JPH08198774A - Ｄｎａワクチン - Google Patents
ＤｎａワクチンInfo
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- JPH08198774A JPH08198774A JP728895A JP728895A JPH08198774A JP H08198774 A JPH08198774 A JP H08198774A JP 728895 A JP728895 A JP 728895A JP 728895 A JP728895 A JP 728895A JP H08198774 A JPH08198774 A JP H08198774A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】エイズ用のワクチンとして有用な、ＨＩＶのエ
ンベロープ蛋白質の遺伝常法の少なくとも一部をコード
する塩基配列を有し、動物細胞内で発現可能なプラスミ
ドである。 【効果】安全でかつ液性免疫と細胞性免疫の双方を誘導
することができる。
ンベロープ蛋白質の遺伝常法の少なくとも一部をコード
する塩基配列を有し、動物細胞内で発現可能なプラスミ
ドである。 【効果】安全でかつ液性免疫と細胞性免疫の双方を誘導
することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、エイズ（ＡＩＤＳ：Ac
quired Immune Deficiency Syndrome 後天性免疫不全症
候群）の予防あるいは治療に使用されるワクチンに関す
るものである。詳しく述べると本発明は、エイズウイル
ス（以下、ＨＩＶと記する）感染症に対する、ＤＮＡワ
クチンに関するものである。
quired Immune Deficiency Syndrome 後天性免疫不全症
候群）の予防あるいは治療に使用されるワクチンに関す
るものである。詳しく述べると本発明は、エイズウイル
ス（以下、ＨＩＶと記する）感染症に対する、ＤＮＡワ
クチンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】レトロウイルスの一種とされるＨＩＶ
は、血液を媒介として、例えば感染者との性交渉あるい
は患者の血液輸血などによって感染する。そして感染に
より血中のＴ細胞が破壊され、免疫機能が著しく低下
し、カポシ肉腫、ニューモシスチスカリニ肺炎等に罹患
して死に至る。ＨＩＶ感染者数は、近年、加速度的に増
加しており、特にタイ王国、アメリカ合衆国などの諸国
においては、エイズが国民の死亡原因の上位に位置する
といったような事態となっており、その対処策が全世界
的に極めて重要なものになっている。このようなＨＩＶ
感染に対する予防および治療法については、現在数多く
の研究がなされており、ＨＩＶに対するワクチンの開発
についてもいくつかの報告がなされている。その１つに
弱毒性ウイルスワクチンがある。これは、病原性を持つ
ＨＩＶに遺伝子操作を施し、病原性を消失させたり、あ
るいは、ＨＩＶと共通の抗原性を有するウイルスを免疫
原として使用する方法である。弱毒化したウイルスは接
種された宿主に対して効果的に長期間持続する強い免疫
原性を誘導するが、理論的にはウイルスの病原性が回復
したり、非常にまれなケースではあるが他のウイルスに
汚染されている可能性が残る等の危険性がともなう。
は、血液を媒介として、例えば感染者との性交渉あるい
は患者の血液輸血などによって感染する。そして感染に
より血中のＴ細胞が破壊され、免疫機能が著しく低下
し、カポシ肉腫、ニューモシスチスカリニ肺炎等に罹患
して死に至る。ＨＩＶ感染者数は、近年、加速度的に増
加しており、特にタイ王国、アメリカ合衆国などの諸国
においては、エイズが国民の死亡原因の上位に位置する
といったような事態となっており、その対処策が全世界
的に極めて重要なものになっている。このようなＨＩＶ
感染に対する予防および治療法については、現在数多く
の研究がなされており、ＨＩＶに対するワクチンの開発
についてもいくつかの報告がなされている。その１つに
弱毒性ウイルスワクチンがある。これは、病原性を持つ
ＨＩＶに遺伝子操作を施し、病原性を消失させたり、あ
るいは、ＨＩＶと共通の抗原性を有するウイルスを免疫
原として使用する方法である。弱毒化したウイルスは接
種された宿主に対して効果的に長期間持続する強い免疫
原性を誘導するが、理論的にはウイルスの病原性が回復
したり、非常にまれなケースではあるが他のウイルスに
汚染されている可能性が残る等の危険性がともなう。
【０００３】またＨＩＶの蛋白の一部を合成したペプチ
ドワクチンも報告されている。その多くはＶ３領域のペ
プチドであるが、Ｈｏらはｅｎｖ領域のペプチドをＫＬ
Ｈに結合させてワクチンとしている。またタイプの異な
るウイルス株のペプチド配列を組み合わせたり、高分子
ペプチドにすることによって免疫原性を高める方法が試
みられてきた。しかしながら、一般的には修飾していな
いペプチドをアジュバントなしに接種したとしても、強
い細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することは、極めて困難であ
る。
ドワクチンも報告されている。その多くはＶ３領域のペ
プチドであるが、Ｈｏらはｅｎｖ領域のペプチドをＫＬ
Ｈに結合させてワクチンとしている。またタイプの異な
るウイルス株のペプチド配列を組み合わせたり、高分子
ペプチドにすることによって免疫原性を高める方法が試
みられてきた。しかしながら、一般的には修飾していな
いペプチドをアジュバントなしに接種したとしても、強
い細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することは、極めて困難であ
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】このように従来から、
エイズに対するワクチンとして、各種の報告がなされて
いるにも拘わらず、安全性が高くしかも予防効果の高い
決定的なワクチンは未だ報告されていない。従って本発
明は、新規なエイズ用ワクチンを提供することを目的と
する。本発明はまた安全性が高く、かつ種々のＨＩＶの
変異株に対して強い液性免疫と細胞性免疫とを誘導する
ことができ、予防効果の高いエイズ用ワクチンを提供す
ることを目的とする。
エイズに対するワクチンとして、各種の報告がなされて
いるにも拘わらず、安全性が高くしかも予防効果の高い
決定的なワクチンは未だ報告されていない。従って本発
明は、新規なエイズ用ワクチンを提供することを目的と
する。本発明はまた安全性が高く、かつ種々のＨＩＶの
変異株に対して強い液性免疫と細胞性免疫とを誘導する
ことができ、予防効果の高いエイズ用ワクチンを提供す
ることを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記諸目的は、以下の手
段によって達成される。 （１） ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）のエンベロー
プ蛋白質の遺伝情報の少なくとも一部をコードする塩基
配列を有する発現プラスミドからなるＤＮＡワクチン。
段によって達成される。 （１） ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）のエンベロー
プ蛋白質の遺伝情報の少なくとも一部をコードする塩基
配列を有する発現プラスミドからなるＤＮＡワクチン。
【０００６】（２） 上記エンベロープ蛋白質の遺伝情
報をコードする塩基配列は、ＣＭＶ（サイトメガロウイ
ルス）のプロモーター領域をコードする塩基配列の下流
に連結されている上記（１）に記載のＤＮＡワクチン。
報をコードする塩基配列は、ＣＭＶ（サイトメガロウイ
ルス）のプロモーター領域をコードする塩基配列の下流
に連結されている上記（１）に記載のＤＮＡワクチン。
【０００７】（３） 上記エンベロープ蛋白質の遺伝情
報をコードする塩基配列が、ｇｐ１６０である上記
（１）または（２）に記載のＤＮＡワクチン。
報をコードする塩基配列が、ｇｐ１６０である上記
（１）または（２）に記載のＤＮＡワクチン。
【０００８】（４） 蛋白質ｒｅｖの遺伝情報をコード
する塩基配列を有する発現プラスミドをさらに有する
（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡワクチン。
する塩基配列を有する発現プラスミドをさらに有する
（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡワクチン。
【０００９】
【作用】本発明者は、エイズの予防あるいは治療に有効
なワクチンとして安全性が高くかつ液性免疫および細胞
性免疫を強く誘導するものを得るため、鋭意研究の結
果、ＨＩＶを構成する蛋白質の一部をコードするＤＮＡ
による直接の免疫により宿主細胞の中で外来蛋白質が産
生され、細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されることによって長
期防御効果を維持することができるとの知見を得た。な
お、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するためには、小胞体の主
要組織適合性抗原クラスＩ分子に抗原性のペプチドを結
合させる必要があると言われているが、これは細胞にお
ける内因性の抗原性ペプチドの産生が細胞傷害性Ｔ細胞
の誘導過程に重要であることを示唆しており、ＤＮＡワ
クチンは宿主細胞の中で外来蛋白質を発現させるため、
特にこの点においても有用であると考えられる。
なワクチンとして安全性が高くかつ液性免疫および細胞
性免疫を強く誘導するものを得るため、鋭意研究の結
果、ＨＩＶを構成する蛋白質の一部をコードするＤＮＡ
による直接の免疫により宿主細胞の中で外来蛋白質が産
生され、細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されることによって長
期防御効果を維持することができるとの知見を得た。な
お、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するためには、小胞体の主
要組織適合性抗原クラスＩ分子に抗原性のペプチドを結
合させる必要があると言われているが、これは細胞にお
ける内因性の抗原性ペプチドの産生が細胞傷害性Ｔ細胞
の誘導過程に重要であることを示唆しており、ＤＮＡワ
クチンは宿主細胞の中で外来蛋白質を発現させるため、
特にこの点においても有用であると考えられる。
【００１０】そして、ＤＮＡワクチンとしてＨＩＶのエ
ンベロープの蛋白質の遺伝情報をコードする塩基配列を
有し、動物細胞内で発現可能なプラスミドを調製した。
これはさらにサイトメガロウイルスのプロモーター領域
の遺伝情報をコードする塩基配列の下流にＨＩＶのエン
ベロープの蛋白質の遺伝情報をコードする塩基配列を連
結することにより、サイトメガロウイルス（以下、ＣＭ
Ｖと記す）の強力なプロモーターよりワクチンとして働
くＨＩＶのエンベロープの蛋白質が高レベルで産生さ
れ、この蛋白質により強い液性免疫と細胞性免疫とが誘
導される。
ンベロープの蛋白質の遺伝情報をコードする塩基配列を
有し、動物細胞内で発現可能なプラスミドを調製した。
これはさらにサイトメガロウイルスのプロモーター領域
の遺伝情報をコードする塩基配列の下流にＨＩＶのエン
ベロープの蛋白質の遺伝情報をコードする塩基配列を連
結することにより、サイトメガロウイルス（以下、ＣＭ
Ｖと記す）の強力なプロモーターよりワクチンとして働
くＨＩＶのエンベロープの蛋白質が高レベルで産生さ
れ、この蛋白質により強い液性免疫と細胞性免疫とが誘
導される。
【００１１】また本発明は、さらにＨＩＶエンベロープ
の蛋白質の発現を促進させる作用を有する蛋白質である
ｒｅｖの遺伝情報をコードする塩基配列を有するプラス
ミドを同時に接種することによってその作用が増強され
る。なお、これらに使用されるプラスミドは、ある特定
の大腸菌細胞内では自己複製が可能であるが、動物細胞
内では自己複製が不可能である例えばｐＣＭＶ１６０の
ようなプラスミドを用いることが望ましい。
の蛋白質の発現を促進させる作用を有する蛋白質である
ｒｅｖの遺伝情報をコードする塩基配列を有するプラス
ミドを同時に接種することによってその作用が増強され
る。なお、これらに使用されるプラスミドは、ある特定
の大腸菌細胞内では自己複製が可能であるが、動物細胞
内では自己複製が不可能である例えばｐＣＭＶ１６０の
ようなプラスミドを用いることが望ましい。
【００１２】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。 実施例１） プラスミドの作製 ＨＩＶ−１ IIIＢ株のｅｎｖ（エンベロープ）領域（ｇ
ｐ１６０遺伝子を含む）を有するプラスミド ｐＳＭＴ
Ｅ７（J.Immunol.144,94-102) からｅｎｖ領域のＤＮＡ
断片を制限酵素 ＳａｌＩおよびＢｐｕ１１０２Ｉによ
って切り出し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって
平滑末端とした。次にサイトメガロウイルスのプロモー
ターを有する発現プラスミド ｐＢＣ／ＣＭＶを制限酵
素 ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩによって開環し、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端とした後、前記
ｅｎｖ領域のＤＮＡをＤＮＡリガーゼによって結合さ
せ、図１に示すプラスミド ｐＣＭＶ１６０を作製し
た。
説明する。 実施例１） プラスミドの作製 ＨＩＶ−１ IIIＢ株のｅｎｖ（エンベロープ）領域（ｇ
ｐ１６０遺伝子を含む）を有するプラスミド ｐＳＭＴ
Ｅ７（J.Immunol.144,94-102) からｅｎｖ領域のＤＮＡ
断片を制限酵素 ＳａｌＩおよびＢｐｕ１１０２Ｉによ
って切り出し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって
平滑末端とした。次にサイトメガロウイルスのプロモー
ターを有する発現プラスミド ｐＢＣ／ＣＭＶを制限酵
素 ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩによって開環し、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端とした後、前記
ｅｎｖ領域のＤＮＡをＤＮＡリガーゼによって結合さ
せ、図１に示すプラスミド ｐＣＭＶ１６０を作製し
た。
【００１３】実施例２） マウス筋肉中でのプラスミド
ｐＣＭ１６０の発現 《ＲＴ−ＰＣＲによるエンベロープ遺伝子転写産物の確
認》上記実施例１により調製したプラスミド ｐＣＭＶ
１６０がマウス筋肉中でｇｐ１６０のｍＲＮＡを産生し
ているか否かをＲＴ−ＰＣＲで解析した。６〜１０週令
のＢＡＬＢ／Ｃマウスにプラスミド ｐＣＭＶ１６０ ５
０μｇおよびプラスミド ｐｃＲＥＶ ５０μｇを接種し
た。接種２日後、マウスの筋肉０.１ｇからＲＮＡを抽
出し、その１０μｇに逆転写酵素を作用させＤＮＡ鎖の
作製を行ないさらにＰＣＲによる増幅を行なった。ＰＣ
Ｒ産物は１％アガロースゲル電気泳動により分離後臭化
エチジウムで染色を行なった。対照としてプラスミド
ｐＢＣ／ＣＭＶを接種したマウスの筋肉から抽出したＲ
ＮＡを用いた。ＰＣＲに用いたエンベロープ遺伝子のプ
ライマーは、センス鎖５'−ＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧ
ＧＡＡＴＧＣＴＡＧＴＴＧ−３'、アンチセンス鎖５'−
ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＧＴＣＴＣＡＴＴＣＴ
ＴＴＣＣＣＴ−３'である。
ｐＣＭ１６０の発現 《ＲＴ−ＰＣＲによるエンベロープ遺伝子転写産物の確
認》上記実施例１により調製したプラスミド ｐＣＭＶ
１６０がマウス筋肉中でｇｐ１６０のｍＲＮＡを産生し
ているか否かをＲＴ−ＰＣＲで解析した。６〜１０週令
のＢＡＬＢ／Ｃマウスにプラスミド ｐＣＭＶ１６０ ５
０μｇおよびプラスミド ｐｃＲＥＶ ５０μｇを接種し
た。接種２日後、マウスの筋肉０.１ｇからＲＮＡを抽
出し、その１０μｇに逆転写酵素を作用させＤＮＡ鎖の
作製を行ないさらにＰＣＲによる増幅を行なった。ＰＣ
Ｒ産物は１％アガロースゲル電気泳動により分離後臭化
エチジウムで染色を行なった。対照としてプラスミド
ｐＢＣ／ＣＭＶを接種したマウスの筋肉から抽出したＲ
ＮＡを用いた。ＰＣＲに用いたエンベロープ遺伝子のプ
ライマーは、センス鎖５'−ＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧ
ＧＡＡＴＧＣＴＡＧＴＴＧ−３'、アンチセンス鎖５'−
ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＧＴＣＴＣＡＴＴＣＴ
ＴＴＣＣＣＴ−３'である。
【００１４】また実験法の対照としてマウス筋肉のβ−
アクチンの転写産物の確認を同時に行なった。β−アク
チンのＰＣＲ用プライマーとしては、センス鎖５'−Ｔ
ＧＧＡＡＴＣＣＴＧＴＧＴＧＧＣＡＴＣＣＡＡＴＧＡＡ
ＡＣ−３'、アンチセンス鎖５'−ＴＡＡＡＡＣＧＣＡＧ
ＣＴＣＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＣＧ−３'を用いた。ＤＮ
Ａワクチンを接種したマウスで１、２共に１ｋｂのエン
ベロープ遺伝子の転写産物が確認された。対象のプラス
ミド ｐＢＣ／ＣＭＶを接種したマウスでは、エンベロ
ープ遺伝子の転写産物は確認できなかった。これにより
ＤＮＡワクチンはマウス筋肉中でエンベロープ遺伝子の
ｍＲＮＡを発現可能であることが示された。
アクチンの転写産物の確認を同時に行なった。β−アク
チンのＰＣＲ用プライマーとしては、センス鎖５'−Ｔ
ＧＧＡＡＴＣＣＴＧＴＧＴＧＧＣＡＴＣＣＡＡＴＧＡＡ
ＡＣ−３'、アンチセンス鎖５'−ＴＡＡＡＡＣＧＣＡＧ
ＣＴＣＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＣＧ−３'を用いた。ＤＮ
Ａワクチンを接種したマウスで１、２共に１ｋｂのエン
ベロープ遺伝子の転写産物が確認された。対象のプラス
ミド ｐＢＣ／ＣＭＶを接種したマウスでは、エンベロ
ープ遺伝子の転写産物は確認できなかった。これにより
ＤＮＡワクチンはマウス筋肉中でエンベロープ遺伝子の
ｍＲＮＡを発現可能であることが示された。
【００１５】《免疫組織染色によるエンベロープの遺伝
子の発現の確認》６〜１０週令のＢＡＬＢ／Ｃマウスに
プラスミド ｐＣＭＶ１６０ １０μｇおよびプラスミド
ｐｃＲＥＶ １０μｇを接種した。接種１０日後、接種
部位のマウスの筋肉を固定し、切片を作製した。その切
片を最初に抗ＨＩＶエンベロープ蛋白質マウスモノクロ
ーナル抗体と反応させた。次にＰＢＳで洗浄後、ペルオ
キシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧを反応させた。再び
ＰＢＳで洗浄後、３，３’−ジアミノベンジジンで染色
したところ、いくつかの細胞が特異的に染色されてお
り、プラスミド ｐＣＭＶ １６０はマウス筋肉細胞中
でエンベロープの蛋白質を発現していることが確認され
た。
子の発現の確認》６〜１０週令のＢＡＬＢ／Ｃマウスに
プラスミド ｐＣＭＶ１６０ １０μｇおよびプラスミド
ｐｃＲＥＶ １０μｇを接種した。接種１０日後、接種
部位のマウスの筋肉を固定し、切片を作製した。その切
片を最初に抗ＨＩＶエンベロープ蛋白質マウスモノクロ
ーナル抗体と反応させた。次にＰＢＳで洗浄後、ペルオ
キシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧを反応させた。再び
ＰＢＳで洗浄後、３，３’−ジアミノベンジジンで染色
したところ、いくつかの細胞が特異的に染色されてお
り、プラスミド ｐＣＭＶ １６０はマウス筋肉細胞中
でエンベロープの蛋白質を発現していることが確認され
た。
【００１６】実施例３） ウサギを用いての免疫原性の
検討 《ワクチンの接種回数と抗体価の変動》日本ＳＬＣより
購入した１０週令のＳＴＤ：ＪＷ／ＣＳＫウサギに対し
て、上記実施例１により調製したプラスミド ｐＣＭ１
６０ １０μｇをプラスミド ｐｃＲＥＶ１０μｇと共に
接種した。次に２週、４週、６週、８週間後に再び同様
の接種を行なった。それぞれの免疫１週間後に血清を採
取し、ＥＬＩＳＡ法によって抗体価を測定した。
検討 《ワクチンの接種回数と抗体価の変動》日本ＳＬＣより
購入した１０週令のＳＴＤ：ＪＷ／ＣＳＫウサギに対し
て、上記実施例１により調製したプラスミド ｐＣＭ１
６０ １０μｇをプラスミド ｐｃＲＥＶ１０μｇと共に
接種した。次に２週、４週、６週、８週間後に再び同様
の接種を行なった。それぞれの免疫１週間後に血清を採
取し、ＥＬＩＳＡ法によって抗体価を測定した。
【００１７】ＥＬＩＳＡは、Inami らの方法に従って行
なった。(AIDS 5,1140-1141.1991)すなわちｐＣＭ１６
０およびｐｃＲＥＶが産生したペプチドと、ｇｐ１２０
とを２０μｇ／ｍｌの濃度で９６穴プレートに固相化し
た。マッコウクジラのミオグロビンのペプチド（ＡＬＶ
ＥＡＤＶＡ）も対照として同一濃度で固相化した。１時
間後、ウエルを洗浄し、希釈した血清を分注し１時間反
応させた。その後、再びウエルを洗浄しペルオキシダー
ゼ標識した抗ウサギＩｇＧを反応させ、さらにウエルを
洗浄後、ＯＰＤ溶液を加えて発色させた。図２に示した
ように抗ＨＩＶ抗体価は、２週目の免疫以降大きく上昇
した。それ以降は、免疫回数に応じて徐々に上昇した。
抗体価はＯＤ490 が０.２以上となる最高希釈倍率の逆
数として表現している。
なった。(AIDS 5,1140-1141.1991)すなわちｐＣＭ１６
０およびｐｃＲＥＶが産生したペプチドと、ｇｐ１２０
とを２０μｇ／ｍｌの濃度で９６穴プレートに固相化し
た。マッコウクジラのミオグロビンのペプチド（ＡＬＶ
ＥＡＤＶＡ）も対照として同一濃度で固相化した。１時
間後、ウエルを洗浄し、希釈した血清を分注し１時間反
応させた。その後、再びウエルを洗浄しペルオキシダー
ゼ標識した抗ウサギＩｇＧを反応させ、さらにウエルを
洗浄後、ＯＰＤ溶液を加えて発色させた。図２に示した
ように抗ＨＩＶ抗体価は、２週目の免疫以降大きく上昇
した。それ以降は、免疫回数に応じて徐々に上昇した。
抗体価はＯＤ490 が０.２以上となる最高希釈倍率の逆
数として表現している。
【００１８】《ワクチン２回接種後の抗体価の変動》前
記のウサギにプラスミド ｐＣＭＶ１６０ ２５μｇおよ
びプラスミド ｐｃＲＥＶ２５μｇを２回接種した。抗
体価は前記と同様な方法で測定した。図３に示したよう
に抗ＨＩＶ抗体価は免疫８週間後でさえ上昇し続けてい
る。
記のウサギにプラスミド ｐＣＭＶ１６０ ２５μｇおよ
びプラスミド ｐｃＲＥＶ２５μｇを２回接種した。抗
体価は前記と同様な方法で測定した。図３に示したよう
に抗ＨＩＶ抗体価は免疫８週間後でさえ上昇し続けてい
る。
【００１９】実施例４） 中和試験 ＨＩＶ感染に対する血清の中和効果をＨＩＶを感染させ
たＭＴ−４細胞または感染させてないＭＴ−４細胞の生
存率を測定することによって求めた。ＨＩＶ−１ III
Ｂ，ＳＦ２，Ｇｕｎ１株のＴＣＩＤ50（50％Tissue Cul
ture Infectious Dose）の１００倍量をＤＮＡワクチン
を接種したニホンザルから採取し段階希釈した血清で４
℃、９０分間、前処理した。続いて１ウエル当たり１５
０μｌの完全培地（５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１
６４０）に２.５×１０4のＭＴ−４細胞を含む９６穴マ
イクロプレートに前処理したウイルスを５０μｌ接種
し、５％ＣＯ2、３７℃で５日間培養した。コントロー
ルとして前処理していないＨＩＶ−１および感染させて
いない細胞も培養した。感染５日後、ＨＩＶを感染させ
た細胞および感染させていない細胞の生存率をＭＴＴ法
によって測定した。
たＭＴ−４細胞または感染させてないＭＴ−４細胞の生
存率を測定することによって求めた。ＨＩＶ−１ III
Ｂ，ＳＦ２，Ｇｕｎ１株のＴＣＩＤ50（50％Tissue Cul
ture Infectious Dose）の１００倍量をＤＮＡワクチン
を接種したニホンザルから採取し段階希釈した血清で４
℃、９０分間、前処理した。続いて１ウエル当たり１５
０μｌの完全培地（５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１
６４０）に２.５×１０4のＭＴ−４細胞を含む９６穴マ
イクロプレートに前処理したウイルスを５０μｌ接種
し、５％ＣＯ2、３７℃で５日間培養した。コントロー
ルとして前処理していないＨＩＶ−１および感染させて
いない細胞も培養した。感染５日後、ＨＩＶを感染させ
た細胞および感染させていない細胞の生存率をＭＴＴ法
によって測定した。
【００２０】ＭＴＴ法は、黄色の 3-(4,5-dimethyl 1-2
-Thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H tetorazoum bromide（Ｍ
ＴＴ）が生細胞のミトコンドリアの脱水素酵素によって
青いホルマザンに還元されるのを光学的に測定する方法
である。培養液中に添加されたＭＴＴの還元をマイクロ
プレートリーダーを用いて５４０ｎｍの吸光度を測定す
ることによって求める。中和活性は、次の式から算出さ
れる。 １００×［（ＯＤＴ）ＨＩＶ − （ＯＤＣ）ＨＩＶ］／
［（ＯＤＣ）ｍｏｃｋ−（ＯＤＣ）ＨＩＶ］ （ＯＤＴ）ＨＩＶ ： 血清で前処理したＨＩＶ感染細
胞の吸光度 （ＯＤＣ）ＨＩＶ ： コントロ−ルの未処理ＨＩＶ感
染細胞の吸光度 （ＯＤＣ）ｍｏｃｋ： コントロ−ルの感染させていな
い細胞の吸光度 図４に示したようにＨＩＶ−１ IIIＢ株に対して強い中
和特性を示した。
-Thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H tetorazoum bromide（Ｍ
ＴＴ）が生細胞のミトコンドリアの脱水素酵素によって
青いホルマザンに還元されるのを光学的に測定する方法
である。培養液中に添加されたＭＴＴの還元をマイクロ
プレートリーダーを用いて５４０ｎｍの吸光度を測定す
ることによって求める。中和活性は、次の式から算出さ
れる。 １００×［（ＯＤＴ）ＨＩＶ − （ＯＤＣ）ＨＩＶ］／
［（ＯＤＣ）ｍｏｃｋ−（ＯＤＣ）ＨＩＶ］ （ＯＤＴ）ＨＩＶ ： 血清で前処理したＨＩＶ感染細
胞の吸光度 （ＯＤＣ）ＨＩＶ ： コントロ−ルの未処理ＨＩＶ感
染細胞の吸光度 （ＯＤＣ）ｍｏｃｋ： コントロ−ルの感染させていな
い細胞の吸光度 図４に示したようにＨＩＶ−１ IIIＢ株に対して強い中
和特性を示した。
【００２１】実施例５） 抗融合試験 ＨＩＶに感染したＣＥＭ細胞を約１０〜１４日培養す
る。その間培養は、最大ＣＰＥ（Cytopathic Effect）
に達し、大多数の細胞は死滅する。しかし細胞の生き残
った分画は安定的に感染してそのうちの一部が融合し、
巨大細胞を作る。ＤＮＡワクチンを接種したニホンザル
から採取した血清が、この融合を阻止するか否かを Put
neyらが報告した方法を用いて調べた（Science, 234, 1
392-1395 1986))。
る。その間培養は、最大ＣＰＥ（Cytopathic Effect）
に達し、大多数の細胞は死滅する。しかし細胞の生き残
った分画は安定的に感染してそのうちの一部が融合し、
巨大細胞を作る。ＤＮＡワクチンを接種したニホンザル
から採取した血清が、この融合を阻止するか否かを Put
neyらが報告した方法を用いて調べた（Science, 234, 1
392-1395 1986))。
【００２２】ＨＩＶ−１ IIIＢ株を感染させたＣＥＭ細
胞 ２.５ ×１０5／ｍｌの４０μｌ、感染させていない
ＣＥＭ細胞 １.７５×１０6／ｍｌの４０μｌ、および
ＤＮＡワクチンを接種したニホンザルから採取し、段階
希釈した被験血清２０μｌを９６穴プレートで３７℃、
２０〜２４時間培養した。巨大細胞（これらの細胞は最
初に入れた細胞の５倍以上の直径を持つ）の出現数を４
０倍の倒立顕微鏡で計測した。抗融合活性は巨大細胞の
出現阻止の割合によって求めた。対照の被験血清はＤＮ
Ａワクチンを接種する前に採取した血清を用いた。 出現阻止率＝（ＮC −Ｎt）／ＮC×１００ Ｎt ： 被検血清中で出現した巨大細胞の数 ＮC ： 対照の血清中で出現した巨大細胞の数 図４に示したようにＨＩＶ−１ IIIＢ株に対して強い抗
融合活性を示した。
胞 ２.５ ×１０5／ｍｌの４０μｌ、感染させていない
ＣＥＭ細胞 １.７５×１０6／ｍｌの４０μｌ、および
ＤＮＡワクチンを接種したニホンザルから採取し、段階
希釈した被験血清２０μｌを９６穴プレートで３７℃、
２０〜２４時間培養した。巨大細胞（これらの細胞は最
初に入れた細胞の５倍以上の直径を持つ）の出現数を４
０倍の倒立顕微鏡で計測した。抗融合活性は巨大細胞の
出現阻止の割合によって求めた。対照の被験血清はＤＮ
Ａワクチンを接種する前に採取した血清を用いた。 出現阻止率＝（ＮC −Ｎt）／ＮC×１００ Ｎt ： 被検血清中で出現した巨大細胞の数 ＮC ： 対照の血清中で出現した巨大細胞の数 図４に示したようにＨＩＶ−１ IIIＢ株に対して強い抗
融合活性を示した。
【００２３】実施例６） フットパッド腫張反応 ＤＮＡワクチンを接種されたマウスが、ＨＩＶ特異的な
遅延型過敏反応を誘導できるか否かをフットパッド腫張
反応で確認した。プラスミド ｐＣＭＶ１６０およびプ
ラスミド ｐｃＲＥＶを表１に示した分量でマウスの四
頭筋に１回接種した。３週間後１０μｇのＰＮＤ（prin
cipal Neutralizing Determinant）ペプチド、リコンビ
ナントｇｐ１２０抗原をマウスのフットパッドに接種し
た。２４時間後、フットパッドの腫張の大きさを抗原接
種前後のフットパッドの厚さの差を０.０１ｍｍを１単
位とした測定法で求めた。コントロールのマウスにはマ
ッコウクジラミオグロビンのペプチドを接種した。
遅延型過敏反応を誘導できるか否かをフットパッド腫張
反応で確認した。プラスミド ｐＣＭＶ１６０およびプ
ラスミド ｐｃＲＥＶを表１に示した分量でマウスの四
頭筋に１回接種した。３週間後１０μｇのＰＮＤ（prin
cipal Neutralizing Determinant）ペプチド、リコンビ
ナントｇｐ１２０抗原をマウスのフットパッドに接種し
た。２４時間後、フットパッドの腫張の大きさを抗原接
種前後のフットパッドの厚さの差を０.０１ｍｍを１単
位とした測定法で求めた。コントロールのマウスにはマ
ッコウクジラミオグロビンのペプチドを接種した。
【００２４】表１に示したように１回のＤＮＡワクチン
の接種のみで、高いレベルの遅延型過敏反応を誘導すこ
とができた。しかし接種量が、合計で１０μｇを超える
と遅延型過敏反応は減少していた。
の接種のみで、高いレベルの遅延型過敏反応を誘導すこ
とができた。しかし接種量が、合計で１０μｇを超える
と遅延型過敏反応は減少していた。
【００２５】
【表１】
【００２６】接種量が合計で０.４μｇ以下の場合に最
大の遅延型過敏反応を誘導することができた。また、プ
ラスミド ｐＣＭＶ１６０のみの接種では遅延型過敏反
応を誘導することができなかった。
大の遅延型過敏反応を誘導することができた。また、プ
ラスミド ｐＣＭＶ１６０のみの接種では遅延型過敏反
応を誘導することができなかった。
【００２７】実施例７） 免疫されたリンパ球の増殖反
応 動物が抗原に一度感作され、細胞性免疫が応答すると、
その免疫学的記憶がリンパ球に保存される。このリンパ
球を取り出し、抗原で刺激すると対照と比較して有意に
その増殖が起る。ここでは、ＤＮＡワクチンの接種が、
抗原特異的なリンパ球の増殖反応を誘導できるか否かを
確認した。プラスミド ｐＣＭＶ１６０ １０μｇおよび
プラスミド ｐｃＲＥＶ １０μｇをＢＡＬＢ／Ｃマウス
の腓腹筋に接種した。またベクターＤＮＡすなわちｐＢ
Ｃ１２／ＣＭＶのみも接種した。接種３週間後、脾細胞
と接種部位のリンパ腺細胞球を調製した。４×１０5個
の脾細胞を５％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、メルカプトエ
タノール、および抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０培地
で９６穴平底プレ−トを用いて４日間培養した。
応 動物が抗原に一度感作され、細胞性免疫が応答すると、
その免疫学的記憶がリンパ球に保存される。このリンパ
球を取り出し、抗原で刺激すると対照と比較して有意に
その増殖が起る。ここでは、ＤＮＡワクチンの接種が、
抗原特異的なリンパ球の増殖反応を誘導できるか否かを
確認した。プラスミド ｐＣＭＶ１６０ １０μｇおよび
プラスミド ｐｃＲＥＶ １０μｇをＢＡＬＢ／Ｃマウス
の腓腹筋に接種した。またベクターＤＮＡすなわちｐＢ
Ｃ１２／ＣＭＶのみも接種した。接種３週間後、脾細胞
と接種部位のリンパ腺細胞球を調製した。４×１０5個
の脾細胞を５％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、メルカプトエ
タノール、および抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０培地
で９６穴平底プレ−トを用いて４日間培養した。
【００２８】ＨＩＶ−１ IIIＢ株、ＴｈａｉＡ株のＰＮ
Ｄペプチドおよびマッコウクジラのミオグロビンペプチ
ドそれぞれ５０μｇをウエルに添加した。分化反応は、
3Ｈ-thymidineの取り込みを見る方法で測定した（J.Imu
nol. 123,182-188 (1978))。表２に示したようにプラス
ミド ｐＣＭＶ１６０ １０μｇおよびプラスミドｐｃＲ
ＥＶ ５μｇを接種されたマウスから調製したリンパ球
は、IIIＢ株のＰＮＤペプチドに対して増殖反応を示し
た。ＴｈａｉＡ株のＰＮＤペプチドには幾分弱い増殖反
応を示したが、対照のマッコウクジラのミオグロビンペ
プチドには増殖反応を示さなかった。またベクターのみ
のｐＢＣ１２／ＣＭＶを接種したマウスから調製したリ
ンパ球では、増殖反応を示さなかった。
Ｄペプチドおよびマッコウクジラのミオグロビンペプチ
ドそれぞれ５０μｇをウエルに添加した。分化反応は、
3Ｈ-thymidineの取り込みを見る方法で測定した（J.Imu
nol. 123,182-188 (1978))。表２に示したようにプラス
ミド ｐＣＭＶ１６０ １０μｇおよびプラスミドｐｃＲ
ＥＶ ５μｇを接種されたマウスから調製したリンパ球
は、IIIＢ株のＰＮＤペプチドに対して増殖反応を示し
た。ＴｈａｉＡ株のＰＮＤペプチドには幾分弱い増殖反
応を示したが、対照のマッコウクジラのミオグロビンペ
プチドには増殖反応を示さなかった。またベクターのみ
のｐＢＣ１２／ＣＭＶを接種したマウスから調製したリ
ンパ球では、増殖反応を示さなかった。
【００２９】
【表２】
【００３０】実施例８） 細胞傷害性試験 ＤＮＡワクチンの接種により、抗原特異的細胞傷害性Ｔ
細胞が誘導されるか否かを調べた。１０μｇのＤＮＡを
ＢＡＬＢ／Ｃ（Ｈ−２d ）マウスに筋注した。ＤＮＡ接
種３週間後に脾臓とリンパ腺の細胞を採取した。１×１
０6個のリンパ球はin vitro（非必須アミノ酸、メルカ
プトエタノール、ピルビン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ
１６４０培地中）でＶ３ペプチドでを結合した同種のま
たはＣ３Ｈ（Ｈ−２Ｋ）の脾細胞で再度刺激された。５
日間培養後、これらの脾細胞（エフェクタ−細胞）の細
胞障害活性は Crericiらが報告している６時間51Ｃｒ放
出活性を測定することによって求めた（J.Immunol.146,
2214-2219.(1991)）。
細胞が誘導されるか否かを調べた。１０μｇのＤＮＡを
ＢＡＬＢ／Ｃ（Ｈ−２d ）マウスに筋注した。ＤＮＡ接
種３週間後に脾臓とリンパ腺の細胞を採取した。１×１
０6個のリンパ球はin vitro（非必須アミノ酸、メルカ
プトエタノール、ピルビン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ
１６４０培地中）でＶ３ペプチドでを結合した同種のま
たはＣ３Ｈ（Ｈ−２Ｋ）の脾細胞で再度刺激された。５
日間培養後、これらの脾細胞（エフェクタ−細胞）の細
胞障害活性は Crericiらが報告している６時間51Ｃｒ放
出活性を測定することによって求めた（J.Immunol.146,
2214-2219.(1991)）。
【００３１】標的細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＣ
３Ｈマウスの脾細胞から調製し、ＣｏｎＡ（５μｇ／ｍ
ｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３日間培養した。Ｃ
ｏｎＡで処理された細胞は終濃度２μｇ／ｍｌのペプチ
ドと６０分間培養し、それを結合させた。これらの処理
を行った細胞は、［51Ｃｒ］Ｎａ2Ｏ4で標識され、十分
な洗浄の後、標的細胞として用いられた。また、エフェ
クター細胞の一部は、精製された抗ＣＤ８モノクローナ
ル抗体と４℃、１時間培養した。洗浄後、細胞は１０倍
希釈した低毒性ウサギ補体とともに３７℃、１時間培養
した。細胞はさらに洗浄後、細胞傷害性試験に用いた。
３Ｈマウスの脾細胞から調製し、ＣｏｎＡ（５μｇ／ｍ
ｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３日間培養した。Ｃ
ｏｎＡで処理された細胞は終濃度２μｇ／ｍｌのペプチ
ドと６０分間培養し、それを結合させた。これらの処理
を行った細胞は、［51Ｃｒ］Ｎａ2Ｏ4で標識され、十分
な洗浄の後、標的細胞として用いられた。また、エフェ
クター細胞の一部は、精製された抗ＣＤ８モノクローナ
ル抗体と４℃、１時間培養した。洗浄後、細胞は１０倍
希釈した低毒性ウサギ補体とともに３７℃、１時間培養
した。細胞はさらに洗浄後、細胞傷害性試験に用いた。
【００３２】エフェクター細胞と標的細胞の比の範囲
は、５：１〜４０：１である。特異的な51Ｃｒの放出の
百分率は、次の式で計算される。 （検体の放出 − 自然放出）／（最大放出 − 自然放
出）×１００ 無添加または５％のTriton X-100を添加した培地で培養
された標的細胞からそれぞれ51Ｃｒの自然放出または最
大放出を求めた。図５に示したように、ＣＴＬ反応は５
μｇのＤＮＡワクチンの接種で確認された。この反応
は、エフェクター細胞からＣＤ８陽性のＴリンパ球を除
去することによって完全にブロックされた。これらの結
果は、ＤＮＡの免疫によって、高いレベルのＨＩＶ特異
的な細胞性免疫が誘導されることを示している。
は、５：１〜４０：１である。特異的な51Ｃｒの放出の
百分率は、次の式で計算される。 （検体の放出 − 自然放出）／（最大放出 − 自然放
出）×１００ 無添加または５％のTriton X-100を添加した培地で培養
された標的細胞からそれぞれ51Ｃｒの自然放出または最
大放出を求めた。図５に示したように、ＣＴＬ反応は５
μｇのＤＮＡワクチンの接種で確認された。この反応
は、エフェクター細胞からＣＤ８陽性のＴリンパ球を除
去することによって完全にブロックされた。これらの結
果は、ＤＮＡの免疫によって、高いレベルのＨＩＶ特異
的な細胞性免疫が誘導されることを示している。
【００３３】
【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、エ
イズの予防あるいは治療に有用で、液性免疫ばかりでな
く細胞性免疫を強く誘導することが可能である安全なＤ
ＮＡワクチンを提供することができる。
イズの予防あるいは治療に有用で、液性免疫ばかりでな
く細胞性免疫を強く誘導することが可能である安全なＤ
ＮＡワクチンを提供することができる。
【図１】は、本発明のＤＮＡワクチンに使用するプラス
ミド ｐＣＭＶ１６０を表す。
ミド ｐＣＭＶ１６０を表す。
【図２】は、本発明のＤＮＡワクチンの接種回数による
抗ＨＩＶ抗体価の変動を表す。
抗ＨＩＶ抗体価の変動を表す。
【図３】は、本発明のＤＮＡワクチン２回接種後の抗Ｈ
ＩＶ抗体価の経時的変動を表す。
ＩＶ抗体価の経時的変動を表す。
【図４】は、本発明のＤＮＡワクチンの中和活性および
抗融合活性を表す。
抗融合活性を表す。
【図５】は、 本発明のＤＮＡワクチンの細胞障害活性
を表す。
を表す。
Claims (4)
- 【請求項１】 ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）のエン
ベロープ蛋白質の遺伝情報の少なくとも一部をコードす
る塩基配列を有し、動物細胞内で発現可能なプラスミド
からなることを特徴とするＤＮＡワクチン。 - 【請求項２】 上記エンベロープ蛋白質の遺伝情報をコ
ードする塩基配列は、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）
のプロモーター領域をコードする塩基配列の下流に連結
されている請求項１に記載のＤＮＡワクチン。 - 【請求項３】 上記エンベロープ蛋白質の遺伝情報をコ
ードする塩基配列がｇｐ１６０あるいはその一部である
請求項１または２に記載のＤＮＡワクチン。 - 【請求項４】 蛋白質ｒｅｖの遺伝情報をコードする塩
基配列を有し動物細胞内で発現可能なプラスミドをさら
に有する請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡワクチ
ン。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP728895A JPH08198774A (ja) | 1995-01-20 | 1995-01-20 | Ｄｎａワクチン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP728895A JPH08198774A (ja) | 1995-01-20 | 1995-01-20 | Ｄｎａワクチン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08198774A true JPH08198774A (ja) | 1996-08-06 |
Family
ID=11661855
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP728895A Pending JPH08198774A (ja) | 1995-01-20 | 1995-01-20 | Ｄｎａワクチン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08198774A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997031115A3 (en) * | 1996-02-22 | 1997-10-09 | Merck & Co Inc | Synthetic hiv genes |
| WO1997048370A3 (en) * | 1996-06-21 | 1998-03-26 | Merck & Co Inc | Vaccines comprising synthetic genes |
| US6534312B1 (en) | 1996-02-22 | 2003-03-18 | Merck & Co., Inc. | Vaccines comprising synthetic genes |
-
1995
- 1995-01-20 JP JP728895A patent/JPH08198774A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997031115A3 (en) * | 1996-02-22 | 1997-10-09 | Merck & Co Inc | Synthetic hiv genes |
| US6534312B1 (en) | 1996-02-22 | 2003-03-18 | Merck & Co., Inc. | Vaccines comprising synthetic genes |
| WO1997048370A3 (en) * | 1996-06-21 | 1998-03-26 | Merck & Co Inc | Vaccines comprising synthetic genes |
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