EA043834B1 - ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES FOR THE TREATMENT OF STARGARDT'S DISEASE - Google Patents

ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES FOR THE TREATMENT OF STARGARDT'S DISEASE Download PDF

Info

Publication number
EA043834B1
EA043834B1 EA201991460 EA043834B1 EA 043834 B1 EA043834 B1 EA 043834B1 EA 201991460 EA201991460 EA 201991460 EA 043834 B1 EA043834 B1 EA 043834B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
aoh
pseudoexon
seq
abca4
nucleotides
Prior art date
Application number
EA201991460
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Роберт Вильхельмус Йоханна Коллин
Иглесиас Алехандро Гаранто
Францискус Петер Мария Кремерс
Сильвия Альберт
Original Assignee
Стихтинг Радбауд Университайр Медис Сентрюм
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Стихтинг Радбауд Университайр Медис Сентрюм filed Critical Стихтинг Радбауд Университайр Медис Сентрюм
Publication of EA043834B1 publication Critical patent/EA043834B1/en

Links

Description

Область изобретенияField of invention

Изобретение относится к области медицины. В частности, оно относится к новым антисмысловым олигонуклеотидам, которые можно использовать для лечения, профилактики и/или замедления болезниThe invention relates to the field of medicine. In particular, it relates to novel antisense oligonucleotides that can be used to treat, prevent and/or delay disease

Штаргардта.Stargardt.

Предшествующий изобретению уровень техникиPrior art

Аутосомно-рецесивные мутации в АВСА4 вызывают болезнь Штаргардта, прогрессирующее нарушение, которое характеризуется потерей центрального зрения и часто приводит к полной слепоте. Типичным признаком болезни Штаргардта является наличие множества желтых пятен (крапинок), распределенных на всем протяжении сетчатки пациентов. Ген АВСА4 состоит из 50 экзонов и кодирует белок, состоящий из 2273 аминокислот. Этот белок экспрессируется во внешних сегментах колбообразных и палочкообразных рецепторных клеток и играет важную роль в удалении побочных продуктов после фотопреобразования.Autosomal recessive mutations in ABCA4 cause Stargardt disease, a progressive disorder that is characterized by loss of central vision and often leads to complete blindness. A typical sign of Stargardt disease is the presence of many yellow spots (speckles) distributed throughout the retina of patients. The ABCA4 gene consists of 50 exons and encodes a protein consisting of 2273 amino acids. This protein is expressed in the outer segments of flask and rod receptor cells and plays an important role in the removal of byproducts after photoconversion.

Помимо STGD1, варианты АВСА4 могут также приводить к другим подтипам заболевания сетчатки в диапазоне от макулопатии в виде бычьего глаза до аутосомно-рецессивной колбочково-палочковой дистрофии (arCRD; Cremers et al., 1998; Maugeri et al., 2000) и панретинальных дистрофий (Cremers et al., 1998; Martinez-Mir et al., 1998; Shroyer et al., 2001; Duncker et al., 2014), в зависимости от тяжести аллелей.In addition to STGD1, ABCA4 variants can also lead to other subtypes of retinal disease ranging from bull's eye maculopathy to autosomal recessive cone-rod dystrophy (arCRD; Cremers et al., 1998; Maugeri et al., 2000) and panretinal dystrophies ( Cremers et al., 1998; Martinez-Mir et al., 1998; Shroyer et al., 2001; Duncker et al., 2014), depending on the severity of the alleles.

Двухаллельные варианты АВСА4 можно выявить приблизительно в 80% случаев STGD1 (Allikmets et al., 1997; Fujinami et al., 2013; Lewis et al., 1999; Maugeri et al., 1999; Rivera et al., 2000; Schulz et al., 2017; Webster et al., 2001; Zernant et al., 2011; Zernant et al., 2017), и 30% случаев arCRD (Maugeri et al., 2000), после секвенирования кодирующих областей и прилегающих сайтов сплайсинга. В основном, индивидуумы с arCRD или панретинальной дистрофией имеют два тяжелых аллеля АВСА4, в то время как индивидуумы с STGD1 имеют два умеренно тяжелых варианта или сочетание легкого и тяжелого вариантов (Maugeri et al., 1999; van Driel et al., 1998). Было выдвинуто предположение, что большинство утраченных вариантов ABCA4 у пациентов с STGD1 расположены в интронных областях гена, и фактически, за последние несколько лет, несколько групп показали присутствие таких вариантов в глубине интрона (Bauwens et al., 2015; Вах et al., 2015; Braun et al., 2013; Lee et al., 2016; Schulz et al., 2017; Zernant et al., 2014). В 2013, Браун с коллегами (Braun et al., 2013) описали два варианта в интроне 30 (c.4539+2001G>A и с.4539+2028С>Т, далее обозначенные M1 и М2, соответственно), которые предположительно могли влиять на сплайсинг пре-мРНК ABCA4, пока без предоставления экспериментальных данных. До настоящего времени М2 был выявлен в 13 случаях (Bauwens et al., 2015; Вах et al., 2015; Braun et al., 2013; Lee et al., 2016; Schulz et al., 2017; Zernant et al., 2014). M1 был обнаружен в 31 случае и, что интересно, особенно часто встречался в голландской и бельгийской популяциях (Bauwens et al., 2015; Вах et al., 2015; Braun et al., 2013; Lee et al., 2016; Zernant et al., 2014). Кроме того, мы идентифицировали несколько дополнительных мутаций ABCA4 в глубине интрона, которые приводят к вставке псевдоэкзонов, либо за счет активации криптического акцепторного или донорного сайтов сплайсинга, или за счет усиления мотивов ESE, которые расположены внутри псевдоэкзонов. Эти дополнительные мутации включают c.769-784C>T, c.859-540C>G, c.859-506G>C, c.1937 + 435C>G, c.4539+1100A>G, c.4539+1106C>T, c.5197-557G>T.Biallelic ABCA4 variants can be identified in approximately 80% of STGD1 cases (Allikmets et al., 1997; Fujinami et al., 2013; Lewis et al., 1999; Maugeri et al., 1999; Rivera et al., 2000; Schulz et al. ., 2017; Webster et al., 2001; Zernant et al., 2011; Zernant et al., 2017), and 30% of arCRD cases (Maugeri et al., 2000), after sequencing the coding regions and adjacent splice sites. In general, individuals with arCRD or panretinal dystrophy have two severe ABCA4 alleles, while individuals with STGD1 have two moderately severe variants or a combination of mild and severe variants (Maugeri et al., 1999; van Driel et al., 1998). It has been hypothesized that the majority of lost ABCA4 variants in STGD1 patients are located in intronic regions of the gene, and in fact, over the past few years, several groups have shown the presence of such variants deep within the intron (Bauwens et al., 2015; Bax et al., 2015 ; Braun et al., 2013; Lee et al., 2016; Schulz et al., 2017; Zernant et al., 2014). In 2013, Braun and colleagues (Braun et al., 2013) described two variants in intron 30 (c.4539+2001G>A and c.4539+2028C>T, hereafter designated M1 and M2, respectively), which could presumably influence on ABCA4 pre-mRNA splicing, without providing experimental data yet. To date, M2 has been identified in 13 cases (Bauwens et al., 2015; Bax et al., 2015; Braun et al., 2013; Lee et al., 2016; Schulz et al., 2017; Zernant et al., 2014). M1 was found in 31 cases and, interestingly, was particularly common in Dutch and Belgian populations (Bauwens et al., 2015; Bax et al., 2015; Braun et al., 2013; Lee et al., 2016; Zernant et al., 2016 al., 2014). In addition, we identified several additional ABCA4 mutations deep in the intron that result in the insertion of pseudoexons, either by activating cryptic acceptor or splice donor sites or by enhancing ESE motifs that are located within the pseudoexons. These additional mutations include c.769-784C>T, c.859-540C>G, c.859-506G>C, c.1937+435C>G, c.4539+1100A>G, c.4539+1106C> T, c.5197-557G>T.

В настоящее время проводятся несколько клинических испытаний для STGD1, использующих различных терапевтические стратегии (http://www.clinicaltrials.gov): i) генозаместительную терапию за счет доставки полной кДНК ABCA4 (~6,8 т.п.н.) при помощи лентивирусного вектора (NCT01367444 и NCT01736592); ii) субретинальную тренсплантацию клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека (hESC-RПЭ) (NCT02445612 и NCT02941991) и iii) введение C20-D3-ретинилацетата (NCT02402660). Каждый из этих подходов имеет ограничения, и до сих пор не было получено данных об эффективности этих клинических испытаний.Several clinical trials are currently ongoing for STGD1 using different therapeutic strategies (http://www.clinicaltrials.gov): i) gene replacement therapy by delivering the full ABCA4 cDNA (~6.8 kb) via lentiviral vector (NCT01367444 and NCT01736592); ii) subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) (NCT02445612 and NCT02941991) and iii) administration of C20-D3-retinyl acetate (NCT02402660). Each of these approaches has limitations, and to date no data have been obtained on the effectiveness of these clinical trials.

Поскольку значительное количество мутаций в ABCA4 влияет на сплайсинг пре-мРНК ABCA4, они представляют собой привлекательную мишень для регуляции сплайсинга путем терапии на основе антисмысловых олигонуклеотидов (AOH). Таким образом, существует необходимость в разработке АОН для регуляции сплайсинга гена ABCA4, чтобы обеспечить экспрессию функционального белка ABCA4 у индивидуумов, страдающих от болезни Штаргардта.Because a significant number of mutations in ABCA4 affect ABCA4 pre-mRNA splicing, they represent an attractive target for regulation of splicing by antisense oligonucleotide (AOH)-based therapy. Thus, there is a need to develop an AON to regulate splicing of the ABCA4 gene to ensure expression of functional ABCA4 protein in individuals suffering from Stargardt disease.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду для перенаправления сплайсинга, который:The invention relates to an antisense oligonucleotide for splicing redirection, which:

комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SEQ ID NO: 261, или их части;complementary or substantially complementary to a polynucleotide having the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 or SEQ ID NO: 261, or part thereof;

предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 162, 181, 82, 102, 122, 142 или SEQ ID NO: 262, или их части;preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide with the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 162, 181, 82, 102, 122, 142 or SEQ ID NO: 262, or part thereof;

более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 160, 180, 80, 100, 120, 140 или SEQ ID NO: 260, или их части более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинук- 1 043834 леотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 31, или их части;more preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide having the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 160, 180, 80, 100, 120, 140 or SEQ ID NO: 260, or portions thereof, more preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide leotide with a nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 31, or part thereof;

более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 32, или их части;more preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide having the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 32, or a portion thereof;

более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, 16, 19, 163, 166, 169, 33, 36, 39, 42, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251, 254, 257, 83, 86, 89, 103, 106, 109, 123, 126, 129, 143, 146, 149, 263, 266 и SEQ ID NO: 269, или их части; и более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 17, 20, 164, 167, 170, 34, 37, 40, 43, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 84, 87, 90, 104, 107, 110, 124, 127, 130, 144, 147, 150, 264, и SEQ ID NO: 270, или их части.more preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide with a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 13, 16, 19, 163, 166, 169, 33, 36, 39, 42, 182, 185, 188, 191, 194 , 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251, 254, 257, 83, 86, 89, 10 3 , 106, 109, 123, 126, 129, 143, 146, 149, 263, 266 and SEQ ID NO: 269, or parts thereof; and more preferably is complementary or substantially complementary to a polynucleotide with a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 14, 17, 20, 164, 167, 170, 34, 37, 40, 43, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 84, 87, 90, 90, 90, 90, 90, 90, 90 104, 107, 110, 124, 127, 130, 144, 147, 150, 264, and SEQ ID NO: 270, or parts thereof.

Изобретение дополнительно относится к антисмысловому олигонуклеотиду для перенаправления сплайсинга по любому из предшествующих пунктов, где указанный антисмысловой олигонуклеотид содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 18, 21, 165, 168, 171, 35, 38, 41, 44, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259, 85, 88, 91, 105, 108, 111, 125, 128, 131, 145, 148, 151, 265, 268 и SEQ ID NO: 271.The invention further provides an antisense oligonucleotide for splicing redirection according to any of the preceding claims, wherein said antisense oligonucleotide contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, 18, 21, 165, 168, 171, 35, 38, 41, 44, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250 , 253, 256, 259, 85, 88, 91, 105, 108, 111, 125, 128, 131, 145, 148, 151, 265, 268 and SEQ ID NO: 271.

Изобретение дополнительно относится к вирусному вектору, экспрессирующему антисмысловой олигонуклеотид по изобретению для перенаправления сплайсинга, в условиях, которые способствуют экспрессии антисмыслового олигонуклеотида для пропуска экзонов.The invention further relates to a viral vector expressing an antisense oligonucleotide of the invention for splicing redirection, under conditions that promote expression of the antisense oligonucleotide for exon skipping.

Изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, содержащей антисмысловой олигонуклеотид по изобретению для перенаправления сплайсинга или вирусный вектор по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.The invention further relates to a pharmaceutical composition containing an antisense oligonucleotide of the invention for splicing redirection or a viral vector of the invention and a pharmaceutically acceptable excipient.

Изобретение дополнительно относится к антисмысловому олигонуклеотиду по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектору по изобретению и композиции по изобретению для применения в качестве лекарственного средства.The invention further relates to an antisense oligonucleotide of the invention for splicing redirection, a vector of the invention and a composition of the invention for use as a drug.

Изобретение дополнительно относится к антисмысловому олигонуклеотиду по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектору по изобретению и композиции по изобретению для применения для лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4 и требующего модуляции сплайсинга ABCA4.The invention further provides an antisense oligonucleotide of the invention for splicing redirection, a vector of the invention and a composition of the invention for use in the treatment of an ABCA4-associated disease or condition requiring modulation of ABCA4 splicing.

Изобретение дополнительно относится к применению антисмыслового олигонуклеотида по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектора по изобретению и композиции по изобретению для получения лекарственного средства.The invention further relates to the use of an antisense oligonucleotide of the invention for splicing redirection, a vector of the invention and a composition of the invention for the production of a medicament.

Изобретение дополнительно относится к применению антисмыслового олигонуклеотида по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектора по изобретению и композиции по изобретению для лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4 и требующего модуляции сплайсинга ABCA4.The invention further relates to the use of an antisense oligonucleotide of the invention for splicing redirection, a vector of the invention and a composition of the invention for the treatment of a disease or condition associated with ABCA4 and requiring modulation of ABCA4 splicing.

Изобретение дополнительно относится к способу модуляции сплайсинга ABCA4 в клетке, включающему контакт указанной клетки с антисмысловым олигонуклеотидом по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектором по изобретению и композицией по изобретению.The invention further relates to a method of modulating ABCA4 splicing in a cell, comprising contacting said cell with an antisense oligonucleotide of the invention to redirect splicing, a vector of the invention, and a composition of the invention.

Изобретение дополнительно относится к способу лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4 и требующего модуляции сплайсинга ABCA4, у нуждающегося в этом индивидуума, при этом указанный способ включает контакт клетки указанного индивидуума с антисмысловым олигонуклеотидом по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектором по изобретению и композицией по изобретению.The invention further provides a method of treating a disease or condition associated with ABCA4 and requiring modulation of ABCA4 splicing in an individual in need thereof, said method comprising contacting a cell of said individual with an antisense oligonucleotide of the invention to redirect splicing, a vector of the invention and a composition of the invention .

Краткое описание чертежейBrief description of drawings

Фиг. 1 показывает результаты примера А, где восстановление дефектов сплайсинга, вызванных мутацией ABCA4 c.4539+1100A>G и с.4539+1106С>Т, проводили путем доставки АОН в анализе минигенов.Fig. 1 shows the results of Example A, where repair of splicing defects caused by the ABCA4 mutation c.4539+1100A>G and c.4539+1106C>T was achieved by delivering AON in a minigene assay.

Фиг. 2 показывает результаты примера С, где восстановление при помощи АОН дефектов сплайсинга, вызванных мутацией ABCA4 c.4539+2001G>A, проводили путем доставки АОН к культивируемым клеткам-предшественникам фоторецепторов, полученным от пациента.Fig. 2 shows the results of Example C, where AON repair of splicing defects caused by the ABCA4 c.4539+2001G>A mutation was achieved by delivering AON to cultured patient-derived photoreceptor progenitor cells.

Фиг. 3 показывает результаты примера В; восстановление при помощи АОН дефектов сплайсинга, вызванных мутацией ABCA4 c.4539+2001G>A, проводили путем доставки АОН в анализе минигенов.Fig. 3 shows the results of Example B; AON-mediated repair of splicing defects caused by the ABCA4 c.4539+2001G>A mutation was performed by AON delivery in a minigene assay.

Фиг. 4А показывает результаты примера С, где идентифицировали дефекты сплайсинга, вызванные мутациями ABCA4 с.4539+2001С>А (M1) и c.4539+2028C>T (М2). Были выявлены полосы с нарушенным сплайсингом, в частности, после обработки (+) циклогексимидом (СНХ). В качестве контроля использовали ОТ-ПЦР для актина (АСТВ). (В) Количественная оценка соотношения правильно и неправильно сплайсированных транскриптов ABCA4 для каждой клеточной линии с СНХ и без СНХ.Fig. 4A shows the results of Example C, where splicing defects caused by the ABCA4 mutations c.4539+2001C>A (M1) and c.4539+2028C>T (M2) were identified. Bands with disrupted splicing were detected, particularly after treatment with (+) cycloheximide (CHX). Actin RT-PCR (ACTB) was used as a control. (B) Quantification of the ratio of correctly and incorrectly spliced ABCA4 transcripts for each cell line with and without CHX.

Фиг. 5 - характеристика in silico воздействия, вызванного внутриинтронными вариантами M1Fig. 5 - in silico characterization of effects caused by intra-intronic M1 variants

- 2 043834 (c.4539+2001G>A) и М2 (с.4539+2028С>Т). Схематически представлены границы псевдоэкзона размером 345 п.н. с расположением M1 и М2, геномные положения сайтов сплайсинга, выявленные события сплайсинга, и предсказания для сайтов сплайсинга и для акцепторных, и для донорных сайтов. Точечная линия показывает сплайсинг от криптического сайта донора сплайсинга в экзоне 30 в положении g.94495074 (GRCh37/hg19) до обычного сайта акцептора сплайсинга в экзоне 31 (r.4467_4539del, р.Cys1490Glufs*12). Предсказанные величины сайтов акцептора и донора сплайсинга в ситуациях контроля и мутации не показали никаких различий. На средних панелях показаны воздействия вариантов, создающих или усиливающих новые мотивы ESE. SSFL: SpliceSiteFinder-like и HSF: Human Splicing Finder.- 2 043834 (c.4539+2001G>A) and M2 (c.4539+2028C>T). The boundaries of the 345 bp pseudoexon are schematically represented. with M1 and M2 locations, genomic positions of splice sites, identified splicing events, and splice site predictions for both acceptor and donor sites. The dotted line shows splicing from the cryptic splice donor site in exon 30 at position g.94495074 (GRCh37/hg19) to the regular splice acceptor site in exon 31 (r.4467_4539del, p.Cys1490Glufs*12). The predicted values of the splice acceptor and donor sites in the control and mutation situations did not show any differences. The middle panels show the effects of variants that create or enhance new ESE motives. SSFL: SpliceSiteFinder-like and HSF: Human Splicing Finder.

Фиг. 6А - схематическое изображение псевдоэкзона, указывающее на расположение вариантов, мотивы SC35 с наивысшими оценками и антисмысловые олигонуклеотиды (AOH). (В) - анализ РНК клеток, обработанных AOH. ОТ-ПЦР от экзона 30 до экзона 31 ABCA4 у контроля, M1- (c.4539+2001G>A) иМ2(с. 4539+2028C>T) содержащих клеток-предшественников фоторецепторов (РРС) после доставки AOH. Для нормализации образцов использовали амплификацию мРНК актина (АСТВ). NT-: необработанные и в отсутствие циклогексимида (СНХ); NT+: неообработанные в присутствии СНХ; А1: АОН1; А2: АОН2; A3: AOH3; А4: АОН4; S: SON и MQ: отрицательный контроль для ПЦР. (С) - полуколичественное соотношение правильно и неправильно сплайсированных транскриптов во всех образцах с M1 и М2. (D) процент коррекции каждого АОН по сравнению с NT+, на основании соотношения, наблюдаемого на фиг. 3С. Статистические различия по эффективности АОН для M1 и М2 показаны звездочкой (*: р<0,05 с использованием критерия Манна-Уитни).Fig. 6A is a schematic representation of a pseudoexon indicating the location of variants, top-scoring SC35 motifs, and antisense oligonucleotides (AOH). (B) RNA analysis of AOH-treated cells. RT-PCR from exon 30 to exon 31 of ABCA4 in control, M1- (c.4539+2001G>A) and M2 (c.4539+2028C>T) containing photoreceptor progenitor cells (PPCs) after AOH delivery. Actin mRNA amplification (ACTM) was used to normalize samples. NT-: untreated and in the absence of cycloheximide (CHX); NT+: untreated in the presence of CHX; A1: Caller ID1; A2: Caller ID2; A3: AOH3; A4: AON4; S: SON and MQ: negative control for PCR. (C) - semi-quantitative ratio of correctly and incorrectly spliced transcripts in all samples from M1 and M2. (D) Percentage correction of each AON compared to NT+, based on the relationship observed in Fig. 3C. Statistical differences in AON efficiency for M1 and M2 are indicated by an asterisk (*: p < 0.05 using the Mann-Whitney test).

Фиг. 7А - профиль экспрессии генов в одной контрольной и M1/M2-полученных индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (iPSC) по сравнению с соответствующими родительскими линиями фибробластов. (В) - профиль экспрессии генов в одной контрольной и М1/М2-полученных клеткахпредшественниках фоторецепторов (РРС) после месяца дифференцировки по сравнению с iPSC. Появление РРС можно установить по увеличению экспрессии CRX. Дифференцировку в фоторецепторподобные клетки показывают путем повышенной экспрессии OPN1SW, OPN1M/LW, RCV1 и ABCA4 по сравнению с геном плюрипотентности ОСТ3/4. Результаты показаны в виде среднего ±SD. Все данные наносили на график относительно экспрессии АСТВ.Fig. 7A is a gene expression profile of one control and M1/M2-derived induced pluripotent stem cells (iPSC) compared to the corresponding parental fibroblast lines. (B) Gene expression profile in one control and M1/M2-derived photoreceptor progenitor cells (PPCs) after a month of differentiation compared to iPSCs. The appearance of RMS can be determined by an increase in CRX expression. Differentiation into photoreceptor-like cells is demonstrated by increased expression of OPN1SW, OPN1M/LW, RCV1 and ABCA4 compared to the pluripotency gene OCT3/4. Results are shown as mean ±SD. All data were plotted against ACTB expression.

Фиг. 8 - анализ с помощью ОТ-ПЦР от экзона 2 до экзона 5 ABCA4 на контрольных (CON), M1 (с. 4539+2001C>A) и М2 (с.4539+2028С>Т) клетках-предшественниках фоторецепторов в отсутствие (-) и в присутствии (+) СНХ. РНК сетчатки взрослого человека использовали в качестве контроля, в то время как MQ представлял собой отрицательный контроль реакции.Fig. 8 - RT-PCR analysis from exon 2 to exon 5 of ABCA4 on control (CON), M1 (c. 4539+2001C>A) and M2 (c.4539+2028C>T) photoreceptor progenitor cells in the absence of (- ) and in the presence of (+) CHX. Adult retinal RNA was used as a control, while MQ was a negative reaction control.

На фиг. 9 представлен скрининг 26 последовательностей АОН на их способность исправлять дефекты сплайсинга, вызванные мутацией c.4539+2001G>A. (А) Типичная картина электрофореза ОТ-ПЦР для детеции с 30 по 31 экзоны ABCA4 у РРС, полученных у пациента. Нижняя полоса показывает правильный транскрипт, в то время как верхние полосы представляют транскрипты с нарушениями. Полосы с нарушениями были выявлены после обработки циклогексимидом (СНХ), что указывает на то, что эти транскрипты подвергаются нонсенс-опосредованной деградации (NMD). В клетки были доставлены вместе 26 различных молекул AOH, а также два SON (отрицательные контроли, которые называются SON1 и SON2). Результаты сравнивали с необработанными клетками (NT) в присутствии СНХ (+СНХ). В качестве контроля нагрузки применяли актин. MQ использовали в качестве отрицательного контроля ПЦР.In fig. Figure 9 shows the screening of 26 AON sequences for their ability to correct splicing defects caused by the c.4539+2001G>A mutation. (A) Typical RT-PCR electrophoresis pattern for deletions of exons 30 to 31 of ABCA4 in patient-derived RMS. The lower band shows the correct transcript, while the upper bands represent disrupted transcripts. Abnormal bands were detected after cycloheximide (CHX) treatment, indicating that these transcripts undergo nonsense-mediated degradation (NMD). 26 different AOH molecules were delivered together into the cells, as well as two SONs (negative controls called SON1 and SON2). The results were compared with untreated cells (NT) in the presence of CHX (+CHX). Actin was used as a loading control. MQ was used as a negative PCR control.

Представлен процент (В) правильных/исправленных транскриптов и (С) неправильных транскриптов после полуколичественной оценки двух независимых повторов. На основании процента молекулы АОН были классифицированы на эффективные (сплошной серый), умеренно эффективные (точечный рисунок), мало эффективные (рисунок в плоску) и неэффективные (рисунок в крестик). Сплошные, точечные и пунктирные линии указывают на пороги для определения эффективности различных AOH. Белым показаны контроли, указывающие на базовые уровни неправильных транскриптов. Черным показан образец, который не обрабатывали АОН и СНХ.The percentage of (B) correct/corrected transcripts and (C) incorrect transcripts after semiquantitative evaluation of two independent replicates is presented. Based on the percentage, AON molecules were classified into effective (solid gray), moderately effective (dot pattern), slightly effective (flat pattern), and ineffective (cross pattern). Solid, dotted, and dashed lines indicate thresholds for determining the effectiveness of different AOHs. Controls indicating basal levels of abnormal transcripts are shown in white. Shown in black is a sample that was not treated with AON and CHX.

Фиг. 10 показывает скрининг АОН по семи мутациям в гене ABCA4, которые приводят к включению псевдоэкзона. Мидигены, содержащие геномную область, подвергали мутагенезу для вставки мутации, которая встречается у людей. Затем этими мидигенами трансфицировали клетки HEK293T и через 24 ч доставляли в эти клетки различные AOH. Анализ проводили путем ОТ-ПЦР. Для всех вариантов были разработаны три AOH, а в качестве отрицательного контроля доставляли SON. NT указывал на необработанные и представлял собой трансфицированные клетки без обработки AOH. Линия НЕК представляла собой дополнительный отрицательный контроль, состоящий из нетрансфицированных клеток HEK293T.Fig. 10 shows AON screening for seven mutations in the ABCA4 gene that result in pseudoexon inclusion. Midigens containing the genomic region were mutagenized to insert a mutation that occurs in humans. HEK293T cells were then transfected with these midigens, and various AOHs were delivered to these cells after 24 h. The analysis was performed by RT-PCR. For all treatments, three AOHs were developed and SON was delivered as a negative control. NT indicated untreated and represented transfected cells without AOH treatment. The HEK line was an additional negative control consisting of untransfected HEK293T cells.

Описание последовательностей.Description of sequences.

SEQ ID NO.SEQ ID NO.

Название.Name.

1. Геномная ДНК ABCA4.1. Genomic DNA ABCA4.

2. кДНК ABCA4.2. ABCA4 cDNA.

- 3 043834- 3 043834

3. Белок ABCA4.3. ABCA4 protein.

10. Псевдоэкзон 30-31(68) РНК.10. Pseudoexon 30-31(68) RNA.

11. Псевдоэкзон 30-31(68) РНК; меньшая мишень.11. Pseudoexon 30-31(68) RNA; smaller target.

12. Псевдоэкзон 30-31 (68) РНК; меньшая мишень (область АОН + 10).12. Pseudoexon 30-31 (68) RNA; smaller target (AON area + 10).

13. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+10 н.).13. Target site of pseudoexon 30-31 (68) for AOH-1 and flanking sequences (+10 nt).

14. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+5 н.).14. Target site of pseudoexon 30-31 (68) for AOH-1 and flanking sequences (+5 nt).

15. AOH-1 для псевдоэкзона 30-31 (68).15. AOH-1 for pseudoexon 30-31 (68).

16. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+10 н.).16. Target site of pseudoexon 30-31 (68) for AOH-2 and flanking sequences (+10 nt).

17. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+5 н.).17. Target site of pseudoexon 30-31 (68) for AOH-2 and flanking sequences (+5 nt).

18. AOH-2 для псевдоэкзона 30-31 (68).18. AOH-2 for pseudoexon 30-31 (68).

19. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+10 н.).19. Target site of pseudoexon 30-31 (68) for AOH-3 and flanking sequences (+10 nt).

20. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+5 н.).20. Target site of pseudoexon 30-31 (68) for AOH-3 and flanking sequences (+5 nt).

21. AOH-3 для псевдоэкзона 30-31 (68).21. AOH-3 for pseudoexon 30-31 (68).

30. Псевдоэкзон 30-31 (345) РНК.30. Pseudoexon 30-31 (345) RNA.

31. Псевдоэкзон 30-31 (345) РНК; меньшая мишень.31. Pseudoexon 30-31 (345) RNA; smaller target.

32. Псевдоэкзон 30-31 (345) РНК; меньшая мишень (область АОН + 10).32. Pseudoexon 30-31 (345) RNA; smaller target (AON area + 10).

33. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+10 н.).33. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-1 and flanking sequences (+10 nt).

34. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+5 н.).34. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-1 and flanking sequences (+5 nt).

35. AOH-1 для псевдоэкзона 30-31 (345).35. AOH-1 for pseudoexon 30-31 (345).

36. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+10 н.).36. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-2 and flanking sequences (+10 nt).

37. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+5 н.)37. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-2 and flanking sequences (+5 nt.)

38. AOH-2 для псевдоэкзона 30-31 (345).38. AOH-2 for pseudoexon 30-31 (345).

39. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+10 н.).39. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-3 and flanking sequences (+10 nt).

40. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+5 н.)40. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-3 and flanking sequences (+5 nt.)

41. AOH-3 для псевдоэкзона 30-31 (345).41. AOH-3 for pseudoexon 30-31 (345).

42. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-4 и фланкирующие последовательности (+10 н.).42. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-4 and flanking sequences (+10 nt).

43. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-4 и фланкирующие последовательности (+5 н.).43. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-4 and flanking sequences (+5 nt).

44. AOH-4 для псевдоэкзона 30-31 (345).44. AOH-4 for pseudoexon 30-31 (345).

45. SON-1 для псевдоэкзона 30-31 (345).45. SON-1 for pseudoexon 30-31 (345).

смысловая версия SEQ ID NO: 35.semantic version SEQ ID NO: 35.

- 4 043834- 4 043834

50 pCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31 дикого типа 50 pCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31 wild type 51 pCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31 C.4539+1100G 51 pCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31 C.4539+1100G 52 pCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31 С.4539+1106Т 52 pCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31 S.4539+1106T 53 pCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31 С.4539+2001А 53 pCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31 S.4539+2001A 54 АВСА4_ех2 Fw 54 АВСА4_ех2 Fw 55 АСТВ_ехЗ Fw 55 ASTV_ехЗ Fw 56 АВСА4_ех30 Fw 56 ABCA4_ex30 Fw 57 АВСА4_ех20/21 Fw 57 АВСА4_ех20/21 Fw 58 CRX Fw 58 CRX Fw 59 LIN28 Fw 59 LIN28 Fw 60 NANOG Fw 60 NANOG Fw 61 OCT4 Fw 61 OCT4 Fw 62 OPN1M/LW Fw 62 OPN1M/LW Fw 63 OPN1SW Fw 63 OPN1SW Fw 64 RCV1 Fw 64 RCV1 Fw 65 S0X2 Fw 65 S0X2 Fw 66 ABCA4_ex5 Rv 66 ABCA4_ex5 Rv 67 ACTB_ex4 Rv 67 ACTB_ex4 Rv 68 ABCA4_ex31 Rv 68 ABCA4_ex31 Rv 69 ABCA4_ex21 Rv 69 ABCA4_ex21 Rv 70 CRX Rv 70 CRX Rv 71 LIN28 Rv 71 LIN28 Rv 72 NANOG Rv 72 NANOG Rv 73 OCT4 Rv 73 OCT4 Rv 7 4 OPN1M/LW Rv 7 4 OPN1M/LW Rv 75 OPN1SW Rv 75 OPN1SW Rv 76 RCV1 Rv 76 RCV1 Rv 77 S0X2 Rv 77 S0X2 Rv

80. Псевдоэкзон 6-7 (162).80. Pseudoexon 6-7 (162).

81. Увеличенная мишень псевдоэкзона 6-7 (162)+фланкирующие последовательности (+50 н.).81. Enlarged pseudoexon 6-7 target (162) + flanking sequences (+50 nt).

82. Увеличенная мишень псевдоэкзона 6-7 (162)+фланкирующие последовательности (+20 н.).82. Enlarged pseudoexon 6-7 target (162) + flanking sequences (+20 nt).

83. Сайт-мишень псевдоэкзона 6-7 (162) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+10 н.).83. Pseudoexon 6-7 target site (162) for AOH-1 and flanking sequences (+10 nt).

84. Сайт-мишень псевдоэкзона 6-7 (162) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+5 н.).84. Pseudoexon 6-7 target site (162) for AOH-1 and flanking sequences (+5 nt).

85. AOH-1 для псевдоэкзона 6-7 (162).85. AOH-1 for pseudoexon 6-7 (162).

86. Сайт-мишень псевдоэкзона 6-7 (162) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+10 н.).86. Pseudoexon 6-7 target site (162) for AOH-2 and flanking sequences (+10 nt).

87. Сайт-мишень псевдоэкзона 6-7 (162) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+5 н.).87. Pseudoexon 6-7 target site (162) for AOH-2 and flanking sequences (+5 nt).

88. AOH-2 для псевдоэкзона 6-7 (162).88. AOH-2 for pseudoexon 6-7 (162).

89. Сайт-мишень псевдоэкзона 6-7 (162) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+10 н.).89. Pseudoexon 6-7 target site (162) for AOH-3 and flanking sequences (+10 nt).

90. Сайт-мишень псевдоэкзона 6-7 (162) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+5 н.).90. Pseudoexon 6-7 target site (162) for AOH-3 and flanking sequences (+5 nt).

91. AOH-3 для псевдоэкзона 6-7 (162).91. AOH-3 for pseudoexon 6-7 (162).

100. Псевдоэкзон 7-8 (141).100. Pseudoexon 7-8 (141).

101. Увеличенная мишень псевдоэкзона 7-8 (141)+фланкирующие последовательности (+50 н.).101. Enlarged pseudoexon 7-8 target (141) + flanking sequences (+50 nt).

102. Увеличенная мишень псевдоэкзона 7-8 (141)+фланкирующие последовательности (+20 н.).102. Enlarged pseudoexon 7-8 target (141) + flanking sequences (+20 nt).

103. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (141) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+10 н.).103. Pseudoexon 7-8 target site (141) for AOH-1 and flanking sequences (+10 nt).

104. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (141) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+5 н.).104. Pseudoexon 7-8 target site (141) for AOH-1 and flanking sequences (+5 nt).

105. AOH-1 для псевдоэкзона 7-8 (141).105. AOH-1 for pseudoexon 7-8 (141).

106. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (141) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+10 н.).106. Pseudoexon 7-8 target site (141) for AOH-2 and flanking sequences (+10 nt).

107. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (141) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+5 н.).107. Pseudoexon 7-8 target site (141) for AOH-2 and flanking sequences (+5 nt).

108. AOH-2 для псевдоэкзона 7-8 (141).108. AOH-2 for pseudoexon 7-8 (141).

109. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (141) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+10 н.).109. Pseudoexon 7-8 target site (141) for AOH-3 and flanking sequences (+10 nt).

110. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (141) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+5 н.).110. Pseudoexon 7-8 target site (141) for AOH-3 and flanking sequences (+5 nt).

111. AOH-3 для псевдоэкзона 7-8 (141).111. AOH-3 for pseudoexon 7-8 (141).

120. Псевдоэкзон 7-8 (56).120. Pseudoexon 7-8 (56).

121. Увеличенная мишень псевдоэкзона 7-8 (56)+фланкирующие последовательности (+50 н.).121. Enlarged pseudoexon 7-8 target (56) + flanking sequences (+50 nt).

- 5 043834- 5 043834

122. Увеличенная мишень псевдоэкзона 7-8 (56)+фланкирующие последовательности (+20 н.).122. Enlarged pseudoexon 7-8 target (56) + flanking sequences (+20 nt).

123. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (56) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+10 н.).123. Pseudoexon 7-8 target site (56) for AOH-1 and flanking sequences (+10 nt).

124. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (56) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+5 н.).124. Pseudoexon 7-8 target site (56) for AOH-1 and flanking sequences (+5 nt).

125. AOH-1 для псевдоэкзона 7-8 (56).125. AOH-1 for pseudoexon 7-8 (56).

126. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (56) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+10 н.).126. Pseudoexon 7-8 target site (56) for AOH-2 and flanking sequences (+10 nt).

127. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (56) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+5 н.).127. Pseudoexon 7-8 target site (56) for AOH-2 and flanking sequences (+5 nt).

128. AOH-2 для псевдоэкзона 7-8 (56).128. AOH-2 for pseudoexon 7-8 (56).

129. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (56) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+10 н.).129. Pseudoexon 7-8 target site (56) for AOH-3 and flanking sequences (+10 nt).

130. Сайт-мишень псевдоэкзона 7-8 (56) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+5 н.).130. Pseudoexon 7-8 target site (56) for AOH-3 and flanking sequences (+5 nt).

131. AOH-3 для псевдоэкзона 7-8 (56).131. AOH-3 for pseudoexon 7-8 (56).

140. Псевдоэкзон 13-14 (134).140. Pseudoexon 13-14 (134).

141. Увеличенная мишень псевдоэкзона 13-14 (134)+фланкирующие последовательности ( + 50 н.).141. Enlarged target of pseudoexon 13-14 (134) + flanking sequences (+ 50 nt).

142. Увеличенная мишень псевдоэкзона 13-14 (134)+фланкирующие последовательности (+20 н.).142. Enlarged target of pseudoexon 13-14 (134) + flanking sequences (+20 nt).

143. Сайт-мишень псевдоэкзона 13-14 (134) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+10 н.).143. Pseudoexon 13-14 target site (134) for AOH-1 and flanking sequences (+10 nt).

144. Сайт-мишень псевдоэкзона 13-14 (134) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+5 н.).144. Pseudoexon 13-14 target site (134) for AOH-1 and flanking sequences (+5 nt).

145. AOH-1 для псевдоэкзона 13-14 (134).145. AOH-1 for pseudoexon 13-14 (134).

146. Сайт-мишень псевдоэкзона 13-14 (134) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+10 н.).146. Pseudoexon 13-14 target site (134) for AOH-2 and flanking sequences (+10 nt).

147. Сайт-мишень псевдоэкзона 13-14 (134) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+5 н.).147. Pseudoexon 13-14 target site (134) for AOH-2 and flanking sequences (+5 nt).

148. AOH-2 для псевдоэкзона 13-14 (134).148. AOH-2 for pseudoexon 13-14 (134).

149. Сайт-мишень псевдоэкзона 13-14 (134) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+10 н.).149. Pseudoexon 13-14 target site (134) for AOH-3 and flanking sequences (+10 nt).

150. Сайт-мишень псевдоэкзона 13-14 (134) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+5 н.).150. Pseudoexon 13-14 target site (134) for AOH-3 and flanking sequences (+5 nt).

151. AOH-3 для псевдоэкзона 13-14 (134).151. AOH-3 for pseudoexon 13-14 (134).

160. Псевдоэкзон 30-31 (68).160. Pseudoexon 30-31 (68).

161. Увеличенная мишень псевдоэкзона 30-31 (68)+фланкирующие последовательности (+50 н.).161. Enlarged target of pseudoexon 30-31 (68) + flanking sequences (+50 nt).

162. Увеличенная мишень псевдоэкзона 30-31 (68)+фланкирующие последовательности (+20 н.).162. Enlarged target of pseudoexon 30-31 (68) + flanking sequences (+20 nt).

163. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+10 н.).163. Pseudoexon 30-31 (68) target site for AOH-1 and flanking sequences (+10 nt).

164. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+5 н.).164. Target site of pseudoexon 30-31 (68) for AOH-1 and flanking sequences (+5 nt).

165. AOH-1 для псевдоэкзона 30-31 (68).165. AOH-1 for pseudoexon 30-31 (68).

166. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+10 н.).166. Target site of pseudoexon 30-31 (68) for AOH-2 and flanking sequences (+10 nt).

167. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+5 н.).167. Target site of pseudoexon 30-31 (68) for AOH-2 and flanking sequences (+5 nt).

168. AOH-2 для псевдоэкзона 30-31 (68).168. AOH-2 for pseudoexon 30-31 (68).

169. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+10 н.)169. Target site of pseudoexon 30-31 (68) for AOH-3 and flanking sequences (+10 nt.)

170. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (68) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+5 н.).170. Target site of pseudoexon 30-31 (68) for AOH-3 and flanking sequences (+5 nt).

171. AOH-3 для псевдоэкзона 30-31 (68).171. AOH-3 for pseudoexon 30-31 (68).

180. Псевдоэкзон 30-31 (345).180. Pseudoexon 30-31 (345).

181. Увеличенная мишень псевдоэкзона 30-31 (345)+фланкирующие последовательности (+20 н.).181. Enlarged target of pseudoexon 30-31 (345) + flanking sequences (+20 nt).

182. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+10 н.).182. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-1 and flanking sequences (+10 nt).

183. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+5 н.).183. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-1 and flanking sequences (+5 nt).

184. AOH-1 для псевдоэкзона 30-31 (345).184. AOH-1 for pseudoexon 30-31 (345).

185. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+10 н.).185. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-2 and flanking sequences (+10 nt).

186. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+5 н.).186. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-2 and flanking sequences (+5 nt).

187. AOH-2 для псевдоэкзона 30-31 (345).187. AOH-2 for pseudoexon 30-31 (345).

188. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+10 н.).188. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-3 and flanking sequences (+10 nt).

189. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+5 н.).189. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-3 and flanking sequences (+5 nt).

190. AOH-3 для псевдоэкзона 30-31 (345).190. AOH-3 for pseudoexon 30-31 (345).

191. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-4 и фланкирующие последовательности (+10 н.).191. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-4 and flanking sequences (+10 nt).

- 6 043834- 6 043834

192. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-4 и фланкирующие последовательности (+5192. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-4 and flanking sequences (+5

н.).n.).

193. AOH-4 для псевдоэкзона 30-31 (345).193. AOH-4 for pseudoexon 30-31 (345).

194. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-5 и фланкирующие последовательности (+10 н.).194. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-5 and flanking sequences (+10 nt).

195. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-5 и фланкирующие последовательности (+5 н.)195. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-5 and flanking sequences (+5 nt.)

196. AOH-5 для псевдоэкзона 30-31 (345).196. AOH-5 for pseudoexon 30-31 (345).

197. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-б и фланкирующие последовательности (+10 н.).197. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-b and flanking sequences (+10 nt).

198. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-б и фланкирующие последовательности (+5 н.).198. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-b and flanking sequences (+5 nt).

199. AOH-6 для псевдоэкзона 30-31 (345).199. AOH-6 for pseudoexon 30-31 (345).

200. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-7 и фланкирующие последовательности (+10 н.).200. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-7 and flanking sequences (+10 nt).

201. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-7 и фланкирующие последовательности (+5 н.)201. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-7 and flanking sequences (+5 nt.)

202. AOH-7 для псевдоэкзона 30-31 (345).202. AOH-7 for pseudoexon 30-31 (345).

203. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-8 и фланкирующие последовательности (+10 н.).203. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-8 and flanking sequences (+10 nt).

204. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-8 и фланкирующие последовательности (+5 н.).204. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-8 and flanking sequences (+5 nt).

205. AOH-8 для псевдоэкзона 30-31 (345).205. AOH-8 for pseudoexon 30-31 (345).

206. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-9 и фланкирующие последовательности (+10 н.).206. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-9 and flanking sequences (+10 nt).

207. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-9 и фланкирующие последовательности (+5 н.).207. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-9 and flanking sequences (+5 nt).

208. AOH-9 для псевдоэкзона 30-31 (345).208. AOH-9 for pseudoexon 30-31 (345).

209. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-10 и фланкирующие последовательности (+10 н.).209. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-10 and flanking sequences (+10 nt).

210. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-10 и фланкирующие последовательности (+5 н.).210. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-10 and flanking sequences (+5 nt).

211. AOH-10 для псевдоэкзона 30-31 (345).211. AOH-10 for pseudoexon 30-31 (345).

212. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-11 и фланкирующие последовательности (+10 н.).212. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-11 and flanking sequences (+10 nt).

213. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-11 и фланкирующие последовательности (+5 н.).213. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-11 and flanking sequences (+5 nt).

214. AOH-11 для псевдоэкзона 30-31 (345).214. AOH-11 for pseudoexon 30-31 (345).

215. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-12 и фланкирующие последовательности (+10 н.).215. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-12 and flanking sequences (+10 nt).

216. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-12 и фланкирующие последовательности (+5 н.).216. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-12 and flanking sequences (+5 nt).

217. AOH-12 для псевдоэкзона 30-31 (345).217. AOH-12 for pseudoexon 30-31 (345).

218. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-13 и фланкирующие последовательности (+10 н.).218. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-13 and flanking sequences (+10 nt).

219. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-13 и фланкирующие последовательности (+5 н.).219. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-13 and flanking sequences (+5 nt).

220. AOH-13 для псевдоэкзона 30-31 (345).220. AOH-13 for pseudoexon 30-31 (345).

221. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-14 и фланкирующие последовательности (+10 н.).221. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-14 and flanking sequences (+10 nt).

222. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-14 и фланкирующие последовательности (+5 н.).222. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-14 and flanking sequences (+5 nt).

223. AOH-14 для псевдоэкзона 30-31 (345).223. AOH-14 for pseudoexon 30-31 (345).

224. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-15 и фланкирующие последовательности (+10 н.).224. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-15 and flanking sequences (+10 nt).

225. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-15 и фланкирующие последовательности (+5 н.).225. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-15 and flanking sequences (+5 nt).

226. AOH-15 для псевдоэкзона 30-31 (345).226. AOH-15 for pseudoexon 30-31 (345).

227. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-16 и фланкирующие последовательности (+10 н.).227. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-16 and flanking sequences (+10 nt).

228. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-16 и фланкирующие последовательности (+5 н.).228. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-16 and flanking sequences (+5 nt).

- 7 043834- 7 043834

229. AOH-16 для псевдоэкзона 30-31 (345).229. AOH-16 for pseudoexon 30-31 (345).

230. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-17 и фланкирующие последовательности (+10230. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-17 and flanking sequences (+10

н.).n.).

231. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-17 и фланкирующие последовательности (+5 н.).231. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-17 and flanking sequences (+5 nt).

232. AOH-17 для псевдоэкзона 30-31 (345).232. AOH-17 for pseudoexon 30-31 (345).

233. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-18 и фланкирующие последовательности (+10 н.).233. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-18 and flanking sequences (+10 nt).

234. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-18 и фланкирующие последовательности (+5 н.).234. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-18 and flanking sequences (+5 nt).

235. AOH-18 для псевдоэкзона 30-31 (345).235. AOH-18 for pseudoexon 30-31 (345).

236. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-19 и фланкирующие последовательности (+10 н.).236. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-19 and flanking sequences (+10 nt).

237. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-19 и фланкирующие последовательности (+5 н.).237. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-19 and flanking sequences (+5 nt).

238. AOH-19 для псевдоэкзона 30-31 (345).238. AOH-19 for pseudoexon 30-31 (345).

239. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-20 и фланкирующие последовательности (+10 н.).239. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-20 and flanking sequences (+10 nt).

240. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-20 и фланкирующие последовательности (+5 н.).240. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-20 and flanking sequences (+5 nt).

241 AOH-20 для псевдоэкзона 30-31 (345).241 AOH-20 for pseudoexon 30-31 (345).

242 Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-21 и фланкирующие последовательности (+10 н.).242 Pseudoexon 30-31 target site (345) for AOH-21 and flanking sequences (+10 nt).

243. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-21 и фланкирующие последовательности (+5 н.).243. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-21 and flanking sequences (+5 nt).

244. AOH-21 для псевдоэкзона 30-31 (345).244. AOH-21 for pseudoexon 30-31 (345).

245. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-22 и фланкирующие последовательности (+10 н.).245. Pseudoexon 30-31 target site (345) for AOH-22 and flanking sequences (+10 nt).

246. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-22 и фланкирующие последовательности (+5 н.)246. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-22 and flanking sequences (+5 nt.)

247. AOH-22 для псевдоэкзона 30-31 (345).247. AOH-22 for pseudoexon 30-31 (345).

248. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-23 и фланкирующие последовательности (+10 н.).248. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-23 and flanking sequences (+10 nt).

249. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-23 и фланкирующие последовательности (+5 н.).249. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-23 and flanking sequences (+5 nt).

250. AOH-23 для псевдоэкзона 30-31 (345).250. AOH-23 for pseudoexon 30-31 (345).

251. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-24 и фланкирующие последовательности (+10 н.).251. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-24 and flanking sequences (+10 nt).

252 Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-24 и фланкирующие последовательности (+5 н.).252 Pseudoexon 30-31 target site (345) for AOH-24 and flanking sequences (+5 nt).

253 AOH-24 для псевдоэкзона 30-31 (345).253 AOH-24 for pseudoexon 30-31 (345).

254 Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-25 и фланкирующие последовательности (+10 н.).254 Pseudoexon 30-31 target site (345) for AOH-25 and flanking sequences (+10 nt).

255. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-25 и фланкирующие последовательности (+5 н.)255. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-25 and flanking sequences (+5 nt.)

256. AOH-25 для псевдоэкзона 30-31 (345).256. AOH-25 for pseudoexon 30-31 (345).

257. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-26 и фланкирующие последовательности (+10 н.).257. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-26 and flanking sequences (+10 nt).

258. Сайт-мишень псевдоэкзона 30-31 (345) для AOH-26 и фланкирующие последовательности (+5 н.).258. Target site of pseudoexon 30-31 (345) for AOH-26 and flanking sequences (+5 nt).

259. AOH-26 для псевдоэкзона 30-31 (345).259. AOH-26 for pseudoexon 30-31 (345).

260. Псевдоэкзон 36-37 (188).260. Pseudoexon 36-37 (188).

261. Увеличенная мишень псевдоэкзона 36-37 (188)+фланкирующие последовательности (+50 н.).261. Enlarged target of pseudoexon 36-37 (188) + flanking sequences (+50 nt).

262. Увеличенная мишень псевдоэкзона 36-37 (188)+фланкирующие последовательности (+20 н.).262. Enlarged target of pseudoexon 36-37 (188) + flanking sequences (+20 nt).

263. Сайт-мишень псевдоэкзона 36-37 (188) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+10 н.).263. Pseudoexon 36-37 (188) target site for AOH-1 and flanking sequences (+10 nt).

264. Сайт-мишень псевдоэкзона 36-37 (188) для AOH-1 и фланкирующие последовательности (+5 н.).264. Target site of pseudoexon 36-37 (188) for AOH-1 and flanking sequences (+5 nt).

265. AOH-1 для псевдоэкзона 36-37 (188).265. AOH-1 for pseudoexon 36-37 (188).

266. Сайт-мишень псевдоэкзона 36-37 (188) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+10 н.).266. Target site of pseudoexon 36-37 (188) for AOH-2 and flanking sequences (+10 nt).

267. Сайт-мишень псевдоэкзона 36-37 (188) для AOH-2 и фланкирующие последовательности (+5267. Target site of pseudoexon 36-37 (188) for AOH-2 and flanking sequences (+5

- 8 043834- 8 043834

н.).n.).

н.).n.).

н.).n.).

268. AOH-2 для псевдоэкзона 36-37 (188).268. AOH-2 for pseudoexon 36-37 (188).

269. Сайт-мишень псевдоэкзона 36-37 (188) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+10269. Target site of pseudoexon 36-37 (188) for AOH-3 and flanking sequences (+10

270. Сайт-мишень псевдоэкзона 36-37 (188) для AOH-3 и фланкирующие последовательности (+5270. Target site of pseudoexon 36-37 (188) for AOH-3 and flanking sequences (+5

271. AOH-3 для псевдоэкзона 36-37 (188).271. AOH-3 for pseudoexon 36-37 (188).

280. SON-1 (c.4539+2001C>A, смысловая версия АОН1 30-31 (345)).280. SON-1 (c.4539+2001C>A, semantic version of AON1 30-31 (345)).

281. SON-2 (c.4539+2001C>A, смысловая версия АОН4 30-31 (345)).281. SON-2 (c.4539+2001C>A, semantic version of AON4 30-31 (345)).

282. SON-3 (c.1937+435C>G, смысловая версия АОН2 13-14 (134)).282. SON-3 (c.1937+435C>G, semantic version of AON2 13-14 (134)).

290 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6-intron7 дикого типа290 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6-intron7 wild type

291 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6-intron7 С.769-784Т291 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6-intron7 S.769-784T

292 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6-intronl1 дикого типа 293 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6-intronl1 C.859-540G 294 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6-intronl1 С.859-506С 295 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intronll-intronl5 дикого типа 296 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intronll-intronl5 C.1937+435G 297 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron29-intron32 дикого типа 298 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron29-intron32 C.4539+1100G 299 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron29-intron32 C.4539+1106T 300 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron31-intron37 дикого типа 301 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron31-intron37 C.5197-557T 302 RHO_ex3 fw292 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6-intronl1 wild type 293 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6-intronl1 C.859-540G 294 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6-intronl1 C.859-506C 295 pCI -Neo-Rho-ABCA4-intronll-intronl5 wild type 296 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intronll-intronl5 C.1937+435G 297 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron29-intron32 wild type 298 pCI-Neo-Rho- ABCA4-intron29-intron32 C.4539+1100G 299 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron29-intron32 C.4539+1106T 300 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron31-intron37 wild type 301 pCI-Neo-Rho-ABCA4- intron31-intron37 C.5197-557T 302 RHO_ex3 fw

303 ABCA4_exl rev303 ABCA4_exl rev

304 ABCA4_exl fw304 ABCA4_exl fw

305 ABCA4_ex8 rev305 ABCA4_ex8 rev

306 ABCA4_exl3 fw306 ABCA4_exl3 fw

307 ABCA4_exl4 rev307 ABCA4_exl4 rev

308 ABCA4_ex30 fw308 ABCA4_ex30 fw

309 ABCA4_ex32 rev309 ABCA4_ex32 rev

310 ABCA4_ex32 fw310 ABCA4_ex32 fw

311 ABCA4 ex37 rev311 ABCA4 ex37 rev

Таблица 1Table 1

Характеристики антисмысловых олигонуклеотидов (AOH)Characteristics of Antisense Oligonucleotides (AOH)

Название Name SEQ ID NO: SEQ ID NO: Последовательность 5'—>3' Subsequence 5'—>3' Длина Length % GC %GC Тш (°C) Tsh (°C) АОН-1 для псевдоэкзона 30-31 (68) AON-1 for pseudoexon 30-31 (68) 15/165 15/165 GUAAUCUGUUCUGGACUU GUAAUCUGUUCUGGACUU 18 18 39 39 43,5 43.5 АОН-2 для псевдоэкзона 30-31 (68) AON-2 for pseudoexon 30-31 (68) 18/168 18/168 UAGAACUCCCAGGACAGG UAGAACUCCCAGGACAGG 18 18 56 56 50,3 50.3 АОН-3 для псевдоэкзона 30-31 (68) AON-3 for pseudoexon 30-31 (68) 21/171 21/171 CUAAAUC С С С CAGGAGAU CUAAAUC C C C CAGGAGAU 18 18 50 50 48 48

- 9 043834- 9 043834

АОН-1 для псевдоэкзона 6-7 (162) AON-1 for pseudoexon 6-7 (162) 85 85 GAUGGAAUCACUGAUCCUAG GAUGGAAUCACUGAUCCUAG 20 20 45 45 49, 7 49, 7 АОН-2 для псевдоэкзона 6-7 (162) AON-2 for pseudoexon 6-7 (162) 88 88 AGCUCCAGAGACUGAUGUGA AGCUCCAGAGACUGAUGUGA 20 20 50 50 51,8 51.8 АОН-3 для псевдоэкзона 6-7 (162) AON-3 for pseudoexon 6-7 (162) 91 91 CUCACCACUGCUCCUGC CUCACCACUGCUCCUGC 17 17 65 65 51,9 51.9 АОН-1 для псевдоэкзона 7-8 (141) AON-1 for pseudoexon 7-8 (141) 105 105 CCCACCAAGAUGGGGAUACU CCCACCAAGAUGGGGGAUACU 20 20 55 55 53, 8 53, 8 АОН-2 для псевдоэкзона 7-8 (141) AON-2 for pseudoexon 7-8 (141) 108 108 GGUUCUGUUGUC С САС CAAG GGUUCUGUUGUC WITH CAC CAAG 20 20 55 55 53, 8 53, 8 АОН-3 для псевдоэкзона 7-8 (141) AON-3 for pseudoexon 7-8 (141) 111 111 CAAAUCACAGACUGACССCU CAAAUCACAGACUGACCCCU 20 20 50 50 51,8 51.8 АОН-1 для псевдоэкзона 7-8 (56) AON-1 for pseudoexon 7-8 (56) 125 125 GACUGAGCAAUACUCCGUC GACUGAGCAAUACUCCGUC 19 19 53 53 51,1 51.1 АОН-2 для псевдоэкзона 7-8 (56) AON-2 for pseudoexon 7-8 (56) 128 128 AUCACAGAGUGACCCCUAG AUCACAGAGUGACCCCUAG 19 19 53 53 51,1 51.1 АОН-3 для псевдоэкзона 7-8 (56) AON-3 for pseudoexon 7-8 (56) 131 131 CUGAGCAAUACUCCGUCUG CUGAGCAAUACUCCGUCUG 19 19 53 53 51,1 51.1 АОН-1 для псевдоэкзона 13-14 (134) AON-1 for pseudoexon 13-14 (134) 145 145 CUCСCAGGAACCAGACCUA CUCCAGGAACCAGACCUA 19 19 58 58 53,2 53.2 АОН-2 для псевдоэкзона 13-14 (134) AON-2 for pseudoexon 13-14 (134) 148 148 GCUCAUCCAACACAUUCCUC GCUCAUCCAACACAUUCCUC 20 20 50 50 51,8 51.8 АОН-3 для псевдоэкзона Caller ID-3 for pseudoexon 151 151 CCUGGGAUGGGAGUGUC CCUGGGAAUGGGAGUGUC 17 17 65 65 51,9 51.9

- 10 043834- 10 043834

13-14 (134) 13-14 (134) АОН-1 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-1 for pseudoexon 30-31 (345) 35/184 35/184 ACAGGAGUCCUCAGCAUUG ACAGGAGUCCUCAGCAUUG 19 19 53 53 51,1 51.1 АОН-2 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-2 for pseudoexon 30-31 (345) 38/187 38/187 UUUUGUCCAGGGACCAAGG UUUUGUCCAGGGACCAAGG 19 19 53 53 51,1 51.1 АОН-3 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-3 for pseudoexon 30-31 (345) 41/190 41/190 CUGUUACAUUUUGUCCAGG CUGUUACAUUUUGUCCAGG 19 19 42 42 46, 8 46, 8 АОН-4 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-4 for pseudoexon 30-31 (345) 44/193 44/193 GGGGCACAGAGGACUGAGA GGGGCACAGAGGACUGAGA 19 19 63 63 55, 4 55, 4 АОН-5 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-5 for pseudoexon 30-31 (345) 196 196 GAGAGAAAAUAUUGCUUGAG АА GAGAGAAAAUAUUGCUUGAG AA 22 22 32 32 47,4 47.4 АОН-6 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-6 for pseudoexon 30-31 (345) 199 199 GCAGAUGAGCUGUGAUUCAA GCAGAUGAGCUGUGAUUCAA 20 20 45 45 49, 7 49, 7 АОН-7 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-7 for pseudoexon 30-31 (345) 202 202 UAUGAUGCAGCAGAUGAGCU G UAUGAUGCAGCAGAUGAGCU G 21 21 48 48 52,4 52.4 АОН-8 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-8 for pseudoexon 30-31 (345) 205 205 UGGGAUCCCUAUGAUGCAGC UGGGAUCCCUAUGAUGCAGC 20 20 55 55 53, 8 53, 8 АОН-9 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-9 for pseudoexon 30-31 (345) 208 208 AGAGGACUGAGACAAGUUCC AGAGGACUGAGACAAGUUCC 20 20 50 50 51,8 51.8 АОН-10 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-10 for pseudoexon 30-31 (345) 211 211 GCUUCCUCUUGGGGCACAGA GCUUCCUCUUGGGGCACAGA 20 20 60 60 55, 9 55, 9 АОН-11 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-11 for pseudoexon 30-31 (345) 214 214 CCUCAGCAUUGACAGCAA CCUCAGCAUUGACAGCAA 18 18 50 50 48 48 АОН-12 для AON-12 for 217 217 ACAGGAGCCCUCAGCAUUG ACAGGAGCCCUCAGCAUUG 19 19 58 58 53,2 53.2

- 11 043834- 11 043834

псевдоэкзона 30-31 (345) АОН-13 для псевдоэкзона 30-31 (345) pseudoexon 30-31 (345) AON-13 for pseudoexon 30-31 (345) 220 220 UGGAGGCAGCCACAGGAG UGGAGGGCAGCCACAGGAG 18 18 67 67 54, 9 54, 9 АОН-14 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-14 for pseudoexon 30-31 (345) 223 223 GAUGCUGGAGGGUUUUGAGU G GAUGCUGGAGGGGUUUUGAGU G 21 21 52 52 54,4 54.4 АОН-15 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-15 for pseudoexon 30-31 (345) 226 226 GAUGCUGGAGAGUUUUGAGU G GAUGCUGGAGAGUUUUGAGU G 21 21 48 48 52,4 52.4 АОН-16 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-16 for pseudoexon 30-31 (345) 229 229 GCCUUGACGUCCUGAUGCU GCCUUGACGUCCUGAUGCU 19 19 58 58 53,2 53.2 АОН-17 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-17 for pseudoexon 30-31 (345) 232 232 GCCAAGAGCUCAGGGUACAG GCCAAGAGCUCAGGGUACAG 20 20 60 60 55, 9 55, 9 АОН-18 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-18 for pseudoexon 30-31 (345) 235 235 CUUGGCCUCCCCUCCCUC CUUGGCCUCCCCUCCCUC 18 18 72 72 57,2 57.2 АОН-19 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-19 for pseudoexon 30-31 (345) 238 238 AACACCAUGUAGGUAGGC AACACCAUGUAGGUAGGC 18 18 50 50 48 48 АОН-20 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-20 for pseudoexon 30-31 (345) 241 241 GUUUAGGAAAUGAAACACCA UG GUUUAGGAAAUGAAACACCA U.G. 22 22 36 36 49, 2 49, 2 АОН-21 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-21 for pseudoexon 30-31 (345) 244 244 GACCGCGUGGAAGUAAGG GACCGCGUGGAAGUAAGG 18 18 61 61 52, 6 52, 6 АОН-22 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-22 for pseudoexon 30-31 (345) 247 247 AUAAGUUUCUAAGCUGGACA G AUAAGUUUCUAAGCUGGACA G 21 21 38 38 48,5 48.5 АОН-23 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-23 for pseudoexon 30-31 (345) 250 250 GGACCAAGGACCAACACUAC GGACCAAGGACCAACACUAC 20 20 55 55 53, 8 53, 8 АОН-24 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-24 for pseudoexon 30-31 (345) 253 253 GGCUGUUACAUUUUGUCCAG G GGCUGUUACAUUUUGUCCAG G 21 21 48 48 52,4 52.4 АОН-25 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-25 for pseudoexon 30-31 (345) 256 256 GGCAGGAACUGGCUUGCCUU GGCAGGAACUGGCUUGCCUU 20 20 60 60 55, 9 55, 9 АОН-26 для псевдоэкзона 30-31 (345) AON-26 for pseudoexon 30-31 (345) 259 259 AGAAGUGAAAGAAAAUGGCA GG AGAAGUGAAAGAAAAUGGCA GG 22 22 41 41 51,1 51.1 АОН-1 для псевдоэкзона 36-37 (188) AON-1 for pseudoexon 36-37 (188) 265 265 CAGAGUUGGGCACUGUUC CAGAGUUGGGCACUGUUC 18 18 56 56 50,3 50.3 АОН-2 для псевдоэкзона 36-37 (188) AON-2 for pseudoexon 36-37 (188) 268 268 GGCUGAUCUGGUGCAGG GGCUGAUCUGGUGCAGG 17 17 65 65 51,9 51.9 АОН-3 для псевдоэкзона 36-37 (188) AON-3 for pseudoexon 36-37 (188) 271 271 CUUACAGGAGGCUGAUCUG CUUACAGGAGGCUGAUCUG 19 19 53 53 51,1 51.1 SON-1 для псевдоэкзона 30-31 (345) SON-1 for pseudoexon 30-31 (345) 45/280 45/280 CAAUGCUGAGGACUCCUGU Смысловая версия АОН-1 (SEQ ID NO: 35/184) CAAUGCUGAGGACUCCUGU Semantic version AON-1 (SEQ ID NO: 35/184) 19 19 53 53 51,1 51.1 SON-2 для псевдоэкзона 30-31 (345) SON-2 for pseudoexon 30-31 (345) 281 281 UCUCAGUCCUCUGUGCCCC Смысловая версия АОН-4 (SEQ ID NO: 44/193) UCUCAGUCCUCUGUGCCCC Semantic version AON-4 (SEQ ID NO: 44/193) 19 19 63 63 55, 4 55, 4 SON-3 для псевдоэкзона 13-14 (134) SON-3 for pseudoexon 13-14 (134) 282 282 GAGGAAUGUGUUGGAUGAGC Смысловая версия АОН-2 (SEQ ID NO: 148) GAGGAAUGUGUUGGAUGAGC Semantic version AON-2 (SEQ ID NO: 148) 20 20 50 50 51,8 51.8

Некоторые мутации расположены внутри псевдоэкзона (например, когда мутация создает экзонныйSome mutations are located within a pseudoexon (for example, when a mutation creates an exon

- 12 043834 энхансер сплайсинга (ESE), который в свою очередь создает псевдоэкзон, мутация будет частью псевдоэкзона) AOH, сконструированные для перенаправления сплайсинга, будут иметь нарушение комплементарности в сайте мутации относительно последовательности дикого типа. Это касается AOH с SEQ ID- 12 043834 splicing enhancer (ESE), which in turn creates a pseudo-exon, the mutation will be part of the pseudo-exon) AOHs designed to redirect splicing will have a mismatch at the mutation site relative to the wild-type sequence. This applies to AOH with SEQ ID

NO: 35/184, 131 и 226 и SON с SEQ ID NO: 45/280; мутация относительно последовательности дикого типа выделена жирным шрифтом и подчеркнута.NO: 35/184, 131 and 226 and SON with SEQ ID NO: 45/280; mutation relative to the wild-type sequence is shown in bold and underlined.

Таблица 2table 2

Дополнительная информация по AOH для псевдоэкзона 30-31 (345)Additional AOH information for pseudoexon 30-31 (345)

АОН # AND HE # Областьмишень AreaTarget SF2 SF2 SC35 SC35 SRp40 SRp40 SRp55 SRp55 Тип области Area type Другие примеч ания Other note 5 5 интрон intron 0 0 0 0 1 1 0 0 Смешанная Mixed 6 6 акцептор acceptor 1 1 1 1 1 1 2 2 Смешанная Mixed 7 7 акцептор acceptor 1 1 1 1 2 2 2 2 Смешанная Mixed 8 8 Псевдоэкз он (ПЭ) Pseudoex on (PE) 0 0 2 2 2 2 2 2 Смешанная Mixed 9 9 ПЭ PE 0 0 1 1 2 2 0 0 Смешанная Mixed Частично перекрывается с АОН4 Partially overlaps with Caller ID4 4 4 ПЭ PE 1 1 3 3 3 3 0 0 Смешанная Mixed 10 10 ПЭ PE 2 2 3 3 1 1 0 0 Смешанная Mixed Частично перекрывается с АОН4 Partially overlaps with Caller ID4 11 eleven ПЭ PE 1 1 1 1 1 1 1 1 Смешанная Mixed Частично перекрывается с АОН1 Partially overlaps from Caller ID1 1 1 ПЭ PE 1 1 1 1 2 2 2 2 Смешанная Mixed Специфичный ДЛЯ с. 4539+2001G >А Specific FOR With. 4539+2001G >A 12 12 ПЭ PE 1 1 1 1 2 2 1 1 Смешанная Mixed Версия дикого типа для АОН1 Wild type version for AON1 13 13 ПЭ PE 0 0 2 2 2 2 2 2 Смешанная Mixed Частично перекрывается с АОН1 Partially overlaps from Caller ID1 14 14 ПЭ PE 1 1 1 1 2 2 1 1 Закрытая/0т крытая Closed/0t covered Версия дикого типа для АОН15 Wild type version for AON15 15 15 ПЭ PE 1 1 1 1 2 2 1 1 Закрытая/От Closed/From Специфичный Specific

- 13 043834- 13 043834

лонка 2 показывает положение относительно ПЭ. Колонки с 3 до 6 показывают число предсказанных мотивов экзонных энхансеров сплайсинга, т.е. SF2, SC35, SRp40 и SRp55, которые перекрываются соответствующими AOH. Колонка 7 показывает конфигурацию РНК в положении AOH, т.е. открытую, закрытую или смешанную конфигурацию.Column 2 shows the position relative to the PE. Columns 3 to 6 show the number of predicted exonic splicing enhancer motifs, i.e. SF2, SC35, SRp40 and SRp55, which are overlapped by the corresponding AOHs. Column 7 shows the configuration of the RNA at the AOH position, i.e. open, closed or mixed configuration.

Подробное описание изобретения.Detailed description of the invention.

По определению, AOH по существу являются комплементарными (антисмысловыми) по отношению к мишени, что позволяет им связываться с соответствующей молекулой пре-мРНК, таким образом предотвращая связывание белков, необходимых для сплайсинга. Как правило, такое отсутствие связывания приводит к пропуску целевого экзона, как было показано ранее авторами настоящего изобретения для мутации c.2991+1655A>G в СЕР290 (Collin et al., 2012; Garanto et al., 2016). Кроме того, AOH могут перенаправлять аппарат сплайсинга по направлению к соседним сайтам акцептора или донора сплайсинга. Это привело авторов изобретения к отбору мутаций ABCA4, которые также могут поддаваться терапии путем регуляции сплайсинга на основе AOH. Эти мутации представляют собой варианты глубоко в интронных областях, которые создают новые участки связывания акцептора сплайсинга, донора сплайсинга или экзонного энхансера сплайсинга, и приводят к включению псевдоэкзонов в мРНК соответствующего гена. AOH будут использоваться для блокирования распознавания псевдоэкзона (и следовательно индуцировать его пропуск), таким образом полностью восстанавливая транскрипт дикого типа и функцию соответствующего белка. Были отобраны следующие мутации:By definition, AOHs are essentially complementary (antisense) to the target, allowing them to bind to the corresponding pre-mRNA molecule, thereby preventing the binding of proteins required for splicing. Typically, this lack of binding results in skipping of the target exon, as previously shown by us for the c.2991+1655A>G mutation in CEP290 (Collin et al., 2012; Garanto et al., 2016). In addition, AOHs can redirect the splicing machinery toward adjacent splice acceptor or donor sites. This led us to screen for ABCA4 mutations that may also be amenable to AOH-based splicing regulation therapy. These mutations are variants deep in intronic regions that create new splice acceptor, splice donor, or exonic splice enhancer binding sites and result in the inclusion of pseudoexons in the mRNA of the corresponding gene. AOHs will be used to block pseudoexon recognition (and hence induce its skipping), thus completely restoring the wild-type transcript and the function of the corresponding protein. The following mutations were selected:

c.769-784C>T. Эта мутация приводит к вставке псевдоэкзона размером 162 н. между экзонами 6 и 7 ABCA4.c.769-784C>T. This mutation results in the insertion of a 162 nt pseudoexon. between exons 6 and 7 of ABCA4.

c.859-540C>G. Эта мутация приводит к вставке псевдоэкзона размером 141 н. между экзонами 7 и 8 ABCA4.c.859-540C>G. This mutation results in the insertion of a 141 nt pseudoexon. between exons 7 and 8 of ABCA4.

c.859-506G>C. Эта мутация приводит к вставке псевдоэкзона размером 56 н. между экзонами 7 и 8 ABCA4.c.859-506G>C. This mutation results in the insertion of a 56 nt pseudoexon. between exons 7 and 8 of ABCA4.

C.1937+435OG. Эта мутация приводит к вставке псевдоэкзона размером 134 н. между экзонами 13 и 14 ABCA4.C.1937+435OG. This mutation results in the insertion of a 134 nt pseudoexon. between exons 13 and 14 of ABCA4.

c.4539+1100A>G и c.4539+1106C>T. Эти мутации приводят к одинаковой вставке псевдоэкзона размером 68 н. между экзонами 30 и 31 ABCA4 и их можно, таким образом, подвергать воздействию одинаковых AOH.c.4539+1100A>G and c.4539+1106C>T. These mutations result in the same 68-nt pseudoexon insertion. between exons 30 and 31 of ABCA4 and can thus be exposed to the same AOHs.

c.4539+2001G>A и c.4539+2028C>T. Эти мутации приводят к одинаковой вставке псевдоэкзона размером 345 н. между экзонами 30 и 31 ABCA4 и их можно, таким образом, подвергать воздействию одинаковых AOH.c.4539+2001G>A and c.4539+2028C>T. These mutations result in the same 345-nt pseudoexon insertion. between exons 30 and 31 of ABCA4 and can thus be exposed to the same AOHs.

c.5197-557G>T. Эта мутация приводит к вставке псевдоэкзона размером 188 н. между экзонами 36 и 37 ABCA4.c.5197-557G>T. This mutation results in the insertion of a 188 nt pseudoexon. between exons 36 and 37 of ABCA4.

Авторы изобретения предлагают AOH для регуляции сплайсинга для вышеперечисленных классовThe inventors propose AOH for splicing regulation for the above classes

- 14 043834 мутаций; термины регуляция сплайсинга и перенаправить сплайсинг используются в настоящем изобретении взаимозаменяемо и включают в себя терапию путем регуляции сплайсинга на основе AOH для вышеперечисленных мутаций.- 14 043834 mutations; The terms splicing regulation and splicing redirect are used interchangeably in the present invention and include AOH-based splicing regulation therapy for the above mutations.

Таким образом, настоящее изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду для перенаправления сплайсинга, который:Thus, the present invention provides an antisense splice redirection oligonucleotide that:

комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SEQ ID NO: 261, или их части;complementary or substantially complementary to a polynucleotide having the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 or SEQ ID NO: 261, or part thereof;

предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 162, 181, 82, 102, 122, 142 или SEQ ID NO: 262, или их части;preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide with the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 162, 181, 82, 102, 122, 142 or SEQ ID NO: 262, or part thereof;

более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 160, 180, 80, 100, 120, 140 или SEQ ID NO: 260, или их части более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 31, или их части;more preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide having the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 160, 180, 80, 100, 120, 140 or SEQ ID NO: 260, or parts thereof, more preferably complementary or substantially complementary to the polynucleotide having the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 31, or part thereof;

более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 32, или их части;more preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide having the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 32, or a portion thereof;

более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, 16, 19, 163, 166, 169, 33, 36, 39, 42, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251, 254, 257, 83, 86, 89, 103, 106, 109, 123, 126, 129, 143, 146, 149, 263, 266 и SEQ ID NO: 269, или их части; и более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 17, 20, 164, 167, 170, 34, 37, 40, 43, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 84, 87, 90, 104, 107, 110, 124, 127, 130, 144, 147, 150, 264, 268 и SEQ ID NO: 270, или их части.more preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide with a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 13, 16, 19, 163, 166, 169, 33, 36, 39, 42, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251, 254, 257, 83, 86, 89, 89, 89, 89, 89. 103, 106, 109, 123, 126, 129, 143, 146, 149, 263, 266 and SEQ ID NO: 269, or parts thereof; and more preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide having a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 14, 17, 20, 164, 167, 170, 34, 37, 40, 43, 183, 186, 189, 192 , 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 84, 87, 9 0 , 104, 107, 110, 124, 127, 130, 144, 147, 150, 264, 268 and SEQ ID NO: 270, or parts thereof.

В настоящем изобретении упоминается SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 и SEQ ID NO: 261, или их части.The present invention refers to SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 and SEQ ID NO: 261, or parts thereof.

В контексте изобретения:In the context of the invention:

SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 16, 17, 19, 201, 60, 162, 163, 164, 166, 167, 169 и 170 или их части, каждая является предпочтительной частью SEQ ID NO: 10 и 161;SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 16, 17, 19, 201, 60, 162, 163, 164, 166, 167, 169 and 170 or parts thereof, each being a preferred part of SEQ ID NO: 10 and 161 ;

SEQ ID NO: 181, 180, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251, 254, 257, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255 и 258 или их части, каждая является предпочтительной частью SEQ ID NO: 30;SEQ ID NO: 181, 180, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251, 254, 257, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 2 10, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255 and 258 or parts thereof, each being a preferred part of SEQ ID NO: 30;

SEQ ID NO: 82, 80, 83, 86, 89, 84, 87 и 90 или их части, каждая является предпочтительной частью SEQ ID NO: 81;SEQ ID NO: 82, 80, 83, 86, 89, 84, 87 and 90 or parts thereof, each being a preferred part of SEQ ID NO: 81;

SEQ ID NO: 102, 100, 103, 106, 109, 104, 107 и 110 или их части, каждая является предпочтительной частью SEQ ID NO: 10;SEQ ID NO: 102, 100, 103, 106, 109, 104, 107 and 110 or parts thereof, each being a preferred part of SEQ ID NO: 10;

SEQ ID NO: 122, 120, 123, 126, 129, 124, 127 и 130 или их части, каждая является предпочтительной частью SEQ ID NO: 121;SEQ ID NO: 122, 120, 123, 126, 129, 124, 127 and 130 or parts thereof, each being a preferred part of SEQ ID NO: 121;

SEQ ID NO: 142, 140, 143, 146, 149, 144, 147 и 150 или их части, каждая является предпочтительной частью SEQ ID NO: 141;SEQ ID NO: 142, 140, 143, 146, 149, 144, 147 and 150 or parts thereof, each being a preferred part of SEQ ID NO: 141;

SEQ ID NO: 262, 260, 263, 266, 269, 264, 267 и 270 или их части, каждая является предпочтительной частью SEQ ID NO: 261.SEQ ID NO: 262, 260, 263, 266, 269, 264, 267 and 270, or parts thereof, each being a preferred part of SEQ ID NO: 261.

Термин пропуск экзона в настоящем изобретении определяют как индукцию, выработку или повышенную выработку в клетке зрелой мРНК, не содержащей конкретный экзон, который мог бы присутствовать в зрелой мРНК без пропуска экзона. Пропуск экзона получают путем снабжения клетки, экспрессирующей пре-мРНК указанной зрелой мРНК, молекулой, способной создавать помехи для последовательностей, таких как, например, последовательность (криптического) донора сплайсинга или (криптического) акцептора сплайсинга, необходимая для ферментативного процесса сплайсинга, или молекулой, которая способна создавать помехи для сигнала включения экзона, необходимого для распознавания участка нуклеотидов как экзона, который должен быть включен в зрелую мРНК; такие молекулы в настоящем изобретении обозначают как молекулы для пропуска экзона. Термин пре-мРНК относится к непроцессированному или частично процессированному предшественнику мРНК, который синтезируется путем транскрипции с матрицы ДНК в клетке, а именно, в ядре.The term exon skipping is defined herein as the induction, production or increased production in a cell of mature mRNA that does not contain a particular exon that would be present in the mature mRNA without exon skipping. Exon skipping is obtained by providing the cell expressing the pre-mRNA of the mature mRNA with a molecule capable of interfering with sequences, such as, for example, a (cryptic) splice donor or (cryptic) splice acceptor sequence required for the enzymatic splicing process, or a molecule which is capable of interfering with the exon inclusion signal necessary to recognize a stretch of nucleotides as an exon that should be included in the mature mRNA; such molecules are referred to herein as exon skipping molecules. The term pre-mRNA refers to the unprocessed or partially processed precursor mRNA that is synthesized by transcription from a DNA template in the cell, namely the nucleus.

Термин сохранение экзона в настоящем изобретении в настоящем изобретении определяют как индукцию, выработку или повышенную выработку в клетке зрелой мРНК, содержащей конкретный экзон, который должен присутствовать в зрелой мРНК без удаления (неправильного) экзона. Сохранение экзона получают путем снабжения клетки, экспрессирующей пре-мРНК, указанной зрелой мРНК, молекулой АОН, способной создавать помеху последовательностям, таким как, например, альтернативныеThe term exon retention in the present invention is defined in the present invention as the induction, production or increased production in a cell of a mature mRNA containing a specific exon that should be present in the mature mRNA without removing the (incorrect) exon. Exon conservation is obtained by providing the cell expressing the pre-mRNA of said mature mRNA with an AON molecule capable of interfering with sequences such as, for example, alternative

- 15 043834 сайты сплайсинга, расположенные до или после обычных сайтов сплайсинга. Термин антисмысловой олигонуклеотид или АОН понимают, как относящийся к олигонуклеотидной молекуле, содержащей нуклеотидную последовательность, которая по существу комплементарна нуклеотидной последовательности-мишени в молекуле пре-мРНК, гяРНК (гетерогенной ядерной РНК) или молекуле мРНК. Степень комплементарности (или комплементарность по существу) антисмысловой последовательности предпочтительно такова, что молекула, содержащая антисмысловую последовательность, может формировать стабильный гибрид с нуклеотидной последовательностью-мишенью в молекуле РНК в физиологических условиях.- 15 043834 splice sites located before or after regular splice sites. The term antisense oligonucleotide or AON is understood to refer to an oligonucleotide molecule containing a nucleotide sequence that is substantially complementary to a target nucleotide sequence in a pre-mRNA molecule, hnRNA (heterogeneous nuclear RNA) or mRNA molecule. The degree of complementarity (or substantially complementarity) of the antisense sequence is preferably such that the molecule containing the antisense sequence can form a stable hybrid with the target nucleotide sequence in the RNA molecule under physiological conditions.

Термины антисмысловой олигонуклеотид, АОН и олигонуклеотид в настоящем изобретении используют взаимозаменяемо и понимают, как относящиеся к олигонуклеотиду, содержащему антисмысловую последовательность. Специалист в данной области может с легкостью оценить связывание AOH со своей мишенью при помощи способов, известных в данной области, таких как анализ изменения подвижности геля, описанный в EP1619249. Термин по существу комплементарный при использовании в контексте изобретения указывает, что допускаются некоторые нарушения комплементарности в антисмысловой последовательности при условии сохранения функциональности, т.е. индуцирования пропуска экзона или сохранения экзона. Предпочтительно, комплементарность составляет от 90 до 100%. В основном допускается 1 или 2 нарушения комплементарности в AOH из 20 нуклеотидов или 1, 2, 3 или 4 нарушения комплементарности в AOH из 40 нуклеотидов, или 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нарушения комплементарности в AOH из 60 нуклеотидов, и т.д. Необязательно, указанный AOH можно дополнительно тестировать путем трансфекции клеток сетчатки пациентов. Пропуск экзона или сохранение экзона можно оценивать путем ОТ-ПЦР (такой, например, как описанная в EP 1619249). Комплементарные области предпочтительно сконструированы таким образом, что в сочетании они являются специфичными для экзона пре-мРНК. Такую специфичность можно создать при помощи различных длин комплементарных областей, поскольку она зависит от фактических последовательностей в других молекулах (пре-)мРНК в системе. Риск того, что AOH будет также способен гибридизироваться с одной или несколькими другими молекулами пре-мРНК снижается с увеличением размера AOH. Очевидно, что AOH, содержащие нарушения комплементарности в области комплементарности, но сохраняющие способность гибридизироваться и/или связываться с целевой областью/областями в пре-мРНК, можно использовать в изобретении. Однако, предпочтительно, по меньшей мере, комплементарные части не содержат такие нарушения комплементарности, поскольку AOH без нарушений комплементарности комплементарной части, как правило, имеют более высокую эффективность и более высокую специфичность, чем AOH с такими нарушениями комплементарности в одной или нескольких областях комплементарности. Считается, что более высокие силы гибридизации (т.е. увеличение числа взаимодействий с противоположной цепью) благоприятны для повышения эффективности вмешательства в аппарат сплайсинга системы.The terms antisense oligonucleotide, AON and oligonucleotide are used interchangeably in the present invention and are understood to refer to an oligonucleotide containing an antisense sequence. One skilled in the art can readily assess the binding of an AOH to its target using methods known in the art, such as the gel mobility shift assay described in EP1619249. The term substantially complementary, when used in the context of the invention, indicates that some complementarity violations in the antisense sequence are tolerated as long as functionality is maintained, i.e. inducing exon skipping or exon retention. Preferably, the complementarity is from 90 to 100%. Generally, 1 or 2 mismatches are allowed in a 20-nt AOH, or 1, 2, 3, or 4 mismatches in a 40-nt AOH, or 1, 2, 3, 4, 5, or 6 mismatches in a 60-nt AOH, and etc. Optionally, said AOH can be further tested by transfecting patient retinal cells. Exon skipping or exon retention can be assessed by RT-PCR (such as that described in EP 1619249). The complementary regions are preferably designed such that, in combination, they are specific to the pre-mRNA exon. Such specificity can be created by using different lengths of complementary regions, since it depends on the actual sequences in other (pre-)mRNA molecules in the system. The risk that an AOH will also be able to hybridize with one or more other pre-mRNA molecules decreases with increasing AOH size. It will be appreciated that AOHs containing complementarity defects in the complementarity region but retaining the ability to hybridize and/or bind to the target region/regions in the pre-mRNA can be used in the invention. However, preferably, at least the complementary moieties do not contain such complementarity violations, since AOHs without complementary moiety malfunctions generally have higher potency and higher specificity than AOHs with such complementarity violations in one or more complementarity regions. It is believed that higher hybridization forces (i.e., an increase in the number of interactions with the opposite strand) are favorable for increasing the efficiency of interference with the splicing machinery of the system.

АОН по изобретению предпочтительно не содержит участка CpG, более предпочтительно, не содержит никаких CpG. Присутствие CpG или фрагмента CpG в олигонуклеотиде, как правило, связано с повышенной иммуногенностью указанного олигонуклеотида (Dorn и KipnSnberger, 2008). Повышенная иммуногенность нежелательна, поскольку она может вызвать повреждение ткани, которую лечат, т.е. глаза. Иммуногенность можно оценивать на модели на животных путем оценки присутствия клеток CD4+ и/или CD8+ и/или воспалительной инфильтрации мононуклеарами. Иммуногенность можно также оценивать в крови животного или человека, которого лечат AOH по изобретению, выявляя присутствие нейтрализующего антитела и/или антитела, распознающего указанный AOH, при помощи стандартного иммунологического анализа, известного специалисту. Воспалительную реакцию, выработку интерферона типа I, выработку IL-12 и/или повышение иммуногенности можно оценивать, выявляя наличие или повышенное количество нейтрализующего антитела или антитела, распознающего указанный AOH, при помощи стандартного иммунологического анализа. AOH по изобретению еще более предпочтительно имеет приемлемую кинетику связывания с РНК и/или термодинамические свойства. Кинетика связывания с РНК и/или термодинамические свойства, по меньшей мере, частично определяются температурой плавления олигонуклеотида (Tm; рассчитывается при помощи калькулятора свойств олигонуклеотида (www.unc.edu/-cail/biotool/oligo/index) для одноцепочечной РНК с использованием базовой Tm и модели ближайшего соседа), и/или свободной энергией комплекса AOH-целевой экзон (при помощи RNA structure, версии 4.5). Если Tm слишком высокая, ожидается, что AOH будет менее специфичным. Приемлемая Tm и свободная энергия зависят от последовательности AOH. Таким образом, сложно получить предпочтительные диапазоны для каждого из этих параметров. Приемлемая Tm может находиться в диапазоне между 35 и 7 0°С, а приемлемая свободная энергия может находиться в диапазоне между 15 и 45 кКал/моль. Специалист, таким образом, может сначала выбрать AOH в качестве потенциального терапевтического соединения, который связывается и/или комплементарен SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SEQ ID NO: 261, или их частям, как определено далее в настоящем изобретении. Специалист может проверить, что указанный AOH способен связываться с указанными последовательностями, как ранее определено в настоящем изобретении. Необязательно на втором этапе, он может использовать изобретение для дополнительной оптимизации указанного AOH, проверяя его на отсутствие CpG и/или оптимизируя его Tm и/или свободную энергию комплекса AOH-мишень. Он может пытаться сконструиThe AON of the invention preferably does not contain a CpG region, more preferably does not contain any CpGs. The presence of a CpG or CpG fragment in an oligonucleotide is generally associated with increased immunogenicity of said oligonucleotide (Dorn and Kipn Snberger, 2008). Increased immunogenicity is undesirable as it may cause damage to the tissue being treated, i.e. eyes. Immunogenicity can be assessed in an animal model by assessing the presence of CD4+ and/or CD8+ cells and/or inflammatory mononuclear cell infiltration. Immunogenicity can also be assessed in the blood of an animal or human being treated with an AOH of the invention by detecting the presence of a neutralizing antibody and/or an antibody recognizing said AOH using a standard immunoassay known to one skilled in the art. The inflammatory response, type I interferon production, IL-12 production, and/or increased immunogenicity can be assessed by detecting the presence or increased amount of neutralizing antibody or antibody recognizing the specified AOH using a standard immunoassay. The AOH of the invention even more preferably has acceptable RNA binding kinetics and/or thermodynamic properties. RNA binding kinetics and/or thermodynamic properties are at least partially determined by the oligonucleotide melting temperature (Tm; calculated using the Oligonucleotide Properties Calculator (www.unc.edu/-cail/biotool/oligo/index) for single-stranded RNA using the base Tm and nearest neighbor models), and/or the free energy of the AOH-target exon complex (using RNA structure, version 4.5). If Tm is too high, AOH is expected to be less specific. Acceptable Tm and free energy depend on the AOH sequence. Thus, it is difficult to obtain preferred ranges for each of these parameters. Acceptable Tm may be between 35 and 7 0°C, and acceptable free energy may be between 15 and 45 kcal/mol. One skilled in the art may thus first select an AOH as a potential therapeutic compound that binds and/or is complementary to SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 or SEQ ID NO: 261, or portions thereof, such as as further defined in the present invention. One skilled in the art can verify that said AOH is capable of binding to said sequences as previously defined in the present invention. Optionally in a second step, he can use the invention to further optimize said AOH by testing it for the absence of CpG and/or optimizing its Tm and/or free energy of the AOH-target complex. He may try to construct

- 16 043834 ровать AOH с несколькими CpG, предпочтительно, с отсутствием CpG и/или с более приемлемой Tm и/или свободной энергией, получая его путем выбора определенной последовательности ABCA4 (включая SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 и SEQ ID NO: 261, или их части), которой комплементарен AOH. Альтернативно, если AOH комплементарен указанному фрагменту в пределах SEQ ID NO: 10 или 30, содержит CpG, и/или не имеет приемлемой Tm и/или свободной энергии, специалист может улучшить любые из этих параметров, уменьшая длину AOH, и/или выбирая определенный фрагмент в SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SEQ ID NO: 261, которому комплементарен AOH, и/или изменяя химию AOH.- 16 043834 create an AOH with multiple CpGs, preferably with no CpG and/or with a more suitable Tm and/or free energy, obtained by selecting a specific ABCA4 sequence (including SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 and SEQ ID NO: 261, or parts thereof) to which AOH is complementary. Alternatively, if the AOH is complementary to the specified fragment within SEQ ID NO: 10 or 30, contains a CpG, and/or does not have an acceptable Tm and/or free energy, one skilled in the art can improve any of these parameters by reducing the length of the AOH, and/or selecting a specific fragment in SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 or SEQ ID NO: 261, to which AOH is complementary, and/or changing the chemistry of AOH.

Считается, что AOH по изобретению индуцирует пропуск экзона, если процент пропуска при измерении количественной ОТ-ПЦР в реальном времени составляет, по меньшей мере, 30, или, по меньшей мере, 35, или, по меньшей мере, 40, или, по меньшей мере, 45, или, по меньшей мере, 50, или, по меньшей мере, 55, или, по меньшей мере, 60, или, по меньшей мере, 65, или, по меньшей мере, 70, или, по меньшей мере, 75, или, по меньшей мере, 80, или, по меньшей мере, 85, или, по меньшей мере, 90, или, по меньшей мере, 95, или 100%.An AOH of the invention is considered to induce exon skipping if the skipping percentage as measured by quantitative real-time RT-PCR is at least 30, or at least 35, or at least 40, or at least at least 45, or at least 50, or at least 55, or at least 60, or at least 65, or at least 70, or at least 75, or at least 80, or at least 85, or at least 90, or at least 95, or 100%.

Считается, что AOH по изобретению индуцирует сохранение экзона, если процент сохранения при измерении количественной ОТ-ПЦР в реальном времени составляет, по меньшей мере, 30, или, по меньшей мере, 35, или, по меньшей мере, 40, или, по меньшей мере, 45, или, по меньшей мере, 50, или, по меньшей мере, 55, или, по меньшей мере, 60, или, по меньшей мере, 65, или, по меньшей мере, 70, или, по меньшей мере, 75, или, по меньшей мере, 80, или, по меньшей мере, 85, или, по меньшей мере, 90, или, по меньшей мере, 95, или 100%.The AOH of the invention is considered to induce exon retention if the percentage of retention as measured by quantitative real-time RT-PCR is at least 30, or at least 35, or at least 40, or at least at least 45, or at least 50, or at least 55, or at least 60, or at least 65, or at least 70, or at least 75, or at least 80, or at least 85, or at least 90, or at least 95, or 100%.

Предпочтительно, AOH по изобретению, содержащий часть, которая (по существу) комплементарна SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SeQ ID NO: 261, или их части, представляет собой AOH, где (по существу) комплементарная часть составляет, по меньшей мере, 50 длины AOH по изобретению, более предпочтительно, по меньшей мере, 60, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 70, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 80, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90 или даже более предпочтительно, по меньшей мере, 95, или даже более предпочтительно 98 или даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99, или даже более предпочтительно 100%.Preferably, the AOH of the invention containing a portion that is (substantially) complementary to SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 or SeQ ID NO: 261, or portions thereof, is an AOH wherein essentially) the complementary part is at least 50 times the length of the AOH according to the invention, more preferably at least 60, even more preferably at least 70, even more preferably at least 80, even more preferably according to at least 90 or even more preferably at least 95, or even more preferably 98 or even more preferably at least 99, or even more preferably 100%.

Предпочтительно, AOH по изобретению содержит или включает последовательность, которая комплементарна или по существу комплементарна части SEQ ID NO: 10 или 30. В качестве примера, AOH может содержать последовательность, которая комплементарна или по существу комплементарна части SEQ ID NO: 10 или 30 и содержит дополнительные фланкирующие последовательности.Preferably, the AOH of the invention contains or includes a sequence that is complementary or substantially complementary to a portion of SEQ ID NO: 10 or 30. As an example, an AOH may contain a sequence that is complementary or substantially complementary to a portion of SEQ ID NO: 10 or 30 and contains additional flanking sequences.

Предпочтительно, AOH по изобретению представляет собой AOH, где часть, которая (по существу) комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 30, или их части, содержит, по меньшей мере, один мотив ESE (экзонный энхансер сплайсинга), предпочтительно два, три, четыре или более мотивов ESE. Мотивы ESE известны специалисту в данной области. Выявление и определение ESE предпочтительно проводят так же, как и в примерах в настоящем изобретении. В варианте осуществления, AOH по изобретению не содержит мотив ESE.Preferably, the AOH of the invention is an AOH wherein the portion that is (substantially) complementary to a polynucleotide with the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 30, or a portion thereof, contains at least one ESE motif (exonic splicing enhancer), preferably two, three, four or more ESE motifs. ESE motifs are known to one skilled in the art. The detection and determination of ESE is preferably carried out in the same way as in the examples in the present invention. In an embodiment, the AOH of the invention does not contain an ESE motif.

Предпочтительно, AOH по изобретению представляет собой AOH, где часть, которая (по существу) комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SEQ ID NO: 261, или их части, имеет длину приблизительно от 8 до приблизительно 40 нуклеотидов, а именно, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотида.Preferably, the AOH of the invention is an AOH wherein the portion that is (substantially) complementary to a polynucleotide with the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 or SEQ ID NO: 261, or portions thereof, has a length of from about 8 to about 40 nucleotides, namely, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides.

Предпочтительно, AOH по изобретению представляет собой AOH, где часть, которая (по существу) комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SEQ ID NO: 261, или их части, имеет длину от 8 до 40, а именно, предпочтительно от 10 до 40, более предпочтительно от 14 до 30, более предпочтительно от 16 до 24 нуклеотидов, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотида.Preferably, the AOH of the invention is an AOH wherein the portion that is (substantially) complementary to a polynucleotide with the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 or SEQ ID NO: 261, or parts thereof, has a length of from 8 to 40, namely preferably from 10 to 40, more preferably from 14 to 30, more preferably from 16 to 24 nucleotides, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23 or 24 nucleotides.

Предпочтительно, AOH по изобретению представляет собой AOH, где часть, которая (по существу) комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SEQ ID NO: 261, или их части, имеет длину, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, или 40 нуклеотидов, и указанная часть, которая (по существу) комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SeQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SEQ ID NO: 261, или их части, или их части, имеет длину не более 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, или 40 нуклеотидов.Preferably, the AOH of the invention is an AOH wherein the portion that is (substantially) complementary to a polynucleotide with the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 or SEQ ID NO: 261, or parts thereof, has a length of at least 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, or 40 nucleotides, and said portion that is (substantially) complementary to a polynucleotide with the nucleotide sequence consisting of SeQ ID NO: 10 , 161, 30, 81, 101, 121, 141 or SEQ ID NO: 261, or parts thereof, or parts thereof, is not more than 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 in length , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, or 40 nucleotides.

Дополнительные последовательности (по существу) комплементарной части можно использовать для модификации связывания белка, такого как фактор, способствующий сплайсингу, с AOH, или для модификации термодинамического свойства AOH, а именно, для модификации аффинности связывания с целевой РНК.Additional (substantially) complementary moiety sequences can be used to modify the binding of a protein, such as a splicing factor, to AOH, or to modify the thermodynamic property of AOH, namely, to modify the binding affinity to the target RNA.

Предпочтительный AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга имеет длину приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, болееThe preferred AOH of the invention for splicing redirection has a length of from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more

- 17 043834 предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до 24 нуклеотидов, такую как 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов.- 17043834 preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to 24 nucleotides, such as 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides.

Более предпочтительный AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга имеет длину от 8 до 100, предпочтительно от 10 до 40, более предпочтительно от 14 до 30, более предпочтительно от 16 до нуклеотидов, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов.A more preferred AOH of the invention for splicing redirection has a length of from 8 to 100, preferably from 10 to 40, more preferably from 14 to 30, more preferably from 16 to nucleotides, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides.

Предпочтительно, AOH по изобретению имеет длину, по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов.Preferably, the AOH of the invention has a length of at least 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 or 40 nucleotides.

Предпочтительно, AOH по изобретению имеет длину не более чем 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,Preferably, the AOH of the invention has a length of no more than 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.

18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,

48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,

78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 нуклеотидов.78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100 nucleotides.

В варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 18, 21, 165, 168, 171, 35, 38, 41, 44, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259, 85, 88, 91, 105, 108, 111, 125, 128, 131, 145, 148, 151, 265, 268 и SEQ ID NO: 271.In an embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, 18, 21, 165, 168, 171, 35, 38, 41, 44, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259, 85, 88, 91, 91, 91. 105, 108, 111, 125, 128, 131, 145, 148, 151, 265, 268 and SEQ ID NO: 271.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 15, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,In a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 15 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 18, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,In a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 18 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 21, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,In a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 21 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 35. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 35, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,In a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 35. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 35 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 38. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 38, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24 нуклеотидов, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,In a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 38. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 38 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24 nucleotides, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,

- 18 043834- 18 043834

38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,

68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,

98, 99 или 100 нуклеотидов.98, 99 or 100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 41, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,In a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 41. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 41 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 44. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 44, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,In a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 44. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 44 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 165. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 165, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,In a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 165. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 165 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 168. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 168, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,In a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 168. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 168 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 171. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 171, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,In a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 171. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 171 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 184. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 184, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,In a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 184. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 184 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

- 19 043834- 19 043834

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 187. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 187, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 187. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 187 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 190. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 190, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 190. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 190 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 193. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 193, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 193. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 193 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 196. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 196, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 196. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 196 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 199. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 199, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,In a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 199. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 199 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, или 100 нуклеотиды.100 nucleotides 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 202. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 202, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 202. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 202 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes

- 20 043834 последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 205. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 205, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает- 20043834 a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 205. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 205 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 208. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 208, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 208. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 208 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 211 Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 211, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 211. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 211 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40 , more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 214. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 214, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 214. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 214 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 217. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 217, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,In a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 217. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 217 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, или 100 нуклеотиды.100 nucleotides 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 220. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 220, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 220. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 220 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 223. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 223, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100,In a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 223. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 223 preferably contains from about 8 to about 100,

- 21 043834 предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает- 21 043834 preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides , or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 226. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 226, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 226. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 226 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 229. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 229, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 229. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 229 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 232. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 232, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 232. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 232 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 235. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 235, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,In a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 235. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 235 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, или 100 нуклеотиды.100 nucleotides, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 238. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 238, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 238. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 238 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 241. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 241, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, аIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 241. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 241 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, and

- 22 043834 именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает- 22 043834 namely, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 244. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 244, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 244. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 244 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 247. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 247, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 247. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 247 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 250. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 250, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100 нуклеотидов, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40 нуклеотидов, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24 нуклеотидов, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,In a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 250. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 250 preferably contains from about 8 to about 100 nucleotides, preferably from about 10 to about 40 nucleotides, more preferably about 14 to about 30 nucleotides, more preferably about 16 to about 24 nucleotides, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,

26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55,26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55,

56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,

86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 нуклеотидов.86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 253. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 253, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 253. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 253 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 256. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 256, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 256. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 256 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 259. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 259, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,In a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 259. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 259 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40,

- 23 043834- 23 043834

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 85. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 85, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 85. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 85 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 88. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 88, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 88. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 88 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 91. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 91, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 91. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 91 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 105. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 105, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 105. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 105 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 108. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 108, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 108. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 108 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 111. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 111, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 111. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 111 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

- 24 043834- 24 043834

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 125. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 125, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 125. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 125 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 128. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 128, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,In a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 128. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 128 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, или 100 нуклеотиды.100 nucleotides, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 131. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 131, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 131. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 131 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 145. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 145, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 145. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 145 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 148. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 148, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 148. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 148 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 151. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 151, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 151. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 151 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes

- 25 043834 последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 265. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 265, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включает- 25 043834 a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 265. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 265 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 268. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 268, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 268. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 268 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

В предпочтительном варианте осуществления предлагается AOH, который содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 271. Предпочтительный AOH, включающий SEQ ID NO: 271, предпочтительно содержит приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно приблизительно от 16 до приблизительно 24, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, или предпочтительно содержит или включаетIn a preferred embodiment, an AOH is provided that contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 271. A preferred AOH comprising SEQ ID NO: 271 preferably contains from about 8 to about 100, preferably from about 10 to about 40, more preferably from about 14 to about 30, more preferably from about 16 to about 24, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides, or preferably contains or includes

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or

100 нуклеотидов.100 nucleotides.

АОН по изобретению для перенаправления сплайсинга может содержать один или несколько остатков РНК (рибонуклеотида), или один или несколько остатков ДНК (дезоксирибонуклеотида), и/или один или несколько аналогов или эквивалентов нуклеотида, как будет подробно описано далее в настоящем изобретении.The AON of the invention for splicing redirection may comprise one or more RNA residues (ribonucleotide), or one or more DNA residues (deoxyribonucleotide), and/or one or more nucleotide analogs or equivalents, as will be described in detail later in the present invention.

Предпочтительно, чтобы АОН по изобретению для перенаправления сплайсинга содержал один или несколько остатков, которые модифицированы для того чтобы повысить устойчивость к нуклеазам, и/или чтобы увеличить аффинность антисмыслового олигонуклеотида к целевой последовательности. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления AOH содержит, по меньшей мере, один нуклеотидный аналог или эквивалент, где нуклеотидный аналог или эквивалент определяют как остаток с модифицированным основанием, и/или модифицированным остовом, и/или с неприродной межнуклеозидной связью, или с комбинацией этих модификаций.Preferably, the AON of the invention for splicing redirection contains one or more residues that are modified to increase nuclease resistance and/or to increase the affinity of the antisense oligonucleotide for the target sequence. Thus, in a preferred embodiment, the AOH contains at least one nucleotide analogue or equivalent, wherein a nucleotide analogue or equivalent is defined as a residue with a modified base, and/or a modified backbone, and/or a non-natural internucleoside linkage, or a combination of these modifications.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеотидный аналог или эквивалент содержит модифицированный остов. Примеры таких остовов представлены морфолиновыми остовами, карбаматными остовами, силоксановыми остовами, сульфидными, сульфоксидными и сульфоновыми остовами, формаацетиловыми и тиоформацетиловыми остовами, метиленформацетиловыми остовами, рибоацетиловыми остовами, алкен-содержащими остовами, сульфаматными, сульфонатными и сульфонамидными остовами, метилениминовыми и метиленгидразиновыми остовами, и амидными остовами.In a preferred embodiment, the nucleotide analogue or equivalent contains a modified backbone. Examples of such backbones include morpholine backbones, carbamate backbones, siloxane backbones, sulfide, sulfoxide and sulfone backbones, formaacetyl and thioformacetyl backbones, methyleneformacetyl backbones, riboacetyl backbones, alkene-containing backbones, sulfamate, sulfonate and sulfonamide backbones, methylene imine and methylene hydrazine backbones, and amide skeletons.

Фосфородиамидатморфолиновые олигомеры представляют собой олигонуклеотиды с модифицированным остовом, которые ранее были исследованы как антисмысловые агенты.Phosphorodiamidate-morpholine oligomers are backbone-modified oligonucleotides that have previously been investigated as antisense agents.

Морфолиновые олигонуклеотиды имеют незаряженный остов, в котором дезоксирибозный сахар ДНК замещен шестичленным кольцом, а фосфодиэфирная связь замещена фосфороамидатной связью. Морфолиновые олигонуклеотиды устойчивы к ферментативному разрушению и, по-видимому, функционируют как антисмысловые агенты путем ареста трансляции или препятствуя сплайсингу пре-мРНК, а не путем активации РНКазы Н. Морфолиновые олигонуклеотиды успешно доставляли в тканевую культуру клеток при помощи способов, которые физически разрушают клеточную мембрану, и одно исследование, в котором сравнивали эти способы, выявило, что введение при соскабливании является наиболее эффективным способом доставки; однако, поскольку морфолиновый остов не заряжен, катионные липиды не являются эффективными медиаторами захвата морфолиновых олигонуклеотидов в клетки. Недавняя статья показала формирование триплекса морфолиновым олигонуклеотидом, и, из-за неионного остова, эти исследования показали, что морфолиновый олигонуклеотид был способен формировать триплекс в отсутствие магния.Morpholine oligonucleotides have an uncharged backbone in which the deoxyribose sugar of DNA is replaced by a six-membered ring and the phosphodiester bond is replaced by a phosphoramidate bond. Morpholine oligonucleotides are resistant to enzymatic degradation and appear to function as antisense agents by arresting translation or interfering with pre-mRNA splicing rather than by activating RNase H. Morpholine oligonucleotides have been successfully delivered into tissue culture cells using methods that physically disrupt the cell membrane , and one study comparing these methods found scraping administration to be the most effective delivery method; however, since the morpholine backbone is uncharged, cationic lipids are not effective mediators of morpholine oligonucleotide uptake into cells. A recent paper showed triplex formation by a morpholine oligonucleotide, and, due to the nonionic backbone, these studies showed that the morpholine oligonucleotide was capable of triplex formation in the absence of magnesium.

Еще более предпочтительно, чтобы связь между остатками остова не включала атом фосфора, а именно, связь, которая образована межнуклеозидными связями короткоцепочечного алкила или цикло- 26 043834 алкила, межнуклеозидными связями смешанного гетероатома и алкила или циклоалкила, или межнуклеозидными связями одного или нескольких короткоцепочечных гетероатомов или гетероциклов.Even more preferably, the bond between the backbone residues does not include a phosphorus atom, namely, a bond that is formed by short-chain alkyl or cycloalkyl internucleoside bonds, mixed heteroatom-alkyl or cycloalkyl internucleoside bonds, or one or more short-chain heteroatom internucleoside bonds, or heterocycles.

Предпочтительный нуклеотидный аналог или эквивалент содержит пептид-нуклеиновую кислоту (ПНК), с модифицированным полиамидным остовом (Nielsen et al., 1991). Молекулы на основе ПНК являются истинными миметиками молекул ДНК в отношении распознавания по парам оснований. Остов ПНК состоит из единиц №(2-аминоэтил)-глицина, связанных пептидными связями, где нуклеиновые основания связаны с остовом метиленкарбонильными связями. Альтернативный остов содержит одноуглеродный протяженный пирролидиновый мономер ПНК (Govindaraju и Kumar, 2005). Поскольку остов молекулы ПНК не содержит заряженных фосфатных групп, гибриды ПНК-РНК, как правило, более стабильны, чем гибриды РНК-РНК или РНК-ДНК, соответственно (Egholm et al., 1993). Еще более предпочтительный остов содержит морфолиновый нуклеотидный аналог или эквивалент, в котором сахар рибозы или дезоксирибозы замещен шестичленным морфолиновым кольцом. Наиболее предпочтительный нуклеотидный аналог или эквивалент содержит фосфороамидатморфолиновый олигомер (РМО), в котором сахар рибозы или дезоксирибозы замещен шестичленным морфолиновым кольцом, а анионная фосфодиэфирная связь между соседними морфолиновыми кольцами замещена неионной фосфороамидатной связью.The preferred nucleotide analogue or equivalent comprises a peptide nucleic acid (PNA) with a modified polyamide backbone (Nielsen et al., 1991). PNA-based molecules are true mimetics of DNA molecules in terms of base pair recognition. The PNA backbone consists of Na(2-aminoethyl)-glycine units linked by peptide bonds, where the nucleobases are linked to the backbone by methylenecarbonyl bonds. An alternative backbone contains the one-carbon extended pyrrolidine monomer PNA (Govindaraju and Kumar, 2005). Because the backbone of the PNA molecule does not contain charged phosphate groups, PNA-RNA hybrids are generally more stable than RNA-RNA or RNA-DNA hybrids, respectively (Egholm et al., 1993). An even more preferred backbone comprises a morpholine nucleotide analogue or equivalent in which the ribose or deoxyribose sugar is replaced by a six-membered morpholine ring. The most preferred nucleotide analog or equivalent comprises a phosphoamidate morpholine oligomer (PMO) in which the ribose or deoxyribose sugar is replaced by a six-membered morpholine ring and the anionic phosphodiester bond between adjacent morpholine rings is replaced by a nonionic phosphoamidate bond.

Еще в одном дополнительном варианте осуществления нуклеотидный аналог или эквивалент по изобретению содержит замену одного не-мостиковых кислородов в фосфодиэфирной связи. Такая модификация слегка дестабилизирует спаривание, но добавляет дополнительную устойчивость к разрушению нуклеазами. Предпочтительный нуклеотидный аналог или эквивалент содержит тиофосфат, хиральный тиофосфат, фосфородитиоат, фосфотриэфир, аминоалкилфосфотриэфир, Н-фосфонат, метил и другой алкилфосфонат, включая 3'-алкилен фосфонат, 5'-алкилен фосфонат и хиральный фосфонат, фосфинат, фосфорамидат, включая 3'-амино фосфорамидат и аминоалкилфосфорамидат, тионофосфорамидат, тионоалкилфосфонат, тионоалкилфосфотриэфир, селенофосфат или боранофосфат.In yet another further embodiment, the nucleotide analogue or equivalent of the invention comprises replacing one non-bridging oxygen in the phosphodiester bond. This modification slightly destabilizes the pairing but adds additional resistance to degradation by nucleases. A preferred nucleotide analogue or equivalent contains a thiophosphate, chiral thiophosphate, phosphorodithioate, phosphotriester, aminoalkylphosphotriester, H-phosphonate, methyl and other alkylphosphonate, including 3'-alkylene phosphonate, 5'-alkylene phosphonate and chiral phosphonate, phosphinate, phosphoramidate, including 3'- amino phosphoramidate and aminoalkyl phosphoramidate, thionophosphoramidate, thionoalkyl phosphonate, thionoalkyl phosphotriester, selenophosphate or boranophosphate.

Еще более предпочтительный нуклеотидный аналог или эквивалент по изобретению содержит один или несколько сахарных групп, которые являются моно- или дизамещенными по 2', 3' и/или 5' положению, такие как -ОН; -F; замещенный или незамещенный, линейный или разветвленный низший (С1-С10) алкил, алкенил, алкинил, алкарил, аллил, или аралкил, которые могут прерываться одним или несколькими гетероатомами; O-, S-, или N-алкил; O-, S-, или N-алкенил; O-, S-или N-алкинил; O-, S-, или Nаллил; O-алкил-O-алкил, -метокси, -аминопропокси; метоксиэтокси; диметиламинооксиэтокси; и диметиламиноэтоксиэтокси. Сахарная группа может быть пиранозой или ее производным, или дезоксипиранозой или ее производным, предпочтительно рибозой или ее производным, или дезоксирибозой или ее производным. Предпочтительно производное сахарной группы содержит замкнутую нуклеиновую кислоту (ЗНК), в которой 2'-атом углерода связан с 3'- или 4'-атомом углерода сахарного кольца, таким образом, формируя бициклическую сахарную группу. Предпочтительная ЗНК содержит 2'-О, 4'-Сэтилен-мостиковую нуклеиновую кислоту (Morita et al., 2 001). Эти замены придают нуклеотидному аналогу или эквиваленту устойчивость к РНКазе Н и нуклеазам и повышают аффинность к РНК-мишени.An even more preferred nucleotide analogue or equivalent of the invention contains one or more sugar groups that are mono- or disubstituted at the 2', 3' and/or 5' position, such as -OH; -F; substituted or unsubstituted, linear or branched lower (C 1 -C 10 ) alkyl, alkenyl, alkynyl, alkaryl, allyl, or aralkyl, which may be interrupted by one or more heteroatoms; O-, S-, or N-alkyl; O-, S-, or N-alkenyl; O-, S-or N-alkynyl; O-, S-, or Nallyl; O-alkyl-O-alkyl, -methoxy, -aminopropoxy; methoxyethoxy; dimethylaminooxyethoxy; and dimethylaminoethoxyethoxy. The sugar group may be pyranose or a derivative thereof, or deoxypyranose or a derivative thereof, preferably ribose or a derivative thereof, or deoxyribose or a derivative thereof. Preferably, the sugar group derivative contains a closed nucleic acid (LNA) in which the 2' carbon atom is bonded to the 3' or 4' carbon atom of the sugar ring, thereby forming a bicyclic sugar group. A preferred LNA contains a 2'-O,4'-Cethylene-bridged nucleic acid (Morita et al., 2001). These substitutions render the nucleotide analog or equivalent resistant to RNase H and nucleases and increase affinity for the target RNA.

В другом варианте осуществления нуклеотидный аналог или эквивалент по изобретению содержит одну или несколько модификаций или замен оснований. Модифицированные основания включают синтетические и природные основания, такие как инозин, ксантин, гипоксантин и другие аза-, деаза-, гидрокси, -гало, -тио, тиол, -алкил, -алкенил, -алкинил, тиоалкил производные пиримидиновых и пуриновых оснований, которые известны или будут известны в данной области.In another embodiment, a nucleotide analogue or equivalent of the invention contains one or more base modifications or substitutions. Modified bases include synthetic and natural bases such as inosine, xanthine, hypoxanthine and other aza-, deaza-, hydroxy, -halo, -thio, thiol, -alkyl, -alkenyl, -alkynyl, thioalkyl derivatives of pyrimidine and purine bases, which are or will be known in the art.

Специалисту следует понимать, что необязательно все положения в AOH должны быть модифицированы единообразно. Кроме того, в один AOH можно вводить более чем один вышеуказанный аналог или эквивалент или даже в одно положение в AOH. В определенных вариантах осуществления AOH по изобретению имеет, по меньшей мере, два различных типа аналогов или эквивалентов.One skilled in the art will appreciate that not all provisions in the AOH need to be modified uniformly. In addition, more than one of the above analogues or equivalents can be introduced into one AOH, or even at one position in the AOH. In certain embodiments, the AOH of the invention has at least two different types of analogues or equivalents.

Таким образом, предпочтительный AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга содержит а 2'-О алкилтиофосфатный антисмысловой олигонуклеотид, такой как 2'-О-метил модифицированная рибоза (РНК), 2'-О-этил модифицированная рибоза, 2'-О-пропил модифицированная рибоза, и/или замещенные производные этих модификаций, такие как галогенированные производные.Thus, the preferred AOH of the invention for splice redirection contains a 2'-O alkyl thiophosphate antisense oligonucleotide such as 2'-O-methyl modified ribose (RNA), 2'-O-ethyl modified ribose, 2'-O-propyl modified ribose, and/or substituted derivatives of these modifications, such as halogenated derivatives.

Специалисту следует также понимать, что для эффективной терапии можно комбинировать различные AOH по изобретению. В варианте осуществления, применяют комбинацию, по меньшей мере, из двух AOH по изобретению, а именно, двух различных AOH по изобретению, трех различных AOH по изобретению, четырех различных AOH по изобретению, или пяти AOH по изобретению.One skilled in the art will also appreciate that the various AOHs of the invention can be combined for effective therapy. In an embodiment, a combination of at least two inventive AOHs is used, namely, two different inventive AOHs, three different inventive AOHs, four different inventive AOHs, or five inventive AOHs.

АОН по изобретению для перенаправления сплайсинга может быть связан с группой, которая усиливает захват антисмыслового олигонуклеотида в клетки, предпочтительно клетки сетчатки. Примеры таких групп представляют собой холестерины, углеводы, витамины, биотин, липиды, фосфолипиды, пептиды, проникающие в клетки, включая в качестве неограничивающих примеров антеннапедию, ТАТ, транспортан и положительно заряженные аминокислоты, такие как олигоаргинин, полиаргинин, олиголизин или полилизин, антигенсвязывающие домены, представленные антителом, Fab-фрагментом антитела, или одноцепочечным антигенсвязывающим доменом, таким как верблюжий однодоменный антигенсвязывающий домен.The AON of the invention for splicing redirection may be associated with a group that enhances the uptake of the antisense oligonucleotide into cells, preferably retinal cells. Examples of such groups are cholesterols, carbohydrates, vitamins, biotin, lipids, phospholipids, cell penetrating peptides including but not limited to antennapedia, TAT, transportan and positively charged amino acids such as oligoarginine, polyarginine, oligolysine or polylysine, antigen binding domains represented by an antibody, a Fab fragment of an antibody, or a single-chain antigen-binding domain, such as a camel single-chain antigen-binding domain.

- 27 043834- 27 043834

АОН по изобретению для перенаправления сплайсинга можно вводить непрямым образом при помощи подходящих способов, известных в данной области. Его можно, например, вводить индивидууму или в клетку, ткань или орган указанного индивидуума как таковые, в виде так называемого гологоThe AON of the invention for splicing redirection can be introduced indirectly using suitable methods known in the art. It can, for example, be administered to an individual or into a cell, tissue or organ of said individual as such, in the form of a so-called naked

AOH. Его также можно вводить в форме экспрессирующего вектора, где экспрессирующий вектор кодирует транскрипт РНК, содержащий последовательность указанного АОН по изобретению.AOH. It can also be administered in the form of an expression vector, where the expression vector encodes an RNA transcript containing the sequence of the specified AON according to the invention.

Экспрессирующий вектор предпочтительно вводят в клетку, ткань, орган или индивидууму при помощи носителя для доставки генов. В предпочтительном варианте осуществления предлагается экспрессирующий вектор на основе вируса, содержащий экспрессирующую кассету или транскрипционную кассету, которая управляет экспрессией или транскрипцией AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга. Таким образом, изобретение относится к вирусному вектору, экспрессирующему антисмысловой олигонуклеотид по изобретению для перенаправления сплайсинга, который помещен в условия, способствующие экспрессии антисмыслового олигонуклеотида для перенаправления сплайсинга. Клетку можно обеспечивать AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга путем экспрессии антисмыслового олигонуклеотида на основе плазмиды или вирусной экспрессии, которая обеспечивается векторами на основе аденовируса или аденоассоциированного вируса. Экспрессия может управляться промотором РНК-полимеразы II (Pol II), таким как РНК-промотор U7 или промотор РНК-полимеразы III (Pol III), такой как РНК-промотор U6. Предпочтительным носителем для доставки является вирусный вектор, такой как вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), или ретровирусный вектор, такой как лентивирусный вектор и т.п. Также для доставки AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга можно соответствующим образом применять плазмиды, искусственные хромосомы, плазмиды, используемые для направленной гомологичной рекомбинации и интеграции в геном человека в клетках. Предпочтительными для изобретения являются такие векторы, где транскрипция управляется промоторами PolIII, и/или где транскрипты находятся в форме слияний с транскриптами U1 или U7, которые дают хорошие результаты для доставки небольших транскриптом. Они известны специалистам в данной области для разработки подходящих транскриптов. Предпочтительными являются транскрипты под управлением PolIII, предпочтительно, в форме слитого транскрипта с транскриптом U1 или U7. Такие слияния можно получать, как описано ранее (Gorman et al., 1998).The expression vector is preferably introduced into a cell, tissue, organ or individual using a gene delivery vehicle. In a preferred embodiment, a virus-based expression vector is provided containing an expression cassette or transcription cassette that directs the expression or transcription of the AOH of the invention to redirect splicing. Thus, the invention relates to a viral vector expressing an antisense splice redirection oligonucleotide of the invention that is placed under conditions that promote expression of the antisense splice redirection oligonucleotide. The cell can be provided with the AOH of the invention to redirect splicing by expression of a plasmid-based antisense oligonucleotide or viral expression, which is provided by adenovirus or adeno-associated virus vectors. Expression can be driven by an RNA polymerase II (Pol II) promoter, such as the U7 RNA promoter, or an RNA polymerase III (Pol III) promoter, such as the U6 RNA promoter. A preferred delivery vehicle is a viral vector such as an adeno-associated virus (AAV) vector or a retroviral vector such as a lentiviral vector and the like. Also, for the delivery of AOH according to the invention, plasmids, artificial chromosomes, plasmids used for directed homologous recombination and integration into the human genome in cells can be suitably used for splicing redirection. Preferred vectors of the invention are those where transcription is driven by PolIII promoters and/or where the transcripts are in the form of fusions to U1 or U7 transcripts, which provide good results for the delivery of small transcriptomes. These are known to those skilled in the art for the development of suitable transcripts. Preferred are transcripts under the control of PolIII, preferably in the form of a fusion transcript with a U1 or U7 transcript. Such fusions can be prepared as previously described (Gorman et al., 1998).

Предпочтительная экспрессирующая система для AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV). Были разработаны одноцепочечные и двухцепочечные векторы на основе AAV, которые можно использовать для длительной экспрессии антисмысловых нуклеотидных последовательностей для высокоэффективного перенаправления сплайсинга. Предпочтительный вектор на основе AAV, например, содержит экспрессирующую кассету, которой управляет промотор РНК-полимеразы III (Pol III) или промотор РНК-полимеразы II (Pol II). Предпочтительным РНК-промотором является, например, РНК-промотор U6 Pol III или РНКпромотор U7 Pol II U7.A preferred expression system for the AOH of the invention for splicing redirection is an adeno-associated virus (AAV) vector. Single- and double-stranded AAV-based vectors have been developed that can be used for long-term expression of antisense nucleotide sequences for highly efficient splicing redirection. A preferred AAV-based vector, for example, contains an expression cassette driven by an RNA polymerase III promoter (Pol III) or an RNA polymerase II promoter (Pol II). A preferred RNA promoter is, for example, U6 Pol III RNA promoter or U7 Pol II U7 RNA promoter.

Изобретение, таким образом, относится к вектору на основе вируса, содержащему промотор Pol II или Pol III, управляющий экспрессирующей кассетой для экспрессии AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга.The invention thus relates to a virus-based vector containing a Pol II or Pol III promoter driving the AOH expression cassette of the invention to redirect splicing.

Вектор на основе AAV по изобретению представляет собой рекомбинантный вектор на основе AAV и относится к вектору на основе AAV, содержащему часть генома AAV с кодируемым AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, инкапсидированному в белковую оболочку из белка капсида, полученного из серотипа AAV, как описано в другом месте в настоящем изобретении. Часть генома AAV может содержать инвертированные концевые повторы (ITR), полученные из серотипа аденоассоциированного вируса, такого как AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9 и другие. Белковая облочка, состоящая из белка капсида, может быть получена из серотипа AAV, такого как AAV1, 2, 3, 4, 5, 8, 9 и другие. Белковую оболочку можно также называть капсидной белковой оболочкой. У вектора на основе AAV может быть удален один ген или предпочтительно все гены AAV дикого типа, но он может все еще содержать функциональные ITR-последовательности нуклеиновой кислоты. Функциональные ITRпоследовательности необходимы для репликации, спасения и упаковки вирионов AAV. ITRпоследовательности могут быть последовательностями дикого типа или могут иметь, по меньшей мере, 80, 85, 90, 95 или 100% идентичности последовательности с последовательностями дикого типа или могут быть изменены, например, путем вставки, мутации, делеции или замены нуклеотидов, при условии, что они остаются функциональными. В этом контексте, функциональность относится к способности непосредственно упаковывать геном в капсидную оболочку, а затем обеспечивать экспрессию в инфицированной клетке-хозяине или клетке-мишени. В контексте по изобретению капсидная белковая оболочка может быть из иного серотипа, чем геномные ITR вектора на основе AAV. Вектор на основе AAV в соответствии с настоящим изобретением может, таким образом, состоять из капсидной белковой оболочки, т.е. капсида в виде икосаэдра, который содержит белки капсида (VP1, VP2, и/или VP3) одного из серотипов AAV, например, серотипа 2 AAV, в то время как ITR-последовательности, содержащиеся в этом векторе на основе AAV5, могут быть из любого вышеописанного серотипа AAV, включая вектор на основе AAV2. Вектор на основе AAV2, таким образом, содержит капсидную белковую оболочку серотипа 2 AAV, в то время как, например, вектор на основе AAV5 содержит капсидную белковую оболочку серо- 28 043834 типа 5 AAV, посредством чего любой из них может инкапсидировать любую геномную ITR вектора на основе AAV.The AAV-based vector of the invention is a recombinant AAV-based vector and refers to an AAV-based vector containing a portion of the AAV genome encoded by the AOH of the invention for splicing redirection, encapsidated in a protein shell from a capsid protein derived from an AAV serotype, as described in elsewhere in the present invention. Part of the AAV genome may contain inverted terminal repeats (ITRs) derived from an adeno-associated virus serotype such as AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9 and others. The protein shell, consisting of the capsid protein, can be obtained from an AAV serotype such as AAV1, 2, 3, 4, 5, 8, 9 and others. The protein shell may also be referred to as the capsid protein shell. An AAV-based vector may have one or preferably all wild-type AAV genes deleted and may still contain functional ITR nucleic acid sequences. Functional ITR sequences are required for replication, rescue, and packaging of AAV virions. The ITR sequences may be wild-type sequences or may have at least 80, 85, 90, 95, or 100% sequence identity to wild-type sequences or may be altered, for example, by insertion, mutation, deletion, or nucleotide substitution, provided that that they remain functional. In this context, functionality refers to the ability to directly package a genome into a capsid shell and then mediate expression in an infected host or target cell. In the context of the invention, the capsid protein shell may be from a different serotype than the AAV-based genomic ITR vectors. The AAV-based vector according to the present invention may thus consist of a capsid protein shell, i.e. icosahedral capsid that contains the capsid proteins (VP1, VP2, and/or VP3) of one of the AAV serotypes, e.g., AAV serotype 2, while the ITR sequences contained in this AAV5-based vector can be from any of the AAV serotype described above, including an AAV2-based vector. An AAV2-based vector thus contains a serotype 2 AAV capsid protein shell, while, for example, an AAV5-based vector contains a serotype 5 AAV capsid protein shell, whereby either can encapsidate any of the vector's genomic ITRs based on AAV.

Предпочтительно, рекомбинантный вектор на основе AAV по изобретению содержит капсидную белковую оболочку серотипа 2, 5, 8 AAV или серотипа 9 AAV, где геном или ITR AAV, присутствующие в указанном векторе на основе AAV, получены из серотипа 2, 5, 8 AAV или серотипа 9 AAV; такой вектор на основе AAV обозначают как вектор AAV2/2, AAV 2/5, AAV2/8, AAV2/9, AAV5/2, AAV5/5, AAV5/8, AAV 5/9, AAV8/2, AAV 8/5, AAV8/8, AAV8/9, AAV9/2, AAV9/5, AAV9/8, или AAV9/9.Preferably, the recombinant AAV vector of the invention comprises a capsid protein shell of AAV serotype 2, 5, 8 or AAV serotype 9, wherein the AAV genome or ITR present in said AAV vector is derived from AAV serotype 2, 5, 8 or serotype 9 AAV; such an AAV-based vector is designated as AAV2/2, AAV 2/5, AAV2/8, AAV2/9, AAV5/2, AAV5/5, AAV5/8, AAV 5/9, AAV8/2, AAV 8/5 vector , AAV8/8, AAV8/9, AAV9/2, AAV9/5, AAV9/8, or AAV9/9.

Более предпочтительно, рекомбинантный вектор на основе AAV по изобретению содержит капсидную белковую оболочку серотипа 2 AAV и геном или ITR AAV, присутствующие в указанном векторе на основе AAV, получены из серотипа 5 AAV; такой вектор обозначают как вектор AAV 2/5.More preferably, the recombinant AAV vector of the invention comprises an AAV serotype 2 capsid protein shell and the AAV genome or ITR present in said AAV vector is derived from AAV serotype 5; such a vector is referred to as the AAV 2/5 vector.

Более предпочтительно, рекомбинантный вектор на основе AAV по изобретению содержит капсидную белковую оболочку серотипа 2 AAV и геном или ITR AAV, присутствующие в указанном векторе на основе AAV, получены из серотипа 8 AAV; такой вектор обозначают как вектор AAV 2/8.More preferably, the recombinant AAV vector of the invention comprises an AAV serotype 2 capsid protein shell and the AAV genome or ITR present in said AAV vector is derived from AAV serotype 8; such a vector is referred to as the AAV 2/8 vector.

Более предпочтительно, рекомбинантный вектор на основе AAV по изобретению содержит капсидную белковую оболочку серотипа 2 AAV и геном или ITR AAV, присутствующие в указанном векторе на основе AAV, получены из серотипа 9 AAV; такой вектор обозначают как вектор AAV 2/9.More preferably, the recombinant AAV vector of the invention comprises an AAV serotype 2 capsid protein shell and the AAV genome or ITR present in said AAV vector is derived from AAV serotype 9; such a vector is designated the AAV 2/9 vector.

Более предпочтительно, рекомбинантный вектор на основе AAV по изобретению содержит капсидную белковую оболочку серотипа 2 AAV и геном или ITR AAV, присутствующие в указанном векторе на основе AAV, получены из серотипа 2 AAV; такой вектор обозначают как вектор AAV 2/2.More preferably, the recombinant AAV vector of the invention comprises an AAV serotype 2 capsid protein shell and the AAV genome or ITR present in the AAV vector is derived from AAV serotype 2; such a vector is referred to as the AAV 2/2 vector.

Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, представленная предпочтительной последовательностью нуклеиновой кислоты, предпочтительно вставлена между геномом или ITR-последовательностями AAV, такой как последовательности, указанные выше, например, экспрессирующая конструкция, содержащая регуляторный элемент экспрессии, функционально связанный с кодирующей последовательностью и 3'-терминирующей последовательностью.The nucleic acid molecule encoding the AOH of the invention for splicing redirection, represented by a preferred nucleic acid sequence, is preferably inserted between the genome or ITR sequences of AAV, such as the sequences specified above, for example, an expression construct containing an expression regulatory element operably linked to the coding sequence and a 3' termination sequence.

Хелперные функции AAV, в основном, относится к соответствующим функциям AAV, необходимым для репликации и упаковки AAV, которые предоставлены в векторе на основе AAV in trans. Хелперные функции AAV дополняют функции AAV, которые утрачены в векторе на основе AAV, но у них отсутствуют ITR AAV (которые предоставлены геномом вектора на основе AAV). Хелперные функции AAV включают две главные ORF (открытые рамки считывания) AAV, а именно, кодирующую область rep и кодирующую область cap или по существу функционально идентичные им последовательности.AAV helper functions generally refer to the corresponding AAV functions required for AAV replication and packaging, which are provided in an AAV-based vector in trans. AAV helper functions complement the AAV functions that are lost in the AAV-based vector, but they lack the AAV ITRs (which are provided by the AAV-based vector genome). AAV helper functions include the two major ORFs (open reading frames) of AAV, namely the rep coding region and the cap coding region or sequences substantially functionally identical to them.

Области Rep и Сар хорошо известны в данной области, см., например, (Chiorini et al., 1999) или US 5139941, включенные в настоящее изобретение в качестве ссылки. Хелперные функции AAV могут быть предоставлены в хелперной конструкции AAV, которая может быть плазмидой. Введение хелперной конструкции в клетку-хозяина может происходить, например, путем трансформации, трансфекции или трансдукции до или одновременно с введением генома AAV, присутствующего в векторе на основе AAV, как указано в настоящем изобретении. Хелперные конструкции AAV по изобретению можно выбирать таким образом, что они производят желаемую комбинацию серотипов для капсидной белковой оболочки вектора на основе AAV с одной стороны и для репликации и упаковки генома AAV, присутствующего в указанном векторе на основе AAV, с другой стороны.The Rep and Car regions are well known in the art, see, for example, (Chiorini et al., 1999) or US 5,139,941, incorporated herein by reference. AAV helper functions may be provided in an AAV helper construct, which may be a plasmid. Introduction of the helper construct into a host cell may occur, for example, by transformation, transfection, or transduction prior to or simultaneously with introduction of the AAV genome present in an AAV-based vector as provided herein. The AAV helper constructs of the invention can be selected such that they produce the desired combination of serotypes for the capsid protein shell of an AAV-based vector on the one hand and for the replication and packaging of the AAV genome present in said AAV-based vector on the other hand.

Вирус-помощник AAV обеспечивает дополнительные функции, необходимые для репликации и упаковки AAV. Подходящие вирусы-помощники AAV включают аденовирусы, вирусы простого герпеса (такие как HSV типов 1 и 2) и вирусы осповакцины. Дополнительные функции, обеспечиваемые вирусом-помощником, можно также вводить в клетку-хозяина посредством векторов, как описано в US 6531456, включенном в настоящее изобретение в качестве ссылки.The AAV helper virus provides additional functions required for AAV replication and packaging. Suitable AAV helper viruses include adenoviruses, herpes simplex viruses (such as HSV types 1 and 2) and vaccinia viruses. Additional functions provided by the helper virus can also be introduced into the host cell via vectors, as described in US 6,531,456, incorporated herein by reference.

Предпочтительно, геном AAV, который присутствует в рекомбинантном векторе на основе AAV по изобретению, не содержит никаких нуклеотидных последовательностей, кодирующих вирусные белки, такие как гены rep (репликация) или cap (capsid) AAV. Геном AAV может дополнительно содержать маркер или репортерный ген, такой как ген, например, кодирующий ген устойчивости к антибиотику, флуоресцентный белок (например, gfp) или ген, кодирующий химически, ферментативно или иным способом выявляемый и/или селектируемый продукт (например, lacZ, aph и т.д.), известный в данной области.Preferably, the AAV genome that is present in the recombinant AAV-based vector of the invention does not contain any nucleotide sequences encoding viral proteins, such as AAV rep (replication) or cap (capsid) genes. The AAV genome may further comprise a marker or reporter gene, such as a gene, for example, encoding an antibiotic resistance gene, a fluorescent protein (e.g., gfp), or a gene encoding a chemically, enzymatically or otherwise detectable and/or selectable product (e.g., lacZ, aph, etc.) known in the art.

Предпочтительно, вектор на основе AAV по изобретению конструируют и производят в соответствии со способом, согласно Garanto et al., 2016, который включен в настоящее изобретение в качестве ссылки.Preferably, the AAV-based vector of the invention is designed and produced in accordance with the method according to Garanto et al., 2016, which is incorporated herein by reference.

Предпочтительный вектор на основе AAV по изобретению представляет собой вектор на основе AAV, предпочтительно вектор AAV2/5, AAV2/8, AAV2/9 или AAV2/2, экспрессирующий AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, при этом AOH содержит или предпочтительно включает последовательность, которая:A preferred AAV-based vector of the invention is an AAV-based vector, preferably an AAV2/5, AAV2/8, AAV2/9 or AAV2/2 vector, expressing an AOH of the invention for splicing redirection, wherein the AOH contains or preferably includes a sequence that :

комплементарна или по существу комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 или SEQ ID NO: 261, или их части;complementary or substantially complementary to a polynucleotide having the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 10, 161, 30, 81, 101, 121, 141 or SEQ ID NO: 261, or part thereof;

предпочтительно комплементарна или по существу комплементарна полинуклеотиду с нуклеотид- 29 043834 ной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 162, 181, 82, 102, 122, 142 или SEQ ID NO: 262, или их части;preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide with the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 162, 181, 82, 102, 122, 142 or SEQ ID NO: 262, or part thereof;

более предпочтительно комплементарна или по существу комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 160, 180, 80, 100, 120, 140 или SEQ ID NO: 260, или их части более предпочтительно комплементарна или по существу комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 31, или их части;more preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide having the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 160, 180, 80, 100, 120, 140 or SEQ ID NO: 260, or a portion thereof, more preferably complementary or substantially complementary to the polynucleotide having the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 31, or part thereof;

более предпочтительно комплементарна или по существу комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 32, или их части;more preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide having the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 32, or a portion thereof;

более предпочтительно комплементарна или по существу комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, 16, 19, 163, 166, 169, 33, 36, 39, 42, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251, 254, 257, 83, 86, 89, 103, 106, 109, 123, 126, 129, 143, 146, 149, 263, 266 и SEQ ID NO: 269, или их части; и более предпочтительно комплементарна или по существу комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 17, 20, 164, 167, 170, 34, 37, 40, 43, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 84, 87, 90, 104, 107, 110, 124, 127, 130, 144, 147, 150, 264, 268 и SEQ ID NO: 270, или их части.more preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide with a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 13, 16, 19, 163, 166, 169, 33, 36, 39, 42, 182, 185, 188, 191, 194 , 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251, 254, 257, 83, 86, 89, 10 3 , 106, 109, 123, 126, 129, 143, 146, 149, 263, 266 and SEQ ID NO: 269, or parts thereof; and more preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide having a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 14, 17, 20, 164, 167, 170, 34, 37, 40, 43, 183, 186, 189, 192 , 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 84, 87, 9 0 , 104, 107, 110, 124, 127, 130, 144, 147, 150, 264, 268 and SEQ ID NO: 270, or parts thereof.

Еще более предпочтительный вектор на основе AAV по изобретению представляет собой вектор на основе AAV, предпочтительно вектор AAV2/5, AAV2/8, AAV2/9 или AAV2/2, экспрессирующий молекулу для пропуска экзона или молекулу по изобретению для сохранения экзона 12, которая экспрессирует AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, который содержит, или предпочтительно включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 18, 21, 165, 168, 171, 35, 38, 41, 44, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259, 85, 88, 91, 105, 108, 111, 125, 128, 131, 145, 148, 151, 265, 268 и SEQ ID NO: 271.An even more preferred AAV-based vector of the invention is an AAV-based vector, preferably an AAV2/5, AAV2/8, AAV2/9, or AAV2/2 vector expressing an exon skipping molecule or an exon 12 sparing molecule of the invention that expresses An AOH of the invention for splicing redirection that contains, or preferably includes, a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, 18, 21, 165, 168, 171, 35, 38, 41, 44, 184, 187, 190 , 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259, 85, 88 , 91, 105, 108, 111, 125, 128, 131, 145, 148, 151, 265, 268 and SEQ ID NO: 271.

Ожидается улучшение способов обеспечения индивидуума или клетки, ткани, органа указанного индивидуума AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, учитывая прогресс, который уже был достигнут к настощему времени. Такие будущие улучшения, конечно, могут быть включены для достижения упомянутого эффекта реструктурирования мРНК при помощи способа по изобретению. AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга можно доставлять в виде голого AOH индивидууму, клетке, ткани или органу указанного индивидуума. При введении AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, предпочтительно, чтобы молекула растворялась в растворе, который совместим со способом доставки. Клетки сетчатки можно снабжать плазмидой для экспрессии антисмыслового олигонуклеотида, доставляя плазмиду в водном растворе.Improvements in methods for providing an individual or cell, tissue, organ of said individual with AOH of the invention for splicing redirection are expected, given the progress that has already been made to date. Such future improvements may of course be included to achieve the said effect of restructuring the mRNA using the method of the invention. The splice redirection AOH of the invention can be delivered as naked AOH to an individual, cell, tissue or organ of said individual. When administering the AOH of the invention to redirect splicing, it is preferable that the molecule is dissolved in a solution that is compatible with the delivery method. Retinal cells can be provided with a plasmid for expression of an antisense oligonucleotide by delivering the plasmid in an aqueous solution.

Альтернативно, предпочтительным способом доставки для AOH для перенаправления сплайсинга или плазмиды для экспрессии такого AOH является вирусный вектор или наночастицы. Предпочтительно, вирусные векторы или наночастицы доставляют в сетчатку или в другие соответствующие клетки. Такая доставка в клетки сетчатки или в другие соответствующие клетки может происходить in vivo, in vitro или ex vivo; см. например, Garanto et al., 2016, который включен в настоящее изобретение в качестве ссылки.Alternatively, a preferred delivery method for splice redirection AOH or plasmid for expression of such AOH is a viral vector or nanoparticles. Preferably, viral vectors or nanoparticles are delivered to the retina or other appropriate cells. Such delivery to retinal cells or other appropriate cells may occur in vivo, in vitro or ex vivo; see, for example, Garanto et al., 2016, which is incorporated herein by reference.

Альтернативно, плазмиду можно доставлять путем трансфекции при помощи известных агентов для транфекции. Для внутривенного, подкожного, внутримышечного, интратекального и/или внутрижелудочкового введения предпочтительно, чтобы раствор представлял собой физиологический солевой раствор. Особенно предпочтительным в изобретении является применение эксципиентов или агентов для транфекции, которые будут помогать доставке каждого из компонентов, определенных в настоящем изобретении, к клетке и/или в клетку, предпочтительно клетку сетчатки. Предпочтительными являются эксципиенты или агенты для транфекции, способные формировать комплексы, наночастицы, мицеллы, везикулы и/или липосомы, которые доставляют каждый компонент, определенный в настоящем изобретении, в составе комплекса или захваченный в везикулу или липосому, через мембрану клетки. Множество таких эксципиентов известно в данной области. Подходящие эксципиенты или агенты для транфекции включают полиэтиленимин (ПЭ1; ExGen500 (MBI Fermentas)), Липофектамин™ 2000 (Invitrogen) или их производные, или аналогичные катионные полимеры, в том числе полипропиленимин или сополимеры полиэтиленимина (ПЭС) и производные, синтетические амфифилы (SAINT-18), липофектин™, DOTAP и/или белки вирусного капсида, которые способны к самосборке в частицы, которые могут доставить каждый компонент, определенный в настоящем изобретении, к клетке, предпочтительно, клетке сетчатки. Было показано, что такие эксципиенты эффективно доставляют олигонуклеотид, такой как AOH, к широкому спектру культивируемых клеток, включая клетки сетчатки. Их высокий трансфекционный потенциал сочетается с токсичностью от исключительно низкой до умеренной в отношении общей выживаемости клеток. Можно использовать легкость структурной модификации, чтобы проводить даль- 30 043834 нейшие модификации и анализ их дополнительных (in vivo) характеристик переноса нуклеиновых кислот и токсичности.Alternatively, the plasmid can be delivered by transfection using known transfection agents. For intravenous, subcutaneous, intramuscular, intrathecal and/or intraventricular administration, it is preferred that the solution is physiological saline. Particularly preferred in the invention is the use of excipients or transfection agents that will assist in the delivery of each of the components defined in the present invention to and/or into a cell, preferably a retinal cell. Preferred are excipients or transfection agents capable of forming complexes, nanoparticles, micelles, vesicles and/or liposomes that deliver each component defined herein, complexed or entrapped in a vesicle or liposome, across a cell membrane. Many such excipients are known in the art. Suitable excipients or transfection agents include polyethylenimine (PE1; ExGen500 (MBI Fermentas)), Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) or derivatives thereof, or similar cationic polymers including polypropylenimine or polyethylenimine (PES) copolymers and derivatives, synthetic amphiphiles (SAINT -18), lipofectin™, DOTAP and/or viral capsid proteins that are capable of self-assembling into particles that can deliver each component defined in the present invention to a cell, preferably a retinal cell. Such excipients have been shown to effectively deliver an oligonucleotide such as AOH to a wide range of cultured cells, including retinal cells. Their high transfection potential is coupled with exceptionally low to moderate toxicity in terms of overall cell survival. The ease of structural modification can be used to further modify and analyze their additional (in vivo) nucleic acid transport and toxicity characteristics.

Липофектин представляет собой пример агента для липосомальной трансфекции. Он состоит из двух липидных компонентов, катионного липида N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N, N,Nтриметилхлорид аммония (DOTMA) (ср. DOTAP, который представляет собой метилсульфатную соль) и нейтрального липида липид диолеоилфосфатидилэтаноламина (DОПЭ). Нейтральный компонент опосредует внутриклеточное высвобождение. Другая группа систем доставки представляет собой полимерные наночастицы.Lipofectin is an example of a liposomal transfection agent. It consists of two lipid components, the cationic lipid N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,Ntrimethyl ammonium chloride (DOTMA) (cf. DOTAP, which is a methyl sulfate salt) and the neutral lipid lipid dioleoylphosphatidylethanolamine ( DOPE). The neutral component mediates intracellular release. Another group of delivery systems are polymer nanoparticles.

Поликатионы, такие как диэтиламиноэтиламиноэтил (DEAE)-декстран, которые хорошо известны как реагенты для трансфекции ДНК, можно комбинировать с бутилцианоакрилатом (РВСА) и гексилцианоакрилатом (РНСА) для формирования катионных наночастиц, которые могут доставлять каждый из компонентов, определенных в настоящем изобретении, предпочтительно AOH по изобретению, через клеточную мембрану в клетки.Polycations such as diethylaminoethylaminoethyl (DEAE)-dextran, which are well known as DNA transfection reagents, can be combined with butyl cyanoacrylate (PBCA) and hexyl cyanoacrylate (PHCA) to form cationic nanoparticles that can deliver each of the components defined in the present invention, preferably AOH according to the invention, through the cell membrane into cells.

В дополнение к этим распространенным материалам наночастиц, катионный пептид протамин предлагает альтернативный подход для формирования состава олигонуклеотида с коллоидами. Эта система коллоидных наночастиц может формировать так называемые прочастицы, которые можно получать путем простого процесса самосборки, для упаковки и внутриклеточного высвобождения олигонуклеотида. Специалист может выбрать и адаптировать любые из вышеуказанных или другие коммерчески доступные альтернативные эксципиенты и системы доставки для упаковки и доставки молекулы для пропуска экзонов для применения в настоящем изобретении для ее доставки для профилактики, лечения или замедления заболевания или состояния, связанного с ABCA4. Профилактику, лечение или замедление заболевания или состояния, связанного с ABCA4 в настоящем изобретении предпочтительно определяют как предотвращение, остановку, прекращение прогрессирования, или обращение вспять частичного или полного нарушения зрения или слепоты, которая вызвана генетическим дефектом в гене ABCA4.In addition to these common nanoparticle materials, the cationic peptide protamine offers an alternative approach for forming an oligonucleotide with colloids. This colloidal nanoparticle system can form so-called proparticles, which can be produced through a simple self-assembly process to package and release the oligonucleotide intracellularly. One skilled in the art may select and adapt any of the above or other commercially available alternative excipients and delivery systems for packaging and delivering the exon skipping molecule for use in the present invention for delivery thereof for preventing, treating, or delaying an ABCA4-related disease or condition. Prevention, treatment or retardation of a disease or condition associated with ABCA4 in the present invention is preferably defined as preventing, stopping, stopping the progression, or reversing partial or complete visual impairment or blindness that is caused by a genetic defect in the ABCA4 gene.

Кроме того, AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга может быть ковалентно или нековалентно связан с нацеливающим лигандом, разработанным специально для облегчения захвата в клетку, цитоплазму и/или ядро. Такой лиганд мог бы включать (i) соединение (включая в качестве неограничивающих примеров пептид(-подобные) структуры), распознающее специфические элементы клетки, ткани или органа, облегчающие клеточный захват и/или (ii) химическое соединение, способное облегчить захват в клетки и/или внутриклеточное высвобождение олигонуклеотида из везикул, например, эндосом или лизосом.In addition, the splice redirection AOH of the invention may be covalently or non-covalently linked to a targeting ligand designed specifically to facilitate uptake into the cell, cytoplasm and/or nucleus. Such a ligand could include (i) a compound (including, but not limited to, peptide(s)-like structures) that recognizes specific elements of a cell, tissue, or organ to facilitate cellular uptake and/or (ii) a chemical compound capable of facilitating uptake into cells and /or intracellular release of the oligonucleotide from vesicles, such as endosomes or lysosomes.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга формулируют в состав, или лекарственное средство, или композицию, которая обеспечивает, по меньшей мере, эксципиент и/или нацеливающий лиганд для доставки и/или средство его доставки к клетке и/или улучшение его внутриклеточной доставки.Thus, in a preferred embodiment, the AOH of the invention for splicing redirection is formulated into a composition, or drug, or composition that provides at least an excipient and/or targeting ligand for delivery and/or a means of delivery thereof to the cell and/or improving its intracellular delivery.

Следует понимать, что если композиция содержит дополнительный компонент, такой как вспомогательное соединение, как далее определено в настоящем изобретении, каждый компонент композиции может не быть надлежащим образом сформулирован в одной единственной комбинации, или композиции, или препарате. В зависимости от их индивидуальности и характерных особенностей, специалист будет знать, какой тип состава является наиболее подходящим для каждого компонента, определенного в настоящем изобретении. В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к композиции или препарату, который находится в форме набора частей, содержащих AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, а также дополнительное вспомогательное соединение, как далее определено в настоящем изобретении.It should be understood that if the composition contains an additional component, such as an auxiliary compound, as further defined in the present invention, each component of the composition may not be suitably formulated in one single combination, or composition, or preparation. Depending on their individuality and characteristics, one skilled in the art will know which type of formulation is most suitable for each component defined in the present invention. In a preferred embodiment, the invention relates to a composition or preparation that is in the form of a set of parts containing the AOH of the invention for splicing redirection, as well as an additional auxiliary compound, as further defined in the present invention.

Если необходимо и/или при желании, AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга или вектор, предпочтительно вирусный вектор по изобретению, экспрессирующий AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, можно вводить в фармацевтически активную смесь путем добавления фармацевтически приемлемого носителя.If necessary and/or desired, the AOH of the invention for splicing redirection or a vector, preferably a viral vector of the invention, expressing the AOH of the invention for splicing redirection, can be introduced into the pharmaceutically active mixture by adding a pharmaceutically acceptable carrier.

Таким образом, изобретение также относится к композиции, предпочтительно, фармацевтической композиции, содержащей AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, или вирусный вектор по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент. Такая композиция может содержать один AOH для перенаправления сплайсинга или вирусный вектор по изобретению, но может также содержать несколько различных AOH для перенаправления сплайсинга или вирусных векторов по изобретению. Такая фармацевтическая композиция может содержать любой фармацевтически приемлемый эксципиент, включая носитель, наполнитель, консервант, адъювант, растворитель и/или разбавитель. Такой фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель, консервант, адъювант, растворитель и/или разбавитель можно найти, например в Remington, 2000. Каждая отличительная черта указанной композиции была ранее определена в настоящем изобретении.Thus, the invention also relates to a composition, preferably a pharmaceutical composition, comprising an AOH of the invention for splicing redirection, or a viral vector of the invention, and a pharmaceutically acceptable excipient. Such a composition may contain a single splice redirection AOH or viral vector of the invention, but may also contain several different splice redirection AOHs or viral vectors of the invention. Such a pharmaceutical composition may contain any pharmaceutically acceptable excipient, including a carrier, excipient, preservative, adjuvant, solvent and/or diluent. Such a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, preservative, adjuvant, solvent and/or diluent can be found, for example, in Remington, 2000. Each feature of said composition has previously been defined in the present invention.

Предпочтительным путем введения является инъекция в стекловидное тело водного раствора или специально адаптированного состава для внутриглазного введения. ЕР2425 814 описывает эмульсию масло в воде, специально адаптированную для внутриглазного (интравитреального) введения лекарственных средств на основе пептида или нуклеиновой кислоты. Эта эмульсия менее плотная, чем жидкостьThe preferred route of administration is intravitreal injection of an aqueous solution or a specially adapted composition for intraocular administration. EP2425 814 describes an oil in water emulsion specifically adapted for intraocular (intravitreal) administration of peptide or nucleic acid based drugs. This emulsion is less dense than liquid

- 31 043834 стекловидного тела, так что эмульсия плавает наверху стекловидного тела, что позволяет избежать того, что введенное лекарственное средство нарушит зрение.- 31 043834 vitreous body, so that the emulsion floats on top of the vitreous body, which avoids that the administered drug will interfere with vision.

Если используют несколько AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, концентрация или доза, определенные в настоящем изобретении, могут относиться к общей концентрации или дозе всех использованных олигонуклеотидов или к концентрации или дозе каждой использованной или добавленной молекуле для пропуска экзонов. Таким образом, в варианте осуществления, предлагается композиция, где количество каждого или общее количество использованных AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга дозируют в количестве в диапазоне от 0,01 и до 20, предпочтительно от 0,05 и до 20 мг/кг на глаз. Предлагается подходящая интравитреальная доза и она составляет от 0,05 мг и до 5 мг, предпочтительно в пределах от 0,1 до 1 мг на глаз, а именно, приблизительно на глаз: 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 мг.If multiple AOHs of the invention are used for splicing redirection, the concentration or dose defined in the present invention may refer to the total concentration or dose of all oligonucleotides used or the concentration or dose of each exon skipping molecule used or added. Thus, in an embodiment, a composition is provided wherein the amount of each or the total amount of splice redirection AOHs of the invention used is dosed in an amount ranging from 0.01 to 20, preferably 0.05 to 20 mg/kg per eye. A suitable intravitreal dose is suggested to be between 0.05 mg and 5 mg, preferably between 0.1 and 1 mg per eye, namely approximately per eye: 0.1, 0.2, 0.3, 0 .4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 or 1.0 mg.

Предпочтительный AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга предназначен для лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4, у индивидуума. Во всех вариантах осуществления изобретения, термин лечение понимают как предотвращение или замедление заболевания или состояния, связанного с ABCA4. Индивидуум, которого можно бы было лечить при помощи AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, уже был диагностирован как имеющий заболевание или состояние, связанное с ABCA4.A preferred splice redirection AOH of the invention is for treating an ABCA4 related disease or condition in an individual. In all embodiments of the invention, the term treatment is understood as preventing or delaying a disease or condition associated with ABCA4. An individual who could be treated with the splice redirection AOH of the invention has already been diagnosed as having an ABCA4 related disease or condition.

Альтернативно, индивидуум, которого можно бы было лечить при помощи AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, еще не был диагностирован как имеющий заболевание или состояние, связанное с ABCA4, но он может быть индивидуумом с повышенным риском развития заболевания или состояния, связанного с ABCA4, в будущем с учетом его или ее генотипа. Предпочтительный индивидуум является человеком. Во всех вариантах осуществления изобретения, заболевание или состояние, связанное с ABCA4, предпочтительно является болезнью Штаргардта.Alternatively, an individual who could be treated with the splice redirection AOH of the invention has not yet been diagnosed as having an ABCA4-related disease or condition, but may be an individual at increased risk of developing an ABCA4-related disease or condition in future based on his or her genotype. The preferred individual is a human. In all embodiments, the disease or condition associated with ABCA4 is preferably Stargardt's disease.

Таким образом, изобретение дополнительно относится к AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, или вирусному вектору по изобретению, или (фармацевтической) композиции по изобретению для применения в качестве лекарственного средства, предпочтительно в качестве лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4, требующего регуляции сплайсинга ABCA4, и для применения в качестве лекарственного средства для профилактики, лечения или замедления заболевания или состояния, связанного с ABCA4. Каждый признак всех вариантов осуществления медицинского применения в данном изобретении был ранее определен в данном изобретении и предпочтительно является таким признаком, как определено ранее в данном изобретении.Thus, the invention further relates to an AOH of the invention for splicing redirection, or a viral vector of the invention, or a (pharmaceutical) composition of the invention for use as a medicament, preferably as a medicament for the treatment of an ABCA4-related disease or condition requiring regulation of ABCA4 splicing, and for use as a drug to prevent, treat, or delay an ABCA4-related disease or condition. Each feature of all medical use embodiments of the present invention has been previously defined in the present invention and is preferably a feature as previously defined in the present invention.

Изобретение дополнительно относится к способу лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4, требующего регуляции сплайсинга ABCA4, указанный способ, включает контакт клетки указанного индивидуума с AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектором по изобретению или (фармацевтической) композицией по изобретению. Каждый признак всех вариантов осуществления медицинского применения в данном изобретении был ранее определен в данном изобретении и предпочтительно является таким признаком, как определено ранее в данном изобретении.The invention further provides a method of treating a disease or condition associated with ABCA4 requiring regulation of ABCA4 splicing, said method comprising contacting a cell of said individual with an AOH of the invention to redirect splicing, a vector of the invention or a (pharmaceutical) composition of the invention. Each feature of all medical use embodiments of the present invention has been previously defined in the present invention and is preferably a feature as previously defined in the present invention.

Изобретение дополнительно относится к применению AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектора по изобретению или (фармацевтической) композиции по изобретению для получения лекарственного средства. Каждый признак всех вариантов осуществления медицинского применения в данном изобретении был ранее определен в данном изобретении и предпочтительно является таким признаком, как определено ранее в данном изобретении.The invention further relates to the use of an AOH according to the invention for splicing redirection, a vector according to the invention or a (pharmaceutical) composition according to the invention for the production of a drug. Each feature of all medical use embodiments of the present invention has been previously defined in the present invention and is preferably a feature as previously defined in the present invention.

Изобретение дополнительно относится к применению AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектора по изобретению или (фармацевтической) композиции по изобретению для получения лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4, требующего регуляции сплайсинга ABCA4. Каждый признак всех вариантов осуществления медицинского применения в данном изобретении был ранее определен в данном изобретении и предпочтительно является таким признаком, как определено ранее в данном изобретении.The invention further relates to the use of an AOH of the invention for splicing redirection, a vector of the invention or a (pharmaceutical) composition of the invention to produce a medicament for the treatment of an ABCA4-related disease or condition requiring regulation of ABCA4 splicing. Each feature of all medical use embodiments of the present invention has been previously defined in the present invention and is preferably such feature as previously defined in the present invention.

Изобретение дополнительно относится к применению AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, вектора по изобретению или (фармацевтической) композиции по изобретению для лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4, требующего регуляции сплайсинга ABCA4. Каждый признак всех вариантов осуществления медицинского применения в данном изобретении был ранее определен в данном изобретении и предпочтительно является таким признаком, как определено ранее в данном изобретении.The invention further relates to the use of an AOH of the invention for splicing redirection, a vector of the invention or a (pharmaceutical) composition of the invention for the treatment of an ABCA4-related disease or condition requiring regulation of ABCA4 splicing. Each feature of all medical use embodiments of the present invention has been previously defined in the present invention and is preferably a feature as previously defined in the present invention.

Лечение при применении или при способе по изобретению проводят предпочтительно, по меньшей мере, однократно, и предпочтительно оно длится, по меньшей мере, одну неделю, один месяц, несколько месяцев, один год, 2, 3, 4, 5, 6 лет или дольше, а именно, всю жизнь. Каждый AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга или его эквивалент, как определено в настоящем изобретении, для применения по изобретению может быть подходящим для прямого введения in vivo в клетку, ткань и/или орган индивидуумов, уже заболевших или с риском развития заболевания или состояния, связанного с ABCA4, и его можно вводить in vivo, ex vivo или in vitro. Частота введения AOH, композиции, соединения или вспомогательного соединения по изобретению может зависеть от нескольких параметров, таких как тя- 32 043834 жесть заболевания, возраст пациента, мутация пациента, количество AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга (т.е. доза), состав AOH, композиции, соединения или вспомогательного соединения по изобретению, путь введения и т.д. Частота введения может варьировать в пределах ежедневной, еженедельной, по меньшей мере, раз в две недели, или три недели, или четыре недели, или пять недель или в течение более долгого периода времени.Treatment with the use or method of the invention is preferably carried out at least once, and preferably lasts for at least one week, one month, several months, one year, 2, 3, 4, 5, 6 years or longer , namely, all my life. Each splice redirection AOH of the invention, or its equivalent as defined herein, for use in the invention may be suitable for direct in vivo administration into a cell, tissue and/or organ of individuals already diseased with, or at risk of developing, a disease or condition associated with ABCA4 and can be administered in vivo, ex vivo or in vitro. The frequency of administration of the AOH, composition, compound or auxiliary compound of the invention may depend on several parameters, such as the severity of the disease, the age of the patient, the mutation of the patient, the amount of AOH of the invention for splicing redirection (ie, dose), the composition of the AOH , composition, compound or auxiliary compound according to the invention, route of administration, etc. The frequency of administration may range from daily, weekly, at least every two weeks, or three weeks, or four weeks, or five weeks, or over a longer period of time.

Диапазон доз АОН, композиции, соединения или вспомогательного соединения по изобретению предпочтительно разрабатывают на основании исследований с повышающимися дозами в клинических испытаниях (применение in vivo), для которых существуют строгие требования протокола. AOH по изобретению можно использовать в дозе, которая находится в диапазоне от 0,01 до 20, предпочтительно, от 0,05 до 20 мг/кг. Подходящая интравитреальная доза будет находиться между 0,05 и 5 мг, предпочтительно, между 0,1 и 1 мг на глаз, а именно, приблизительно на глаз: 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 мг.The dosage range of the AON, composition, compound or excipient of the invention is preferably developed based on escalating dose studies in clinical trials (in vivo use) for which there are strict protocol requirements. The AOH of the invention can be used in a dose that is in the range of 0.01 to 20, preferably 0.05 to 20 mg/kg. A suitable intravitreal dose will be between 0.05 and 5 mg, preferably between 0.1 and 1 mg per eye, namely approximately per eye: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0. 5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 or 1.0 mg.

В предпочтительном варианте осуществления используют концентрацию олигонуклеотида, определенного в настоящем изобретении, которая находится в диапазоне от 0,1 до 1 мкМ. Предпочтительно, этот диапазон предназначен для применения in vitro на клеточной модели, такой как клетки сетчатки или ткань сетчатки. Более предпочтительно, применяемая концентрация находится в диапазоне от 1 до 400, даже более предпочтительно, от 10 до 200, даже более предпочтительно, от 50 до 100 нМ. Если применяют несколько различных AOH, эта концентрация или доза может относиться к общей концентрации или дозе AOH или к концентрации или дозе каждого из добавленных AOH.In a preferred embodiment, a concentration of the oligonucleotide defined in the present invention is used that is in the range of 0.1 to 1 μM. Preferably, this range is intended for in vitro use in a cellular model such as retinal cells or retinal tissue. More preferably, the concentration used is in the range of 1 to 400, even more preferably 10 to 200, even more preferably 50 to 100 nM. If several different AOHs are used, this concentration or dose may refer to the total concentration or dose of AOH or the concentration or dose of each AOH added.

В предпочтительном варианте осуществления вирусный вектор, предпочтительно, вектор на основе AAV, описанный ранее в настоящем изобретении, в качестве носителя для доставки молекулы по изобретению, вводят в дозе в диапазоне от 1х109-1х1017 вирусных частиц на инъекцию, более предпочтительно, от 1х1010-1х1012вирусных частиц на инъекцию.In a preferred embodiment, the viral vector, preferably an AAV-based vector described earlier in the present invention, as a delivery vehicle for the molecule of the invention, is administered at a dose ranging from 1x10 9 -1x10 17 viral particles per injection, more preferably from 1x10 10 -1x10 12 viral particles per injection.

Диапазоны концентрации или дозы AOH, показанные выше, представляют собой предпочтительные концентрации или дозы для применений in vivo, in vitro или ex vivo. Специалисту будет понятно, что в зависимости от использованных AOH, клетки-мишени, которую обрабатывают, гена-мишени и его уровней экспрессии, использованной среды и условий транфекции и инкубации, концентрация или доза использованных AOH может дополнительно варьировать и потребовать дальнейшей оптимизации.The AOH concentration or dosage ranges shown above represent preferred concentrations or dosages for in vivo, in vitro or ex vivo applications. One of ordinary skill in the art will appreciate that depending on the AOHs used, the target cell being treated, the target gene and its expression levels, the medium used, and the transfection and incubation conditions, the concentration or dose of AOHs used may further vary and require further optimization.

АОН по изобретению для перенаправления сплайсинга, или вирусный вектор по изобретению, или композицию по изобретению для применения по изобретению можно вводить in vivo в клетку, ткань и/или орган индивидуумов, уже заболевших или с риском развития заболевания или состояния, связанного с ABCA4, и можно вводить in vivo, ex vivo или in vitro. AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, или вирусный вектор по изобретению, или композицию по изобретению можно вводить in vivo напрямую или опосредованно в клетку, ткань и/или орган индивидуума, уже заболевшего или с риском развития заболевания или состояния, связанного с ABCA4, и можно вводить напрямую или опосредованно in vivo, ex vivo или in vitro. Поскольку болезнь Штаргардта имеет ярко выраженный фенотип в клетках сетчатки, предпочтительно, чтобы указанные клетки-мишени представляли собой клетки сетчатки, еще более предпочтительно, что указанная ткань представляет собой сетчатку, и еще более предпочтительно, что указанный орган содержит или включает в себя глаз.The AON of the invention for splicing redirection, or the viral vector of the invention, or the composition of the invention for use in the invention can be administered in vivo into a cell, tissue and/or organ of individuals who already have or are at risk of developing an ABCA4-related disease or condition, and can be administered in vivo, ex vivo or in vitro. The AOH of the invention for splicing redirection, or the viral vector of the invention, or the composition of the invention can be administered in vivo directly or indirectly into a cell, tissue and/or organ of an individual who already has or is at risk of developing an ABCA4-related disease or condition, and can administered directly or indirectly in vivo, ex vivo or in vitro. Because Stargardt disease has a distinct phenotype in retinal cells, it is preferred that said target cells are retinal cells, even more preferably said tissue is retina, and even more preferably said organ comprises or includes an eye.

Изобретение дополнительно относится к способу модуляции сплайсинга ABCA4 в клетке, включающему контакт клетки, предпочтительно, клетки сетчатки, с AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, или вирусным вектором по изобретению, или (фармацевтической) композицией по изобретению. Отличительные признаки этого аспекта предпочтительно являются признаками, ранее определенными в настоящем изобретении. Контакт клетки с AOH по изобретению для перенаправления сплайсинга, или вирусным вектором по изобретению, или композицией по изобретению можно проводить любым способом, известным специалисту в данной области. Включено применение способов для доставки AOH для перенаправления сплайсинга, вирусных векторов и композиций, как описано ранее в настоящем изобретении. Контакт может быть прямым или опосредованным и может быть in vivo, ex vivo или in vitro.The invention further relates to a method of modulating ABCA4 splicing in a cell, comprising contacting a cell, preferably a retinal cell, with an AOH of the invention to redirect splicing, or a viral vector of the invention, or a (pharmaceutical) composition of the invention. The features of this aspect are preferably those previously defined in the present invention. Contacting a cell with an AOH of the invention to redirect splicing, or a viral vector of the invention, or a composition of the invention can be accomplished by any method known to one skilled in the art. Included are the use of methods for delivering AOH for splicing redirection, viral vectors and compositions as previously described in the present invention. Contact may be direct or indirect and may be in vivo, ex vivo or in vitro.

Если не указано иначе, каждый вариант осуществления, описанный в настоящем изобретении, можно комбинировать с другим вариантом осуществления, описанным в настоящем изобретении.Unless otherwise indicated, each embodiment described in the present invention can be combined with another embodiment described in the present invention.

Определения.Definitions.

В этом изобретении и в его формуле изобретения глагол содержать и его спряжения в его неограничивающем смысле означают, что элементы, следующие за словом, включены, но элементы, конкретно не упомянутые, не исключены. Кроме того, ссылка на элемент неопределенным артиклем a или an не исключает возможности присутствия более чем одного элемента, если контекст явно не требует наличия одного и только одного из элементов. Неопределенный артикль а или an, таким образом, как правило, означает по меньшей мере один.In this invention and its claims, the verb contain and its conjugations in its non-limiting sense mean that elements following the word are included, but elements not specifically mentioned are not excluded. In addition, referring to an element by the indefinite article a or an does not exclude the possibility of the presence of more than one element, unless the context clearly requires the presence of one and only one of the elements. The indefinite article a or an thus generally means at least one.

Слово приблизительный или приблизительно при использовании в сочетании с числовым значением (например, приблизительно 10) предпочтительно означает, что значением может быть заданное значение (из 10) на 5% больше или меньше от значения.The word approximate or approximately when used in combination with a numeric value (eg, approximately 10) preferably means that the value may be a given value (out of 10) 5% more or less than the value.

- 33 043834- 33 043834

Информация о последовательностях, представленная в данном изобретении, не должна толковаться так узко, чтобы требовать включения ошибочно идентифицированного основания. Специалист способен выявить такие ошибочно идентифицированные основания и знает, как исправить такие ошибки. В случае ошибок последовательности преимущество будет иметь последовательность полипептида, которую можно получить путем экспрессии гена, присутствующего в SEQ ID NO: 1, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид.The sequence information provided in this invention should not be construed so narrowly as to require the inclusion of a misidentified base. The specialist is able to identify such misidentified grounds and knows how to correct such errors. In the event of sequence errors, preference will be given to a polypeptide sequence that can be obtained by expression of the gene present in SEQ ID NO: 1 containing the nucleic acid sequence encoding the polypeptide.

Все патентные и литературные ссылки, процитированные в настоящем описании, таким образом, включены в качестве ссылки в полном объеме.All patent and literature references cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

Варианты осуществления изобретения.Embodiments of the invention.

1. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга, который:1. Antisense oligonucleotide for splicing redirection, which:

комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 30, или их части;complementary or substantially complementary to a polynucleotide having the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 30, or a portion thereof;

предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 31, или их части;preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide having the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 31, or a portion thereof;

более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 32, или их части;more preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide having the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 32, or a portion thereof;

более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 42, или их части; и более предпочтительно комплементарен или по существу комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 43, или их части.more preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide with a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO: 42, or parts thereof; and more preferably complementary or substantially complementary to a polynucleotide with a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 43, or parts thereof.

2. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с вариантом осуществления 1, где часть, которая комплементарна или по существу комплементарна полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 30, или их части, имеет длину приблизительно от 8 до приблизительно 40, предпочтительно, приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно, приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно, приблизительно от 16 до приблизительно 24 нуклеотидов, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов.2. An antisense splice redirection oligonucleotide according to Embodiment 1, wherein the portion that is complementary or substantially complementary to a polynucleotide having the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 30, or portions thereof, has a length of approximately 8 to about 40, preferably about 10 to about 40, more preferably about 14 to about 30, more preferably about 16 to about 24 nucleotides, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides.

3. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, который имеет длину приблизительно от 8 до приблизительно 100, предпочтительно, приблизительно от 10 до приблизительно 40, более предпочтительно, приблизительно от 14 до приблизительно 30, более предпочтительно, приблизительно от 16 до приблизительно 24 нуклеотидов, а именно, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов.3. An antisense splice redirection oligonucleotide according to any of the preceding embodiments, which has a length of about 8 to about 100, preferably about 10 to about 40, more preferably about 14 to about 30, more preferably about 16 to about 24 nucleotides, namely 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 nucleotides.

4. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанный антисмысловой олигонуклеотид содержит или включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 44.4. An antisense oligonucleotide for splicing redirection in accordance with any of the preceding embodiments, wherein said antisense oligonucleotide contains or includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 44.

5. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, содержащий, по меньшей мере, один рибонуклеотид.5. An antisense splice redirection oligonucleotide according to any of the preceding embodiments, comprising at least one ribonucleotide.

6. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, содержащий, по меньшей мере, один мотив ESE (экзонного энхансера сплайсинга).6. An antisense splice redirection oligonucleotide according to any of the preceding embodiments, comprising at least one ESE (exonic splicing enhancer) motif.

7. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, содержащий 2'-О алкилтиофосфатный антисмысловой олигонуклеотид, такой как 2'-O-метил модифицированная рибоза (РНК), 2'-О-этил модифицированная рибоза, 2'-О-пропил модифицированная рибоза, и/или замещенные производные этих модификаций, такие как галогенированные производные.7. An antisense splice redirection oligonucleotide according to any of the preceding embodiments, comprising a 2'-O alkyl thiophosphate antisense oligonucleotide such as 2'-O-methyl modified ribose (RNA), 2'-O-ethyl modified ribose, 2' -O-propyl modified ribose, and/or substituted derivatives of these modifications, such as halogenated derivatives.

8. Вирусный вектор, экспрессирующий антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, в условиях, способствующих экспрессии антисмыслового олигонуклеотида для пропуска экзона.8. A viral vector expressing an antisense splice redirection oligonucleotide according to any of the preceding embodiments, under conditions that promote expression of the antisense exon skipping oligonucleotide.

9. Фармацевтическая композиция, содержащая антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-7, или вирусный вектор в соответствии с вариантом осуществления 7 и фармацевтически приемлемый эксципиент.9. A pharmaceutical composition comprising an antisense splice redirection oligonucleotide according to any of embodiments 1 to 7, or a viral vector according to embodiment 7, and a pharmaceutically acceptable excipient.

10. Фармацевтическая композиция в соответствии с вариантом осуществления 9, где фармацевтическая композиция предназначена для интравитреального введения и вводится в дозе от 0,05 до 5 мг для общего количества антисмысловых олигонуклеотидов для перенаправления сплайсинга на глаз.10. The pharmaceutical composition according to embodiment 9, wherein the pharmaceutical composition is for intravitreal administration and is administered at a dose of 0.05 to 5 mg for the total amount of antisense splice redirection oligonucleotides to the eye.

11. Фармацевтическая композиция в соответствии с вариантом осуществления 10, где фармацевтическая композиция предназначена для интравитреального введения и вводится в дозе от 0,1 до 1 мг для общего количества антисмысловых олигонуклеотидов для перенаправления сплайсинга на глаз, а именно, приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 мг общего количества антисмысловых олигонуклеотидов для перенаправления сплайсинга на глаз.11. The pharmaceutical composition according to embodiment 10, wherein the pharmaceutical composition is for intravitreal administration and is administered at a dose of 0.1 to 1 mg for a total amount of antisense splice redirection oligonucleotides per eye, namely about 0.1, 0. 2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, or 1.0 mg total antisense splice redirection oligonucleotides by eye.

- 34 043834- 34 043834

12. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-7, вектор в соответствии с вариантом осуществления 8 или композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 9-11 для применения в качестве лекарственного средства.12. An antisense splice redirection oligonucleotide according to any of embodiments 1-7, a vector according to embodiment 8, or a composition according to any one of embodiments 9-11 for use as a drug.

13. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-7, вектор в соответствии с вариантом осуществления 9 или композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 9-11 для применения для лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4, требующего регуляции сплайсинга ABCA4.13. An antisense splice redirection oligonucleotide according to any of embodiments 1-7, a vector according to embodiment 9, or a composition according to any one of embodiments 9-11 for use in treating an ABCA4-related disease or condition requiring regulation of ABCA4 splicing.

14. Применение антисмыслового олигонуклеотида для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-7, вектор в соответствии с вариантом осуществления 8 или композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 9-11 для получения лекарственного средства.14. Use of an antisense splice redirection oligonucleotide according to any of embodiments 1 to 7, a vector according to embodiment 8, or a composition according to any of embodiments 9 to 11 to produce a drug.

15. Применение антисмыслового олигонуклеотида для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1 -6, вектор в соответствии с вариантом осуществления 7 или композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 8-10 для получения лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4, требующего регуляции сплайсинга ABCA4.15. Use of an antisense splice redirection oligonucleotide according to any of embodiments 1 to 6, a vector according to embodiment 7, or a composition according to any of embodiments 8 to 10 to produce a medicament for treating a disease or condition associated with ABCA4, which requires regulation of ABCA4 splicing.

16. Применение антисмыслового олигонуклеотида для перенаправления сплайсинга в соответствии с любым из вариантов осуществления 1 -7, вектор в соответствии с вариантом осуществления 7 или композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 9-11 для лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4, требующего регуляции сплайсинга ABCA4.16. Use of an antisense splice redirection oligonucleotide according to any of embodiments 1 to 7, a vector according to embodiment 7, or a composition according to any of embodiments 9 to 11 for treating an ABCA4-related disease or condition requiring regulation ABCA4 splicing.

17. Способ регуляции сплайсинга ABCA4 в клетке, указанный способ включает контакт указанной клетки с антисмысловым олигонуклеотидом для перенаправления сплайсинга, определенным в любом из вариантов осуществления 1-7, вектором в соответствии с вариантом осуществления 7 или композицией в соответствии с любым из вариантов осуществления 9-11.17. A method of regulating ABCA4 splicing in a cell, said method comprising contacting said cell with an antisense splice redirection oligonucleotide defined in any of embodiments 1-7, a vector in accordance with embodiment 7, or a composition in accordance with any of embodiments 9- eleven.

18. Способ лечения заболевания или состояния, связанного с ABCA4, требующего регуляции сплайсинга ABCA4, у нуждающегося в этом индивидуума, указанный способ включает контакт клетки указанного с антисмысловым олигонуклеотидом для перенаправления сплайсинга, определенным в любом из вариантов осуществления 1-7, вектором в соответствии с вариантом осуществления 7 или композицией в соответствии с любым из вариантов осуществления 9-11.18. A method of treating an ABCA4-related disease or condition requiring regulation of ABCA4 splicing in an individual in need thereof, said method comprising contacting said cell with an antisense splicing redirection oligonucleotide defined in any one of embodiments 1-7, a vector in accordance with embodiment 7 or the composition according to any of embodiments 9-11.

19. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга для применения в соответствии с вариантом осуществления 12 или 13, применение в соответствии с вариантом осуществления 15 или 16 или способ в соответствии с вариантом осуществления 18, где заболевание или состояние, связанное с ABCA4, представляет собой болезнь Штаргардта.19. An antisense splice redirection oligonucleotide for use in accordance with embodiment 12 or 13, use in accordance with embodiment 15 or 16, or a method in accordance with embodiment 18, wherein the disease or condition associated with ABCA4 is Stargardt disease.

ПримерыExamples

Сначала мы оценивали in vitro эффективность ряда AOH по перенаправлению дефектов сплайсинга, вызванных мутациями c.4539+1100A>G, с.4539+1106С>Т и c.4539+2001C>A в ABCA4, на клетках эмбриональной почки человека (HEK293T). Для этого мы использовали конструкции минигенов, т.е. плазмиды, которые несут последовательность части гена ABCA4, как правило, интересующую область с наличием или отсутствием мутации, фланкированную с каждой стороны, по меньшей мере, 500 п.н. последовательности ABCA4 дикого типа. Плазмида также содержит последовательности экзонов и границы экзон-интрон экзонов 3 и 5 гена RHO на каждой стороне последовательности ABCA4, соответственно. Таким образом, можно легко измерить воздействие варианта ABCA4 на сплайсинг соответствующего экзона или псевдоэкзонов. Затем, мы использовали более крупные конструкции (называемые мидигенами) для оценки характера других вариантов глубоко в интроне, которые были обнаружены, в том числе с.769-784С>Т, c.859-540C>G, c.859-506G>C, c.1937+435C>G, c.4539+1100A>G, c.4539+1106C>T и c.5197-557G>T. Получение этих мидигенов описано в Sangermano et al. (2018) Наконец, в дополнение к анализу минигенов, мы также использовали клетки-предшественники фоторецепторов (РРС) от пациента с комбинацией мутаций ABCA4, а именно мутации c.4539+2001G>A вместе с с.4892Т>С (р.Leu1631Pro) на другом аллеле, для оценки потенциала AOH по избеганию дефектов сплайсинга. Также для оценки потенциала AOH по избеганию дефектов сплайсинга использовали РРС от пациента с комплексным аллелем, содержащим с.302+68>>Т и с.4539+2028С>Т (М2), и делецией с.6148698_6670delinsTGTGCACCTCCCTAG на другом аллеле (Lee et al., 2016). Сначала в разделе Материалы и способы описаны детали эксперимента, в то время как результаты описаны и проиллюстрированы далее в разделе Результаты.We first assessed the in vitro efficacy of a series of AOHs to redirect splicing defects caused by the c.4539+1100A>G, c.4539+1106C>T and c.4539+2001C>A mutations in ABCA4 in human embryonic kidney cells (HEK293T). To do this, we used minigene constructs, i.e. plasmids that carry the sequence of part of the ABCA4 gene, typically the region of interest with or without the mutation, flanked on each side by at least 500 bp. wild-type ABCA4 sequences. The plasmid also contains the exon sequences and exon-intron boundaries of exons 3 and 5 of the RHO gene on each side of the ABCA4 sequence, respectively. In this way, the effect of an ABCA4 variant on the splicing of the corresponding exon or pseudoexons can be easily measured. Next, we used larger constructs (called midigens) to assess the nature of other variants deep in the intron that were discovered, including c.769-784C>T, c.859-540C>G, c.859-506G>C , c.1937+435C>G, c.4539+1100A>G, c.4539+1106C>T and c.5197-557G>T. The preparation of these midigens is described in Sangermano et al. (2018) Finally, in addition to the minigene analysis, we also used photoreceptor progenitor cells (PPCs) from a patient with a combination of ABCA4 mutations, namely the c.4539+2001G>A mutation together with c.4892T>C (p.Leu1631Pro) on a different allele, to evaluate the potential of AOH to avoid splicing defects. Also, to evaluate the potential of AOH to avoid splicing defects, we used RRS from a patient with a complex allele containing c.302+68>>T and c.4539+2028C>T (M2), and a deletion of c.6148698_6670delinsTGTGCACCTCCCTAG on another allele (Lee et al ., 2016). The experimental details are described first in the Materials and Methods section, while the results are described and illustrated further in the Results section.

Материалы и способы.Materials and methods.

А. Мутации: c.4539+1100A>G & с.4539+1106С>Т - минигены.A. Mutations: c.4539+1100A>G & c.4539+1106C>T - minigenes.

Получение минигена для каждой мутации.Obtaining a minigene for each mutation.

Был создан миниген, включающий часть интрона 29, полностью экзон 30, интрон 30 и экзон 31, и часть интрона 31. Эту геномную область клонировали в вектор pCI-Neo-Rhodopsin при помощи Gateway System. Полученный вектор (называемый pCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31 дикого типа, SEQ ID NO: 50) использовали для введения мутаций c.4539+1100A>G и с.4539+1106С>Т путем сайт-специфического мута- 35 043834 генеза (новый вектор назвали pCI-Neo-Rho-ABCA4-c.4539+1100G, SEQ ID NO: 51 и pCI-Neo-RhoABCA4-c.4539+1106T, SEQ ID NO: 52). Контрольный и мутированный векторы подтверждали секвенированием по Сэнгеру. Минигенами затем трансфицировали клетки HEK293T, которые собирали через 48 ч после трансфекции и проводили анализ ОТ-ПЦР для того чтобы выявить дефект сплайсинга.A minigene was created including part of intron 29, all of exon 30, intron 30 and exon 31, and part of intron 31. This genomic region was cloned into the pCI-Neo-Rhodopsin vector using the Gateway System. The resulting vector (referred to as pCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31 wild type, SEQ ID NO: 50) was used to introduce mutations c.4539+1100A>G and c.4539+1106C>T by site-specific mutation. 043834 genesis (the new vector was named pCI-Neo-Rho-ABCA4-c.4539+1100G, SEQ ID NO: 51 and pCI-Neo-RhoABCA4-c.4539+1106T, SEQ ID NO: 52). The control and mutated vectors were confirmed by Sanger sequencing. The minigenes were then transfected into HEK293T cells, which were harvested 48 h post-transfection and RT-PCR analysis was performed to detect the splicing defect.

Конструирование и тестирование АОН.Design and testing of Caller ID.

Анализ РНК клеток HEK293T, трансфицированных минигенами, показал дефект сплайсинга премРНК, который заключается во вставке псевдоэкзона. Были сконструированы несколько AOH с использованием последовательности этого псевдоэкзона. Затем, AOH трансфицировали HEK293T совместно с минигенами. Для подтверждения эффективности AOH, проводили анализ ОТ-ПЦР на клетках. Эффективность каждого из AOH оценивали, доставляя одинаковые количества минигена и различные концентрации AOH и проводя после этого анализ ОТ-ПЦР.RNA analysis of HEK293T cells transfected with minigenes showed a defect in premRNA splicing, which consists of the insertion of a pseudoexon. Several AOHs have been constructed using the sequence of this pseudoexon. Next, AOH was transfected with HEK293T along with minigenes. To confirm the effectiveness of AOH, RT-PCR analysis was performed on cells. The effectiveness of each AOH was assessed by delivering equal amounts of minigene and different concentrations of AOH and then performing RT-PCR analysis.

Анализ ОТ-ПЦР.RT-PCR analysis.

Выделяли тотальную РНК с использованием набора NucleoSpin RNA Clean-up (каталожный № 740955-50; Macherey-Nagel, Duren, Germany) no протоколу производителя. Определяли количество РНК и синтезировали кДНК из 1 мкг РНК с использованием набора iScript cDNA synthesis (каталожный №, 1708891; Bio-Rad, Hercules, CA) по инструкциям производителя. Наконец, оценивали эффективность AOH, проводя ПЦР от экзона 30 до экзона 31 или ПЦР, покрывающую область от экзона 29 до 34.Total RNA was isolated using the NucleoSpin RNA Clean-up kit (catalog no. 740955-50; Macherey-Nagel, Duren, Germany) according to the manufacturer's protocol. RNA was quantified and cDNA was synthesized from 1 μg of RNA using the iScript cDNA synthesis kit (catalog no. 1708891; Bio-Rad, Hercules, CA) according to the manufacturer's instructions. Finally, AOH efficiency was assessed by performing PCR from exon 30 to exon 31 or PCR covering the region from exon 29 to 34.

В. Мутация: c.4539+2001C>A - миниген.B. Mutation: c.4539+2001C>A - minigene.

Получение минигена.Obtaining a minigene.

Был создан миниген, включающий часть интрона 29, полностью экзон 30, интрон 30 и экзон 31, и часть интрона 31. Эту геномную область клонировали в вектор pCI-Neo-Rhodopsin при помощи Gateway System. Полученный вектор (называемый pCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31 дикого типа, SEQ ID NO: 50) использовали для введения мутации c.4539+2001G>A мутация путем сайт-специфического мутагенеза (новый вектор назвали pCI-Neo-Rho-ABCA4-c.4539+2001A, SEQ ID NO: 53). Контрольный и мутированный векторы подтверждали секвенированием по Сэнгеру. Минигенами затем трансфицировали клетки HEK293T, которые собирали через 48 ч после трансфекции и проводили анализ ОТ-ПЦР для того чтобы выявить дефект сплайсинга.A minigene was created that included part of intron 29, all of exon 30, intron 30 and exon 31, and part of intron 31. This genomic region was cloned into the pCI-Neo-Rhodopsin vector using the Gateway System. The resulting vector (named pCI-Neo-Rho-ABCA4-30-31 wild type, SEQ ID NO: 50) was used to introduce the c.4539+2001G>A mutation by site-directed mutagenesis (the new vector was named pCI-Neo-Rho -ABCA4-c.4539+2001A, SEQ ID NO: 53). The control and mutated vectors were confirmed by Sanger sequencing. The minigenes were then transfected into HEK293T cells, which were harvested 48 h post-transfection and RT-PCR analysis was performed to detect the splicing defect.

Конструирование и тестирование АОН.Design and testing of Caller ID.

Трансфекция минигеном pCI-Neo-Rho-ABCA4-c.4539+2001A клеток HEK293T показала вставку псевдоэкзона. Были сконструированы несколько AOH с использованием последовательности этого псевдоэкзона. AOH доставляли в клетки HEK293T вместе с минигеном. Проводили анализ РНК трансфицированных клеток.Transfection of the pCI-Neo-Rho-ABCA4-c.4539+2001A minigene into HEK293T cells showed pseudoexon insertion. Several AOHs have been constructed using the sequence of this pseudoexon. AOH was delivered to HEK293T cells along with a minigene. RNA analysis of transfected cells was performed.

Анализ РНК.RNA analysis.

Выделяли тотальную РНК с использованием набора NucleoSpin RNA Clean-up (каталожный № 740955-50; Macherey-Nagel, Duren, Germany) по протоколу производителя. Определяли количество РНК и синтезировали кДНК из 1 мкг РНК с использованием набора iScript cDNA synthesis (каталожный №, 1708891; Bio-Rad, Hercules, CA) по инструкциям производителя. Наконец, оценивали эффективность AOH, проводя ПЦР от экзона 30 до экзона 31 или ПЦР, покрывающую область от экзона 29 до 34.Total RNA was isolated using the NucleoSpin RNA Clean-up kit (catalog no. 740955-50; Macherey-Nagel, Duren, Germany) according to the manufacturer's protocol. RNA was quantified and cDNA was synthesized from 1 μg of RNA using the iScript cDNA synthesis kit (catalog no. 1708891; Bio-Rad, Hercules, CA) according to the manufacturer's instructions. Finally, AOH efficiency was assessed by performing PCR from exon 30 to exon 31 or PCR covering the region from exon 29 to 34.

С. Мутации: c.4539+2001C>A и c.4539+2028C>T - оценка РРС.C. Mutations: c.4539+2001C>A and c.4539+2028C>T - RRS assessment.

Получение клеток-предшественников фоторецепторов (РРС).Generation of photoreceptor progenitor cells (PPCs).

Получали биопсию кожи пациента с гетерозиготной мутацией c.4539+2001G>A (M1) и пациента с гетерозиготной мутацией c.4539+2028C>T (М2), и получали клеточные линии фибробластов. Затем, перепрограммировали индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), как описано ранее (Sangermano et al. 2016), и дифференцировали в клетки-предшественники фоторецепторов (РРС) с использованием способа, адаптированного Sangermano et al. (2016) или Flamier et al. (2016). Проводили анализ ОТ-ПЦР на дифференцированных клетках.Skin biopsies were obtained from a patient with the heterozygous mutation c.4539+2001G>A (M1) and a patient with the heterozygous mutation c.4539+2028C>T (M2), and fibroblast cell lines were obtained. Next, induced pluripotent stem cells (iPSCs) were reprogrammed as described previously (Sangermano et al. 2016) and differentiated into photoreceptor progenitor cells (PPCs) using a method adapted from Sangermano et al. (2016) or Flamier et al. (2016). RT-PCR analysis was performed on differentiated cells.

Анализ транскрипта ABCA4.ABCA4 transcript analysis.

Через тридцать суток дифференцировки, собирали контрольные и полученные от пациентов РРС. Проводили анализ путем ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с использованием праймеров, расположенных в экзоне 2 (прямой) и экзоне 5 (обратный) или экзоне 30 (прямой) и экзоне 31 (прямой) гена ABCA4. В качестве контроля использовали праймеры актина (АСТВ). Последовательности праймеров представлены в SEQ ID NO: 54-77. Все реакционные смеси (50 мкл) содержали 10 мкМ каждой пары праймеров, Taq ДНК-полимеразу, 1 Ед/мкл (каталожный номер 11647679001, Roche, Basel, Switzerland), 10χ буфер для ПЦР без MgCl2, 25 мМ MgCl2, 10 мМ dNTPs, и 50 нг кДНК. Условия ПЦР представляли собой первый этап денатурации при 94°С в течение 5 мин с последующими 35 циклами с этапами плавления (94°С в течение 30 с), отжига (58°С в течение 30 с), и удлинения (72°С в течение 1 мин), с финальным этапом элонгации при 72°С в течение 5 мин. Продукты ПЦР разделяли на 1 мас./об.% агарозном геле и полученные полосы вырезали и очищали с помощью набора NucleoSpin®Gel&PCR cleanup (каталожный номер 740609,250, Macherey-Nagel) по протоколу производителя. Наконец, 100 нг очищенного продукта ПЦР анализировали путем секвенирования по Сэнгеру на анализаторе ДНК 3100 или 3730 (Thermo Fisher Scientific).After thirty days of differentiation, control and patient-derived RMS were collected. Reverse transcription PCR (RT-PCR) analysis was performed using primers located in exon 2 (forward) and exon 5 (reverse) or exon 30 (forward) and exon 31 (forward) of the ABCA4 gene. Actin primers (ACTB) were used as a control. The primer sequences are shown in SEQ ID NO: 54-77. All reaction mixtures (50 μl) contained 10 μM of each primer pair, Taq DNA polymerase, 1 U/μl (catalog number 11647679001, Roche, Basel, Switzerland), 10χ PCR buffer without MgCl 2 , 25 mM MgCl 2 , 10 mM dNTPs, and 50 ng cDNA. PCR conditions were a first denaturation step at 94°C for 5 min followed by 35 cycles of melting (94°C for 30 s), annealing (58°C for 30 s), and extension (72°C for 30 s). for 1 min), with a final elongation step at 72°C for 5 min. PCR products were separated on a 1 w/v agarose gel and the resulting bands were excised and purified using the NucleoSpin®Gel&PCR cleanup kit (catalog number 740609.250, Macherey-Nagel) according to the manufacturer's protocol. Finally, 100 ng of purified PCR product was analyzed by Sanger sequencing on a 3100 or 3730 DNA analyzer (Thermo Fisher Scientific).

- 36 043834- 36 043834

Конструирование антисмыслового олигонуклеотида (AOH).Antisense Oligonucleotide (AOH) Design.

Последовательность ПЭ плюс 50 пар оснований, фланкирующих обе стороны, анализировали, как описано ранее (Aartsma-Rus et al., 2012). В кратком изложении, в целом структуру РНК интерсующей области анализировали при помощи программы mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/PHKFolding-Form, последний доступ 23-07-2017), для того чтобы выявить частично открытые и закрытые области. Мотивы энхансера сплайсинга определяли при помощи ESE finder 3.0 (http://krainer01.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi?process=home, последний доступ 23-07-2017). Особое внимание уделяли областям SC35, поскольку было показано, что существует положительная корреляция между присутствием таких мотивов и эффективностью AOH (Aartsma-Rus et al., 2012). Сначала, этот анализ привел к разработке четырех AOH, двух, которые перекрывали мотив SC35 с наивысшей оценкой (АОН2 и AOH3), одному на 5'-конце ПЭ (АОН4) и одному, который перекрывался с мутацией c.4539+2001G>A (AOH1). На последующем этапе, были разработаны 22 дополнительных AOH, для поиска корреляций между эффективностью AOH и их положением относительно псевдоэкзона, их перекрытием с определенными мотивами ESE, и их специфичностью (т.е. могут ли нарушения комплементарности единичных нуклеотидов аннулировать их эффективность).The PE sequence plus the 50 bp flanking both sides was analyzed as previously described ( Aartsma-Rus et al., 2012 ). Briefly, the overall RNA structure of the intervening region was analyzed using the mfold program (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/PHKFolding-Form, last accessed 07/23/2017) to reveal partially open and closed areas. Splicing enhancer motifs were determined using ESE finder 3.0 (http://krainer01.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi?process=home, last accessed 07/23/2017). Particular attention was paid to SC35 regions, as it has been shown that there is a positive correlation between the presence of such motifs and AOH efficiency (Aartsma-Rus et al., 2012). Initially, this analysis led to the development of four AOHs, two that overlapped the highest scoring SC35 motif (AOH2 and AOH3), one at the 5' end of the PE (AOH4), and one that overlapped with the c.4539+2001G>A mutation ( AOH1). In a subsequent step, 22 additional AOHs were designed to look for correlations between the effectiveness of AOHs and their position relative to the pseudoexon, their overlap with certain ESE motifs, and their specificity (i.e., whether single nucleotide complementarity violations could abolish their effectiveness).

Окончательные последовательности AOH также оценивали по свободной энергии молекулы отдельно, возможности образования димеров, и их взаимодействие с интересующей областью. Для этого, применяли инструмент для вторичной структуры РНК (http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb, последний доступ 23-07-2017), используя инструменты для вторичной структуры РНК и предсказания двойного складывания. Мы убедились, что все AOH имели значение свободной энергии выше -4 по отдельности, выше -14 в виде димера и между 21 и 28 для AOH-область связывания. Рассчитывали с использованием расчетной энергии интересующей области минус энергия AOH, связавшегося с областью. Все последовательности AOH имели длину 19 нуклеотидов с Tm выше 46°С и содержанием GC между 40% и 65%. Последовательности и свойства AOH перечислены в табл. 1; дополнительные свойства AOH для псевдоэкзона 30-31 (345) перечислены в табл. 2. AOH были химически модифицированы добавлением тиофосфатного остова и 2-O-метильной модификации сахара 2OMe/PS к каждому нуклеотиду, и их приобретали у Eurogentec (Liege, Belgium). AOH растворяли в PBS 1х (дважды автоклавированном) до конечной концентрации 100 мкМ. Были заказаны два смысловых олигонуклеотида (SON-1 [SEQ ID NO: 280] и SON-2 [SEQ ID NO: 281]) с такой же химией для использования в качестве отрицательного контроля.The final AOH sequences were also assessed for the free energy of the molecule alone, the potential for dimer formation, and its interaction with the region of interest. To do this, the RNA Secondary Structure Tool (http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb, last accessed 07/23/2017) was used using the RNA Secondary Structure and Bifold Prediction Tools. We verified that all AOHs had free energy values above -4 individually, above -14 as a dimer, and between 21 and 28 for the AOH-binding region. Calculated using the estimated energy of the region of interest minus the energy of the AOH bound to the region. All AOH sequences were 19 nucleotides in length with a Tm greater than 46°C and a GC content between 40% and 65%. AOH sequences and properties are listed in Table. 1; Additional AOH properties for pseudoexon 30-31 (345) are listed in Table. 2. AOHs were chemically modified by adding a thiophosphate backbone and a 2-O-methyl sugar modification 2OMe/PS to each nucleotide and were purchased from Eurogentec (Liege, Belgium). AOH was dissolved in PBS 1x (autoclaved twice) to a final concentration of 100 μM. Two sense oligonucleotides (SON-1 [SEQ ID NO: 280] and SON-2 [SEQ ID NO: 281]) with the same chemistry were ordered to serve as negative controls.

Обработка АОН.Caller ID processing.

После дифференцировки, РРС обрабатывали AOH (0,5 и 1 мкМ), смешивая голые AOH непосредственно со средой для культивирования. Через 24 ч, добавляли циклогексимид (СНХ, каталожный номер С4859, Sigma Aldrich) в конечной концентрации 0,1 мг/мл и инкубировали клетки еще 24 ч. Через 48 ч после доставки AOH клетки собирали, промывали PBS и выделяли РНК. Синтез кДНК проводили с использованием 1 мкг РНК, как описано выше. Все реакции разбавляли до 20 нг/мкл, добавляя 30 мкл дистиллированной воды. Для анализа ОТ-ПЦР, использовали 80 нг кДНК для всех реакций с ABCA4, и 40 нг для анализа с АСТВ. Все реакционные смеси (25 мкл) содержали 10 мкМ каждой пары праймеров, Taq ДНК-полимеразу, 1 Ед/мкл (каталожный номер 11647679001, Roche), 10х буфер для ПЦР с MgCl2, дополненный 1 мМ MgCl2, 2 мкМ dNTPs, и 80 или 40 нг кДНК. Условия ПЦР для фрагментов ABCA4 с экзона 30 до 31 были следующими: 94°С в течение 2 мин, 35 циклов из 30 секунд при 94°С, 30 с при 58°С и 90 с при 72°С, с последующим финальным этапом из 2 мин при 72°С. Для амплификации актина ПЦР проводили в тех же условиях, за исключением времени элонгации 30 с. Полный объем продуктов ПЦР для ABCA4 и 10 мкл ампликона актина разделяли на 2 мас./об.% агарозном геле. Полученные полосы анализировали с использованием Секвенирования по Сэнгеру. Соотношение между правильно и неправильно сплайсированными вариантами оценивали с использованием программы Fiji (Schindelin et al., 2012).After differentiation, RPCs were treated with AOH (0.5 and 1 μM) by mixing bare AOH directly with the culture medium. After 24 h, cycloheximide (CHX, catalog number C4859, Sigma Aldrich) was added at a final concentration of 0.1 mg/ml and the cells were incubated for an additional 24 h. 48 h after AOH delivery, cells were harvested, washed with PBS, and RNA was isolated. cDNA synthesis was performed using 1 μg of RNA as described above. All reactions were diluted to 20 ng/μL by adding 30 μL of distilled water. For RT-PCR analysis, 80 ng of cDNA was used for all reactions with ABCA4, and 40 ng for the analysis with ACTB. All reaction mixtures (25 µl) contained 10 µM of each primer pair, 1 U/µl Taq DNA polymerase (catalog number 11647679001, Roche), 10x MgCl 2 PCR buffer supplemented with 1 mM MgCl 2 , 2 µM dNTPs, and 80 or 40 ng cDNA. PCR conditions for ABCA4 fragments from exons 30 to 31 were as follows: 94°C for 2 min, 35 cycles of 30 seconds at 94°C, 30 s at 58°C, and 90 s at 72°C, followed by a final step of 2 min at 72°C. For actin amplification, PCR was performed under the same conditions, except for the elongation time of 30 s. The total volume of ABCA4 PCR products and 10 μl of actin amplicon were separated on a 2 wt/vol% agarose gel. The resulting bands were analyzed using Sanger Sequencing. The ratio between correctly and incorrectly spliced variants was assessed using the Fiji program ( Schindelin et al., 2012 ).

D. Мутации: c.769-784C>T, c.859-540C>G, c.859-506G>C, c.1937+435C>G, c.4539+1100A>G, c.4539+1106c>T и c.5197-557C>T - мидигены.D. Mutations: c.769-784C>T, c.859-540C>G, c.859-506G>C, c.1937+435C>G, c.4539+1100A>G, c.4539+1106c> T and c.5197-557C>T are midigens.

Получение мидигена для каждой мутации.Obtaining a midigen for each mutation.

Был создан мидиген для каждой мутации (Sangermano et al., 2018). Эти мидигены включали существенный фрагмент геномной ДНК ABCA4 на каждой стороне соответствующих мутаций, часто охватывающий один или несколько фланкирующих экзонов. Эту геномную область клонировали в вектор pCINeo-Rhodopsin с использованием Gateway System. Полученные векторы (pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6intron7 дикого типа (SEQ ID NO: 290), pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6-intronll дикого типа (SEQ ID NO: 292), pCI-Neo-Rho-ABCA4-intronll-intronl5 дикого типа (SEQ ID NO: 295), pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron29intron32 дикого типа (SEQ ID NO: 297), pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron31-intron37 дикого типа (SEQ ID NO: 300)) применяли для введения мутаций c.769-784C>T, c.859-540C>G, c.859-506G>C, c.1937+435C>G, c.4539+1100A>G, c.4539+1106C>T и c.5197-557G>T в соответствующий вектор путем сайтспецифического мутагенеза (новые векторы назвалиA midigen for each mutation was created (Sangermano et al., 2018). These midigens included a substantial fragment of ABCA4 genomic DNA on each side of the corresponding mutations, often spanning one or more flanking exons. This genomic region was cloned into the pCINeo-Rhodopsin vector using the Gateway System. Resulting vectors (pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6intron7 wild type (SEQ ID NO: 290), pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6-intronll wild type (SEQ ID NO: 292), pCI-Neo-Rho-ABCA4 -intronll-intronl5 wild type (SEQ ID NO: 295), pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron29intron32 wild type (SEQ ID NO: 297), pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron31-intron37 wild type (SEQ ID NO : 300)) were used to introduce mutations c.769-784C>T, c.859-540C>G, c.859-506G>C, c.1937+435C>G, c.4539+1100A>G, c. 4539+1106C>T and c.5197-557G>T into the corresponding vector by site-specific mutagenesis (the new vectors were called

- 37 043834 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6Intron7 C.769-784T (SEQ ID NO: 291), pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6intronll C.859-540G (SEQ ID NO: 293), pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6intronll C.859-506C (SEQ ID NO: 294), pCI-Neo-Rho-ABCA4intronll-intronl5 C.1937+435G (SEQ ID NO: 296), pCI-Neo-RhoABCA4-intron29-intron32 C.4539+1100G (SEQ ID NO: 298), pCI-NeoRho-ABCA4-intron29-intron32 C.4539+1106T (SEQ ID NO: 299) и pCINeo-Rho-ABCA4-lntron31-lntron37 C.5197-557T (SEQ ID NO: 301)).- 37 043834 pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6Intron7 C.769-784T (SEQ ID NO: 291), pCI-Neo-Rho-ABCA4-intron6intronll C.859-540G (SEQ ID NO: 293), pCI-Neo -Rho-ABCA4-intron6intronll C.859-506C (SEQ ID NO: 294), pCI-Neo-Rho-ABCA4intronll-intronl5 C.1937+435G (SEQ ID NO: 296), pCI-Neo-RhoABCA4-intron29-intron32 C.4539+1100G (SEQ ID NO: 298), pCI-NeoRho-ABCA4-intron29-intron32 C.4539+1106T (SEQ ID NO: 299) and pCINeo-Rho-ABCA4-lntron31-lntron37 C.5197-557T ( SEQ ID NO: 301)).

Контрольный и мутированный векторы подтверждали секвенированием по Сэнгеру. Мидигенами затем трансфицировали клетки HEK293T, которые собирали через 48 ч после трансфекции и проводили анализ ОТ-ПЦР для того чтобы выявить дефект сплайсинга.The control and mutated vectors were confirmed by Sanger sequencing. Midigens were then transfected into HEK293T cells, which were harvested 48 h post-transfection and RT-PCR analysis was performed to detect the splicing defect.

Конструирование и тестирование АОН.Design and testing of Caller ID.

Анализ РНК клеток HEK293T, трансфицированных мидигенами, показал дефект сплайсинга премРНК, который заключается во вставке псевдоэкзона. Были сконструированы несколько AOH с использованием последовательности этого псевдоэкзона. Затем, AOH трансфицировали HEK293T совместно с мидигенами. Для подтверждения эффективности AOH, проводили анализ ОТ-ПЦР на клетках. Эффективность каждого из AOH оценивали, доставляя одинаковые количества мидигена и различные концентрации AOH и проводя после этого анализ ОТ-ПЦР. В каждый эксперимент был включен один SON в качестве отрицательного контроля. Во время окончательной проверки мы обнаружили, что АОН1, который был разработан для мутации c.859-540C>G был заказан неправильно, и вместо него была введена и получена последовательность AOH3 для мутации c.5197-557G>T. Это также повлияло на интерпретацию результатов.RNA analysis of HEK293T cells transfected with midigens showed a defect in premRNA splicing, which consists of the insertion of a pseudoexon. Several AOHs have been constructed using the sequence of this pseudoexon. Next, AOH was transfected with HEK293T along with midigens. To confirm the effectiveness of AOH, RT-PCR analysis was performed on cells. The effectiveness of each AOH was assessed by delivering equal amounts of midigene and different concentrations of AOH and then performing RT-PCR analysis. One SON was included in each experiment as a negative control. During final verification, we discovered that AOH1, which was designed for the c.859-540C>G mutation, was ordered incorrectly, and instead the AOH3 sequence was inserted and obtained for the c.5197-557G>T mutation. This also affected the interpretation of the results.

Анализ ОТ-ПЦР.RT-PCR analysis.

Выделяли тотальную РНК с использованием набора NucleoSpin RNA Clean-up (каталожный № 740955-50; Macherey-Nagel, Duren, Germany) по протоколу производителя. Определяли количество РНК и синтезировали кДНК из 1 мкг РНК с использованием набора iScript cDNA synthesis (каталожный №, 1708891; Bio-Rad, Hercules, CA) по инструкциям производителя. Наконец, оценивали эффективность AOH, проводя ПЦР с использованием соответствующих праймеров ABCA4 (SEQ ID NO: 302, родопсин ехЗ fw; SEQ ID NO: 303, ABCA4 ex7 rev;Total RNA was isolated using the NucleoSpin RNA Clean-up kit (catalog no. 740955-50; Macherey-Nagel, Duren, Germany) according to the manufacturer's protocol. RNA was quantified and cDNA was synthesized from 1 μg of RNA using the iScript cDNA synthesis kit (catalog no. 1708891; Bio-Rad, Hercules, CA) according to the manufacturer's instructions. Finally, the efficiency of AOH was assessed by performing PCR using the corresponding ABCA4 primers (SEQ ID NO: 302, rhodopsin ex3 fw; SEQ ID NO: 303, ABCA4 ex7 rev;

SEQ ID NO: 304, ABCA4 ex7 fw; SEQ ID NO: 305, ABCA4 ex8 rev; SEQ ID NO: 306, ABCA4 exl3 fw; SEQ ID NO: 307, ABCA4 exl4 rev; SEQ ID NO: 308, ABCA4 ex30 fw; SEQ ID NO: 309, ABCA4 ex32 rev; SEQ ID NO: 310, ABCA4 ex32 tw; SEQ ID NO: 311, ABCA4 ex37 rev).SEQ ID NO: 304, ABCA4 ex7 fw; SEQ ID NO: 305, ABCA4 ex8 rev; SEQ ID NO: 306, ABCA4 exl3 fw; SEQ ID NO: 307, ABCA4 exl4 rev; SEQ ID NO: 308, ABCA4 ex30 fw; SEQ ID NO: 309, ABCA4 ex32 rev; SEQ ID NO: 310, ABCA4 ex32 tw; SEQ ID NO: 311, ABCA4 ex37 rev).

Результаты.Results.

A. Минигенными конструкциями с мутацией c.4539+1100A>G или с. 4539+1106С>Т трансфицировали клетки НЕК293Т вместе с конструкцией с последовательностью ABCA4 дикого типа. Как показано на фиг. 1, обе мутации приводят к вставке псевдоэкзона размером 86 п.н. в транскрипт (дорожки, помеченные NT), хотя были также выявлены некоторые оставшиеся транскрипты дикого типа. Трансфекция тремя различными AOH показала, что для обеих мутаций вставка псевдоэкзона была полностью отменена в присутствии АОН1 (AOH-1 для псевдоэкзона 30-31(68), SEQ ID NO: 15), и АОН2 (AOH-2 для псевдоэкзона 30-31(68), SEQ ID NO: 18), в то время как AOH3 (AOH-3 для псевдоэкзона 30-31(68), SEQ ID NO: 21) привел к частичному перенаправлению событий сплайсинга (фиг. 1). Эти данные демонстрируют способность АОН перенаправлять события нарушенного сплайсинга, вызванные мутациями c.4539+1100A>G или c.4539+1 106C>T.A. Minigene constructs with mutation c.4539+1100A>G or c. 4539+1106C>T were transfected into HEK293T cells along with a construct with the wild-type ABCA4 sequence. As shown in FIG. 1, both mutations result in the insertion of an 86 bp pseudoexon. into the transcript (lanes labeled NT), although some remaining wild-type transcripts were also detected. Transfection with three different AOHs showed that for both mutations, pseudoexon insertion was completely abolished in the presence of AOH1 (AOH-1 for pseudoexon 30-31(68), SEQ ID NO: 15), and AOH2 (AOH-2 for pseudoexon 30-31( 68), SEQ ID NO: 18), while AOH3 (AOH-3 for pseudoexon 30-31(68), SEQ ID NO: 21) resulted in partial redirection of splicing events (Fig. 1). These data demonstrate the ability of AON to redirect disrupted splicing events caused by the c.4539+1100A>G or c.4539+1 106C>T mutations.

B. Минигенной конструкцией с мутацией c.4539+2001A>G (A) трансфицировали клетки HEK293T вместе с конструкцией с последовательностью ABCA4 дикого типа (G). Минигенной конструкцией с мутацией c.4539+2001G>A трансфицировали клетки HEK293T вместе с конструкцией с последовательностью ABCA4 дикого типа. Анализ ОТ-ПЦР с использованием РНК, полученной из этих клеток выявил включение псевдоэкзона, соответствующего последовательности размером 345 п.н. в интрон 30, но только когда клетки культивировали в присутствии циклогексимида (+СНХ), вещества, которое постоянно используют для подавления нонсенс-опосредованной деградации неправильных транскриптов. Как показано на фиг. 3, все четыре AOH (AOH1=А0Н-1 для псевдоэкзона 30-31(345), SEQ ID NO: 35, АОН2= AOH-2 для псевдоэкзона 30-31(345), SEQ ID NO: 38, AOH3=AOH-3 для псевдоэкзона 30-31(345), SEQ ID NO: 41, АОН4= AOH-4 для псевдоэкзона 30-31(345), SEQ ID NO: 44),) полностью перенаправляли сплайсинг ABCA4 в отличие от SON. При использовании конструкции WT (левая дорожка), как и ожидалось, был выявлен только интактный продукт без псевдоэкзона. В настоящем изобретении AOH взаимозаменяемо обозначены как AOH-n и AOHn, где n представляет собой целое число; AOH могут быть показаны с - или без -.B. The minigene construct with the c.4539+2001A>G mutation (A) was transfected into HEK293T cells along with the wild-type ABCA4 sequence construct (G). The minigene construct with the c.4539+2001G>A mutation was transfected into HEK293T cells along with a construct with the wild-type ABCA4 sequence. RT-PCR analysis using RNA obtained from these cells revealed the inclusion of a pseudoexon corresponding to a 345-bp sequence. into intron 30, but only when cells were cultured in the presence of cycloheximide (+CHX), a substance routinely used to inhibit nonsense-mediated degradation of incorrect transcripts. As shown in FIG. 3, all four AOHs (AOH1=A0H-1 for pseudoexon 30-31(345), SEQ ID NO: 35, AOH2=AOH-2 for pseudoexon 30-31(345), SEQ ID NO: 38, AOH3=AOH- 3 for pseudoexon 30-31(345), SEQ ID NO: 41, AOH4= AOH-4 for pseudoexon 30-31(345), SEQ ID NO: 44),) completely redirected ABCA4 splicing in contrast to SON. Using the WT construct (left lane), as expected, only the intact product without the pseudoexon was detected. In the present invention, AOHs are denoted interchangeably as AOH-n and AOHn, where n is an integer; AOH may be shown with - or without -.

С. В клетках-предшественниках фоторецепторов, полученных от пациента, гетерозиготного по мутации c.4539+2001G>A (M1) ABCA4, анализ ОТ-ПЦР с использованием РНК, полученной из этих клеток выявил включение псевдоэкзона, соответствующего последовательности размером 345 п.н. в интрон 30,C. In photoreceptor progenitor cells obtained from a patient heterozygous for the c.4539+2001G>A (M1) ABCA4 mutation, RT-PCR analysis using RNA obtained from these cells revealed the inclusion of a pseudoexon corresponding to a 345 bp sequence . in intron 30,

- 38 043834 но только когда клетки культивировали в присутствии циклогексимида (+СНХ), вещества, которое постоянно используют для подавления нонсенс-опосредованной деградации неправильных транскриптов. Как показано на фиг. 2, после трансфекции четырьмя различными AOH, нацеленными на этот псевдоэкзон (АОН1=АОН-1 для псевдоэкзона 30-31(345), SEQ ID NO: 35, АОН2= AOH-2 для псевдоэкзона 3031(345), SEQ ID NO: 38, AOH3=AOH-3 для псевдоэкзона 30-31(345), SEQ ID NO: 41, AOH4=AOH-4 для псевдоэкзона 30-31(345), SEQ ID NO: 44), вставка псевдоэкзона полностью исчезла после введения АОН1 и АОН4. Этого не произошло в случае отрицательного контроля олиго SON (SEQ ID NO: 45), который имеет последовательность, комплементарную АОН1, что демонстрирует, что АОН1 и АОН4 эффективно и специфически перенаправляют события нарушенного сплайсинга, вызванные мутацией c.4539+2001G>A.- 38 043834 but only when the cells were cultured in the presence of cycloheximide (+CHX), a substance that is routinely used to suppress nonsense-mediated degradation of incorrect transcripts. As shown in FIG. 2, after transfection with four different AOHs targeting this pseudoexon (AOH1=AOH-1 for pseudoexon 30-31(345), SEQ ID NO: 35, AOH2=AOH-2 for pseudoexon 3031(345), SEQ ID NO: 38 , AOH3=AOH-3 for pseudoexon 30-31(345), SEQ ID NO: 41, AOH4=AOH-4 for pseudoexon 30-31(345), SEQ ID NO: 44), the pseudoexon insertion completely disappeared after the introduction of AOH1 and Caller ID4. This was not the case with the negative control oligo SON (SEQ ID NO: 45), which has a sequence complementary to AON1, demonstrating that AON1 and AON4 efficiently and specifically redirect disrupted splicing events caused by the c.4539+2001G>A mutation.

Чтобы определить, приводят ли варианты c.4539+2001G>A (M1) и с. 4539+2028C>T (М2) к нарушению сплайсинга пре-мРНК ABCA4, получали клеточные линии фибробластов от двух неродственных пациентов с болезнью Штаргардта (STGD1). Пациент с STGD1 с M1 имел миссенс-вариант с.4892Т>С (р.Leu1631Pro) в транс-ориентации (Webster et al., 2001). Пациент с STGD1 с М2 имел вариант в глубине интрона с.302+68С>Т в цис-ориентации, в то время как делеция с.6148-698_6670delinsTGTGCACCTCCCTAG (р.?) присутствовала на другом аллеле. Кроме того, получали линию фибробластов от здорового контроля. Все клетки культивировали в отсутствие и присутствии циклогексимида (СНХ), соединения, которое обычно используют для подавления нонсенсопосредованного разрушения продуктов РНК, несущих мутации, укорачивающие белок. Анализ ОТ-ПЦР с праймерами, расположенными в экзонах 30 и 31, выявил только чисты продукт, соответствующий ожидаемому продукту с экзонами 30 и 31 (фиг. 4). Никаких продуктов с нарушениями сплайсинга не было выявлено в фибробластах от пациентов с STGD1.To determine whether variants c.4539+2001G>A (M1) and c. 4539+2028C>T (M2) to disruption of ABCA4 pre-mRNA splicing, fibroblast cell lines were obtained from two unrelated patients with Stargardt disease (STGD1). The STGD1 patient with M1 had a missense variant c.4892T>C (p.Leu1631Pro) in trans (Webster et al., 2001). The patient with STGD1 with M2 had a variant deep in intron c.302+68C>T in cis-orientation, while the deletion c.6148-698_6670delinsTGTGCACCTCCCTAG (p?) was present on the other allele. In addition, a fibroblast line was obtained from healthy controls. All cells were cultured in the absence and presence of cycloheximide (CHX), a compound commonly used to inhibit nonsense-mediated destruction of RNA products carrying protein-truncating mutations. RT-PCR analysis with primers located in exons 30 and 31 revealed only a pure product corresponding to the expected product with exons 30 and 31 (Fig. 4). No splicing abnormalities were detected in fibroblasts from STGD1 patients.

Для исследования потенциально специфических для сетчатки дефектов сплайсинга, которые вызваны двумя мутациями ABCA4 глубоко в интроне, контрольные фибробласты и фибробласты пациентов были перепрограммированы в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) при помощи лентивирусной трансдукции факторами Яманаки (Takahashi et al., 2006). Количественная ПЦР (q-ПЦР) (фиг. 7) и иммунофлуоресцентный анализ (данные не показаны) подтвердили плюрипотентность iPSC. Затем, эти iPSCs дифференцировали в течение одного месяца в клетки-предшественники фоторецепторов (PPCs). Мы использовали протокол, описанный ранее Flamier и коллегами (Flamier et al., 2016), для получения относительно гомогенной популяции колбочковых клеток, поскольку клетки, которые в первую очередь поражаются при STGD1, представляют собой колбочковые фоторецепторные клетки. Характеристика РРС, полученных от контроля и пациентов, выявила значимо повышенную экспрессию ABCA4, которая была приблизительно в 40 раз выше у РРС, чем у контрольных iPSC, но только приблизительно в три раза выше у М1-и М2-РРС по сравнению с M1- и M2-iPSC. Дополнительная характеристика РРС выявила, что все три клеточных линии дифференцировали в направлении S-колбочек, хотя контрольные РРС экспрессировали более высокие количества CRX и OPN1SW по сравнению с M1- и М2-РРС (фиг. 7В).To investigate potential retina-specific splicing defects that are caused by two ABCA4 mutations deep in the intron, control and patient fibroblasts were reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) using lentiviral transduction with Yamanaka factors (Takahashi et al., 2006). Quantitative PCR (q-PCR) (Fig. 7) and immunofluorescence analysis (data not shown) confirmed the pluripotency of iPSCs. These iPSCs were then differentiated over one month into photoreceptor progenitor cells (PPCs). We used the protocol described previously by Flamier and colleagues ( Flamier et al., 2016 ) to obtain a relatively homogeneous population of cone cells, since the cells primarily affected in STGD1 are cone photoreceptor cells. Characterization of RPCs derived from controls and patients revealed significantly increased ABCA4 expression, which was approximately 40-fold higher in RPCs than in control iPSCs, but only approximately three times higher in M1- and M2-RRS compared to M1- and M2-iPSC. Additional characterization of RPCs revealed that all three cell lines differentiated toward S-cones, although control RPCs expressed higher amounts of CRX and OPN1SW compared to M1- and M2-RRSs ( Fig. 7B ).

Поскольку ABCA4 сильно экспрессировался в РРС, мы провели анализ RT-ПЦР от экзона 30 до экзона 31, который показал неправильные транскрипты и в M1- и в М2-полученных РРС после обработки СНХ, но не в контрольных РРС (фиг. 4А). Полуколичественная оценка соотношения между правильными и неправильными вариантами сплайсинга в образцах, обработанных СНХ, выявила, что ~25% транскриптов ABCA4 у пациента с M1 и ~15% транскриптов ABCA4 у пациента с М2 были с нарушениями (фиг. 4В). Более детальный анализ всех полос путем секвенирования по Сэнгеру выявил ПЭ размером 345 н., содержащий преждевременный стоп-кодон (фиг. 5), который по прогнозу приводит к укороченному белковому продукту р.Arg1514Leufs*36. Интересно то, что, оба варианта включают одинаковый ПЭ в транскрипт мРНК после обработки СНХ. После того как была идентифицирована последовательность, мы изучили влияние обоих вариантов на сплайсинг. В соответствии со всеми предсказаниями при помощи программы, ни M1, ни М2 не изменяют силу сайта акцептора или донора сплайсинга (фиг. 5). Сайт донора сплайсинга для ПЭ размером 345 н. содержит в качестве канонической последовательности сайта сплайсинга GC, которая распознается только программой Splice-Site-Finder-Like (SSFL). Дальнейшие предсказания in silico показали, что M1 увеличивает силу сайта экзонного энхансера сплайсинга SF2 и создает новый мотив SRp55, в то время как М2 создает один мотив SC35 и два мотива SRp40 (фиг. 5).Because ABCA4 was highly expressed in RPCs, we performed RT-PCR analysis from exon 30 to exon 31, which showed abnormal transcripts in both M1- and M2-derived RPCs after CHX treatment, but not in control RPCs ( Fig. 4A ). Semiquantitative assessment of the ratio between correct and incorrect splice variants in CHX-treated samples revealed that ∼25% of ABCA4 transcripts in patient M1 and ∼15% of ABCA4 transcripts in patient M2 were dysregulated ( Fig. 4B ). More detailed analysis of all bands by Sanger sequencing revealed a 345 nt PE containing a premature stop codon (Fig. 5) predicted to result in the truncated protein product p.Arg1514Leufs*36. Interestingly, both variants include the same PE in the mRNA transcript after CHX treatment. Once the sequence was identified, we examined the effect of both variants on splicing. Consistent with all predictions from the program, neither M1 nor M2 altered the strength of the splice acceptor or donor site (Fig. 5). The splice donor site for PE is 345 nt. contains as a canonical splice site sequence GC, which is recognized only by the Splice-Site-Finder-Like (SSFL) program. Further in silico predictions revealed that M1 increases the strength of the SF2 exonic enhancer splice site and creates a new SRp55 motif, while M2 creates one SC35 motif and two SRp40 motifs (Fig. 5).

Дальнейший углубленный анализ всех полос, полученных при ОТ-ПЦР, выявил, что одна полоса содержит гетеродуплексы правильно сплайсированного транскрипта вместе с одним из транскриптов с ПЭ (фиг. 4). Кроме того, очень слабая полоса, у которой отсутствовали последние 73 п.н. экзона 30, была обнаружена во всех образцах, обработанных СНХ, включая контроль. Этот альтернативный транскрипт, который также был выявлен в полосе гетеродуплекса (фиг. 4), объясняется относительно слабым сайтом донора сплайсинга (оценка Human Splicing Finder (HSF): 75,9). Этот продукт сплайсинга (r.4467_4539del, р.Cys1490Glufs*12) был также выявлен как результат вариантов сайта неканонического сплайсинга в природном донорском сайте сплайсинга экзона 30 (R. Sangermano, M. Khan et al., 2018). Интересно, чтоFurther in-depth analysis of all RT-PCR bands revealed that one band contained heteroduplexes of the correctly spliced transcript together with one of the PE transcripts (Fig. 4). In addition, there was a very faint band that was missing the last 73 bp. exon 30 was detected in all CHX-treated samples, including the control. This alternative transcript, which was also detected in the heteroduplex band (Fig. 4), is attributed to the relatively weak splice donor site (Human Splicing Finder (HSF) score: 75.9). This splice product (r.4467_4539del, p.Cys1490Glufs*12) was also identified as a result of non-canonical splice site variants in the natural splice donor site of exon 30 (R. Sangermano, M. Khan et al., 2018). I wonder what

- 39 043834 этот новый сайт донора был ранее описан как сайт акцептора сплайсинга (оценка HSF: 89,6), создающий изоформу без первых 114 п.н. экзона 30 (Gerber et al., 1998).- 39 043834 this new donor site was previously described as a splice acceptor site (HSF score: 89.6), creating an isoform without the first 114 bp. exon 30 (Gerber et al., 1998).

В семи случаях STGD1 с М2, в которых это было исследовано, С.ЗО2+68С>Т была обнаружена в цис-ориентации (R. Allikmets, неопубликованные данные; Braun et al., 2013; Lee et al., 2016 и Zernant et al., 2014). Для того чтобы изучить вклад этого варианта в патологию STGD1, мы провели ОТ-ПЦР мРНК из контрольных РРС, М1-и М2-РРС, обработанных и необработанных СНХ, а также из мРНК сетчатки взрослого человека. Как показано на фиг. 8, праймеры ПЦР, расположенные в экзонах 2 и 5, производили продукт канонического сплайсинга размером 459 н., а также меньший фрагмент размером 317 н. во всех РРС и сетчатке человека. Подтверждение полос секвенированием по Сэнгеру выявило, что в 317-н. фрагменте отсутствовал экзон 3 (размер: 142 п.н.). Никаких других продуктов сплайсинга не наблюдали, что указывает на то, что вариант С.ЗО2+68С>Т не приводит к активации криптических сайтов сплайсинга и/или экзонным энхансерам сплайсинга.In the seven cases of STGD1 with M2 in which this was examined, C.3O2+68C>T was found in cis orientation (R. Allikmets, unpublished data; Braun et al., 2013; Lee et al., 2016 and Zernant et al. al., 2014). To examine the contribution of this variant to STGD1 pathology, we performed RT-PCR on mRNA from control RMS, M1- and M2-RMS, CHX-treated and untreated RMS, and from adult human retinal mRNA. As shown in FIG. 8, PCR primers located in exons 2 and 5 produced a canonical splice product of 459 nt as well as a smaller fragment of 317 nt. in all RMS and human retina. Confirmation of the bands by Sanger sequencing revealed that at 317-nt. the fragment lacked exon 3 (size: 142 bp). No other splice products were observed, indicating that the C.3O2+68C>T variant does not lead to activation of cryptic splice sites and/or exonic splice enhancers.

Как только был выяснен механизм, связанный с вариантами M1 и М2, нашей целью стала разработка терапевтического подхода, основанного на регуляции сплайсинга, для пропуска ПЭ. Привлекательным и эффективным способом являлось применение AOH, малых молекул РНК, которые способны проникать в клетку, связываться с пре-мРНК и модифицировать рисунок сплайсинга. Для того чтобы повысить их аффинность связывания и избежать активации РНКазы Н (и, таким образом, разрушения транскрипта), мы использовали 2-O-метил-модифицированные РНК AOH с тиофосфатными (2OMe/PS) остовами, описанными ранее (Collin et al., 2012; Garanto et al., 2016; Gerard et al., 2012 и Slijkerman et al., 2016). В целом, мы сконструировали четыре АОНа: два, для того чтобы заблокировать мотив SC35 с наивысшей оценкой, расположенный на 3'-конце ПЭ (АОН2, AOH3), один для того чтобы заблокировать второй по оценке SC35 на 5'-конце ПЭ (АОН4), и один для того чтобы заблокировать свежеобразованный мотив SRp55, связанный с M1 (AOH1; фиг. 6А). Кроме того, для этой же области был сконструирован смысловой олигонуклеотид (SON), комплементарный АОН1 и содержащий такие же химические модификации, как и другие АОНы, но не способный связываться с пре-мРНК. АОНы и SON доставляли к РРС после месяца дифференцировки и анализировали РНК через 48 ч. Как и ожидалось, обработка СНХ увеличивала присутствие неправильно сплайсированных транскриптов в клетках без лечения (фиг. 6В и С). Кроме того, не было различий между нелеченными клетками и клетками, обработанными SON. Мы продемонстрировали, что АОНы эффективны для пропуска экзонов. Мы обнаружили, что АОН4 был способен эффективно производить до ~75% пропуска ПЭ в обеих клеточных линиях при двух различных концентрациях (фиг. 6D), в то время как АОН1 был очень эффективен на клеточной линии с M1. АОН2 показал меняющуюся эффективность, в то время как AOH3 был способен перенаправлять сплайсинг и при 0,5 мкМ, и при 1 мкМ (фиг. 6В, С и D). Одним из объяснений для АОН2 и AOH3, показывающих такое различное поведение, несмотря на нацеливания на одну область, могли бы быть свойства AOH (табл. 1, 2). AOH3 по сравнению с АОН2 имеет более низкое содержание GC и Tm, что может влиять на стабильность и связывающую способность, таким образом, объясняя низкую эффективность.Once the mechanism associated with the M1 and M2 variants was elucidated, our goal was to develop a therapeutic approach based on splicing regulation to skip PE. An attractive and effective approach has been the use of AOHs, small RNA molecules that can enter cells, bind to pre-mRNA, and modify the splicing pattern. To increase their binding affinity and avoid RNase H activation (and thus transcript degradation), we used 2-O-methyl-modified AOH RNAs with thiophosphate (2OMe/PS) backbones described previously (Collin et al., 2012; Garanto et al., 2016; Gerard et al., 2012 and Slijkerman et al., 2016). In total, we designed four AOHs: two to block the highest-scoring SC35 motif located at the 3' end of the PE (AOH2, AOH3), one to block the second-scored SC35 motif at the 5' end of the PE (AOH4 ), and one to block the newly formed SRp55 motif associated with M1 (AOH1; Fig. 6A ). In addition, a sense oligonucleotide (SON) was designed for this same region, complementary to AON1 and containing the same chemical modifications as other AONs, but unable to bind to pre-mRNA. AONs and SONs were delivered to RPCs after a month of differentiation and RNA was analyzed 48 h later. As expected, CHX treatment increased the presence of misspliced transcripts in untreated cells (Fig. 6B and C). Additionally, there were no differences between untreated and SON-treated cells. We demonstrate that AONs are effective for exon skipping. We found that AOH4 was able to efficiently produce up to ∼75% PE skip in both cell lines at two different concentrations ( Figure 6D ), while AOH1 was highly effective in the M1 cell line. AOH2 showed variable efficiency, while AOH3 was able to redirect splicing at both 0.5 μM and 1 μM (Fig. 6B, C, and D). One explanation for AOH2 and AOH3 showing such different behavior despite targeting the same region could be the properties of AOH (Tables 1, 2). AOH3, compared to AOH2, has lower GC and Tm content, which may affect stability and binding capacity, thus explaining the low efficiency.

Для того чтобы дополнительно расширить наш поиск наиболее мощных AOH для перенаправления дефектов сплайсинга, вызванных мутацией c.4539+2001G>A, мы сконструировали и исследовали 22 дополнительных АОНа (АОН5-АОН26, SEQ ID NO: 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253 и 256, соответственно), и оценили их способность перенаправлять сплайсинг ABCA4, предупреждая включение псевдоэкзона размером 345 н.. Ранее исследованные АОНы 1-4 (SEQ ID NO: 35/184, 38/187, 41/190 и 44/193, соответственно) брали отдельно, а также два смысловых олигонуклеотида(SON1 [SEQ ID NO: 280] и S0N2 [SEQ ID NO: 281]). Результаты показаны на фиг. 9. помимо AOH 1 и 4, другие эффективные АОНы включали АОН9, АОН10, АОН14, АОН17, АОН18, АОН22, АОН23 и АОН24. Умеренно эффективные АОНы включали АОН2, АОН8, АОН11, АОН13, АОН16, АОН20 и АОН21. Слабоэффективные или неэффективные АОНы включали AOH3, АОН5, АОН6, АОН7, АОН12, АОН15, АОН19, АОН25 и АОН26. При сравнении сойств этих AOH стал очевидным ряд вещей:To further expand our search for the most potent AOHs to redirect splicing defects caused by the c.4539+2001G>A mutation, we designed and screened 22 additional AOHs (AOH5-AOH26, SEQ ID NO: 196, 199, 202, 205, 208 , 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, and 256, respectively) and assessed their ability to redirect ABCA4 splicing by preventing inclusion of a 345 nt pseudoexon .. Previously studied AONs 1-4 (SEQ ID NO: 35/184, 38/187, 41/190 and 44/193, respectively) were taken separately, as well as two sense oligonucleotides (SON1 [SEQ ID NO: 280] and S0N2 [SEQ ID NO: 281]). The results are shown in Fig. 9. In addition to AOH 1 and 4, other effective AOHs included AOH9, AOH10, AOH14, AOH17, AOH18, AOH22, AOH23, and AOH24. Moderately effective AONs included AON2, AON8, AON11, AON13, AON16, AON20, and AON21. Weakly effective or ineffective AOHs included AOH3, AOH5, AOH6, AOH7, AOH12, AOH15, AOH19, AOH25, and AOH26. When comparing the properties of these AOHs, a number of things became apparent:

i) АОНы, нацеленные на области вне псевдоэкзона (АОН5, АОН6, АОН7, АОН25 и АОН26) не способны перенаправлять сплайсинг ABCA4;i) AONs targeting regions outside the pseudoexon (AON5, AON6, AON7, AON25, and AON26) are unable to redirect ABCA4 splicing;

ii) АОНы, которые имели единичное нарушение комплементарности со своей мишенью, были неэффективными, т.е. AOH1 является специфичным для мутации c.4539+2001G>A, и и не перенаправляет сплайсинг у пациента с мутацией с.4539+2028С>Т (фиг. 6D). Аналогично, AOH15 является специфичным для псевдоэкзона с мутацией с.4539+2028С>Т и не эффективен для коррекции дефектов сплайсинга, вызванных мутацией c.4539+2001G>A (фиг. 9);ii) AONs that had a single mismatch with their target were ineffective, i.e. AOH1 is specific for the c.4539+2001G>A mutation and does not redirect splicing in a patient with the c.4539+2028C>T mutation (Fig. 6D). Similarly, AOH15 is specific for the pseudoexon with the c.4539+2028C>T mutation and is not effective in correcting splicing defects caused by the c.4539+2001G>A mutation (Fig. 9);

iii) АОНы, которые эффективны для перенаправления сплайсинга, часто содержат мотив SC35 (и эффективные, и умеренно эффективные имеют в среднем в 1,8 и 1,45 раз больше мотивов SC35 по сравненю со слабоэффективными и неэффективными АОНами). Не наблюдали значительных различий для мотивов SF2 и SRp40. Для умеренно эффективных АОНов, мы выявили обогащение мотивами SRp55 в 4 и 2,6 раз по сравнению с эффективными и с группой слабоэффективных и неэффективных АОНов, соответственно);iii) AONs that are effective in splicing redirection often contain an SC35 motif (both effective and moderately effective ones have on average 1.8 and 1.45 times more SC35 motifs compared to weakly and ineffective AONs). No significant differences were observed for the SF2 and SRp40 motifs. For moderately effective AONs, we found an enrichment of SRp55 motifs by 4 and 2.6 times compared with effective and with a group of weakly effective and ineffective AONs, respectively);

iv) в среднем, не было различий по длине AOH, между теми, которые перенаправляли сплайсинг иiv) on average, there was no difference in AOH length between those that redirected splicing and

- 40 043834 которые не перенаправляли. Однако, мы все обнаружили, что температура плавления (Tm) была в среднем на 2 и 3 градуса выше у эффективных АОНов, при сравнении с умеренно эффективной группой и группой, состоящей из слабоэффективных и неэффективных АОНов;- 40 043834 which did not redirect. However, we all found that the melting temperature (Tm) was on average 2 and 3 degrees higher for the effective AONs when compared with the moderately effective group and the group consisting of weak and ineffective AONs;

v) также в среднем и эффективные, и умеренно эффективные АОНы показали процентное содержание GC выше 54%, в то время как в среднем у слабоэффективных или неэффективных АОНов было ниже 48%;v) also, on average, both effective and moderately effective AONs showed a GC percentage above 54%, while on average, weakly effective or ineffective AONs were below 48%;

vi) мы не наблюдали явных различий между АОНами, которые связывались с предсказанными смешанными областями с частично открытыми и частично открытыми областями, и АОНами, которые связывались или с закрытыми или с открытыми областями.vi) We did not observe clear differences between AONs that bound to predicted mixed regions with partially open and partially open regions and AONs that bound to either closed or open regions.

D. Мидигенными конструкциями с мутацией с.769-784С>Т, c.859-540C>G, c.859-506G>C, c.1937+435C>G, c.4539+1100A>G, c.4539+1106C>T или c.5197-557G>T трансфицировали клетки HEK293T вместе с конструкцией с соответствующими последовательностями ABCA4 дикого типа. Как показано на фиг. 10, все мутации в различной степени приводят к вставке псевдоэкзона различной длины (дорожки, обозначенные NT). Трансфекция тремя различными АОНами, а также одним общим SON для каждой мутации, показала, что для всех мутаций, по меньшей мере, один AOH был эффективен для спасения от вставки псевдоэкзона, связанной с этой мутацией. Конкретно, для c.769-784C>T, добавление АОН1 и АОН2 приводит к снижению вставки псевдоэкзона, в то время как AOH3 частично исправляет дефект сплайсинга. Для c.859-540C>G, АОН1 не эффективен, АОН2 очень эффективен, в то время как AOH3 частично исправляет дефект сплайсинга. Однако, во время финальной проверки, мы обнаружили, что АОН1, который был разработан для мутации c.859-540C>G, был заказан неправильно, и вместо него была заказана и получена последовательность AOH3 для мутации c.5197-557G>T. Это также повлияло на интерпретацию результатов. Таким образом, отрицательный результат, полученный для АОН1, я вляется ожидаемым, поскольку фактический использованный AOH не специфичен для соответствующего псевдоэкзона, и, таким образом, не должен работать. Для c.859-506G>C, AOH1 и AOH3 привели к снижению содержания транскрипта с псевдоэкзоном, в то время как АОН2 был неэффективен. Для C.1937+435OG, все три АОНа привели к уменьшению транскриптов ABCA4 с псевдоэкзоном. Для мутаций c.4539+1100A>G и c.4539+1106C>T, AOH1 и AOH2, по-видимому, были эффективны, в то время как AOH3 явно не был. Наконец, для мутации c.5197-557G>T, все три АОНа показали уменьшение транскриптов с псевдоэкзоном. Вместе эти данные демонстрируют способность АОНов перенаправлять события нарушенного сплайсинга, вызванные исследованными мутациями в глубине интрона ABCA4, по меньшей мере, с одним эффективным AOH для каждого псевдоэкзона.D. Midigenic constructs with mutation c.769-784C>T, c.859-540C>G, c.859-506G>C, c.1937+435C>G, c.4539+1100A>G, c.4539+ 1106C>T or c.5197-557G>T were transfected into HEK293T cells along with a construct with the corresponding wild-type ABCA4 sequences. As shown in FIG. 10, all mutations, to varying degrees, result in the insertion of a pseudoexon of varying lengths (lanes labeled NT). Transfection with three different AOHs, as well as one common SON for each mutation, showed that for all mutations, at least one AOH was effective in rescuing the pseudoexon insertion associated with that mutation. Specifically, for c.769-784C>T, addition of AOH1 and AOH2 results in decreased pseudoexon insertion, while AOH3 partially corrects the splicing defect. For c.859-540C>G, AOH1 is not effective, AOH2 is very effective, while AOH3 partially corrects the splicing defect. However, during final inspection, we discovered that AOH1, which was designed for the c.859-540C>G mutation, was ordered incorrectly, and instead the AOH3 sequence was ordered and received for the c.5197-557G>T mutation. This also affected the interpretation of the results. Thus, the negative result obtained for AOH1 is expected, since the actual AOH used is not specific for the corresponding pseudoexon, and thus should not work. For c.859-506G>C, AOH1 and AOH3 resulted in a decrease in pseudoexon transcript abundance, while AOH2 was ineffective. For C.1937+435OG, all three AONs resulted in a decrease in ABCA4 pseudoexon transcripts. For the c.4539+1100A>G and c.4539+1106C>T mutations, AOH1 and AOH2 appeared to be effective, while AOH3 clearly was not. Finally, for the c.5197-557G>T mutation, all three AONs showed a decrease in pseudoexon transcripts. Together, these data demonstrate the ability of AOHs to redirect disrupted splicing events caused by the examined mutations deep in the ABCA4 intron, with at least one effective AOH for each pseudoexon.

Обсуждение.Discussion.

В этом исследовании, мы показали, что два соседних варианта глубоко в интроне ABCA4, c.4539+2001G>A и c.4539+2028C>T, приводят к специфичному для сетчатки включению псевдоэкзона (ПЭ) размером 345 н. в части транскриптов ABCA4. Этот ПЭ, который по предсказанию приводит к укорочению белка (р.Arg1514Leufs*36) , был обнаружен в виде низкокопийной альтернативной формы сплайсинга ABCA4 при проведении глубокого РНК-секвенирования для РНК желтого пятна человека (Braun et al., 2013).Количественная оценка продукта ОТ-ПЦР выявила больше вставок ПЭ из-за M1, чем из-за М2. На основании фенотипа глаз у пациентов STGD1 с M1, и характера вариантов, наблюдаемых в транс-ориентации у этих пациентов, предположили, что M1 действует как тяжелый вариант (Bauwens et al., 2015; Вах et al., 2015; Braun et al., 2013). Напротив, на основании наших собственных наблюдений и ограниченных клинических данных, доступных для некоторых пациентов с STGD1 с М2 (Lee et al., 2016), мы предположили, что М2 действует как вариант от мягкого до умеренно тяжелого. Мы, таким образом, могли бы ожидать, что количество мутантной мРНК у пациента с M1, миссенс-вариантом в транс-ориентации, должно быть равным количеству правильного продукта. Это не так, хотя трудно сравнивать, поскольку более маленькие продукты амплифицируются более эффективно и подавление путем NMD может ыть неполным. Вставка ПЭ из-за М2 менее известна, чем для M1, что согласуется с ее менее серьезным характером. Однако, мы не можем исключить возможности, что другие cis-действующие варианты, упущенные во время секвенирования локусов, (Zernant et al., 2014) действуют согласованно с этими вариантами интрона 30. Кроме того, могут играть роль специфические механизмы, связанные с типом клеток, поскольку обе линии РРС, полученные от пациентов были менее дифференцированные, чем контрольная линия РРС, указывая на возможность задержки в дифференцировке. Это может оказывать значительное влияние на количество вставок ПЭ. Ясный пример важности ретинальной дифференцировки для распознавания ПЭ был описан для варианта в глубине интрона c.2991+1655A>G в СЕР290. В то время как лимфобластные и фибробластные клетки пациентов имели эту мутацию в гомозиготном виде, соотношение неправильно и правильно сплайсированного СЕР290 составляет ~1:1 (Collin et al., 2012; Garanto et al., 2016; den Hollander et al., 2006), было обнаружено что, в фоторецепторных клетках, полученных из iPSC количество неправильно сплайсированного СЕР290 резко возрастает (соотношение ~1:4; Parfitt et al., 2016). Это исследование не только раскрыо понимание того, почему эта мутация, несмотря на повсеместную экспрессию СЕР290, приводит к несиндромному ретинальному фенотипу, но также продемонстрировало огромную силу использования ретинальных клеток, полученных из iPSC, от пациентов для изучения дефектов сплайсинга в подходящей клеточной системе.In this study, we show that two adjacent variants deep in the ABCA4 intron, c.4539+2001G>A and c.4539+2028C>T, result in a retina-specific inclusion of a 345-nt pseudoexon (PE). in terms of ABCA4 transcripts. This PE, which is predicted to result in a truncation of the protein (p.Arg1514Leufs*36), was detected as a low-copy alternative splice form of ABCA4 by deep RNA-seq of human macular RNA (Braun et al., 2013). Product quantification. RT-PCR revealed more PE insertions due to M1 than due to M2. Based on the ocular phenotype of STGD1 patients with M1, and the nature of the variants observed in trans orientation in these patients, it has been proposed that M1 acts as a severe variant (Bauwens et al., 2015; Bax et al., 2015; Braun et al. , 2013). In contrast, based on our own observations and the limited clinical data available for some STGD1 patients with M2 (Lee et al., 2016), we hypothesized that M2 acts as a mild to moderately severe variant. We would thus expect that the amount of mutant mRNA in a patient with M1, a missense variant in trans, should be equal to the amount of the correct product. This is not the case, although it is difficult to compare since smaller products are amplified more efficiently and suppression by NMD may be incomplete. PE insertion due to M2 is less well known than for M1, consistent with its less severe nature. However, we cannot exclude the possibility that other cis-acting variants missed during loci sequencing (Zernant et al., 2014) act in concert with these intron 30 variants. In addition, cell type-specific mechanisms may play a role , as both patient-derived RRMS lines were less differentiated than the control RRMS line, indicating the possibility of a delay in differentiation. This can have a significant impact on the number of PE inserts. A clear example of the importance of retinal differentiation for PE recognition was described for a variant deep intron c.2991+1655A>G in CEP290. While patient lymphoblast and fibroblast cells had this mutation homozygously, the ratio of misspliced to correctly spliced CEP290 is ~1:1 (Collin et al., 2012; Garanto et al., 2016; den Hollander et al., 2006) , the amount of misspliced CEP290 was found to increase dramatically in iPSC-derived photoreceptor cells (ratio ~1:4; Parfitt et al., 2016). This study not only provides insight into why this mutation, despite ubiquitous expression of CEP290, results in a nonsyndromic retinal phenotype, but also demonstrates the tremendous power of using iPSC-derived retinal cells from patients to study splicing defects in a suitable cell system.

- 41 043834- 41 043834

Известные ранее интронные варианты, связанные с наследственными заболеваниями сетчатки (IRD), создавали новые сайты акцептора сплайсинга или донора сплайсинга, которые давали возможность вставки ПЭ (Braun et al., 2013; Bonifert et al., 2016; Webb et al., 2012; van den Hurk et al., 2003; Vache et al., 2012; Rio Frio et al., 2009; Naruto et al., 2015; Mayer et al., 2016; Liquori et al., 2016; den Hollander et al., 2006; Carss et al., 2017). Насколько нам известно, мы первые сообщаем о вставке ПЭ, которая не вызвана этим механизмом, а, вероятно, связана с образованием новых мотивов ESE при IRD. Интронные области пронизаны парами предсказанных сайтов акцептора и донора сплайсинга, которые теоретически могут фланкировать ПЭ. После выявления дополнительных ПЭ, которые не активируются путем создания сайтов сплайсинга, будет возможно определить последовательность мотивов, которые переводят криптические ПЭ в реальные ПЭ.Previously known intronic variants associated with inherited retinal diseases (IRDs) created new splice acceptor or splice donor sites that allowed PE insertion (Braun et al., 2013; Bonifert et al., 2016; Webb et al., 2012; van den Hurk et al., 2003; Vache et al., 2012; Rio Frio et al., 2009; Naruto et al., 2015; Mayer et al., 2016; Liquori et al., 2016; den Hollander et al. , 2006; Carss et al., 2017). To our knowledge, we are the first to report PE insertion that is not caused by this mechanism but is likely due to the formation of new ESE motifs in IRD. The intronic regions are pierced by pairs of predicted splice acceptor and donor sites, which could theoretically flank the PE. Once additional PEs are identified that are not activated by splice site creation, it will be possible to determine the sequence of motifs that translate cryptic PEs into actual PEs.

Вставки ПЭ, связанные с M1 и М2, были успешно блокированы несколькими AOH. M1специфичный AOH был эффективен только на М1-клеточной линии, и даже в двойной концентрации AOH, AOH1 был все еще неспособен корректировать дефект сплайсинга на клеточной линии с М2. Кроме того, М2-специфичный AOH, который имел единичное нарушение комплементарности с последовательностью ПЭ, был неэффективен у пациента с M1. Эти результаты подчеркивают специфичность последовательности и тот факт, что несовпадения одного нуклеотида достаточно для изменения эффективности AOH. Заново созданный мотив SRp55 может играть важную роль в детекции ПЭ. Это еще предстоит выяснить, учитывая тот факт, что оба варианта активируют одинаковый ПЭ, и А0Н4 способен пропустить ПЭ в обоих случаях. Одним из ограничений AOH является то, что они связываются со специфическими последовательностями и, таким образом, невозможно тестировать такой же AOH на модели на животных, если отсутствует консервативная область ДНК/РНК, за исключением того, если создана модель, в которую вставлена часть последовательности человека в ортологичном положении в геном животного. Однако, уже известно, что химия 2OMe/PS и 2МОЕ (2-O-Метоксиэтил)/PS не токсична для глаза, как показано на нескольких животных моделях (Garanto et al., 2016; Gerard et al., 2015; Murray et al., 2015). Кроме того, первый коммерческий AOH применяли для лечения зболевания глаз, CMVретинита (Fomivirsen approved for CMV retinitis: first antisense drug. AIDS treatment news, 7 (1998)). Таким образом, технология AOH выглядит безопасным и многообещающим подходом для лечения заболеваний глаз. Вследствие отсутствия моделей на животных, применение фоторецепторов, полученных из iPSC, по-видимому, является подходящей альтернативой, хотя все еще нужно выяснить, можно ли восстановить функцию белка ABCA4 белок после лечения этих клеток.PE insertions bound to M1 and M2 were successfully blocked by several AOHs. M1-specific AOH was only effective in the M1 cell line, and even at twice the concentration of AOH, AOH1 was still unable to correct the splicing defect in the M2 cell line. In addition, the M2-specific AOH, which had a single mismatch with the PE sequence, was ineffective in the M1 patient. These results highlight sequence specificity and the fact that a single nucleotide mismatch is sufficient to alter the effectiveness of AOH. The newly created SRp55 motif may play an important role in the detection of PE. This remains to be seen, given the fact that both variants activate the same PE and A0H4 is able to bypass PE in both cases. One limitation of AOHs is that they bind to specific sequences and thus it is not possible to test the same AOH in an animal model if a conserved DNA/RNA region is missing, unless a model is created in which part of the human sequence is inserted in an orthologous position in the animal genome. However, it is already known that 2OMe/PS and 2MOE (2-O-Methoxyethyl)/PS chemistry are not toxic to the eye, as shown in several animal models (Garanto et al., 2016; Gerard et al., 2015; Murray et al. ., 2015). In addition, the first commercial AOH was used to treat the eye disease, CMV retinitis (Fomivirsen approved for CMV retinitis: first antisense drug. AIDS treatment news, 7 (1998)). Thus, AOH technology appears to be a safe and promising approach for the treatment of eye diseases. Due to the lack of animal models, the use of iPSC-derived photoreceptors appears to be a suitable alternative, although it still remains to be seen whether ABCA4 protein function can be restored after treating these cells.

В заключение, с использованием полученных от пациента iPSC, дифференцированных в Sколбочки, мы смогли идентифицировать молекулярный дефект из-за двух рекуррентных соседних вариантов в глубине интрона, лежащих в основе STGD1. Дефект сплайсинга состоял из вставки ПЭ размером 345, которая, по-видимому, является тканеспецифической, и, наиболее вероятно, вызвана наличием новообразованных экзонных энхансеров сплайсинга, а не связана с возникновением новых сайтов сплайсинга. Кроме того, был разработан и протестирован терапевтический подход на основе AOH, показывающий, что один AOH способен перенаправить сплайсинг в обеих мутированных клеточных линиях. Кроме того, вариант-специфический AOH был очень эффективен против M1, но не М2, что указывает на то, что единичный некомплементарный нуклеотид может резко изменить эффективность AOH. Для нескольких мутаций в глубине интрона ABCA4 (т.е. с.769-784С>Т, c.859-540C>G, c.859-506G>C, c.1937+435C>G, c.4539+1100A>G, c.4539+1106C>T или c.5197-557G>T) мы показали, что все они приводят к вставке псевдоэкзона. Были сконструированы АОНы для блокирования вставки этого псевдоэкзона, и для каждого псевдоэкзона, по меньшей мере, один AOH был способен значительно снизить количество нарушенных транскриптов ABCA4. В целом, эти результаты подчеркивают потенциал AOH как терапевтического инструмента для болезни Штаргардта.In conclusion, using patient-derived iPSCs differentiated into S cones, we were able to identify a molecular defect due to two recurrent adjacent variants deep intron underlying STGD1. The splicing defect consisted of a PE insertion of size 345, which appears to be tissue specific and is most likely caused by the presence of newly formed exonic splice enhancers rather than due to the emergence of new splice sites. Additionally, an AOH-based therapeutic approach was developed and tested, showing that a single AOH is able to redirect splicing in both mutated cell lines. In addition, variant-specific AOH was highly effective against M1 but not M2, indicating that a single noncomplementary nucleotide can dramatically alter the effectiveness of AOH. For several mutations deep in the ABCA4 intron (i.e. c.769-784C>T, c.859-540C>G, c.859-506G>C, c.1937+435C>G, c.4539+1100A> G, c.4539+1106C>T or c.5197-557G>T) we showed that they all result in pseudoexon insertion. AOHs were designed to block insertion of this pseudoexon, and for each pseudoexon, at least one AOH was able to significantly reduce the amount of disrupted ABCA4 transcripts. Overall, these results highlight the potential of AOH as a therapeutic tool for Stargardt disease.

- 42 043834- 42 043834

СсылкиLinks

Aartsma-Rus, A. Overview on AON design. Methods Mol. Biol. 867, 117-129 (2012), doi:10.1007/978-1-61779-767-5_8.Aartsma-Rus, A. Overview on AON design. Methods Mol. Biol. 867, 117-129 (2012), doi:10.1007/978-1-61779-767-5_8.

Allikmets, R., Singh, N., Sun, H., Shroyer, N. F., Hutchinson, A., Chidambaram, A., Gerrard, B., Baird, L., Stauffer, D., Peiffer, A., Rattner, A., Smallwood, P., Li, Y., Anderson, K. L., Lewis, R. A., Nathans, J., Leppert, M., Dean, M. & Lupski, J. R. A photoreceptor cell-specific ATP-binding transporter gene (ABCR) is mutated in recessive Stargardt macular dystrophy. Nat. Genet. 15, 236-246 (1997), doi:10.1038/ng0397-236.Allikmets, R., Singh, N., Sun, H., Shroyer, N. F., Hutchinson, A., Chidambaram, A., Gerrard, B., Baird, L., Stauffer, D., Peiffer, A., Rattner , A., Smallwood, P., Li, Y., Anderson, K. L., Lewis, R. A., Nathans, J., Leppert, M., Dean, M. & Lupski, J. R. A photoreceptor cell-specific ATP-binding transporter gene (ABCR) is mutated in recessive Stargardt macular dystrophy. Nat. Genet. 15, 236-246 (1997), doi:10.1038/ng0397-236.

Bauwens, M., De Zaeytijd, J., Weisschuh, N., Kohl, S., Meire, F., Dahan, K., Depasse, F., De Jaegere, S., De Ravel, T., De Rademaeker, M., Loeys, B., Coppieters, F., Leroy, В. P. & De Baere, E. An augmented ABCA4 screen targeting noncoding regions reveals a deep intronic founder variant in Belgian Stargardt patients. Hum. Mutat. 36, 39-42 (2015), doi:10.1002/humu.22716.Bauwens, M., De Zaeytijd, J., Weisschuh, N., Kohl, S., Meire, F., Dahan, K., Depasse, F., De Jaegere, S., De Ravel, T., De Rademaeker , M., Loeys, B., Coppieters, F., Leroy, V. P. & De Baere, E. An augmented ABCA4 screen targeting noncoding regions reveals a deep intronic founder variant in Belgian Stargardt patients. Hum. Mutat. 36, 39-42 (2015), doi:10.1002/humu.22716.

Bax, N. M., Sangermano, R., Roosing, S., Thiadens, A. A., Hoefsloot, L. H., van den Born, L. I., Phan, M., Klevering, B. J., Westeneng-van Haaften, C., Braun, T. A., Zonneveld-Vrieling, Μ. N., de Wijs, I., Mutlu, M., Stone, E. M., den Hollander, A. I., Klaver, С. C., Hoyng, С. B. & Cremers, F. P. M. Heterozygous deep-intronic variants and deletions in ABCA4 in persons with retinal dystrophies and one exonic ABCA4 variant. Hum. Mutat. 36, 43-47 (2015), doi:10.1002/humu.22717.Bax, N. M., Sangermano, R., Roosing, S., Thiadens, A. A., Hoefsloot, L. H., van den Born, L. I., Phan, M., Klevering, B. J., Westeneng-van Haaften, C., Braun, T. A., Zonneveld -Vrieling, M. N., de Wijs, I., Mutlu, M., Stone, E. M., den Hollander, A. I., Klaver, S. C., Hoyng, S. B. & Cremers, F. P. M. Heterozygous deep-intronic variants and deletions in ABCA4 in persons with retinal dystrophies and one exonic ABCA4 variant. Hum. Mutat. 36, 43-47 (2015), doi:10.1002/humu.22717.

Bonifert, T., Gonzalez Menendez, I., Battke, F., Theurer, Y., Synofzik, M., Schols, L. & Wissinger, B. Antisense oligonucleotide mediated splice correction of a deep intronic mutation in OPA1. Mol. Then. Nucleic Acids 5, e390 (2016), doi:10.1038/mtna.2016.93.Bonifert, T., Gonzalez Menendez, I., Battke, F., Theurer, Y., Synofzik, M., Schols, L. & Wissinger, B. Antisense oligonucleotide mediated splice correction of a deep intronic mutation in OPA1. Mol. Then. Nucleic Acids 5, e390 (2016), doi:10.1038/mtna.2016.93.

Braun, T. A., Mullins, R. F., Wagner, A. H., Andorf, J. L., Johnston, R. M., Bakall, В. B., Deluca, A. P., Fishman, G. A., Lam, B. L., Weleber, R. G., Cideciyan, A. V., Jacobson, S. G., Sheffield, V. C., Tucker, B. A. & Stone, E. M. Non-exomic and synonymous variants in ABCA4 are an important cause of Stargardt disease. Hum. Mol. Genet. 22, 5136-5145 (2013), doi:10.1093/hmg/ddt367.Braun, T. A., Mullins, R. F., Wagner, A. H., Andorf, J. L., Johnston, R. M., Bakall, V. B., Deluca, A. P., Fishman, G. A., Lam, B. L., Weleber, R. G., Cideciyan, A. V., Jacobson, S. G. , Sheffield, V. C., Tucker, B. A. & Stone, E. M. Non-exomic and synonymous variants in ABCA4 are an important cause of Stargardt disease. Hum. Mol. Genet. 22, 5136-5145 (2013), doi:10.1093/hmg/ddt367.

Chiorini, J.A., Kim, F., Yang, L., and Kotin, R.M. (1999). Cloning and characterization of adeno-associated virus type 5. Journal of virology 73, 1309-1319.Chiorini, J.A., Kim, F., Yang, L., and Kotin, R.M. (1999). Cloning and characterization of adeno-associated virus type 5. Journal of virology 73, 1309-1319.

Collin, R.W., den Hollander, A.I., van der Velde-Visser, S.D., Bennicelli, J., Bennett, J., and Cremers, F.P. (2012). Antisense Oligonucleotide (AON)-based Therapy for Leber Congenital Amaurosis Caused by a Frequent Mutation in CEP290. Molecular therapy Nucleic acids 1, el4.Collin, R.W., den Hollander, A.I., van der Velde-Visser, S.D., Bennicelli, J., Bennett, J., and Cremers, F.P. (2012). Antisense Oligonucleotide (AON)-based Therapy for Leber Congenital Amaurosis Caused by a Frequent Mutation in CEP290. Molecular therapy Nucleic acids 1, el4.

Cremers, F. P. M., van de Pol, D. J., van Driel, M., den Hollander, A. I., van Haren, F. J., Knoers, N. V., Tijmes, N., Bergen, A. A., Rohrschneider, K. , Blankenagel, A., Pinckers, A. J., Deutman, A. F. & Hoyng, С. B. Autosomal recessive retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy caused by splice site mutations in the Stargardt's disease gene ABCR. Hum. Mol. Gen. 7, 355-362 (1998) .Cremers, F. P. M., van de Pol, D. J., van Driel, M., den Hollander, A. I., van Haren, F. J., Knoers, N. V., Tijmes, N., Bergen, A. A., Rohrschneider, K., Blankenagel, A., Pinckers , A. J., Deutman, A. F. & Hoyng, S. B. Autosomal recessive retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy caused by splice site mutations in the Stargardt's disease gene ABCR. Hum. Mol. Gen. 7, 355-362 (1998).

- 43 043834 den Hollander, A. I., Koenekoop, R. K. , Yzer, S., Lopez,- 43 043834 den Hollander, A. I., Koenekoop, R. K., Yzer, S., Lopez,

I., Arends, M. L., Voesenek, К. E., Zonneveld, Μ. N., Strom, T.I., Arends, M. L., Voesenek, K. E., Zonneveld, M. N., Strom, T.

M., Meitinger, T., Brunner, H. G., Hoyng, С. B., van den Born,M., Meitinger, T., Brunner, H. G., Hoyng, S. B., van den Born,

L. I., Rohrschneider, K. & Cremers, F. P. Mutations in theL. I., Rohrschneider, K. & Cremers, F. P. Mutations in the

CEP290 (NPHP6) gene are a frequent cause of Leber congenital amaurosis. Am. J. Hum. Genet. 79, 556-561 (2006).CEP290 (NPHP6) gene are a frequent cause of Leber congenital amaurosis. Am. J.Hum. Genet. 79, 556-561 (2006).

Dorn, A., and Kippenberger, S. (2008). Clinical application of CpG-, ηοη-CpG-, and antisense oligodeoxynucleotides as immunomodulators. Current opinion in molecular therapeutics 10, 10-20 .Dorn, A., and Kippenberger, S. (2008). Clinical application of CpG-, ηοη-CpG-, and antisense oligodeoxynucleotides as immunomodulators. Current opinion in molecular therapeutics 10, 10-20.

Egholm, M., Buchardt, 0., Christensen, L., Behrens, C., Freier, S.M., Driver, D.A., Berg, R.H., Kim, S.K., Norden, B., and Nielsen, P.E. (1993). PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules. Nature 365, 566-568.Egholm, M., Buchardt, 0., Christensen, L., Behrens, C., Freier, S.M., Driver, D.A., Berg, R.H., Kim, S.K., Norden, B., and Nielsen, P.E. (1993). PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules. Nature 365, 566-568.

Flamier, A., Barabino, A. & Bernier, G. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors. Bioprotocol 6, el870 (2016), doi:10.21769/BioProtoc.1870Flamier, A., Barabino, A. & Bernier, G. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors. Bioprotocol 6, el870 (2016), doi:10.21769/BioProtoc.1870

Fujinami, K. , Zernant, J., Chana, R. K. , Wright, G. A., Tsunoda, K., Ozawa, Y., Tsubota, K., Webster, A. R., Moore, A. T., Allikmets, R. & Michaelides, M. ABCA4 gene screening by next-generation sequencing in a British cohort. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54, 6662-6674 (2013), doi:10.1167/iovs.1312570.Fujinami, K., Zernant, J., Chana, R. K., Wright, G. A., Tsunoda, K., Ozawa, Y., Tsubota, K., Webster, A. R., Moore, A. T., Allikmets, R. & Michaelides, M. ABCA4 gene screening by next-generation sequencing in a British cohort. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54, 6662-6674 (2013), doi:10.1167/iovs.1312570.

Garanto, A., Chung, D.C., Duijkers, L., Corral-Serrano, J.C., Messchaert, M., Xiao, R., Bennett, J., Vandenberghe, L.H., and Collin, R.W. (2016). In vitro and in vivo rescue of aberrant splicing in CEP290-associated LCA by antisense oligonucleotide delivery. Human molecular genetics 25, 2552-2563.Garanto, A., Chung, D.C., Duijkers, L., Corral-Serrano, J.C., Messchaert, M., Xiao, R., Bennett, J., Vandenberghe, L.H., and Collin, R.W. (2016). In vitro and in vivo rescue of aberrant splicing in CEP290-associated LCA by antisense oligonucleotide delivery. Human molecular genetics 25, 2552-2563.

Gerard, X., Perrault, I., Hanein, S., Silva, E., Bigot, K. , Defoort-Delhemmes, S., Rio, M., Munnich, A., Scherman, D., Kaplan, J., Kichler, A. & Rozet, J. M. AON-mediated exon skipping restores ciliation in fibroblasts harboring the common Leber congenital amaurosis CEP290 mutation. Mol. Ther. Nucleic Acids 1, e29 (2012), doi:10.1038/mtna.2012.21Gerard, X., Perrault, I., Hanein, S., Silva, E., Bigot, K., Defoort-Delhemmes, S., Rio, M., Munnich, A., Scherman, D., Kaplan, J. ., Kichler, A. & Rozet, J. M. AON-mediated exon skipping restores ciliation in fibroblasts harboring the common Leber congenital amaurosis CEP290 mutation. Mol. Ther. Nucleic Acids 1, e29 (2012), doi:10.1038/mtna.2012.21

Gerard, X., Perrault, I., Munnich, A., Kaplan, J. & Rozet,Gerard, X., Perrault, I., Munnich, A., Kaplan, J. & Rozet,

- 44 043834- 44 043834

J. M. Intravitreal injection of splice-switching oligonucleotides to manipulate splicing in retinal cells. Mol. Ther. Nucleic Acids 4, e250 (2015), doi:10.1038/mtna.2015.24.J. M. Intravitreal injection of splice-switching oligonucleotides to manipulate splicing in retinal cells. Mol. Ther. Nucleic Acids 4, e250 (2015), doi:10.1038/mtna.2015.24.

Gerber, S., Rozet, J. M., van de Pol, T. J., Hoyng, С. B., Munnich, A., Blankenagel, A., Kaplan, J. & Cremers, F. P. M. Complete exon-intron structure of the retina-specific ATP binding transporter gene (ABCR) allows the identification of novel mutations underlying Stargardt disease. Genomics 48, 139142 (1998), doi:10.1006/geno.1997.5164.Gerber, S., Rozet, J. M., van de Pol, T. J., Hoyng, S. B., Munnich, A., Blankenagel, A., Kaplan, J. & Cremers, F. P. M. Complete exon-intron structure of the retina-specific ATP binding transporter gene (ABCR) allows the identification of novel mutations underlying Stargardt disease. Genomics 48, 139142 (1998), doi:10.1006/geno.1997.5164.

Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schumperli, D., and Kole, R. (1998). Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 49294934.Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schumperli, D., and Kole, R. (1998). Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 49294934.

Govindaraju, T., and Kumar, V.A. (2005) . Backbone-extended pyrrolidine peptide nucleic acids (bepPNA): design, synthesis and DNA/RNA binding studies. Chemical communications, 495-497.Govindaraju, T., and Kumar, V.A. (2005). Backbone-extended pyrrolidine peptide nucleic acids (bepPNA): design, synthesis and DNA/RNA binding studies. Chemical communications, 495-497.

Lee, W., Xie, Y., Zernant, J., Yuan, B., Bearelly, S., Tsang, S. H., Lupski, J. R. & Allikmets, R. Complex inheritance of ABCA4 disease: four mutations in a family with multiple macular phenotypes. Hum. Genet. 135, 9-19 (2016), doi:10.1007/s00439-015-1605-y.Lee, W., Xie, Y., Zernant, J., Yuan, B., Bearelly, S., Tsang, S. H., Lupski, J. R. & Allikmets, R. Complex inheritance of ABCA4 disease: four mutations in a family with multiple macular phenotypes. Hum. Genet. 135, 9-19 (2016), doi:10.1007/s00439-015-1605-y.

Lewis, R. A., Shroyer, N. F., Singh, N., Allikmets, R., Hutchinson, A., Li, Y., Lupski, J. R., Leppert, M. & Dean, M. Genotype/Phenotype analysis of a photoreceptor-specific ATPbinding cassette transporter gene, ABCR, in Stargardt disease. Am. J. Hum. Genet. 64, 422-434 (1999), doi:10.1086/302251.Lewis, R. A., Shroyer, N. F., Singh, N., Allikmets, R., Hutchinson, A., Li, Y., Lupski, J. R., Leppert, M. & Dean, M. Genotype/Phenotype analysis of a photoreceptor-specific ATPbinding cassette transporter gene, ABCR, in Stargardt disease. Am. J.Hum. Genet. 64, 422-434 (1999), doi:10.1086/302251.

Martinez-Mir, A., Paloma, E., Allikmets, R., Ayuso, C., del Rio, T., Dean, M., Vilageliu, L., Gonzalez-Duarte, R. & Balcells, S. Retinitis pigmentosa caused by a homozygous mutation in the Stargardt disease gene ABCR. Nat. Genet. 18, 1112 (1998), doi:10.1038/ng0198-ll.Martinez-Mir, A., Paloma, E., Allikmets, R., Ayuso, C., del Rio, T., Dean, M., Vilageliu, L., Gonzalez-Duarte, R. & Balcells, S. Retinitis pigmentosa caused by a homozygous mutation in the Stargardt disease gene ABCR. Nat. Genet. 18, 1112 (1998), doi:10.1038/ng0198-ll.

Maugeri, A., Klevering, B. J., Rohrschneider, K., Blankenagel, A., Brunner, H. G., Deutman, A. F., Hoyng, С. B. & Cremers, F. P. M. Mutations in the ABCA4 (ABCR) gene are the major cause of autosomal recessive cone-rod dystrophy. Am. J.Maugeri, A., Klevering, B. J., Rohrschneider, K., Blankenagel, A., Brunner, H. G., Deutman, A. F., Hoyng, S. B. & Cremers, F. P. M. Mutations in the ABCA4 (ABCR) gene are the major cause of autosomal recessive cone-rod dystrophy. Am. J.

- 45 043834- 45 043834

Hum. Genet. 67, 960-966 (2000), doi:10.1086/303079.Hum. Genet. 67, 960-966 (2000), doi:10.1086/303079.

Maugeri, A., van Driel, M. A., van de Pol, D. J.,Maugeri, A., van Driel, M. A., van de Pol, D. J.,

Klevering, B. J., van Haren, F. J., Tijmes, N., Bergen, A. A., Rohrschneider, K. , Blankenagel, A., Pinckers, A. J., Dahl, N.,Klevering, B. J., van Haren, F. J., Tijmes, N., Bergen, A. A., Rohrschneider, K., Blankenagel, A., Pinckers, A. J., Dahl, N.,

Brunner, H. G., Deutman, A. F., Hoyng, С. B. & Cremers, F. P. M. The 2588G-->C mutation in the ABCR gene is a mild frequent founder mutation in the Western European population and allows the classification of ABCR mutations in patients with Stargardt disease. Am. J. Hum. Genet. 64, 1024-1035 (1999).Brunner, H. G., Deutman, A. F., Hoyng, S. B. & Cremers, F. P. M. The 2588G-->C mutation in the ABCR gene is a mild frequent mutation in the Western European population and allows the classification of ABCR mutations in patients with Stargardt disease. Am. J.Hum. Genet. 64, 1024-1035 (1999).

Morita, K., Hasegawa, C., Kaneko, M., Tsutsumi, S., Sone, J., Ishikawa, T., Imanishi, T., and Koizumi, M. (2001). 2'-O,4'C-ethylene-bridged nucleic acids (ENA) with nuclease-resistance and high affinity for RNA. Nucleic acids research Supplement, 241-242.Morita, K., Hasegawa, C., Kaneko, M., Tsutsumi, S., Sone, J., Ishikawa, T., Imanishi, T., and Koizumi, M. (2001). 2'-O,4'C-ethylene-bridged nucleic acids (ENA) with nuclease-resistance and high affinity for RNA. Nucleic acids research supplement, 241-242.

Murray, S. F., Jazayeri, A., Matthes, Μ. T., Yasumura, D., Yang, H., Peralta, R., Watt, A., Freier, S., Hung, G., Adamson, P. S., Guo, S., Monia, В. P., LaVail, Μ. M. & McCaleb, M. L. Allele-specific inhibition of rhodopsin with an antisense oligonucleotide slows photoreceptor cell degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci . 56, 6362-6375 (2015), doi:10.1167/iovs.1516400.Murray, S. F., Jazayeri, A., Matthes, M. T., Yasumura, D., Yang, H., Peralta, R., Watt, A., Freier, S., Hung, G., Adamson, P. S., Guo, S., Monia, V. P., LaVail , M. M. & McCaleb, M. L. Allele-specific inhibition of rhodopsin with an antisense oligonucleotide slows photoreceptor cell degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 6362-6375 (2015), doi:10.1167/iovs.1516400.

Naruto, T., Okamoto, N., Masuda, K. , Endo, T., Hatsukawa, Y., Kohmoto, T. & Imoto, I. Deep intronic GPR143 mutation in a Japanese family with ocular albinism. Sci. Rep. 5, 11334 (2015), doi:10.1038/srepll334.Naruto, T., Okamoto, N., Masuda, K., Endo, T., Hatsukawa, Y., Kohmoto, T. & Imoto, I. Deep intronic GPR143 mutation in a Japanese family with ocular albinism. Sci. Rep. 5, 11334 (2015), doi:10.1038/srepll334.

Nielsen, P.E., Egholm, M., Berg, R.H., and Buchardt, 0. (1991). Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Science 254, 1497-1500.Nielsen, P. E., Egholm, M., Berg, R. H., and Buchardt, O. (1991). Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Science 254, 1497-1500.

Parfitt, D. A., Lane, A., Ramsden, С. M., Carr, A. J.,Parfitt, D. A., Lane, A., Ramsden, S. M., Carr, A. J.,

Munro, P. M., Jovanovic, K. , Schwarz, N., Kanuga, N., Muthiah, Μ. N., Hull, S., Gallo, J. M., da Cruz, L., Moore, A. T., Hardcastle, A. J., Coffey, P. J. & Cheetham, Μ. E.Munro, P. M., Jovanovic, K., Schwarz, N., Kanuga, N., Muthiah, M. N., Hull, S., Gallo, J. M., da Cruz, L., Moore, A. T., Hardcastle, A. J., Coffey, P. J. & Cheetham, M. E.

Identification and correction of mechanisms underlying inherited blindness in human iPSC-derived optic cups. Cell stem Cell 18, 769-781 (2016), doi:10.1016/j. stem.2016.03.021.Identification and correction of underlying mechanisms inherited blindness in human iPSC-derived optic cups. Cell stem Cell 18, 769-781 (2016), doi:10.1016/j. stem.2016.03.021.

- 46 043834- 46 043834

Rio Frio, T., McGee, T. L., Wade, N. M., Iseli, C., Beckmann, J. S., Berson, E. L. & Rivolta, C. A single-base substitution within an intronic repetitive element causes dominant retinitis pigmentosa with reduced penetrance. Hum. Mutat. 30, 1340-1347 (2009), doi:10.1002/humu.21071.Rio Frio, T., McGee, T. L., Wade, N. M., Iseli, C., Beckmann, J. S., Berson, E. L. & Rivolta, C. A single-base substitution within an intronic repetitive element causes dominant retinitis pigmentosa with reduced penetrance. Hum. Mutat. 30, 1340-1347 (2009), doi:10.1002/humu.21071.

Rivera, A., White, K., Stohr, H., Steiner, K., Hemmrich, N., Grimm, T., Jurklies, B., Lorenz, B., Scholl, Η. P., Apfelstedt-Sylla, E. & Weber, В. H. A comprehensive survey of sequence variation in the ABCA4 (ABCR) gene in Stargardt disease and age-related macular degeneration. Am. J. Hum. Genet. 67, 800-813 (2000), doi:10.1086/303090.Rivera, A., White, K., Stohr, H., Steiner, K., Hemmrich, N., Grimm, T., Jurklies, B., Lorenz, B., Scholl, Η. P., Apfelstedt-Sylla, E. & Weber, V. H. A comprehensive survey of sequence variation in the ABCA4 (ABCR) gene in Stargardt disease and age-related macular degeneration. Am. J.Hum. Genet. 67, 800-813 (2000), doi:10.1086/303090.

Sangermano, R., Bax, N.M., Bauwens, M., van den Born, L.I., De Baere, E., Garanto, A., Collin, R.W., Goercharn-Ramlal, A.S., den Engelsman-van Dijk, A.H., Rohrschneider, K., et al. (2016). Photoreceptor Progenitor mRNA Analysis Reveals Exon Skipping Resulting from the ABCA4 c.5461-10T-->C Mutation in Stargardt Disease. Ophthalmology 123, 1375-1385.Sangermano, R., Bax, N.M., Bauwens, M., van den Born, L.I., De Baere, E., Garanto, A., Collin, R.W., Goercharn-Ramlal, A.S., den Engelsman-van Dijk, A.H., Rohrschneider , K., et al. (2016). Photoreceptor Progenitor mRNA Analysis Reveals Exon Skipping Resulting from the ABCA4 c.5461-10T-->C Mutation in Stargardt Disease. Ophthalmology 123, 1375-1385.

Sangermano R, Khan M, Cornelis SS, Richelle V, Albert S, Elmelik D, Garanto A, Qamar R, Lugtenberg D, van den Born LI, Collin RWJ, Cremers FPM. Genome Res (2018), epub ahead of print, doi: 10.1101/gr.226621.117.Sangermano R, Khan M, Cornelis SS, Richelle V, Albert S, Elmelik D, Garanto A, Qamar R, Lugtenberg D, van den Born LI, Collin RWJ, Cremers FPM. Genome Res (2018), epub ahead of print, doi: 10.1101/gr.226621.117.

Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig,Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig,

V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K. , Tomancak, P. & Cardona, A. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods 9, 676-682 (2012), doi:10.1038/nmeth.2019.V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K. , Tomancak, P. & Cardona, A. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods 9, 676-682 (2012), doi:10.1038/nmeth.2019.

Schulz, H. L., Grassmann, F., Kellner, U., Spital, G., Ruther, K., Jagle, H., Hufendiek, K. , Rating, P., Huchzermeyer, C., Baier, M. J., Weber, В. H. & Stohr, H. Mutation spectrum of the ABCA4 gene in 335 Stargardt disease patients from a multicenter German cohort-impact of selected deep intronic variants and common SNPs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 58, 394403 (2017), doi:10.1167/iovs.16-19936 .Schulz, H. L., Grassmann, F., Kellner, U., Spital, G., Ruther, K., Jagle, H., Hufendiek, K., Rating, P., Huchzermeyer, C., Baier, M. J., Weber, V. H. & Stohr, H. Mutation spectrum of the ABCA4 gene in 335 Stargardt disease patients from a multicenter German cohort-impact of selected deep intronic variants and common SNPs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 58, 394403 (2017), doi:10.1167/iovs.16-19936.

Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures byTakahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by

--

Claims (2)

  1. defined factors. Cell 126, 663-676 (2006), doi:10.1016/j. cell.2 00 6.07.024
    Vache, C., Besnard, T., Ie Berre, P., Garcia-Garcia, G., Baux, D., Larrieu, L., Abadie, C., Blanchet, C., Bolz, H. J., Millan, J., Hamel, C., Malcolm, S., Claustres, M. & Roux, A. F. Usher syndrome type 2 caused by activation of an USH2A pseudoexon: implications for diagnosis and therapy. Hum. Mutat. 33, 104-108 (2012), doi:10.1002/humu.21634.
    van den Hurk, J. A., van de Pol, D. J., Wissinger, B., van Driel, M. A., Hoefsloot, L. H., de Wijs, I. J., van den Born, L. I., Heckenlively, J. R., Brunner, H. G., Zrenner, E., Ropers, H. H. & Cremers, F. P. M. Novel types of mutation in the choroideremia ( CHM) gene: a full-length LI insertion and an intronic mutation activating a cryptic exon. Hum. Genet. 113, 268-275 (2003), doi:10.1007/s00439-003-0970-0.
    van Driel, M. A., Maugeri, A., Klevering, B. J., Hoyng, C. B. & Cremers, F. P. M. ABCR unites what ophthalmologists divide(s). Ophthalmic Genet. 19, 117-122 (1998).
    Webb, T. R., Parfitt, D. A., Gardner, J. C., Martinez, A., Bevilacqua, D., Davidson, A. E., Zito, I., Thiselton, D. L., Ressa, J. H., Apergi, M., Schwarz, N., Kanuga, N., Michaelides, M., Cheetham, Μ. E., Gorin, Μ. B. & Hardcastle, A. J. Deep intronic mutation in OFD1, identified by targeted genomic nextgeneration sequencing, causes a severe form of X-linked retinitis pigmentosa (RP23). Hum. Mol. Genet. 21, 3647-3654 (2012), doi:10.1093/hmg/ddsl94.
    Webster, A. R., Heon, E., Lotery, A. J., Vandenburgh, K., Casavant, T. L., Oh, К. T., Beck, G., Fishman, G. A., Lam, B. L., Levin, A., Heckenlively, J. R., Jacobson, S. G., Weleber, R. G., Sheffield, V. C. & Stone, E. M. An analysis of allelic variation in the ABCA4 gene. Invest. Ophthal. Vis. Sci. 42, 1179-1189 (2001) .
    Zernant, J., Lee, W. , Collison, F. T., Fishman, G. A., Sergeev, Y. V., Schuerch, K., Sparrow, J. R., Tsang, S. H. & Allikmets, R. Frequent hypomorphic alleles account for a significant fraction of ABCA4 disease and distinguish it from age-related macular degeneration. J. Med. Genet. 54, 404-412 (2017), doi:10.1136/jmedgenet-2017-104540.
    Zernant, J., Schubert, C., Im, К. M., Burke, T., Brown, C. M., Fishman, G. A., Tsang, S. H., Gouras, P., Dean, M. & Allikmets, R. Analysis of the ABCA4 gene by next-generation sequencing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 8479-8487 (2011), doi:10.1167/iovs.11-8182.
    Fomivirsen approved for CMV retinitis: first antisense drug. AIDS treatment news, 7 (1998).
    ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга, который комплементарен полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 10, или 30; где антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга содержит 2'-О алкилтиофосфатный антисмысловой олигонуклеотид.
  2. 2. Антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга по п.1, где антисмысловой олигонуклеотид для перенаправления сплайсинга содержит 2'-O-метил модифицированную рибозу (РНК), 2'-О-этил модифицированную рибозу и/или 2'-О-пропил модифицированную рибозу.
    -
EA201991460 2016-12-13 2017-12-13 ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES FOR THE TREATMENT OF STARGARDT'S DISEASE EA043834B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16203864.0 2016-12-13
EP17189492.6 2017-09-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA043834B1 true EA043834B1 (en) 2023-06-29

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220204972A1 (en) Antisense oligonucleotides for the treatment of Stargardt disease
US11414662B2 (en) Antisense oligonucleotides for the treatment of usher syndrome type 2
US11479771B2 (en) Antisense oligonucleotides for the treatment of eye disease
US10647985B2 (en) Antisense oligonucleotides for the treatment of Leber congenital amaurosis
AU2018252191B2 (en) Antisense oligonucleotides for the treatment of stargardt disease
US20220049250A1 (en) Antisense Oligonucleotides Rescue Aberrant Splicing of ABCA4
WO2020015959A1 (en) Antisense oligonucleotides rescue aberrant splicing of abca4.
EA043834B1 (en) ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES FOR THE TREATMENT OF STARGARDT&#39;S DISEASE
US11739324B2 (en) Antisense oligonucleotides rescue aberrant splicing of ABCA4
US20220290154A1 (en) Antisense oligonucleotides rescue aberrant splicing of ABCA4
EA047370B1 (en) RESTORATION BY ANTI-SENSE OLIGONUCLEOTIDES ABCA4 WITH ABERRANT SPLICING
EA046920B1 (en) ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES RESTORING ABERRANT SPLICING OF ABCA4