KR19990087126A - 합성 사람 면역결핍 바이러스 유전자 - Google Patents

합성 사람 면역결핍 바이러스 유전자 Download PDF

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존 더블유 쉬버
메리-엘렌 데이비스
다니엘 씨 프리드
마가렛 에이 류
헬렌 씨 페리
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폴락 돈나 엘.
머크 앤드 캄파니 인코포레이티드
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Abstract

본원에는 HIV 유전자 및 HIV 유전자의 변형물을 암호화하는 합성 DNA 분자가 제공되어 있다. 이러한 합성 분자의 코돈은 프로젝트된 숙주 세포에 의해 선호된 코돈을 이용한다. 당해 합성 분자는 중화 항체 및 세포-매개된 면역을 통해 HIV 감염에 대한 효과적인 면역 예방을 제공하는 폴리뉴클레오티드 백신으로서 사용될 수 있다.

Description

합성 사람 면역결핍 바이러스 유전자
관련 출원에 대한 참조
본원은 1996년 2월 22일자로 출원된 미국 특허원 제60/012,082호에 관한 비-가출원이다.
연방 정부 지원 연구 개발에 관한 언급
해당 없음
마이크로피시 첨부에 대한 참조
해당 없음
1.HIV 감염:
사람 면역결핍 바이러스-1(HIV-1)은 후천성 사람 면역결핍증(AIDS) 및 이와 관련된 질환의 병인제이다. HIV-1은 레트로비리대(Retroviridae) 계열의 RNA 바이러스이고 모든 레트로바이러스의 5'LTR-gag-pol-env-LTR3' 구성을 나타낸다. 또한, HIV-1은 tat 및 rev 유전자를 포함하여, 조절성 기능 또는 공지되지 않은 기능을 갖는 소수의 유전자를 포함한다. env 유전자는 160-킬로달톤(kDa) 전구체(gp160)로서 해독된 다음 세포성 프로테아제에 의해 절단되어 외부 120-kDa 외막 당단백질(gp120)과 트랜스멤브레인 41-kDa 외막 당단백질(gp41)을 생성시키는 바이러스 외막 당단백질을 암호화한다. gp120과 gp41은 연결되어 있고 바이러스 입자와 HIV-감염된 세포 표면상에 나타난다. gp120은 헬퍼 T-임파구, 대식 세포 및 기타 표적 세포의 표면상에 존재하는 CD4 수용체에 결합된다. gp120이 CD4에 결합된 후, gp41은 바이러스 유입과 관련된 융합 사건을 매개한다.
바이러스 입자 상의 gp120이 T4 임파구 또는 기타 표적 세포의 표면상의 CD4 수용체와 결합되면 감염이 시작된다. 이와 같이 결합된 바이러스는 표적 세포와 합체되고 이의 RNA 게놈은 세포의 이본쇄 DNA로 역전사된다. 이러한 바이러스성 DNA는 세포 핵 내의 유전 물질내로 혼입되고, 여기서 상기 바이러스성 DNA는 새로운 바이러스성 RNA, 바이러스성 단백질 및 새로운 바이러스 입자의 생성을 지시한다. 새로운 입자를 표적 세포막으로부터 발아시켜 다른 세포를 감염시킨다.
면역 방어에 중요한 T4 임파구의 파괴가 HIV 감염의 특징인 진행성 면역 기능 장애의 주요 원인이다. 표적 세포의 상실은 대부분의 침입체와 싸우는 신체 방어 능력을 심각하게 손상시키지만, 바이러스, 진균, 기생충, 및 미코박테리아를 포함하는 특정 박테리아에 대한 방어에 특히 심각한 영향을 미친다.
HIV-1은 이를 복제하고, 이로부터 발아된 다음 세포막을 손상시킴으로써 감염된 세포를 사멸시킨다. HIV-1은 감염된 세포 표면상에 나타난 바이러스 gp120을 통해 표적 세포를 간접적으로 사멸시킬 수 있다. T 세포상의 CD4 수용체는 gp120에 대한 친화성이 강하기 때문에, CD4 수용체를 발현하는 건강한 세포는 gp120과 결합하고 감염된 세포와 융합되어 합포체(syncytium)를 형성할 수 있다. 합포체는 생존할 수 없다.
HIV-1는 또한 감염된 세포에 대한 정상의 세포성 면역 방어를 유발할 수도 있다. 항체의 도움하에 또는 도움없이, 세포독성 방어 세포는 이의 표면상에 바이러스성 단백질을 나타내는 감염된 세포를 파괴할 수 있다. 최종적으로, 유리 gp120이 HIV-1에 감염된 개체의 혈액 내에 순환될 수 있다. 이러한 유리 단백질이 감염되지 않은 세포의 CD4 수용체와 결합될 수 있어, 이들을 감염시켜 면역 반응을 야기시키는 것으로 여겨진다.
HIV-1의 감염은 항상 거의 치명적이며 현재, HIV-1 감염에 대한 치료약이 없다. HIV-1 감염을 예방하는데 효과적인 백신이 아직까지 시판되고 있지 않다. 격세유전 또는 감염의 위험으로 인해, 생 약독화된 바이러스는 아마도 백신으로서 사용될 수가 없다. 대부분의 아단위 백신 접근방식이 HIV 감염을 예방하는데 성공적이지 못하였다. 몇몇 감염된 사람의 수명을 연장시키면서 HIV-1 감염을 치료하는 것은 심각한 부작용을 나타낸다. 따라서, 이와 같은 치명적인 감염에 맞서는데 효과적인 치료법 및 백신에 대한 필요성이 크게 대두되고 있다.
2.백신
백신 접종이 질병 예방의 효과적인 형태이고 수 가지 유형의 바이러스 감염에 대하여 성공적인 것으로 입증되었다. 예방적 체액성 및 세포성 면역을 유발시키기 위하여 HIV-1 항원을 사람 면역 시스템에 공급하는 방법을 결정하는 것은 어려운 과제이다. 현재, 효과적인 HIV 백신을 발생시키기 위한 시도는 성공적이지 못하였다. AIDS 환자에 있어서, 유리 바이러스는 단지 저수준으로만 존재한다. HIV-1의 전달은 융합과 합포체 형성을 통하여 세포-대-세포 상호작용에 의해 고무된다. 따라서, 유리 바이러스 또는 바이러스성 아단위에 대하여 발생된 항체는 바이러스 감염된 세포를 제거하는데 있어서 일반적으로 비효과적이다.
백신은 항원을 "기억"하는 신체 능력을 이용하고 있다. 먼저 소정의 항원과 부딪친 후, 면역 시스템은 개체의 생애 동안 이러한 항원의 면역학적 기억을 보유하는 세포를 발생시킨다. 다음에 이러한 항원에 노출되면 면역 반응이 자극되어, 그 결과 상기 병원체가 제거되거나 불활성화된다.
면역 시스템은 병원체를 두 가지 방식으로 취급하는데, 즉 체액성 반응 및 세포-매개된 반응에 의해서이다. 체액성 반응에서는, 임파구가 상기 항원과 결합하는 특이적 항체를 발생시켜 병원체를 불활성화시킨다. 세포-매개된 반응은 감염된 세포를 특이적으로 공격하여 이를 파괴시키는 세포독성 및 헬퍼 T 임파구를 포함한다.
HIV-1 바이러스를 이용한 백신 개발은 HIV-1가 동일한 세포의 일부를 감염시키기 때문에 백신이 면역 시스템(즉, T4 임파구) 내에서 활성화되어야 할 필요가 있다는 문제점을 나타내고 있다. 면역 시스템에 대한 손상이 일어나기 이전에 HIV를 불활성화시키는 백신을 개발하는 것이 유리하다. 특히 적합한 유형의 HIV 백신은 HIV 변이체를 인식하고 이들의 감염이 시작되는 HIV 양성 개체에서 작용하는 항-HIV 면역 반응을 발생시킬 것이다.
바이러스, 특히 중화성 및 보호성 면역 반응의 유도를 목적으로 하는, 사람 면역결핍 바이러스와 같이 돌연변이 속도가 높은 바이러스에 대한 백신을 개발하는데 있어서 주요 난제는 상이한 바이러스 분리물 또는 균주 간의 바이러스성 외막 단백질이 다양하다는 것이다. 마우스와 사람 모두에 있어서 세포독성 T-임파구(CTL)는 보존된 내부 바이러스 단백질로부터 유도된 에피토프를 인지할 수 있고 바이러스에 대한 면역 반응에 중요한 것으로 사료되기 때문에, 상이한 바이러스 균주에 대한 이종 보호를 제공할 수 있는 CTL 백신을 개발하고자 한 노력들이 있어왔다.
CD8+ CTL는 이의 T 세포 수용체가 MHC 부류 Ⅰ 분자와 결합된 바이러스성 펩타이드를 인식할 때 바이러스 감염된 세포를 사멸시키는 것으로 공지되어 있다. 이러한 바이러스성 펩타이드는 바이러스 내에서의 단백질의 위치 또는 기능에 상관없이 내인성으로 합성된 바이러스성 단백질로부터 유도된다. 따라서, 보존된 바이러스성 단백질로부터 에피토프를 인식함으로써, CTL는 교차-균주 보호를 제공할 수 있다. CTL 인식을 위해 MHC 부류 Ⅰ과 결합할 수 있는 펩타이드는 세포질 또는 소포체 내에 존재하거나 이를 통과하는 단백질로부터 기원된다. 일반적으로, 엔도솜 프로세싱 경로로 들어가는(MHC 부류 Ⅱ 분자에 의해 제시된 항원의 경우에서와 같이) 외인성 단백질은 CD8+ CTL 반응을 발생시키는데 효과적이지 못하다.
CTL 반응을 발생시키기 위한 대부분의 노력들은 벡터를 복제시켜 세포 내에 단백질 항원을 생성시키는데 사용되어 왔거나 펩타이드를 사이토졸 내로 도입하는 것에 초점을 맞춰왔다. 이러한 접근법들은 백신으로서의 유용성을 감소시킬 수도 있다는 단점을 지니고 있다. 레트로바이러스성 벡터는 재조합 바이러스의 복제 능력은 유지시키면서 융합 단백질로서 발현될 수 있는 폴리펩타이드의 크기와 구조 상의 제한이 있으며, 후속 면역화를 위한 백시니아와 같은 벡터의 효능이 벡터 자체에 대한 면역 반응에 의해 위태할 수도 있다. 또한, 바이러스성 벡터 및 변형된 병원체는 이들을 사람에게 사용하는 것을 방해할 수 있는 위험을 본래 지니고 있다. 더욱이, 표현될 펩타이드 에피토프의 선별은 개체의 MHC 항원의 구조에 의존적이기 때문에, 펩타이드 백신은 이계교배된 집단에서의 MHC 단순유형의 다양성으로 인해 제한된 효능을 지닐 수 있다.
3.DNA 백신
문헌[참조:Benvenisty, N., and Reshef, L.[PNAS 83, 9551-9555, (1986)]]에는 마우스 내로 복강내, 정맥내 또는 근육내 도입된 CaCl2-침전된 DNA가 발현될 수 있는 것으로 나타났다. 마우스에서 CaCl2처리없이 DNA 발현 벡터를 근육내 주사하면, 근육 세포에 의해 DNA가 흡수되고 이러한 DNA에 의해 암호화된 단백질이 발현된다. 이러한 플라스미드는 배체적으로 유지되고 복제되지는 않는다. 연속적으로, 랫트, 어류 및 영장류의 골격근 및 랫트의 심근에서 근육내 주사한 후에 안정적인 발현이 관찰되었다. 치료제로서 핵산을 사용하는 기술은 국제공개공보 WO 90/11092(1990년 10월 4일)에 보고되었으며, 여기서는 프로세싱되지 않은 폴리뉴클레오티드를 사용하여 척추동물에게 백신 접종한다.
상기 방법이 성공하기 위해서 면역화가 근육내 투여이어야 할 필요는 없다. 소의 성장 호르몬(BGH)을 암호화하는 DNA로 피복된 골드 마이크로포사체를 마우스의 피부 내로 도입하면 마우스에서 항-BGH 항체가 생산된다. 젯트 주입기를 사용하여 살아있는 동물의 피부, 근육, 지방 및 유선 조직을 형질감염시킨다. 핵산을 도입하기 위한 각종 방법이 검토되었다. 마우스에서 DNA:양이온성 리포좀 복합체를 정맥내 주사하여 클로닝된 형질유전자를 전신계 발현시키는 것이 문헌[참조:Zhu et al., Science 261:209-211(1993년 7월 9일)]에 나타나있다. 문헌[참조:Ulmer et al., Science 259:1745-1749(1993)]에는 인플루엔자 바이러스 단백질을 암호화하는 DNA를 근육내 주사함으로써 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 이종 보호에 관해 보고되어 있다.
병원체와 종양 항원에 대하여 목적하는 면역 반응을 유도할 수 있는 특정한 치료제 및 예방제에 대한 필요성이 본 발명에 의해 충족된다. 이러한 치료학적 접근 방식에서 특히 중요한 것은 항원 유전자가 수득되는 균주와 이종인 바이러스 균주에 의해서 야기된 질병 또는 감염을 방지할 수 있는 T 세포 면역 반응을 유도하는 능력이다. 이는 HIV가 신속하게 돌연변이된다고 인식되어 왔고 수 많은 발병성 분리물이 동정되었기 때문에[예를 들면, 245가지의 별개의 HIV 분리물을 동정하는 LaRosa et al., Science 249:932-935(1990) 참조], 상기 바이러스를 다룰 때 특히 우려된다. 이와 같이 인식된 다변성에 대응하여, 연구자들은 펩타이드 면역화를 근거로 하여 CTL을 발생시키고자 하였다. 따라서, 문헌[참조:Takahashi et al., Science 255:333-336 (1992)]에는 HIV 외막(gp160) 결정기를 인식하는 광범위하게 교차 반응성인 세포독성 T 세포의 유도에 관해 보고되어 있다. 그러나, 상기 저자들은 진정하게 교차 반응성인 CTL 반응을 달성하기가 어렵다는 것을 인식하였으며 매우 엄격한 T 세포를 프라이밍 또는 재자극시키는 것과 이미 자극된 CTL로부터 유효인자 기능(세포독성 포함)을 유발시키는 것은 이분된다고 제안하였다.
왕(Wang) 등은 클로닝된 게놈성 (스플라이싱되지 않은) HIV 유전자를 근육내 접종함으로써 마우스에서 HIV에 대한 면역 반응을 유도하는 것에 관해 보고하였다. 그러나, 이러한 연구에서 성취된 면역 반응도는 매우 낮다. 또한, 왕 등은 DNA 작제물은 인접한 Tat/REV-gp160-Tat/REV 암호화 서열을 암호화하는 HIV의 필수적 게놈 조각을 활용하였다고 보고하였다. 다음에 상세히 기술되는 바와 같이, 이는 gp160을 고도로 발현시키기 위한 서브옵티말 시스템(suboptimal system)이다. 이는 또한, Tat의 발현이 카포시 육종의 진행에 기여하기 때문에 잠재적으로 위험하다.
WO 93/17706에는 바이러스에 대항하여 동물에게 백신 접종하는 방법이 기재되어 있는데, 여기서는 담체 입자를 유전자 작제물로 피복하고 이와 같이 피복된 입자를 특정 동물 세포 내로 가속 주입한다. HIV에 관해서는, 본질적으로는 전체 게놈 마이너스 긴 말단 반복물 (LTR)이 사용되는 것으로 제안되었다. 이러한 방법은 수용체에 대해 상당한 위험을 내포하고 있다. 일반적으로, HIV의 작제물은 백신의 안전성을 보장받기 위하여 HIV 게놈을 약 50% 미만 함유하여야 한다고 여겨져왔으며, 이는 효소적 잔기 및 바이러스성 조절 단백질(이들 중 다수는 공지되어 있지 않거나 잘 이해되지 않은 기능을 지닌다)이 제거되었다는 것을 보장해준다. 따라서, 유용한 사람 HIV 백신이 유전자-운반 기술로부터 창출되는 경우에는 수 많은 문제점이 남게된다.
본 발명은 폴리뉴클레오티드를 살아있는 조직 내로 도입하여 단백질 발현을 유도하는 공지된 어떠한 방법도 포괄한다. 그러나, 본 발명은 HIV 및 기타 단백질을 항원 프로세싱 경로에 도입하여 HIV-특이적 CTL 및 항체를 효과적으로 발생시키기 위한 신규의 면역원(immunogen)을 제공한다. 이러한 약제는 세포성 및 체액성 항-HIV 및 HIV 중화 면역 반응 모두를 유도하기 위한 백신으로서 유효하다. 본 발명에 있어서, 앞서 인지된 문제점에 역점을 두었으며 이러한 문제점은 동물 내로 도입될 때 상기 방법과 연관된 부수의 위험없이 HIV 단백질 및 에피토프의 효과적인 발현을 지시하는 폴리뉴클레오티드 면역원을 제공함으로써 해결되었다. 따라서, 이로써 발생된 면역 반응은 HIV를 인식하고, HIV 복제를 억제하며, HIV에 감염된 세포를 동정하고 이를 사멸시키는데 유효하며 수 많은 HIV 균주에 대해 교차 반응성이다.
4.코돈 활용 및 코돈 컨텍스트(context)
유기체의 코돈 짝짓기는 고도로 정교하며 유기체마다 상이하다. 이러한 정보를 이용하여 목적하는 해독 효율를 갖는 변형된 또는 합성 유전자를 작제 및 발현시키고, 게놈 내의 일정 영역이 단백질 암호화 영역인지를 결정하고, 해독 휴지 부위를 이종 유전자 내로 도입하며, 뉴클레오티드 서열의 관계 또는 모세포 기원 여부를 확인한다.
형질전환된 유기체 내에서 외래 이종 유전자를 발현시키는 것은 현재 통상적인 일이다. 예를 들면, 쥐 및 사람 유전자를 포함하여 다수의 포유동물 유전자가 단일 세포 유기체내로 성공적으로 삽입된 바 있다. 이와 관련한 표준 기술은 플라스미드 또는 파아지와 같은 벡터 내로 발현될 외래 유전자를 도입하고 이러한 벡터를 이용하여 상기 유전자를 유기체 내로 삽입하는 것을 포함한다. 이러한 유전자에 대한 천연 프로모터는 유전자가 삽입되는 숙주에 적합한 강력한 프로모터로 통상 대체된다. 단백질 서열 분석 기기는 심지어 미량의 천연 단백질의 아미노산 서열도 밝혀준다. 이러한 아미노산 서열로부터, 이들 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 추론할 수 있다. DNA 합성은 또한 신속하게 개발되고 있는 분야이며 이와 같이 추론된 DNA 서열에 상응하는 합성 유전자를 용이하게 작제할 수 있다.
발현 시스템과 재조합 DNA에 관한 기술이 급격히 발전하고 있음에도 불구하고, 외래 또는 합성 유전자를 특정 유기체 내에서 발현시키고자 하는 경우에는 상당한 어려움이 있다. 예를 들면, 수많은 천연의 활성 단백질이, 이들이 외래 숙주 내에서 발현될 때 발생되는 것과 상이한 방식으로 글리코실화된다. 이러한 이유로, 효모와 같은 진핵 숙주는 많은 포유동물 유전자를 발현시키기 위해 박테리아성 숙주 보다 바람직할 수 있다. 글리코실화 문제는 지속적인 연구 과제이다.
또 다른 문제점은 보다 더 불충분하게 인지되고 있다. 강한 프로모터와 커플링된 경우일지라도 합성 유전자의 빈번한 해독이 예상할 수 있는 것보다 훨씬 덜 효과적으로 진행된다. 발현 유기체에 대한 외인성 유전자 외래물에 대해서도 종종 상기와 같이 적용된다. 회수 가능한 양의 해독 산물을 생성시키는, 상당히 효과적인 방식으로 상기 유전자가 전사되는 경우일지라도, 단백질은 종종 불활성이거나 천연 단백질과는 성질면에서 상이하다.
후자의 문제점은 각종 유기체에서의 단백질 폴딩의 차이에 통상 기인된 것으로 인식되고 있다. 이러한 문제점에 대한 해결책을 찾기가 어려우며 단백질 폴딩을 조절하는 기전을 파악하기도 어렵다.
해독 효능과 관련된 문제점은 코돈 컨텍스트 영향과 관련되는 것으로 여겨진다. 모든 유기체에서 유전자의 단백질 암호화 영역에는 광범위한 기능성 구속이 가해지는데, 이들 중 몇몇은 적절하게 기능하는 단백질뿐만 아니라 적당한 해독 개시 및 정지 시그날을 암호화하는데 필수적인 사항에 달려 있다. 그러나, 단백질 암호화 영역의 몇몇 양상이 식별되었는데, 이는 상기 구속 요인 측면에서 용이하게 이해되지는 않는다. 이러한 양상의 두 가지 중요한 부류는 코돈 활용 및 코돈 상황과 관련이 있다.
코돈 활용이 한쪽으로 상당히 치우쳐져 있고 상이한 유기체마다 매우 다양하다는 것은 공지되어 있다. 코돈 활용 패턴은 tRNA 동종수용체의 상대적인 많고 적음과 관련되는 것으로 나타났다. 다량의 단백질을 암호화하느냐 혹은 소량의 단백질을 암호화하느냐에 따라서 이를 암호화하는 유전자는 이들의 코돈 선호도에 있어서 차이를 나타낸다. 코돈 활용에서 한쪽으로 치우치는 것이 펩타이드 연장율을 변화시킬 수 있다는 가능성이 광범위하게 논의되었다. 코돈 사용에 있어서의 차이가 해독 속도의 차이와 연관되기는 하지만, 해독에 대한 코돈 선택의 직접적인 영향을 설명하기는 어려웠다. 코돈 활용 패턴에 대하여 제안된 기타 구속 요인으로는 해독의 충실성을 최대화하는 것과 단백질 합성의 역학적 효능을 최적화시키는 것이 있다.
코돈을 규칙적으로 사용하는 것과 별개로, 코돈/안티코돈 인식이 코돈 자체의 외부 서열에 의해 영향을 받는다는 상당한 근거가 축적되었으며, 이러한 현상은 "코돈 컨텍스트"로 칭해진다. 가까이 있는 뉴클레오티드는 넌센스 코돈 뿐만 아니라 미스센스 코돈의 억제 효능에 대하여 강력한 영향력을 지니고 있다. 명백하게, 천연 박테리아 집단에서 억제인자 활성이 풍부하기 위해서 뿐만 아니라 셀레노시스테인 및 포스포세린을 암호화하는 "종결" 코돈을 사용하기 위해서는 종결이 컨텍스트-의존적이어야 한다. 유사한 컨텍스트 효과가 해독의 충실성뿐만 아니라 해독 개시의 효능에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
이. 콜라이(E.coli)의 단백질 암호화 영역의 통계학적 분석 결과, 또 다른 "코돈 컨텍스트"가 나타났다. 한 위치에 특정한 유전자가 존재하는 것이 이웃하는 코돈에서의 특정 뉴클레오티드의 발생 빈도에 강하게 영향을 미치며, 이들 컨텍스트 구속요인은 유전자가 높은 수준으로 발현되느냐 낮은 수준으로 발현되느냐에 따라서 현저하게 상이하다. 컨텍스트 효과가 인식되긴 하였지만, 코돈에 인접한 바람직한 뉴클레오티드와 관한 통계학적 규칙의 예상값은 비교적 낮다. 이로써, 목적하는 해독 효율을 달성시키는 코돈을 선택하기 위해 상기 뉴클레오티드 선호도 테이터를 이용하는 것이 제한된다.
자동화 뉴클레오티드 서열 분석 기기의 출현으로 인해, 광범위한 유기체에 대한 다량의 서열 데이터를 이용할 수 있었다. 이들 데이터를 이해하는 것에는 상당한 어려움이 따른다. 예를 들면, 유전자 서열 데이터를 단백질 서열과 관련짓기 위해서는 게놈의 암호화 영역을 동정하는 것이 중요하다. 또한, 특정 유기체의 게놈의 조상이 상당히 흥미롭다. 몇몇 유기체의 게놈이 혼합된 조상을 갖는다는 것은 공지되어 있다. 기원이 바이러스성인 몇몇 서열은 현재 안정적으로 진핵 유기체의 게놈 내로 혼입된다. 바이러스성 서열 자체는 실질적으로 관련되지 않은 또 다른 종으로부터 기원될 수 있다. 특정 유전자의 조상을 이해하는 것은 다른 유기체에서 관련 유전자와 이들의 해독 산물간의 적절한 유사성을 묘사하는데 중요할 수 있다.
해독에 대한 코돈 컨텍스트 효과를 보다 잘 이해하는 것이 필요하고, 또한 목적하는 어떠한 해독 효과에 대한 적당한 코돈을 결정하는 방법이 필요하다. 또한, 뉴클레오티드 서열 데이터로부터 게놈의 암호화 영역을 동정하는 방법이 필요하다. 단백질 폴딩을 조절하고 외래 유전자가 숙주 내에서 발현될 때 적절하게 폴딩되게 해주는 방법이 필요하다. 목적하는 해독 효능에 따라서 변형되거나 작제된 유전자가 상당한 가치가 있다.
산업상 및 약제학적으로 관심있는 단백질을 미생물에 의해 발현시키기 위한 재조합 DNA 기술을 실시하는 또 다른 국면이 "코돈 선호도"의 현상이다. 목적하는 소정의 생성물을 작제하기 위해 "사용"할 유전자 발현을 위해 존재하는 구조가 유전적으로 형질전환된 숙주 세포라는 것은 선행 기술분야에서 인식되어 왔지만, 특정 미생물 내에서 획득된 발현 정도는 삽입된 외인성 유전자 내에 존재하는 아미노산-특이적 유전자 코드의 특정 대체 형태에 일부 근거하여 다양하게 변할 수 있다. 4개의 가능한 뉴클레오티드 염기의 "트리플" 코돈은 64가지의 다양한 형태로 존재할 수 있다. 이들 형태가 단지 20개의 상이한 아미노산에 대한 메시지(및 전사 개시 및 종결)만을 제공한다는 것은 몇몇 아미노산이 하나 이상의 코돈에 의해서 암호화될 수 있다는 것을 의미한다. 실제로, 몇몇 아미노산은 6개 정도로 많은 "중복"되는 대체 코돈을 갖는 반면, 몇몇 기타 아미노산은 단일의 요구되는 코돈만을 갖는다. 완전하게 이해되지 않았기 때문에, 대체 코돈은 상이한 유형의 세포의 내인성 DNA에 모두 균일하게 존재하는 것은 아니며 특정 유형의 세포 내에 특정 코돈에 대한 이용 가능한 천연의 분류체계 또는 "선호도"가 존재하는 것으로 보인다.
한 예로서, 아미노산 루이신은 CTA, CTC, CTG, CTT, TTA 및 TTG(이는 각각 mRNA 코돈인 CUA, CUC, CUG, CUU, UUA 및 UUG에 상응한다)를 포함하는 6가지 DNA 코돈 중의 어느 하나에 의해 특정화된다. 미생물에 대한 게놈 코돈 빈도의 소모적인 분석 결과, 이. 콜라이의 내인성 DNA는 대부분 통상적으로 CTG 루이신-특정화 코돈을 함유하는 반면, 효모 및 점균류의 DNA는 대부분 통상적으로 TTA 루이신-특정화 코돈을 함유하고 있다. 이러한 분류체계 관점에서, 이. 콜라이 숙주에 의해서 루이신이 풍부한 폴리펩타이드를 고도로 발현시킬 수 있는 가능성은 어느 정도는 코돈 사용의 빈도에 좌우될 것이라는 것이 일반적으로 알려져 있다. 예를 들면, TTA 코돈이 풍부한 유전자는 아마도 이. 콜라이에서 덜 발현될 것인 반면, CTG 코돈이 풍부한 유전자는 아마도 상기 폴리펩타이드를 고도로 발현할 것이다. 유사하게, 효모 세포가 루이신 풍부한 폴리펩타이드의 발현을 위해 프로젝트된 형질전환 숙주 세포인 경우, 삽입된 DNA에 사용하기에 바람직한 코돈은 TTA일 것이다.
코돈 선호도 현상이 재조합 DNA 기술에 대하여 밀접한 관계에 지니고 있는 것으로 나타났고, 이러한 현상은 성공적으로 형질전환된 숙주 유기체에서 외인성 유전자의 고도의 발현을 달성시키는데 실패한 선행 분야의 수많은 사례를 설명해줄 수 있으며 덜 "우선적인" 코돈은 삽입된 유전자 내에 반복적으로 존재할 수 있으며 발현을 위한 상기 숙주 세포 구조는 효율적으로 작용하지 않을 수 있다. 이러한 현상은 프로젝트된 숙주 세포의 우선적인 코돈을 포함하는 것으로 고안된 합성 유전자가 재조합 DNA 기술을 실시하는데 바람직한 형태의 외래 유전 물질을 제공한다는 것을 제시하고 있다.
5.단백질 트래픽킹(trafficking)
진핵 세포를 상징하는 기능의 다양성은 이들 막 경계물의 구조적 차이에 좌우된다. 이들 구조물을 발생시키고 유지시키기 위해서는, 단백질이 소포체 내의 이들의 합성 부위로부터 세포 전반에 걸쳐 예정된 목적지로 수송되어야만 한다. 이를 위해서는, 트래픽킹 단백질이, 주 트래픽킹 경로에 근접한 지점에 위치한 루트 선별에 관여하는 분자상 구조에 의해 인식되는 분류 시그날을 나타내야 한다. 대부분의 단백질은 이들의 최종 목적지, 즉 이들이 이들의 기능을 수행하는 세포내 위치가 이들의 영구적인 거주지가 되기 때문에 상기 대부분의 단백질에 대한 분류 결정이 단지 1회에 이루어질 필요가 있다.
세포내 통합성의 유지는 단백질을 선별적으로 분류하고 이들을 이들의 정확한 목적지로 정확하게 수송하는 것에 부분적으로 좌우된다. 과거 수년동안, 단백질을 표적화하고 이의 위치설정을 위하여 분자상 구조를 정밀 조사하는 것이 활발하게 연구되어 왔다. '어드레스 라벨'로서 작용할 수 있는 단백질에 대하여 제한된 서열 모티브가 동정되었다. 수많은 분류 시그날이 막 단백질의 세포질성 도메인과 결합된 채로 발견되었다.
발명의 요약
HIV env 및 HIV env의 변형물을 암호화하는 합성 DNA 분자가 제공되어 있다. 이러한 합성 분자의 코돈은 프로젝트된 숙주 세포의 우선적인 코돈을 포함한다. 이러한 합성 분자는 바람직한 형태의 외래 유전 물질을 제공해준다. 당해 합성 분자는 중화 항체 및 세포-매개된 면역성을 통하여 HIV 감염에 대한 효과적인 면역예방제를 제공하는 폴리뉴클레오티드 백신으로서 사용할 수 있다. 본 발명은 영장류 및 사람과 같은 포유동물을 포함하여 생체내에서 척추동물에게 직접적으로 주입될 때 이러한 동물 내에서 암호화된 단백질의 발현을 유도시키는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
HIV 백신.
도 1은 HIV env 카셋트-근거한 발현 방법을 도시한 것이다.
도 2는 DNA 백신 매개된 항-gp120 반응을 도시한 것이다.
도 3은 쥐의 DNA 백신 혈청의 항-gp120 ELISA 역가를 도시한 것이다.
도 4는 HIV env PNV 세포 배양물 형질감염후, gp120의 상대적 발현을 나타낸 것이다.
도 5는 tPA-gp143/optA 대 optB DNA 백신 접종을 수행한 후 평균 항-gp120 ELISA 반응을 도시한 것이다.
도 6은 쥐의 DNA 백신 혈청에 의한 HIV의 중화를 도시한 것이다.
도 7은 쥐의 HIV env DNA 백신으로부터 혈청에 의한 HIV 중화를 도시한 것이다.
도 8은 최적화된 HIV env DNA 작제물의 면역블롯 분석이다.
HIV env를 암호화하는 합성 DNA 분자 및 변형된 형태의 HIV env를 암호화하는 합성 DNA 분자가 제공된다. 이러한 합성 분자의 코돈은 프로젝트된 숙주 세포에 의해 우선적으로 선택된 코돈을 사용하도록 고안된다. 이러한 합성 분자는 중화 항체 및 세포-매개된 면역성을 통하여 HIV 감염에 대한 효과적인 면역예방제를 제공하는 폴리뉴클레오티드 백신으로서 사용할 수 있다. 당해 합성 분자는 면역원성 조성물로서 사용할 수 있다. 본 발명은 영장류 및 사람과 같은 포유동물을 포함하여 생체내에서 척추동물에게 직접적으로 주입될 때 이러한 동물 내에서 암호화된 단백질의 발현을 유도시키는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 살아있는 척추동물 세포 내로 도입될 때 폴리뉴클레오티드가 세포내 구조물을 지시하여 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산에 의해 암호화된 해독 산물을 생성시킬 수 있도록 조절 인자를 함유하는 핵산의 조합물이다. 본 발명의 한 양태에서는, 이러한 폴리뉴클레오티드가 전사 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 HIV 유전자를 포함하는 폴리데옥시리보핵산이다. 본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 폴리뉴클레오티드 백신(PNV)은 진핵 세포내 구조물(리보좀, tRNA, 및 기타 해독 인자)에 의해 기꺼이 해독될 수 있는 하나 이상의 HIV 유전자를 암호화하는 폴리리보핵산을 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 단백질이 후천성 면역 결핍증(AIDS)의 병인제인 사람 면역결핍 바이러스(HIV)와 연관된 단백질과 같이 병리학적 상태에 있는 동물을 제외한 동물에서는 정상적으로 발생되지 않는 단백질(즉, 이종 단백질)인 경우, 이러한 동물의 면역 시스템을 활성화하여 보호성 면역 반응을 개시시킨다. 이들 외인성 단백질은 동물의 조직에 의해 생성되기 때문에, 발현된 단백질은 관련 유기체(HIV)로의 실제적인 감염이 발생되는 경우와 유사한 방식으로 주요 조직적합성 시스템(MHC)에 의해 프로세싱된다. 그 결과, 동족의 병원체에 대하여 면역 반응이 유도된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 생물학적 시스템 내로 도입하는 경우, 이는 HIV 단백질 및 에피토프의 발현과 특이적 면역 반응의 생성을 유도시킨다. 이와 같이 유도된 항체 반응은 발현된 HIV 단백질에 대해 특이적이어서 HIV를 중화시킨다. 또한, HIV 감염된 세포를 특이적으로 인식하여 이를 파괴시키는 세포독성 T-임파구(CTL)가 유도된다.
본원은 포유동물 조직 내로의 도입시 별개의 유전자 생성물의 단일 세포 내에서 생체내 발현을 유도시키는 폴리뉴클레오티드의 사용 방법을 제공한다. 본원은 REV와 독립적인 유전자를 획득하기 위해서 REV 의존적 HIV 유전자를 다수 조작해야할 필요가 없는 해결책을 제공해준다. 본원에 기술된 REV와 독립적인 발현 시스템은 당연히 유용하며 목적하는 단일 유전자 생성물의 단일 세포내에서 생체내 발현을 설명해주는 시스템이다.
본 발명의 수많은 용도가 항바이러스 백신 접종에 적용되기 때문에, 당해 폴리뉴클레오티드는 종종 폴리뉴클레오티드 백신 또는 PNV로서 지칭된다. 이는 면역 자극 및 항종양 치료에 있어서의 이들 폴리뉴클레오티드의 부가의 용도가 본 발명의 범위를 벗어난다고 할 수는 없다.
한 양태에 있어서, HIV 유전자 생성물을 암호화하는 유전자를 발현 백터 내로 혼입시킨다. 이러한 벡터는 진핵 RNA 폴리머라제에 의해 인식된 전사 프로모터, 및 HIV 유전자 암호화 서열의 말단에 있는 전사 터미네이터를 함유한다. 바람직한 양태에 있어서, 상기 프로모터는 인트론 A 서열을 갖는 사이토메갈로바이러스 프로모터이지만, 당해 분야의 숙련자는 강력한 면역글로불린과 같이 공지된 다수의 어떠한 프로모터 또는 진핵 유전자 프로모터도 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 바람직한 전사 터미네이터는 소의 성장 호르몬 터미네이터이다. CMVintA-BGH 터미네이터의 조합물이 특히 바람직하다.
원핵 세포에서의 당해 폴리뉴클레오티드의 제조를 보조하기 위하여, 항생제 내성 마커를 발현 벡터 내에 포함시킬 수 있으며; 이러한 마커는 마커의 발현이 진핵 세포에서는 일어나지 않도록 원핵 프로모터의 전사 조절하에 있을 수 있다. 앰피실린 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자 및 기타 약제학적으로 허용되는 항생제 내성 마커가 사용될 수 있다. 원핵 유기체에서의 발효에 의해 당해 폴리뉴클레오티드를 고 수준으로 생성시키는 것을 보조하기 위해서는, 상기 벡터가 원핵 복제 기점을 함유하고 높은 복제수인 것이 유리할 수 있다. 수많은 시판용 원핵 클로닝 벡터가 이러한 잇점을 제공해준다. 비-필수 DNA 서열을 제거하고 상기 벡터가 진핵 세포에서는 복제할 수 없도록 하는 것이 바람직하다. 이로써, 폴리뉴클레오티드 백신 서열이 수용체 게놈과 통합되는 위험을 최소화한다. 당해 폴리뉴클레오티드의 발현을 특정한 조직 유형으로 제한하는 것이 바람직한 경우에는 언제든지 조직-특이적 프로모터 또는 인핸서를 사용할 수 있다.
한 양태에 있어서, 발현 벡터 pnRSV가 사용되는데, 여기서는 라우스 육종 바이러스(RSV) 긴 말단 반복체(LTR)가 프로모터로서 사용된다. 또 다른 양태에서는, CMV 프로모터와 BGH 전사 터미네이터가 클로닝된 돌연변이된 pBR322 벡터, V1이 사용된다. 또 다른 양태에서는, V1 및 pUC19의 요소들을 조합하여 V1J로 명명된 발현 벡터를 생성시켰다. V1J 또는 또 다른 바람직한 발현 벡터 내로, gp120, gp41, gp160, gag, pol, env 등의 HIV 유전자, 또는 항-HIV 면역 반응을 유도할 수 있는 기타 어떠한 HIV 유전자를 클로닝시킨다. 또 다른 양태에서는, 앰피실린 내성 유전자를 V1J로부터 제거하고 네오마이신 내성 유전자로 대체하여, 본 발명에 따라서 사용하기 위하여 상이한 HIV 유전자가 클로닝된 V1J-neo를 발생시킨다. 또 다른 양태에서는, 상기 벡터가 V1Jns인데, 이는 독특한 Sfi1 제한 부위를 V1J-neo의 2114번 위치에서 단일 Kpn1 부위 내로 공학적 처리시켰다는 점을 제외하고는 V1Jneo와 동일하다. 사람 게놈 DNA에서의 Sfi1 부위의 발생율은 극히 낮다(100,000개 염기당 대략 1개 부위). 따라서, 이러한 벡터는 추출된 게놈 DNA를 단순히 Sfi1 분해시킴으로써 숙주 DNA으로의 발현 벡터의 통합에 관해 조심스럽게 모니터할 수 있게 해준다. 추가의 정련에서는 상기 벡터가 V1R이다. 이러한 벡터에서는, 가능한 한 많은 비-필수 DNA가 상기 벡터로부터 "트리밍(trimming)"되어 고도로 조밀한 벡터를 생성시킨다. 이러한 벡터는 V1Jns의 유도체이다. 상기 벡터는 보다 큰 삽입물이 사용될 수 있게 해주는데, 이로써 바람직하지 못한 서열이 암호화되고 세포에 의한 흡수가 최적화된다는 우려가 덜해진다.
본 발명의 한가지 양태에서는, HIV gp160, gp120, gag, 및 SF2, ⅢB 또는 MN 등의 실험실용으로 만든 HIV 균주로부터의 기타 유전자 생성물을 암호화하는 유전자를 혼입시킨다. 당해 분야의 숙련자는 HIV-1로부터의 유전자와 유사한 기능을 지닌 HIV-2 균주로부터의 유전자를 사용하는 것이 HIV-1 작제물에 대해 본원에서 사용된 것과 유사한 면역 반응을 발생시키는 것으로 예상될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이들 유전자를 수득하기 위한 클로닝 및 조작 방법은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다.
실험실용으로 만든 HIV 균주에 대한 면역 반응을 이끌어내는 것이 HIV의 1차 분리물의 중화를 제공하는데 적합하지 않을 수도 있다고 인지된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서는, 병발성인 HIV의 1차 분리물로부터의 유전자를 당해 폴리뉴클레오티드 면역원에 혼입시킨다. 이는 바이러스성 유전자의 cDNA 복사물을 제조한 다음 개개의 유전자를 상기 폴리뉴클레오티드 면역원 내로 서브클로닝시킴으로써 수행한다. 많은 HIV 균주의 많은 유전자에 대한 서열이 현재 유전자뱅크(GENEBANK)로부터 입수 가능하고 이러한 HIV의 1차 분리물은 이들 균주가 입수 가능해지도록 회사[Quality Biological, Inc., 7581 Lindbergh Drive, Gaithersburg, Maryland 20879]와 계약한 내쇼날 인스티튜트 오브 알러지 앤드 인펙셔스 디지즈(NIAID)로부터 입수 가능하다. 이러한 균주는 또한, 국제 보건 기구(WHO)[Network for HIV Isolation and Characterization, Vaccine Development Unit, Office of Research, Globa Programme on AIDS, CH-1211 Geneva 27, Switzerland]로부터 입수 가능하다. 이러한 작업으로부터, 당해 분야의 숙련자는 본 발명의 용도 중의 하나가 HIV 서열 다양성과 HIV 중화의 혈청학간의 상관관계뿐만 아니라 기타 파라미터가 만들어질 수 있도록 생체 내에서뿐만 아니라 시험관내에서의 시험 및 분석용 시스템을 제공하는 것이라는 것을 인식할 것이다. HIV 균주의 1차 분리물로부터의 유전자의 혼입은 상기 바이러스의 임상적 분리물에 대하여 면역 반응을 유도시키는 면역원을 제공하므로 아직까지 상기 분야에서 충족되지 않았던 바와 같이 필요성을 충족시켜준다. 더욱이, 발병성 분리물이 변화됨에 따라, 상기 면역원을 변형시켜 새로운 서열을 필요에 따라 반영할 수 있다.
용어를 일관되게 하기 위하여, 폴리뉴클레오티드 면역원 작제물을 기술하는데 본원에서 다음과 같이 약정한다: "벡터명-HIV 균주-유전자-부가 요소". 따라서, MN 균주의 gp160 유전자가 발현 벡터 V1Jneo 내로 클로닝되는 작제물의 명칭은 본원에서 "V1Jneo-MN-gp160"으로 제시된다. 작제물에 가해지는 부가의 요소는 다음에 상세히 기술된다. 바이러스의 병인성 균주가 변화됨에 따라, 약제에 혼입하기에 최적인 정확한 유전자도 변할 수 있다. 그러나, 다음에 나타낸 바와 같이, 이종 균주로부터 보호시킬 수 있는 CTL 반응이 유도되기 때문에, 균주 변이성이 완전 바이러스 또는 아단위 폴리펩타이드 근거 백신과 비교할 때 본 발명의 면역원 및 백신에 있어서 덜 결정적이다. 또한, 약제는 용이하게 조작되어 새로운 유전자 내로 삽입되기 때문에, 이는 분자 생물학의 표준 기술에 의해 용이하게 조정된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제가 결합되는 DNA 쇄 상의 인식 부위를 지칭한다. 이러한 프로모터는 RNA 폴리머라제와 개시 복합체를 형성하여 전사 활성을 개시하고 이를 진행시킨다. 상기 복합체는 "인핸서"로 명명된 서열을 활성화시키거나 "사일런서(silencer)"로 명명된 서열을 억제함으로써 변형시킬 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "리더"는 유전자를 따라 전사되는 구조 유전자의 5' 말단에 있는 DNA 서열을 지칭한다. 이러한 리더는 통상적으로, 종종 프로-서열로 불리우는 N-말단 펩타이드 연장물을 갖는 단백질을 생성시킨다. 소포체 또는 막으로 분비되도록 설정된 단백질의 경우, 이와 같이 일반적으로 소수성인 시그날 서열은 단백질을 소포체 내로 지시하여 이로부터 적당한 목적지로 방출된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "인트론"은 유전자 생성물 내의 아미노산을 암호화하지 않는 유전자의 중간 부분에서 발생하는 DNA의 특정 절편을 지칭한다. 인트론의 전구체 RNA가 절단되므로, 이는 mRNA 내로 전사되지 않거나 단백질로 해독되지 않는다.
용어 "카셋트"는 발현되어야할 핵산 서열을 함유하는 본 발명의 서열을 지칭한다. 이러한 카셋트는 개념상 카셋트 테이프와 유사하다. 각 카셋트는 고유의 서열을 지닐 것이다. 따라서, 카셋트를 교환함으로써, 벡터는 상이한 서열을 발현할 것이다. 5' 및 3' 말단에서의 제한 부위로 인해, 카셋트는 용이하게 삽입되거나, 제거되거나 또 다른 카셋트로 대체될 수 있다.
용어 "3' 해독되지 않은 영역" 또는 "3' UTR"은 통상적으로 특정 구조 유전자로 전사되는 이러한 유전자의 3' 말단에 있는 서열을 지칭한다. 이러한 3'UTR 영역은 통상 폴리 A 서열을 함유한다. 3'UTR이 DNA로부터 전사된다 할지라도, 이는 단백질로 해독되기 전에 절단된다.
용어 "비-암호화 영역" 또는 "NCR"은 상기 구조 유전자의 3'UTR 영역에 인접한 영역을 지칭한다. 이러한 NCR 영역은 전자 종결 시그날을 함유한다.
용어 "제한 부위"는 제한 엔도뉴클레아제의 서열 특이적 절단 부위를 지칭한다.
용어 "벡터"는 DNA 단편을 숙주 유기체 또는 숙주 조직 내로 도입시킬 수 있는 몇몇 수단을 지칭한다. 플라스미드, 박테리오파아지 및 코스미드를 포함하여 각종 유형의 벡터가 있다.
용어 "유효량"은 적절한 수준의 폴리펩타이드가 생성되기에 충분한 PNV가 주입되는 것을 의미한다. 당해 분야의 숙련자는 이러한 수준이 다양할 수 있다는 것을 인지한다.
본 발명을 기술하기 위하여, HIV에 대한 다음의 배경이 제공된다. 사람 면역결핍 바이러스는 리보핵산(RNA) 게놈을 지니며, 이의 구조는 도 1에 나타낸다. 이러한 RNA 게놈은 본원에 교시된 방법에 따라서 클로닝 및 조작하기 위한 cDNA 복사물을 생성시키기 위하여 당해 분야에 공지된 방법에 따라서 역전사되어야만 한다. 상기 게놈의 각 말단에는 프로모터로서 작용하는 긴 말단 반복체가 있다. 이들 말단 사이에, 상기 게놈은 각종 판독 프레임에서 주요 유전자 생성물로서 gag-pol-env를 암호화하는데, gag는 그룹 특이적 항원이고; pol은 역전사효소 또는 폴리머라제이며; 또한, 또 다른 판독 프레임에서 상기 영역에 의해 암호화된 것은 예를 들면, gp160에서 gp120 및 gp41로의 해독 후 프로세싱에 관여하는 바이러스성 프로테아제이고; env는 외막 단백질이며; vif는 비리온 감염 인자이고; REV는 비리온 단백질 발현의 조절 인자이며; neg는 음성 조절 인자이고; vpu는 비리온 생산성 인자 "u"이며; tat는 전사의 트랜스-활성인자이고; vpr은 바이러스성 단백질이다. 이들 요소들 각각의 기능은 기술된 바 있다.
본 발명의 한 양태에 있어서, HIV 또는 SIV 단백질을 암호화하는 유전자를 전사 프로모터에 직접적으로 연결시킨다. env 유전자는 막 결합된 큰 단백질 gp160을 암호화하는데, 이는 해독 후에 gp41 및 gp120으로 변형된다. gp120 유전자는 발현을 위해 사이토메갈로바이러스 프로모터의 조절하에 놓여질 수 있다. 그러나, gp120은 막에 결합되지 않으므로 발현시 세포로부터 분비될 수 있다. HIV는 감염된 세포에서 잠복기를 거치기 때문에, 세포-결합된 HIV 에피토프에 지시된 면역 반응이 발생되는 것이 바람직하다. 부가적으로, 백신이 바이러스성 감염에 의해 생성된 것과 구조면에서 유사한, 막 결합된 올리고머성 ENV 항원을 생성시켜 바이러스성 중화에 대해 가장 효능있는 항체 반응을 발생시키는 것이 바람직하다. 이러한 목표는 세포-막 결합된 에피토프, gp160을 생체내에서 발현시켜 면역 반응을 개시함으로써 본 발명에 의해 달성된다. 그러나, gp160의 발현은 비-스플라이싱된 유전자의 핵으로부터 비-유출로 인해 REV의 부재하에서는 억제된다. 이러한 시스템을 이해하기 위해서는, HIV의 라이프 사이클이 추가로 상세히 기술되어야 한다.
HIV의 라이프 사이클에서는, 숙주 세포의 감염시, HIV RNA 게놈은 단일 전사 단위로서 숙주 게놈성 DNA로 통합되는 프로바이러스성 DNA 내로 역전사된다. LTR은 HIV 유전자를 5' 방향에서부터 3' 방향(gag, pol, env)으로 전사시켜 전체 게놈의 비-스플라이싱된 전사체를 형성시키는 프로모터를 제공한다. 이와 같이 비-스플라이싱된 전사체는 gag 및 pol을 해독시키는 mRNA로서 작용하지만, env 암호화된 유전자의 해독을 위해서는 제한된 스플라이싱이 일어나야만 한다. 발현될 조절성 유전자 생성물 ENV의 경우에는, 하나 이상의 스플라이싱 사건이 발생되어야만 하는데, 이는 게놈 셋팅에 있어서 REV와 env가 도 1에 도시된 바와 같이 중첩되기 때문이다. env의 전사가 발생되기 위해서는, REV 전사가 중지되어야 하고 그 반대도 가능하다. 또한, 핵으로부터 비-스플라이싱된 RNA를 유출시키기 위해서는 REV가 존재해야 한다. 그러나, 이러한 방식으로 작용하는 REV의 경우, REV 반응성 요소(RRE)가 상기 전사체에 대해 제시되어야만 한다[참조:Malim et al., Nature 338:254-257].
본 발명의 폴리뉴클레오티드 백신에 있어서, 특정 HIV 유전자의 의무적인 스플라이싱은 완전하게 스플라이싱된 유전자를 제공함으로써(즉, 판독 프레임에서 스위치가 필요없거나 비암호화 영역을 제거할 필요없이 목적하는 유전자 생성물에 대한 완전한 개방 판독 프레임을 제공하는데; 당해 분야의 숙련자는 특정한 유전자를 스플라이싱할 때 생성되는 정확한 서열에는 일부 허용 범위가 있지만, 작용성 암호화 서열이 수득되는 한은 이 것도 허용 가능하다) 제거된다. 따라서, 한 양태에 있어서, gp160에 대한 완전한 암호화 서열은 각 유전자 생성물의 어떠한 간헐적 발현도 요구되지 않도록 스플라이싱시킨다.
본 발명에 따라서 발생된 이중 체액성 및 세포성 면역 반응은 특히, 집단뿐만 아니라 감염된 개체 내에서 돌연변이하려는 HIV의 성향을 가정하면 HIV 감염을 상당히 억제시킨다. HIV에 유효한 예방용 백신을 제형화하기 위해서는, 예를 들면, gp160에 대한 다가 항체 반응(env는 US 사람 집단에서 가장 널리퍼져 있는 균주인, 각종 HIV-1에 교차하여 대략 80% 보존된, 클라드 B 균주이다)과, HIV 뿐만 아니라 gp160의 보존된 부위에 대해 반응성인 세포독성 T 세포 및 gag에 의해 암호화된 내부 바이러스성 단백질에 대한 주요 중화 표적 모두를 발생시키는 것이 바람직하다. 본 발명자들은 통상의 실험실용 균주; 감염된 집단 내에서 발견된 우세한 1차 바이러스성 분리물; 마스킹되지 않은 교차 균주, 중화 항체 에피토프로 고안된 변이된 gp160s; 및 gag 및 pol 유전자(HIV 분리물과 교차하여 약 95% 보존됨) 등의 기타 대표적인 HIV 유전자 중에서 선택된 gp160을 포함하는 HIV 백신을 만들었다.
면역결핍 상태로 진행되지 않은 거의 모든 HIV 혈청양성 환자는 항-gag CTL를 지니고 있는 반면, 이들 환자의 약 60%는 교차 균주인 gp160 특이적 CTL를 나타낸다. 그러나, AIDS로서 공지된 질병 상태로 진행된 감염된 개개인에서 발견된 HIV 특이적 CTL의 양은 훨씬 낮은데, 이는 본 발명자들이 교차 균주 CTL 반응을 유도할 수 있다는 본 발견의 중요성을 입증해준다.
본 발명자들의 env 및 gag 폴리뉴클레오티드 백신 작제물에 의해 유도된 면역 반응이 마우스 및 랫트에서 나타났다. 마우스에서 env에 대한 항체 생성을 모니터링함으로써 소정의 작제물이 적합하게 면역원성이라는, 즉 고 비율로 백신접종된 동물이 항체 반응을 나타낸다는 확신을 할 수 있다. 마우스는 또한, 본 발명자들의 작제물에 의한 CTL 유도를 시험하기에 적합한 가장 다루기 쉬운 동물 모델을 제공해주므로, 이를 사용하여 특정한 작제물이 이러한 활성을 발생시킬 수 있는지를 평가한다. 원숭이(아프리카산 그린, 붉은털원숭이, 침팬지)는 보다 큰 비-설치류 동물에서 항체 평가하기 위한 영장류를 포함하여 부가의 종을 제공해준다. 이들 종은 또한, 마우스 혈청에서 관찰된 레트로바이러스에 대한 고도의 내인성 중화 활성으로 인해 항혈청 중화 분석용으로는 마우스 보다 선호된다. 이들 데이터는 충분한 면역원성이 본 발명자들의 백신에 의해 야기되어, 이러한 시스템에 대하여 공지된 보호 수준의 중화 항체를 근거로 한 침팬지/HIV ⅢB 챌린지 모델 실험에서 보호를 달성시킬 수 있다는 것을 증명하고 있다. 그러나, 과학계에서 현재 지속적으로 수용하고 있는 보호에 관한 개념이 HIV 감염으로부터의 완전한 보호를 지시해주는 소위 "멸균 면역"으로부터 질병 예방 쪽으로 바뀌고 있다. 이러한 목표에 대한 수많은 상관 관계에 있는 것으로는 HIV 역전사효소 활성, 혈청 샘플의 감염도, p24의 ELISA 검정 또는 기타 혈중 HIV 항원 농도, 즉 증가된 CD4+T 세포 농도, 및 생존 연장율에 의해 측정된 바와 같은, 감소된 혈중 바이러스 역가가 있다[참조:Cohen, J., Science 262:1820-1821, 1993; 이에서는 항-HIV 백신 효능에 대해 전개되는 개념에 관해 토론하고 있다]. 본 발명의 면역원은 또한 HIV의 감염성(임상적, 1차) 분리물에 대한 중화 면역 반응을 발생시킨다.
면역학
A.env에 대한 항체 반응
1.gp160 및 gp120
ELISA 검정을 이용하여 분비된 gp120 또는 막 결합된 gp160을 발현하는 백신 벡터가 env-특이적 항체를 생성시키는데 효능이 있는지의 여부를 결정한다. 본 발명의 백신 접종용 벡터에 의한 env 발현의 초기 시험관내 성상확인은 gp160 형질감염된 세포 용해물을 면역블롯 분석함으로써 제공된다. 이들 데이터는 형질감염체 세포 gp160 발현을 가시화시켜 주는 항-gp41 및 항-gp120 모노클로날 항체를 사용하여 gp160 발현을 확인시켜 주고 이를 정량화해준다. 본 발명의 한 양태에 있어서, gp160은 다음 이유로 인해 gp120 보다 선호된다: (1) 초기 gp120 벡터는 마우스에서 일정하지 못한 면역원성을 제공하며 아프리카산 그린 원숭이에서 매우 낮거나 비-반응성이고; (2) gp160은 gp41의 혼입으로 인해 대략 190개 아미노산 잔기를 첨가시킴으로써 부가의 중화 항체뿐만 아니라 CTL 에피토프에 도움이 되며; (3) gp160 발현은 4량체 어셈블리 및 전반적인 형태 측면에서 바이러스성 env와 더욱 유사하고, 이는 올리고머-의존성 중화 에피토프를 제공할 수 있으며; (4) 본 발명자들은 마우스, 흰담비 및 사람이 아닌 영장류에서 중화 항체 반응을 생성시키기 위한 막 결합된 인플루엔자 HA 작제물의 성공과 마찬가지로, 항-gp160 항체 발현이 항-gp120 항체 발생보다 우수하다는 사실을 발견하였다. 어떠한 유형의 env를 선별하는가 또는 env 아단편의 칵테일이 바람직한지는 다음에 기술된 실험에 의해 결정된다.
2.중화 활성의 존재 및 전체 효과
원숭이로부터의 ELISA 양성 항혈청을 시험한 결과, 이는 동종 및 이종 HIV 균주 모두를 중화시키는 것으로 나타났다.
3.V3 대 비-V3 중화 항체
env PNV에 대한 주요한 목적은 광범위하게 중화시키는 항체를 발생시키는 것이다. V3 루프에 대하여 지시된 항체가 매우 균주 특이적인 것으로 본 발명에 의해 밝혀졌으며 이러한 반응의 혈청학을 이용하여 균주를 한정하였다.
a. 비-V3 중화 항체는 CD4 결합에 관여하는 gp120 내에서 불연속적인 구조적 에피토프를 1차적으로 인식하는 것으로 여겨진다. 이러한 도메인에 대한 항체는 폴리클로날이고, 아마도 바이러스가 이의 세포내 리간드를 결합시켜야 하는 필요성에 의해 부여된 돌연변이에 대한 제한 요인으로 인해 더욱 광범위하게 교차-중화시킨다. 시험관내 분석을 이용하여, 면역화된 동물로부터의 혈청에 의해 96웰 플레이트 상에 고정화된 CD4에 대한 gp120의 결합을 차단시키는 것에 관해 시험한다. 두 번째 시험관내 분석은 플라스틱 상에 고정화된 선택된 V3 도메인을 나타내는 합성 펩타이드에 대한 직접적인 항체 결합을 탐지해준다. 이들 분석은 본 발명자들의 연구에 사용된 어떠한 유형의 동물로부터의 항혈청에 대해서도 적합하며 본 발명의 백신을 발생시킨 중화 항체의 유형을 한정해줄 뿐만 아니라 바이러스 중화와의 시험관내 상관관계를 제공해준다.
b. gp41은 광범위하게 중화시키는 2F5 모노클로날 항체[Viral Testing System Corp.(Texas Commerce Tower, 600 Travis Street, Suite 4750, Houston, TX 77002-3005(USA) 또는 Waldheim Pharmazeutika GmbH, Boltzmangasse 11, A-1091 Wien, Austria)로부터 시판되고 있음]에 의해 인식된 고도로 보존된 선형 에피토프 에 상응하는 하나 이상의 주요 중화 결정기 뿐만 아니라 gp41의 N-말단에 위치한 잘 보존된 "융합 펩타이드" 도메인을 포함하여 기타 잠재적 부위를 지니고 있다. 앞서 언급된 바와 같은 면역블롯에 의해 gp41에 대하여 지시된 항체를 탐지하는 것 이외에도, 플라스틱 상에 고정화된 이들 도메인을 나타내는 합성 펩타이드에 결합되는 항체를 대상으로 시험관내 분석 시험을 사용한다.
4.항체 반응의 성숙
HIV 혈청 양성 환자에 있어서, 중화 항체 반응은 주로 항-V3으로부터 진행되어 상기 기술된(#3) 구조적 gp120 도메인 에피토프(gp41 에피토프를 포함함)를 포함하는, 보다 광범위하게 중화시키는 항체를 혼입시킨다. 이들 유형의 항체 반응을 시간과 후속 백신접종 기간 전반에 걸쳐 모니터한다.
B.env 및 gag에 대한 T 세포 반응도
1.CTL 반응의 발생
세포 내에서 합성되는 바이러스성 단백질은 MHC Ⅰ-제한된 CTL 반응을 야기시킨다. 이들 각각의 단백질은 혈청 양성 환자에게서 CTL을 유발시킨다. 본 발명의 백신 또한 마우스에서 CTL을 유발시킬 수 있다. 마우스 균주의 면역원성은 인플루엔자 NP로 입증된 바와 같이 이러한 연구에 도움이 된다. 수개의 에피토프가 Balb/c 마우스에서 HIV 단백질 env, REV, nef 및 gag에 대해 한정되었기 때문에 시험관내 CTL 배양과 세포독성 분석을 촉진시켜준다. 이들 유전자로 형질감염된 쥐의 마스토사이토마 P815와 같은 합성 종양주를 사용하여 CTL 뿐만 아니라 시험관내 항원 특이적 재자극에 대한 표적을 제공하는 것이 유리하다. MHC 부류Ⅰ-제한된 세포독성 T 임파구를 유도시킬 수 있는 면역원을 한정시키는 방법은 공지되어 있다. 아미노산 152 내지 176을 포함하는 펩타이드가 HIV 중화 항체를 유도하는 것으로 밝혀졌으며, 이들 방법을 이용하여 본 발명의 PNV에 혼입하기 위한 면역원성 에피토프를 동정할 수도 있다. 또 다른 방법으로는, gp160, gp120, 프로테아제 또는 gag를 암호화하는 전체 유전자를 사용할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, T-세포 효과인자 기능은 성숙한 T-세포 표현형, 예를 들면, 세포독성, B-세포 활성화를 위한 사이토킨 분비, 및/또는 대식세포 및 친핵체의 보충 또는 자극과 연관이 있다.
2.TH 활성 측정
백신 접종된 동물로부터 유도된 비장 세포 배양물을 대상으로 하여, 재조합 단백질 또는 펩타이드 에피토프를 가함으로써 특이적 항원에 대한 리콜을 시험한다. 비장성 항원 표시 세포 APC를 수반함으로써 나타낸, 이러한 항원에 의한 T 세포의 활성화는 이들 배양물을 증식시킴으로써 또는 사이토킨을 생성시킴으로써 모니터한다. 사이토킨 생성 패턴으로, TH 반응을 유형 1 또는 유형 2로서 분류시킬 수 있다. 우점적 TH2 반응은 면역절충된 혈청 양성 환자에서 세포 면역의 배제와 상관이 있는 것으로 여겨지기 때문에, 생성되는 면역 반응의 조작을 허용하면서 환자에서 소정의 PNV에 의해 발생된 반응의 유형을 한정할 수 있다.
3.지연형 과감작성(DTH)
혈중 주사 후 바이러스성 항원에 대한 DTH는 세포내의 1차적으로 MHCⅡ-제한된 면역의 지표가 된다. 재조합 HIV 단백질과 공지된 에피토프에 대한 합성 펩타이드의 입수 용이성으로 인해, 이들 시약을 사용하여 백신접종된 척추동물에서 DTH 반응을 용이하게 결정함으로써 세포내 면역을 유도하기 위한 부가의 생체내 상관 관계 요인을 제공해준다.
보호
상기 면역학적 연구를 근거로 해보면, 본 발명의 백신이 발병성 HIV에 의한 챌린지에 대하여 척추동물에서 유효하다는 것을 예견할 수 있다. 이들 연구는 이들 동물을 PNV 작제물, 또는 gp160ⅢB, gagⅢB, nefⅢB 및 REVⅢB로 구성되는 PNV 작제물의 칵테일로 충분히 백신 접종한 후에 HIVⅢB/침팬지 챌린지에서 수행한다. 이와 관련하여 ⅢB 균주가 유용한데, 이는 이러한 균주의 치사량의 침팬지 역가가 확립되었기 때문이다. 그러나, HIV의 모든 균주 및 상기 소정의 균주에 특이적이거나 이에 이종인 에피토프를 사용하는 동일한 연구가 구상된다. 침팬지 이외에 제2의 백신 접종/챌린지 모델은 scid-hu PBL 마우스이다. 이러한 모델은 마우스 숙주에서 사람 임파구 면역 시스템 및 후속 HIV 챌린지를 수반한 본 발명의 시험을 허용해준다. 이러한 시스템은 이것이 어떠한 HIV 균주와의 사용에도 용이하도록 적응되고 HIV의 1차 분리물의 다중 균주에 대한 보호의 증거를 제시하기 때문에 유리하다. 제3의 챌린지 모델은 하이브리드 HIV/SIV 바이러스(SHIV)를 이용하며, 이들 중 몇몇은 붉은털 원숭이를 감염시키고 면역결핍증을 유발시켜 사망시키는 것으로 나타났다[참조:Li, J., et al., J. AIDS 5:639-646, 1992]. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 백신 작제물로 붉은털 원숭이를 백신접종시키는 것은 치사량의 SHIV로의 후속 챌린지에 대하여 보호적이다.
PNV 작제물 요약
HIV 및 기타 유전자를 폴리뉴클레오티드 백신 접종에 대해 최적화시킨 발현 벡터에 연결시킨다. 필수적으로 모든 외부로부터의 DNA를 제거하면, 전사 프로모터, 면역원성 에피토프, 전사 터미네이터, 박테리아성 복제 기점 및 항생제 내성 유전자의 필수 요소들이 남게된다.
env 및 gag와 같은 HIV 말기 유전자의 발현은 REV 의존적이고, 이를 위해서는 REV 반응 요소(RRE)가 바이러스성 유전자 전사체 상에 존재해야 한다. 분비된 형태의 gp120은 gp120 리더 펩타이드를 tPA(조직형 플라스미노겐 활성인자)로부터와 같은 이종 리더로 치환시킴으로써, 바람직하게는 면역글로불린 리더 펩타이드와 같이 고도로 발현된 포유동물 단백질에서 발견되는 바와 같은 리더 펩타이드에 의해 REV의 부재하에서 발생시킬 수 있다. 본 발명자들은 형질감염된 세포(RD, 사람 라도마이오사크로마주)에서 분비된 gp120을 효과적으로 발현시키는 V1Jns 내로 tPA-gp120 키메라 유전자를 삽입하였다. 단일 시스트론성(monocistronic) gp160은 REV 발현 벡터의 첨가없이는 형질감염시 어떠한 단백질도 생성시키지 못한다.
대표적인 작제물 성분(그러나, 이에 제한되지는 않는다):
1. tPA-gp120MN;
3. gp160ⅢB;
10. gagⅢB: 항-gag CTL에 대함;
11. tPA-gp120ⅢB;
12. 구조적 돌연변이된 gp160: V1, V2 및/또는 V3 루프 결실 또는 치환;
20. 인플루엔자 바이러스 핵단백질, 혈구응집소, 매트릭스, 뉴라미니다제 및 기타 항원성 단백질 등(이에 제한되는 것은 아니다)의, HIV 이외의 병원체에 의해 발현된 항원을 암호화하는 유전자; 단순 포진 바이러스 유전자; 사람 유두종 바이러스 유전자; 결핵 항원; A, B 또는 C형 간염 바이러스 항원.
후속 바이러스성 챌린지에 대한 폴리뉴클레오티드 HIV 면역원의 보호 효능은 본 발명의 비-복제성 플라스미드 DNA로 면역화시킴으로써 나타낸다. 이는 어떠한 감염성 제제도 포함되지 않고, 바이러스 입자의 어셈블리가 요구되지 않으며, 결정기 선별이 허용되기 때문에 유리하다. 더욱이, gag 및 프로테아제의 서열 및 기타 바이러스성 유전자 생성물의 일부가 HIV의 각종 균주에 보존되기 때문에, 클로닝된 유전자를 수득시키게 하는 균주에 동종인 HIV의 발병성 균주 뿐만 아니라 상기 균주에 이종인 HIV의 발병성 균주에 의한 후속 챌린지에 대한 보호가 가능하다.
gp160을 암호화하는 DNA 발현 벡터를 근육내 주사하면 후속 바이러스성 챌린지에 대하여 상당히 보호적인 면역이 발생된다. 특히, gp160-특이적 항체 및 1차 CTL이 생성된다. 가변성 외막 단백질의 항원성 이동 및 표류에도 불구하고 보존된 단백질에 대하여 지시된 면역 반응은 유효할 수 있다. 각 HIV 유전자 생성물이 약간의 보존율을 나타내고 CTL이 세포내 발현과 MHC 프로세싱에 반응하여 발생되기 때문에, 많은 바이러스 유전자가 gp160에 대해 성취된 것과 유사한 반응을 유발시키는 것으로 예측할 수 있다. 따라서, 이들 유전자 중의 다수가, 발현 벡터(다음 참조)에 클로닝되고 서열화된 연결물에 의해 나타낸 바와 같이 클로닝시켜 이들 작제물이 이용 가능한 형태의 면역원성 제제가 되도록 한다.
본 발명은 자가-복제제 또는 보조제를 필요로하지 않으면서도 교차-균주 보호 면역을 유도시키는 특정 수단을 제공해준다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드로의 면역화는 수많은 기타 잇점을 부여해준다. 백신 접종에 대한 이와 같은 접근은 종양뿐만 아니라 감염성 제제에 대해서도 적용 가능해야하는데, 이는 CD8+ CTL 반응이 병리생리학적 양 반응 모두에 중요하기 때문이다[참조: K. Tanaka et al., Annu. Rev. Immunol. 6, 359(1988)]. 따라서, 형질전환 과정에 결정적인 단백질에 대한 면역 반응을 유발시키는 것이 암 보호 또는 면역치료법의 효과적인 수단일 수 있다. 바이러스성 단백질과 사람 성장 호르몬 DNA를 주입한 후 발현된 단백질에 대한 고 역가 항체를 발생시키는 것은 이것이 별개로 또는 보존된 항원에 대하여 표적된 세포독성 T-임파구 백신과 조합하여 항체-근거 백신을 만드는데 용이하고도 고도로 효과적인 수단이라는 것을 제시하고 있다.
DNA 작제물의 생성 및 정제의 용이성을 전통적인 단백질 정제 방법과 호의적으로 비교함으로써, 조합 백신의 발생을 촉진시킨다. 따라서, 예를 들면, gp160, gp120, gp41 또는 기타 어떠한 HIV 유전자를 암호화하는 다중 작제물을 제조하고, 혼합한 다음 함께 투여할 수 있다. 단백질 발현이 DNA 주입을 수반하면서 유지되기 때문에, B- 및 T-세포 메모리의 영속이 증진됨으로써, 장기간 지속되는 체액성 및 세포-매개된 면역을 유발시킬 수 있다.
DNA 작제물을 제조 및 정제하기 위한 분자 생물학의 표준 기술로 인해 본 발명의 DNA 면역원을 제조할 수 있다. 따라서, 분자 생물학의 표준 기술이 본 발명의 생성물을 제조하기에 충분하지만, 본원에 기술된 특정 작제물은, 지금까지 표준 불활성화 완전 바이러스 또는 아단위 단백질 백신을 사용해서는 획득할 수 없었던 결과인, 놀랍게도 교차 균주를 생성시키고 1차 HIV 분리물 중화를 야기시키는 신규의 폴리뉴클레오티드 면역원을 제공해준다.
백신 수용체 내로 도입될 발현 가능한 DNA 또는 전사된 RNA의 양은 사용된 전사 및 해독 프로모터의 강도 및 발현된 유전자 생성물의 면역원성에 좌우될 것이다. 일반적으로, 면역학적으로 또는 예방학적으로 유효한 약 1ng 내지 100mg의 용량을 근육 조직 내로 직접적으로 투여한다. 피하 주사, 피내 주입, 피부를 통한 압흔 및 기타 투여 방식(예: 복강내, 정맥내 또는 흡입 운반)이 또한 고려된다. 부스터 백신 접종이 제공되어야 하는 것도 고려된다. HIV 폴리뉴클레오티드 면역원으로 백신 접종한 후, gp160, gp120 및 gag 유전자 생성물과 같은 HIV 단백질 면역원으로의 부스팅을 고려하기도 한다. 본 발명의 PNV를 비경구 투여하는 것과 동시에 또는 이에 이어서 인터루킨-12 단백질을 정맥내, 근육내, 피하 또는 기타 투여 방식과 같이 비경구 투여하는 것이 또한 유리하다.
당해 폴리뉴클레오티드는 순수한 상태, 즉 수용체의 면역 시스템에 영향을 미치는 어떠한 단백질, 보조제 또는 기타 제제와 결합되지 않을 수 있다. 이러한 경우, 당해 폴리뉴클레오티드가 멸균 식염수 또는 멸균성 완충 식염수 등의(이에 제한되지는 않는다) 생리학적으로 허용되는 용액 중에 존재하는 것이 바람직하다. 또 다르게는, DNA가 레시틴 리포좀 또는 당해 분야에 공지된 기타 리포좀 등의 리포좀과 결합하여 DNA-리포좀 혼합물로서 존재할 수 있거나, 또는 DNA는 단백질 또는 기타 담체와 같이, 면역 반응을 부스터시키는 것으로 당해 분야에 공지된 보조제와 결합될 수 있다. DNA의 세포내 흡수를 보조하는 제제, 예를 들면, 칼슘 이온(이에 제한되지는 않는다)을 사용하는 것이 유리할 수도 있다. 이들 제제는 일반적으로 본원에서 형질감염 촉진 시약 및 약제학적으로 허용되는 담체로서 지칭된다. 폴리뉴클레오티드로 피복된 마이크로포사체의 피복 기술은 당해 분야에 공지되어 있고 또한 본 발명과 연계해서도 유용하다.
다음 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공된 것이며 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
재료 기술
벡터 pF411 및 pF412: 이들 벡터는 알. 갈로 실험실에서 작제된 벡터 pSP62로부터 아클로닝시켰다. pSP62는 바이오테크 리서치 래보라토리즈, 인코포레이티드로부터 시판되고 있는 시약이다. pSP62는 람다 HXB2로부터 아클로닝된 HXB2 게놈의 12.5kb XbaⅠ 단편을 갖는다. pSP62를 SalⅠ 및 XbaⅠ로 분해시키면 HXB2 단편, 즉 5'-XbaⅠ/SalⅠ, 6.5kb 및 3'-SalⅠ/XbaⅠ, 6kb가 생성된다. 이들 삽입체를 SmaⅠ 및 SalⅠ 부위에서 pUC18 내로 아클로닝시켜 pF411(5'-XbaⅠ/SalⅠ) 및 pF412(3'-XbaⅠ/SalⅠ)을 생성시킨다. pF411은 gag/pol을 함유하고 pF412는 tat/rev/env/nef를 함유한다.
레플리겐 시약
재조합 rev(ⅢB), #RP1024-10
rec, gp120(ⅢB), #RP1001-10
항-rev 모노클로날 항체, #RP1029-10
항-gp120 mAB, #1C1, #RP1010-10
AIDS 조사 및 선호 시약 프로그램
항-gp41 mAB 하이브리도마, 체시 8, #526
HIV, 원칙적으로 HIV gag(대략 95% 보존됨) 및 env(gp160 또는 gp120; 70 내지 80% 보존됨) 유전자 생성물에 지시된 HIV에 대한 중화 항체 반응 및 세포독성 T 임파구(CTL) 모두를 유도하는 방법을 고안한다. gp160은 HIV 입자에 대해 공지된 유일한 중화 항체 에피토프를 함유하는 반면, 항-env 및 항-gag CTL 반응의 중요성은 중화 항체의 출현 이전에 발생되는, 감염을 수반하는 1차 바이러스혈증의 클리어런스뿐만 아니라 질병이 없는 상태를 유지하는데 있어서의 CTL의 역할을 이들 세포 면역 개시와 공지된 수준으로 연합함으로써 최고조에 달한다. HIV는 이의 유전적 다양성으로 인해 악명이 높기 때문에, 본 발명자들은 임상적 분리물로부터 유도된 몇몇 대표적인 env 유전자 및 gp41(대략 90% 보존됨)을 혼입시킴으로써 중화 항체의 보다 큰 전체 효과를 수득하기를 희망하지만, 고도로 보존된 gag 유전자는 광범위한 교차 균주 CTL 반응을 발생시켜야 한다.
실시예 2
HIV 말기 유전자 생성물의 이종 발현
완전한 길이의 단백질을 생성시키기 위해서는, env 및 gag 등의 HIV 구조 유전자는 HIV 조절성 유전자 rev를 발현시켜야 한다. 본 발명자들은 gag의 rev-의존적 발현으로 인해, 저수준의 단백질이 생성되고 rev 자체가 세포에 대해 독성일 수 있다는 사실을 밝혀내었다. 본 발명자들이 시험관내에서 비교적 고수준의 gp160의 rev-의존적 발현을 성취하긴 하였지만, 이러한 백신은 rev/gp160 DNA로의 생체내 면역화를 수행하면서 gp160에 대한 저수준의 항체를 유도시킨다. 이는 rev의 공지된 세포독성 효과뿐만 아니라 수백개의 핵을 함유하는 미오튜불(myotubule)에서 rev 기능을 획득하는데 있어서의 어려움 증가로부터 야기될 수 있다(rev 단백질은 발생되는 gag 또는 env 단백질 발현에 대한 rev-의존적 전사체와 동일한 핵에 존재할 필요가 있다). 그러나, env 유전자 gag를 선별적으로 변형시켜 rev-독립적인 발현을 수득하는 것이 가능하였다. 백신 목적용 이들 플라스미드에 관한 평가가 진행중이다.
일반적으로, 본 발명의 백신은 CMV 초기(IE) 프로모터, BGH 폴라아데닐화 부위 및 pUC 주쇄로 구성되는 본 발명의 일반화된 백신 접종용 벡터 V1Jns 내에서 발현을 최적화하기 위하여 1차적 HIV(ⅢB) env 및 gag 유전자를 활용하였다. 얼마나 큰 유전자 절편(예를 들면, gp120 대 gp160)이 사용되었는지에 따라서, env의 천연의 분비성 리더 펩타이드를 조직 특이적 플라스미노겐 활성인자(tPA) 유전자로 대체하고 이로써 생성된, CMV 인트론 A를 갖는 CMVIE 프로모터 뒤에 있는 키메라 유전자를 발현시킴으로써, env에 대한 rev-독립적인 발현의 다양한 효능이 달성될 수 있다. tPA-gp120은 백신 접종된 마우스 및 원숭이에서 항-gp120 면역 반응을 유도시키기에 충분히 기능하는 방식으로 작제된 분비된 gp120 벡터의 한 예이다.
막-부착된 단백질이 분비된 단백질과 비교해서 훨씬 더 상당한 (및 아마도 HIV 중화에 대해 더욱 특이적인) 항체 반응을 유도시킬 뿐만 아니라 부가의 면역 에피토프를 획득시킨다는 보고로 인해, 본 발명자들은 V1Jns-tPA-gp160 및 V1Jns-rev/gp160을 제조하였다. tPA-gp160 벡터는 형질감염된 세포의 면역블롯 분석에 의해 나타낸 바와 같이, rev의 첨가없이도 탐지 가능한 양의 gp160 및 gp120을 생성시키지만, 발현 정도는 rev-의존적 gp160-발현 플라스미드인 rev/gp160에 대해 수득된 것보다 훨씬 낮다. 이는 아마도, gp160 전사체에 대한 rev 의존성을 부여해주는 억제성 영역(INS로 명명됨)이 gp41의 COOH-말단을 포함하여 gp160 내에서의 여러 부위에서 발생되기 때문인 것으로 여겨진다(다음의 도식 참조). 이들 억제성 서열을 제거함으로써 env의 전반적인 발현 정도를 증가시키도록 고안된, COOH-말단적으로 절단된 형태의 tPA-gp160, tPA-gp143에 대한 한 벡터를 제조한다. gp143 벡터는 또한, 막 단백질을 세포 표면으로가 아니라 리소좀으로 전환시키는 것으로 공지된 펩타이드 모티브(예:leu-leu)를 함유하는 세포내 gp41 영역을 제거시킨다. 따라서, gp143은 완전한 길이의 gp160와 비교해서 세포 표면으로의 단백질의 수송 효율과 env 단백질의 발현(rev-의존성을 저하시킴으로써) 모두를 증가시키는 것으로 예상될 수 있으며, 여기서 상기 단백질은 DNA 백신 접종 후 항-gp160 항체를 보다 잘 유도시킬 수 있다. rev 반응 요소(RRE) 서열(350bp)을 광범위하게 사일런트 돌연변이시킴으로써 tPA-gp143을 추가로 변형시켜 발현을 위한 부가의 억제성 서열을 제거한다. 이러한 작제물, gp143/mutRRE는 두가지 형태, 즉 gp120/41에 대한 단백질 분해성 절단 부위를 제거시킨 형태(형태 A) 또는 보유시킨 형태(형태 B)로 제조한다. 백시니아에서 발현된 절단 가능하지 않은 gp160을 사용하여 마우스를 백신 접종시키면 절단 가능한 형태보다도 훨씬 높은 수준의 gp160에 대한 항체가 유도되었다는 문헌의 보고 내용 때문에 양 형태를 제조하였다.
세포 형질감염체에서 gp160/gp120 발현에 대한 정량적 ELISA를 개발시켜 이들 벡터에 대한 상대적인 발현 능력을 결정한다. 293 세포를 시험관내에서 형질감염시킨 다음 세포 결합된 gp120 대 분비된/방출된 gp120을 정량화하면 다음과 같은 결과가 수득된다: (1) tPA-gp160은 세포 표면으로 수송된 것에 대한 비율이 세포내적으로 보유된 것의 비율과 유사한 rev/gp160 보다 5 내지 10배 정도 덜 gp120을 발현시켰고; (2) tPA-gp143은 단지 낮은 수준의 세포-결합된 gp143으로 rev/gp160 보다는 gp120을 3 내지 6배 정도 더 많이 분비시켰는데, 이는 gp160의 세포질성 말단이 이러한 서열의 부분적 결실에 의해 극복될 수 있는 gp160의 세포내 보존을 야기시킨다는 것을 확인시켜주며; (3) tPA-gp143/mutRRE A 및 B는 모(parental) tPA-gp143 보다 대략 10배 정도 더 높은 수준으로 단백질을 발현시켜주는 반면, 단백질분해성 프로세싱의 제거는 형태 A에 대해서 확인되었다.
따라서, rev-독립적인 발현을 증가시키고자 한 본 방법으로 인해, 전반적인 발현이 단계적으로 증가되었을 뿐만 아니라 막-부착된 gp143이 리소좀으로부터 떨어져서 세포 표면으로 재지시되었다. NH2-말단(tPA 리더) 또는 COOH-말단(gp41)에 있는 이들 변형물을 함유하는 벡터 카셋트 내에서 각종 바이러스성 분리물로부터 유도된 gp120 서열을 삽입하는 것이 가능해야 하는 것이 중요한데, 여기서 상이한 바이러스성 균주 간에는 항원성 차이가 거의 존재하지 않는다. 달리 말하면, 이는 임상적으로 관련된 백신을 수득하기 위해 각종 1차 바이러스성 분리물로부터 유도된 gp120을 삽입시킴으로써 용이하게 변형될 수 있는 유전 작제물이다.
이들 발현 방법을 백신 용도로 타당한 바이러스에 적용하고 본 접근법의 통칙을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 또한, 1차 HIV 분리물(노쓰 아메리칸 컨센서스 V3 펩타이드 루프; 대식세포-반응성 및 비합포체-유도 표현형을 함유함)로부터 유도된 tPA-gp120 벡터를 제조하였다. 이러한 벡터는 형질감염된 293 세포를 이용하여 gp120을 고수준으로 발현/분비시키고 마우스에서 항-gp120 항체를 유도시켰는데, 이는 이것이 작용성 형태로 클로닝되었다는 것을 나타낸다. 1차 분리물 gp160 유전자는 또한, 실험실용 균주로부터 유도된 gp160에 대해서와 동일한 방식으로 발현에 사용될 것이다.
실시예 3
HIV-1 env 폴리뉴클레오티드 백신에 대한 면역 반응
gp120 DNA 백신이 투여된 아프리카산 그린 원숭이(AGM)와 붉은털 원숭이(RHM)는 2 내지 3회 백신 접종 후 낮은 수준의 중화 항체를 나타내었으며, 이는 부가의 백신 접종에 의해 증가될 수 없었다. 이들 결과뿐만 아니라, HIV 백신 분야에서 올리고머성 gp160이 gp120 단량체보다 중화 항체를 유발시키는데 훨씬 더 타당한 표적 항원일 것이라는 의식[참조:Moore and Ho, J. Virol. 67:863, 1993]이 증가됨에 따라, 본 발명자들은 gp160 근거 벡터를 효과적으로 발현시키는데 초점을 맞추게 되었다[상기 참조]. 마우스 및 AGM에게 또한 상기 1차 분리물 유도된 tPA-gp120 백신을 접종하였다. 이들 동물은 500 내지 5000 범위의 항-V3 펩타이드(동종 서열을 이용함) 상대적 종점 항체 역가를 나타내는데, 이는 상기 백신 고안물이 임상적으로 관련된 바이러스성 분리물에 대해 작용성이라는 것을 입증해준다.
gp160-기본 백신인 rev-gp160 및 tPA-gp160은 마우스와 사람이 아닌 영장류에서 항체 반응을 지속적으로 유발시키지 못하였거나 낮은 항체 역가를 산출시켰다. tPA-gp143 플라스미드를 이용한 본 발명자들의 초기 결과는 2회 백신 접종 후 마우스 및 AGM에서 >103의 기하학적 평균 역가를 산출시켰다. 이들 데이터는 본 발명자들이 발현 정도를 증가시킴으로써 gp160-유사 백신의 면역원성을 상당히 증가시켰다는 것을 지시하고 있다. 이러한 작제물뿐만 아니라 tPA-gp143/mutRRE A 및 B 벡터를 대상으로 하여 항체 반응, 특히 바이러스 중화에 대한 성상 확인이 지속적으로 이루어질 것이다.
결과적으로, gp120 DNA 백신 접종시키면, TH1-유사 사이토킨 분비 프로파일(즉, IL-4를 거의 또는 전혀 사용하지 않고 g-인터페론 및 IL-2 생성)로 시험된 모든 임파성 구획물(비장, 혈액, 서혜, 격막 및 장골 돌기)에서 강력한 헬퍼 T 세포 반응이 야기되었다. 이들 사이토킨은 일반적으로 강력한 세포성 면역을 증진시키고 HIV-혈청 양성 환자에 대해서 질병이 없는 상태를 유지시키는 것과 연관이 있다. 림프절은 바이러스가 혈액 내에서 용이하게 탐지될 수 없는 경우일지라도 바이러스의 큰 저장소를 보유하고 있는, HIV 복제에 대한 1차적 부위인 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 DNA 백신의 경우에 나타낸 바와 같이, 각종 림프 부위에서 항-HIV 면역 반응을 유발시키는 백신은 초기 감염 후 임파관의 성공적인 전이증식의 예방에 도움을 줄 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이, 본 발명자들은 본 프로그램을 이용하여 성공하기 위한 기회를 최대화하는데 필수적인 다음 목표의 실현을 고려하고 있다: (1) 영장류에서 보다 강력한 중화 항체를 발생시킬 수 있는 env-기본 벡터; (2) 영장류에서 CTL에 의해 성상이 확인된 바와 같이 강력한 T-임파구 반응 및 헬퍼 유효인자 기능을 유발시키는 gag 및 env 벡터; (3) 본 발명의 백신에 임상적으로 관련된 HIV-1 균주로부터의 env 및 gag를 유전자를 사용하고 이들이 유발시키는 면역원성 반응, 특히 1차 분리물의 중화의 성상을 확인함; (4) 적절하게 최적화된 백신을 이용하여 침팬지/HIV(ⅢB) 또는 붉은털 원숭이/SHIV와 같은 동물 챌린지 모델에서 보호를 증명함; (5) 임상적 용도에 적당한 면역 반응의 기간을 결정함. 이들 목표 중 처음 3가지에 대하여 상당한 진보가 이루어졌으며 본 발명의 gp160 및 gag에 대한 백신 접종용 작제물이 이들 초기 결과에 대하여 증진시킬 것인지의 여부를 결정하기 위한 실험이 진행중이다.
실시예 4
백신 생산용 벡터
A. V1Jneo 발현 벡터:
이는 V1J를 지니고 있는 박테리아의 항생제 선별에 사용된 ampr유전자를 제거하기 위해 필요한데, 이는 앰피실린이 대규모 발효기에서는 사용될 수 없기 때문이다. V1J의 pUC 주쇄로부터의 ampr유전자는 SspⅠ 및 Eam1105I 제한 효소를 사용하여 분해시킴으로써 제거한다. 나머지 플라스미드를 아가로즈 겔 전기영동시켜 정제하고, T4 DNA 폴리머라제로 평활 말단화시킨 다음, 송아지 장내 알칼린 포스파타제로 처리한다. 트랜스포존 903으로부터 유도되고 pUC4K 플라스미드 내에 함유된 시판용 kanr유전자를 PstⅠ 제한 효소를 이용하여 절단하고, 아가로즈 겔 전기영동시켜 정제하고, T4 DNA 폴리머라제로 평활 말단화시킨다. 이러한 단편을 V1J 주쇄에 연결하고, V1Jneo #1 및 3으로 명명된, 어느 한 방향에서 kanr유전자를 갖는 플라스미드를 유도시킨다. 제한 효소 분해 분석, 즉 연결체 영역의 DNA 서열분석에 의해 이들 플라스미드 각각에 대해 확인하면, 이들은 V1J와 유사한 양의 플라스미드를 생성시키는 것으로 나타났다. 이종 유전자 생성물의 발현 또한 이들 V1Jneo 벡터에 대해서 V1J에 필적한다. 본 발명자들은 발현 작제물로서 V1J에서의 ampr유전자와 동일한 방향으로 kanr유전자를 함유하는 V1Jneo #3(이는 V1Jneo로서 후술됨)을 임의로 선별하였다.
B.V1Jns 발현 벡터
SfiⅠ 부위를 V1Jneo에 가하여 통합 연구를 촉진시킨다. 시판되고 있는 13염기쌍 SfiⅠ 링커(New England BoiLabs)를 상기 벡터의 BGH 서열 내에 있는 KpnⅠ 부위에서 가한다. V1Jneo를 KpnⅠ으로 선형화하고, 겔 정제하며, T4 DNA 폴리머라제에 의해 평활하게 한 다음, 이러한 평활체 SfiⅠ 링커에 연결한다. 제한 지도화함으로써 클로날 분리물을 선택하고 상기 링커를 통하여 서열분석함으로써 확인한다. 새로운 벡터를 V1Jns로 명명하였다. V1Jns(SfiⅠ 지님)에서의 이종 유전자의 발현은 V1Jneo(KpnⅠ 지님)의 발현에 필적한다.
C.V1Jns-tPA
분비된 및/또는 막 단백질에 이종 리더 펩타이드 서열을 제공하기 위하여, V1Jns를 변형시켜 사람 조직 특이적 플라스미노겐 활성인자(tPA) 리더를 포함하도록 한다. 2개의 합성 상보적 올리고머를 어닐링시킨 다음 BglⅡ 절단시킨 V1Jn에 연결시킨다. 센스 및 안티센스 올리고머는 5'-GATCACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GA-3'(서열 18) 및 5'-GAT CTC GCT GGG CGA AAC GAA GAC TGC TCC ACA CAG CAG CAG CAC ACA GCA GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT GGT-3'이다. 코작 서열은 센스 올리코머에서 밑줄쳐져 있다. 이들 올리고머는 BglⅡ-절단된 서열에 연결하기에 적합한 오버행잉 염기를 갖는다. 연결 후, 상부 BglⅡ 부위는 파괴시키는 반면, 하부 BglⅡ는 후속 연결을 위해 보존시킨다. 양 연결 부위뿐만 아니라 전체 tPA 리더 서열 모두를 DNA 서열분석하여 확인한다. 부가적으로, 본 발명자들의 컨센서스 최적화 벡터 V1Jns(=SfiⅠ 부위를 갖는 V1Jneo)에 적합하도록 하기 위해서, KpnⅠ 부위를 T4 DNA 폴리머라제로 평활하게한 다음 SfiⅠ 링커(카탈로그 #1138, New England Biolabs)로 연결시킴으로써 SfiⅠ 제한 부위를 V1Jns-tPA의 BGH 터미네이터 영역 내의 KpnⅠ 부위에 놓아둔다. 이러한 변형을 제한 분해 및 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인하였다.
실시예 5
Ⅰ.HIV env 백신 작제물
분비된 env-유도된 항원(gp120 및 gp140)을 생성시키는 백신:
gp120으로서 REV-의존적 env 유전자의 발현을 다음과 같이 수행한다: gp120을 천연의 리더 펩타이드 서열(V1Jns-gp120)을 지니거나, 또는 이와 같은 천연의 리더 펩타이드(V1Jns-gp120)를 대체하는 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA) 리더 서열과의 융합물로서 HIV의 MN 균주로부터 PCR-클로닝시킨다. tPA-gp120 발현은 REV-독립적인 것으로 나타났다[참조:B.S.Chapman et al., Nuc. Acids Res. 19, 3979(1991); 다른 리더 서열도 gp120 유전자가 REV 독립적이게 하는데 유사한 기능을 제공할 것이라는 것을 인지해야 한다]. 이는 상기 언급된 벡터를 이용하여 다음 gp120 작제물을 제조함으로써 달성된다.
실시예 6
gp120 백신 작제물:
A.V1Jns-tPA-HIV MN gp120:
HIV gp120 유전자(Medimmune)를, 펩타이드 리더 서열의 첫 번째 30개 아미노산을 제거시키고 tPA 리더 펩타이드로 구성되는 키메라 단백질을 생성시킨 다음 아미노산 잔기 30 다음에 gp120 서열을 잔존시키는 V1Jns-tPA 내로의 클로닝을 촉진시키도록 고안된 올리고머를 사용하여 PCR 증폭시킨다. 이러한 고안으로 인해, REV-독립적인 gp120이 발현되고 이러한 플라스미드를 지니고 있는 세포로부터 가용성 gp120이 분비될 수 있다. 사용된 센스 및 안티센스 PCR 올리고머는 5'-CCC CGG ATC CTG ATC ACA GAA AAA TTG TGGGTC ACA GTC-3' 및 5'-C CCC AGG AATC CAC CTGTTAGCG CTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TCT C-3'이다. 해독 중지 코돈이 밑줄쳐져 있다. 이들 올리고머는 센스 올리고머의 BamHⅠ 부위에 대해 3' 위치된 BclⅠ 부위를 갖는 해독 개방 판독 프레임의 어느 한 말단에 BamHⅠ 제한 효소 부위를 함유한다. 이러한 PCR 생성물을 BclⅠ에 이어서 BamHⅠ로 연속적으로 분해하고, BglⅡ 분해시킨 V1Jns-tPA에 연결시킨 다음, 송아지 장 알칼린 포스파타제 처리한다. 이로써 생성된 벡터를 서열 분석하여 tPA 리더와 gp120암호화 서열간의 인프레임(inframe) 융합을 확인하고, gp120 발현과 분비를 형질감염된 RB 세포의 면역블롯 분석에 의해 확인한다.
B.V1Jns-tPA-HIV ⅢB gp120:
이 벡터는 HIV ⅢB가 gp120 서열에 사용되었다는 것을 제외하고는 Ⅰ.A.와 유사하다. 사용된 센스 및 안티센스 PCR 올리고머는 각각 다음과 같다:5'- GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3' 및 5'-CCA CAT TGA TCA GAT ATC TTA TCT TTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TC-3'. 이들 올리고머는 삽입체의 어느 한 말단에 BclⅠ을 제공할 뿐만 아니라 3' 말단에 있는 BclⅡ 부위의 바로 상부에 EcoRV를 제공한다. 5'말단 BclⅡ 부위는 V1Jns-tPA의 BglⅡ 부위로의 연결을 허용해주어 이의 천연의 리더 서열을 갖지 않는, tPA 리더 서열과 gp120을 암호화하는 키메라 tPA-gp120 유전자를 생성시킨다. 연결 생성물을 제한 분해 및 DNA 서열 분석에 의해 확인한다.
실시예 7
gp140 백신 작제물:
이들 작제물은 천연의 리더 대신 tPA 리더를 갖는 tPA-gp120과 유사하게 PCR에 의해 제조되지만, 트랜스멤브레인 펩타이드의 NH2-말단 바로 다음에 본 유전자를 종결시킴으로써 분비된 항원을 생성시키도록 고안된다(보호된 카복시말단 아미노산 서열=NH2-....TNWLWYIK-COOH). gp120 생성 작제물과 다르게, gp140 작제물은 올리고머성 항원을 생성시켜야 하고 2F5 모노클로날 항체에 의해 정의된 ELDKWA와 같은 공지된 gp41-함유된 항체 중화 에피토프를 보유해야 한다.
작제물은, gp120과 gp41의 연결부에서의 gp160 단백질 분해적 절단 부위가 문헌[참조: Kieny et al., Prot Eng. 2:219-255, 1988]에 기술된 바와 같이 적절한 아미노산 치환에 의해 보유되는지(B) 또는 제거되는지(A)에 따라서 2가지 형태(A 또는 B)로 제조된다[야생형 서열=NH2-...KAKRRVVQREKR...COOH 및 돌연변이된 서열=NH2-...KAONHVVQNEHO...COOH(여기서, 돌연변이된 아미노산이 밑줄쳐져 있다)].
A.V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-A/SRV-1 3'-UTR(HIV-1 ⅢB 근거)
본 작제물은 다음 센스 및 안티센스 PCR 올리고머를 사용하여 벡터 ⅣB(최적화된 RRE-A 절편을 함유함)로부터 AvrⅡ/EcoRⅤ 절편을 수득함으로써 PCR에 의해 수득한다: 5'-CT GAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAAT TTG GGG TTG CTC TGG-3'(서열 ) 및 5'-CGC AGG GGA GGT GGT CTA GAT ATC TTA TTA TTT TAT ATA CCA CAG CCA ATT TGT TAT G-3'. 합성 유전자 절편으로서 제조되고 시미안 레트로바이러스-1(SRV-1, 하기 참조)로부터 유도되는 3'-UTR을 gp140 개방 판독 프레임의 3' 말단 바로 다음에 도입된 SrfⅠ 제한 효소 부위에 삽입한다. 이러한 UTR 서열은 HIV env 및 gag의 rev-독립적인 발현을 촉진시키는 것으로 앞서 언급된 바 있다.
B.V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-B/SRV-1 3'-UTR(HIV-1 ⅢB 근거)
본 작제물은 env 단백질 분해적 절단 부위가 출발물질로서 작제물 ⅣC를 사용함으로써 보유시켰다는 것을 제외하고는 ⅡA와 유사하다.
C.V1Jns-tPA-gp140/opt30-A(HIV-1 ⅢB 근거)
본 작제물은 AvrⅡ 및 SrfⅠ 제한 효소 절단시킨 다음 gp30에 상응하지만 해독에 대해 최적의 코돈(다음 gp32-opt 참조)으로 구성된 합성 DNA 절편을 연결시킴으로써 ⅣB로부터 유도시킨다. 다음 센스 및 안티센스 올리고머를 각각 사용하여 PCR 증폭시킴으로써 gp32-opt로부터 gp30-opt DNA를 수득한다: 5'-GGT ACA CCT AGG CAT CTG GGG CTG CTC TGG-3' 및 5'-CCA CAT GAT ATC G CCC GGG C TTA TTA TTT GAT GTA CCA CAG CCA GTT GGT GAT G-3'. 이러한 DNA 절편을 AvrⅡ 및 EcoRⅤ 제한 효소로 절단시킨 다음, AvrⅡ 및 SrfⅠ로 절단시켜 상응하는 DNA 절편을 제거시킨 V1Jns-tPA-gp143/opt32-A(ⅣD)에 연결시킨다. 이로써 생성된 생성물을 연결부의 DNA 서열 분석 및 면역블롯 분석에 의해 확인한다.
D.V1Jns-tPA-gp140/opt30-B(HIV-1 ⅢB 근거)
본 작제물은 env 단백질 분해적 절단 부위를 보유시켰다는 것을 제외하고는 ⅡC와 유사하다.
E.V1Jns-tPA-gp140/opt all-A
본 작제물의 env 유전자는 완전하게 최적 코돈으로만 구성된다. 일정 영역(C1, C5, gp32)은 ⅣB,D,H로 기술된 것이며, 여기서 해독에 최적 코돈으로 구성된 합성 DNA 절편을 사용하여 가변 영역 1 내지 5에 상응하는 부가의 합성 DNA 절편을 삽입시킨다(HIV-1 MN V1-V5를 근거로 한 다음 실시예 참조).
F.V1Jns-tPA-gp140/opt all-B
본 작제물은 env 단백질 분해적 절단 부위를 보유시켰다는 것을 제외하고는 ⅡE와 유사하다.
G. V1Jns-tPA-gp140/opt all-A(비-ⅢB 균주)
본 작제물은 ⅢB가 아닌 균주로부터의 env 아미노산 서열을 사용하여 가변 영역(V1-V5) 전반에 걸친 최적의 코돈 활용을 결정한다는 것을 제외하고는 상기 ⅡE와 유사하다.
H.V1Jns-tPA-gp140/opt all-B(비-ⅢB 균주)
본 작제물은 env 단백질 분해적 절단 부위를 보유시켰다는 것을 제외하고는 ⅡG와 유사하다.
실시예 8
gp160 백신 작제물
상기 언급된 바와 같은 gp160 단백질 분해적 절단 부위인지에 따라서 작제물을 2가지 형태(A 또는 B)로 제조한다.
A.V1Jns-rev/env:
본 벡터는 엑손 1에서의 전체 tat 암호화 영역이 REV 개방 판독 프레임의 시작부 까지 결실된다는 것을 제외하고는 상기 섹션 D에서 기술된 것의 변이물이다. V1Jns-gp160ⅢB(상기 섹션 A 참조)를 PstⅠ 및 KpnⅠ 제한 효소로 절단하여 gp160 유전자의 5'-영역을 제거한다. PCR 증폭을 이용하여 HXB2 게놈 클론으로부터 gp160 내의 KpnⅠ 부위까지의 첫 번째 REV 엑손을 암호화하는 DNA 절편을 수득한다. 센스 및 안티센스 PCR 올리고머는 각각 다음과 같다: 5'-GGT ACA CTG CAG TCA CCG TCC T ATG GCA GGA AGA AGC GGA GAC-3' 및 5'-CCA CAT CA GGT ACC CCA TAA TAG ACT GTG ACC-3'. 이들 올리고머는 DNA 단편의 5' 및 3' 말단에 각각 PstⅠ 및 KpnⅠ 제한 효소 부위를 제공한다. 이로써 생성된 DNA를 PstⅠ 및 KpnⅠ으로 분해하고, 아가로즈 전기영동 겔로부터 정제한 다음, V1Jns-gp160(PstⅠ/KpnⅠ)으로 연결시킨다. 생성된 플라스미드는 제한 효소 분해에 의해 확인한다.
B.V1Jns-gp160:
HIV Ⅲb 클론 HXB2로부터 유도된 HIV Ⅲb 게놈의 3' 말단 절반을 함유하는 플라스미드 pF412로부터 PCR 증폭시켜 HIV Ⅲb gp160을 클로닝시킨다. PCR 센스 및 안티센스 올리고머는 각각 다음과 같다: 5'-GGT ACA TGA TCAACC ATGAGA GTG AAG GAG AAA TAT CAG C-3' 및 5'-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATCTTATAG CAA AAT CCT TTC C-3'. 코작 서열과 해독 중지 코돈이 밑줄쳐져 있다. 이들 올리고머는 env 유전자의 양 말단에 해독 개방 판독 프레임을 벗어나서 BclⅠ 제한 효소 부위를 제공한다. (BclⅠ-분해된 부위는 BglⅡ-분해된 부위로의 연결에 적합하며, 이때 양 제한 효소에 대한 민감도의 상실이 이어진다. BclⅠ은 PCR-클로닝 gp160용으로 선택하는데, 이는 이러한 유전자가 내부 BglⅡ 뿐만 아니라 BamHⅠ 부위를 함유하기 때문이다). 상기 안티센스 올리고머를 또한 다른 PCR-유도된 유전자에 대해서 앞서 기술된 바와 같이 BclⅠ 부위에 바로 앞에 있는 EcoRⅤ 부위에 삽입한다. 증폭된 gp160 유전자를 아가로즈 겔 정제시키고, BclⅠ로 분해한 다음, 송아지 장 알칼린 포스파타제로 처리한다. 이와 같이 클론된 유전자는 크기가 약 2.6kb이고 gp160과 V1Jns의 각 연결부는 DNA 서열분석을 통해 확인한다.
C.V1Jns-tPA-gp160(HIV-1 ⅢB 근거)
본 벡터는 천연의 리더 서열을 갖지 않는 완전한 길이의 gp160이 PCR에 의해 수득된다는 것을 제외하고는 상기 실시예 1(C)와 유사하다. 센스 올리고머는 Ⅰ.C.에서 사용된 것과 동일하고 안티센스 올리고머는 5'-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3'이다. 이들 올리고머는 상기 삽입체의 어느 한 말단에 BclⅠ부위를 제공할 뿐만 아니라 3' 말단에 BclⅠ 부위의 바로 상부에 EcoRⅤ를 제공한다. 5'말단 BclⅠ 부위는 V1Jns-tPA의 BglⅡ 부위로의 연결을 허용해주어 이의 천연의 리더 서열을 갖지 않는, tPA 리더 서열과 gp160을 암호화하는 키메라 tPA-gp160 유전자를 생성시킨다. 연결 생성물을 제한 분해 및 DNA 서열 분석에 의해 확인한다.
D.V1Jns-tPA-gp160/optC1/opt41-A(HIV-1 ⅢB 근거):
본 작제물은 tPA 리더 다음의 gp120의 아미노 말단에 C1을 대체하는 부가의 최적화된 코돈 절편(다음 참조)이 있는, gp32이 아닌 C5 및 gp41에 대해 완전히 최적화된 코돈 절편을 갖는 ⅣH를 근거로 한 것이다. 새로운 C1 절편을 다음 PCR용 올리고머를 사용하여 SOE PCR을 통하여 나머지 gp143 절편에 연결시켜 연결된 C1/143 절편을 합성한다: 5'-CCT GTG TGT GAG TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AAG AAT GAT ACT AAT AC-3'. 생성된 gp143 유전자는 V1-V5 영역을 제외한 최적 코돈을 함유하고 기타 HIV 유전자로부터 가변 영역을 삽입하기 위하여 C1과 V1의 연결부에 위치한 독특한 PmeⅠ제한 효소 부위를 갖는다.
E.V1Jns-tPA-gp160/optC1/opt41-B(HIV-1 ⅢB 근거)
본 작제물은 env 단백질 분해적 절단 부위를 보유시켰다는 것을 제외하고는 ⅢD와 유사하다.
F.V1Jns-tPA-gp160/opt all-A(HIV-1 ⅢB 근거)
본 작제물의 env 유전자는 앞서 언급된 바와 같은, 완전하게 최적 코돈으로만 구성된다. 일정 영역(C1, C5, gp32)은 카셋트로서 사용되는 ⅢD,E에 기술된 것이나, 가변 영역 V1-V5은 최적 코돈으로 구성된 합성 DNA 절편으로부터 유도된다.
G.V1Jns-tPA-gp160/opt all-B
본 작제물은 env 단백질 분해적 절단 부위를 보유시켰다는 것을 제외하고는 ⅢF와 유사하다.
H. V1Jns-tPA-gp160/opt all-A(비-ⅢB 균주)
본 작제물은 ⅢB가 아닌 균주로부터의 env 아미노산 서열을 사용하여 가변 영역(V1-V5) 전반에 걸친 최적의 코돈 활용을 결정한다는 것을 제외하고는 상기 ⅢF와 유사하다.
I.V1Jns-tPA-gp160/opt all-B(비-ⅢB 균주)
본 작제물은 env 단백질 분해적 절단 부위를 보유시켰다는 것을 제외하고는 ⅢH와 유사하다.
실시예 9
gp143 백신 작제물
천연의 리더 대신 tPA 리더를 사용하지만, COOH-종결되고 막-결합된 env를 생성시키도록 고안된(프로젝트된 세포내 아미노산 서열=NH2-NRVRQGYSP-COOH), 상기 언급된 기타 tPA 함유 작제물(tPA-gp120, tPA-gp140 및 tPA-gp160)과 유사하게 PCR에 의해 상기 작제물을 제조한다. 이러한 작제물은 tPA 도입을 수반하는 env의 증가된 발현을 조합하고 env의 세포내 분획에 상응하는 전사체 또는 펩타이드 영역이 발현 또는 단백질 안정성/세포 표면에 대한 단백질 수송에 불리한 영향을 미칠지도 모르는 가능성을 최소화시킬 목적으로 고안되었다. gp160 단백질 분해적 절단 부위가 상기 언급된 바와 같이 제거되는지 또는 보유되는지에 따라서 작제물을 2가지 형태(A 또는 B) 형태로 제조한다. gp143에 대한 절단으로부터 생성된 잔여 gp41 단편을 gp32로서 지칭한다.
A.V1Jns-tPA-gp143
본 작제물은 다음 센스 및 안티센스 PCR 올리고머를 갖는 플라스미드 pF412를 사용하여 PCR에 의해 제조한다: 5'-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3'(서열 ) 및 5'-CCA CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCC CTG CCT CAC TCT GTT CAC-3'. 이로써 생성된 DNA 절편은 env 개방 판독 프레임에 대한 3'-다음에 위치한 SrfⅠ 부위로 분해된 V1Jns-tPA/BglⅡ 내로 클로닝하기 위하여 어느 한 말단에 BclⅠ 제한 부위를 함유한다. 연결부의 DNA 서열분석 및 형질감염된 세포의 면역블롯 분석에 의해 작제물을 확인한다.
B.V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-A
본 작제물은 독특한 MunⅠ 제한 효소 부위 및 상기 언급된 하부 SrfⅠ 부위를 이용하여 DNA 절편을 절단함으로써 ⅣA에 근거한 것이다. 이러한 절편은 gp120 C5 도메인 및 완전한 gp32의 일정 분획에 상응한다. 해독용 최적 코돈으로 구성된, gp160의 rev 반응 요소(RRE A)의 대략 350bp에 상응하는 합성 DNA 절편을 스플라이스 중첩 연장(SOE) PCR에 의해 잔여 gp32 절편에 연결시키면, 두 절편의 연결부에 AvrⅡ 제한 효소 부위가 생성된다(그러나, 아미노산 서열상의 변화는 없다). gp32 함유 도메인을 발생시키기 위한 다음 센스 및 안티센스 PCR 올리고머를 각각 사용하여 이들 PCR 반응을 수행한다: 5'-CT GAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAT TTG GGG TTG CTG TGG-3' 및 5'-CCA CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCC CTG CCT CAC TCT GTT CAC-3'(이는 ⅣA에 대한 안티센스 올리고머로서 사용된다). 변이된 RRE(mutRRE-A)를, 다음 센스 올리고머, 즉 5'-GGT ACA CAA TTG GAG GAG CGA GTT ATA TAA ATA TAA G-3' 및 gp32 절편을 만들기 위해 사용된 안티센스 올리고머를 사용하여 SOE PCR에 의해 gp32의 야생형 서열에 연결한다. 이로써 생성된 연결된 DNA 절편을 MunⅠ 및 SrfⅠ 제한 효소로 분해하고 모 gp143/MunⅠ/SrfⅠ 분해된 플라스미드에 연결한다. 이로써 생성된 작제물을 연결체 및 SOE PCR 연결부의 DNA 서열분석 및 형질감염된 세포의 면역블롯 분석에 의해 확인한다.
C.V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-B
본 작제물은 mutRRE-A 대신 mutRRE-B 합성 유전자 절편을 사용함으로써 env 단백질 분해적 절단 부위를 보유시켰다는 것을 제외하고는 ⅣB와 유사하다.
D.V1Jns-tPA-gp143/opt32-A
AvrⅡ 및 SrfⅠ 제한 효소 분해시킨 다음 gp132에 상응하지만 해독용 최적 코돈(다음 gp32 opt 참조)을 포함하는합성 DNA 절편을 연결함으로써 상기 작제물을 ⅣB로부터 유도한다. 이로써 생성된 생성물을 연결부의 DNA 서열분석 및 면역블롯 분석에 의해 확인한다.
E.V1Jns-tPA-gp143/opt32-B
본 작제물은 초기 플라스미드로서 ⅣC를 사용함으로써 env 단백질 분해적 절단 부위를 보유시켰다는 것을 제외하고는 ⅣD와 유사하다.
G.V1Jns-tPA-gp143/SRV-1 3'-UTR
본 작제물은 시미안 레트로바이러스-1(SRV-1, 하기 참조)로부터 유도된 3'-UTR를 gp143 개방 판독 프레임의 3'- 바로 다음에 도입된 SrfⅠ 제한 효소 부위 내로 삽입한다는 것을 제외하고는 ⅣA와 유사하다. 이러한 UTR 서열은 HIV env 및 gag의 rev-독립적인 발현을 촉진시키는 것으로 앞서 언급된 바 있다.
H.V1Jns-tPA-gp143/optC1/opt32A
본 작제물은 tPA 리더 다음의 gp120의 아미노 말단에 C1을 대체하는 부가의 최적화된 코돈 절편(다음 참조)이 있는, C5 및 gp32에 대해 완전히 최적화된 코돈 절편을 갖는 ⅣD를 근거로 한 것이다. 새로운 C1 절편을 다음 PCR용 올리고머를 사용하여 SOE PCR을 통하여 나머지 gp143 절편에 연결시켜 연결된 C1/143 절편을 합성한다: 5'-CCT GTG TGT GAG TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AAG AAT GAT ACT AAT AC-3'. 생성된 gp143 유전자는 V1-V5 영역을 제외한 최적 코돈을 함유하고 기타 HIV 유전자로부터 가변 영역을 삽입하기 위하여 C1과 V1의 연결부에 위치한 독특한 PmeⅠ제한 효소 부위를 갖는다.
I.V1Jns-tPA-gp143/optC1/opt32B
본 작제물은 env 단백질 분해적 절단 부위를 보유시켰다는 것을 제외하고는 ⅣH와 유사하다.
J.V1Jns-tPA-gp143/opt all-A
본 작제물의 env 유전자는 완전하게 최적 코돈으로만 구성된다. 일정 영역(C1, C5, gp32)은 카셋트로서 사용되는 4B,D,H에 기술된 것이며, 여기서 가변 영역 V1-V5에 상응하는 부가의 합성 DNA 절편을 해독용 최적 코돈으로 구성된 합성 DNA 절편을 이용하여 삽입시킨다.
K.V1Jns-tPA-gp143/opt all-B
본 작제물은 env 단백질 분해적 절단 부위를 보유시켰다는 것을 제외하고는 ⅣJ와 유사하다.
L. V1Jns-tPA-gp143/opt all-A(비-ⅢB 균주)
본 작제물은 ⅢB가 아닌 균주로부터의 env 아미노산 서열을 사용하여 가변 영역(V1-V5) 전반에 걸친 최적의 코돈 활용을 결정한다는 것을 제외하고는 상기 ⅢG와 유사하다.
M.V1Jns-tPA-gp143/opt all-B(비-ⅢB 균주)
본 작제물은 ⅢB가 아닌 균주로부터의 env 아미노산 서열을 사용하여 가변 영역(V1-V5) 전반에 걸친 최적의 코돈 활용을 결정한다는 것을 제외하고는 상기 ⅢG와 유사하다.
실시예 10
gp143/glyB 백신 작제물
천연의 리더 대신 tPA 리더를 사용하지만 gp143의 경우에서와 같이 COOH-종결되고 막-결합된 env를 생성시키도록 고안된, 상기 언급된 기타 tPA 함유 작제물(tPA-gp120, tPA-gp140, tPA-gp143 및 tPA-gp160)과 유사하게 PCR에 의해 본 작제물을 제조한다. 그러나, gp143/glyB 작제물은 6개의 아미노산이 세포내 펩타이드도메인을 포함하도록 프로젝트되고, 마지막 4개의 아미노산이 사람 글리코포린 B(glyB) 단백질의 카복실 말단에 있는 것과 동일하다는 점에서 gp143과 상이하다[프로젝트된 세포내 아미노산 서열=NH2-NRLIKA-COOH(여기서, 밑줄친 잔기는 env와 glyB 모두에 공통적인 glyB 및 "R"에 상응한다)]. 이러한 작제물은 발현 또는 단백질 안정성/세포 표면에 대한 단백질 수송에 불리한 영향을 미칠지도 모르는 env의 세포내 분획에 상응하는 전사체 또는 펩타이드 영역을 짧은 세포질성 도메인을 갖는 과잉 발현된 단백질로부터의 펩타이드 서열(glyB)로 대체함으로써 상기 영역을 모두 완전하게 제거함으로써 세포 표면에 대한 표적화 지시 및 부가의 env 발현을 획득할 목적으로 고안되었다[세포내 아미노산 서열=NH2-RRLIKA-COOH]. gp160 단백질 분해적 절단 부위가 상기 언급된 바와 같이 제거되는지 또는 보유되는지에 따라서 작제물을 2가지 형태(A 또는 B) 형태로 제조한다.
A.V1Jns-tPA-gp143/opt32-A/glyB
본 작제물은 다음 안티센스 PCR 올리고머를 사용하여 gp143의 세포내 펩타이드 도메인을 상기 언급된 바와 같은 글리코포린 B의 것으로 대체한다는 것을 제외하고는 ⅣD와 동일하다: 5'-CCA CAT GAT ATC G CCC GGG C TTA TTA GGC CTT GAT CAG CCG GTT CAC AAT GGA CAG CAC AGC-3'.
B.V1Jns-tPA-gp143/opt32-B/glyB
본 작제물은 env 단백질 분해적 절단 부위를 보유시켰다는 것을 제외하고는 ⅤA와 유사하다.
C.V1Jns-tPA-gp143/optC1/opt32-A/glyB
본 작제물은 gp120의 첫 번째 일정 영역(C1)이 ⅣH에서와 같이 해독용 최적 코돈으로 대체된다는 것을 제외하고는 ⅤA와 동일하다.
D.V1Jns-tPA-gp143/optC1/opt32-B/glyB
본 작제물은 env 단백질 분해적 절단 부위를 보유시켰다는 것을 제외하고는 ⅤC와 유사하다.
E.V1Jns-tPA-gp143/opt all-A/glyB
이러한 작제물의 env 유전자는 앞서 언급된 바와 같이 완전하게 최적의 코돈만으로 구성된다.
F.V1Jns-tPA-gp143/opt all-B/glyB
본 작제물은 env 단백질 분해적 절단 부위를 보유시켰다는 것을 제외하고는 ⅤE와 유사하다.
G.V1Jns-tPA-gp143/opt all-A/glyB(비-ⅢB 균주)
본 작제물은 ⅢB가 아닌 균주로부터의 env 아미노산 서열을 사용하여 가변 영역(V1-V5) 전반에 걸친 최적의 코돈 활용을 결정한다는 것을 제외하고는 상기 ⅢG와 유사하다.
H.V1Jns-tPA-gp143/opt all-B/glyB(비-ⅢB 균주)
본 작제물은 env 단백질 분해적 절단 부위를 보유시켰다는 것을 제외하고는 ⅤG와 유사하다.
가변 루프 결실이 있는 HIV env 백신 작제물
본 작제물은 앞서 열거된 모든 env 형태(gp120, gp140, gp143, gp160, gp143/glyB)를 포함할 수 있지만 제조 동안 결실된 gp120 영역 내에 가변 루프(예를 들면, V1, V2 및/또는 V3)를 지니고 있다. 이들 변형의 목적은 CD4 결합 부위와 같이 보존된 중화 에피토프의 노출을 방해할 수 있는 펩타이드 절편을 제거하는 것이다. 예를 들면, 다음 올리고머가 PCR 반응에 사용되어 V1/V2 결실을 가져와 THE C1과 C2 절편을 인접시킨다: 5'-CTG ACC CCC CTG TGT GTG GGG GCT GGC AGT TGT AAC ACC TCA GTC ATT ACA CAG-3'.
실시예 11
증가된 env 유전자 발현을 위한 합성 유전자 절편의 고안
유전자 절편을, 동일하게 해독된 서열(인지된 것은 제외함)을 갖긴 하지만 문헌[J.Molec. Biol. Vol. 183, pp.1-12, 1985]에 "아미노산 서열 데이터로부터 유추된 합성 올리고뉴클레오티드 프로브: 이론적 및 실험적 고찰"이란 표제로 발표된 연구지에서 알. 라드(R. Lathe)에 의해 정의된 바와 같은 대체 코돈을 활용할 수 있는 서열로 전환시킨다. HIV env 유전자 절편의 rev-독립적인 발현을 증가시는 것으로 다음에 기술된 방법은 상기 유전자를 포유동물 세포에서 효과적으로 발현시키지 못하는 것으로 공지된 것은 전반적인 전사체 조성의 결과라는 본 발명자들의 가설을 근거로 한 것이다. 따라서, 동일한 단백질 서열을 암호화하는 대체 코돈을 사용하여 rev의 부재하에서 env 발현에 대한 제한요인을 제거할 수 있다. env 내의 코돈 활용을 주시한 결과, 높은 비율의 코돈이 고도로 발현된 사람 유전자에 의해 자주 사용되는 것으로 나타났다. 이용된 특정 코돈 치환 방법은 라드 등으로부터의 데이터를 이용하여 다음과 같이 기술될 수 있다:
1. 적절한 개방 판독 프레임에 대한 코돈 위치를 확인한다.
2. 사람 유전자에 의한 관찰된 사용 회수에 대해 야생형 코돈을 비교한다(라드 등의 표 3 참조).
3. 코돈이 가장 통상적으로 사용되지 않은 경우, 표 5의 데이터를 기준으로 하여 높은 발현을 위해 이를 최적의 코돈으로 대체시킨다.
4. 새로운 코돈의 세 번째 뉴클레오티드 및 3'-에 바로 인접한 코돈의 첫 번째 뉴클레오티드를 검사한다. 5'-CG-3'쌍 형성이 새로운 코돈 선별로 인해 이루어진 경우, 이를 표 5에 지시된 선택물로 대체시킨다.
5. 전체 유전자 절편이 대체될 때까지 이러한 과정을 반복한다.
6. 이들 코돈 치환물(예: "ATTTA" 서열, 부주의로 인한 인트론 스플라이스 인식 부위의 생성, 원하지 않은 제한 효소 부위 등)에 의해 발생된 바람직하지 못한 서열에 대해서 새로운 유전자 서열을 검사하고, 이들 서열을 제거시키는 코돈을 대체시킨다.
7. 합성 유전자 절편을 어셈블리하고 발현 증진 여부에 대해 시험한다.
이들 방법을 사용하여, 발현용 최적 코돈만으로 구성된 유전자를 생성시키는 HIV env에 대하여 다음 합성 유전자 절편을 생성시킨다: (ⅰ) gp120-C1(opt); (ⅱ) V1-V5(opt); (ⅲ) RRE-A/B(mut 또는 opt); 및 (ⅳ) 각 절편에 대해 수득된 코돈 대체물/뉴클레오티드 치환물의 비율이 각각 56/19, 73/26, 78/28 및 61/25인 gp30(opt). 이들 절편의 각각은 앞서 상세히 기술되었으며, 다음에 열거된 실제 서열을 가진다.
gp120-C1(opt)
이는 성숙한 N-말단으로부터 발현용 최적 코돈을 지니도록 고안된 V1의 개시부까지의 gp120 일정 영역(C1) 유전자 절편이다.
MN V1-V5 (opt)
이는 발현용 최적 코돈을 갖는 HIV MN V1-V5(1066BP)에 대하여 유도된 단백질 서열에 상응하는 유전자 절편이다.
RRE.Mut (A)
이는 발현용 최적 코돈으로 구성된 HIV-1의 rev 반응 요소(RRE)에 상응하는 DNA 절편이다. "A"형태는 또한, 진하게 지시된 뉴클레오티드를 사용함으로써 gp120/gp41 연결부에서 공지된 단백질 분해적 절단 부위를 제거하였다.
RRE.Mut (B)
이는 발현용 최적 코돈으로 구성된 HIV-1의 rev 반응 요소(RRE)에 상응하는 DNA 절편이다. "B"형태는 gp120/gp41 연결부에서 공지된 단백질 분해적 절단 부위를 보유하고 있다.
gp32 (opt)
이는 발현용 최적 코돈으로 구성된 gp143의 AvrⅡ 부위(RRE의 말단에서 바로 출발함)에서부터 이의 말단까지의 gp32 유전자 절편이다.
SRV-1 CTE (A)
이는 시미안 레트로바이러스-1 게놈으로부터의 3'-UTR에 상응하는 합성 유전자 절편이다. 이러한 DNA는 rev-독립적인 발현을 증가시키기 위하여 HIV 유전자의 3' 말단에 다음 방향으로 위치시킨다.
SRV-1 CTE (B)
이러한 합성 유전자 절편은 단일 뉴클레오티드 돌연변이를 이용하여 ATTTA 서열을 제거한다는 것을 제외하고는 상기 나타낸 SRV-1 CTE(A)와 동일하다. 이러한 서열은 mRNA 턴오버 증가와 연관된다.
실시예 11
시험관내 gp120 백신 발현
이들 작제물을 대상으로 하여 형질감염된 사람 횡문근육종(RD) 세포에서 시험관내 발현을 시험한다. 형질감염된 RD 세포로부터 분비된 tPA-gp120을 정량화한 결과, V1Jns-tPA-gp120 벡터가 분비된 gp120을 생성시키는 것으로 나타났다.
생체내 gp120 백신 접종
도 12(마우스 데이터) 참조:
V1Jns-tPA-gp120MN PNV-유도된 MHC 부류 Ⅱ-제한된 T 임파구 gp120 특이적 항원 반응성.V1Jns-tPA-gp120MN 200㎍으로 2회 백신 접종시킨 Balb/c 마우스를 희생시키고 재조합 gp120에 대한 헬퍼 T 임파구 반응성을 시험관내에서 결정하기 위하여 이들의 비장을 추출한다. 재조합 gp120ⅢB(레플리겐, 카탈로그 #RP1016-20)를 5㎍/ml(4 x 105세포수/ml) 사용하여 PBMC(말초혈 단핵 세포)로 T 세포 증식 분석을 수행한다. 상기 세포를 단독 배지에서 배양함으로써 이들 세포에 의한 기본 수준의3H-티미딘 흡수율을 획득하는 반면, 최대 증식은 2㎍/ml의 ConA 자극을 이용하여 유도시킨다. ConA-유도된 반응성인 약 3일 째에 피크를 이루고 배지 대조 샘플을 사용하여 상기 시점에서 수거하는 반면, 항원-처리된 샘플은 부가의 배지 대조군을 이용하여 5일째 되는 날에 수거한다. 백신 접종시킨 마우스 반응을 천연의 연령-매치된 선천성 마우스와 비교한다. ConA 양성 대조군은 예상된 바와 같이 천연의 마우스와 면역처리된 마우스 모두에 대해 매우 높은 증식을 유발시킨다. 백신 접종된 마우스에서 gp120 처리함으로써 매우 강한 헬퍼 T 세포 메모리 반응을 획득하지만, 천연의 마우스는 반응되지 않았다(특이적 반응성에 대한 한계치는 >3-4의 자극 지수(SI)이고; SI는 샘플 cpm/배지 cpm의 비로서 산정된다). 이들 마우스에 대해 각각 5643 및 11,900의 항-gp120 ELISA 역가와 비교해서 65 및 14의 SI가 백신접종된 마우스에 대해서 획득된다. 흥미롭게도, 이들 두 마우스의 경우, 항체에 대한 반응도가 보다 높을수록 T 세포 반응성이 보다 낮은 항체 역가를 갖는 마우스 보다 상당히 더 낮다. 이러한 실험은 분비된 gp120 벡터가 생체내에서 헬퍼 T 세포를 효율적으로 활성화시킬 뿐만 아니라 강력한 항체 반응을 발생시킨다는 것을 입증해주고 있다. 또한, 이들 면역 반응 각각은 PNV 접종물에 의해 암호화된 것에 필적하여 이종인 항원을 이용하여 결정한다(ⅢB 대 MN).
실시예 12
gp160 백신
분비된 gp120 작제물 이외에, 본 발명자들은 완전한 길이의 막 결합된 gp160용 발현 작제물을 제조하였다. gp120 이외에 gp160에 대한 이론적 근거는 (1) 더 많은 에피토프가 양 CTL 자극뿐만 아니라 gp41[이에 대하여 강력한 HIV 중화 모노클로날 항체(2F5, 상기 참조)가 지시된다]을 포함하여 중화 항체 생성 모두에 이용 가능하고; (2) 바이러스-생성 gp160에 비해 보다 더 천연인 단백질 구조물이 획득될 수 있으며; (3) 면역원성에 대한 막-결합된 인플루엔자 HA작제물의 성공이다[참조: Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993; Montgomery, D., et al., DNA and Cell Biol., 12:777-783, 1993]. gp160은 추가의 작제물이 만들어져서 REV의 부재하에서의 발현을 증가시키도록 이종 리더 펩타이드 서열을 갖는 경우일지라도 상당한 REV 의존성을 보유하고 있다.
실시예 13
HIV 세포독성 T-임파구에 대한 분석
본 섹션에 기술된 방법은 백신 접종된 마우스에 대해 사용된 바와 같은 분석을 예시하고 있다. 자가성 B 세포주가 각 동물에 대한 표적 동물로서 사용되어야만 한다는 것을 제외하고는 영장류에 대해서 본질적으로 유사한 분석을 이용할 수 있다. 이는 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스를 이용하여 사람에 대해 달성될 수 있으며 B형 간염 바이러스를 이용하여 붉은털 원숭이에 대해서도 달성할 수 있다.
백혈구로부터 적혈구를 분리시키기 위하여 피콜-하이파크 원심분리를 이용하여 신선하게 추출된 혈액 또는 비장으로부터 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 유도시킨다. 마우스의 경우, 림프절을 사용할 수도 있다. IL-1(20U/ml) 및 콘카나발린 A(2㎍/ml)에서 6 내지 12일 동안 시험관내 배양시키거나 동수의 조사된 항원 표시 세포를 이용하여 특이적 항원을 사용함으로써 PBMC로부터 유효인자 CTL를 제조할 수 있다. 특이적 항원은 사용된 동물의 MHC 단순유형에 대한 CTL 인식용으로 공지된 에피토프인 합성 펩타이드(통상 9 내지 15개 아미노산), 또는 적당한 항원을 발현하도록 공학적으로 처리된 백시니아 바이러스 작제물로 이루어질 수 있다. 효적 세포는 선천성이거나 또는 CTL의 시험관내 자극에 대해 기술된 바와 같은 적당한 항원을 표시하도록 처리시킨 MHC 단순유형-매치된 세포주일 수 있다. Balb/c 마우스의 경우, P18 펩타이드(ArgIleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrLysAsn, 서열 51; HIV MN 균주에 대함)를 10μM 농도로 사용하여, 조사된 선천성 비세포를 이용하여 시험관내에서 CTL을 재자극시킬 수 있으며 이를 사용하여 분석에 앞서 약 2시간 동안 37℃에서 배양함으로써 1 내지 10μM에서 세포독성 분석 동안 표적 세포를 감작화할 수 있다. 이들 H-2dMHC 단순유형 마우스의 경우, 쥐의 비만세포종 세포주인 P815는 우수한 표적 세포를 제공해준다. 표적물을 37℃에서 1 내지 2시간 동안 배양한 다음(약 5 x 106세포에 대해 0.2mCi) 이러한 표적 세포를 수 차례 세척함으로써 CTL에 의해 사멸시킬 때 표적 세포의 내부로부터 방출되는 항원-감작화된 표적 세포를 Na51CrO4를 이용하여 부하한다. CTL 집단을 100:1, 50:1, 25:1 등의 유효인자 대 표적물의 다양한 비율로 표적 세포와 혼합하고, 함께 펠렛화한 다음, 상등액을 수거하기 전에 37℃에서 4 내지 6시간 동안 배양한 후, 감마 계수기를 이용하여 방사능 방출에 대해 분석한다. 세포독성은 표적 세포로부터의 자발적인 방출을 공제시킨 표적 세포(0.2% 트리톤 X-100 처리를 이용하여 수득됨)로부터의 방출 가능한 총 계수의 비율로서 산정된다.
실시예 14
HIV 특이적 항체에 대한 분석
기질 항원으로서 특이적 재조합 단백질 또는 합성 펩타이드를 사용하여 HIV에 대하여 발생된 항체를 탐지하도록 ELISA를 고안한다. 96웰 미세역가 플레이트를, 흔들리는 플랫폼 상에서 50㎕/웰을 사용하여 PBS(인산염 완충 식염수) 용액 중의 2㎍/ml의 재조합 항원으로 4℃에서 밤새 도포시킨다. 항원은 재조합 단백질(gp120, rev: Repligen Corp.; gp160, gp41: American Bio-Technologies, Inc.) 또는 합성 펩타이드(ⅢB로부터의 바이러스 분리물 서열에 상응하는 V3 펩타이드 등: American Bio-Technologies, Inc.; 모노클로날 항체 2F5에 대한 gp41 에피토프)로 구성된다. 세척 완충물(PBS/0.05% 트윈 20)을 사용한 다음 진동시키면서 실온에서 차단 완충물(PBS/0.05% 트윈 20 중의 1% 연분홍색 밀크 용액) 200㎕/웰을 1시간 동안 가함으로써 플레이트를 4회 세정한다. 예비-혈청 및 면역 혈청을 차단 완충액 중에서 목적하는 희석 범위로 희석시키고 웰당 100㎕을 가한다. 플레이트를 진동시키면서 실온에서 1시간 동안 배양한 다음 세척 완충액으로 4회 세척한다. 이어서, 차단 완충액 중에서 1:2000으로 희석된 고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 2차 항체(항-붉은털 원숭이 Ig, Southern Biotechnology Associates; 항-마우스 및 항-래빗트 Igs, Jackson Immuno Research)를 100㎕/웰로 각 샘플에 가하고 진동시키면서 실온에서 1시간 동안 배양한다. 플레이트를 세척 완충액으로 4회 세척한 다음, 100mM 시트레이트 완충액 중의 1mg/ml의 o-페닐렌디아민(o-PD, Calbiochem) 용액 100㎕/웰을 가함으로써 전개시킨다. 플레이트를 역학적으로(반응의 처음 10분간) 및 10 및 30분 종점(Thermo-max 마이크로플레이트 판독기, Molecular Devices)에서 450nm의 흡광도에 대해 판독한다.
실시예 15
HIV 중화 항체에 대한 분석
백신 접종된 동물로부터 유도된 혈청을 사용하여 HIV 분리물의 시험관내 중화 분석을 다음과 같이 수행한다. 시험 혈청 및 예비-면역 혈청을 사용하기 전에 56℃에서 60분 동안 가열한다. 적정된 양의 HIV-1을 시험 혈청의 일련의 1:2 희석물로 가하고, 96웰 미세역가 플레이트에서 105MT-4 사람 유임파구 세포에 가하기 전에 실온에서 60분간 배양한다. 바이러스/세포 혼합물을 37℃에서 7일 동안 배양하고 배양물을 테트라졸륨 염료로 염색함으로써 바이러스-매개된 세포의 사멸에 대해 분석한다. 바이러스-매개된 세포 사멸의 방지에 의한 바이러스의 중화가 관찰된다.
실시예 16
임상적 HIV 분리물로부터 유전자의 분리
ConA 처리에 의해 활성화시킨 감염된 PBMC로부터 HIV 바이러스성 유전자를 클로닝한다. 이러한 바이러스성 유전자를 수득하는데 바람직한 방법은 목적하는 유전자에 플랭킹하는 특정 올리고머를 사용하여 감염된 세포상 게놈으로부터 PCR 증폭에 의해서이다. 바이러스성 유전자를 수득하기 위한 두 번째 방법은 감염된 세포의 상등액으로부터 바이러스성 RNA를 정제하고 후속 PCR을 이용하여 상기 물질로부터 cDNA를 제조하는 것이다. 이러한 방법은 사용된 PCR 올리고머와, 특정 프라이밍 올리고머 대신 cDNA를 제조하는데 사용된 랜덤 6량체를 제외하고는 쥐의 B7 유전자를 클로닝하는데 상기 언급된 방법과 유사하다.
게놈성 DNA를 프로테이나제 K 및 SDS가 각각 0.1mg/ml 및 0.5% 최종 농도로 가해진 STE 용액(10mM NaCl, 10mM EDTA, 10mM 트리스-HCl, pH 8.0)에서 용해시킴으로써 감염된 세포 펠렛으로부터 정제한다. 상기 혼합물을 56℃에서 밤새 배양하고 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜(25:24:1) 0.5 용적으로 추출시킨다. 이어서, 나트륨 아세테이트를 0.3M 최종 농도 및 2 용적의 찬 에탄올에 가함으로써 수성 상을 침전시킨다. DNA를 용액으로부터 펠렛 후, 상기 DNA를 0.1X TE 용액(1X TE=10mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 재현탁시킨다. 이때, SDS를 37℃에서 30분 동안 배양하면서 RNAse A 2U로 0.1%에 가한다. 이 용액을 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜로 추출한 다음 앞서와 같이 에탄올로 침전시킨다. DNA를 0.1 X TE에 현탁시키고 260nm에서의 자외선 흡광도를 측정함으로써 정량화한다. 샘플을 PCR에 사용될 때까지 -20℃에서 저장한다.
다음 gp160에 대한 센스 및 안티센스 올리고머를 사용하여 퍼킨-엘머 세투스 키트 및 과정을 이용하여 PCR을 수행한다: 5'-GA AAG AGC AGA AGA CAG TGG CAA TGA-3' 및 5'-GGG CTT TGC TAA ATG GGT GGC AAG TGG CCC GGG C ATG TGG-3'. 이들 올리고머는 상기 생성된 DNA 단편의 3'-말단에 SrfⅠ 부위를 가한다. PCR 유도된 절편을 V1Jns 또는 V1R 백신접종용 벡터 내로 클로닝시키고 V3 영역뿐만 아니라 연결부 부위를 DNA 서열 분석에 의해 확인한다.
실시예 17
T 세포 증식 분석
PBMC를 수득하고 PBMC 집단 내에서의 증식에 의해 결정된 바와 같이 특이적 항원에 대한 리콜 반응에 대해 시험한다. 수거하기 전 마지막 18 내지 24시간 배양 동안 세포 배양물에 가해지는3H-티미딘을 사용하여 증식을 모니터한다. 세포 수거제는 증식이 발생하는 경우에는 필터 상에 동위원소 함유 DNA를 보유하지만 정지한 세포는 유리 형태로 필터 상에 보유되지 않은 동위원소를 혼입시키지 못한다. 설치류 또는 영장류의 경우, 4 X 105세포를 총 200㎕의 완전 배지(RPMI/10% 태내 송아지 혈청)에서 96웰 미소역가 플레이트에 도말한다. PMBC 및 배지 만을 사용하여 배경 증식 반응을 결정하는 반면, 양성 대조군으로서 작용하는 식물성 혈구응집소(PHA) 또는 콘카나발린 A(ConA) 등의 레시틴을 1 내지 5㎍/ml 농도로 사용하여 비특이적 반응을 발생시킨다. 특이적 항원은 공지된 펩타이드 에피토프, 공지된 단백질 또는 불활성화된 바이러스로 구성된다. 항원 농도는 펩타이드의 경우에는 1 내지 10μM의 범위이고 단백질의 경우에는 1 내지 10㎍/ml이다. 레시틴 유도된 증식은 세포 배양물 배양한지 3 내지 5일 째에 피크를 이루는 반면, 항원 특이적 반응은 5 내지 7일째에 피크를 이룬다. 배지 배경에 비해 3배 이상인 방사선 계수가 수득되는 경우에 특이적 증식이 발생되며, 이는 종종 배경에 대한 비율 또는 자극 지수(SI)로서 종종 제시된다. HIV gp160은 gp160/gp120 면역되거나 HIV-감염된 개개체의 T 세포 증식을 야기시키는 것으로 공지된 몇몇 펩타이드를 함유하는 것으로 공지되어 있다. 이들 중 가장 통상적으로 사용되는 것은:
T1(LysGlnIleIleAsnMetTrpGlnGluValGlyLysAlaMetTyrAla); T2(HisGluAspIleIleSerLeuTrpAspGlnSerLeuLys); 및
TH4(AspArgVlaIleGluValValGlnGlyAalTyrArgAlaIleArg)이다. 이들 펩타이드는 항원-감작화된 마우스, 사람이 아닌 영장류 및 사람으로부터의 PMBC의 증식을 자극하는 것으로 나타났다.
실시예 18
벡터 V1R 제조
본 발명의 기본적인 백신 접종용 벡터를 최적화하는 것을 지속적으로 하기 위하여, 본 발명자들은 V1R로서 명명된 V1Jns의 유도체를 제조하였다. 이러한 벡터 작제의 목적은 최소 크기의 백신 벡터, 즉 불필요한 DNA 서열을 지니지 않으면서도 전반적으로 최적화된 이종 유전자 발현 특징과 V1J 및 V1Jns가 부여하는 높은 플라스미드 산출량은 여전히 보유한 벡터를 수득하는 것이다. 본 발명자들은 당해 문헌뿐만 아니라 (1) 이. 콜라이 복제 기점을 포함하는 pUC 주쇄 내의 영역이 박테리아로부터의 플라스미드 생성에 영향을 미치지 않으면서도 제거될 수 있고; (2) 카나마이신 개방 판독 프레임 다음에 있는 kanr유전자의 3'-영역은 박테리아성 터미네이터가 대신 삽입되는 경우에는 제거될 수 있으며; (3) BGH 터미네이터의 3'-절반으로부터의 대략 300bp가 이의 조절성 작용기(BGH 요소 내에서 본래의 KpnⅠ 제한 효소 부위 다음)에 영향을 미치지 않으면서도 제거될 수 있다는 실험에 의해 결정하였다.
CMVintA 프로모터/BGH 터미네이터, 복제 기점 및 카나마이신 내성 요소를 각각 나타내는 V1Jns로부터의 3가지 DNA 절편을 합성하기 위하여 PCR을 사용하여 V1R을 작제한다. 각 절편에 독특한 제한 효소를 PCR 올리고머를 사용하여 각 절편 말단에 가한다: CMVintA /BGH에 대해서는 SspⅠ 및 XhoⅠ; kanr유전자에 대해서는 EcoRV 및 BamHⅠ; 및 orir에 대해서는 BclⅠ 및 SalⅠ. 이들 효소 부위를 선택하는데, 이는 이들이 각 부위를 연속적으로 상실시키면서 PCR-유도된 DNA 절편 각각의 지시적 연결을 허용시켜주기 때문이다: EcoRV 및 SspⅠ는 연결에 적합한 평활 말단된 DNA를 잔존시키는 반면, BamHⅠ 및 BclⅠ은 SalⅠ 및 XhoⅠ과 같이 상보적 오버행을 잔존시킨다. PCR에 의해 이들 절편을 수득한 후, 각 절편을 앞서 지시된 적당한 제한 효소로 분해시킨 다음 이들 3가지 DNA 절편 모두를 함유하는 단일 반응 혼합물에서 함께 연결시킨다. orir의 5'-말단은 카나마이신 내성 유전자에 대한 종결 정보를 제공할 수 있도록 상기 영역에서 정상적으로 발견되는 T2 rho 독립적인 터미네이터 서열을 포함하도록 고안된다. 이와 같이 연결된 생성물은 제한 효소 분해(>8개 효소) 뿐만 아니라 연결부의 DNA 서열 분석에 의해 확인한다. V1R 내에서 바이러스성 유전자를 사용한 DNA 플라스미드 생산과 이종 발현은 V1Jns와 유사한 것으로 여겨진다. 성취된 총 벡터 크기 감소는 1346bp이다(V1Jns=4.86kb; V1R=3.52kb)(도 11, 서열 45 참조).
V1R을 합성하기 위해 사용된 PCR 올리고머 서열(제한 효소 부위는 밑줄쳐져 있고 서열 다음에 블랭킷으로 나타내었다):
(1) 5'-GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TAC G-3' [SspI, 서열:],
(2) 5'-CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGC ACC-3' [XhoI, 서열 ::](CMVintA/BGH 단편용),
(3) 5'-GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGT TGT GTC TCA AAA TC-3' [EcoRI, 서열::],
(4) 5'-CCA CAT GGA TCC G TAA TGC TCT GCC AGT GTT ACA ACC-3' [BamHI, 서열 ::](카나마이신 내성 유전자 단편용),
(5) 5'-GGT ACA TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATC TTC TTG-3' [BclI, 서열 ::],
(6) 5'-CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG-3' [SalI, 서열 ::](이. 콜라이 복제 기점용).
연결부는 다음 올리고머를 사용하여 V1R에 대해 서열분석하였다:
5'-GAG CCA ATA TAA ATG TAC-3'(서열::)[CMVintA/kanr연결부]
5'-CAA TAG CAG GCA TGC-3'(서열::)[BGH/ori 연결부]
5'-G CAA GCA GCA GAT TAC-3'(서열::)[ori/kanr연결부]
실시예 19
HIV 후기 유전자 생성물의 이종 발현
env 및 gag 등의 HIV 구조 유전자는 완전한 길이의 단백질을 효과적으로 생성시키기 위하여 HIV 조절성 유전자인 rev의 발현을 필요로 한다. 본 발명자들은 gag의 rev-의존적 발현으로 인해 저수준의 단백질이 생성되고 rev 자체가 세포에 대해 독성일 수 있다는 사실을 밝혔다. 본 발명자들이 시험관내에서 비교적 고수준의 gp160의 rev-의존적 발현을 성취하긴 하였지만, 이러한 백신은 rev/gp160 DNA으로의 생체내 면역화를 수행하면서 gp160에 대한 저수준의 항체를 유도시킨다. 이는 rev의 공지된 세포독성 효과뿐만 아니라 수 백개의 핵을 함유하는 미오튜불에서 rev 기능을 수득하는데 있어서의 어려움 증가로부터 기인된 것일 수 있다(gag 또는 env 단백질 발현이 발생되기 위해서는 rev 단백질이 rev-의존적 전사체와 동일한 핵에 존재할 필요가 있다). 그러나, env 유전자의 선별된 변형물을 사용하여 rev-독립적인 발현을 수득하는 것이 가능하였다.
1.env의 rev-독립적인 발현
일반적으로, 본 발명의 백신은 CMV 즉시 초기(IE) 프로모터, BGH-유도된 폴리아데닐화 및 전사 종결 서열 및 pUC 주쇄로 구성되는 본 발명의 일반화된 백신 접종용 벡터 V1Jns 내에서 발현을 최적화하기 위하여 1차적 HIV(ⅢB) env 및 gag 유전자를 활용하였다. 얼마나 큰 유전자 절편(예를 들면, gp120 대 gp160)이 사용되었는지에 따라서, env의 천연의 분비성 리더 펩타이드를 조직 특이적 플라스미노겐 활성인자(tPA) 유전자로부터의 것으로 대체하고 이로써 생성된, CMV 인트론 A를 갖는 CMVIE 프로모터 뒤에 있는 키메라 유전자를 발현시킴으로써, env에 대한 rev-독립적인 발현의 다양한 효능이 달성될 수 있다. tPA-gp120은 백신 접종된 마우스 및 원숭이에서 항-gp120 면역 반응을 유도시키기에 충분히 기능하는 방식으로 작제된 분비된 gp120 벡터의 한 예이다.
막-부착된 단백질이 분비된 단백질과 비교해서 훨씬 더 상당한 (및 아마도 HIV 중화에 대해 더욱 특이적인) 항체 반응을 유도시킬 뿐만 아니라 부가의 면역 에피토프를 획득시킨다는 보고서로 인해, 본 발명자들은 V1Jns-tPA-gp160 및 V1Jns-rev/gp160을 제조하였다. tPA-gp160 벡터는 형질감염된 세포의 면역블롯 분석에 의해 나타낸 바와 같이, rev의 첨가없이도 탐지 가능한 양의 gp160 및 gp120을 생성시키지만, 발현 정도는 rev-의존적 gp160-발현 플라스미드인 rev/gp160에 대해 수득된 것보다 훨씬 낮다. 이는 아마도, gp160 전사체에 대한 rev 의존성을 부여해주는 억제성 영역이 gp41의 COOH-말단을 포함하여 gp160 내에서의 여러 부위에서 발생되기 때문인 것으로 여겨진다. 이들 억제성 서열을 제거함으로써 env의 전반적인 발현 정도를 증가시키도록 고안된, COOH-말단적으로 절단된 형태의 tPA-gp160(tPA-gp143)에 대한 한 벡터를 제조한다. gp143 벡터는 또한, 막 단백질을 세포 표면으로가 아니라 리소좀으로 전환시키는 것으로 공지된 펩타이드 모티브(예:Leu-Leu)를 함유하는 세포내 gp41 영역을 제거시킨다. 따라서, gp143은 완전한 길이의 gp160와 비교해서 세포 표면으로의 단백질의 수송 효율과 env 단백질의 발현(rev-의존성을 저하시킴으로써) 모두를 증가시키는 것으로 예상될 수 있으며, 여기서 상기 단백질은 DNA 백신 접종 후 항-gp160 항체를 보다 잘 유도시킬 수 있다. rev 반응 요소(RRE) 서열(350bp)을 광범위하게 사일런트 돌연변이시킴으로써 tPA-gp143을 추가로 변형시켜 발현을 위한 부가의 억제성 서열을 제거한다. 이러한 작제물, gp143/mutRRE는 두가지 형태, 즉 gp120/41에 대한 단백질 분해성 절단 부위를 제거시킨 형태(형태 A) 또는 보유시킨 형태(형태 B)로 제조한다. 백시니아에서 발현된 절단 가능하지 않은 gp160을 사용하여 마우스를 백신 접종시키면 절단 가능한 형태보다도 훨씬 높은 수준의 gp160에 대한 항체가 유도되었다는 문헌의 보고 내용에 기인하여 양 형태를 제조하였다.
세포 형질감염체에서 gp160/gp120 발현에 대한 정량적 ELISA를 개발시켜 이들 벡터에 대한 상대적인 발현 능력을 결정한다. 293 세포를 시험관내에서 형질감염시킨 다음 세포 결합된 gp120 대 분비된/방출된 gp120을 정량화하면 다음과 같은 결과가 수득된다: (1) tPA-gp160은 세포 표면으로부터 방출된 비율이 세포내적으로 보유된 비율과 유사한 rev/gp160 보다 5 내지 10배 정도 덜 gp120을 발현시켰고; (2) tPA-gp143은 단지 낮은 수준의 세포-결합된 gp143으로 rev/gp160 보다는 gp120을 3 내지 6배 정도 더 많이 분비시켰는데, 이는 gp160의 세포질성 말단이 이러한 서열의 부분적 결실에 의해 극복될 수 있는 gp160의 세포내 보존을 야기시킨다는 것을 확인시켜주며; (3) tPA-gp143/mutRRE A 및 B는 모 tPA-gp143 보다 대략 10배 정도 더 높은 수준으로 단백질을 발현시켜주는 반면, 단백질 분해성 프로세싱의 제거는 형태 A에 대해서 확인되었다.
따라서, rev-독립적인 발현을 증가시키고자 한 본 방법으로 인해, 전반적인 발현 수준이 단계적으로 증가되었을 뿐만 아니라 막-부착된 gp143이 리소좀으로부터 떨어져서 세포 표면으로 재지시되었다. NH2-말단(tPA 리더) 또는 COOH-말단(gp41)에 있는 이들 변형물을 함유하는 벡터 카셋트 내에서 각종 1차 바이러스성 분리물로부터 유도된 gp120 서열을 삽입하는 것이 가능해야만 하는, 유전 작제물인 것이 중요하다.
2.임상적 분리물로부터 유도된 gp120의 발현
이들 발현 방법을 백신 용도로 타당한 바이러스에 적용하고 본 접근법의 통칙을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 또한, 1차 HIV 분리물(노쓰 아메리칸 컨센서스 V3 펩타이드 루프; 대식세포-반응성 및 비합포체-유도 표현형을 함유함)로부터 유도된 tPA-gp120 벡터를 제조하였다. 이러한 벡터는 형질감염된 293 세포를 이용하여 gp120을 고수준으로 발현/분비시키고 마우스에서 항-gp120 항체를 유도시켰는데, 이는 이것이 작용성 형태로 클로닝되었다는 것을 나타낸다. 1차 분리물 gp160 유전자 또한, 실험실용 균주로부터 유도된 gp160에 대해서와 동일한 방식으로 발현에 사용될 것이다.
B.HIV-1 env 폴리뉴클레오티드 백신에 대한 면역 반응
마우스에서 면역 반응에 대한 백신 접종 경로의 효과: gp160의 발현을 증가시키고자 하는 노력을 진행중이지만, 본 발명자들은 tPA-gp120 DNA 작제물을 활용하여 면역 반응과 이들을 증진시키는 방법을 평가하였다. 마우스에서 100, 10 및 1㎍ 용량으로 본 벡터에 대해 근육내 및 피내 백신 접종 경로를 비교한다. 어느 한 경로에 의한 백신 접종은 3가지 용량 수준 모두에서 2 내지 3회 백신 접종한 후 모든 수용체에서 항체 반응(GMTs=103-104)을 유발시켰다. 각 경로는 명백한 용량-의존성 반응을 나타내면서 유사한 항-gp120 항체 역가를 유발시켰다. 그러나, 본 발명자들은 특히 초기 접종한 후 보다 낮은 용량에서 피내 백신 접종에 대한 반응의 보다 큰 변화성을 관찰하였다. 더욱이, 항원-특이적 시험관내 증식 및 사이토킨 분비에 의해 결정된 바와 같이, 헬퍼 T-세포 반응은 혈중 보다는 근육내 백신 접종에서 보다 높다. 본 발명자들은 본 백신에 대한 피내 백신 접종이 근육내 백신 접종에 비해 어떠한 잇점도 제공하지 못하는 것으로 결론지었다.
2.마우스에서 gp120 DNA 백신-매개된 헬퍼 T 세포 면역
gp120 DNA 백신 접종시키면, TH1-유사 사이토킨 분비 프로파일(즉, IL-4를 거의 또는 전혀 사용하지 않고 g-인터페론 및 IL-2 생성)로 시험된 모든 임파성 구획물(비장, 혈액, 서혜, 격막 및 장골 돌기)에서 강력한 헬퍼 T 세포 반응이 야기되었다. 이들 사이토킨은 일반적으로 강력한 세포성 면역을 증진시키고 HIV-혈청 양성 환자에 대해서 질병이 없는 상태를 유지시키는 것과 연관이 있다. 림프절은 바이러스가 혈액 내에서 용이하게 탐지될 수 없는 경우일지라도 바이러스의 큰 저장소를 보유하고 있는, HIV 복제에 대한 1차적 부위인 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 DNA 백신의 경우에 나타낸 바와 같이, 각종 림프 부위에서 항-HIV 면역 반응을 유발시키는 백신은 초기 감염 후 임파관의 성공적인 전이증식의 예방에 도움을 줄수 있다.
3.env DNA 백신 매개된 항체 반응
gp120 DNA 백신이 투여된 아프리카산 그린 원숭이(AGM)와 붉은털 원숭이(RHM)는 2 내지 3회 백신 접종 후 낮은 수준의 중화 항체를 나타내었으며, 이는 부가의 백신 접종에 의해 증가될 수 없었다. 이들 결과뿐만 아니라, HIV 백신 분야에서 올리고머성 gp160이 gp120 단량체보다 중화 항체를 유발시키는데 훨씬 더 타당한 표적 항원일 것이라는 의식이 증가됨에 따라, 본 발명자들은 gp160 근거 벡터를 효과적으로 발현시키는데 초점을 맞추게 되었다[상기 참조]. 마우스 및 AGM에게 또한 상기 1차 분리물 유도된 tPA-gp120 백신을 접종하였다. 이들 동물은 500 내지 5000 범위의 항-V3 펩타이드(동종 서열을 이용함) 상대적 종점 항체 역가를 나타내는데, 이는 상기 백신 고안물이 임상적으로 관련된 바이러스성 분리물에 대해 작용성이라는 것을 입증해준다.
gp160 근거 백신인 rev-gp160 및 tPA-gp160은 마우스와 사람이 아닌 영장류에서 항체 반응을 지속적으로 유발시키지 못하였거나 낮은 항체 역가를 산출시켰다. tPA-gp143 플라스미드를 이용한 본 발명자들의 초기 결과는 2회 백신 접종 후 마우스 및 AGM에서 >103의 기하학적 평균 역가를 산출시켰다. 이들 데이터는 본 발명자들이 발현 정도를 증가시키고 세포 표면에 대한 env의 보다 효과적인 세포내 트래픽킹에 의해 gp160-유사 백신의 면역원성을 상당히 증가시켰다는 것을 지시하고 있다. 이러한 작제물뿐만 아니라 tPA-gp143/mutRRE A 및 B 벡터를 대상으로 하여 항체 반응, 특히 바이러스 중화에 대한 성상 확인이 지속적으로 이루어질 것이다.
4.원숭이에서 env DNA 백신-매개된 CTL 반응
본 발명자들은 gp120 및 gp160/IRES/rev DNA로 백신 접종시킨 RHM의 CTL 반응에 대한 성상 확인을 지속하였다. 이러한 백신이 투여된 4마리 원숭이 모두는 2회 백신 접종 후 상당한 MHC 부류 Ⅰ-제한된 CTL 활성(유효인자/표적에서의 20 내지 35% 특이적 사멸=20)을 나타내었다. 4번째 백신 접종 후, 이들 활성은 유사한 시험 조건하에서 50 내지 60% 사멸율로 증가되었는데, 이는 부가의 백신 접종이 반응을 상당히 부스팅시켰다는 것을 지시하고 있다. 이러한 CTL 활성은 최종 백신 접종 후 적어도 7개월 동안 이들의 피크 수준의 약 50% 수준으로 지속되었는데, 이는 장기간 메모리가 확립되었다는 것을 지시해준다.

Claims (10)

  1. HIV env 단백질 또는 이의 단편을 암호화하고 포유동물 숙주에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 서열을 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서,
    V1Jns-tPA-HIVMNgp120;
    V1Jns-tPA-HIVIIIBgp120;
    V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-A/SRV-1 3'-UTR;
    V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-B/SRV-1 3'-UTR;
    V1Jns-tPA-gp140/opt30-A;
    V1Jns-tPA-gp140/opt30-B;
    V1Jns-tPA-gp140/opt all-A;
    V1Jns-tPA-gp140/opt all-B;
    V1Jns-tPA-gp140/opt all-A;
    V1Jns-tPA-gp140/opt all-B;
    V1Jns-rev/env:;
    V1Jns-gp160;
    V1Jns-tPA-gp160;
    V1Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-B;
    V1Jns-tPA-gp160/opt all-A;
    V1Jns-tPA-gp160/opt all-B;
    V1Jns-tPA-gp160/opt all-A;
    V1Jns-tPA-gp160/opt all-B;
    V1Jns-tPA-gp143;
    V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-A;
    V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-B;
    V1Jns-tPA-gp143/opt32-A;
    V1Jns-tPA-gp143/opt32-B;
    V1Jns-tPA-gp143/SRV-1 3'-UTR;
    V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32A;
    V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32B;
    V1Jns-tPA-gp143/opt all-A;
    V1Jns-tPA-gp143/opt all-B;
    V1Jns-tPA-gp143/opt all-A;
    V1Jns-tPA-gp143/opt all-B;
    V1Jns-tPA-gp143/opt32-A/glyB;
    V1Jns-tPA-gp143/opt32-B/glyB;
    V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-A/glyB;
    V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-B/glyB;
    V1Jns-tPA-gp143/opt all-A/glyB;
    V1Jns-tPA-gp143/opt all-B/glyB;
    V1Jns-tPA-gp143/opt all-A/glyB;
    V1Jns-tPA-gp143/opt all-B/glyB; 및 이의 혼합물로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 생체내에서 사람 조직을 포함한 척추동물 조직 내로 도입될 때 항-HIV 중화 항체, HIV 특이적 T-세포 면역 반응 또는 보호 면역 반응을 유도시키는, HIV gag, gag-프로테아제 또는 env 유전자 생성물을 암호화하는 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항의 폴리뉴클레오티드 1ng 내지 100mg을 척추동물의 조직 내로 도입하는 단계를 포함하여, 척추동물에서 HIV 에피토프에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  5. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 척추동물의 조직 내로 도입하는 단계를 포함하여, HIV의 발병성 균주에 의해 야기된 감염 또는 질병에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 약독화된 HIV, 사멸된 HIV, HIV env 단백질, HIV gag 단백질, HIV pol 단백질 및 이들의 조합물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제1항의 폴리뉴클레오티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, HIV 감염에 대한 백신.
  8. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 영장류의 조직 내로 도입하고 이와 동시에 인터루킨 12를 비경구적으로 투여하는 단계를 포함하여, 영장류에서 항-HIV 면역 반응을 유도하는 방법.
  9. 척추동물의 세포를 생체내에서 제1항의 폴리뉴클레오티드에 노출시키는 단계를 포함하여, 세포독성 및 헬퍼 T-세포 증식, 및 HIV 항원에 특이적인 림포카인 분비를 포함한 유효인자 기능을 자극하기 위하여 항원 제시 세포를 유도하는 방법.
  10. (a) 적절한 개방 판독 프레임에 대한 코돈의 위치를 확인하는 단계;
    (b) 사람 유전자에 의해 관찰된 사용 빈도에 대한 야생형 코돈을 비교하는 단계;
    (c) 야생형 코돈을 사람 유전자의 고 발현을 위해 최적화된 코돈으로 대체하는 단계; 및
    (d) 증진된 발현 여부를 시험하는 단계를 포함하여, HIV 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA의 발현을 증진시키는 방법.
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