие количества CRX и OPN1SW по сравнению с M1- и М2-РРС (фиг. 7В).
Поскольку ABCA4 сильно экспрессировался в РРС, мы провели анализ RT-ПЦР от экзона 30 до экзона 31, который показал неправильные транскрипты и в M1- и в М2-полученных РРС после обработки СНХ, но не в контрольных РРС (фиг. 4А). Полуколичественная оценка соотношения между правильными и неправильными вариантами сплайсинга в образцах, обработанных СНХ, выявила, что ~25% транскриптов ABCA4 у пациента с M1 и ~15% транскриптов ABCA4 у пациента с М2 были с нарушениями (фиг. 4В). Более детальный анализ всех полос путем секвенирования по Сэнгеру выявил ПЭ размером 345 н., содержащий преждевременный стоп-кодон (фиг. 5), который по прогнозу приводит к укороченному белковому продукту р.Arg1514Leufs*36. Интересно то, что, оба варианта включают одинаковый ПЭ в транскрипт мРНК после обработки СНХ. После того как была идентифицирована последовательность, мы изучили влияние обоих вариантов на сплайсинг. В соответствии со всеми предсказаниями при помощи программы, ни M1, ни М2 не изменяют силу сайта акцептора или донора сплайсинга (фиг. 5). Сайт донора сплайсинга для ПЭ размером 345 н. содержит в качестве канонической последовательности сайта сплайсинга GC, которая распознается только программой Splice-Site-Finder-Like (SSFL). Дальнейшие предсказания in silico показали, что M1 увеличивает силу сайта экзонного энхансера сплайсинга SF2 и создает новый мотив SRp55, в то время как М2 создает один мотив SC35 и два мотива SRp40 (фиг. 5).
Дальнейший углубленный анализ всех полос, полученных при ОТ-ПЦР, выявил, что одна полоса содержит гетеродуплексы правильно сплайсированного транскрипта вместе с одним из транскриптов с ПЭ (фиг. 4). Кроме того, очень слабая полоса, у которой отсутствовали последние 73 п.н. экзона 30, была обнаружена во всех образцах, обработанных СНХ, включая контроль. Этот альтернативный транскрипт, который также был выявлен в полосе гетеродуплекса (фиг. 4), объясняется относительно слабым сайтом донора сплайсинга (оценка Human Splicing Finder (HSF): 75,9). Этот продукт сплайсинга (r.4467_4539del, р.Cys1490Glufs*12) был также выявлен как результат вариантов сайта неканонического сплайсинга в природном донорском сайте сплайсинга экзона 30 (R. Sangermano, M. Khan et al., 2018). Интересно, что
- 39 043834 этот новый сайт донора был ранее описан как сайт акцептора сплайсинга (оценка HSF: 89,6), создающий изоформу без первых 114 п.н. экзона 30 (Gerber et al., 1998).
В семи случаях STGD1 с М2, в которых это было исследовано, С.ЗО2+68С>Т была обнаружена в цис-ориентации (R. Allikmets, неопубликованные данные; Braun et al., 2013; Lee et al., 2016 и Zernant et al., 2014). Для того чтобы изучить вклад этого варианта в патологию STGD1, мы провели ОТ-ПЦР мРНК из контрольных РРС, М1-и М2-РРС, обработанных и необработанных СНХ, а также из мРНК сетчатки взрослого человека. Как показано на фиг. 8, праймеры ПЦР, расположенные в экзонах 2 и 5, производили продукт канонического сплайсинга размером 459 н., а также меньший фрагмент размером 317 н. во всех РРС и сетчатке человека. Подтверждение полос секвенированием по Сэнгеру выявило, что в 317-н. фрагменте отсутствовал экзон 3 (размер: 142 п.н.). Никаких других продуктов сплайсинга не наблюдали, что указывает на то, что вариант С.ЗО2+68С>Т не приводит к активации криптических сайтов сплайсинга и/или экзонным энхансерам сплайсинга.
Как только был выяснен механизм, связанный с вариантами M1 и М2, нашей целью стала разработка терапевтического подхода, основанного на регуляции сплайсинга, для пропуска ПЭ. Привлекательным и эффективным способом являлось применение AOH, малых молекул РНК, которые способны проникать в клетку, связываться с пре-мРНК и модифицировать рисунок сплайсинга. Для того чтобы повысить их аффинность связывания и избежать активации РНКазы Н (и, таким образом, разрушения транскрипта), мы использовали 2-O-метил-модифицированные РНК AOH с тиофосфатными (2OMe/PS) остовами, описанными ранее (Collin et al., 2012; Garanto et al., 2016; Gerard et al., 2012 и Slijkerman et al., 2016). В целом, мы сконструировали четыре АОНа: два, для того чтобы заблокировать мотив SC35 с наивысшей оценкой, расположенный на 3'-конце ПЭ (АОН2, AOH3), один для того чтобы заблокировать второй по оценке SC35 на 5'-конце ПЭ (АОН4), и один для того чтобы заблокировать свежеобразованный мотив SRp55, связанный с M1 (AOH1; фиг. 6А). Кроме того, для этой же области был сконструирован смысловой олигонуклеотид (SON), комплементарный АОН1 и содержащий такие же химические модификации, как и другие АОНы, но не способный связываться с пре-мРНК. АОНы и SON доставляли к РРС после месяца дифференцировки и анализировали РНК через 48 ч. Как и ожидалось, обработка СНХ увеличивала присутствие неправильно сплайсированных транскриптов в клетках без лечения (фиг. 6В и С). Кроме того, не было различий между нелеченными клетками и клетками, обработанными SON. Мы продемонстрировали, что АОНы эффективны для пропуска экзонов. Мы обнаружили, что АОН4 был способен эффективно производить до ~75% пропуска ПЭ в обеих клеточных линиях при двух различных концентрациях (фиг. 6D), в то время как АОН1 был очень эффективен на клеточной линии с M1. АОН2 показал меняющуюся эффективность, в то время как AOH3 был способен перенаправлять сплайсинг и при 0,5 мкМ, и при 1 мкМ (фиг. 6В, С и D). Одним из объяснений для АОН2 и AOH3, показывающих такое различное поведение, несмотря на нацеливания на одну область, могли бы быть свойства AOH (табл. 1, 2). AOH3 по сравнению с АОН2 имеет более низкое содержание GC и Tm, что может влиять на стабильность и связывающую способность, таким образом, объясняя низкую эффективность.
Для того чтобы дополнительно расширить наш поиск наиболее мощных AOH для перенаправления дефектов сплайсинга, вызванных мутацией c.4539+2001G>A, мы сконструировали и исследовали 22 дополнительных АОНа (АОН5-АОН26, SEQ ID NO: 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253 и 256, соответственно), и оценили их способность перенаправлять сплайсинг ABCA4, предупреждая включение псевдоэкзона размером 345 н.. Ранее исследованные АОНы 1-4 (SEQ ID NO: 35/184, 38/187, 41/190 и 44/193, соответственно) брали отдельно, а также два смысловых олигонуклеотида(SON1 [SEQ ID NO: 280] и S0N2 [SEQ ID NO: 281]). Результаты показаны на фиг. 9. помимо AOH 1 и 4, другие эффективные АОНы включали АОН9, АОН10, АОН14, АОН17, АОН18, АОН22, АОН23 и АОН24. Умеренно эффективные АОНы включали АОН2, АОН8, АОН11, АОН13, АОН16, АОН20 и АОН21. Слабоэффективные или неэффективные АОНы включали AOH3, АОН5, АОН6, АОН7, АОН12, АОН15, АОН19, АОН25 и АОН26. При сравнении сойств этих AOH стал очевидным ряд вещей:
i) АОНы, нацеленные на области вне псевдоэкзона (АОН5, АОН6, АОН7, АОН25 и АОН26) не способны перенаправлять сплайсинг ABCA4;
ii) АОНы, которые имели единичное нарушение комплементарности со своей мишенью, были неэффективными, т.е. AOH1 является специфичным для мутации c.4539+2001G>A, и и не перенаправляет сплайсинг у пациента с мутацией с.4539+2028С>Т (фиг. 6D). Аналогично, AOH15 является специфичным для псевдоэкзона с мутацией с.4539+2028С>Т и не эффективен для коррекции дефектов сплайсинга, вызванных мутацией c.4539+2001G>A (фиг. 9);
iii) АОНы, которые эффективны для перенаправления сплайсинга, часто содержат мотив SC35 (и эффективные, и умеренно эффективные имеют в среднем в 1,8 и 1,45 раз больше мотивов SC35 по сравненю со слабоэффективными и неэффективными АОНами). Не наблюдали значительных различий для мотивов SF2 и SRp40. Для умеренно эффективных АОНов, мы выявили обогащение мотивами SRp55 в 4 и 2,6 раз по сравнению с эффективными и с группой слабоэффективных и неэффективных АОНов, соответственно);
iv) в среднем, не было различий по длине AOH, между теми, которые перенаправляли сплайсинг и
- 40 043834 которые не перенаправляли. Однако, мы все обнаружили, что температура плавления (Tm) была в среднем на 2 и 3 градуса выше у эффективных АОНов, при сравнении с умеренно эффективной группой и группой, состоящей из слабоэффективных и неэффективных АОНов;
v) также в среднем и эффективные, и умеренно эффективные АОНы показали процентное содержание GC выше 54%, в то время как в среднем у слабоэффективных или неэффективных АОНов было ниже 48%;
vi) мы не наблюдали явных различий между АОНами, которые связывались с предсказанными смешанными областями с частично открытыми и частично открытыми областями, и АОНами, которые связывались или с закрытыми или с открытыми областями.
D. Мидигенными конструкциями с мутацией с.769-784С>Т, c.859-540C>G, c.859-506G>C, c.1937+435C>G, c.4539+1100A>G, c.4539+1106C>T или c.5197-557G>T трансфицировали клетки HEK293T вместе с конструкцией с соответствующими последовательностями ABCA4 дикого типа. Как показано на фиг. 10, все мутации в различной степени приводят к вставке псевдоэкзона различной длины (дорожки, обозначенные NT). Трансфекция тремя различными АОНами, а также одним общим SON для каждой мутации, показала, что для всех мутаций, по меньшей мере, один AOH был эффективен для спасения от вставки псевдоэкзона, связанной с этой мутацией. Конкретно, для c.769-784C>T, добавление АОН1 и АОН2 приводит к снижению вставки псевдоэкзона, в то время как AOH3 частично исправляет дефект сплайсинга. Для c.859-540C>G, АОН1 не эффективен, АОН2 очень эффективен, в то время как AOH3 частично исправляет дефект сплайсинга. Однако, во время финальной проверки, мы обнаружили, что АОН1, который был разработан для мутации c.859-540C>G, был заказан неправильно, и вместо него была заказана и получена последовательность AOH3 для мутации c.5197-557G>T. Это также повлияло на интерпретацию результатов. Таким образом, отрицательный результат, полученный для АОН1, я вляется ожидаемым, поскольку фактический использованный AOH не специфичен для соответствующего псевдоэкзона, и, таким образом, не должен работать. Для c.859-506G>C, AOH1 и AOH3 привели к снижению содержания транскрипта с псевдоэкзоном, в то время как АОН2 был неэффективен. Для C.1937+435OG, все три АОНа привели к уменьшению транскриптов ABCA4 с псевдоэкзоном. Для мутаций c.4539+1100A>G и c.4539+1106C>T, AOH1 и AOH2, по-видимому, были эффективны, в то время как AOH3 явно не был. Наконец, для мутации c.5197-557G>T, все три АОНа показали уменьшение транскриптов с псевдоэкзоном. Вместе эти данные демонстрируют способность АОНов перенаправлять события нарушенного сплайсинга, вызванные исследованными мутациями в глубине интрона ABCA4, по меньшей мере, с одним эффективным AOH для каждого псевдоэкзона.
Обсуждение.
В этом исследовании, мы показали, что два соседних варианта глубоко в интроне ABCA4, c.4539+2001G>A и c.4539+2028C>T, приводят к специфичному для сетчатки включению псевдоэкзона (ПЭ) размером 345 н. в части транскриптов ABCA4. Этот ПЭ, который по предсказанию приводит к укорочению белка (р.Arg1514Leufs*36) , был обнаружен в виде низкокопийной альтернативной формы сплайсинга ABCA4 при проведении глубокого РНК-секвенирования для РНК желтого пятна человека (Braun et al., 2013).Количественная оценка продукта ОТ-ПЦР выявила больше вставок ПЭ из-за M1, чем из-за М2. На основании фенотипа глаз у пациентов STGD1 с M1, и характера вариантов, наблюдаемых в транс-ориентации у этих пациентов, предположили, что M1 действует как тяжелый вариант (Bauwens et al., 2015; Вах et al., 2015; Braun et al., 2013). Напротив, на основании наших собственных наблюдений и ограниченных клинических данных, доступных для некоторых пациентов с STGD1 с М2 (Lee et al., 2016), мы предположили, что М2 действует как вариант от мягкого до умеренно тяжелого. Мы, таким образом, могли бы ожидать, что количество мутантной мРНК у пациента с M1, миссенс-вариантом в транс-ориентации, должно быть равным количеству правильного продукта. Это не так, хотя трудно сравнивать, поскольку более маленькие продукты амплифицируются более эффективно и подавление путем NMD может ыть неполным. Вставка ПЭ из-за М2 менее известна, чем для M1, что согласуется с ее менее серьезным характером. Однако, мы не можем исключить возможности, что другие cis-действующие варианты, упущенные во время секвенирования локусов, (Zernant et al., 2014) действуют согласованно с этими вариантами интрона 30. Кроме того, могут играть роль специфические механизмы, связанные с типом клеток, поскольку обе линии РРС, полученные от пациентов были менее дифференцированные, чем контрольная линия РРС, указывая на возможность задержки в дифференцировке. Это может оказывать значительное влияние на количество вставок ПЭ. Ясный пример важности ретинальной дифференцировки для распознавания ПЭ был описан для варианта в глубине интрона c.2991+1655A>G в СЕР290. В то время как лимфобластные и фибробластные клетки пациентов имели эту мутацию в гомозиготном виде, соотношение неправильно и правильно сплайсированного СЕР290 составляет ~1:1 (Collin et al., 2012; Garanto et al., 2016; den Hollander et al., 2006), было обнаружено что, в фоторецепторных клетках, полученных из iPSC количество неправильно сплайсированного СЕР290 резко возрастает (соотношение ~1:4; Parfitt et al., 2016). Это исследование не только раскрыо понимание того, почему эта мутация, несмотря на повсеместную экспрессию СЕР290, приводит к несиндромному ретинальному фенотипу, но также продемонстрировало огромную силу использования ретинальных клеток, полученных из iPSC, от пациентов для изучения дефектов сплайсинга в подходящей клеточной системе.
- 41 043834
Известные ранее интронные варианты, связанные с наследственными заболеваниями сетчатки (IRD), создавали новые сайты акцептора сплайсинга или донора сплайсинга, которые давали возможность вставки ПЭ (Braun et al., 2013; Bonifert et al., 2016; Webb et al., 2012; van den Hurk et al., 2003; Vache et al., 2012; Rio Frio et al., 2009; Naruto et al., 2015; Mayer et al., 2016; Liquori et al., 2016; den Hollander et al., 2006; Carss et al., 2017). Насколько нам известно, мы первые сообщаем о вставке ПЭ, которая не вызвана этим механизмом, а, вероятно, связана с образованием новых мотивов ESE при IRD. Интронные области пронизаны парами предсказанных сайтов акцептора и донора сплайсинга, которые теоретически могут фланкировать ПЭ. После выявления дополнительных ПЭ, которые не активируются путем создания сайтов сплайсинга, будет возможно определить последовательность мотивов, которые переводят криптические ПЭ в реальные ПЭ.
Вставки ПЭ, связанные с M1 и М2, были успешно блокированы несколькими AOH. M1специфичный AOH был эффективен только на М1-клеточной линии, и даже в двойной концентрации AOH, AOH1 был все еще неспособен корректировать дефект сплайсинга на клеточной линии с М2. Кроме того, М2-специфичный AOH, который имел единичное нарушение комплементарности с последовательностью ПЭ, был неэффективен у пациента с M1. Эти результаты подчеркивают специфичность последовательности и тот факт, что несовпадения одного нуклеотида достаточно для изменения эффективности AOH. Заново созданный мотив SRp55 может играть важную роль в детекции ПЭ. Это еще предстоит выяснить, учитывая тот факт, что оба варианта активируют одинаковый ПЭ, и А0Н4 способен пропустить ПЭ в обоих случаях. Одним из ограничений AOH является то, что они связываются со специфическими последовательностями и, таким образом, невозможно тестировать такой же AOH на модели на животных, если отсутствует консервативная область ДНК/РНК, за исключением того, если создана модель, в которую вставлена часть последовательности человека в ортологичном положении в геном животного. Однако, уже известно, что химия 2OMe/PS и 2МОЕ (2-O-Метоксиэтил)/PS не токсична для глаза, как показано на нескольких животных моделях (Garanto et al., 2016; Gerard et al., 2015; Murray et al., 2015). Кроме того, первый коммерческий AOH применяли для лечения зболевания глаз, CMVретинита (Fomivirsen approved for CMV retinitis: first antisense drug. AIDS treatment news, 7 (1998)). Таким образом, технология AOH выглядит безопасным и многообещающим подходом для лечения заболеваний глаз. Вследствие отсутствия моделей на животных, применение фоторецепторов, полученных из iPSC, по-видимому, является подходящей альтернативой, хотя все еще нужно выяснить, можно ли восстановить функцию белка ABCA4 белок после лечения этих клеток.
В заключение, с использованием полученных от пациента iPSC, дифференцированных в Sколбочки, мы смогли идентифицировать молекулярный дефект из-за двух рекуррентных соседних вариантов в глубине интрона, лежащих в основе STGD1. Дефект сплайсинга состоял из вставки ПЭ размером 345, которая, по-видимому, является тканеспецифической, и, наиболее вероятно, вызвана наличием новообразованных экзонных энхансеров сплайсинга, а не связана с возникновением новых сайтов сплайсинга. Кроме того, был разработан и протестирован терапевтический подход на основе AOH, показывающий, что один AOH способен перенаправить сплайсинг в обеих мутированных клеточных линиях. Кроме того, вариант-специфический AOH был очень эффективен против M1, но не М2, что указывает на то, что единичный некомплементарный нуклеотид может резко изменить эффективность AOH. Для нескольких мутаций в глубине интрона ABCA4 (т.е. с.769-784С>Т, c.859-540C>G, c.859-506G>C, c.1937+435C>G, c.4539+1100A>G, c.4539+1106C>T или c.5197-557G>T) мы показали, что все они приводят к вставке псевдоэкзона. Были сконструированы АОНы для блокирования вставки этого псевдоэкзона, и для каждого псевдоэкзона, по меньшей мере, один AOH был способен значительно снизить количество нарушенных транскриптов ABCA4. В целом, эти результаты подчеркивают потенциал AOH как терапевтического инструмента для болезни Штаргардта.
- 42 043834
Ссылки
Aartsma-Rus, A. Overview on AON design. Methods Mol. Biol. 867, 117-129 (2012), doi:10.1007/978-1-61779-767-5_8.
Allikmets, R., Singh, N., Sun, H., Shroyer, N. F., Hutchinson, A., Chidambaram, A., Gerrard, B., Baird, L., Stauffer, D., Peiffer, A., Rattner, A., Smallwood, P., Li, Y., Anderson, K. L., Lewis, R. A., Nathans, J., Leppert, M., Dean, M. & Lupski, J. R. A photoreceptor cell-specific ATP-binding transporter gene (ABCR) is mutated in recessive Stargardt macular dystrophy. Nat. Genet. 15, 236-246 (1997), doi:10.1038/ng0397-236.
Bauwens, M., De Zaeytijd, J., Weisschuh, N., Kohl, S., Meire, F., Dahan, K., Depasse, F., De Jaegere, S., De Ravel, T., De Rademaeker, M., Loeys, B., Coppieters, F., Leroy, В. P. & De Baere, E. An augmented ABCA4 screen targeting noncoding regions reveals a deep intronic founder variant in Belgian Stargardt patients. Hum. Mutat. 36, 39-42 (2015), doi:10.1002/humu.22716.
Bax, N. M., Sangermano, R., Roosing, S., Thiadens, A. A., Hoefsloot, L. H., van den Born, L. I., Phan, M., Klevering, B. J., Westeneng-van Haaften, C., Braun, T. A., Zonneveld-Vrieling, Μ. N., de Wijs, I., Mutlu, M., Stone, E. M., den Hollander, A. I., Klaver, С. C., Hoyng, С. B. & Cremers, F. P. M. Heterozygous deep-intronic variants and deletions in ABCA4 in persons with retinal dystrophies and one exonic ABCA4 variant. Hum. Mutat. 36, 43-47 (2015), doi:10.1002/humu.22717.
Bonifert, T., Gonzalez Menendez, I., Battke, F., Theurer, Y., Synofzik, M., Schols, L. & Wissinger, B. Antisense oligonucleotide mediated splice correction of a deep intronic mutation in OPA1. Mol. Then. Nucleic Acids 5, e390 (2016), doi:10.1038/mtna.2016.93.
Braun, T. A., Mullins, R. F., Wagner, A. H., Andorf, J. L., Johnston, R. M., Bakall, В. B., Deluca, A. P., Fishman, G. A., Lam, B. L., Weleber, R. G., Cideciyan, A. V., Jacobson, S. G., Sheffield, V. C., Tucker, B. A. & Stone, E. M. Non-exomic and synonymous variants in ABCA4 are an important cause of Stargardt disease. Hum. Mol. Genet. 22, 5136-5145 (2013), doi:10.1093/hmg/ddt367.
Chiorini, J.A., Kim, F., Yang, L., and Kotin, R.M. (1999). Cloning and characterization of adeno-associated virus type 5. Journal of virology 73, 1309-1319.
Collin, R.W., den Hollander, A.I., van der Velde-Visser, S.D., Bennicelli, J., Bennett, J., and Cremers, F.P. (2012). Antisense Oligonucleotide (AON)-based Therapy for Leber Congenital Amaurosis Caused by a Frequent Mutation in CEP290. Molecular therapy Nucleic acids 1, el4.
Cremers, F. P. M., van de Pol, D. J., van Driel, M., den Hollander, A. I., van Haren, F. J., Knoers, N. V., Tijmes, N., Bergen, A. A., Rohrschneider, K. , Blankenagel, A., Pinckers, A. J., Deutman, A. F. & Hoyng, С. B. Autosomal recessive retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy caused by splice site mutations in the Stargardt's disease gene ABCR. Hum. Mol. Gen. 7, 355-362 (1998) .
- 43 043834 den Hollander, A. I., Koenekoop, R. K. , Yzer, S., Lopez,
I., Arends, M. L., Voesenek, К. E., Zonneveld, Μ. N., Strom, T.
M., Meitinger, T., Brunner, H. G., Hoyng, С. B., van den Born,
L. I., Rohrschneider, K. & Cremers, F. P. Mutations in the
CEP290 (NPHP6) gene are a frequent cause of Leber congenital amaurosis. Am. J. Hum. Genet. 79, 556-561 (2006).
Dorn, A., and Kippenberger, S. (2008). Clinical application of CpG-, ηοη-CpG-, and antisense oligodeoxynucleotides as immunomodulators. Current opinion in molecular therapeutics 10, 10-20 .
Egholm, M., Buchardt, 0., Christensen, L., Behrens, C., Freier, S.M., Driver, D.A., Berg, R.H., Kim, S.K., Norden, B., and Nielsen, P.E. (1993). PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules. Nature 365, 566-568.
Flamier, A., Barabino, A. & Bernier, G. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors. Bioprotocol 6, el870 (2016), doi:10.21769/BioProtoc.1870
Fujinami, K. , Zernant, J., Chana, R. K. , Wright, G. A., Tsunoda, K., Ozawa, Y., Tsubota, K., Webster, A. R., Moore, A. T., Allikmets, R. & Michaelides, M. ABCA4 gene screening by next-generation sequencing in a British cohort. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54, 6662-6674 (2013), doi:10.1167/iovs.1312570.
Garanto, A., Chung, D.C., Duijkers, L., Corral-Serrano, J.C., Messchaert, M., Xiao, R., Bennett, J., Vandenberghe, L.H., and Collin, R.W. (2016). In vitro and in vivo rescue of aberrant splicing in CEP290-associated LCA by antisense oligonucleotide delivery. Human molecular genetics 25, 2552-2563.
Gerard, X., Perrault, I., Hanein, S., Silva, E., Bigot, K. , Defoort-Delhemmes, S., Rio, M., Munnich, A., Scherman, D., Kaplan, J., Kichler, A. & Rozet, J. M. AON-mediated exon skipping restores ciliation in fibroblasts harboring the common Leber congenital amaurosis CEP290 mutation. Mol. Ther. Nucleic Acids 1, e29 (2012), doi:10.1038/mtna.2012.21
Gerard, X., Perrault, I., Munnich, A., Kaplan, J. & Rozet,
- 44 043834
J. M. Intravitreal injection of splice-switching oligonucleotides to manipulate splicing in retinal cells. Mol. Ther. Nucleic Acids 4, e250 (2015), doi:10.1038/mtna.2015.24.
Gerber, S., Rozet, J. M., van de Pol, T. J., Hoyng, С. B., Munnich, A., Blankenagel, A., Kaplan, J. & Cremers, F. P. M. Complete exon-intron structure of the retina-specific ATP binding transporter gene (ABCR) allows the identification of novel mutations underlying Stargardt disease. Genomics 48, 139142 (1998), doi:10.1006/geno.1997.5164.
Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schumperli, D., and Kole, R. (1998). Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 49294934.
Govindaraju, T., and Kumar, V.A. (2005) . Backbone-extended pyrrolidine peptide nucleic acids (bepPNA): design, synthesis and DNA/RNA binding studies. Chemical communications, 495-497.
Lee, W., Xie, Y., Zernant, J., Yuan, B., Bearelly, S., Tsang, S. H., Lupski, J. R. & Allikmets, R. Complex inheritance of ABCA4 disease: four mutations in a family with multiple macular phenotypes. Hum. Genet. 135, 9-19 (2016), doi:10.1007/s00439-015-1605-y.
Lewis, R. A., Shroyer, N. F., Singh, N., Allikmets, R., Hutchinson, A., Li, Y., Lupski, J. R., Leppert, M. & Dean, M. Genotype/Phenotype analysis of a photoreceptor-specific ATPbinding cassette transporter gene, ABCR, in Stargardt disease. Am. J. Hum. Genet. 64, 422-434 (1999), doi:10.1086/302251.
Martinez-Mir, A., Paloma, E., Allikmets, R., Ayuso, C., del Rio, T., Dean, M., Vilageliu, L., Gonzalez-Duarte, R. & Balcells, S. Retinitis pigmentosa caused by a homozygous mutation in the Stargardt disease gene ABCR. Nat. Genet. 18, 1112 (1998), doi:10.1038/ng0198-ll.
Maugeri, A., Klevering, B. J., Rohrschneider, K., Blankenagel, A., Brunner, H. G., Deutman, A. F., Hoyng, С. B. & Cremers, F. P. M. Mutations in the ABCA4 (ABCR) gene are the major cause of autosomal recessive cone-rod dystrophy. Am. J.
- 45 043834
Hum. Genet. 67, 960-966 (2000), doi:10.1086/303079.
Maugeri, A., van Driel, M. A., van de Pol, D. J.,
Klevering, B. J., van Haren, F. J., Tijmes, N., Bergen, A. A., Rohrschneider, K. , Blankenagel, A., Pinckers, A. J., Dahl, N.,
Brunner, H. G., Deutman, A. F., Hoyng, С. B. & Cremers, F. P. M. The 2588G-->C mutation in the ABCR gene is a mild frequent founder mutation in the Western European population and allows the classification of ABCR mutations in patients with Stargardt disease. Am. J. Hum. Genet. 64, 1024-1035 (1999).
Morita, K., Hasegawa, C., Kaneko, M., Tsutsumi, S., Sone, J., Ishikawa, T., Imanishi, T., and Koizumi, M. (2001). 2'-O,4'C-ethylene-bridged nucleic acids (ENA) with nuclease-resistance and high affinity for RNA. Nucleic acids research Supplement, 241-242.
Murray, S. F., Jazayeri, A., Matthes, Μ. T., Yasumura, D., Yang, H., Peralta, R., Watt, A., Freier, S., Hung, G., Adamson, P. S., Guo, S., Monia, В. P., LaVail, Μ. M. & McCaleb, M. L. Allele-specific inhibition of rhodopsin with an antisense oligonucleotide slows photoreceptor cell degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci . 56, 6362-6375 (2015), doi:10.1167/iovs.1516400.
Naruto, T., Okamoto, N., Masuda, K. , Endo, T., Hatsukawa, Y., Kohmoto, T. & Imoto, I. Deep intronic GPR143 mutation in a Japanese family with ocular albinism. Sci. Rep. 5, 11334 (2015), doi:10.1038/srepll334.
Nielsen, P.E., Egholm, M., Berg, R.H., and Buchardt, 0. (1991). Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Science 254, 1497-1500.
Parfitt, D. A., Lane, A., Ramsden, С. M., Carr, A. J.,
Munro, P. M., Jovanovic, K. , Schwarz, N., Kanuga, N., Muthiah, Μ. N., Hull, S., Gallo, J. M., da Cruz, L., Moore, A. T., Hardcastle, A. J., Coffey, P. J. & Cheetham, Μ. E.
Identification and correction of mechanisms underlying inherited blindness in human iPSC-derived optic cups. Cell stem Cell 18, 769-781 (2016), doi:10.1016/j. stem.2016.03.021.
- 46 043834
Rio Frio, T., McGee, T. L., Wade, N. M., Iseli, C., Beckmann, J. S., Berson, E. L. & Rivolta, C. A single-base substitution within an intronic repetitive element causes dominant retinitis pigmentosa with reduced penetrance. Hum. Mutat. 30, 1340-1347 (2009), doi:10.1002/humu.21071.
Rivera, A., White, K., Stohr, H., Steiner, K., Hemmrich, N., Grimm, T., Jurklies, B., Lorenz, B., Scholl, Η. P., Apfelstedt-Sylla, E. & Weber, В. H. A comprehensive survey of sequence variation in the ABCA4 (ABCR) gene in Stargardt disease and age-related macular degeneration. Am. J. Hum. Genet. 67, 800-813 (2000), doi:10.1086/303090.
Sangermano, R., Bax, N.M., Bauwens, M., van den Born, L.I., De Baere, E., Garanto, A., Collin, R.W., Goercharn-Ramlal, A.S., den Engelsman-van Dijk, A.H., Rohrschneider, K., et al. (2016). Photoreceptor Progenitor mRNA Analysis Reveals Exon Skipping Resulting from the ABCA4 c.5461-10T-->C Mutation in Stargardt Disease. Ophthalmology 123, 1375-1385.
Sangermano R, Khan M, Cornelis SS, Richelle V, Albert S, Elmelik D, Garanto A, Qamar R, Lugtenberg D, van den Born LI, Collin RWJ, Cremers FPM. Genome Res (2018), epub ahead of print, doi: 10.1101/gr.226621.117.
Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig,
V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K. , Tomancak, P. & Cardona, A. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods 9, 676-682 (2012), doi:10.1038/nmeth.2019.
Schulz, H. L., Grassmann, F., Kellner, U., Spital, G., Ruther, K., Jagle, H., Hufendiek, K. , Rating, P., Huchzermeyer, C., Baier, M. J., Weber, В. H. & Stohr, H. Mutation spectrum of the ABCA4 gene in 335 Stargardt disease patients from a multicenter German cohort-impact of selected deep intronic variants and common SNPs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 58, 394403 (2017), doi:10.1167/iovs.16-19936 .
Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by
-
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP16203864.0 | 2016-12-13 | ||
| EP17189492.6 | 2017-09-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA043834B1 true EA043834B1 (ru) | 2023-06-29 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220204972A1 (en) | Antisense oligonucleotides for the treatment of Stargardt disease | |
| US11414662B2 (en) | Antisense oligonucleotides for the treatment of usher syndrome type 2 | |
| US11479771B2 (en) | Antisense oligonucleotides for the treatment of eye disease | |
| US10647985B2 (en) | Antisense oligonucleotides for the treatment of Leber congenital amaurosis | |
| JP7113532B2 (ja) | スタルガルト病の処置のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド | |
| US20220049250A1 (en) | Antisense Oligonucleotides Rescue Aberrant Splicing of ABCA4 | |
| EP3824086A1 (en) | Antisense oligonucleotides rescue aberrant splicing of abca4 | |
| EA043834B1 (ru) | Антисмысловые олигонуклеотиды для лечения болезни штаргардта | |
| US11739324B2 (en) | Antisense oligonucleotides rescue aberrant splicing of ABCA4 | |
| US20220290154A1 (en) | Antisense oligonucleotides rescue aberrant splicing of ABCA4 |