JPH09504296A

JPH09504296A - Ｈｉｖ粘膜感染の阻止

Info

Publication number: JPH09504296A
Application number: JP7512750A
Authority: JP
Inventors: チェルキンスキ，セシル; ホルムグレーン，ヤーン; ホーラル，ペーテル; スヴェンネルホルム，ブー; ヴァールネ，アンデシュ
Original assignee: シンテロインコーポレイテッド
Priority date: 1993-10-26
Filing date: 1994-10-25
Publication date: 1997-04-28
Also published as: CA2169453A1; EP0726776A1; AU8087994A; WO1995011701A1

Abstract

(57)【要約】ペプチドワクチンを投与することによって膣及び直腸粘膜上皮へのＨＩＶ侵入を阻止する方法を開示する。粘膜細胞への侵入に関与するgp120のエピトープに対応するペプチドに対して産生される抗体はペプチド又はペプチド−コレラ毒素複合体を上皮細胞に導入することによってインビボで産生される。得られた中和抗体は、その後のＨＩＶによるこれら組織の感染を阻止することができる。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＩＶ粘膜感染の阻止発明の分野本発明はＨＩＶと生殖器及び直腸粘膜上皮との結合阻止に関するものである。発明の背景非被包性リンパ球様組織の分散性凝集物はしばしば胃腸管、気道及び泌尿生殖路の粘膜下領域に局在化している。これらの管は外来微生物が身体内に侵入する主要な媒介である。分泌型免疫グロブリンＡ（ＩgＡ）は粘膜を横切ることができ、病原体の侵入から粘膜を保護できる抗体である。かくして、粘膜リンパ球様組織は粘膜表面で生起する局所免疫応答に重要な役割を果たしている。Ｔ細胞、マクロファージ及びランゲルハンス細胞に侵入するためにＨＩＶが使用する細胞表面ＣＤ4レセプターを粘膜上皮細胞が発現するかどうかに関係なく、ＨＩＶが粘膜上皮細胞に潜在的に感染し得ることは良く確立されている（Fant ini等、（1992年）J.Virol.、66: 5805; Fantini等、（1991年）Virology、185: 904）。ＨＩＶが粘膜腸管上皮細胞に侵入するためのレセプターは糖脂質であると思われる（Yahi等、（1992年）J．Virol.、66：4848）が、これら細胞との結合に介在するＨＩＶエピトープに関する情報は無い。この（これらの）エピトープはＨＩＶの粘膜侵入を防止するために局所粘膜免疫系が作用し得る理想的な標的となるので、上記のような知識は最も重要なものであろう。直腸及び生殖器（膣）粘膜からのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）の侵入を防ぐために粘膜免疫応答を誘発することはエイズ（ＡＩＤＳ）予防の１方法として有意には研究されていない。ウイルス性糖タンパク質gp120から誘導され慣用的に投与されているワクチンはＨＩＶに対する免疫を殆ど提供しない。全身免疫法は、ＨＩＶのサル対応物であるサルのシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）の静脈内投与に対して保護したが、膣粘膜から導入されたＳＩＶによる感染を防ぐことはできなかった(Miller等、（1990年）J．Immunol.、144: 122)。一般的に、抗原を粘膜に送達しても強力な免疫応答は誘発されない。しかし乍ら、重要な例外は、既知の最も強力な粘膜免疫原の１つである細菌コレラ菌（Vi brio chorela）によって産生されるコレラ毒素（ＣＴ）である。ＣＴは、そのＢサブユニットを使用して粘膜細胞表面のガングリオシドＧＭ1と呼ばれるスフィンゴ糖脂質と強く結合する。Ｂサブユニット（ＣＴＢ）と共有結合した少量の抗原を粘膜に投与すると、非ヒト霊長類を含む実験動物において粘膜並びに粘膜外免疫応答を活発に誘発することが示されている(Czerkinsky等、（1989年）Infec t．Immun.、57: 1072〜1077; Liang等、（1988年）J．Immunol.、141、3781〜37 87；Lehner等、（1992年）Science、258: 1365〜1369; Holmgren等、（1993年） Vaccine、11: 1179〜1184)。経口的に免疫化したヒトで特異的Ｂ細胞応答を腸から他の粘膜組織まで拡散させる可能性も証明されている(Czerkinsky等、（1991 年）Infect．Immun.、59：996〜1001)。加えて、ＨＩＶ−１感染者の粘膜免疫応答は非経口的に投与されたワクチンに対する劇的な応答低下と比較して比較的安定なままであることも示されている(Eriksson等、（1993年）AIDS、7: 1087〜10 91)。この研究は粘膜免疫と全身免疫の相対的独立性を強調するだけでなく、既に感染した者ではＨＩＶ−特異的粘膜免疫が誘発され、その結果その後の粘膜伝染を妨げる可能性も提起している。生殖器及び直腸粘膜の免疫応答を誘発するのに有効な免疫化法は非ヒト霊長類で評価されている(Lehner等、（1992年）Scien ce、258：1365〜1369)。性的に伝染されたＨＩＶ感染の発生率(全症例の75％以上)、新規ＡＩＤＳ症例数の驚くべき増加及び全身免疫化法では顕著な粘膜免疫応答を誘発できないことからみて、ＨＩＶが循環に侵入してくる粘膜表面で免疫応答を生じさせ得るワクチンはＨＩＶ−１感染を低下させる総合的なアプローチの一部としてかなりの価値を有しているであろう。発明の要約本発明の１つの実施態様は、ワクチンを粘膜に投与し、それによって粘膜に約 10から約50個までのアミノ酸を有するＨＩＶ−１ gp120のペプチドを送達し、そしてそれによって、ペプチドに対する抗体を粘膜に産生させる（上記ペプチドはこれらの抗体が粘膜上皮細胞内でのＨＩＶ−１感染を阻止するように選択されている）ことによってＨＩＶ−１による粘膜細胞の感染を阻止する方法である。好ましい実施態様では、ペプチドは、ＨＩＶ−１による粘膜細胞の感染を阻止する抗体を粘膜に産生させるのに有効なエピトープを含んでおり、該ペプチドは本質的に配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯＳ）：9、10、11、12又は13からなっている。ワクチンは粘膜へのペプチド送達を高める物質を含んでいるのが有利である。好ましくは、この物質は粘膜結合タンパク質であり; 最も好ましくは、この物質はコレラ毒素の結合サブユニットか又は大腸菌の熱に不安定なエンテロトキシンの結合サブユニットのどちらかである。本発明によって、ペプチドと粘膜結合タンパク質は一緒に結合して、有利には組換えＤＮＡの発現産生物であるキメラタンパク質を形成することも提供される。本発明のもう１つの実施態様では、上記の物質は脂質である。好ましくは、この脂質は脂質小胞の形態である。好ましい実施態様では、投与段階は上記ペプチドを機能的にコードするポリヌクレオチドを粘膜に投与し、それによって粘膜細胞に該ペプチドを産生させることからなる。本発明の更なる実施態様は、ＨＩＶ−１による粘膜細胞の感染を阻止するワクチンを提供し、該ワクチンはエピトープに対する抗体がＨＩＶ−１による粘膜上皮細胞の感染を阻止するように選択されているエピトープを有する、ＨＩＶ−１ gp120の10から50個のアミノ酸ペプチド、及び該ペプチドの粘膜への送達を促進するためペプチドと結合した化合物又は構造体を含んでいる。好ましくは、このペプチドは本質的に配列番号9、10、11、12又は13からなっており、上記化合物又は構造体は脂質小胞である。最も好ましくは、この化合物又は構造体は粘膜結合タンパク質である。特に好ましい実施態様では、結合タンパク質は、有利には結合サブユニットであるコレラ毒素タンパク質である。他の好ましい実施態様では、結合タンパク質は大腸菌の熱に不安定なエンテロトキシンの結合サブユニットである。発明の詳細な説明本発明は、ＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質gp120の配列から誘導された合成ペプチドの識別を開示する。これらのペプチドを使用して、形質転換されたヒト膣及び結腸直腸細胞株の感染をインビトロで阻止する中和抗体を産生させた。これらのペプチドは局在性粘膜免疫応答産生を誘発し、ヒト結腸直腸及び膣上皮細胞のＨＩＶ−１による感染を中和できる抗体を産生させる。これらのペプチドは本願明細書では配列番号: 9〜13として記載する。本発明の1つの態様では、配列番号: 9、10、11、12及び13の1つ又はそれより多くを使用して抗体を産生させる。これらの抗体は、動物の筋肉内、腹腔内、皮下又は粘膜に投与することを含む任意の慣用の方法で産生させることができる。モノクローナル及びポリクローナルの両抗体の産生が意図されている。これらの抗体を使用すると、粘膜細胞と結合した抗体が提供され、その後細胞にＨＩＶ−１を投与しても粘膜上皮細胞の感染が予防される。これらの抗体はウイルスと細胞の結合を阻止又は予防し、それによってウイルスによる細胞感染を阻止又は予防する。抗体は外来性であっても内在性抗体であってもよく、また細胞はインビトロであってもインビボであってもよい。細胞がインビトロであるとき、抗体は典型的には実験室若しくは家畜で発生させるか又はモノクローナル抗体である。更に重要なことには、上記結合に関与するメカニズムや構造を分析するための価値ある道具が提供される。細胞がインビボであるとき、抗体は好ましくは、配列番号9〜13の1つまたはそれより多いペプチドをその細胞が存在する動物に投与して発生させられている内在性粘膜抗体である。以下で記載する粘膜ワクチン化が特に好ましい。しかし乍ら、外来性抗体を動物に投与して粘膜細胞のＨＩＶ−１感染を阻止することもできる。本願明細書に記載した処置の全てで、粘膜細胞は好ましくはヒト起源である。本発明のペプチドは単独又は組み合わせて使用することができ、そしてＣＴ、ＣＴＢ及び大腸菌の熱に不安定なエンテロトキシンの結合サブユニットを含む他の上皮細胞結合タンパク質と結合させないか又は結合させることもできる。ペプチドは化学的手段か組換え手段のどちらによって結合されていてもよい。ペプチドをコードするＤＮＡは周知の方法によってコレラ毒素またはそのＢサブユニットをコードするＤＮＡと結合させ、真核生物の発現ベクター内に挿入し、脂質小胞又は層板状構造体（lamellar structures）を使用して上皮細胞に送達することができる。次に、これらのペプチド−ＣＴ、ＣＴＢ又はエンテロトキシン複合体をインビボで産生させると、局在性粘膜免疫応答を発揮し、その後のＨＩＶ感染から保護される。コレラ毒素のような粘膜上皮細胞結合タンパク質を含めると、ペプチドがこれらの細胞内に入る効率が有利に高められる。コレラ毒素Ａ−Ｂ二量体のＢサブユニットは細胞表面レセプターへの結合に関与しているので、ペプチド−ＣＴＢ複合体も上皮細胞に効果的に結合する。文献もまた、免疫原ペプチドと他の腸結合タンパク質の組成物を形成する方法を報告している(Wenneras等、（1990年）FEMS Microbiol．Lett.、66: 107〜112)。ペプチド−ＣＴＢ複合体の形成技術は良く知られている(Liang等、（1988年）J．Immunol．141: 3781〜3 787; Sanchez等、（1990年）Res．Microbiol．141: 971〜979)。リポソーム形成及びリポソーム内に封入されたペプチドの送達もローウェル（Lowell）によって記載されているように周知である(New Generation Vaccines、Woodrow，G.C.及びLevine，M.M.編集、Marcel Dekker，Inc.、ニューヨーク州、141〜160頁)。これらのペプチドはモノクローナル及びポリクローナル抗体の産生にも有用である。これらの抗体はＨＩＶ−１に対する明白な中和効果を有している。これらのペプチドは単独でか又はＣＴ若しくは他の分子と結合させた後、ＨＩＶ−１の粘膜上皮細胞内侵入を阻止するのに十分な粘膜抗体応答を生じさせるのに十分な量で経口、直腸、膣又はこれらの経路を組み合わせて投与することができる。使用されるペプチドの量はそれらの製薬製剤並びに送達部位及び経路に依存する；しかし乍ら、成人ではペプチドの免疫原の適量は一般的に約50μgから約１mgの間であり、これを２週間から１年又はそれ以上の期間に亘って１〜４回投与する。本発明のペプチド、ペプチド結合タンパク質複合体及び他の組成物を経口投与して局在性胃腸粘膜免疫応答を生じさせるか又は膣内若しくは直腸内投与して性的接触によりウイルスが侵入し易いこれらの領域に局在性粘膜免疫応答を生じさせることができる。これらのペプチドはＨＩＶ−１感染に対する局在性粘膜免疫を産生させるのに必要な量の単位投与量で投与することができる。経口的に投与するために考えられる医薬組成物には錠剤、カプセル、液剤等が含まれ、そして膣内又は直腸内に投与するために意図される医薬組成物には、約10μgから約10m gまで又はそれ以上の量の注射用担体、坐剤、軟膏、ゲル、クリーム、発泡剤、スプレー剤、分散剤、懸濁剤、ペースト剤等が含まれる。これらの製剤は任意の形態であることができ、一般的には周知の医薬的に許容可能な任意の担体と組み合わせた活性成分を含んでいる。これらの製剤は更に有利には保存剤、抗細菌剤、抗真菌剤、抗酸化剤、浸透性剤及び同様な物質を慣用の組成及び量で含んでいる。本発明の組成物の製剤化を支援するために、レミングトンの製薬科学（Reming ton's Pharmaceutical Sciences）第15版、ペンシルベニア州イーストンのマックパブリッシングカンパニー（Mack Publishing Co.）（1975年）を参照することができる。意図した投与態様によって、ペプチド又は複合体は、これらの領域を裏張りしている上皮細胞に直接取り込まれることができると推定される。これらのペプチド及び複合体は有利にはリポソーム内に入れてこれらの物質の細胞への送達を促進することができる。ペプチド又はペプチド結合タンパク質複合体を単独か又は脂質小胞若しくは他の層板状構造体と組み合わせるかのどちらかで同様な投与量範囲で直接注射することも、これらの組織で抗ＨＩＶ応答を発揮する方法であると考えられる。実施例１結腸直腸及び膣上皮細胞のＨＩＶ−１感染に対する感受性ＨＴＬＶ−IIIＢに感染したＨ9Ｔ細胞リンパ腫細胞（ＡＴＣＣＨＴＢ−176）（Popovic等、（1984年）Science、224: 497〜500）のＨＩＶ−１感染性ウイルスストックを以下の実験で使用した。これらの細胞は、20％の胎児ウシ血清(ＦＣＳ)、100単位／mlのペニシリン及び100μg／mlのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−1640培地中で維持した。ウイルスストックは周知の方法を使用して調製し、−90℃で冷凍した。１×10⁴の組織培養感染性投与量（ＴＣＩＤ₅₀）の終点力価を有するＨＴＬＶ−IIIＢの１つのストックを全ての実験に使用した。形質転換した膣上皮細胞（Ｈs 760 Ｔ及びＨs 769.Ｖg細胞; それぞれＡＴＣＣＣＲＬ−7491及び7499）の２つのクローン及び結腸腺癌ＨＴ−29細胞（ＡＴＣＣＨＴＢ−38）の12のサブクローン中のＨＩＶ−１のＨＴＬＶ−IIIＢ単離物の終点力価は、それぞれの細胞株を100μl／ウェル（ＩＴＣＩＤ₅₀／細胞から0.00 00 1ＴＣＩＤ₅₀／細胞までの範囲）のウイルス連続10倍希釈物と共に24ウェルのプレート（Costar）に接種して37℃で２時間実施した。吸着後、細胞を修正イーグル培地（ＭＥＭ）で５回洗浄し、そして1.5mlの増殖培地（膣細胞にはＤＭＥＭ及び結腸細胞にはＭＥＭ、これらは共に10％の胎児ウシ血清(ＦＣＳ)、１％のＬ −グルタミン及び抗生物質を含有している）を補充した。感染７日後、上皮細胞をＭＥＭで５回洗浄し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中0.1％のトリプシンで５分間37℃で処理した。Ｈ9維持培地中のＨＴＬＶ−IIIＢ感染Ｈ9細胞(10⁶個の細胞)を各ウェルに加え、上皮細胞と共に24時間共培養（coculture）した。Ｈ 9培養物は、ＨＩＶ−誘導シンシチウム形成を、顕微鏡的に７日間追跡し、ｐ24 抗原産生物の存在を、100pg／mlほどの少ないp24を測定できるエリザ法を使用して追跡した。膣細胞株Ｈs 760.Ｔ及びＨs 769.Ｖgは許容であった。Hs 760.Ｔのウイルス感染は共培養によって高多重度（１ＴＣＩＤ₅₀／細胞）で検出され、そしてＨＴ−29結腸細胞クローンのうち６つは0.1〜0.01ＴＣＩＤ₅₀／細胞の範囲の多重度で許容であった。更に試験するため、これらのクローンのうちクローンＬ20を選択した。ＨＩＶ−１ＲＮＡ及びＤＮＡは、以下の実施例に記載したようにして上皮細胞中と培養上清液中の両方で検出した。実施例２ＰＣＲによるプロウイルスＤＮＡの検出上皮細胞を感染７日後に採取してＤＮＡを抽出した(Sambrook等、（1989年）M olecular Cloning、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2: 9.16〜 9.19)。ＨＩＶ−１env遺伝子に特異的なプライマー、（5'−ＧＴＡＡＣＧＣＡＣＡＧＴＴＴＴＡＡＴＴＧＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡ−3'；配列番号: １）及び（5'− ＣＣＴＣＡＴＡＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＴ−3'; 配列番号: ２）をプロウイルスＤＮＡの検出に使用した。ＤＮＡ（200ng）は、α−³²Ｐ−ｄＣＴＰを使用してＤＮＡ熱サイクラー（Perkin−Elmer、コネティカット州ノルウォーク）で増幅してフラグメントを標識した。反応混合物は、10μlの10×ＰＣＲ緩衝液(Promega、ウィスコンシン州メディソン)、1.5mMのＭgＣl₂、20pmolのプライマー、0.125mＭのｄＮＴＰs、５μＣiのα-³²Ｐ−ｄＣＴＰ及び0.5単位のＴaq ＤＮＡポリメラーゼ（Promega）からなっていた。増幅は35サイクルであり、94 ℃で１分間の変性、55℃で１分間のアニーリング及び72℃で１分間の延長が含まれていた。最終反応混合物の10分の１を５％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分析した。ゲルを乾燥し、増感スクリーンを使用してＸ線フィルム（ X-OMAT；Eastman Kodak、ニューヨーク州ロチェスター）に13〜16時間暴露した。ＨＩＶコピー数（ＨＩＶゲノムの数）を測定するために、ＡＣＨ−2細胞からＤＮＡの連続２倍希釈物を単離し、そしてこの細胞は細胞当たり１個のプロウイルスコピーを含有していた(Clouse等、（1989年）J．Immunol.、142: 431〜438; Seshamma等、（1992年）J．Virol．Methods、40: 331〜346; Graziosi等、（19 93年）Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.、90: 6405〜6409)。各希釈物中の総ＤＮＡ量を、Ｈ9細胞から抽出されたＤＮＡを使用して200ngにそろえ、ＰＣＲを上記のようにして実施した。ＨＩＶコピー数は、増幅したバンドの強度を比較して概算した。内部標準として１対のヒトβ−アクチンプライマーを使用するＰＣＲ分析を平行して実施した。実施例３ＲＴ−ＰＣＲによるＨＩＶＲＮＡ発現の検出感染７日後に上皮細胞を採取し、ＲＮＡゾル（RNAzol）法（Biotex Laborator ies、テキサス州ヒューストン）によって総ＲＮＡを抽出した。各試料について、総ＲＮＡ 500ngをＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼＩ（Boehringer Mannheim、ドイツ国マンハイム）10単位と共に37℃で１時間インキュベートした。次に、試料を 80℃で10分間加熱してＤＮアーゼを分解した。ｃＤＮＡは、下流ＰＣＲプライマー（下記）10pmol、0.625mＭのｄＮＴＰs、５×反応緩衝液（Promega）及び200 単位のモロニー（Moloney）ネズミ白血病ウイルス逆転写酵素（ＲＴ）（Promega ）を用いて最終容量を20μlとしてＲＴ反応で合成した。この混合物を37℃で１時間インキュベートした。ｃＤＮＡは実施例３に記載したようにしてＰＣＲにより30サイクルで増幅した。ＨＩＶ−１の調節ＲＮＡを検出するために使用したプライマーは次のとおりであった： 5'−ＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧ−3'（配列番号: ３） 5'−ＧＧＣＣＴＧＴＣＧＧＧＴＣＣＣＣＴＣＧ−3'（配列番号: ４）ＨＩＶ−１の構造ＲＮＡを検出するために使用したＨＩＶ−１主要スプライスドナー（ＭＳＤ）部位に特異的なプライマーは次のとおりであった： 5'−ＣＴＣＴＣＧＡＣＧＣＡＧＧＡＣＴＣＧＧＣ−3'（配列番号: ５） 5'−ＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＣＴＴＡＡＣＣＧ−3'（配列番号: ６）増幅したフラグメント中に₃₂Ｐ−ｄＣＴＰを導入し、その最終反応混合物の10 分の１を８％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分析した。各試料において、逆転写酵素処理をしないＲＮＡもＰＣＲで増幅させ、増幅されたフラグメントがＨＩＶｃＤＮＡからのものであってＨＩＶＤＮＡの夾雑によるものではないことが証明された。実施例４ＲＴ組合せ（nested）ＰＣＲによる培養上清液中のＨＩＶＲＮＡの検出ＲＮＡをＲＮＡゾル（RNAzol）法で培養上清液500μlから抽出した。ＤＮアーゼＩ処理後、ＲＴプライマーとして配列番号:８を用いたＲＴ反応でｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを組合せＰＣＲ方法で増幅した。最初のＰＣＲ用のプライマーは次のとおりであった： 5'−ＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＴＡＧＴＡＡＴＴＡＧＡＴＣＴ−3'（配列番号: ７） 5'−ＧＧＴＧＧＧＴＧＣＴＡＣＴＣＣＴＡＡＴＴＧＴＴＣＡＡＴＴＣ−3'（配列番号: ８）２番目の（組合せ）ＰＣＲ用に使用したプライマーは配列番号: ７及び配列番号: ２であった。最初のＰＣＲ生成物の10分の１を２番目のＰＣＲ反応に加えた。ＰＣＲ条件は、増幅を40サイクルで実施したことを除いて実施例３に記載したとおりであった。最終反応混合物の10分の１を２％アガロースゲルでの電気泳動によって分析し、臭化エチジウムで染色した。ＲＴ処理をしないＲＮＡ試料もＤＮＡ夾雑用の試験として組合せプライマーで増幅させた。ＨＩＶ−１で感染した上皮細胞におけるＤＮＡ含量及びＲＮＡ発現を表２に示す。ＨＩＶ感染細胞が細胞当たりプロウイルスＤＮＡを１コピー含有している場合、ＨＴ29 Ｌ20細胞の約１％がＨＩＶ−１で感染されている。表２に見られるように、ＨＩＶ−１で感染したＨＴ29 Ｌ20細胞中の調節ＲＮＡの発現はＨＩＶ− １で感染したＨ9細胞やＡＣＨ−2細胞より低い。構造ＲＮＡの発現はかろうじて検出できる。実施例６抗ペプチド抗血清によるＬ20及びＨs769細胞でのＨＴＬＶ−IIIＢ感染性の中和高度免疫血清を、以下で示すｇｐ120配列から誘導された５つのペプチド（表３）で免疫化したサルから単離した。アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）（カリフォルニア州フォスターシティ）430Ａペプチド合成器を使用して固相ペプチド合成を実施した。アミノ末端システイン残基を各ペプチドに加えて担体タンパク質とのカップリングを促進した。ペプチドは、Ｎ−スクシンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート（ＳＰＤＰ; Pharmacia、スウェーデン国ウプサラ）を使用して等級Ｖのオボアルブミン（Sigma、ミズーリー州セントルイス）と約10：１（ペプチド: オボアルブミン）のモル比で共有結合させた。３から５歳の雄及び雌サル（Mac aca fascicularis）を、フロイントの完全（１回目の注射）又は不完全（２回目と３回目の注射）アジュバント中で乳化したオボアルブミン複合ペプチド100μg を３週間間隔で連続的に３回筋肉内注射して免疫化した。免疫化前と、最後に免疫化して１又は２週間後に大腿静脈から血液を集めた。免疫前及び免疫後血清を調製して−20℃で貯蔵した。これらのペプチドはサルでＨＩＶに対する中和抗体を誘発することが示されている(Vahlne等、（1991年）Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.、88: 10744〜10748 )。これらの抗体、高度のＨＴＬＶ−IIIＢ中和能力を有するモルモット高度免疫血清及びｇｐ120に対するモノクローナル抗体（後の２つはスウェーデン国ウプサラのL．Akerblomの好意によって提供された）は、ＨＴ−29、クローンＬ20、結腸細胞及びＨs 760.Ｔ膣細胞におけるＨＩＶ−１感染性の一次阻止によりＨＴＬＶ−IIIＢ感染性を中和する能力についてアッセイし、続いて、非常に許容なＨ9リンパ球様細胞と共培養してアッセイした。ストックウイルスは、結腸細胞での中和には10⁴ ＴＣＩＤ⁵⁰に希釈しそして膣細胞での中和には希釈しないで（10⁶ ＴＣＩＤ₅₀）使用し、そして１：５で開始する熱不活性化サル血清の連続４倍希釈物と混合した。サル血清は１：10又は１：20の最終希釈で使用した。モルモット高度免疫血清は陽性対照として使用した。37℃で２時間インキュベートした後、血清ウイルス混合物を上皮細胞と共に37 ℃で２時間インキュベートした。これらの細胞を培地で２回洗浄し、各ウエルに 1.5mlの維持培地をそれぞれ補充した。感染７日後に、細胞を５回洗浄して0.1％トリプシンで５分間37℃で処理した。Ｈ9細胞（10⁶個）を各ウェルに加え、そして共培養物をシンシチウム形成及びｐ24抗原の存在について７日間モニターした。ＨＳ 760.Ｔ細胞、Ｈs769細胞及びＨＴ−29 Ｌ20細胞での結果をそれぞれ表４ /５、６及び７に示し、そしてｐ24抗原を少なくとも90％減少させた血清希釈の逆数として定義される平均中和力価として表わす。ＨＩＶ−１コピー数もＨＩＶ−１に感染したＨＳ 760.Ｔ細胞について示す（表４及び５）。これらの結果によって、プロウイルスＤＮＡの値はＨＴ29 Ｌ20と抗−gp120モルモット血清とのインキュベーションによって顕著に減少したことが示された。ウイルス負荷の減少は、配列番号: 9、10、11及び13に対応するペプチド（表３）に対する抗血清と共にインキュベートした細胞においても見られた。ＨＩＶ− １コピー数は、配列番号: 13のペプチドに対する抗血清によってＨＳ769膣上皮細胞においても顕著に減少した。実施例７ gp120エピトープに対するワクチンによるインビボＨＩＶ−１粘膜感染からの保護配列番号: 9〜13の配列を有するペプチドに対応するＤＮＡをコレラ毒素のＢサブユニットをコードするＤＮＡと分子生物学の標準的な方法によって結合させる。得られたキメラ構築物を、適当な翻訳開始及び終結シグナルを含有するｐＧＥＸ（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）のような市販で入手できる真核生物発現ベクター内に入れる。次に、この構築物を当該技術分野で周知の方法によって脂質小胞中に導入する。次いで、この脂質小胞を周知の薬理学的な調製方法によって発泡組成物又は坐剤組成物中に処方し、そしてＨＩＶ感染の危険性の高いヒトの膣及び／又は直腸に投与する。投与される投与量範囲は約 10μgから10mgまでの範囲である。投与は合計３回の投与を２週間間隔で繰り返す。膣及び直腸粘膜における抗−ＨＩＶ抗体の存在は膣分泌物及び糞（これらはそれぞれ膣及び直腸上皮から剥離した細胞を含んでいる）からタンパク質を単離し、そしてｐ24エリザ法を実施することによりアッセイし、抗体が存在するかどうかを測定する。次いで、これらの抗体をＨＩＶ−１ウイルス中和アッセイ（Va hlne等、（1991年）Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.、88: 10744〜10748）で使用することができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９５年３月３０日【補正内容】請求の範囲１．粘膜上皮にワクチンを投与する段階を含むＨＩＶ−１による粘膜上皮細胞の感染を阻止する方法であって、上記ワクチンは約10から約50個までのアミノ酸を有するＨＩＶ−１ gp120のペプチドを含んでおり、そしてそれによって上記ペプチドに対する抗体が上記粘膜内に産生され、上記ぺプチドは上記抗体がＨＩＶ −１による上記細胞の感染を阻止するように選択されている該方法。２．上記ペプチドが、上記粘膜細胞とＨＩＶ−１間の結合を阻止する抗体の粘膜産生を生じさせるのに有効なエピトープを含有し、上記エピトープは配列番号 : 9、10、11、12又は13に存在する請求項１に記載の方法。３．上記ワクチンが上記ペプチドの粘膜への送達を高める物質を更に含んでいる請求項２に記載の方法。４．上記物質が粘膜結合タンパク質を含んでいる請求項３に記載の方法。５．上記粘膜結合タンパク質がコレラ毒素の結合サブユニットである請求項４に記載の方法。６．上記粘膜結合タンパク質が大腸菌の熱に不安定なエンテロトキシンの結合サブユニットである請求項４に記載の方法。７．上記ペプチドと上記粘膜結合タンパク質が一緒に結合してキメラタンパク質を形成する請求項４に記載の方法。８．上記キメラタンパク質が組換えＤＮＡの発現産生物である請求項７に記載の方法。９．上記物質が脂質を含んでいる請求項３に記載の方法。１０．上記脂質が脂質小胞の形態である請求項９に記載の方法。１１．上記投与段階が、上記ペプチドを機能的にコードするポリヌクレオチドを粘膜に投与し、そしてそれによって上記ペプチドを粘膜細胞に産生させることを含む請求項１に記載の方法。１２．ＨＩＶ−１による粘膜細胞の感染を阻止するための組成物であって、エピトープに対する抗体がＨＩＶ−１の粘膜上皮細胞への結合を阻止するように選択されたエピトープを有するＨＩＶ−１ gp120の10から50個のアミノ酸のペプチド; 及び上記ペプチドの粘膜への送達を促進するために上記ペプチドと結合した化合物又は構造体、を含んでいる該組成物。１３．上記エピトープが配列番号: 9、10、11、12又は13に存在する請求項１２に記載の組成物。１４．上記化合物又は構造体が脂質小胞である請求項１２に記載の組成物。１５．上記化合物又は構造体が粘膜結合タンパク質である請求項１２に記載の組成物。１６．上記結合タンパク質がコレラ毒素タンパク質である請求項１５に記載の組成物。１７．上記結合タンパク質がコレラ毒素の結合サブユニットである請求項１５に記載の組成物。１８．上記結合タンパク質が大腸菌の熱に不安定なエンテロトキシンの結合サブユニットである請求項１５に記載の組成物。１９．ＨＩＶ−１による粘膜上皮細胞の感染阻止用の約10から約50個までのアミノ酸を有するＨＩＶ−１ gp120のペプチドであって、粘膜に投与され、該ペプチドに対する、上記ＨＩＶ−１による上記粘膜上皮細胞の感染を阻止する抗体が上記粘膜に産生されるように選択されている該ペプチド。２０．上記ぺプチドが、ＨＩＶ−１による上記粘膜細胞の感染を阻止する抗体の粘膜産生を生じさせるのに有効なエピトープを含み、上記エピトープは配列番号: 9、10、11、12又は13に存在する請求項１９に記載のペプチド。２１．上記ペプチドが、該ペプチドの粘膜への送達を高める物質を更に含んでいる請求項２０に記載のペプチド。２２．上記物質が粘膜結合タンパク質を含んでいる請求項２１に記載のペプチド。２３．上記粘膜結合タンパク質がコレラ毒素の結合サブユニットである請求項２２に記載のペプチド。２４．上記粘膜結合タンパク質が大腸菌の熱に不安定なエンテロトキシンの結合サブユニットである請求項２２に記載のペプチド。２５．上記ペプチドと上記粘膜結合タンパク質が一緒に結合してキメラタンパク質を形成する請求項２２に記載のペプチド。２６．上記キメラタンパク質が組換えＤＮＡの発現産生物である請求項２５に記載のペプチド。２７．上記物質が脂質を含んでいる請求項２１に記載のペプチド。２８．上記脂質が脂質小胞の形態である請求項２７に記載のペプチド。２９．上記投与段階が、上記ペプチドを機能的にコードするポリヌクレオチドを粘膜に投与し、そしてそれによって上記ペプチドを粘膜細胞に産生させることを含む請求項１９に記載のペプチド。３０．ＨＩＶ−１による粘膜細胞の感染を阻止する方法であって、配列番号: 9、10、11、12又は13の１つ又はそれより多いペプチドに対する粘膜抗体を産生させ；上記抗体を粘膜上皮細胞と接触させて提供し; そして上記細胞をＨＩＶ−１と接触させ、それによって上記抗体がＨＩＶ−１による上記細胞の感染を阻止する、段階を含む該方法。３１．上記抗体が免疫原をインビボで粘膜組織に投与することによって産生される請求項３０に記載の方法。３２．上記免疫原が粘膜結合タンパク質と結合している請求項３１に記載の方法。３３．上記粘膜結合タンパク質がコレラ毒素のＢサブユニットである請求項３２に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ホーラル，ペーテルスウェーデン，イェーテボリ，エス―412 66，オランジェリーガータン 21 ビー (72)発明者スヴェンネルホルム，ブースウェーデン，イェーテボリ，エス―412 66，ヤーコブスダールスガータン 48 (72)発明者ヴァールネ，アンデシュスウェーデン，ヴェストラフレールンダ，エス―421 70，グリマーラズバイ 10

Claims

【特許請求の範囲】１．ＨＩＶ−１による粘膜細胞の感染を阻止する方法であって、粘膜にワクチンを投与する段階を含み、それによって粘膜に約10から約50個までのアミノ酸を有するＨＩＶ−１ gp120のペプチドを送達し、上記ペプチドに対する抗体が上記粘膜内に産生され、上記ペプチドは上記抗体がＨＩＶ−１による粘膜上皮細胞の感染を阻止するように選択されている該方法。２．上記ペプチドが、ＨＩＶ−１による上記粘膜細胞の感染を阻止する抗体の粘膜産生を生じさせるのに有効なエピトープを含有し、本質的に配列番号: 9、1 0、11、12又は13からなる請求項１に記載の方法。３．上記ワクチンが上記ペプチドの粘膜への送達を高める物質を更に含んでいる請求項２に記載の方法。４．上記物質が粘膜結合タンパク質を含んでいる請求項３に記載の方法。５．上記粘膜結合タンパク質がコレラ毒素の結合サブユニットである請求項４に記載の方法。６．上記粘膜結合タンパク質が大腸菌の熱に不安定なエンテロトキシンの結合サブユニットである請求項４に記載の方法。７．上記ペプチドと上記粘膜結合タンパク質が一緒に結合してキメラタンパク質を形成する請求項４に記載の方法。８．上記キメラタンパク質が組換えＤＮＡの発現産生物である請求項７に記載の方法。９．上記物質が脂質を含んでいる請求項３に記載の方法。１０．上記脂質が脂質小胞の形態である請求項９に記載の方法。１１．上記投与段階が、上記ペプチドを機能的にコードするポリヌクレオチドを粘膜に投与し、そしてそれによって上記ペプチドを粘膜細胞に産生させることを含む請求項１に記載の方法。１２．ＨＩＶ−１による粘膜細胞の感染を阻止するためのワクチンであって、エピトープに対する抗体がＨＩＶ−１による粘膜上皮細胞の感染を阻止するように選択されたエピトープを有するＨＩＶ−１ gp120の10から50個のアミノ酸ペプチド; 及び上記ペプチドの粘膜への送達を促進するために上記ペプチドと結合した化合物又は構造体、を含む該ワクチン。１３．上記ペプチドが本質的に配列番号： 9、10、11、12又は13からなっている請求項１２に記載のワクチン。１４．上記化合物又は構造体が脂質小胞である請求項１２に記載のワクチン。１５．上記化合物又は構造体が粘膜結合タンパク質である請求項１２に記載のワクチン。１６．上記結合タンパク質がコレラ毒素タンパク質である請求項１５に記載のワクチン。１７．上記結合タンパク質がコレラ毒素の結合サブユニットである請求項１５に記載のワクチン。１８．上記結合タンパク質が大腸菌の熱に不安定なエンテロトキシンの結合サブユニットである請求項１５に記載のワクチン。１９．ＨＩＶ−１による粘膜上皮細胞の感染阻止用の約10から約50個までのアミノ酸を有するＨＩＶ−１ gp120のペプチドであって、粘膜に投与され、該ペプチドに対する、上記ＨＩＶ−１による上記粘膜上皮細胞の感染を阻止する抗体が上記粘膜に産生されるように選択されている該ペプチド。２０．上記ペプチドが、ＨＩＶ−１による上記粘膜細胞の感染を阻止する抗体の粘膜産生を生じさせるのに有効なエピトープを含有し、本質的に配列番号: ９、10、11、12又は13からなっている請求項１９に記載のペプチド。２１．上記ペプチドが、該ペプチドの粘膜への送達を高める物質を更に含んでいる請求項２０に記載のペプチド。２２．上記物質が粘膜結合タンパク質を含んでいる請求項２１に記載のペプチド。２３．上記粘膜結合タンパク質がコレラ毒素の結合サブユニットである請求項２２に記載のペプチド。２４．上記粘膜結合タンパク質が大腸菌の熱に不安定なエンテロトキシンの結合サブユニットである請求項２２に記載のペプチド。２５．上記ペプチドと上記粘膜結合タンパク質が一緒に結合してキメラタンパク質を形成する請求項２２に記載のペプチド。２６．上記キメラタンパク質が組換えＤＮＡの発現産生物である請求項２５に記載のペプチド。２７．上記物質が脂質を含んでいる請求項２１に記載のペプチド。２８．上記脂質が脂質小胞の形態である請求項２７に記載のペプチド。２９．上記投与段階が、上記ペプチドを機能的にコードするポリヌクレオチドを粘膜に投与し、そしてそれによって上記ペプチドを粘膜細胞に産生させることを含む請求項１９に記載のペプチド。