KR20020025970A - 바이러스 감염성을 차단하는 펩티드 및 그 사용 방법 - Google Patents

바이러스 감염성을 차단하는 펩티드 및 그 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20020025970A
KR20020025970A KR1020027001899A KR20027001899A KR20020025970A KR 20020025970 A KR20020025970 A KR 20020025970A KR 1020027001899 A KR1020027001899 A KR 1020027001899A KR 20027001899 A KR20027001899 A KR 20027001899A KR 20020025970 A KR20020025970 A KR 20020025970A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gly
peptide
gln
ser
hiv
Prior art date
Application number
KR1020027001899A
Other languages
English (en)
Inventor
발네앤더스
Original Assignee
트리펩 아베
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 트리펩 아베 filed Critical 트리펩 아베
Publication of KR20020025970A publication Critical patent/KR20020025970A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
    • Y10S977/915—Therapeutic or pharmaceutical composition
    • Y10S977/916—Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 인간 면역결핍성 바이러스(HIV) 감염을 포함하는 바이러스 감염을 억제하는 아미드 형태의 펩티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HIV 감염을 포함하는 바이러스 감염의 치료 및 예방용 약제에서의 상기 펩티드를 사용하는 방법을 포함하는 상기 펩티드의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

바이러스 감염성을 차단하는 펩티드 및 그 사용 방법{PEPTIDES THAT BLOCK VIRAL INFECTIVITY AND METHODS OF USE THEREOF}
모든 바이러스는 핵산을 보유하는 코어를 둘러싸고 있는 단백질 껍질로 이루어져 있다. 바이러스 핵산을 직접 둘러싸고 있는 단백질 껍질은 캡시드로 불리는 반면에, 캡시드와 핵산을 모두 보유하는 완전 단백질-핵산 복합체는 뉴클레오캡시드로 불린다. 아레나바이러스, 로타바이러스, 오르비바이러스, 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 파필로마바이러스, 아데노바이러스, 허피스바이러스, 파라믹소바이러스 및 헤파드나바이러스는 모두 이러한 일반적인 구조적 특징을 나타낸다(Virology, Fields 편집, 제3판, 리펜코트-라벤 출판사, pp 1513, 1645, 1778, 2047, 2113, 2221 및 2717(1996)).
캡시드는 다수의 소단위(캡소미어)로 이루어지며, 캡소미어는 단백질의 몇가지 동종 또는 이종 중합체로부터 형성된다. 바이러스 조립체에서의 캡소미어 사이의 비공유적 결합은 폴딩된 단백질 도메인을 안정화시키는 것과 동일한 종류이다. 두 소단위 사이의 계면은 아미노산 측쇄가 서로에 대해 조밀하게 채워져 있어서 단일 도메인과 매우 유사할 수 있다. 분석된 대부분의 바이러스 구조에 공통된 특징은 하나의 캡소미어의 폴리펩티드쇄가 인접 캡소미어의 도메인의 상하로 연장될 수 있는 방식이다. 이러한 연장된 폴리펩티드 암은 다른 폴리펩티드 암과 서로 얽히고, 소수성 상호작용, 수소 결합 및 염교를 개시함으로써 캡시드를 안정화하는 것에 도움을 준다. 개개의 캡소미어 사이의 접촉과 일부 바이러스의 경우 코어 단백질과의 접촉은 전체 캡시드 구조를 결정하며, 동일한 수의 캡소미어가 관여한다면, 반복된 접촉이 일어나며, 생성되는 구조는 대칭적이다(Virology, Fields 편집, 제3판, 리펜코트-라벤 출판사, p 62(1996)).
일부 간단한 바이러스들은 그 해체된 성분들로부터 자발적으로 형성되는 반면에, 다른 바이러스들은 조립을 유발하기 위해 캡소미어의 효소-촉매적 변형을 필요로 한다. 바이러스의 자가 조립은 결합을 일으키는 조건 하에 단백질 소단위 사이의 상호작용의 안정성에 의해 유도된다. 보다 복잡한 바이러스는 종종 자가 조립 과정을 진행한 아조립체로부터 구성된다(Virology, Fields 편집, 제3판, 리펜코트-라벤 출판사, p 62, 70, 1646 및 1888(1996)). 다수의 바이러스의 캡시드는 단백질 조성에서 상이하지만, 일반적인 바이러스의 구조적 디자인은 교대로 단백질의 몇 개의 동종 또는 이종 중합체로 이루어진 중합된 캡소미어를 특징으로 하는 것으로 진화되었다.
HIV는 인간을 감염시키고, 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)을 일으키는 렌티바이러스에게 주어진 이름이다. 인간의 렌티바이러스 분리물은 분자적으로 클로닝된 바이러스 게놈의 혈청학적 성질 및 서열 분석에 기초하여 두 가지(HIV-1 및 HIV-2) 형중 하나로 분류된다. 유전적으로 특이한 렌티바이러스는 아프리카 녹색 원숭이, 검은 마가베이(sooty magabey), 비비, 침팬지 및 사이크(sykes)를 비롯한 여러 가지 비인간 영장류 종에서 얻어져 왔다. 총괄적으로 비인간 영장류의 렌티바이러스 분리물은 SIV로 불린다. 서열 분석으로부터 일부 SIV 균주와 HIV-1 및 HIV-2 균주의 게놈은 고도의 상동성을 나타냄을 알 수 있다. 또한, 전자 현미경 분석에 의하면, HIV 및 SIV의 초미세구조는 둘다 외피 당단백질 스파이크를 보유하는 지질 이중층 막으로 둘러싸인 원추형 뉴클레오캡시드를 가진 직경 약 110 ㎚의 비리온을 가진다는 점에서 유사하다(Virology, Fields 편집, 제3판, 리펜코트-라벤 출판사, pp 1882-1883(1996)).
HIV는 7개 이상의 유전자를 보유하는 복합 레트로바이러스이다.gag, pol및env로 명명된 바이러스 구조 유전자는 각각 바이러스 코어 단백질, 역전사효소 및 바이러스 외피의 바이러스 당단백질을 암호화한다. 나머지 HIV 유전자는 바이러스 복제에 관여하는 부속 유전자이다.gag및env유전자는 폴리단백질을 암호화한다. 즉, 이들 유전자 각각으로부터 합성된 단백질은 여러 개의 더 작은 단백질로 해독후 변형에 의해 절단된다.
HIV 및 SIV 비리온의 전체 모양은 구형이지만, 뉴클레오캡시드는 나비가 광역 자유단 약 40~60 ㎚ 및 협단 약 20 ㎚인 약 100 ㎚의 긴 치수를 가진 것으로서 비대칭적이다. 각 성숙 비리온내 뉴클레오캡시드는 Gag 전구 폴리펩티드로부터 단백질 분해 처리된 단백질로 둘러싸인 바이러스 1본쇄 RNA 게놈 2분자로 이루어져 있다. 바이러스가 암호화하는 프로테아제(PR)에 의한gag유전자 폴리단백질(Pr55)의 절단은 성숙한 캡시드 단백질을 생성한다. 이러한gag유전자 생성물은 뉴클레오캡시드와 비리온 외피 사이에 위치하는 것으로 생각되는 매트릭스 단백질(p17), 캡시드 껍질로부터 형성되는 주 캡시드 단백질(p24); 및 바이러스 RNA 게놈에 결합하는 뉴클레오캡시드 단백질(p9)이다. 감염된 세포에서의 이러한 단백질 분해 처리가 비리온 형태 발생에 관련되어 있다(Virology, Fields 편집, 제3판, 리펜코트-라벤 출판사, pp 1886-1887(1996))..
주요 캡시드 단백질 p24(CA로도 불림)는 약 240개의 아미노산을 보유하며, 24~27 kD의 분자량을 나타낸다. 단백질 p24는 자가 결합하여 이량체 및 도데카머 만큼 큰 올리고머 복합체를 형성한다. HIV-1 gag 폴리펩티드에서의 돌연변이를 사용한 유전자 연구에서는 분자의 C 말단의 절반을 포함하는 p24 단백질내 몇가지 기능 도메인과, 다양한 레트로바이러스의 p24 단백질에 보존된 20개 아미노산에 걸치는 주상동성 영역(MHR)이 확인되었다. 이들 돌연변이는 전구 뉴클레오캡시드 조립체에 영향을 끼치는 것으로 보인다((Virology, Fields 편집, 제3판, 리펜코트-라벤 출판사, pp 1888-1889 (1996)).
AIDS의 병인제로서의 HIV-1의 발견 이래로, 이 바이러스가 질병을 일으키는 메카니즘을 이해하는 데 있어 상당한 진보가 이루어졌다. 다수의 진단학적 시험이 개발되어 왔지만, HIV 백신 치료의 진보는 주로 바이러스의 이질성 및 적당한 동물 모델의 부재로 인해 지연되어 왔다(Martin,Nature, 345:572-573(1990)).
AIDS를 치료하기 위해 다양한 약제가 사용되어 왔다. 그러나, 이들 약물은 다수가(전부는 아니더라도) 치료제로서의 그 유용성을 크게 제한하는 심각한 부작용을 일으킨다. HIV 역전사효소가 바이러스 복제에서의 그것의 중대한 역할로 인해 약물 표적 중의 하나가 된다. 몇 가지 뉴클레오시드 유도체가 아지도티미딘(AZT, 지도비딘)을 포함하여 HIV 역전사효소를 저해하는 것으로 확인되어 왔다. AZT는 다수의 환자가 그 투여를 용인할 수 없을 만큼 심각한 부작용을 일으킨다. HIV 역전사효소를 저해하는 다른 뉴클레오시드 유사체는 AZT보다 더 큰 부작용을 일으키는 것으로 확인되었다. 또 다른 약물 표적은 바이러스 발육에 중대한 HIV 프로테아제(PR)이다. PR은 아스파르틱 프로테아제이고 합성 화합물에 의해 저해될 수 있다(Richards,FEBS Lett., 253:214-216 (1989)). 프로테아제 저해제는 역전사효소 저해제보다 더 효과적으로 HIV의 성장을 저해하지만, 지속된 치료는 지방 이영양증, 과지방혈증 및 인슐린 저항과 같은 대사 질병과 관련되어 왔다.
또한, HIV는 뉴클레오시드/뉴클레오티드 유사체 역전사효소 저해제 및 프로테아제 저해제에 대한 내성을 신속히 증가시킨다. 이러한 내성은 환자들 사이에서도 확산될 수 있다. 예컨대, HIV에 최근에 감염된 개체의 10분의 1이 이미 AZT에 대한 내성을 나타냈다는 연구 결과가 알려졌는데, 이는 그들이 수혈시에 AZT에 내성이 있는 바이러스를 보균한 사람에 의해 감염되기 때문이다.
부작용이 거의 없는 특이적이고 선택적인 치료제를 얻는 것이 HIV 및 SIV를 비롯한 바이러스 감염의 예방 및 치료에 유용할 것이다.
본 발명은 인간 면역 결핍증 바이러스(HIV) 감염을 비롯한 바이러스 감염을 저해하는 펩티드의 발견에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 다양한 소형 펩티드를 포함하는 약물이 HIV 감염과 같은 바이러스 감염의 치료용 및 예방용으로 개시된다.
도 1은 HUT78 세포에서 HIV 감염성 연구 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 처리되지 않은 HIV 입자의 전자 현미경 복합체이다.
도 3은 프로테아제 저해제 리토나비르와 접촉된 HIV 입자의 전자 현미경 복합체이다.
도 4는 GPG-NH와 접촉된 HIV 입자의 전자 현미경 복합체이다.
도 5는 HIV-1 p24 단백질의 카르복실 말단에 상응하는 단백질 서열(146-231 위치) 및 HIV-2, SIV, 라우스 육종 바이러스(RSV), 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1형(HTLV-1), 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), 메이슨-파이저 원숭이 바이러스(MPMV) 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV)의 단백질 서열의 배열을 예시한 것이다.
도 6은 GPG-NH2, 리토나비르(리토), AZT 또는 상기 제제의 조합의 존재 및 부재 하에 배양된 HIV 감염된 세포의 상청액에서 검출된 p24(pg/㎖)의 그래프이다.
도 7은14C-GPG-NH2의 경구 투여 후에 샘플링한 래트 뇨 및 래트 혈장(rp) 뿐만 아니라14C-GPG-NH2로 항온 처리한 인간 혈장(Hp)으로부터 분리된, 비단백질 결합된 방사성 표지된 화합물을 가진 박층 크로마토그래피를 예시한 것이다. 샘플링 시간이 표시되어 있고, R1-R13은 확인된 방사성 화합물의 위치를 나타내는 작용을 한다.
도 8은 0.1N HCl 및 50 mM KCl로 처리되고 24 시간에 걸쳐 샘플링한 분리된14C-GPG-NH2를 가진 박층 크로마토그래피 지지체이다. 숫자는 산 노출 시간을 나타내고, R은 확인된14C-GPG-NH2의 위치를 나타내는 작용을 한다.
도 9는 래트 혈액내14C-GPG-NH2및 그 대사물의 분배 그래프이다.
도 10은 경구 투여된14C-GPG-NH2인 래트의 혈장 분획으로부터 방사성의 제거 그래프이다.
도 11은 10% SDS/PAGE 상에서 분리된 미정제 및 분획된 래트 혈장 단백질을 나타낸다. 8-f3은14C-GPG-NH2의 투여 후 8 시간 째에 샘플에서 취한 세 번째 분획을 의미하며, 8-f1은14C-GPG-NH2의 투여 후 8 시간 째에 샘플에서 취한 첫 번째 분획을 의미하며, 4-f3은14C-GPG-NH2의 투여 후 4 시간 째에 샘플에서 취한 세 번째 분획을 의미하며, 4-f1은14C-GPG-NH2의 투여 후 4 시간 째에 샘플에서 취한 첫 번째 분획을 의미하며, 8h, 4h, 2h 및 1h는14C-GPG-NH2의 투여 후에 샘플을 채취하는 시간을 의미하고, B1-B4는 확인된 단백질의 위치를 나타내는 작용을 한다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명자는 바이러스 캡시드 단백질에 상응하는 서열을 가진 변형된 소형 펩티드가 적당한 뉴클레오캡시드 형성을 방해함으로써 바이러스 감염을 예방 및/또는 저해한다는 것을 발견하였다. 그러한 펩티드는 바이러스 질병, 특히 HIV/AIDS환자에서의 치료에 유용하며, 바이러스 감염, 특히 HIV 감염 위험이 있는 환자의 예방제로서 및 바이러스에 노출 위험이 상당한 의료 장치에 유용하다.
이하에서 개시하는 바와 같이, 본 발명자는 바이러스 단백질, 예컨대, GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2, 및 SPT-NH2에 상응하는 서열을 가지는 아미드형 소형 펩티드가 배양 상청액에 존재하는 캡시드 단백질 또는 역전사효소 활성의 양을 점검하는 바이러스 감염성 분석에 의해 측정되는 바와 같이, HIV-1, HIV-2 및 SIV의 복제를 저해하는 것을 입증한다. 또한, 본 발명자는 소형 펩티드가 DNA, RNA 및 단백질 합성에 후속하는 단계에서 V3 루프와 무관한 메카니즘으로 바이러스 감염성을 저해한다는 증거를 제시한다.
소형 펩티드로 처리된 HIV 입자의 전자 현미경 이미지는 이러한 새로운 부류의 항바이러스제가 프로테아제 저해제와는 구별되는 방식으로 적당한 캡시드 조립을 방해함을 나타낸다. 또한, 시험관내 결합 분석은 소형 펩티드가 HIV-1의 주 캡시드 단백질(p24)에 결합함을 나타낸다. 여러 가지 바이러스 캡시드 단백질의 서열이 알려져 있기 때문에, 아레나바이러스, 로타바이러스, 오르비바이러스, 레트로바이러스, 파필로마바이러스, 아데노바이러스, 허피스바이러스, 파라믹소바이러스, 믹소바이러스 및 헤파드나바이러스군의 일원들과 같이, 상기 서열에 상응하는 몇 가지 소형 펩티드는 바이러스 감염성 분석법 또는 전자 현미경 기법 또는 그 둘다, 또는 본원에 제시된 분야에서 숙련된 자에게는 명확한 상기 분석들의 변형을 사용하여 선별할 수 있고, 신속히 스크리닝하여 어느 것이 효과적으로 바이러스 감염을 저해 및/또는 예방하는 지를 확인할 수 있다.
바이러스 캡시드 단백질의 서열에 상응하는 소형 펩티드 및 펩티도유사체(총괄적으로 "펩티드제"로 지칭함)를 포함하는 약학 조성물 및 생물공학적 수단을 제조하는 몇 가지 방법이 이하에서 제시된다. 바람직한 펩티드제는 그 카르복시 말단에 아미드기를 가진 트리펩티드, 예컨대, GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2, 및 SPT-NH2이고, 본 발명자는 또한 숙주 세포에서 바이러스 복제(숙주 세포에서의 HIV 복제를 포함)를 저해하는 조성물 및 방법을 제공하는데, 이 조성물은 화학식 X1, X2, X3-NH2또는 화학식 X4, X5, X1, X2, X3-NH2를 가진 아미드형 펩티드를 포함하며, 여기서, X1, X2, X3, X4및 X5는 임의의 아미노산이고, 임의의 하나 또는 두 개의 아미노산이 부재할 수 있다. 바람직한 양태는 X3으로서 글리신 잔기를 가진다. 일부 양태에서, 펩티드제는 단량체형으로 제공되고; 다른 양태에서는 펩티드제가 다량체형 또는 다량체화된 형태로 제공된다. 지지체 결합된 펩티드제 역시 여러 양태에서 사용된다. 펩티드제를 포함하는 약학 조성물은 치료제 또는 예방제로서 또는 바이러스 질병, 바람직하게는 HIV 감염의 치료 및/또는 예방용으로 투여된다. 일부 양태에서는, 펩티드제를 포함하는 약학 조성물이 뉴클레오시드 유사체 역전사효소 저해제, 뉴클레오티드 유사체 역전사효소 저해제, 비뉴클레오시드 유사체 역전사효소 저해제 및 프로테아제 저해제를 포함하는 기타 항바이러스 치료와 함께 투여된다. 본 발명자는 또한 소형 펩티드가 산 가수분해에 내성이 있고, 상당량의 소형 펩티드가 시험 대상에 투여될 때 혈액, 혈장 및 기관 조직에 효과적으로 전달되며, 시험 대상으로의 다량의 소형 펩티드의 투여가 비교적 비독성이라는 증거를 제공한다.
또한, 본 발명자는 바이러스 복제를 저해 또는 예방하거나 바이러스 캡시드 조립을 방해하거나 또는 그 둘다를 하는 펩티드제를 확인하는 몇 가지 방법을 개시한다. 한 가지 방법으로, 유효량의 펩티드제는 바이러스로 감염된 세포와 접촉시키고, 세포들은 바이러스 복제 또는 바이러스 생성물의 존재에 대해 분석된다. 또한, 전자 현미경 분석법을 사용하여 펩티드제가 캡시드 조립을 방해하는 능력은 용이하게 측정될 수 있다. 또한, 캡시드 단백질(예컨대, p24)에 결합하여 캡시드 조립을 방해하고, 따라서 바이러스 복제를 방해하는 펩티드제를 확인하는 방법이 개시된다. 따라서, 캡시드 단백질(예컨대, p24)은 펩티드제, 예컨대, 화학식 X1, X2, X3을 갖는 아미드형 펩티드와 접촉시키며(여기서, X1, X2및 X3은 임의의 아미노산임), 펩티드제와 결합된 캡시드 단백질(예컨대, p24)을 포함하는 복합체가 확인된다. 바이러스 단백질(예컨대, p24) 및 펩티드제와, 펩티드제에 결합된 바이러스 단백질(예컨대, p24)을 가진 생분자 복합체를 보유하는 반응 혼합물 역시 본 발명에서 개시된다.
하기 표 1에 나열된 아미드형의 소형 펩티드를 시험하였다. 이들 소형 펩티드의 다수는 HIV 및/또는 SIV 바이러스 단백질내 서열에 완전히 또는 부분적으로상응하기 때문에 선별 및 합성될 수 있다. 표 1의 소형 펩티드는 하기 실시예 1에 개시된 방법에 따라 합성되나, 물론 당해 분야에 알려진 임의의 방법으로 합성될 수 있다.
[발명의 개요]
본 발명은 바이러스 감염성을 저해하는 소형 펩티드(2~10개 아미노산의 길이)에 관한 것이다. 완전한 캡시드 구조가 비리온의 감염성에 중대한 요소이다. 감염성에 대해 이량체화, 삼량체화, 사량체화 또는 다량체화에 의존하는 캡시드 단백질 거대분자의 조립을 파괴하는 방법은 그러한 단백질-단백질 상호작용에 영향을 끼치는 소형 분자를 만드는 것이다. 그 카르복실 말단 히드록실기가 아미드기로 대체된 소형 펩티드가 캡시드-단백질 상호작용에 그러한 저해 효과를 가진다는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명의 몇가지 측면은 바이러스 캡시드 조립에 영향을 끼치는 변형된 소형 펩티드와 관련된다.
바람직한 양태에서, 짧은 펩티드는 HIv-1, HIv-2 및 SIV의 캡소미어 구성 및 캡시드 조립에 관여하는 단백질에 결합하여 적절한 캡시드 조립 및 따라서 바이러스 감염을 저해 및/또는 방해한다. 소형 펩티드 Gly-Pro-Gly-NH2(GPG-NH2), Gly-Lys-Gly-NH2((GKG-NH2), Cys-Gln-Gly-NH2(CQG-NH2), Arg-Gln-Gly-NH2(RQG-NH2), Lys-Gln-Gly-NH2(KQG-NH2), Ala-Leu-Gly-NH2(ALG-NH2), Gly-Val-Gly-NH2(GVG-NH2), Val-Gly-Gly-NH2(VGG-NH2), Ala-Ser-Gly-NH2(ASG-NH2), Ser-Leu-Gly-NH2(SLG-NH2) 및 Ser-Pro-Thr-NH2(SPT-NH2)가 바람직한 종이다. 이들 소형 펩티드 및 그 구조를 닮은 펩티드 유사체(총괄적으로 "펩티드제"로 지칭됨)는 단량체 또는 다량체 형으로 사용된다. 본 발명의 펩티드제는 바이러스 감염을 앓고 있는 인간을 포함한 포유동물에서의 치료 및 예방용으로 적합하다.
일 양태로, 바이러스로 감염된 숙주 세포에서 바이러스 복제를 저해하는 용도의 조성물은 화학식 X1X2X3-NH2를 갖는 아미드형 펩티드의 효과적인 양을 포함하는데, 여기서, X1,X2및X3은 임의의 아미노산이고, 상기 펩티드는 Gly-Pro-Gly-NH2는 아니며, 상기 조성물은 바이러스 캡시드 조립을 방해함으로써 바이러스 복제를 저해한다. 바람직하게는 상기 펩티드 중 X3은 글리신이다. 또한, 전술한 조성물은 화학식 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2, 및 Ser-Pro-Thr-NH2를 가진 펩티드로 구성된 군에서 선택되는 아미드형 펩티드를 포함할 수 있다.
또 다른 관련 양태에서, 전술한 조성물은 화학식 X4X5X1X2X3-NH2를 가진 아미드형 펩티드인데, 여기서, X4및 X5는 임의의 아미노산이고, 임의의 하나 또는 두 개의 아미노산이 부재할 수 있다. 이 양태는 화학식 X1X2X3을 가진 트리펩티드일 수 있는데, 여기서, 이 서열은 바이러스의 캡시드 단백질의 아미노산 서열에서 확인된다.
일부 양태에서, 전술한 조성물은 지지체에 결합되며, 다른 양태에서, 전술한 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 가진 약제 속으로 혼입된다. 예컨대, 아미드형 펩티드는 화학식 Gly-Lys-Gly-NH2를 가질 수 있고, 지지체에 결합될 수 있다.
또한, 아미드형 펩티드는 예컨대, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2또는 Ser-Leu-Gly-NH2와 같은 화학식을 가질 수 있다. 이들 펩티드 역시 지지체에 결합될 수 있다.
숙주 세포에서 HIV 복제를 저해하는 방법도 한 가지 양태이다. 한 가지 방법은 예컨대, 화학식 X1X2X3-NH2를 가지면서, X1, X2및 X3은 임의의 아미노산인 아미드형 펩티드의 유효량을 세포에 투여하는 것인데, 여기서, 상기 펩티드는 Gly-Pro-Gly-NH2는 아니다. 따라서, 상기 펩티드는 화학식 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2, 및 Ser-Pro-Thr-NH2를 가진 펩티드로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 전술한 방법은 또한 뉴클레오시드 유사체 역전사효소 저해제, 뉴클레오티드 유사체 역전사효소 저해제, 비뉴클레오시드 유사체 역전사효소 저해제 및 프로테아제 저해제로 구성된 군에서 선택되는 항바이러스 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법에 사용된 펩티드는 지지체에 결합되거나 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제로 투여될 수 있다.
또 다른 양태로, 숙주 세포에서 HIV 복제를 저해하는 조성물은 화학식 X1X2X3-NH2를 가지면서, X1, X2및 X3은 임의의 아미노산인 아미드형 펩티드의 유효량을 포함하는데, 여기서, 상기 펩티드는 Gly-Pro-Gly-NH2는 아니며, 상기 조성물은캡시드의 조립을 방해함으로써 HIV 복제를 저해한다. 이 양태의 펩티드는 화학식 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2및 Ser-Pro-Thr-NH2를 가진 펩티드로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하다. 또한, 전술한 아미드형 펩티드는 화학식 X4X5X1X2X3-NH2를 가질 수 있는데, 여기서, X4및 X5는 아미노산이고, 임의의 하나 또는 두 개의 아미노산이 부재할 수 있다. 이들 조성물은 예컨대, HIV의 캡시드 단백질의 아미노산 서열에서 확인되는 트리펩티드 X1X2X3을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 상기 펩티드는 지지체에 결합되고, 다른 양태에서, 상기 펩티드는 약학적으로 허용 가능한 담체를 가진 약제 속으로 혼입된다.
또 다른 방법에서는, 숙주 세포에서 바이러스 복제를 저해하는 방법이 제시되는데, 이것은 화학식 X1X2X3-NH2를 가지면서, X1, X2및 X3은 임의의 아미노산인 아미드형 펩티드의 유효량을 상기 세포에 투여하는 것인데, 여기서, 상기 펩티드는 Gly-Pro-Gly-NH2는 아니다. 이 방법에서, 상기 펩티드는 화학식 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2, 및 Ser-Pro-Thr-NH2를 가진 펩티드로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 이 방법은 또한 뉴클레오시드 유사체 역전사효소 저해제, 뉴클레오티드 유사체 역전사효소 저해제, 비뉴클레오시드 유사체 역전사효소 저해제 및 프로테아제 저해제로 구성된 군에서 선택되는 항바이러스 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 상기 방법에 사용된 펩티드는 지지체에 결합되거나 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제로 투여될 수 있다.
또 다른 방법에서는, 바이러스 캡시드 조립을 방해하는 방법이 제시된다. 이 방법은 화학식 X1X2X3-NH2를 가지면서, X1, X2및 X3은 임의의 아미노산인 아미드형 펩티드의 유효량과 세포를 접촉시키는 것인데, 여기서, 상기 펩티드는 Gly-Pro-Gly-NH2는 아니다. 이 방법에 사용된 펩티드는 화학식 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2, 및 Ser-Pro-Thr-NH2를 가진 펩티드로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 일부 양태에서는, X3이 이 방법에 사용된 펩티드에서 글리신이다.
다른 양태에서, 상기 방법은 화학식 X4X5X1X2X3-NH2를 가진 아미드형 펩티드를 이용하는데, 여기서, X4및 X5는 아미노산이고, 임의의 하나 또는 두 개의 아미노산이 부재한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 바이러스의 단백질의 아미노산 서열에서 확인되는 트리펩티드 X1X2X3의 사용을 포함할 수 있다.
종종, 상기 방법의 펩티드는 지지체에 결합되거나 약제 중에 혼입된다.
펩티드제의 확인 방법도 제시된다. 한 가지 방법으로, 예컨대, 항바이러스 약제 내로의 혼입용 펩티드제는 바이러스로 감염된 다수의 세포를 펩티드제의 유효량과 접촉시키고(여기서, 상기 펩티드는 Gly-Pro-Gly-NH2는 아님), 불완전 캡시드 형성에 대해 바이러스를 분석하며, 불완전한 캡시드 형성을 유도하는 펩티드제를 선별함으로써 확인된다. 이 방법은 현미경 분석을 이용하는 캡시드 형성의 분석을 포함할 수 있고, 바이러스는 HIV-1, HIV-2 및 SIV로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 또한, 확인된 펩티드제는 트리펩티드, 올리고펩티드 및 펩티드유사체로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 예컨대, 상기 펩티드제는 화학식 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2, 및 Ser-Pro-Thr-NH2를 가진 펩티드로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 방법에 사용된 펩티드제는 p24의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 가진다.
또 다른 양태에서, 바이러스 단백질에 결합하는 펩티드제를 확인하는 방법이 제시되는데, 이 방법은 바이러스 단백질을 제공하고, 바이러스 단백질을 펩티드제 유효량과 접촉시키며(여기서, 상기 펩티드는 Gly-Pro-Gly-NH2는 아님), 바이러스 단백질 및 펩티드제를 포함하는 복합체의 형성을 검출하는 것을 포함한다. 상기와 같이, 상기 방법은 HIV-1, HIV-2 및 SIV로 구성된 군에서 선택되는 바이러스로부터 유래한 바이러스 단백질의 사용을 포함한다. 또한, 일 측면에서, 펩티드제는 트리펩티드, 올리고펩티드 및 펩티드유사체로 구성된 군에서 선택된다. 바람직하게는상기 방법은 화학식 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2, 및 Ser-Pro-Thr-NH2를 가진 펩티드로 구성된 군에서 선택된다. 또한, 약제의 제조 방법이 제공되는데, 여기서, 상기 방법에 의해 확인되는 펩티드제는 약제 중에 혼입된다.
약제를 제조하는 또 다른 방법도 제시되는데, 이 방법은 화학식 X1X2X3-NH2를 가지면서, X1, X2및 X3은 임의의 아미노산인 아미드형 펩티드의 유효량을 세포에 투여하고(여기서, 상기 펩티드는 Gly-Pro-Gly-NH2는 아님), 세포에서의 바이러스 복제의 저해를 검출하며, 바이러스 복제의 저해를 일으키는 펩티드를 약제 내로 혼입시키는 것을 포함한다. 이 방법은 화학식 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2, 및 Ser-Pro-Thr-NH2를 가진 펩티드로 구성된 군에서 선택되는 펩티드의 사용을 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 뉴클레오시드 유사체 역전사효소 저해제, 뉴클레오티드 유사체 역전사효소 저해제, 비뉴클레오시드 유사체 역전사효소 저해제 및 프로테아제 저해제로 구성된 군에서 선택되는 항바이러스 화합물을 약제 내로 혼입시키는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 담체를 약제 내로 혼입시키는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 바이러스로 감염된 숙주 세포에서 바이러스 복제를 저해하는 조성물은 화학식 X1X2X3-R을 가지면서, X1, X2및 X3은 임의의 아미노산인 펩티드(여기서, 상기 펩티드는 Gly-Pro-Gly-NH2는 아님)를 포함하는데, 상기 식에서, R은 상기 펩티드의 카르복시 말단에 부착된 조절기이고, 아미드기 또는 유사한 전하 및 입체적 크기를 가진 기타 부분을 포함하며, 상기 조성물은 바이러스 캡시드 조립을 방해함으로써 바이러스 복제를 저해한다. 상기 조성물은 화학식 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2, 및 Ser-Pro-Thr-NH2를 가진 펩티드로 구성된 군에서 선택되는 펩티드일 수 있다. 이들 양태에서, X3은 글리신이 바람직하다.
또한, 상기 조성물은 화학식 X4X5X6X7X8X9X10X1X2X3-R을 가진 펩티드를 포함할 수 있는데, 여기서, X4, X5, X6, X7, X8, X9및 X10은 임의의 아미노산이고, 임의의 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 일곱 개의 아미노산이 부재하고, R은 상기 펩티드의 카르복시 말단에 부착된 조절기이고, 아미드기 또는 유사한 전하 및 입체적 크기를 가진 기타 부분을 포함한다.
상기 조성물은 바이러스의 캡시드 단백질의 아미노산 서열에서 확인되는 펩티드 X1X2X3을 포함하는 것이 바람직하다.
테스트한 펩티드의 아미노산 서열
Leu-Lys-Ala(LKA) Arg-Gln-Gly(RQG)
Iso-Leu-Lys(ILK) Lys-Gln-Gly(KQG)
Gly-Pro-Gln(GPQ) Ala-Leu-Gly(ALG)
Gly-His-Lys(GHK) Gly-Val-Gly(GVG)
Gly-Lys-Gly(GKG) Val-Gly-Gly(VGG)
Ala-Cys-Gln(ACQ) Ala-Ser-Gly(ASG)
Cys-Gln-Gly(CQG) Ser-Leu-Gly(SLG)
Ala-Arg-Val(ARV) Ser-Pro-Thr(SPT)
Lys-Ala-Arg(KAR) Gly-Ala-Thr(GAT)
His-Lys-Ala(HKA) Lys-Ala-Leu(KAL)
Gly-Pro-Gly(GPG)
사용한 약어
Leu-루신 Lys-라이신
Gln-글루타민 Ala-알라닌
His-히스티딘 Ilue-이소루신
Cys-시스테인 Gly-글리신
Pro-프롤린 Arg-아르기닌
Val-발린 Thr-트레오닌
Ser-세린
실시예 1
본 실시예에서, 상기한 소 펩티드를 얻기위해 사용한 방법을 기술한다. 몇몇 트리펩티드는 자동 펩티드 합성기(독일 투빙겐 소재의 시로, 멀티신테크)를 이용하여 화학적으로 합성하였다. 이 합성은 표준 프로토콜에 따라 9-플루오레닐메톡시카르보닐(fmoc) 보호된 아미노산(미국 메사추세츠 베드포드 소재의 밀리겐)을 이용하여 수행하였다. 모든 펩티드는 동결건조한 후, 적절한 농도로 인산염 완충 염수(PBS) 내에 용해시켰다. 상기 펩티드는 PepS-15C18 컬럼(스웨덴 웁살라 소재의파마시아)을 이용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)로 분석하였다.
많은 구체예에서, 펩티드의 카르복시 말단에 부착된 조절기를 보유하는 펩티드("개질된 펩티드")를 사용하였다. 몇몇 경우, 상기 개질된 펩티드는 펩티드의 말단 카르복실기에 일반적으로 존재하는 히드록실 잔기를 아미노기로 치환함으로써 생성하였다. 즉, 말단 COOH 대신에, 상기 펩티드는 CO-NH2를 보유하도록 합성하였다. 예를 들어, 바람직한 소 펩티드는 글리실-리실-글리신 아미드(GKG-NH2), 시스틸-글루타밀-글리신 아미드(CQG-NH2), 글리실-프롤릴-글리신 아미드(GPG-NH2), 아르기닐-글루타밀-글리신 아미드(RQG-NH2), 리실-글루타밀-글리신 아미드(KQG-NH2), 알라닐-루실-글리신 아미드(ALG-NH2), 글리실-발릴-글리신 아미드(GVG-NH2), 발릴-글리실-글리신 아미드(VGG-NH2), 알라닐-세릴-글리신 아미드(ASG-NH2), 세릴-루실-글리신 아미드(SLG-NH2) 및 세릴-프롤릴-트레오닌 아미드(SPT-NH2)를 포함한다. 합성된 트리펩티드 이외에 많은 트리펩티드는 또한 스위스의 바켐 아게에게 구입하였는데, 그 예로는 GKG-NH2, CQG-NH2, 및 GPG-NH2를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
독성학 실험 및 종래의 항바이러스 치료법과 병용하는 소 펩티드의 효과를 평가하는 실험에서, 상기 펩티드는 다음과 같이 얻었다. 초기 실험에서, 고체상 펩티드 합성은 어플라이드 바이오시스템스 430A 펩티드 합성기(미국 캘리포니아 포스터 시티에 소재하는 어플라이드 바이오시스템스)를 이용하여 수행하였다. 상기 펩티드가 산 가수분해에 의해 고형 지지체로부터 분리되는 경우, 각각의 합성은 카르복시 말단 아미드를 산출하는 p-메틸벤질하드릴아민 고체상 지지체 수지(미국 컨터기 루이즈빌에 소재하는 펩티드 인터내쇼날)을 이용하였다. 상기 합성에 이용하기 위한 모든 아미노산은 α-NH2를 보호하며, 스위스의 노바바이오켐 아게에서 시판되는 t-부틸카르보닐기를 함유하였다. 상기 보호기는 고형 지지체 수지로부터 분리된 합성된 펩티드로부터 제거하였는데, 이 제거는 트리플루오로메탄 설폰산을 이용하는 처리에 의해 수행하였으며, 카르복시 말단에 히드록실기(-OH) 대신에 아미노(-NH2) 조절기를 보유하는 펩티드를 생성하였다. 사용전에, 상기 펩티드는 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하였으며, 어플라이드 바이오시스템스 473A 펩티드 서열결정기로 서열결정하였다. 또한, 아미드(CO-NH2; GPG-NH2) 또는 카르복시(COOH; GPG-OH) 말단을 보유하는 트리펩티드 GPG는 스위스의 바켐 아게로부터 구입하였다.
이하, HIV-1, HIV-2 및 SIV 감염을 억제하는 소 펩티드를 동정하기 위해 사용한 몇몇 분석법을 기술한다.
HIV 및 SIV 감염성 분석
실시예 1에 따라 제조한 펩티드는 몇몇 HIV-1, HIV-2 및 SIV 감염 분석에 사용하였다. HIV-1, HIV-2 및 SIV 감염의 효율은 역전사효소 활성, 세포 상청액 내의 p24 단백질의 농도 및 HIV-1 합포체 형성의 현미경에 의한 평가에 의해 모니터링하였다.
초기 실험에서, 몇몇 트리펩티드는 H9 세포에서 HIV-1, HIV-2 및 SIV 감염을 억제할 수 있는 능력에 대해 스크리닝하였다. 일단 억제 펩티드가 동정되면, 더 구체적인 분석을 수행하여 선택된 트리펩티드의 여러가지 농도 및 병용 치료(예를 들어, 하나 이상의 펩티드의 병용)의 효과를 결정하였다.
하기 실시예에서, HIV-1, HIV-2 및 SIV 감염을 억제할 수 있는 그들의 능력에 대해 몇몇 트리펩티드를 스크리닝하는데 사용한 방법을 기술한다.
실시예 2
본 실시예에서, HIV-1, HIV-2 및 SIV 복제를 억제할 수 있는 여러가지 트리펩티드의 능력을 분석하기 위해 사용된 방법을 기술한다. 실험 1 및 2에서, 약 200,000 H9 세포는 25 TCID50에서 HIV-1, HIV-2 또는 SIV로 감염시켜 합성된 트리펩티드 LKA-NH2, ILK-NH2, GPQ-NH2, GHK-NH2, GKG-NH2, ACQ-NH2, ARV-NH2, KAR-NH2, HKA-NH2, GAT-NH2, KAL-NH2, 및 GPG-NH2의 억제 효과를 테스트하였다. 따라서, H9 세포는 10%(v/v) 열변성된 태아 소 혈청(FBS), 페니실린(100 u/ml) 및 스트렙토마이신(100 u/ml), 및 폴리브렌( g/ml)(시그마에서 시판됨)으로 보충된 RPMI 1640 배지 1 ml(모두 지브코에서 시판됨) 내의 여러 농도의 상이한 펩티드(약 100 μM)의 존재 또는 부재하에 재현탁시켰다. 이어서, 바이러스는 25 TCID50으로 20 내지 30 ㎕의 부피에 첨가하였다. 세포는 37℃에서 1 시간 동안 바이러스와 함께 항온처리한 후, 170xg에서 7분 동안 펠릿화하였다. 이어서, 상기 세포는 실온에서 펩티드를 함유하지 않는 RPMI 배지내에서 3회 세척하고, 상기한 바와 같이, 170xg에서 7분 동안 펠릿화하였다. 최종 세척후, 상기 세포는 24웰 평판(코스타 코포레이션) 내에서 상기 펩티드를 함유하는 RPMI 배양 배지내에 재현탁시키고, 37℃, 5% CO2및 습윤 조건하에서 유지하였다.
배지는 감염후 4일, 7일, 10일 및 14일에 교환하였으며, 이때 배양 상청액을 수집하고, 분석하였다. 바이러스의 복제를 모니터링하기 위해, 상청액내 역전사효소(RT) 활성은 시판되는 렌티-RT 활성 키트(스웨덴 웁살라의 카비디 테크)를이용하여 분석하였다. RT의 양은 표준 회귀선을 이용하여 측정하였다. 결과는 흡광도(OD)로 나타냈으며, 흡광도가 크다는 것은 더 높은 단백질 농도 및 더 큰 바이러스 감염을 나타낸다. 합포체 형성은 또한 현미경 조사로 모니터링하였다. 표 2 및 표 3은 각각 실험 1 및 2의 세포 배양 상청액의 흡광도를 나타낸다.
실험 3(표 4)에서, 약 200,000 H9 세포는 25 TCID50에서 HIV-1, HIV-2 또는 SIV로 감염시켜 펩티드 GPG-NH2, GKG-NH2및 CQG-NH2, 및 이들 펩티드의 조합의 상이한 농도의 억제 효과를 테스트하였다(지시된 농도는 각각의 트리펩티드의 농도와 상응한다). 상기한 바와 같이, H9 세포는 10%(v/v) 열변성된 태아 소 혈청(FBS), 페니실린(100 u/ml) 및 스트렙토마이신(100 u/ml), 및 폴리브렌( g/ml)으로 보충된 RPMI 1640 배지 1 ml 내의 여러 농도의 상이한 펩티드(약 100 μM)의 존재 또는 부재하에 재현탁시켰다. 이어서, 바이러스는 25 TCID50으로 20 내지 30 ㎕의 부피에 첨가하였다. 세포는 37℃에서 1 시간 동안 바이러스와 함께 항온처리한 후, 170xg에서 7분 동안 펠릿화하였다. 이어서, 상기 세포는 실온에서 펩티드를 함유하지 않는 RPMI 배지내에서 3회 세척하고, 상기한 바와 같이, 170xg에서 7분 동안 펠릿화하였다. 최종 세척후, 상기 세포는 24웰 평판(코스타 코포레이션) 내에서 상기 펩티드를 함유하는 RPMI 배양 배지내에 재현탁시키고, 습도 5% CO2내 37℃에서 유지하였다.
배지는 감염후 4일, 7일, 및 11일째에 변화시켰는데, 이때 배양 상청액을 수집하고, 분석하였다. 상기한 바와 같이, 바이러스의 복제를 모니터링하기 위해, 상청액내 역전사효소(RT) 활성은 시판되는 렌티-RT 활성 키트(스웨덴 웁살라의 카비디 테크)를이용하여 분석하였다. RT의 양은 표준 회귀선을 이용하여 측정하였다. 결과는 흡광도(OD)로 나타냈으며, 흡광도가 크다는 것은 더 높은 단백질 농도 및 더 큰 바이러스 감염을 나타낸다. 합포체 형성은 또한 현미경 조사로 모니터링하였다. 표 4는 실험 3의 세포 배양 상청액의 흡광도를 나타낸다.
실험 4(표 5)에서, 약 200,000 H9 세포는 25 TCID50에서 HIV-1로 감염시켜 펩티드 GPG-NH2, GKG-NH2및 CQG-NH2, 및 이들 펩티드의 조합의 상이한 농도의 억제 효과를 테스트하였다(지시된 농도는 각각의 트리펩티드의 농도와 상응한다). 상기한 바와 같이, H9 세포는 10%(v/v) 열변성된 태아 소 혈청(FBS), 페니실린(100 u/ml) 및 스트렙토마이신(100 u/ml), 및 폴리브렌( g/ml)으로 보충된 RPMI 1640 배지 1 ml 내의 여러 농도의 상이한 펩티드(약 100 μM)의 존재 또는 부재하에 재현탁시켰다. 이어서, 바이러스는 25 TCID50으로 20 내지 30 ㎕의 부피에 첨가하였다. 세포는 37℃에서 1 시간 동안 바이러스와 함께 항온처리한 후, 170xg에서 7분 동안 펠릿화하였다. 이어서, 상기 세포는 실온에서 펩티드를 함유하지 않는 RPMI 배지내에서 3회 세척하고, 상기한 바와 같이, 170xg에서 7분 동안 펠릿화하였다. 최종 세척후, 상기 세포는 24웰 평판(코스타 코포레이션) 내에서 상기 펩티드를 함유하는 RPMI 배양 배지내에 재현탁시키고, 습도 5% CO2내 37℃에서 유지하였다.
배지는 감염후 4일, 7일, 및 11일째에 변화시켰는데, 이때 배양 상청액을 수집하고, 분석하였다. 상기한 바와 같이, 바이러스의 복제를 모니터링하기 위해, 상청액내 역전사효소(RT) 활성은 시판되는 렌티-RT 활성 키트(스웨덴 웁살라의 카비디 테크)를이용하여 분석하였다. RT의 양은 표준 회귀선을 이용하여 측정하였다. 결과는 흡광도(OD)로 나타냈으며, 흡광도가 크다는 것은 더 높은 단백질 농도 및 더 큰 바이러스 감염을 나타낸다. 합포체 형성은 또한 현미경 조사로 모니터링하였다. 표 5는 실험 4의 세포 배양 상청액의 흡광도를 나타낸다. 11일째에 분석된 상청액은 5배 희석시켜 검출이 더 정확하게 이루어질 수 있도록 하였다.
실험 5(표 6)에서, 약 200,000 H9 세포는 25 TCID50에서 HIV-1로 감염시켜 펩티드 GPG-NH2, GKG-NH2및 CQG-NH2, 및 이들 펩티드의 조합의 상이한 농도의 억제 효과를 테스트하였다. 상기한 바와 같이, H9 세포는 10%(v/v) 열변성된 태아 소 혈청(FBS), 페니실린(100 u/ml) 및 스트렙토마이신(100 u/ml), 및 폴리브렌( g/ml)으로 보충된 RPMI 1640 배지 1 ml 내의 여러 농도의 상이한 펩티드(약 100 μM)의 존재 또는 부재하에 재현탁시켰다. 이어서, 바이러스는 25 TCID50으로 20 내지 30 ㎕의 부피에 첨가하였다. 세포는 37℃에서 1 시간 동안 바이러스와 함께 항온처리한 후, 170xg에서 7분 동안 펠릿화하였다. 이어서, 상기 세포는 실온에서 펩티드를 함유하지 않는 RPMI 배지내에서 3회 세척하고, 상기한 바와 같이, 170xg에서 7분 동안 펠릿화하였다. 최종 세척후, 상기 세포는 24웰 평판(코스타 코포레이션) 내에서 상기 펩티드를 함유하는 RPMI 배양 배지내에 재현탁시키고, 습도 5% CO2내 37℃에서 유지하였다.
배지는 감염후 4일, 7일, 및 14일째에 변화시켰는데, 이때 배양 상청액을 수집하고, 분석하였다. 각 바이러스의 복제는 상청액 내에서 p24의 존재를 검출함으로써 모니터링하였다. HIV p24 항원은 시판되는 HIV p24 항원 검출 키트(애보트)를 이용하여 측정하였다. 결과는 흡광도(OD)로 나타냈으며, 흡광도가 크다는 것은 더 높은 단백질 농도 및 더 큰 바이러스 감염을 나타낸다. 몇몇 경우, 상청액의 일련의 희석액을 제조하여 p24 농도를 더 정확하게 검출하였다. 표 6은 실험 5의 세포 배양 상청액의 흡광도를 나타낸다. 이하 더 상세히 기술하는 바와 같이, 트리펩티드 GPG-NH2, GKG-NH2및 CQG-NH2, 및 이들 펩티드의 조합은 HIV-1, HIV-2 및 SIV 감염을 효과적으로 억제하는 것으로 확인되었다.
실험 6(표 7 및 도 1)에서, 약 200,000 HUT78 세포는 25 TCID50에서 HIV-1로 감염시켜 펩티드 GPG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2, 및 SPT-NH2의 억제 효과를 테스트하였다. HUT 세포는 10%(v/v) 열변성된 태아 소 혈청(FBS, 지브코), 페니실린(100 u/ml) 및 스트렙토마이신(100 u/ml), 및 폴리브렌(시그마, 2 ㎍/ml)으로 보충된 RPMI 1640 배지 1 ml 내의 여러 농도의 상이한 상기 펩티드(약 100 μM)의 존재 또는 부재하에 재현탁시켰다. 이어서, 바이러스는 25 TCID50으로 20 ㎕의 부피에 첨가하였다. 세포는 37℃에서 1 시간 동안 바이러스와 함께 항온처리한 후, 170xg에서 7분 동안 펠릿화하였다. 이어서, 상기 세포는 실온에서 펩티드를 함유하지 않는 RPMI 배지내에서 3회 세척하고, 상기한 바와 같이, 170xg에서 7분 동안 세포 침강 시켰다. 최종 세척후, 상기 세포는 24웰 평판(코스타 코포레이션) 내에서 상기 펩티드를 함유하는 RPMI 배양 배지내에 재현탁시키고, 37℃, 5% CO2및 습윤 조건하에서 유지하였다.
배지는 감염후 4일, 7일, 및 11일째에 변화시켰는데, 이때 배양 상청액을 수집하고, 바이러스 p24 생성은 HIV-1 p24 ELISA 키트(미국 노스 시키고 애보트 레버러토리즈)를 이용하여 모니터링하였다. 후술하는 바와 같이, 소 펩티드 RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2, 및 SPT-NH2는 HIV-1 감염을 효과적으로 억제하는 것으로 확인되었다.
* 수치는 광학 밀도(OD)를 나타냄
* 수치는 광학 밀도(OD)를 나타냄
* 수치는 광학 밀도(OD)를 나타냄
* 수치는 광학 밀도(OD)를 나타냄
* 수치는 광학 밀도(OD)를 나타냄
* 수치는 광학 밀도(OD)를 나타냄
소 펩티드는 HIV-1, HIV-2 및 SIV 감염을 억제 및/또는 예방하였다.
표 1에 기재한 소 펩티드 중에서, GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2및 STP-NH2는 HIV-1 감염을 억제 및/또는 예방하였으며, 또한 GKG-NH2, CQG-NH2및 GPG-NH2는 HIV-2 및 SIV 감염을 억제하거나 예방하는 것으로 확인되었다. 소 펩티드 RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2및 SPT-NH2는 HIV-2 또는 SIV 감염을 에방하거나 억제할 수 있는 그들의 능력에 대해 분석하지 않았지만, HIV-2 및 SIV는 소 펩티드 GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2및 STP-NH2가 상응하며, HIV-2 또는 SIV 감염의 억제 또는 예방 또는 둘다가예상되는 영역에서 캡시드 단백질 구조에서 상당한 상동성을 공유하였다.
실험 1 내지 6(표 2 내지 7 및 도 1)의 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 카르복시 말단 아미노산으로서 글리신을 보유하는 바이러스 캡시드 단백질 서열에 상응하는 아미드 형태의 소 펩티드 GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2및 SLG-NH2가 HIV 감염을 억제 또는 예방하는 것으로 이해해야 할 것이다. 카르복시 말단 알라닌 잔기를 함유하는 펩티드 Leu-Lys-Ala(LKA) 및 His-Lys-Ala(HKA) 또는 글루타민 잔기를 보유하는 펩티드 Gly-Pro-Gln(GPQ) 및 Ala-Cys-Gln(ACQ)는 HIV 감염을 예방하지 않았다. 그러나, 아미노 말단에서 글리신은 억제 인자가 아니었는데, 그 이유는 아미노 말단 글리신 잔기를 보유하는 펩티드 Gly-Pro-Gln(GPQ), Gly-His-Lys(GHK) 및 Gly-Ala-Thr(GAT)는 감염 및 HIV-1 합포체 형성을 예방하지 못하기 때문이다. 또한, 기타 하전되지 않은 극성 측쇄, 예를 들어 Gly-Pro-Gln(GPQ), Ala-Cys-Gln(ACQ) 및 Gly-Ala-Thr(GAT) 또는 카르복시 말단에 비극성 측쇄를 보유하는 펩티드 Ala-Arg-Val(ARV), His-Lys-Ala(HKA), Lys-Ala-Leu(KAL) 및 Leu-Lys-Ala(LKA)는 감염을 예방하지 않았다. 카르복시 말단에서 글리신 잔기는 HIV 및 SIV 감염의 억제와 관련되어 있는 것으로 생각되지만, 다른 아미노산 잔기 또는 소 펩티드의 카르복시 말단에서 개질된 아미노산 잔기는 HIV 및 SIV 감염을 억제할 수 있었다. 예를 들어, Ser-Pro-Thr(SPT)은 HIV-1 감염을 억제하거나 예방하였다.
몇몇 실험에서, HIV-1, HIV-2 및 SIV 감염에 대한 소 펩티드의 효과는 농도및 시간 의존성인 것으로 생각된다. GKG-NH2, CQG-NH2, 및 GPG-NH2및 이들 조합의 5 μM 및 20 μM과 같은 낮은 농도는 HIV-1, HIV-2 및 SIV 감염을 감소시키는데 효가적인 것으로 확인되었다. 그러나, 100 μM 이상의 농도에서, 상기 트리펩티드 GKG-NH2, CQG-NH2, 및 GPG-NH2및 이들 조합은 HIV-1, HIV-2 및 SIV 감염을 더 효과적으로 억제하였다. 표 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 300 μM의 GKG-NH2및 COG-NH2는 거의 100%까지 HIV-1 감염을 감소시켰으며, 이는 세포 상청액 내 p24 항원의 존재를 검출함으로써 확인할 수 있다. 표 6에 나타낸 감소율(%)은 펩티드 테스트한 샘플 내에서 검출된 p24 항원의 양을 대조용 샘플에서 검출된 p24 항원의 양으로 나누고, 나누어 얻어진 값에 100을 곱하여 감소율을 얻었으며, 100%에서 얻어진 %를 빼서 나온 결과이다. 예를 들어, GPG-NH2에 의해 나타난 감소율(%)은 다음과 같다:
5.6 x 102x 100/2.0 x 104및 100% - 3% = 97%
최초 5회의 실험(표 2-6)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 트리펩티드 GKG-NH2, CQG-NH2, 및 GPG-NH2와 이들의 조합은 5 μM 이상의 농도에서 HIV-1, HIV-2 및 SIV 감염을 억제하였다.
6번째 실험(표 7 및 도 1)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 소 펩티드 RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2, 및 SPT-NH2는 100 μM 농도에서HIV-1 감염을 효율적으로 억제하였다. 표 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상청액에서 캡시드 단백질 p24이 양에 의해 측정되는 것 처럼 바이러스의 거의 100% 감소율은 소 펩티드 RQG-NH2, ALG-NH2및 SLG-NH2를 이용하여 얻었다. 표 7에 나타낸 p24의 감소율은 상기 6에 대해 기술한 바와 같이 계산하였다. GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, 및 SPT-NH2는 100 μM에서 HIV-1 감염을 억제 또는 예방하는데 덜 효과적이었지만, 이는 상기 트리펩티드가 더 높은 농도에서 더 효과적임을 의미하는 것이다. 표 2 내지 7 및 도 1에 나타낸 실험 1 내지 6의 결과로 부터 확인할 수 있는 바와 같이, 바이러스 캡시드 단백질의 서열에 상응하는 소 펩티드는 광범위한 농도에서 효과적인 항바이러스제였다.
소 펩티드-매개된 바이러스 억제를 더 잘 이해하기 위해, DNA 합성, RNA 합성 및 단백질 발현에 대한 몇몇 연구를 수행하였다. 이하, 이들 실험을 기술한다.
소 펩티드는 DNA 합성, RNA 합성 및 단백질 발현을 수반하는 단계에서 바이러스 감염을 억제한다.
프로바이러스 DNA 및 바이러스 RNA 합성을 연구하기 위해, 소 펩티드의 존재하에서 배양된 HIV-1 감염된 H-9 세포에서 유래한 DNA 및 RNA는 여러가지 시점(0 내지 48 시간)에서 제조하였다. 서던 블롯 분석 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, HIV-1 DNA는 GPG-NH2의 존재하에서 합성하였으며, 프로바이러스 DNA의 양은 초기 24 시간중 소 펩티드의 여러가지 농도(0-2,000 μM)에서 거의 동일하였다. 이들 결과는 GPG-NH2와 같은 소 펩티드가 HIV-1 진입 및 DNA 합성에 대한 억제 효과를보유하지 않는 것을 입증시켜주는 것임과 동시에 소 펩티드가 HIV-1 역전사 효소 활성을 억제하지 않는 것을 입증시켜 주었다.
노던 블롯 분석에 의해, 3개의 RNA 밴드(9.2, 4.3, 2.0 kb)는 감염 24 내지 48 시간에 검출하였다. 상기 9.2 kb RNA는 게놈 RNA 및 gag와 pol 유전자에 대한 mRNA로서 작용하였다. 4.3 kb의 단일 스플라이싱된 RNA는 적어도 env 유전자 및 조절 유전자에 대해 암호화된 다중 스플라이싱된 2 kb RNA를 의미하였다. 20 μM의 GPG-NH2는 감염후 48시간까지 이들 RNA의 발현에 대한 억제 효과를 보유하지 않았다. 200 μM 및 2000 μM에서, HIV-1 RNA의 감소는 감염후 48 시간에 관찰되었는데, 이는 아마도 두번째 복제 사이클의 억제를 반영하는 것일 것이다. 이들 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 소 펩티드는 전사 단계 뿐만 아니라 전사체의 스플라이싱 후에도 HIV-1 복제를 억제하지않았다. HIV-1이 소 펩티드의 존재하에서 단백질을 적절히 발현하는가를 결정하기 위해 고안된 실험에서, 단백질 발현 또는 개질에 대한 현저한 효과는 관찰되지 않았다. 그러나, 한 실험에서, 폴리아크릴아미드 겔 상에서 gp160/gp120의 비이상적인 이동이 관찰되었다. GPG-NH2의 존재(20 μM 이상) 하에서, gp160 및/또는 gp 120은 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분자량이 120,000 Da에 약간 못미치는 위치로 전기영동되는 것이 관찰되었다. 이 결과는 반복되지 않았으며, gag 단백질 p17 또는 p24의 이동에서의 변화는 관찰되지 않았다. GPG-NH2의 존재 하에서 바이러스 단백질의 글리코실화를 분석하기 위한 연구 결과, N- 또는 O-결합된 글리코실화에 대한 효과는 없었다. 또한, 재조합(백시니아 바이러스 내에서)에 의해 생성된 gp160에 대한 글리코실화는 GPG-NH2에 의해 영향받지 않았다. 또한, GPG-NH2는 HIV-1 특이성 프로테아제의 활성에 영향을 미치지않는 거으로 확인되었다.
상기 실험에서, 소 펩티드는 HIV 발현 사이클의 후기 단계에서 HIV 감염성을 방해하였다. GPG-NH2는 DNA 합성, RNA 합성, 단백질 합성 및 단백질 글리코실화를 방해할 수 없음이 입증되었다. 후술하는 내용에서, 소 펩티드, 예를 들어 GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2및 STP-NH2가 복제 사이클의 후기 단계에서 바이러스 감염을 억제하는 추가 증거가 기술되며, 광의로는 바이러스 감염, 예를 들어 HIV 또는 SIV 감염을 억제할 수 있는 능력에 대해 다른 소 펩티드 및 이의 유도체를 스크리닝하는데 사용할 수 있는 방법이 제공된다. 따라서, 후술하는 내용은 HIV-1 감염된 세포를 소 펩티드의 존재 또는 부재하에서 항온처리하는 몇몇 전자 현미경 실험이다.
소 펩티드는 뉴클레오캡시드의 어셈블리를 방해한다.
일단 소 펩티드 GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2및 STP-NH2가 HIV 감염을 억제하는 것을 발견하였기 때문에, 전자 현미경을 이용하여 소 펩티드와 함꼐 항온처리한 HIV 감염된 세포를 추가로 분석하였다(참조: 도 2 내지 4). 도 4에 도시한 바와 같이, 전자 현미경 분석 결과, GPG-NH2와의 접촉이 적합한 바이러스 뉴클레오캡시드 형성을 방해함을 확인하였다.
이 실험에서, HUT78 세포는 37℃에서 1 시간 동안 300 TCID50으로 HIV-1 SF-2 바이러스를 이용하여 감염시켰다. 이어서, 감염된 세포는 실시예 2에 기술한 바와 같이, 3회 세척하고, 펠릿화하였다. 그후, 상기 세포는 10% FBS, 항생제(100 u/ml) 및 폴리브렌(3.2 ㎍/ml)으로 보충된 RPMI 배양 배지내에 재현탁하였다. 이어서, GPG-NH2는 감염수 3일, 5일 또는 7일에 1 μM 또는 10 μM의 농도로 세포 배야액에 첨가하였다. 대조용 샘플은 0.5 μM 리토나비르(프로테아제 억제제)를 첨가하였다.
세포는, 세포가 통상적인 방법에 의해 2.5% 글루타르알데히드내에 고정되는 시점인 14일까지 배양하였다. 이어서, 고정된 세포는 1% OsO4내에 후고정하고, 에폭시 수지내에 매립하고, 블록은 중합하였다. 바이러스 감염된 세포의 에폰 절편은 약 60 내지 80 nm 두께로 제조하여 뉴크레오캡시드의 폭을 수용하도록 하였다. 상기 절편은 1.0% 우라닐 아세테이트로 염색한 그리드에 거치시키고, 80 kV의 상승 전압에서 제이스 CEM 902 현미경으로 분석하였다. 현미경은 분광광도계를 장착하여 화질을 개선시켰으며, 액체 질소 냉각 트랩을 이용하여 빔 손상을 감소시켰다. EO용 및 GPG-NH2항온처리된 세포를 보유하는 그리드는 며몇 검맹 연구에서 조사하였다.
미처리된 HIV 입자의 전자 현미경 분석 결과, 특징적인 원추형 뉴클레오캡시드 및 상기 뉴클레오캡시드의 길이를 연장시키는 밀폐된 균일하게 염색된 RNA가 확인되었다(참조: 도 2). 대조적으로, 도 3은 바이러스 프로테아제 억제제 리토나비르의 존재하에서 생성된 몇몇 HIV-1 입자를 나타내는 2장의 전자 현미경 사진을 나타내고 있다. 리토나비르로 처리한 감염된 세포는 인식할 수 있는 뉴클레오캡시드를 보유하지 않는 형성상태가 불량한 구조를 나타냈는데, 이는 예상한 일이었다(도 3). 도 4는 GPG-NH2로 처리한 HIV-1 입자를 보유하는 세포가 리토나비르-처리한 입자와는 구별되는 인식할 수 있는 캡시드 구조를 보유하는 HIV-1 입자를 나타냈다. 구체적으로, 몇몇 트리펩티드-처리한 바이러스 입자에서, 원추형 캡시드 구조는 상대적으로 손상되지않은 것으로 나타났으나, RNA는 캡시드 외부 또는 캡시드의 상부(넓은 말단)의 볼형 구조 내에 축적되었다. 또한, 몇몇 캡시드는 정상적인 뉴클레오캡시드와 유사한 형태를 거의 보유하지 않거나 보유하지 않는 기형 구조를 보유하는 것으로 확인되었으며, RNA는 한 말단에서 구조의 외부 또는 구조의 내부에서 확인되었다. 이들 연구로부터, 소 펩티드는 뉴클레오캡시드의 적합한 형성을 방해하며, 이러한 캡시드 발생의 억제는 프로테아제 억제제인 리토나비르의 작용과는 구별되는 단계에서 일어난다는 것을 확인하였다.
GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2및 STP-NH2와 같은 아미드 형태의 트리펩티드가 캡시드 에셈블리를 방해한다는 추가 증거는 표적 물질로서 p24를 이용하는 결합 분석을 수행하는 경우에 확인되었다. p24 결합 분석에 대한 상세한 내용은 후술한다.
소 펩티드는 주 캡시드 단백질(p24)에 결합한다.
실험을 수행하여 소 펩티드가 성숙 캡시드 단백질(CA) 또는 p24와 상호작용함으로써 뉴클레오캡시드 형성을 방해할 수 있는 능력을 보유하는지 여부를 직접 연구하였다. 이 실험에서, p24 결합 분석은 방사능 표지된 GPG-NH2가 p24에 결합할 수 있는 능력을 평가함으로써 수행하였다.
투석에 기초한 결합 분석법은 공극 크기가 10 kD 미만인 투석막(슬라이드-A-라이저, 피어스)을 이용하여 수행하였다. 재조합 단백질 p24 및 gp 120(NCIB의 AIDS 프로그램으로부터 기증받음) 및 BSA(시그마)의 10 μM 저장용액 50 ㎕는 별도의 투석막 내에 투입하고, 단백질은 150 mM NaCl 및 50 mM 트리스-HCl(pH 7.4 완충액) 및 27.5 M14C-GPG-NH2(아메르샴 리미티드, 영국)로 이루어딘 용액 500 ml에 대하 4℃에서 2 시간 동안 투석하였다. 이어서, 투석된 p24, gp120 및 BSA의 10 또는 5 ㎕ 분취액을 제거하고, 섬광 비알 내에서 레디세이프(베크만) 3 ml와 혼합하였다. 이어서,14C는 섬광계수법으로 검출하였다.
표 8에서는, 대표적인 투석 실험으로부터 얻은 결과를 제공한다. 현저하게, p24와 GPG-NH2와의 회합은 투석 평형시 관찰되었다. p24와 회합된 방사성 GPG-NH2의 양은 완충액 내에 존재하는 양 보다 7.5배 많았다. 대조적으로, 투석 완충액내에 존재하는 양에 비해 방사성 GPG-NH2의 인식할 수 있는 양은 gp120 또는 BSA와 회합하지 않았다. 이들 결과로부터 소 펩티드, 예를 들어 GPG-NH2가 p24에 결합하며, 이 상호작용을 통해 적합한 뉴클레오캡시드 형성을 방해함을 확인할 수 있었다.
샘플 투석 완충액 p24 gp120 BSA
μCi/ml 1.816 13.712 1.745 1.674
완충 비율 1.000 7.551 0.961 0.922
후술하는 내용에서, 소 펩티드, 예를 들어 GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2및 STP-NH2는 AZT 또는 리토나비르가 이들 바이러스를 억제하는 방식과는 상이한 메카니즘에 의해 HIV 및 SIV 감염을 억제한다는 추가 증거가 제공된다.
소 펩티드는 AZT 또는 리토나비르에 대해 내성인 HIV-1 균주를 억제한다.
뉴클레오시드 유사체 AZT 또는 프로테아제 억제제 리토나비르에 대해 내성이 있는 HIV-1 균주를 억제하는 소 펩티드의 능력을 평가하였다. HIV-1 내성 분리주는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 내에서 배양하였으며, 바이러스 저장 용액으로서 상청액을 수집하였다. TCID50의 적정(50% 조직 배양 감염량)은 PBMC에 대해 수행하였으며, 역가는 리드 및 무엔치 식에 따라 계산하였다. 400,000 PBMC는 이들 바이러스(IV-1 SF162는 대조용으로 사용함) 25 TCID50으로 감염시켰는데, 37℃에서 1 시간 동안 흡착시키고, 3회 세척하였다. 상기 세포는 약물은 포함하지 않고, GPG-NH2(100 μM), AZT(5 μM) 또는 리토나비르(0.1 μM)를 함유하는 배양 배지 내에 재현탁시키고, 37℃, CO2및 습윤 조건하에서 항온처리하였다. 배양 배지는 4일마다 교환하였으며, 상청액 내의 IV-1 p24 항원 단백질은 ELISA로 모니터링하였다(표9).
표 9에 도시한 바와 같이, GPG-NH2는 AZT 또는 리토나비르 내성 HIV 균주에 대해 강력한 항바이러스 효과를 보유하였다. 본 실험의 결과는 상기 제시된 자료를 입증하였으며, 소 펩티드가 AZT 및 리토나비르와는 상이한 단계에서 HIV 복제를 억제함을 입증하였다. 또한, HIV의 "거리 균주(street strains)"의 치료는 본원에 참고 인용한 미국 특허 제5,627,035호(Vahlne 등)에 개시된 바와 같이 GPG-NH2를 이용하여 수행하였다. 또한, 이들은 HIV 바이러스 단백질의 서열로부터 유도되었기 때문에, 상기 펩티드 GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2및 SPT-NH2는 또한 AZT 및 리토나비르 내성 HIV 감염 뿐만 아니라 HIV의 거리 균주의 치료에도 유용하다.
타입 번호 대조용(%) GPG100 μM(감소율(%)) AZT 5 μM(감소율(%)) 리토b0.1μM(감소율(%))
저 AZT p7261 130000*(0) < 500(100%) < 500(100%) nt
중 AZT p7163 107000(0) < 500(100%) 22200(79%) nt
고 AZT p7227 114000(0) < 500(100%) 68000(40%) nt
저 PI p7300 146000(0) < 500(100%) nta 64000(56%)
고 PI p7141 114000(0) < 500(100%) nt 98000(14%)
* HIV-1 p24 값은 pg/ml로 나타냈으며, 감염후 14일에 수행한 2회의 실험의 평균값이다.
a: 테스트하지 않음
b: 리토나비르
저 AZT : AZT에 대한 낮은 내성으로 분리함
중 AZT : AZT에 대한 중간 내성으로 분리함
고 AZT : AZT에 대한 높은 내성으로 분리함
저 PI : 프로테아제 억제제에 대한 낮은 내성으로 분리함
고 PI : 프로테아제 억제제에 대한 높은 내성으로 분리함
상기 제시한 자료의 추가 지지에서, V3 루프에서 GPG-모티프가 결핍된 HIV-1 돌연변이주에 대한 몇몇 HIV-1 감염성 실험을 수행하였다. 후술하는 이들 실험을 통해 확립된 바와 같이, GPG-NH2-매개된 HIV-1 억제는 V3 루프와 무관한 방식으로 일어났다. HIV-1 env 당단백질 gp120의 V3 루프는 바아러스 복제에 연루될 수 있는 상기 루프의 끝에서 보조된 GPG 서열을 함유하였다. V3 루프 상호작용을 교란시키므로써 GPG-NH2가 HIV-1 감염을 억제하는지 여부를 결정하기 위해, V3 루프 HIV-1 돌연변이 프로바이러스를 구성하였다. GPG 도메인이 결여된 돌연변이 프로바이러스는 감염성 분석에서 세포를 감염시킬 수 있는 능력에 대해 테스트하였으며, 면역세포화학 및 전자 현미경으로 분석하였다. 본 실시예는 이하 돌연변이 프로바이러스의 구성, HIV-1 감염성에 대한 분석, 면역세포화학 및 전자 현미경에 의한 돌연변이 바이러스 입자의 구조 결정 및 GPG-NH2가 돌연변이 바이러스 입자에 의해 감염을 억제함을 기술한다.
실시예 3
감염성 클론 pBRu-2에 기초한 GPG-결실된 프로바이러스는 통상적인 분자생물학 기법을 이용하여 구성하였다. 이. 콜리 DH5α및 NM522 mutS를 이용하여 서브클로닝, 돌연변이유발 및 플라스미드 DNA의 증폭을 수행하였다. puc18 플라스미드는 서브클로닝을 위한 벡터로 사용하였으며, 전장 복제가능 클론인 HIV-1/Bru(LAV, LAI)를 함유하는 HIV-1 프로바이러스 클론 pBRu-2를 이용하여 돌연변이 바이러스를 생성하였다.
env 유전자를 암호화하는 pBRu-2에서 유래한 2.7-kb SalI-to-BamHI 단편은 puc18 벡터의 SalI 및 BamHI 위치 내로 서브클로닝하였다. GPG 결실은 U.S.E. 돌연변이유발 키트(파마시아)를 이용하여 위치 지정된 돌연변이유발에 의해 수행하였다. 2개의 올리고뉴클레오티드가 필요하였다. 돌연변이 올리고뉴클레오티드는 5' 인산화된 CGT ATC CAG AGG AGA GCA TTT GTT ACA ATA GG-3'(스웨덴 스톡홀롬에 소재하는 스칸디나비안 진 신테시스 아베에서 시판됨) 이었다. 선택성 올리고뉴클레오티드는 5' 인산화된 GTG CCA CCT GTC GAC TAA GAA ACC AT-3'이었으며, puc18 벡터 내의 유일한 제한 위치인 AatII가 제거되도록 구성하였다. 따라서, 야생형 DNA는 상응하는 엔도뉴클레아제 AatII를 이용하는 분해에 의해 야생형 DNA 및 돌연변이 DNA의 혼합 푸울로부터 선택적으로 제거하였다. 돌연변이 유발 반응 생성물은 이. 콜리 내로 형질전환하여 플라스미드 DNA를 증폭시켰다. 돌연변이는 자동화 레이져 형광 ALF(상표명) DNA 서열결정기(파마시아)를 이용하는 DNA의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 서열결정에 의해 입증하였다. GPG를 암호화하는 올리고뉴클레오티드로부터결실된 SalI-BamHI 단편은 pBRu-2 내로 클로닝하여 프로바이러스 플라스미드를 생성하였다. 몇몇 박테리아 콜로니로부터 유래한 돌연변이 DNA는 퀴아젠 플라스미드 키드를 이용하여 증폭하고, 정제하였다. 이들중 두개, 즉 mp8 및 mp10 DNA는 세포내로 형질감염하였다.
야생형 DNA 및 돌연변이 DNA, mp8 및 mp10은 DEAE-덱스트란 법을 이용하여 Hela, HUT78 또는 MT-2 세포 내로 형질감염하였다[참조: Palker 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1932-1936 (1988)]. 간략히 설명하면, 106세포는 형질감염 24 시간 전에 제조하였다. 이어서, 배지를 제거하고, 세포는 미리 가온한 인산염 완충 염수(PBS)로 일회 세척하고, TBS-D(트리스 완충 염수-0.1% 덱스트로즈)로 일회 세척하였다. 약 0.5 ㎍ DNA는 TBS-D/DEAE-덱스트란과 혼합하고, 세포에 첨가한 후 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 이어서, 상기 용액을 제거하고, 세포는 TBS-S로 1회 및 PBS로 1회 세척하였다. 세포는 미리 가온한 배지(10% 혈청 및 5 ㎍ 클로로퀸 디포스페이트로 보충됨) 5 ml와 혼합하고, 37℃에서 1 시간 동안 항온처리한 후, 무혈청 배지로 3회 세척하였다. 최종적으로, 상기 세포는 배양 배지 10 ml 내에서 유지하고, 37℃에서 4일 동안 항온처리하였다.
바이러스-함유 상청액을 수집하고, 공극 크기가 0.45 ㎍인 필터를 통해 여과하여 임의 세포를 제거하고, 분취하고, 바이러스 저장 용액으로 -70℃에 유지하였다. 바이러스 적정은 바이러스의 일련의 희석액을 이용하여 MT-2 세포를 감염시킴으로써 수행하였다. 바이러스 상청액의 각각의 5배 희석액으로부터 얻은 100 ㎕는200,000 MT 2 세포를 위한 접종물로 사용하였다. 16시간 흡착한 후, 상기 세포는 5회 세척하고, 24웰 평판(코스타 코포레이션)내의 배양 배지 1.5 ml내에 재현탁시켰다. 배지는 감염후 4일, 7일, 11일에 교환하였으며, 상청액내 p24 생성은 14일째에 수행하였다. 50% 조질 배양 감열양(TCID50)은 리드-무엔치식으로 계산하였다[참조: Reed 및 Muench, Am. J. Hygiene 27: 493-497 (1938)].
CD+ T-세포주 MT-2, C91-PL, C8166, CEM, HUT78, H9, 주르카트 및 몰트-3, 단핵세포주 U937 및 THP-1을 증식시키고, 10%(v/v) 열 불활성화된 태아 소 혈청(지브코), 페니실린(100 u/ml) 및 스트렙토마이신(100 u/ml)으로 보충된 RPMI1640 배지(지브코) 내에 유지하였다. Hela 세포는 2% FBS, 0.8% 덱스트로즈 및 항생제로 보충된 행크의 염을 보유하는 배지 199 내에서 성장시켰다.
말초혈액단핵세포(PBMC)는 피콜-하이파크 밀도구배 원심분리로 정제하고, 감염시키기 이전에 상기하 바와 같이, RPMI 1640 내에서 3일 동안 피토헤마글루티닌(KEBO 랩)으로 자극하였다. 수상돌기 세포(DC)는 문헌[참조: Rormani 등, J. Exp. Med. 180: 83-93 (1994)]에 기술된 바와 같이, 플라스틱에 대한 부착에 의해 단핵 분획으로부터 정제된 혈액 단핵구로부터 생성하였다. 간략히 설명하면, 혈액 단핵 세포는 상기한 바와 같이 정제하고, 부착은 RPMI 배지 내에서 2시간 동안 조직 배양 플라스크에 대해 수행하였고, 그후, 비부착된 세포는 PBS로 세척하여 제거하였다. 부착 세포는 GM-CSF(25 u/ml) 및 IL-4(4.5 u/ml)와 함께 배지 내에서 7일 동안 배양하고, 바이러스로 감염시켰다.
감염은 세포주 MT-2, C91-PL, C8166, CEM, HUT78, H9, 주르카트, 몰트-3,U937, THP-1, PBMC 및 수상돌기 세포(DC)에 대해 수행하였다. CD4+ 세포주에서, 200,000 세포는 100 TCID50에서 16 시간 동안 야생형 또는 돌연변이 바이러스와 함께 37℃에서 배양한 후, 5회 세척하고, 10% FBS, 항생제 및 폴리브렌(시그마, 2 ㎍/ml)으로 보충된 신선한 RPMI 배지 1.5 ml 내에 재현탁시키고, 37℃, 5% CO2및 습윤 조건하의 24-웰 평판에서 항온처리하였다. PBMC에서, 500,000 세포를 사용하였으며, 프로루킨(유로세투스, 150 u/ml), 히드로코티손(시그마, 5 ㎍/ml) 및 폴리브렌(시그마, 2 ㎍/ml)으로 보충된 RPMI 배지에서 배양하였다. DC에서, 800,000 세포는 각각 1시간, 16시간 및 48시간 동안 바이러스에 노출시킨후, PBS 내에서 3회 세척하고, 37℃에서 5분 동안 0.05% 트립신으로 부드럽게 처리하여 임의의 표면 결합된 바이러스를 제거하였다[참조: Grannelli-Piperno 등, J. Exp. Med. 184: 2433-2438 (1996)]. 대조용으로서, PBMC는 동일한 방식으로 mp8에 노출시켰다. 세포는 세척하고, 수집하고, 용해시키고, 페놀/클로로포름 추출에 의해 DNA를 분리한 후, LTR 서열을 검출하는 세미-분취 PCR을 수행하였다. 상기 DNA에 대해 10배의 일련의 희석액을 제조하였으며, LTR PCR은 상기한 바와같이 3개 프라이머 "네스트된(nested)" 구조를 이용하여 40 사이클을 수행하였다[참조: Hwang 등, Science 253: 71-74 (1991)]. DC-PBMC 동시 배양 및 DC-MT-2 동시 배양 실험에서, 250,000 DC는 16 시간 동안 바이러스에 노출시킨후, p24가 검출되지않을 때까지(5 pg/ml) 5회 세척하였다. 이어서, CD4에 대한 HIV-1 결합 에피토프를 파괴하는 0.05% 트립신으로 부드럽게 처리하여 임의의 세포-결합된 바이러스를 제거하였다.세척후, 세포는 200,000 PBMC 또는 100,000 MT-2 세포와 혼합된 RPMI 배양 배지 내에 재현탁시켰다.
감염 실험에서, 배양 배지는 감염후 4일, 7일, 11일, 14일 및 17일에 교환하였으며, 바이러스 성장은 HIV-1 p24 ELISA 키트(미국 노스 시카고 소재의 애보트 레보러토리즈)를 이용하여 p24 수준에 의해 측정하였다. p24 분석법의 ELISA 정량을 이용하여 각각의 바이러스 샘플에서 p24의 수준을 정량하였으며, 이 분석법의 선형 투여량 응답 범위는 1 ml 당 20 pg 내지 640 pg이었다. 모든 바이러스 샘플은 다중 희석으로 분석하였으며, p24 양은 회귀선을 이용하여 측정하였다. DNA는 감염후 17일 동안 배양된 세포로부터 분리하였으며, V3 영역의 직접적인 서열 결정은 돌연변이를 확인하기 위해 이들 DNA에 대해 수행하였다.
또한, 면역세포화학을 감염된 및 감염되지않은 MT-2 세포에 대해 수행하였는데, 문헌[참조: Kowalski 등, Science 237: 1351-1355 (1987)]에 기술된 바와 같이 APAAP(알칼리성 포스파타제 항-알칼리성 포스파타제 면역복합체) 샌드위치 기법에 의해 수행하였다. 세포는 PBS 내에서 2회 세척하였으며, 아세톤을 이용하여 15분 동안 슬라이드 상에 고정하였다. 이어서, 상기 세포는 연속적으로 일차 항체 마우스 항-HIV-1 p24, 이차 항체 토끼 항-마우스 면역글로불린 및 마우스 APAAP 모노클로날 항체(DAKO)와 함께 각각 습식 챔버 내에서 37℃에서 30분 동안 항온처리하고, PBS 내에서 5분 동안 세척하였다. 색생성 기질을 첨가하고 실온에서 20분 동안 항온처리한 후, 슬라이드는 물로 세척하고, 글리세롤에 거치시키고, 현미경(배율 100배)으로 관찰하였다. 모노클로날 항체(Mabs) 마우스 항-HIV-1 p24(DAKO, 1:20 희석함), 토끼 항-마우스 면역글로불린(1:25 희석함)) 및 송아지 장 알칼리성 포스파타제 및 송아지 장 알칼리성 포스파타제(APAAP, 1:20 희석함)에 대한 Mab의 마우스 면역복합체를 이용하여 면역세포화학을 수행하였다.
또한, 감염된 세포를 전자 현미경으로 관찰하였다. 새롭게 감염된 세포는 7일에 2.5% 글루타르알데히드로 고정하고, 1% OSO4 내에 후고정하였다. 세포는 탈수시키고, 에폭시 수지에 매립하고, 1% 우라닐 아세티이트로 염색하였다. 바이러스 감염된 세포의 에폰 절편의 두께는 60 내지 80 nm였다. 시험편은 80 kV의 상승 전압에서 제이스 CEM 902 현미경으로 분석하였다. 현미경은 분광광도계를 장착하여 화질을 개선시켰으며, 액체 질소 냉각 트랩을 이용하여 빔 손상을 감소시켰다.
다른 일련의 실험에서, GPG-NH2가 V3 루프 억제와는 다른 메카니즘에 의해 HIV-1 감염을 억제하는 추가 증거를 얻었다. 따라서, GPG-NH2가 MT-2 세포 내에서 야생형 및 V3-루프 결실 돌연변이(GPG 도메인)의 감염성을 억제할 수 있는 능력을 측정하였다. 이들 실험에서, 약 200,000 NT-2 세포는 HIV-1Bru야생형 및 GPG-결실된 돌연변이 mp8 및 mp10을 이용하여 TCID50으로 감염시켜 GPG-NH2의 억제 효과를 테스트하였다. MT-2 세포는 20 μM 및 100 μM 농도의 GPG-NH2존재 또는 부재하에 10%(v/v) 열-변성된 태아 소 혈청(FBS, 지브코), 페니실린(100 μ/ml), 스트렙토마이신(100 μ/ml) 및 폴리브렌(시그마, 2 ㎍/ml)으로 보충된 RPMI 1640 배지 1 ml 내에 재현탁시켰다. 그후, 바이러스는 25 TCID50으로 부피 20 내지 30 ㎕ 첨가하였다. 세포는 37℃에서 16 시간 동안 항온처리한 후, 170xg에서 7분 동안 원심분리하여 느슨하게 펠릿화하였다. 이어서, 상기 세포는 상기한 바와 같이 170xg에서 7분 동안 세포 침강하여 실온에서 펩티드를 보유하지 않은 배지 내에서 3회 세척하였다. 최종 세척후, 세포는 24-웰 평판(코스타 코포레이션) 내에서 RPMI 배양 배지내에 재현탁시키고, 37℃, 5% CO2및 습윤 조건하에서 유지하였다. 감염후 4일, 7일, 11일 및 14일에 배지를 교환할때 배양 상청액을 수집하였다. 바이러스의 복제를 모니터링하기 위해, 7일 및 14일에 얻은 배양 상청액내 HIV-1 p24 항원 단백질은 선형 투여량 응답 범위가 1 ml 당 p24의 20 pg 내지 640 pg인 ELISA 키트(애보트 래보러토리즈)를 이용하여 분석하였으며, p24 양은 회귀선을 이용하여 측정하였다.
본 실시예에 기술한 실험 결과로부터 확인한 바로는, 이하 상술하는 바와 같이, GPG-NH2는 V3 루프와는 무관한 방식으로 HIV-1 감염을 억제하였다.
소 펩티드는 V3 루프와는 무관한 방식으로 HIV-1 감염을 억제한다.
V3 루프에서 GPG-결실이 바이러스 생성에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, 프로바이러스 플라스미드 DNA(야생형 및 돌연변이형 둘 다)는 CD4 음성 세포주 Hela 및 CD4 양성 세포주 MT-2 및 HUT78 내로 형질감염하였다. 배양 상청액은 매일 수집하고, 바이러스 생성은 p24 레벨을 측정함으로써 모니터링하였다. 유사한 성장 패턴이 야생형 바이러스(WT) 및 Hela 형질감염으로부터 유래한 돌연변이에서 6일 이내에 관찰되었다. 4일까지는 p24 레벨이 증가한후, 증가 상태를 유지하였다. 따라서, 돌연변이 및 야생형 프로바이러스 DNA는 이들 세포내에서 동일하게 잘 발현되었다. 유사한 결과가 HUT78에서도 얻어졌는데, 형질전환체 및 합포체는 이들 형질전환된 HUT78 세포내에서 관찰되었다. 그러나, MT-2로부터의 p24 생성 패턴은 Hela 및 HUT78 세포에서 관찰되는 것과는 전혀 달랐다. 돌연변이 바이러스 프로바이러스 DNA로 형질감염된 세포의 p24 생성이 야생형 바이러스 프로바이러스 DNA로 형질감염된 것 보다 낮았음에도 불구하고, p24 생성 수준은 4일 넘게 계속 증가하였다. 형질감염후 6일째에, 야생형은 1380 ng/ml의 p24를 생성하였지만, mp8 및 mp10의 p24 생성은 각각 15.8 ng/ml 및 13.7 ng/ml 였다. 이들 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, GPG-결실된 돌연변이 후대 바이러스가 생성되었으며, 명백하게 야생형 후대 만큼 효율적인 것은 아님에도 불구하고, 비형질감염된 CD4+ MT-2 세포를 감염시킬 수 있었다. 이들 형질감염된 세포로부터 얻은 DNA는 서열결정하였으며, GPG 결실은 mp8 및 mp10 후대 둘 다에서 확인되었다.
다음으로, 돌연변이 분자 클론이 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 생성할 수 있는 능력을 추가로 분석하였다. Hela 세포 및 MT-2 세포는 프로바이러스 DNA로 형질감염시켰으며, 형질감염하고 4일이 경과된 후, 배양 상청액을 수집하고, 여과하고, p24 수준을 분석하고, 분취액은 바이러스 저장 용액으로서 -70℃에서 냉동시켰다. 바이러스 적정(TCID50)은 MT-2 세포에 대해 수행하였다. MT-2 형질감염체로부터 얻은 상청액은 동량의 p24를 함유하도록 조정하였으며, 야생형 바이러스는 83,300 TCID50/ml를 산출한 반면, 돌연변이 mp8 및 mp10은 각각 16,700 및 25,000 TCID50/ml을 산출하였다. 이 수치는 야생형 바이러스를 통해 얻어진 수치의 5배 미만이었다. Hela 형질감염체 상청액의 더 낮은 p24 생성과 상응하게, 이들이 산출한 역가는 매우 낮았는데, 야생형 및 돌연변이 각각에 대해 70 TCID50/ml 및 10 TCID50/ml였다. 따라서, 돌연변이 바이러스가 여전히 감염성임에도 불구하고, V3내 GPG 모티프의 결실은 이들 세포에서 바이러스 독성을 감소시켰다. 이는 MT-2 세포의 감염에 의해 추가로 테스트하였으며, 후대 바이러스의 생성을 모니터하였다. 이어서, Hela 및 MT-2 형질감염 둘 다로부터 유래한 바이러스 저장 용액을 이용하여 MT-2 세포를 감염시켰다(100 TCID50야생형 또는 MT-2 형질감염체 상청액으로부터 유래한 돌연변이 바이러스 또는 Hela 형질감염체 저장용액으로부터 유래한 바이러스 5 TCID50). 상기 세포들은 바이러스와 함께 16 시간 동안 항온처리하고, 세척하였다. 그후, 상기 세포들은 재현탁하고, 37℃에서 항온처리하였다. 바이러스 복제는 p24 수준 및 세포변성 효과를 측정함으로써 모니터링하였다. MT-2 형질감염체에서 유래한 바이러스, 야생형(WT) 바이러스 및 돌연변이 바이러스(mp8 및 mp10)는 모두 p24 생성에 의한 바이러스 복제를 나타냈다. 야생형은 감염후 11일에 p24 수준이 2,150 ng/ml까지 다다른 반면, 돌연변이 바이러스는 약 4일 지체됨을 나타냈으며, 감염후 14일에 p24 수준이 mp8의 경우에는 1580 ng/ml였으며, mp10의 경우에는 1760 ng/ml 였다. Hela 형질감염체로부터 유래한 바이러스(TCID50)를 이용하는 MT-2 세포의 감염은 WT 및 돌연변이 둘 다에서 p24를 생성하였는데, 성장 동력학은 바이러스를 생성하는 MT-2 세포를 이용하여 얻어진 것과 유사하였다. DNA는 감염된 모든 세포로부터 분리하였으며, 돌연변이는 V3 서열결정에 의해 입증하였는데, 이는 돌연변이의 성장이 야생형 서열의 역전이나 픽업에 의한 것이 아님을 의미하는 것이다.
또한, 합포체 형성은 WT 및 돌연변이 둘 다로 감염된 MT-2 세포에서 관찰되었다. 세포 배양액은 감염 7일후에 고정하였으며, APAAP 샌드위치 기법을 이용하는 면역세포화학을 위해 사용하였다. 감염된 세포는 면역염색하여 적색을 나타내도록 하였다. 야생형 바이러스가 돌연변이(감염후 6일) 보다 더 일찍(감염후 4일) 합포체를 유도함에도 불구하고, 야생형 및 돌연변이 바이러스 감염된 MT-2 세포에서 관찰되었다. 전자 현미경(EM)으로 추가 확인한 결과, 돌연변이 바이러스 감염된 MT-2 세포는 HIV-1 세포를 생성하였다. 특징적인 원추형 코어를 보유하는 HIV-1 입자가 관찰되었다. 이들 자료로부터 확인할 수 있는 바와 같이, GPG-결실 돌연변이 바이러스는 MT-2 세포 내에서 감염성을 유지하였다.
GPG-NH2가 V3 루프 상호작용과는 상이한 메카니즘에 의해 바이러스 감염을 억제한다는 결정적인 증거는 MT-2 세포 내에서 야생형 및 V3-루프 결실 돌연변이(GPG 도메인)의 감염성을 억제할 수 있는 GPG-NH2의 능력을 평가하는 실험을 수행하여 얻었다. 감염후 7일 및 14일 둘 다에서, 야생형 및 돌연변이 바이러스 감염의 상당한 감소가 관찰되었다. 표 10을 참조할 것. 20 μM 및 100 μM에서, GPG-NH2는 야생형 감염 및 GPG 결실 구성물 mp8 및 mp10에 의해 매개된 감염을 효과적으로 감소시켰다. 실제로, 감염후 7일 및 100 μM GPG-NH2에서, 바이러스 감염성의 동일하게 완전한 감소가 야생형, mp8 및 mp10에서 관찰되었다. 이들 결과로부터확인할 수 있는 바와 같이, GPG-NH2는 V3 루프의 GPG 도메인가 상호작용하는 것과는 별개의 메카니즘에 의해 HIV-1 감염을 억제하였다.
7일 p24 pg/ml
대조용 GPG 20μM 감소율(%) GPG 100μM 감소율(%)
WT 33800 23900 29 3390 90
mp8 3170 2420 24 208 93
mp10 3120 1560 50 173 94
14일
WT 357000 223000 38 181000 49
mp8 148000 69100 53 7410 95
mp10 470000 51500 89 47700 90
본원에 제시된 데이타로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 개질된 카르복시 말단을 보유하는 소 펩티드는 바이러스 감염(예를 들어, HIV-1, HIV-2 및 SIV 감염)을 억제하며, p24에 결합하며, 적합한 캡시드 어셈블리를 방해한다. 상기한 많은 분석법들을 이용하여 임의의 소 펩티드, 개질된 소 펩티드, 올리고펩티드 또는 펩티드유사체가 HIV 또는 SIV 감염을 예방 또는 억제할 수 있는 능력을 확인할 수 있다. 또한, 유사한 기법을 이용하여 임의의 소 펩티드, 개질된 소 펩티드, 올리고펩티드 또는 펩티드유사체의 기타 바이러스 감염을 예방 또는 억제할 수 있는 그들의 능력을 확인할 수 있다.
몇몇 바이러스 캡시드 단백질의 서열은 공지되어 있기 때문에, 상이한 바이러스 캡시드의 적합한 어셈블리를 방해하는 아미드 형태의 소 펩티드의 디자인, 제조 및 동정은 용이한 일이다. 여러 가지 캡시드 단백질은 예컨대, 다수의 온코바이러스 및 렌티바이러스의 카르복실 말단 도메인 내에 존재하는 주 상동성 영역(MHR)이라 불리는 20개 아미노산 길이의 상동성 영역을 보유한다(도 5 참조). 도 5는HIV-1의 카르복실 말단 도메인(잔기 146-231)을 나타내고, 이 서열을 다른 바이러스, 즉 새, 마우스 및 원숭이를 감염시키는 바이러스의 캡시드 단백질 서열을 비교한다. 특히, 상기 바이러스 캡시드 단백질의 서열에서는 상당한 상동성이 발견된다. 연구자들은 카르복실 말단 도메인이 HIV-1에서 캡시드 이량체화 및 바이러스 조립에 필요함을 관찰하여 왔다(본원에 참고로 인용하는 문헌 Gamble 등, Science 278: 849 (1997)). 본 명세서에서 기술하는 분석에서 항바이러스 활성을 나타낸 소형 펩티드가 HIV-1, HIV-2 또는 SIV의 카르복실 말단 도메인의 영역에 완전히 또는 부분적으로 상응하였지만, 바이러스의 N-말단 도메인 영역은 캡시드 조립에 중요하며, 바이러스 캡시드 단백질의 N-말단 영역의 아미노산에 완전히 또는 부분적으로 상응하는 소형 펩티드의 디자인 및 합성은 본 발명의 바람직한 양태이다. 그러나, 바이러스 캡시드 단백질의 MHR 영역 및 카르복실 말단 도메인내 아미노산에 완전히 또는 부분적으로 상응하는 소형 펩티드의 사용은 본 발명의 바람직한 양태이다.
본 발명자는 3종의 상이한 바이러스의 캡시드 단백질 서열에 완전히 또는 부분적으로 상응하는 아미드형의 여러 가지 소형 펩티드가 상기 바이러스에 의한 감염을 효과적으로 저해 및/또는 예방한다는 것을 보여 주었다. 여기에 이용된 방법을 사용하여 다른 바이러스의 캡시드 단백질 서열에 완전히 또는 부분적으로 상응하는 아미드형의 추가의 소형 펩티드를 생성시킬 수 있다. 도 5에 개시된 서열의 영역에 상응하는 소형 펩티드, 올리고펩티드 및/도는 펩티드유사체를 설계하고 제조함으로써, 예컨대, HIV, SIV, RSV, HTLV-1, MMTV, MPMV 및 MMLV 감염을 저해하는 신규한 분자는 전술한 스크리닝 기법 또는 당해 분야의 숙련자에게는 자명한 상기분석의 변형법을 사용하여 신속하게 확인할 수 있다. 또한, 기타 바이러스 캡시드 단백질의 서열중 다수는 아레나바이러스, 로타바이러스, 오르비바이러스, 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 파필로마바이러스, 아데노바이러스, 허피스바이러스, 파라믹소바이러스 및 헤파드나바이러스군의 것으로서 알려져 있다. 상기 서열들에 완전히 또는 부분적으로 상응하는 몇 가지 소형 펩티드, 올리고펩티드 및/또는 펩티드 유사체를 선별하고 신속히 스크리닝하여 본원에 기술한 바이러스 감염성 분석 및/또는 전자 현미경 기법, 또는 본 명세서에 제시한 당해 분야의 숙련자에게는 자명한 상기 분석법의 변형법을 사용함으로써 바이러스 감염을 효과적으로 저해 및/또는 예방하는 것들을 확인할 수 있다.
바람직한 양태는 캡시드 조립을 방해하고 바이러스 감염을 저해하는데 사용되는 변형된 카르복시 말단을 가진 소형 펩티드(하나 이상 10개 이하의 길이)를 포함한다. HIV 또는 SIV 캡시드에서 발견되는 서열을 가진 디펩티드, 트리펩티드 및 올리고펩티드와 상응하는 펩티드 유사체를 사용하는 것이 바람직하다. 예컨대, 본 발명의 올리고펩티드는 4~10개의 아미노산을 가질 수 있고, 본 발명의 펩티드유사체는 4~10개의 아미노산과 유사한 구조를 가질 수 있다. 이들 올리고펩티드는 또한 트리펩티드 GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2, 및 SPT-NH2에서 발견되는 완전한 또는 부분적인 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 디펩티드, 트리펩티드 및 올리고펩티드와 유사한 펩티드유사체는 또한 GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2, 및 SPT-NH2에서 발견되는 서열에 상응하는 것이 바람직하다. 소형 펩티드는 카르복실기(COOH)보다는 그 카르복시 말단(CO-NH2)에서 조절기(예컨대, 아미드기)를 보유하는 것이 바람직하다. 카르복시 말단에 기타 조절기를 가진 소형 펩티드 역시 사용할 수 있으나, 바람직하게는 부착된 조절기가 동일한 전하를 가지고 아미드기와 동일하게 입체적으로 움직이는 것이 바람직하다. 일부 양태에서, 소형 펩티드의 어느 하나의 단부에 아세틸 또는 메틸기의 첨가는 소형 펩티드의 흡수를 개선하거나 엑소프로테아제 처리를 방지하거나 또는 그 둘다를 위해 바람직하다.
이하의 설명에서는 디펩티드, 트리펩티드, 10개 이하의 아미노산의 올리고펩티드와, 트리펩티드 및 10개 이하의 아미노산의 올리고펩티드와 유사한 펩티드 유사체(총괄적으로 "펩티드제"로 지칭함)를 포함하는 약학 조성물 및 생물공학적 수단을 제공하는 여러 가지 방법이 제시된다. "펩티드제"란 용어는 디펩티드, 트리펩티드 및 10개 이하의 아미노산의 올리고펩티드를 포함한다는 것을 주목하여야 한다. "펩티드제"란 예컨대, 2~10개의 아미노산의 펩티드와, 2~10개의 아미노산의 펩티드와 유사한 펩티드유사체이다. 또한, "펩티드제는 2~10개의 아미노산의 펩티드, 또는 후술하는 바와 같이 다량체 또는 다량체화제로서 제공되는 2~10개의 아미노산의 펩티드와 유사한 펩티드유사체이다.
예방제 또는 치료제에 대한 바람직한 생물공학적 수단 또는 성분은 HIV-1, HIV-2 또는 SIV와 같은 바이러스의 충분한 친화성 또는 저해가 얻어지는 방식으로또는 또는 형태로 펩티드제를 제공한다. 천연의 단량체 펩티드제(예컨대, 각각 하나의 결합 에피토프만을 보유하는 펩티드제의 개별 단위로서 나타나는 것)가 p24와 같은 캡소미어 단백질에 결합하고/하거나 캡시드 조립을 방해하고/하거나 HIV-1, HIV-2 또는 SIV 감염과 같은 바이러스 감염을 예방하기에 충분하지만, 합성 리간드 또는 다량체 리간드(예컨대, 여러 개의 결합 에피토프를 가진 펩티드제의 다수 단위로서 나타나는 것)는 p24와 같은 캡소미어 단백질에 결합하고/하거나 캡시드 조립을 방해하고/하거나 HIV-1, HIV-2 또는 SIV 감염과 같은 바이러스 감염을 예방하는 능력이 훨씬 더 뛰어날 수 있다. "다량체"란 용어는 하나의 개별 단위로서 결합된 하나 이상의 리간드, 예컨대, 여러 개의 트리펩티드, 올리고펩티드 또는 병렬로 결합된 펩티드유사 분자의 존재를 지칭하는 "다량체"란 용어와는 구별되게, 하나 이상의 리간드, 예컨대, 트리펩티드, 올리고펩티드 또는 펩티드유사체의 존재를 지칭하는 것임을 주목하여야 한다.
다량체 지지체 및 다량체화된 리간드의 제조
p24와 같은 캡소미어 단백질에 결합하고/하거나 캡시드 조립을 방해하고/하거나 HIV-1, HIV-2 또는 SIV 감염과 같은 바이러스 감염을 저해하는 다량체제(합성 또는 천연)는 트리펩티드, 올리고펩티드 또는 펩티드유사체를 거대 분자 지지체에 커플링시켜서 얻을 수 있다. 본원에 사용된 "지지체"란 용어는 담체, 수지나, 펩티드제를 부착, 고정화 또는 안정화하는데 사용되는 임의의 거대 분자 구조를 포함한다. 고체 지지체로는 반응 트레이의 오목부의 벽, 시험관, 폴리스티렌 비드, 자기 비드, 니트로셀룰로스 스트립, 막, 미세입자(예컨대, 라텍스 입자, 양(또는 다른동물)의 적혈구, 인공 세포 및 기타를 들 수 있다. 지지체란 용어는 또한 약제 제조용으로 이해될 때는 담체를 포함한다.
거대 분자 지지체는 소수성 비공유 상호작용에 의해 펩티드의 부분과 상호작용하는 소수성 표면을 가질 수 있다. 지지체의 소수성 표면은 플라스틱과 같은 중합체나, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 또는 폴리비닐과 같이 소수성 기가 연결되어 있는 임의의 다른 중합체일 수도 있다. 한편, 펩티드제는 단백질 및 올리고당/다당류를 포함하는 담체(예컨대, 셀룰로스, 전분, 글리코겐, 키토산 또는 아민화된 세파로스)에 공유결합될 수 있다. 상기 후자의 양태에서, 펩티드제 상의 반응성 기, 예컨대, 히드록시 또는 아미노기를 사용하여 담체 상의 반응성 기에 결합시켜 공유결합을 생성시킬 수 있다. 지지체는 또한 펩티드제와 상호작용하는 하전된 표면을 가질 수도 있다. 또한, 지지체는 펩티드제를 부착시키기 위해 화학적으로 활성화될 수 있는 기타 반응성 기를 가질 수 있다. 예컨대, 시아노겐 브로마이드 활성화된 매트릭스, 에폭시 활성화된 매트릭스, 티오 및 티오프로필 겔, 니트로페닐 클로로포르메이트 및 N-히드록시 숙신이미드 클로르포르메이트 연결체 및 옥시란 아크릴 지지체는 당해 분야에 공지되어 있다.
지지체는 또한 펩티드제가 담체 상의 히드록시, 카르복시 또는 아미노기 및 반응성 기를 통해 공유 연결되는 산화규소 재료(예컨대, 실리카겔, 제올라이트, 아민화된 규조토)와 같은 무기 담체를 포함할 수 있다. 또한, 일부 양태에서는, 리포좀 또는 지질 이중층(천연 또는 합성)을 지지체로서 고려하고, 펩티드제는 막 표면에 부착되거나 리포좀 공학에서의 기법으로 막내로 혼입시킨다. 한 가지 방법으로,리포좀 다량체 지지체는 펩티드제를 지질 이중층에 연결하는 제2 도메인 및 이중층의 표면에 노출되는 펩티드제를 포함한다. 연결부는 알려진 경막 도메인과 유사한 소수성 아미노산 잔기로 이루어지거나 또는 통상의 기법으로 제1 도메인에 부착되는 세라마이드를 포함할 수 있다.
체내 용도(즉, 예방용 또는 치료용)의 지지체 또는 담체는 생리학적, 비독성 및 바람직하게는 비면역 반응성이 있는 것이 바람직하다. 체내용으로 고려되는 담체로는 폴리-L-리신, 폴리-D, L-알라닌, 리포좀 및 크로모소브*(존스-맨빌 프로덕츠, 덴버 캄파니)이 있다. 리간드가 접합된 크로모소브(신소브-Pk)는 용혈성-요독증 증후군의 예방용으로 인간에게 시험되어 왔으며, 부작용을 제공하지 않는 것으로 보고되었다(Armstron 등.J. Infectious Diseases, 171:1042-1045 (1995). 일부 양태의 경우, 본 발명자는 환자 체내에서 펩티드제를 부착하는 능력을 가지는 ""노출된(naked) 담체(즉, 부착된 펩티드제가 부재함)의 투여를 고려한다. 이러한 방법으로, "전구약물" 요법은 노출된 담체를 펩티드제로부터 별개로 투여하는 방법을 고려하며, 둘다 환자의 체내에 있으면, 담체 및 펩티드제는 다량체 복합물에 조립된다.
펩티드제와 지지체 사이에 적당한 길이를 가진 λ 링커 같은 링커의 삽입 역시 고려되어 펩티드제의 보다 큰 융통성을 제공하여 지지체에 의해 제공될 수 있는 임의의 입체적 간섭을 극복한다. p24와 같은 캡소미어 단백질에의 최적 결합 및/또는 캡시드 조립의 방해 및/또는 HIV 또는 SIV 감염과 같은 바이러스 감염의 저해를 허용하는 적당한 길이의 링커의 결정은 본 발명에서 설명한 분석에 다양한 링커로펩티드제를 스크리닝함으로써 결정할 수 있다.
한 가지 유형 이상의 펩티드제를 포함하는 복합 지지체도 일 양태이다. "복합 지지체"는 담체, 수지나, p24와 같은 캡소미어 단백질에 결합하고/하거나 캡시드 조립을 방해하고/하거나 HIV 또는 SIV 감염과 같은 바이러스 감염을 저해하는 2개 이상의 상이한 펩티드제를 부착 또는 고정화하는데 사용되는 임의의 거대 분자 구조일 수 있다. 일부 양태에서는 복합 지지체의 제조에 사용하기 위해 리포좀 또는 지질 이중층(천연 또는 합성)이 고려되며, 펩티드제는 막 표면에 부착되거나 리포좀 공학에서의 기법을 사용하여 막내로 혼입된다.
상기와 같이, 펩티드제와 지지체 사이에 적당한 길이를 가진 λ 링커 같은 링커의 삽입 역시 고려되어 분자내에 보다 큰 융통성을 제공하여 일어날 수 있는 임의의 입체적 간섭을 극복한다. p24와 같은 캡소미어 단백질에의 최적 결합 및/또는 캡시드 조립의 방해 및/또는 HIV 또는 SIV 감염과 같은 바이러스 감염의 저해를 허용하는 적당한 길이의 링커의 결정은 본 발명에서 설명한 분석에서 다양한 링커로 리간드를 스크리닝함으로써 결정할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서는, 전술한 다량체 및 복합체 지지체가 다량체화된 리간드를 부착하여 각각 "다량체화된 다량체 지지체" 및 "다량체화된 복합 지지체를 생성시킬 수 있다. 다량체화된 리간드는 예컨대, 분자 생물학에서 통상적인 기법을 사용하여 두 개 이상의 펩티드제를 병렬로 커플링함으로써 얻을 수 있다. 리간드의 다량체화된 형태는 p24와 같은 캡소미어 단백질에 결합하고/하거나 캡시드 조립을 방해하고/하거나 HIV 또는 SIV 감염과 같은 바이러스 감염을 저해하는 보다양호한 능력을 가진 제제를 얻는 능력으로 인해 다수의 용도에 유용할 수 있다. 또한, 다량체화된 제제를 구성하는 개개의 도메인들 사이에 가요성 λ 링커와 같은 링커 또는 스페이서의 도입이 유용한 양태이다. 단백질 결합 도메인들 사이에 적당한 길이를 가진 λ 링커의 삽입은 예컨대, 분자내에 보다 큰 융통성을 제공할 수 있고, 입체적 간섭을 극복할 수 있다. 유사하게, 다량체화된 리간드와 지지체 사이의 링커의 삽입은 보다 큰 융통성을 제공하고, 지지체에 의해 제공되는 입체적 간섭을 제한할 수 있다. p24와 같은 캡소미어 단백질에의 최적 결합 및/또는 캡시드 조립의 방해 및/또는 HIV 또는 SIV 감염과 같은 바이러스 감염의 저해를 허용하는 적당한 길이의 링커의 결정은 본 발명에서 설명한 분석에서 다양한 링커로 리간드를 스크리닝함으로써 결정할 수 있다.
바람직한 양태에서, 전술한 다양한 유형의 지지체가 GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2, 및 SPT-NH2를 사용하여 생성된다. 다량체 지지체, 복합 지지체, 다량체화된 다량체 지지체 또는 다량체화된 복합 지지체는 총좔적으로 "지지체에 결합된 제제"로 지칭되는 것으로서 트리펩티드 GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2, 및 SPT-NH2를 사용하여 제조하는 것이 바람직하다.
이하의 논의에서는, 치료적 및/또는 예방적 용도를 가진 본 발명의 몇 가지 양태를 기술한다.
치료적 및 예방적 용도
본원에 기술하는 단량체 및 다량체 펩티드제는 HIV 또는 SIV 감염과 같은 바이러스 감염을 피하기 위한 예방 조치로서 또는 HIV 또는 SIV와 같은 바이러스로 이미 감염된 환자를 치료하는 치료제로서 환자의 치료에 적합하다. 예방적 용도로는 누구나 펩티드로 치료할 수 있지만, 가장 적합한 환자는 바이러스 감염 위험이 있는 사람들이다. 그러한 환자로는 동성연애자, 매춘부, 정맥 약물 사용자, 혈우병환자, 바이러스 감염된 어머니에게서 태어난 어린이 및 환자 또는 생물학적 샘플과 접촉한 의료업 종사자들이 있다.
본 발명의 약리학적으로 활성적인 화합물은 galenic pharmacy의 통상적인 방법에 따라 처리하여 환자, 예컨대, 인간을 비롯한 포유동물에게로의 투여용 약제를 생성시킬 수 있다. 펩티드제는 변형 여부와 무관하게 약제 생성물 내로 혼입시킬 수 있다. 또한, 여러 경로에 의해 소형 펩티드를 암화하는 핵산 서열 또는 펩티드제를 전달하는 약제 또는 치료제의 제조도 일 양태이다. 예컨대, 캡시드 조립을 방해함으로써 바이러스 복제를 저해하는 소형 펩티드를 암호화하는 서열을 가진 DNA, RNA 및 바이러스 벡터가 고려된다. 목적하는 펩티드제를 암호화하는 핵산을 단독으로 또는 펩티드제와 함께 투여할 수 있다.
본원에 기술하는 화합물은 통상의 부형제, 즉 비경구, 장내(예컨대, 경구) 또는 펩티드제와 유해하게 반응하지 않는 국소 적용에 적합하고 약학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 담체 물질과의 혼합물로 이용할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체로는 물, 염 용액, 알콜, 아라비아 고무, 식물유, 벤질 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 탄수화물(예컨대, 락토스, 아밀로스 또는 전분), 스테아린산 마그네슘, 활석, 규산, 점성 파라핀, 향유, 지방산 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 펜타에리트리톨 지방산 에스테르, 히드록시 메틸셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈 등이 있으나, 이에 국한되지 않음). 약학 제제는 멸균시킬 수 있고, 보조제, 예컨대, 윤활제, 방부제, 안정화제, 습윤화제, 유화제, 삼투압에 영향을 끼치는 염, 환충액, 착색, 향미 및/도는 방향족 물질 등과 같이 활성 화합물과 유해하게 반응하지 않는 보조제와 필요에 따라 혼합할 수 있다. 이들은 비타민 같은 기타 활성 제제와 필요에 따라 배합할 수도 있다.
일부 양태에서는, 펩티드제를 포함하는 치료제가 보다 양호한 바이러스 반응을 얻기 위해 HIV 감염과 같이 바이러스 감염을 치료하는 기타 치료제와 함께 투여한다. 현재 4개의 상이한 부류의 약물이 인간에서의 HIV-1 감염의 항바이러스 치료에서 임상적 용도를 가진다. 상기 4개 부류의 약물은 다음과 같다. (i) 지도비딘, 라미부딘, 스타부틴, 디다노신, 아바카비르 및 잘시타빈과 같은 뉴클레오시드 유사체 역전사효소 저해제(NRTIs) ; (ii) 아데토비르 및 피박시르와 같은 뉴클레오티드 유사체 역전사효소 저해제; (iii) 에파비렌즈, 네비라핀 및 델라비르딘과 같은 비뉴클레오시드 역전사효소 저해제(NNRTIs) 및 (iv) 인디나비르, 넬피나비르, 리토나비르, 사퀴나비르 및 암프레나비르와 같은 프로테아제 저해제. 펩티드제의 투여와 함께 약물의 2, 3 또는 4개의 상이한 부류를 동시에 사용함으로써, HIV는 내성을 덜 나타내게 되는데, 그 이유는 상이한 부류의 약물 및 펩티드제를 극복하는 다중 돌연변이가 동일한 바이러스 입자에서 나타날 가능성이 더 적기 때문이다.
따라서, 당해 분야의 숙련자에게 알려진 방법과 양으로 뉴클레오시드 유사체역전사효소 저해제, 뉴클레오티드 유사체 역전사효소 저해제, 비뉴클레오시드 유사체 역전사효소 저해제 및 프로테아제 저해제와 함께 제공되는 펩티드제가 본 발명의 바람직한 양태이다. 펩티드제와 뉴클레오시드 유사체 역전사효소 저해제, 뉴클레오티드 유사체 역전사효소 저해제, 비뉴클레오시드 유사체 역전사효소 저해제 및 프로테아제 저해제를 포함하는 약도 본 발명의 양태이다.
GPG-NH2및 통상의 항바이러스제의 배합물로 HIV 감염을 치료하는 효능에 관한 연구는 이하 제시되는 실시예에서 확인할 수 있다.
실시예 4
본 실시예에서는, 아미드형의 소형 펩티드와 AZT의 상이한 배합물을 시험하여 두 화합물이 HIV-1 복제를 저해하기 위해 서로를 보충할 수 있는 지를 측정하는 실험이 제시된다(도 6 참조). 따라서, 200,000 HUT78세포를 GPG-NH2, AZT 또는 리토나비르("리토") 및 이들 화합물의 배합물의 상이한 농도의 존재 또는 부재 하에 25 TCID50에서 HIV-1 SF-2 바이러스로 감염시켰다. 도 6에 나타낸 숫자는 저해용 화합물의 마이크로몰 농도를 나타낸다. 세포들을 다양한 저해제를 사용하여 37℃에서 1 시간 동안 바이러스와 항온처리하고 이어서 3회 세척하였다. 다음, 세포들을 10%(v/v) 열 불활성화된 태내 송아지 혈청(FBS, GIBCO), 페니실린(100μ/㎖), 스트렙토마이신(100μ/㎖) 및 폴리브렌(시그마, 2㎍/㎖)이 보충된, 항바이러스제 및/또는 펩티드를 함유하는 RPMI 1640 배지에 재현탁시키고, 습도와 함께 5% CO2중의 37℃에서24-웰 평판(코스타 코포레이션)에서 배양하였다. 배양 상청액을 4일마다 수집하고, 배지를 감염후 14일이 될 때까지 교환시켰다. 바이러스의 복제를 모니터하기 위해, 상청액 중의 HIV-1 p24 항원 단백질은 시판 키트(애보트)를 사용하여 분석하였다.
GPG-NH2는 AZT의 존재 하에 HIV-1의 복제의 저해를 증가시킨 반면에, 소형 펩티드는 프로테아제 저해제 리토나비르의 것에 대해 단지 부가적인 항바이러스 효과만을 나타낸 것으로 관찰되었다. 그럼에도 불구하고, 이들 실험은 소형 펩티드가 뉴클레오시드 유사체 및 프로테아제 저해제가 바이러스 복제를 방해하는 방식과는 다른 메카니즘으로 HIV-1을 저해한다는 상기 제시한 데이터를 입증한다. 또한, 상기 실험은 소형 펩티드 및 AZT 및/또는 리토나비르를 포함하는 HIV-1 감염에 대한 신규한 치료 프로토콜이 효과적임을 입증한다.
아래의 설명에서는 투여량 및 투여 방법이 제시된다.
투여량 및 투여 방법
특정 펩티드 제제의 효과적인 투여량 및 투여 방법은 개개의 환자 및 질병의 단계 뿐만 아니라 당해 분야의 숙련자에 알려진 기타 인자에 근거하여 달라질 수 있다. 상기 화합물들의 치효 효능 및 독성은 세포 배양 및 실험 동물에서 표준 약학 절차, 예컨대, ED50(군집의 50%에서 치료 효과가 있는 투여량) 및 LD50(군집의 50%에 치사적인 투여량)에 의해 측정할 수 있다. 독성 효과 대 치료 효과의 투여량 비가 치료 지수이고, LD50/ED50비로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 약학 조성물이 바람직하다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터를 인간용 투여량 범위의 설정에 사용하였다. 그러한 화합물의 투여량은 독성이 약간 있거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있는 것이 바람직하다. 투여량은 이용되는 투여량, 환자의 민감도 및 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 변한다.
정확한 투여량은 치료할 환자를 고려하여 개개의 의사에 의해 선택된다. 투여량 및 투여를 조정하여 충분한 레벨의 활성부를 제공하거나 목적하는 효과를 유지한다. 고려할 수 있는 추가 요소로는 질병 단계의 심도, 나이, 환자의 체중 및 성, 식사, 투여 시간 및 빈도, 약물 배합물(들), 반응 민감도 및 치료에 대한 인용/반응을 들 수 있다. 단기 작용 약학 조성물은 매일 투여되는 반면, 장기 작용 약학 조성물은 2~4일마다, 매주 또는 2주에 한번씩 투여된다. 특정 제제의 반감기 및 제거 속도에 따라, 본 발명의 약학 조성물은 하루에 1회 내지 10회 이상 투여된다.
정상 투여량은 투여 경로에 따라 대략 1 내지 100,000 ㎍, 최고 총 투여량 약 10g까지 변화될수 있다. 바람직한 투여량으로는 250㎍, 500㎍, 1㎎, 50㎎, 100㎎, 150㎎, 200㎎, 250㎎, 300㎎, 350㎎, 400㎎, 450㎎, 500㎎, 550㎎, 600㎎, 650㎎, 700㎎, 750㎎, 800㎎, 850㎎, 900㎎, 1g, 1.1g, 1.2g, 1.3g, 1.4g, 1.5g, 1.6g, 1.7g, 1.8g, 1.9g, 2g, 3g, 4g, 5g, 6g, 7g, 8g, 9g 및 10g이 있다. 또한 펩티드제의 농도는 국소형으로 제제를 투여하는 양태에서 매우 높을 수 있다. 펩티드제의 몰 농도는 일부 양태와 함께 사용할 수 있다. 국소 투여용 및/또는 의료 장비 코팅용으로 바람직한 농도는 100μM 내지 800mM의 범위이다. 상기 양태에 대한 바람직한 농도는 500μM 내지 500mM의 범위이다. 예컨대, 국소 투여용 및/또는 의료장비 코팅용으로 바람직한 농도는 500μM, 550μM, 600μM, 650μM, 700μM, 750μM, 800μM, 850μM, 900μM, 1mM, 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 25mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, 100mM, 120mM, 130mM, 140mM, 150mM, 160mM, 170mM, 180mM, 190mM, 200mM, 300mM, 325mM, 350mM, 375mM, 400mM, 425mM, 450mM, 475mM 및 500mM을 포함한다. 특정 투여량 및 전달 방법에 관한 지침은 문헌(미국 특허 제4,657,760호; 제5,206,344호; 또는 제5,225,212호)에 제시되어 있다.
보다 구체적으로, 본원에 기술한 펩티드제의 투여량은 p24와 같은 캡소미어 단백질의 결합 및/또는 캡시드 조립의 방해 및/또는 HIV 또는 SIV 감염과 같은 바이러스 감염의 저해를 포함하는 바람직한 효과를 얻기에 충분한 펩티드제를 제공하는 양이다. 따라서, 펩티드제의 용량은 조직 또는 혈액 농도 또는 그 둘다를 약 0.1 μM 내지 500mM로 산출하는 것이 바람직하다. 바람직한 용량은 조직 또는 혈액 농도를 약 10 μM 내지 500 μM로 산출하는 양이다. 바람직한 용량은 예컨대, 조직 또는 혈액 농도 또는 그 둘다를 다음 농도로 얻는데 필요한 소형 펩티드의 양이다: 10μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 35μM, 40μM, 45μM, 50μM, 55μM, 60μM, 65μM, 70μM, 75μM, 80μM, 85μM, 90μM, 100μM, 110μM, 120μM, 130μM, 140μM, 145μM, 150μM, 160μM, 170μM, 180μM, 190μM, 200μM, 220μM, 240μM, 250μM, 260μM, 280μM, 300μM, 320μM, 340μM, 360μM, 380μM, 400μM, 420μM, 440μM, 460μM, 480μM 및 500μM. 800μM 이상의 조직 농도를 산출하는 용량은 바람직하지 않지만, 본 발명의 일부 양태와 함께 사용할 수 있다. 펩티드의일정한 주입은 또한 혈액 레벨에 의해 측정되는 조직내 안정한 농도를 유지하기 위해 제공될 수도 있다.
보다 높은 조직 농도는 펩티드의 저독성으로 인해 해 없이 유지될 수 있다. HIV-1의 소형 펩티드 내성 균주(예컨대, GPG-NH2내성 균주)를 선별하기 위한 시도는 지금까지 성공하지 못했다. HIV-1 균주 HTLV-IIIB는 시험관내 내성의 발전의 명백한 표시 없이 6개월 이상 동안 GPG-NH2의 연속 희석액(제한 희석액)을 존재하에 통과시켰다.
펩티드제의 투여 경로로는 국소, 결피, 비경구, 위장, 경기관지 및 경폐포 경로가 있다. 국소 투여는 펩티드를 함유하고 국소 도포되는 크림, 겔, 린스 등을 통해 이루어진다. 경피 투여는 펩티드제가 피부로 침투하여 혈류 속으로 들어갈 수 있는 크림, 린스, 겔 등의 도포에 의해 수행된다. 비경구 투여 경로로는 중앙 정맥 라인 내로의 직접 주사, 정맥내, 근육내, 복막내 또는 피하 주사와 같은 전기적 또는 직접 주사를 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 위장관 투여 경로로는 경구 섭취 및 직장 경로를 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 경기관지 및 경폐포 투여 경로로는 입 또는 비강내로의 흡입을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
국소 도포에 적합한 펩티드제 함유 화합물의 조성물로는 생리적으로 허용 가능한 이식물, 연고, 크림, 린스 및 겔을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 펩티드가 적어도 최소한으로 가용성인 임의의 액체, 겔 또는 고체의 약학적으로 허용 가능한 기제가 본 발명에서 국소용으로 적합하다. 국소 도포용 조성물은 HIV의 전염을 예방하기 위해 성교 중에 특히 유용하다. 그러한 용도로 적합한 조성물로는 질 또는 항문용 좌약, 크림 및 관주액을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
경피 투여에 적합한 펩티드제 조성물로는 피부에 직접 도포하거나 경피용 기구("경피용 패치")와 같은 보호 담체 내로 혼입시킨 약학적으로 허용 가능한 현탁액, 오일, 크릴 및 연고를 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 적합한 크림, 연고 등의 예는 Physician's Desk Reference에서 발견되고, 당해 분야에 널리 알려져 있다. 적합한 경피용 기구의 예는 본원에 참고로 인용한 미국 특허 제4,818,540호(1989.4.4, Chinen 등에게 허여)에 기재되어 있다.
비경구 투여에 적합한 펩티드제 조성물로는 약학적으로 허용 가능한 멸균 등장액을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 그러한 용액으로는 펩티드제의 중앙 정맥 라인 내로의 주사, 정맥내, 근육내, 복막내 또는 피하 주사용 염수 및 인산염 완충 염수를 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
경기관지 및 경폐포 투여에 적합한 펩티드제 조성물로는 다양한 유형의 흡입용 에어로졸을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예컨대, 펜타미딘을 에어로졸을 통해 비강내로 AIDS 환자에게 투여하여 뉴모시스티스 카리니에 의해 야기된 폐렴을 예방한다. 펩티드의 경기관지 및 경폐포 투여에 적합한 기구 역시 본 발명의 양태이다. 그러한 기구로는 분무기 및 기화기를 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 현재 이용되는 분무기 및 기화기의 다수의 형태는 펩티드제를 전달하도록 용이하게 개조할 수 있다.
위장관 투여에 적합한 펩티드제 조성물로는 약학적으로 허용 가능한 산제, 환약 또는 섭취용 액체 및 직장 투여용 좌약을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. HIV 감염의 가장 흔한 경로 및 사용 용이성으로 인해, 위장관 투여, 특히 경구 투여가 본 발명의 바람직한 양태이다. 트리펩티드(GPG-NH2)를 가진 500 ㎎의 캡슐이 제조되었고, 이것은 4℃에서 보관될 대 최소 12개월 동안 안정한 것으로 확인되었다. 기타 바이러스-숙주 시스템에 종래 알려진 바와 같이, 소형 펩티드의 특히 항바이러스 활성은 경구 투여 후 혈청에서 검출될 수 있다(Miller 등, Appl. Microbiol., 16:1489 (1968)). 소형 펩티드는 명백히 환자의 소화계에 의해 분해되는 것을 피할 수 있기 때문에, 이들이 경구 투여에 이상적이다.
펩티드제는 또한 HIV 감염의 예방이 중요한 상황에서 사용하기에 적합하다. 예컨대, 의료업 종사자는 항상 HIV 양성일 수 있고, 그 분비 및 체액이 HIV 바이러스를 함유하는 환자에게 노출된다. 또한, 펩티드제는 HIV의 전염을 예방하기 위해 성교 중에 사용하는 항바이러스 조성물 내로 제형화될 수 있다. 그러한 조성물은 당해 분야에 알려져 있고, 본원에 전문을 참고로 인용하는 PCT 공개번호 WO90/04390호 (1990.5.3, Modak 등)로 공개된 국제출원에도 기재되어 있다.
본 발명의 측면은 또한 HIV 전염에 대해 보호하는 장갑, 시트 및 작업 면과 같은 의료 장비용 코팅을 포함한다. 의료용 장갑 및 콘돔용 코팅이 특히 바람직하다. 의료 기구에 사용하기에 적합한 코팅은 펩티드를 함유하는 산제로 또는 펩티드제가 현탁되어 있는 중합체 코팅으로 제공될 수 있다. 코팅 또는 기구용으로 적합한 중합체 재료는 생리학적으로 허용 가능하고, 펩티드제의 치료학적으로 유효량이 확산될 수 있는 것이다. 적합한 중합체로는 폴리우레탄, 폴리메타크릴레이트, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐클로라이드, 셀룰로스 아세테이트, 실리콘 엘라스토머, 콜라젠, 실크 등을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 그러한 코팅은 예컨대, 본원에 그 전문을 참고로 인용하는 미국 특허 제4,612,337호(1986.9.16, Fox 등에게 허여)에 기재되어 있다.
이하의 설명에서는 소형 펩티드에 대한 여러 가지 독성학적 연구가 제시되고, 기타 펩티드제의 독성을 시험하는 방법이 개시된다.
소형 펩티드의 독성 연구
GPG-NH2에 대한 여러 독성학 연구가 수행되어 왔으며, 이들 분석법은 더 많은 펩티드(예컨대, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2및 SPT-NH2)를 사용하여 재현될 수 있다(Vahlne 등의 미국 특허 제5,627,035호 참조). 배양된 림프구에 대한 GPG-NH2의 효과는 하기 실시예에서 제시된다.
실시예 5
본 실시예에서는, 배양된 림프구에 대한 소형 펩티드의 효과와 관련한 몇 가지 독성학 연구가 제시된다. 일반적으로, 최고 2mM 농도에서 시험된 HIV-1에 대한 바이러스 저해 분석법에 사용된 펩티드는 어느 것도 그 형태학적 외관, 트리판 블루 염색 및 세포 성장에 의해 측정할 때 사용된 세포에 어떠한 독성 효과도 나타내지 않았다. GPG-NH2의 독성은 또한 (i) 플라크 감소 분석 및 (ii) HSV-1의 수율 저해 분석에서 시험되었다. GPG-NH2는 최고 1mM의 농도에서 HSV-1 복제를 감소시키지 못했는데, 이는 그 독성의 부재를 확인할 뿐만 아니라 소형 펩티드가 HIV-관련 바이러스를 선택적으로 저해함을 입증하는 것이다. 이러한 견해는 GPG-NH2가 인플루엔자 또는 소아마비 바이러스를 저해하지 못했다는 관찰에 의해 강화되었다.
다음, 정상 인간 림프단구 세포(PBMC)에 대한 독성을 검사하였다. 2mM 만큼 높은 투여량과 4일 정도의 긴 노출 시간에, GPG-NH2는 배양된 단구 및 림프구의 생존능에 이렇다할 영향을 끼치지 못했다. 인간 단핵 세포의 시험관내 증식 반응에 대한 GPG-NH2의 효과 역시 시험하였다. GPG-NH2는 T 세포에 한계의(있다면) 직접적인 항 증식성을 일으키고, 20 μM의 투여량에서 부속 세포(예컨대, 단구 및 수상 세포)의 기능에는 영향을 끼치지 않았다.
다양한 세포주의 시험관내 50%의 세포 독성 농도(CC50) 역시 평가하였다. 따라서, 최고 40mM의 GPG-NH2상이한 농도를 T 세포주 HUT78, H9, CEM-SS, MT-2 및 (비)유도된 ACH-2 뿐만 아니라 대식세포 유래의 세포주 Jurkat-tat III, THP-1 및 (비)유도된 U-1 세포의 배지 배양물 내로 보충하였다. 항온 배양 3일 후에, 세포 수를 계수하였다. HUT78, MT-2 및 Jurkat-tat III의 트리판 블루 염료 배타 및 세포 계수 결과, 40 mM GPG-NH2의 존재하에 배양 3일 동안 세포 성장의 약 40%의 저해를나타냈다. H9, CEM-SS 및 THP-1은 이 GPG-NH2농도에서 세포수의 20% 미만의 감소를 나타냈다. 그러므로, 시험관내 CC50/IC50비는 >104이다. 상기 제시한 독성 실험은 소형 펩티드가 고농도에서조차 림프구에 대한 낮은 독성을 가짐을 입증한다.
설치류에 대한 소형 펩티드의 다량의 효과 역시 분석하였고, 상기 실험을 다음 실시예에서 제시한다.
실시예 6
본 실시예에서는, 소형 펩티드에 대한 생체내 독성 연구 결과를 제시한다. 제 1 실험에서, 소형 펩티드의 다량의 단일 용량을 마우스에게 투여하고, 독성 효과를 분석하였다. 체중 1㎏당 최고 1g의 농도로 마우스 성체의 미정맥에 GPG-NH2의 정맥내 주사는 동물에 아무런 분명한 독성 효과를 나타내지 못했다. 두 번째 실험에서는, 다양한 양의 소형 펩티드의 여러 용량을 마우스에게 거의 3주 동안 투여하였다. 아우스 군(각 군당 5마리의 마우스)에게 6일의 연령에서 시작하여 GPG-NH2의 복막내 주사(매일 체중 1㎏당 0.01, 0.1 및 1g)를 제공하였다. 일일 주사는 18일 동안 계속하였다. 대조군과 비교하여, 마우스에 대한 GPG-NH2의 이렇다할 영향은 없었다. 유사한 실험에서, GPG-NH2의 4주 독성 연구는 덴마크의 스캔톡스 A/S에서 수행하였다. GPG-NH2는 28일 동안 매일 체중 1㎏당 최고 1g의 용량으로 래트에 경구 투여하였다. 동물에 대한 독성의 징후는 관찰되지 않았다. 이들 생체내 독성 실험은 본원의 소형 펩티드가 포유동물에게는 저독성이고 다량으로 안전하게 제공할 수있음을 입증한다.
추가 연구에서, 인간 혈액 및 혈장에서 소형 펩티드의 안정성을 분석하였다. 아래 실시예는 이러한 실험들을 개시한다.
실시예 7
본 실시예는 인간 혈액 및 혈장에서의 소형 펩티드의 안정성에 접근하도록 수행되는 여러 가지 연구를 기술한다. 따라서, 인간 혈액을 새로이 채취하고 EDTA로 처리하였다. 혈장은 2,500 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 분리하였다. GPG-NH2를 10mM 또는 50mM 농도로 혈액 또는 혈장 내로 첨가한 다음, 37℃에서 각각 1, 2 및 4 시간 동안 항온처리하였다. 대조군으로서 GPG-NH2를 10%(v/v) 열 불활성화된 태내 소 혈청(FBS, GIBCO), 페니실린(100u/㎖), 스트렙토마이신(100u/㎖) 및 폴리브렌(시그마, 2 ㎍/㎖)로 보충된 RPMI 1640 배지 내로 첨가하고 동일한 방식으로 항온 배양하였다. 37℃에서 항온 배양 후에, GPG-NH2를 함유하는 혈액을 2,500 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 혈장 샘플의 일부를 5mM 농도의 CaCl2로 37℃에서 10분 동안 처리하고, 13,000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 상청액을 CaClㅁ2처리된 혈장으로 지칭하였다. 그 후, GPG-NH2를 함유하는 혈장 샘플 전부를 RPMI 배지에서 희석하여 최종 농도 20 μM 또는 100 μM의 GPG-NH2(500배 희석액)를 얻고, HIV 복제 분석에 사용하였다.
복제 분석은 HUT78세포 상에서 수행하고, HIV-1 SF-2 바이러스 균주를 사용하였다. 간단히 언급하면, 대략 200,000 세포를 희석된 GPG-아미드를 함유하는 배지, 혈장 도는 혈액에서 얻은 혈장에 재현탁시켰다. GPG-NH2를 함유하는 배지, 혈장 또는 혈액에서 얻은 혈장을 그 세포들과 1hr, 2hr 또는 4hr 동안 37℃에서 항온배양하였다. 1 시간의 흡착 후에, 세포들을 RPMI 배지에서 3회 세척한 다음, 적당한 GPG-아미드 함유 혈장에 재현탁시키고, 습기와 함께 5% CO2중에서 37℃에서 항온 배양하였다. 배양 상청액을 4일 마다 수집하고, 배지를 감염 14일이 될 때까지 교환하였다. 바이러스의 복제를 모니터하기 위해, 상청액 중의 HIV-1 p24 항원 단백질을 시판 키트(애보트)를 사용하여 분석하였다. HIV-1 p24 분석은 감염 7일 및 14일 후에 상청액 상에서 수행하였다. GPG-NH2보충된 배지, 혈장, 또는 혈액에서 얻은 혈장으로 HIV-1을 저해하는 능력에서는 중요한 차이가 관찰되지 않았다.
인간 혈장에서의 GPG-NH2의 안정성은 박층 크로마토그래피(TLC)로 화학적으로 평가하였다(도 7 참조). 이 실험에서는14C GPG-NH2를 인간 혈장과 37℃에서 30분, 2 시간, 또는 8시간 동안 항온 배양하고, TLC로 분리하며, 자동 방사선 분석 필름으로 크로마토그래프의 노출에 의해 가시화하였다. 도 7(레인 Hp0, Hp0.5, Hp2 및 Hp8)에 도시한 바와 같이, 소형 펩티드의 이동성에는 약간의 변화가 관찰되었다. 소형 펩티드의 이동성은 인간 혈장에서 37℃에서 항온 배양 30분 후에 다소 증가하였지만, 이동성에서의 추가적인 변화는 최고 8 시간까지 관찰되지 않았다. TLC 스폿의 질량 분광분석 스펙트럼 분석(전기 분무 분석)은 증가된 이동성을 가진 스폿을 포함하여 모든 스폭이 GPG-NH2임을 입증하였다. 상기 실험은 본원에 기재한 소형 펩티드가 인간 혈액 및 혈장에서 안정하고, 이들은 그 항바이러스성을 보유하며 혈장 프로티나제에 의해 분해되지 않음을 입증한다.
이하의 설명에서는 소형 펩티드의 흡착, 분배 및 대사에 관한 여러 연구가 제시된다.
소형 펩티드의 흡착, 분배 및 대사
소형 펩티드를 포함하는 약제의 경구 투여가 바람직하기 때문에, 소형 펩티드의 산 안정성은 다양한 시간 동안 50mM KCl 및 0.1M HCl의 용액에서14C-표지된 GPG-NH2를 항온 배양함으로써 평가하였다. 산 가수분해 후에, 방사성 표지된 트리펩티를 박층 크로마토그래피(TLC)로 분석하고, HPTLC 평판을 25% 메탄올: 25% 이소프로판올: 15% 부탄올: 35% (0.1N HOAc 및 0.1N NaOAc)로 전개시켰다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 최고 24 시간 동안의 트리펩티드의 항온 처리는 GPG-NH2의 이동성에 영향을 끼치지 않았고, 따라서 분자 구조에도 영향을 끼치지 않았다. 이러한 결과는 소형 펩티드가 위에서 발견되는 것과 유사한 산성 조건 하에 잔존한다는 것을 입증하였다.
또한, 배양 배지로부터 세포 내로의 소형 펩티드의 시험관내 흡수는 일련의 실험에서 연구하였다. 따라서, HUT78, Jurkat-tat III 및 MT-2 세포는14C-표지된 GPG-NH2165 nCi(GPG-NH2의 0.7 μM에 해당)로 항온 배양하였다. 소형 펩티드의 흡수가 관찰되었고, GPG-NH2의 8%(Jurkat-tat III 세포) 및 20%(HUT78세포)가 세포에 혼입되었다. 이 결과는 여러 세포형 내로 소형 펩티드의 혼입이 효과적임을 입증하였다.
또한, 소형 펩티드의 생체내 흡수는 래트에서 분석하였다. 래트에게14C GPG-NH2를 먹이고, 다양한 시점 후에, 혈액, 뇨 및 조직 샘플을 동물로부터 수집하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 공급후 8시간 째에 채취한 래트의 뇨와 공급후 30분, 2 시간 및 8 시간에 채취한 래트 혈장 샘플을 TLC 평판에서 분리하였다(뇨 8, rp0.5, rp2 및 rp8). 모든 조직은 검시후 분석 실시 전에 -20℃로 유지하였다. 조직 샘플 10 내지 30 ㎍을 분석된 각 기관의 3개의 상이한 위치로부터 수집하고, 이어서 기관 조직은 45℃의 조직 용해기(옵티솔브, LKB-왈락) 250 ㎕에 4 내지 6 시간 동안 용해시켰다. 균질화된 조직 용액은 0.05M HCl 산성화된 신틸레이션 칵테일(루마 겔, 루막/3M) 3㎖를 첨가하기 전에 30% H2O250 ㎕ 및 이소프로판올 100 ㎕를 첨가하여 탈색시켰다. 베타 신틸레이션 계수기(LKB-왈락 1218 랙 베타)로 방사능을 측정하였다. 혈장내 유리/비결합된 GPG-NH2를, 1부의 혈장 및 2부의 에탄올로 침전시킨 다음, -70℃에서 1 시간 동안 항온 배양하고, 4℃에서 20,000xg로 15분 동안 원심분리하여 수집하였다. 혈구 샘플을 PBS로 희석하고(혈구 2부 대 PBS 1부의 비로), 혼합물 10 ㎕를 샘플링하고, 조직 샘플로서 분석하였다. 혈장 및 뇨 샘플 5 내지 20 ㎕를 정량 분석전에 레디 세이프(베크만) 유체 3 ㎖와 직접 혼합하였다. 최대 흡수의 계산 기준 및 분포를 제공하느 결과가 표 10 및 11에 제시된다. 값들은 nCi로 표현된 것이다.
동물수*nCi/㎖ 또는 g 조직 1 2 3 4 5 평균
뇌 48 34 31 30 33 35
신장 450 491 467 446 477 466
간 599 413 454 507 503 495
비장 383 428 414 195 413 366
흉선 366 288 290 338 372 331
혈구 90 81 99 95 101 93
혈장 140 126 121 142 124 130
뇨 5,846 5,068 6,841 4,557 5,986 5,660
전체 뇨 7,016 7,096 3,284 283 2,395 4,015
* 동물들은 4 시간 후에 사망시켰다.
동물수*nCi/㎖ 또는 g 조직 6 7 8 9 10 평균
뇌 43 27 28 25 29 30
신장 255 488 461 401 468 415
간 537 419 478 458 578 494
비장 307 281 257 336 285 293
흉선 340 350 323 349 311 334
혈구 51 72 87 71 108 78
혈장 138 123 135 129 148 135
뇨 2,992 5,040 3,121 4,297 2,175 3,525
전체 뇨 6,463 6,653 11,173 10,227 7,613 8,426
* 동물들은 8 시간 후에 사망시켰다.
최대 흡수량의 계산은 다음과 같이 결정되었다. 총공급량은 래트 체중 1㎏당 800μCi(동물당 총 160μCi)였다. GPG-NH2및 그 대사물이 골고루 체내에 분배된다는 가정 하에, 조직에 존재하는 GPG-NH2는 연구된 동물 총수로부터 얻은 상이한 조직의 g수당 평균 계수치를 동물 총수로 나누고, 체중과 배수 0.9를 곱한 것이다. 상기 배수는 혈액 부피의 추정치가 평균 체중의 대략 10%이기 때문에, 혈액 부피로부터 빼기 위해 유도된 것이다. 예컨대(동물 1.5의 데이터로부터), 5 마리의 래트에 대한 총 체중이 207g이고 다양한 조직으로부터 검출된 방사능이 (35+466+495+366+331), 즉 1,693 nCi이며, 혈액으로부터 검출된 방사능이 (93+130), 즉 223 nCi이고, 뇨에서 검출된 방사능이 4,015 nC이라면, 소형 펩티드의 최대 흡수량은 다음과 같이 계산될 수 있다:
조직: (35+466+495+366+331)/5ㆍ207ㆍ0.9= 63,240 nCi
유체: 혈액(93+130)ㆍ207ㆍ0.1=4,642 nCi
뇨: 4,015 nCi
합계: (63.24+4.642+4.015)/800ㆍ0.207= 0.4342, 즉 43% 최대 흡수율.
샘플링된 조직내 보유된/고정화된 GPG-NH2및 그 대사물의 상대 분포는 간에서 가장 높고, 그 다음이 신장, 비장, 흉성, 뇌의 순서로 높게 관찰되었다. 뇨의 방사능은 4 내지 8 시간 사이에 2배로 관찰되었다. TLC 평판으로부터 뇨의 방사성 스폿의 질량 스펙트럼 데이터(전기 분무 질량 분광 분석법)는 뇨의 방사능의 단지 작은 부분만이 천연 GPG-NH2이었음을 나타냈다(도 7 참조). 상기 생체내 연구 결과는 소형 펩티드의 상당량이 혈액, 혈장 및 여러 가지 상이한 조직으로 효과적으로 전달되었음을 입증하였다.
또한 도 9 및 10에 도시한 바와 같이, 소형 펩티드의 상당량이 장시간에 걸쳐 혈장에 잔존한다. 도 9에는, 혈구, 결합된 혈장 단백질 뿐만 아니라 비단백질 결합(유리) 혈장 방사능의 분포가 나타나 있다. 혈장 분획으로부터 방사능의 제거는 도 10에 도시되어 있다. 트리펩티드 GPG-NH2는 반감기가 86.5분이다. 단백질 결합 방사능은 2부의 99.5% 에탄올로 침전시킨 후에 분석하였다. 상기 흡수 및 분포 데이터 및 TLC 데이터로부터, 혈장으로부터 회수된 천연 GPG-NH2의 최소 흡수량이 계산되고, 래트의 공급 1 시간 내에 공급된 GPG-NH2의 적어도 1%가 혈장내 단백질 유리 GPG-NH2로서 회수될 수 있었다.
소형 펩티드를 공급받은 동물의 혈장에서 생물학적 활성 GPG-NH2의 평가를 위해서는, 혈장 샘플을 마지막 공급후 4주 독성 연구 래트로부터 얻은 혈액으로부터 준비하였다. 혈장 샘플을 RPMI 배지에서 1/5로 희석하여 전술한 바와 같이 HIV-1의 SF162 균주로 감염된 PBMC에 투여하였다. 바이러스 감염성은 시판 검출 분석법 (애보트)을 사용하여 상청액내 p24의 양을 검출함으로써 감염 7일, 11일 및 14일 후에 모니터하였다. 표 12에 나타낸 바와 같이, 소형 펩티드로 처리한 래트에서 얻은 혈청은 바이러스 감염성을 저해하는 능력을 보유하였다. 일부 경우에는, 10μM GPG-NH2정도의 적은 양의 투여는 HIV-1 복제의 저해를 가능하게 하는 혈장내 소형 펩티드의 충분한 농도를 제공하였다. 감소율은 표 6에서와 같이 계산되었다. 이들 실험 결과는 본원에 기술한 소형 펩티드가 HIV 복제를 저해하는데 효과적인 동물 체내 농도로 유지될 수 있음을 지지하였다.
전체 혈장의 단백질은 칼럼 크로마토그래피로 분석하고 분류하여 미정제 단백질은 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔(10%) 전기영동(SDS/PAGE)에 의해 분석하였다. 래트 혈장 샘플은 10 mM 트리스-HCl pH8.3 및 50mM KCl의 완충액에서 크기 배타(세파로스 G-50, 파마시아) 크로마토그래피(0.4x6 ㎝)로 부분 정제하였다. 용출물을 10 mM 트리스-HCl pH8.3(세파로스 CL-6B DEAE, 0.4x6㎝)의 완충액액서 NaCl의 증가하는 단계적 구배를 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피로 분리하였다. 용출물을 모니터하고 방사능에 따라 수집하였다(레디 세이프, 베크만; LKB1218, 스웨덴). 강한 신호를 가진 단백질 분획을 10% SDS-PAGE 상에서 분리하고, 이어서, PVDF(폴리비닐리덴 디플루오라이드, 바이오래드)막 상에 블로팅한 다음, 에드만 N-말단 아미노산 서열 분석에 적용시켰다(어플라이드 바이오시스템스 프로사이즈 시퀀서, 미국).
도 11에 도시한 바와 같이, 동물에 공급한 후 60분에 단백질과 공유 결합된 방사능은 거의 없는 것으로 관찰되었다. B1-B4로 표지한 단백질은 서열결정하였으며, 알파-1 앤티트립신(B1), 펜탁신(B-2), C-반응성 단백질(B-3)으로 결정되었으며, B-4는 동정할 수 없었다. 이들 단백질은 모드 간에서 합성되었다. 이에 대한 한 해석은, 가수분해된 GPG-NH2가 간 단백질 합성에 다시 이용된다는 것이다. 이들 실험으로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 소 펩티드는 신체 내에서 대사되는데, 그 이유는 동정된 관련 단백질(B-1, B-2 및 B-3)이 모두 간에서 합성되고, 가수분해되며, 소 펩티드의 재이용이 간에서 일어나기 때문이다.
이상과 같이 본 발명을 특정 구체예 및 실시예를 통해 기술하였지만, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 변형 실시가 가능할 것이다. 따라서, 본 발명은 후술하는 청구의 범위에 의해서만 제한된다.

Claims (62)

  1. 바이러스 감염된 숙주 세포에서 바이러스 복제를 억제하는, 식 X1-X2-X3-NH2의 아미드 형태의 펩티드의 유효량을 포함하는 조성물로서, 이때 X1, X2및 X3은 임의의 아미노산이며, 상기 펩티드는 Gly-Pro-Gly-NH2가 아니며, 상기 조성물은 바이러스 캡시드 어셈블리를 방해함으로써 바이러스 복제를 억제하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 펩티드 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2및 Ser-Pro-Thr-NH2으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, X3이 글리신인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 아미드 형태의 펩티드가 식 X4X5X1X2X3-NH2(이때, X4및 X5는 임의의 아미노산이며, 임의의 하나 또는 두개의 아미노산은 부재함)인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 트리펩티드 X1X2X3은 바이러스의 캡시드 단백질의 아미노산 서열에서 발견되는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 펩티드가 지지체에 결합된 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 펩티드가 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제내에 혼입된 조성물.
  8. 식 Gly-Lys-Gly-NH2인 아미드 형태의 펩티드.
  9. 제8항에 있어서, 지지체에 결합된 펩티드.
  10. 식 Arg-Gln-Gly-NH2인 아미드 형태의 펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 지지체에 결합된 펩티드.
  12. 식 Cys-Gln-Gly-NH2인 아미드 형태의 펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 지지체에 결합된 펩티드.
  14. 식 Lys-Gln-Gly-NH2인 아미드 형태의 펩티드.
  15. 제14항에 있어서, 지지체에 결합된 펩티드.
  16. 식 Ala-Leu-Gly-NH2인 아미드 형태의 펩티드.
  17. 제16항에 있어서, 지지체에 결합된 펩티드.
  18. 식 Ser-Leu-Gly-NH2인 아미드 형태의 펩티드.
  19. 제18항에 있어서, 지지체에 결합된 펩티드.
  20. 숙주 세포에 식 X1X2X3-NH2인 아미드 형태의 펩티드(이때, X1, X2및 X3은 임의의 아미노산이고, 상기 펩티드는 Gly-Pro-Gly-NH2가 아님)의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 숙주 세포에서 HIV 복제를 억제하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 펩티드는 펩티드 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2,Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2및 Ser-Pro-Thr-NH2으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  22. 제20항에 있어서, 뉴클레오시드 유사체 역 전사효소 억제제, 뉴클리오티드 유사체 역 전사효소 억제제, 비뉴클레오시드 역 전사효소 억제제 및 프로테아제 억제제로 구성되는 군으로부터 선택되는 항바이러스 처리 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제20항에 있어서, 상기 펩티드가 지지체에 결합된 방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 펩티드가 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제로 투여되는 방법.
  25. 식 X1X2X3-NH2인 아미드 형태의 펩티드(이때, X1, X2및 X3은 임의의 아미노산이고, 상기 펩티드는 Gly-Pro-Gly-NH2가 아님)의 유효량을 포함하며, 캡시드의 어셈블리를 방해함으로써 HIV 복제를 억제하는, 숙주 세포 내에서 HIV 복제를 억제하는 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 펩티드는 펩티드 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2및 Ser-Pro-Thr-NH2으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조성물.
  27. 제25항에 있어서, X3이 글리신인 조성물.
  28. 제25항에 있어서, 상기 아미드 형태의 펩티드가 식 X4X5X1X2X3-NH2(이때, X4및 X5는 임의의 아미노산이며, 임의의 하나 또는 두개의 아미노산은 부재함)인 조성물.
  29. 제25항에 있어서, 상기 트리펩티드 X1X2X3은 바이러스의 캡시드 단백질의 아미노산 서열에서 발견되는 조성물.
  30. 제25항에 있어서, 상기 펩티드가 지지체에 결합된 조성물.
  31. 제25항에 있어서, 상기 펩티드가 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제내에 혼입된 조성물.
  32. 숙주 세포에 식 X1X2X3-NH2인 아미드 형태의 펩티드(이때, X1, X2및 X3은 임의의 아미노산이고, 상기 펩티드는 Gly-Pro-Gly-NH2가 아님)의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 숙주 세포에서 바이러스 복제를 억제하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 펩티드는 펩티드 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2및 Ser-Pro-Thr-NH2으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  34. 제32항에 있어서, 뉴클레오시드 유사체 역 전사효소 억제제, 뉴클리오티드 유사체 역 전사효소 억제제, 비뉴클레오시드 역 전사효소 억제제 및 프로테아제 억제제로 구성되는 군으로부터 선택되는 항바이러스 처리 단계를 추가로 포함하는 방법.
  35. 제32항에 있어서, 상기 펩티드가 지지체에 결합된 방법.
  36. 제32항에 있어서, 상기 펩티드가 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제로 투여되는 방법.
  37. 숙주 세포에 식 X1X2X3-NH2인 아미드 형태의 펩티드(이때, X1, X2및 X3은 임의의 아미노산이고, 상기 펩티드는 Gly-Pro-Gly-NH2가 아님)의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 숙주 세포에서 바이러스 캡시드 어셈블리를 방해하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 펩티드는 펩티드 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2및 Ser-Pro-Thr-NH2으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  39. 제37항에 있어서, X3이 글리신인 방법.
  40. 제37항에 있어서, 상기 아미드 형태의 펩티드가 식 X4X5X1X2X3-NH2(이때, X4및 X5는 임의의 아미노산이며, 임의의 하나 또는 두개의 아미노산은 부재함)인 방법.
  41. 제37항에 있어서, 상기 트리펩티드 X1X2X3은 바이러스의 캡시드 단백질의 아미노산 서열에서 발견되는 방법.
  42. 제37항에 있어서, 상기 펩티드가 지지체에 결합된 방법.
  43. 바이러스에 감염된 다수의 세포와 유효량의 펩티드 제제(이때, 펩티드는 Gly-Pro-Gly-NH2가 아님)를 접촉시키는 단계;
    불완전 캡시드 형성에 대해 상기 바이러스를 분석하는 단계; 및
    불완전 캡시드 형성을 유도하는 펩티드 제제를 선택하는 단계
    를 포함하는, 항바이러스제 내로 혼입시키기 위한 펩티드 제제를 동정하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 캡시드 형성의 분석에 현미경을 이용하는 방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기 바이러스는 HIV-1, HIV-2 및 SIV로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 펩티드 제제가 트리펩티드, 올리고펩티드 및 펩티드유사체로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  47. 제43항에 있어서, 상기 펩티드는 펩티드 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2,Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2및 Ser-Pro-Thr-NH2으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  48. 제43항에 있어서, 상기 펩티드 제제는 p24의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  49. 바이러스 단백직을 제공하는 단계;
    상기 바이러스 단백질과 유효량의 펩티드 제제(이때, 펩티드 제제는 Gly-Pro-Gly-NH2)와 접촉시키는 단계;
    상기 바이러스 단백질과 펩티드 제제를 포함하는 복합체의 형성을 검출하는 단계
    를 포함하는, 바이러스 단백질에 결합하는 펩티드 제제를 동정하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 바이러스 단백질이 HIV-1, HIV-2 및 SIV로 구성되는 군으로부터 선택되는 바이러스로부터 유래하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 펩티드 제제가 트리펩티드, 올리고펩티드 및 펩티도유사체로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 펩티드는 펩티드 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2및 Ser-Pro-Thr-NH2으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  53. 약제 내에 제49항에서 동정된 펩티드 제제를 혼입시키는 단계를 포함하는 약제의 제조 방법.
  54. 세포에 식 X1X2X3-NH2인 아미드 형태의 펩티드(이때, X1, X2및 X3은 임의의 아미노산이고, 상기 펩티드는 Gly-Pro-Gly-NH2가 아님)의 유효량을 투여하는 단계;
    상기 세포 내에서 바이러스 복제의 억제를 검출하는 단계;
    약제 내로 바이러스 복제의 억제를 유발하는 펩티드를 혼입시키는 단계
    를 포함하는 약제의 제조방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 펩티드는 펩티드 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2및 Ser-Pro-Thr-NH2으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  56. 제54항에 있어서, 뉴클레오시드 유사체 역 전사효소 억제제, 뉴클리오티드 유사체 역 전사효소 억제제, 비뉴클레오시드 역 전사효소 억제제 및 프로테아제 억제제로 구성되는 군으로부터 선택되는 항바이러스 화합물을 혼입시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  57. 제54항에 있어서, 약제 내로 담체롤 혼입시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  58. 식 X1X2X3-R인 펩티드(이때, X1, X2및 X3은 임의의 아미노산이고, 상기 펩티드는 Gly-Pro-Gly-NH2가 아니며, R은 상기 펩티드의 카르복시 말단에 부착된 조절기이고, R이 아미드기 또는 전하 및 입체 부피가 유사한 기타 부를 포함함)를 포함하며, 바이러스 캡시드 어셈블리를 방해함으로써 바이러스 복제를 억제하는, 바이러스에 감염된 숙주 세포에서 바이러스 복제를 억제하는 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 펩티드는 펩티드 Gly-Lys-Gly-NH2, Arg-Gln-Gly-NH2, Cys-Gln-Gly-NH2, Lys-Gln-Gly-NH2, Ala-Leu-Gly-NH2, Gly-Val-Gly-NH2, Val-Gly-Gly-NH2, Ala-Ser-Gly-NH2, Ser-Leu-Gly-NH2및 Ser-Pro-Thr-NH2으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조성물.
  60. 제58항에 있어서, X3이 글리신인 조성물.
  61. 제58항에 있어서, 상기 펩티드가 식 X4X5X6X7X8X9X10X1X2X3-R이며, 이때 X4, X5, X6, X7, X8, X9, 및 X10은 임의의 아미노산이고, 임의의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 아미노산은 부재하며, R은 상기 펩티드의 카르복시 말단에 부착된 조절기이고, R은 아미드기 또는 전하와 입체 부피가 유사한 기타 부를 보유하는 조성물.
  62. 제58항에 있어서, 상기 펩티드 X1X2X3이 바이러스의 캡시드 단백질의 아미노산 서열에서 발견되는 조성물.
KR1020027001899A 1999-08-09 2000-06-29 바이러스 감염성을 차단하는 펩티드 및 그 사용 방법 KR20020025970A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/370,368 US6258932B1 (en) 1999-08-09 1999-08-09 Peptides that block viral infectivity and methods of use thereof
US09/370,368 1999-08-09
PCT/IB2000/000961 WO2001010456A2 (en) 1999-08-09 2000-06-29 Peptides that block viral infectivity and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20020025970A true KR20020025970A (ko) 2002-04-04

Family

ID=23459335

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020027001899A KR20020025970A (ko) 1999-08-09 2000-06-29 바이러스 감염성을 차단하는 펩티드 및 그 사용 방법

Country Status (15)

Country Link
US (2) US6258932B1 (ko)
EP (1) EP1206273A2 (ko)
JP (1) JP2003506410A (ko)
KR (1) KR20020025970A (ko)
CN (1) CN1377275A (ko)
AU (1) AU5700800A (ko)
CA (1) CA2378460A1 (ko)
CZ (1) CZ2002402A3 (ko)
HU (1) HUP0202502A2 (ko)
IL (1) IL147969A0 (ko)
IS (1) IS6262A (ko)
MX (1) MXPA02001344A (ko)
NO (1) NO20020571L (ko)
PL (1) PL354090A1 (ko)
WO (1) WO2001010456A2 (ko)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA02001349A (es) * 1999-08-09 2002-07-22 Tripep Ab Inhibidores de la polimerizacion de proteinas y metodos de uso.
FR2827170B1 (fr) * 2001-07-13 2004-07-16 Soc Extraction Principes Actif Utilisation de peptides pour augmenter l'adhesion cellulaire
US6593455B2 (en) * 2001-08-24 2003-07-15 Tripep Ab Tripeptide amides that block viral infectivity and methods of use thereof
US6455670B1 (en) * 2001-09-06 2002-09-24 Tripep Ab Pentamer peptide amide, ALGPG-NH2, that inhibits viral infectivity and methods of use thereof
WO2003024995A1 (en) * 2001-09-19 2003-03-27 Tripep Ab Molecules that block viral infectivity and methods of use thereof
EP2219031B1 (en) * 2001-10-22 2013-04-24 Amgen, Inc. Use of leptin for treating human lipoatrophy and method of determining predisposition to said treatment
KR100960909B1 (ko) * 2002-04-22 2010-06-04 유니버시티 오브 메릴랜드, 볼티모어 카운티 캡시드 단백질의 항바이러스 억제
US7553926B2 (en) * 2002-04-23 2009-06-30 Andrea Savarino Compositions containing anti-HIV peptides and methods for use
US20050096319A1 (en) * 2003-02-21 2005-05-05 Balzarini Jan M.R. Identification of compounds that inhibit replication of human immunodeficiency virus
JP2006518373A (ja) * 2003-02-21 2006-08-10 トリペップ アクチ ボラゲット Ｈｉｖ複製を抑制するためのグリシンアミド誘導体
DE102005015005A1 (de) * 2005-04-01 2006-10-05 Qiagen Gmbh Verfahren zur Behandlung einer Biomoleküle enthaltenden Probe
TWI457136B (zh) 2005-04-04 2014-10-21 Tibotec Pharm Ltd Ｈｉｖ-感染之預防
CN101370509A (zh) * 2006-01-13 2009-02-18 安克瑞格公司 化合物连同γ辐射在用于治疗癌症中的应用
CA2658227A1 (en) 2006-01-17 2007-07-26 Health Research, Inc. Heteroduplex tracking assay
EP2047848A4 (en) * 2006-07-05 2010-06-09 Univ Tokyo METHOD FOR THE TREATMENT OF GENETIC DISEASES BASED ON A NONSENSE MUTATION
WO2009000296A2 (en) * 2007-06-25 2008-12-31 Oncoreg Ab Tpp ii inhibitors for use in the treatment of autoimmune and inflammatory diseases and transplant rejection
AU2009279616A1 (en) 2008-08-08 2010-02-11 New York Blood Center Small molecule inhibitors of retroviral assembly and maturation
CN101845079B (zh) * 2009-03-27 2014-04-09 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 六肽或其衍生物及其医药用途
JP5664992B2 (ja) * 2009-08-26 2015-02-04 国立大学法人名古屋大学 細胞特異的ペプチド及びその用途
WO2012050925A2 (en) 2010-09-28 2012-04-19 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Highly soluble leptins
EP2646459B1 (en) * 2010-12-02 2020-01-08 Bionor Immuno AS Peptide scaffold design
EP2913338A1 (en) * 2014-02-28 2015-09-02 Roche Diagniostics GmbH Soluable and immunoreactive variants of HTLV capsid antigen p24
US20190343938A1 (en) * 2019-07-02 2019-11-14 Virago Vax Inc. Mammary tumor virus vaccine
CN111116717B (zh) * 2020-01-03 2021-10-29 中国科学院大学温州研究院(温州生物材料与工程研究所) 含有n-甲基-d-葡糖胺单元的糖肽水凝胶、制备方法及其应用

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4215112A (en) * 1979-03-14 1980-07-29 Ortho Pharmaceutical Corporation Tripeptides and methods
US4658013A (en) * 1981-07-28 1987-04-14 Sterling Drug Inc. Analgesic and/or opiate antagonist tripeptide amides and processes for preparation and compositions thereof
US4818540A (en) 1985-02-25 1989-04-04 Rutgers, The State University Of New Jersey Transdermal fertility control system and process
US4612337A (en) 1985-05-30 1986-09-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for preparing infection-resistant materials
US4952411A (en) 1987-02-25 1990-08-28 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method of inhibiting the transmission of AIDS virus
US4950647A (en) * 1988-10-04 1990-08-21 Nucleic Acid Research Institute T cell immunopotentiator
IT1231342B (it) 1989-08-28 1991-11-28 Prodotti Antibiotici Spa Derivati peptidici farmacologicamente attivi e preparazioni farmaceutiche che li contengono
DE4014655A1 (de) * 1990-05-08 1991-11-14 Behringwerke Ag Peptidamide, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende mittel als fibrin/thrombin-gerinnungsinhibitoren
US5346989A (en) * 1990-08-22 1994-09-13 Syntello Vaccine Development Kb Peptides for use in induction of T cell activation against HIV-1
US5627035A (en) 1990-08-22 1997-05-06 Syntello Vaccine Development Ab Peptides that block human immunodeficiency virus and methods of use thereof
GB9024129D0 (en) * 1990-11-06 1990-12-19 Thrombosis Research Trust Inhibitors and substrates of thrombin
WO1992020795A1 (en) 1991-05-17 1992-11-26 Cetus Oncology Corporation INHIBITOR OF NF-λB TRANSCRIPTIONAL ACTIVATOR AND USES THEREOF
NZ280932A (en) * 1995-02-07 1996-12-20 Mitsui Toatsu Chemicals Soil fumigant preparations; stick-shaped device comprising a water-soluble and/or biodegradable film incorporating a soil steriliser and/or a nematocide; ribbon and net shaped preparations; herbicide containing chloropicrin
US5817626A (en) * 1995-03-14 1998-10-06 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of beta-amyloid peptide aggregation
US5770620A (en) * 1995-06-19 1998-06-23 Ontogen Corporation Aryl acrylic acid derivatives useful as protein tyrosine phosphatase inhibitors
US5872210A (en) * 1995-10-05 1999-02-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Transframe peptide inhibitor of viral protease
DE69736976T2 (de) * 1996-03-29 2007-10-18 Trustees Of Boston University, Boston Mit Alzheimer Krankheit verknüpften Verfahren zur Diagnose, zur Herstellung von Medikamenten und zum Screenen von Substanzen sowie aus Beta-Amyloid abgeleiteten Peptiden
US6126939A (en) 1996-09-03 2000-10-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti-inflammatory dipeptide and pharmaceutical composition thereof
WO1998035062A1 (en) * 1997-02-07 1998-08-13 Lingappa Jaisri R Multistep, atp-dependent cell-free system for the assembly of human immunodeficiency virus capsids
US5843995A (en) 1997-07-07 1998-12-01 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Inhibition of HIV-1 replication using oligocarbamate derivatives
AU8912698A (en) 1997-08-19 1999-03-08 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Inhibition of hiv-1 replication using d-amino acid peptides
AU5556799A (en) * 1998-08-12 2000-03-06 University Of Virginia Patent Foundation Assay for assembly of herpes simplex virus capsid
US6455670B1 (en) * 2001-09-06 2002-09-24 Tripep Ab Pentamer peptide amide, ALGPG-NH2, that inhibits viral infectivity and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001010456A2 (en) 2001-02-15
US20020091086A1 (en) 2002-07-11
WO2001010456A3 (en) 2001-09-20
IL147969A0 (en) 2002-09-12
CN1377275A (zh) 2002-10-30
PL354090A1 (en) 2003-12-29
CA2378460A1 (en) 2001-02-15
IS6262A (is) 2002-02-08
MXPA02001344A (es) 2002-07-22
JP2003506410A (ja) 2003-02-18
EP1206273A2 (en) 2002-05-22
HUP0202502A2 (hu) 2002-11-28
CZ2002402A3 (cs) 2002-09-11
US6258932B1 (en) 2001-07-10
NO20020571L (no) 2002-04-05
AU5700800A (en) 2001-03-05
NO20020571D0 (no) 2002-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20020025970A (ko) 바이러스 감염성을 차단하는 펩티드 및 그 사용 방법
KR100269818B1 (ko) 인간 면역 결핍 바이러스(hiv-1) 억제제로서의 합성 폴리펩타이드
Bryant et al. Myristoylation-dependent replication and assembly of human immunodeficiency virus 1.
Yahi et al. SPC3, a synthetic peptide derived from the V3 domain of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) gp120, inhibits HIV-1 entry into CD4+ and CD4-cells by two distinct mechanisms.
CA2226860A1 (en) Novel replication competent human immunodeficiency virus type 2 (hiv-2) proviral clone designated hiv-2kr
OWENS et al. Oligopeptide inhibitors of HIV-induced syncytium formation
CN106749558B (zh) 广谱抑制hiv的脂肽、其衍生物、其药物组合物及其用途
US20070037249A1 (en) Molecules that block viral infectivity and methods of use thereof
AP502A (en) Multiple branch peptide constructions for use against HIV.
US6537967B1 (en) Pentamer peptide amide, ALGPGNH2, which inhibits viral infectivity and methods of use thereof
Pincus et al. Variants selected by treatment of human immunodeficiency virus-infected cells with an immunotoxin.
EP0323157A2 (en) Antiviral compounds and methods
JP3369585B2 (ja) ヒト免疫不全ウイルスの群特異性抗原の選択されたペプチド、その調製および使用
CA2317107C (en) Liposomes containing multiple branch peptide constructions for use against human immunodeficiency virus
Shoji et al. Antimyristoylation of GAG proteins in human T-cell lymphotropic and human immunodeficiency viruses by N-myristoyl glycinal diethylacetal
US6593455B2 (en) Tripeptide amides that block viral infectivity and methods of use thereof
US7285621B2 (en) Multiple branch peptide construction
Kappes Viral protein X
Degar et al. Replication of primary HIV-1 isolates is inhibited in PM1 cells expressing sCD4-KDEL
JP3725899B2 (ja) Ｈｉｖに対して使用するための多分岐ペプチド構築物
WO2006027699A2 (en) Rnaiii-inhibiting peptides for treating hiv infection
CA2047618A1 (en) Use of particular compounds for manufacture of pharmaceutical formulations for metabolic treatments
Fantini et al. Evaluation of multibranched peptides as inhibitors of HIV infection
Owens Biogenesis and function of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein
WO2005113059A2 (en) Disruption of the processing of the viral capsid-spacer peptide 1 protein

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid