CZ276699A3 - Syntetické GAG geny HIV - Google Patents

Abstract

Syntetickémolekuly DNAkódující gag geny HTV amodifikace gag genů HIV. Kodóny syntetických molekuljsou kodóny upřednostňované plánovanou hostitelskou buňkou. Syntetické molekuly mohou být použityjako polynukleotidové vakciny, které umožňují účinnou imunoprofylaxi proti infekci HTV prostřednictvímstimulace tvorby neutralizačních protiláteka vyvolánímbuňkami zprostředkované imunity.

Description

Syntetické GAG geny HIV

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká vakcin proti viru HIV.

Dosavadní stav techniky

Virus lidské imunodeficience 1 (HIV-1) je etiologickým agens lidského syndromu získané imunodeficience (AIDS) a příbuzných onemocnění. HIV-1 je RNA virus náležící do rodiny retrovirů a má 5'LTR-gag-pol-env-LTR3' organizaci, která je vlastní všem retrovirům. Kromě toho obsahuje HIV-1 mnoho genů s regulační nebo neznámou funkcí, jako jsou například tat a rev geny. Env gen kóduje glykoprotein virového obalu, který je translatován jako 160-kDa prekursor (gpl60) a potom je štěpen buněčnou proteasou za vzniku 120 kDa obalového glykoproteinu (gpl20) a transmembránového 41 kDa obalového glykoproteinu (gp41). Gpl20 a gp41 zůstávají v asociaci a jsou přítomny na virových částicích a na povrchu buněk infikovaných HIV. Gpl20 se váže na CD4 receptor, který je přítomen na povrchu pomocných T-lymfocytů, makrofágů a jiných cílových buněk. Po navázání gdl20 na CD4 způsobí gp41 fúzi, která je odpovědná za vstup viru.

Infekce začíná tehdy, když se gpl20 na virové částici naváže na CD4 receptor na povrchu T4 lymfocytů nebo jiných cílových buněk. Navázaný virus splývá s cílovou buňkou a reversně transkribuje svůj RNA genům do dvouřetězcové DNA buňky. Virová DNA je inkorporována ‘do genetického materiálu v buněčném jádru, kde virová DNA řídi produkci nové virové RNA, virových proteinů a nových virových částic. Nové částice jsou vyloučeny z membrány cílových buněk a infikují další buňky.

• ·

Destrukce T4 lymfocytů, které jsou zásadní pro imunitní odpověď, je hlavní příčinou progresivní imunitní dysfunkce, která je hlavním znakem infekce HIV. Ztráta cílových buněk vážným způsobem narušuje schopnost imunitního systému vyhledávat většinu invadujících patogenů, ale nejvýrazněji je narušena obrana proti virům, houbám, parasitům a některým bakteriím, zejména mykobakteriím.

HIV-1 usmrcuje buňky, které infikuje, replikací, únikem z buněk a poškozením buněčné membrány. HIV-1 může usmrtit cílové buňky nepřímo prostřednictvím gpl20, který je přítomen na povrchu infikovaných buněk. Protože CD4 receptor na T buňkách má silnou afinitu pro gpl20, mohou se zdravé buňky exprivující CD4 receptor vázat na gpl20 a mohou fúzovat s infikovanými buňkami za vzniku syncytia.

HIV-1 může také vyvolat normální buněčnou imunitní odpověď proti infikovaným buňkám. S nebo bez pomoci antibiotik mohou cytotoxické buňky imunitního systému destruovat infikované buňky, které mají na svém povrchu přítomny virové proteiny. Nakonec, volné gag a gpl20 proteiny mohou cirkulovat v krvi jedinců infikovaných HIV-1. Volný gpl20 protein se může vázat na CD4 receptor neinfikovaných buněk, čím budou tyto buňky považovány za infikované a bude proti nim vyvolána imunitní odpověď.

Infekce HIV-1 je téměř vždy fatální a v současné době nejsou známá žádná vyléčení infekce HIV-1. Účinné vakciny pro prevenci infekce HIV-1 nejsou dosud dostupné. Vzhledem k nebezpečí zvrhnutí nebo infekce nebude pravděpodobně ve vakcině použit živý atenuovaný virus. Většina podjednotkových vakcin nebyla úspěšná v prevenci infekce HIV-1. Terapie infekce HIV-1, ačkoliv prodlužuje život některých infikovaných osob, má zavažné • 9 ··· nežádoucí účinky. Existuje proto potřeba účinných terapeutických a vakcinačních prostředků pro léčbu této letální infekce.

Vakcinace je účinnou formou prevence onemocnění a byla úspěšně ověřena pro několik typů virových infekcí. Určení způsobů pro presentaci antigenů HIV-1 lidskému imunitnímu systému tak, aby se vyvolala protektivní humorální a protilátková odpověď, je obtížné. Doposud nebyly pokusy o vyrobení účinné vakciny proti HIV úspěšné. U pacientů s AIDS je volný virus přítomen pouze v nízkých koncentracích. Přenos HIV-1 je zesílen interakcemi buňka-buňka a tvorbou syncytií. Proto jsou protilátky namířené proti volnému viru nebo virovým podjednotkám obyčejně neúčinné v eliminaci buněk infikovaných virem.

Vakciny využívají schopnost organismu zapamatovat si antigen. Po prvním kontaktu s daným antigenem tvoří imunitní systém buňky, které si imunologicky zapamatují antigen po dobu svého života. Další expozice antigenů stimuluje imunitní odpověď a vede k eliminaci nebo inaktivaci patogenu.

Imunitní systém odstraňuje patogeny dvěma způsoby: protilátkovou a buňkami zprostředkovanou odpovědí.

V protilátkové odpovědi tvoří lymfocyty specifické protilátky, které se váží na antigen a tak inaktivují patogen. Buňkami zprostředkované odpovědi se účastní cytotoxické a pomocné T lymfocyty, které specificky útočí a destruují infikované buňky.

Vývoj vakcin proti HIV-1 viru má ty problémy, že HIV-1 infikuje stejné buňky, které vakcina potřebuje pro aktivaci imunitního systému (t.j. T4 lymfocyty). Bylo by výhodné vyvinout vakcinu, která by inaktivovala HIV před narušením imunitního • »

systému. Zejména výhodný typ vakciny proti HIV by vyvolával anti-HIV imunitní odpověď, která by rozpoznávala varianty HIV a která by působila u HlV-pozitivních jedinců v počátku infekce.

Hlavním problémem vývoje vakcin proti virům, zejména proti těm virům, které mají vysokou rychlost mutací, jako je virus lidské imunodeficience, a u kterých je žádoucí vyvolání neutralizační a protektivní imunitní odpovědi, je diversita proteinů virového obalu mezi různými izoláty nebo kmeny viru. Protože cytotoxické T-lymfocyty (CTL) u myší i lidí jsou schopné rozpoznání epitopů odvozených od konzervativních vnitřních virových proteinů a proto se považují za významné v imunitní odpovědi proti virům, byly provedeny pokusy o vývoj CTL vakcin schopných vyvolat heterologní ochranu proti různým virovým kmenům.

Je známo, že CD8+ CTL usmrcují virem infikované buňky tehdy, když jejich T receptory rozpoznají virové peptidy asociované s MHC molekulami I třídy. Virové peptidy jsou odvozené od endogenně syntetizovaných virových proteinů, bez ohledu na lokalizaci proteinu nebo na jeho funkce ve viru. Proto může rozpoznání epitopů konzervativních virových proteinů CTL vyvolat mezidruhovou ochranu. Peptidy schopné asociace s MHC třídou pro rozpoznání CTL pocházejí z proteinů, které jsou přítomny v nebo které procházejí skrz cytoplasmu nebo endoplasmatické retikulum. Obecně, exogenní proteiny, které vstupují do buněk procesem endosomálního zpracování (jak je tomu v případě antigenů presentovaných pomocí molekul MHC třída II), nejsou účinné při vyvolání odpovědi CD8+ CTL.

Většina pokusů o vyvolání CTL odpovědí využívala replikujících se vektorů pro produkci proteinového antigenů v buňce nebo byla zaměřena na vložení peptidů do cytosolu. Tyto ···· ·· ·· · přístupy mají omezení, která mohou limitovat jejich použití jako vakcin. Retrovirové vektory mají omezení ve velikosti a struktuře polypeptidů, které mohou být exprivovány jako fúsní proteiny a zároveň v udržování schopnosti replikace rekombinantního viru, a účinnost vektorů jako je vakcinie pro další imunizace může být ohrožena imunitní odpovědí proti vektoru samotnému. Také mají virové vektory a modifikované patogeny vlastní rizika, která mohou být překážkou jejich použití u lidí. Dále, výběr peptidových epitopů pro presentaci je závislý na struktuře MHC antigenů jedince a proto může mit peptidová vakcina omezenou účinnost z důvodů diversity MHC haplotypů v populaci.

Benvenisty, N. a Reshef, L. (PNAS 83: 9551 - 9555 (1986)) popisuje, že DNA srážená CaCl₂, která je podána myším intraperitoneálně (i.p.), intravenosně (i.v.) nebo intramuskulárně (i.m.) může být exprivována. I.m. injekce DNA expresních vektorů bez srážení CaCl₂ u myší vede k vychytávání DNA ve svalových buňkách a k expresi proteinu kódovaného DNA. Plasmidy byly udržovány episomalně a nereplikovaly se. Potom byla setrvalá exprese pozorována po i.m. injekci v kosterním svalu krys, ryb a primátů a v srdečním svalu krys. Technika pro použití nukleových kyselin jako terapeutických činidel byla popsána v WO 90/11092 (4.10.1990), ve kterém jsou holé nukleotidy použity pro vakcinaci u obratlovců.

Pro úspěšné provedení techniky není nutné, aby byla imunizace provedena intramuskulárně. Vložení zlatých mikroprojektilů potažených DNA kódující lidský růstový hormon (HGH) do kůže myší vede k produkci anti-HGH protilátek u myší. Tryskový injektor byl použit pro transfekci kůže, svalu, tuku a prsní žlázy u živých zvířat. Byly popsány různé techniky pro přenos nukleových kyselin. Zhu et al. (Science 261: 209 - 211,

9.7.1993) popisuje, že intravenosní injekce DNA:kationtového liposomového komplexu u myší vede k systémové expresi klonovaného transgenu. Ulmer et al. (Science 259: 1745 - 1749 (1993)) popisuje heterologní ochranu před infekcí chřipkovým virem při použití intramuskulární injekce DNA kódující proteiny chřipkového viru.

Potřeba specifických terapeutických a profylaktických činidel schopných vyvolání požadované imunitní odpovědi proti patogenům a nádorovým antigenům je splněna v předkládaném vynálezu.

Výhodou tohoto terapeutického přístupu je schopnost indukovat imunitní odpověď T-buněk, která může bránit infekcím nebo onemocněním způsobeným i takovými kmeny virů, které jsou heterologní ke kmenu, ze kterého byl získán gen pro antigen.

Toto je zejména výhodné při léčbě infekcí HIV, protože o tomto viru je známo, že rychle mutuje a bylo identifikováno mnoho virulentních izolátů (viz například LaRosa et al., Science 249: 932 - 935 (1990), který identifikuje 245 jednotlivých izolátů HIV). Vzhledem k této známé diversitě se výzkumníci pokusili generovat CTL peptidovou imunizací. Takahashi et al (Science 255: 333 - 336 (1992)) popisuje indukci široce mezikmenovš reaktivních cytotoxických T buněk rozpoznávajících obalovou (gpl60) determinantu HIV. Nicméně, tito pracovníci poznali obtížnost v dosažení skutečně mezikmenově reaktivní CTL odpovědi a naznačili, že existuje dichotomie mezi primární stimulací a restimulaci T buněk, která je velmi striktní a vyvoláním efektorových funkcí, včetně cytotoxícíty, u již stimulovaných CTL.

Wang et al. popisuje vyvolání imunitní odpovědi proti HIV u myší za použití intramuskulární inokulace klonovaným genomovým (nesestřiženým) genem HIV. Nicméně, hladina imunitních odpovědí dosažených v této studii byla velmi nízká. Kromě toho, v práci ·· • · 4 ·

4 · • 444

444« ·« ·· ¹ ·· 4 > »4 4 •44 ··· od Wang et al. využívá DNA konstrukt pouze genomovou část Tat/rev-gpl60-Tat/rev kódující sekvence HIV. Jak je podrobněji popsáno dále, toto je suboptimální systém pro získání vysoké hladiny exprese gpl60. Tento systém je také potenciálně nebezpečný, neboť exprese Tat přispívá k progresi Kaposhiho sarkomu.

WO 93/17706 popisuje způsob pro vakcinaci zvířat proti virům, ve kterém jsou nosiče potaženy genovým konstruktem a potažené částice jsou akcelerovány do zvířecích buněk. Pro HIV bylo navrženo použití v podstatě celého genomu, bez dlouhých koncových repetitivních sekvencí. Tato metoda představuje významná rizika pro příjemce. Obecně se předpokládá, že konstrukt HIV by měl obsahovat méně než 50% HIV genomu pro zajištění bezpečnosti vakciny; toto zajišťuje eliminaci enzymatických a regulačních proteinů viru, z nichž mnohé mají neznámou nebo špatně známou funkci. Tak je stále přítomno mnoho problémů při vývoji použitelných lidských HIV vakcin za použití technologie přenosu genů.

Předkládaný vynález předpokládá použití jakýchkoliv známých technik pro vnesení polynukleotidů do živých tkání za účelem indukce proteinů. Nicméně, předkládaný vynález poskytuje nový imunogen pro vnesení HIV a jiných proteinů do dráhy pro zpracování antigenu pro účinné vyvolání CTL a protilátek specifických pro HIV. Farmaceutický prostředek je použitelný jako vakcina pro vyvolání jak buněčné, tak protilátkové anti-HIV a HIV-neutralizující odpovědi. V předkládaném vynálezu jsou problémy uvedené výše vyřešeny tak, že jsou poskytnuty polynukleotidové imunogeny, které po vnesení do živočicha indukují účinnou expresi HIV proteinů a epitopů bez rizik asociovaných s takovými technikami. Takto vyvolané imunitní odpovědi jsou účinné v rozpoznávání HIV, v inhibici replikace • 9 ··· 9 ·

·♦ 99

9 9 φ • ♦ ♦ 9 • * *·· 9

999 999 • · 9 ·· 99

HIV, v identifikaci a usmrcení buněk infikovaných HIV a jsou zkříženě reaktivní pro mnoho kmenů HIV.

Pořadí kodonů v organismech je vysoce specifické a liší se mezi organismy. Tato informace je použita pro konstrukci a expresi alterovaných nebo syntetických genů, které mají požadovanou translační účinnost, které se použijí pro určení protein-kodujících regionů genomu, pro vnesení míst pro translační pauzy do heterologních genů a pro zajištění vztahu nebo evolučního původu nukleotidových sekvencí.

Exprese cizorodých heterologních genů v transformovaných organismech je v současné době běžná. Velké množství savčích genů, včetně například myších a lidských genů, bylo úspěšně insertováno do jednobuněčných organismů. Standardní techniky obsahují vnesení cizorodého genu, který má být exprivován, do vektoru jako je plasmid nebo fág a využití tohoto vektoru pro inserci genu do organismu. Přirozené promotory pro takové geny jsou běžně nahrazeny silnými promotory kompatibilními s hostitelem, do které je gen insertován. Sekvencování proteinů umožňuje hodnocení aminokyselinových sekvencí i malých množství přirozeného proteinu. Z těchto aminokyselinových sekvencí může být odvozena DNA sekvence kódující tyto proteiny. Syntéza DNA je také rychle se vyvíjejícím oborem a syntetické geny odpovídající těmto odvozeným DNA sekvencím mohou být snadno vyrobeny.

I přes přibývající znalosti expresních systémů a rekombinantní DNA zůstávají při pokusech o expresi cizorodých nebo syntetických genů v organismu významné překážky. Mnoho nativních, aktivních proteinů je například při expresi v cizím hostiteli glykosylováno jiným způsobem, než je přirozený způsob. Z tohoto důvodu jsou pro expresi mnoha savčích genů výhodnější eukaryotičtí hostitelé jako jsou například kvasinky, než ·« ·· » · · · • · · • ··· · ···· ·· »· ’ · · · ί · · · • ··· ·· ·· • ♦ · 9 • * · 9 ··· 999 bakteriální hostitelé. Problém glykosylace je předmětem výzkumu,

Jiným problém je málo poznán. Často je translace syntetického genu, i když je navázán na silný promotor, mnohem méně účinná, než je předpokládáno. Stejná skutečnost platí často pro exogenní geny cizorodé pro expresní organismus. I tehdy, je-li gen transkribován dostatečně účinně, takže je možno získat dostatečná množství produktu translace, je protein často inaktivní nebo se jiným způsobem ve svých vlastnostech liší od přirozeného proteinu.

Je známo, že poslední uvedený problém je často způsoben jiným skládáním proteinu v odlišných organismech. Řešení tohoto problému není známo a mechanismy kontrolující skládání proteinů j sou málo známé.

Předpokládá se, že problémy související s účinností translace jsou ve vztahu s účinky kontextu kodonů. Protein kódující regiony genů ve všech organismech jsou předmětem mnoha funkčních omezení, z nichž některá závisí na požadavcích nutných pro správnou funkci proteinu, stejně jako na vhodných start a stop signálech pro translaci. Nicméně, několik rysů protein-kodujících regionů bylo objeveno a není snadné pochopit jejich přesnou funkci. Dvě důležité třídy takových vlastností jsou ty, které souvisejí s využitím kodonů a ty, které souvisejí s kontextem kodonů.

Je známo, že využití kodonů je vysoce variabilní a že se významně liší mezi růgnými organismy. Bylo dokázáno, že charakter využití kodenů souvisí s relativním množstvím izoakoeptorů tRNA. Geny kódující proteiny přítomné ve velmi malých versus velmi ^velkých množstvích vykazují rozdíly v preferencích kodonů. Možnost, že variabilita ve využití kodonů

mění rychlost elongace peptidu, byla brána v úvahu. Ačkoliv jsou rozdíly ve využití kodonů spojeny s rozdíly v rychlosti translace, přímé účinky volby kodonu na translaci je obtížné prokázat. Jiné navržené techniky charakterizované využitím kodonů zahrnují maximalizaci spolehlivosti translace a optimalizaci kinetické účinnosti syntézy proteinů.

S výjimkou náhodného využití kodonů jsou shromažďovány důkazy, že párování kodon/antikodon je ovlivněno sekvencemi mimo kodon samotný, kdy tento jev se nazývá kontext kodonů.

Existuje silný vliv sousedních nukleotidů na účinnost suprese nesmyslnými kodony, stejně jako chybnými kodony. Je jasné, že nadbytek supresorové aktivity v přirozených populacích bakterií, stejně jako využití terminačních kodonů pro kódování selenocysteinu a fosfoserinu vyžadují, aby byla terminace závislá na kontextu. Podobné účinky kontextu byly prokázány při ovlivnění spolehlivosti translace, stejně jako účinnosti iniciace translace.

Statistické analýzy protein - kódujících regionů E. coli dokázaly jinou manifestaci kontextu kodonů. Přítomnost určitého kodonu v určité pozici silně ovlivňuje frekvenci výskytu určitých nukleotidů v sousedních kodonech a tento kontext se významně liší pro geny exprivované silně a slabé. Ačkoliv byl objeven účinek kontextu, je prediktivní hodnota statistických pravidel týkajících se preferovaných nukleotidů sousedících s kodony relativně nízká. Toto limituje použitelnost takových dat pro preferenci nukleotidů ve výběru kodonů pro dosažení požadované účinnosti translace.

Pokrok ve vybavení pro automatizované sekvencování nukleotidů zajistil dostupnost velkého množství dat pro sekvenci mnoha organismů. Pochopení takových dat představuje značný problém.

··· · ··· ··· • · • · · ·

Například, je významné identifikovat kódující regiony genomu tak, aby odpovídala genetická sekvence proteinové sekvenci. Dále je zkoumán původ genomu některých organismů. Je známo, že genomy některých organismů mají smíšený původ. Některé sekvence, které jsou virového původu, jsou nyní stabilně inkorporovány do genomu eukaryotických organismů. Virové sekvence samotné mohou pocházet z jiných, nepříbuzných druhů. Pochopení původu genu může být významné pro stanovení správných analogií mezi příbuznými geny a jejich translačními produkty.

Existuje potřeba lepšího pochopení vlivu kontextu kodonů na translaci a potřeba technik pro určení vhodných kodonů pro jakýkoliv požadovaný translační efekt. Jsou také potřeba metody pro určení kódujících regionů genomu ze sekvence nukleotidů.

Jsou také potřeba metody pro kontrolu skládání proteinu a pro zajištění správného složení cizorodého genu po expresi v hostiteli. Geny pozměněné nebo konstruované tak, aby měly požadovanou translační účinnost, budou značně významné.

Jiným aspektem technik rekombinantní DNA pro expresi průmyslově a farmaceuticky významných proteinů v mikroorganismech je fenomen preference kodonů. Ačkoliv bylo výše uvedeno, že existující mechanismus pro genovou expresi v geneticky transformované hostitelské buňce bude fungovat tak, že bude tvořen požadovaný produkt, úroveň exprese v mikroorganismu bude různá, podle specifických použitých alternativních forem genetického kódu specifického pro aminokyseliny v insertovaném exogenním genu. Tripletový kodon ze čtyř možných nukleotídových baží může existovat v 64 variantách. Protože tyto varianty nesou informaci pouze pro 20 různých aminokyselin (stejně jako pro zahájení a ukončení transkripce), mohou být některé aminokyseliny kódovány více než jedním kodonem. Některé aminokyseliny mají až šest násobných, alternativních kodonů, zatímco jiné mají jediný kodon. Z ne zcela jasných důvodů nejsou alternativní kodony uniformě přítomny v endogenní DNA různých typů buněk a zdá se, že existuje variabilní přirozená hierarchie nebo preference určitých kodonů v určitých typech buněk.

Například, aminokyselina leucin je určena jakýmkoliv ze 6 DNA kodonů CTA, CTC, CTG, CTT, TTA a TTG (které odpovídají, v příslušném pořadí, mRNA kodonům CUA, CUC, CUG, CUU, UUA a UUG) . Vyčerpávající analýza frekvence kodonů v genomu pro mikroorganismy ukázala, že endogenní DNA E. coli nej častěji obsahuje CTG kodon pro leucin, zatímco DNA kvasinek a plísní nej častěji obsahuje TTA kodon pro leucin. Podle této hierarchie se soudí, že pravděpodobnost získání silné exprese polypeptidu bohatého na leucin v E. coli bude v nějakém rozsahu záviset na frekvenci použití kodonů. Například, gen bohatý na TTA kodony bude pravděpodobně slaběji exprivován v E. coli, zatímco gen bohatý na CTG bude pravděpodobně v E. coli exprivován silně. Podobně, pokud jsou plánovaným hostitelem pro expresi polypeptidu bohatého na leucin kvasinky, bude výhodným kodonem v insertováné DNA kodon TTA.

Významy fenoménu preference kodonů na techniky rekombinantní DNA jsou jasné a fenomen může vysvětlit mnoho předešlých selhání při dosažení silné exprese exogenních genů v úspěšně transformovaných hostitelských organismech - v insertovaném genu může být přítomen méně preferovaný kodon a expresní mechanismy hostitelské buňky mohou fungovat neúčinně. Tento fenomen naznačuje, že syntetické geny, které byly navrženy tak, aby obsahovaly preferované kodony plánovaného hostitele, jsou výhodnou formou genetického materiálu pro provozování technik rekombinantní DNA.

Diversita funkce, která je typická pro eukaryotické buňky, závisí na strukturální diferenciaci jejich membránových vazeb. Pro vytvoření a udržení takových struktur musí být proteiny transportovány z místa syntézy v endoplasmatickém retikulu na předem určená místa v buňce. Tento přenos vyžaduje přepravní proteiny obsahující signály pro třídění, které jsou rozpoznávány molekulárními mechanismy odpovědnými za selekci proteinů, které jsou umístěny v klíčových místech přenosových drah. Třídění probíhá pro většinu proteinů pouze jednou, protože jejich umístění, kde provádějí svou funkci, je permanentní.

Udržování intracelulární integrity závisí částečně na selektivním třídění a přesném transportu proteinů na jejich správná umístění. V průběhu posledních let byl důkladně studován molekulární mechanismus pro zaměření a lokalizaci proteinů. Na proteinech byly stanoveny definované motivy sekvence, které fungují jako sekvence označující umístění. Vedoucí nebo signální peptidy, jako jsou například ty, které jsou odvozeny od aktivačního proteinu tkáňově specifického plasminogenu, tPA, slouží pro transport proteinu do buněčné sekreční dráhy prostřednictvím endoplasmatického retikula a Golgiho aparátu. Bylo objeveno mnoho signálních sekvencí, které jsou asociovány s cytoplasmatickými doménami membránových proteinů jako jsou di-leucinové aminokyselinové motivy nebo tyrosinové sekvence, které mohou směrovat proteiny do lysozomálních kompartmentů. Pro HIV závisí transport a vylučování virových částic z buněk na myristoylaci glycinu číslo 2 na amino-konci gag.

Podstata vynálezu

Vynález obsahuje syntetické molekuly DNA kódující HIV gag a modifikace HIV gag. Kodony syntetických molekul obsahují preferované kodony plánovaných hostitelských buněk. Syntetické molekuly představují výhodné formy cizorodého genetického • · · 4 ·

4

4444 4· materiálu. Syntetické molekuly mohou být použity jako polynukleotidová vakcina, která vyvolává účinnou imunoprofylaxi proti infekci HIV prostřednictvím neutralizačních protilátek a buňkami zprostředkované imunity. Předkládaný vynález poskytuje polynukleotidy, které při přímém vložení do obratlovců, včetně savců jako jsou primáti a lidé, in vivo, indukují expresi kódovaných proteinů ve zvířeti.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr.l ukazuje relativní expresi gag a tPA gag v transfektované buněčné linii 293 po transfekci DNA pro gag HIV.

Obr. 2 ukazuje sérovou anti-gag odpověď u myší po vakcinaci optimalizovanou HIV gag a tPA-gag DNA.

Obr. 3 ukazuje anti-gag CTL odpověďi splenocytů od myší po vakcinaci optimalizovanou HIV gag a tPA-gag DNA.

Obr. 4 ukazuje sekreci cytokinů specifickou pro gag antigen pro splenocyty od myší po vakcinaci optimalizovanou HIV gag a tPA-gag DNA.

Obr. 5 ukazuje anti-HIV gag CTL pro myši vakcinované HIV p55 gag DNA.

Vynález poskytuje syntetické molekuly DNA kódující HIV gag a syntetické molekuly DNA kódující modifikované formy HIV gag. Kodony syntetických molekul jsou navrženy tak, že obsahují preferované kodony plánovaných hostitelských buněk. Syntetické molekuly mohou být použity jako polynukleotidová vakcina, která vyvolává účinnou imunoprofylaxi proti infekci HIV • ··· · •·4 444 prostřednictvím neutralizačních protilátek a buňkami zprostředkované imunity. Syntetické molekuly mohou být použity jako imunogenní prostředek. Předkládaný vynález poskytuje polynukleotidy, které při přímém vložení do obratlovců, včetně savců jako jsou primáti a lidé, in vivo indukují expresí kódovaných proteinů ve zvířeti.

Jak je zde použit, znamená termín polynukleotid nukleovou kyselinu, která obsahuje základní regulační elementy, takže je schopna po vložení do živých buněk obratlovců řízení buněčných mechanismů, které produkují produkty translace kódované geny obsaženými v polynukleotidu. V jednom provedení vynálezu je polynukleotid polydeoxyribonukleová kyselina obsahující alespoň jeden HIV gen, který je operativně navázán na transkripční promotor. V jiném provedení vynálezu obsahuje polynukleotidové vakcina (PNV) polyribonukleovou kyselinu kódující alespoň jeden HIV gen, který je schopen translace v aparátu eukaryotické buňky (v ribosomech, tRNA a jiných transkripčních faktorech). Pokud se protein kódovaný polynukleotidem vyskytuje u zvířete pouze při patologických stavech (t.j. jedná se o heterologní protein), jako jsou například proteiny asociované s virem lidské imunodeficience (HIV), etiologickým agens syndromu získané imunodeficience (AIDS), tak je imunitní systém zvířete aktivován ke spuštění protektivní imunitní odpovědi. Protože jsou tyto exogenní proteiny produkovány tkáněmi zvířete, jsou zpracovány hlavním histokompatibilním systémem (MHC) způsobem, který je analogický s aktuální infekcí příbuzným organismem (HIV). Důsledkem je - jak je uvedeno v předkládaném vynálezu - indukce imunitní odpovědi proti příbuznému.

V souladu s tíflthpřipravili. vynálezci nukleové kyseliny, které po vložení do'biologického. · systému indukují expresi HIV proteinů a epitopů. Indukovaná protilátková odpověď je jak specifická pro

exprivovaný HIV protein, tak neutralizuje HIV. Kromě toho jsou indukovány cytotoxické T-lymfocyty, které specificky rozpoznávají a ničí buňky infikované HIV.

Předkládaný vynález obsahuje metodu pro použití polynukleotidů, který po vložení do savčí tkáně indukuje expresi určitého genového produktu v jednotlivé buňce in vivo.

Předkládaný vynález obsahuje různá provedení, která nevyžadují mnohotné manipulace s rev dependentními HIV geny pro získání rev-independentních genů. Rev-independentní expresní systém, který je zde popsán, je použitelný jako takový a je to systém pro demonstraci exprese jednoho požadovaného genu-produktu v jedné buňce in vivo.

Protože mnoho aplikací předkládaného vynálezu je v oblasti vakcinace proti virovým infekcím, jsou polynukleotidy často označovány jako polynukleotidová vakcina, neboli PNV. To neznamená, že další možnosti použití takových polynukleotidů, v imunitní stimulaci a v protinádorové terapii, jsou mimo rozsah předkládaného vynálezu.

V jednom provedení předkládaného vynálezu je gen kódující HIV genový produkt vložen do expresního vektoru. Vektor obsahuje transkripční promotor rozpoznávaný eukaryotickou RNA polymerasou a transkripční terminátor na konci kódující sekvence HIV genu.

Ve výhodném provedení je promotorem cytomegalovirový promotor se sekvencí intronu A (CMV-intA), ačkoliv odborníků v oboru je známo mnoho dalších protmotorů, jako je například silný imunoglobulinový promotor nebo promotory jiných eukaryotických genů, které mohou být použity. Výhodnou transkripční terminační sekvencí je terminační sekvence hovězího růstového hormonu. Zejména výhodná je kombinace CMVintA-BGH terminační sekvence.

• 9999 999 ·*··9 9 999 · ·|| • 9 9 9 9 9 ···> <9 99 «·

Pro usnadnění přípravy polynukleotidů v prokaryotických buňkách obsahuje expresní vektor také výhodně markér resistence na antibiotika pod transkripční kontrolou prokaryotického promotoru, takže exprese resistence na antibiotikum neprobíhá v eukaryotických buňkách. Mohou být použity geny resistence na ampicilin, geny resistence na neomycin a jiné farmaceuticky přijatelné markéry resistence na antibiotika. Pro usnadnění vysoké hladiny produkce polynukleotidu fermentací v prokaryotickém organismu je výhodné, aby vektor obsahoval prokaryotický element rozpoznávající počátek replikace a aby měl velký počet kopií. Tyto výhody splňuje mnoho komerčně dostupných prokaryotických klonovacích vektorů. Je žádoucí, aby byly odstraněny neesenciální DNA sekvence. Je také žádoucí, aby vektor nebyl schopen replikace v eukaryotických buňkách. Toto minimalizuje riziko integrace sekvencí polynukleotidové vakciny do genomu příjemce. Tkáňově specifické promotory nebo zesilovače transkripce mohou být použity tehdy, je-li žádoucí omezení exprese na určitý typ tkáně.

V jednom provedení je použit expresní vektor pnRSV, ve kterém je jako promotor použita dlouhá terminální repetitivní sekvence (LTR) viru Rousova sarkomu (RSV). V jiném provedení je použit VI, mutovaný pBR322 vektor, do kterého byly klonovány CMV promotor a BGH transkripční terminační sekvence. V j iném provedení byly kombinovány VI a pUC19, za vzniku expresního vektoru označeného VIJ. Do VIJ nebo jiného vhodného expresního vektoru je klonován HIV gen, jako je například gpl20, gp41, gplSO, gag, pol, env, nebo jakýkoliv jiný gen HIV, který může indukovat imunitní odpověď proti HIV. V jiném provedení byl gen pro resistenci na ampicilin odstraněn z VIJ a byl nahrazen genem resistence na neomycin za vzniku VlJ-neo, do kterého byly klonovány různé geny HIV pro použití v předkládaném vynálezu. V jiném provedení je vektorem VIJns, který je stejný jako VIJneo s • · tou výjimkou, že jedinečné Sfil restrikční místo bylo vloženo do jedinečného Kpnl místa v pozici 2114 VlJneo. Incidence Sfil míst v lidské genomové DNA je velmi nízká (přibližně 1 místo na 100000 baží). Proto tento vektor umožňuje podrobné sledování integrace expresního vektoru do DNA hostitele, trávením extrahované genomové DNA Sfil. V dalším provedení je vektorem VIR. V tomto vektoru bylo co možná nejvíce neesenciální DNA vystřiženo z vektoru za vzniku vysoce kompaktního vektoru. Tento vektor je derivátem VIJns. Tento vektor umožňuje použití větších insertů, s menším rizikem toho, že budou kódovány nežádoucí sekvence a s optimalizaci vychytávání buňkami.

V jednom provedení předkládaného vynálezu jsou inkorporovány geny kódující HIV gag z laboratorně adaptovaných kmenů HIV jako je IIIB nebo CAM-1. Odborníkům v oboru bude jasné, že při použití genů z jiných kmenů, než je HIV-1 nebo HIV-2, které mají analogické funkce jako geny z HIV-1, se předpokládá, že vyvolají imunitní odpovědi analogické odpovědím popsaným pro konstrukty z HIV-1. Klonování a metody zpracování pro získání takových genů jsou odborníkům v oboru známé.

Sekvence mnoha genů mnoha HIV kmenů jsou v současnosti veřejně dostupné v GENBANK a takové primární, polní izoláty HIV jsou dostupné od National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), který má kontrakt s Quality Biological, Inc., (7581 Lindberg Drive, Gaithersburg, Maryland 20879). Takové kmeny jsou také dostupné od Světové zdravotnické organizace (WHO) (Network for HIV Isolation and Characterization, Vaccine Devolopment Unit, Office of Research, Global Programme on AIDS, CH-1211 Geneva 27, Switzerland). Z této práce bude odborníkům v oboru jasné, že jedním využitím předkládaného vynálezu je systém pro in vivo a in vitro testování a analýzy, které umožní korelaci diversity sekvence HIV se sérologií HIV neutralizace, ··· · peptidovym přesahem, který se někdy nazývá pro-sekvencí. Pro proteiny určené buď pro sekreci do extracelulárního media, nebo pro membránu, směruje tato signální sekvence, která je obyčejně hydrofobní, protein do endoplasmatického retikula, ze kterého je přesunut do určeného místa.

Termín intron označuje část DNA uvnitř genu, která nekóduje aminokyseliny v produktu genu. Prekursorová RNA intronu je excidována a není proto transkribována do mRNA, ani není translatována na protein.

Termín kazeta označuje sekvenci podle předkládaného vynálezu, která obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která má být exprivována. Kazeta se podobá pásce. Každá kazeta obsahuje vlastní sekvenci. Při záměně kazety exprivuje vektor jinou sekvenci. Díky restrikčním místům na 5' a 3' koncích může být kazeta snadno insertována, odstraněna nebo nahrazena jinou kazetou.

Termín 3' netranslatováný region nebo 3'UTR označuje sekvenci na 3' konci strukturálního genu, která je obvykle transkribována s genem. Tento 3'UTR obvykle obsahuje póly A sekvenci. Ačkoliv je 3'UTR transkribován z DNA, je excidován před translací na protein.

Termín nekódující region nebo NCR označuje region sousedící s 3'UTR regionem strukturálního genu. NCR region obsahuje transkripční terminační signál.

Termín restrikční místo označuje specifické místo sekvence pro štěpení restrikčními endonukleasami.

Termín vektor označuje některé prostředky, pomocí kterých

99 • 99 9

9 9

999 9

9

9999 99

99 » 9 9 9 ► 9 9 9

999 >9 » 9 9 9 » 9 9 9

999 999

9

99

999 mohou být fragmenty DNA vloženy do hostitelského organismu nebo do tkáně hostitele. Existují různé typy vektorů včetně plasmidů, bakteriofágů a kosmidů.

Termín účinné množství označuje dostatečné množství PNV, které po injikování produkuje odpovídající hladiny polypeptidu. Odborníkům v oboru bude jasné, že toto množství se může velmi lišit.

Pro popis předkládaného vynálezu je uveden dosavadní stav znalostí o HIV. Virus lidské imunodeficience (HIV) má genom skládající se z ribonukleové kyseliny. Tento RNA genom musí být reversně transkribován způsobem v oboru známým pro vznik cDNA kopií pro klonování a manipulaci za použití zde uvedených metod. Na každém konci genomu je dlouhá koncová repetitivní sekvence, která působí jako promotor. Mezi těmito konci kóduje genom v různých čtecích rámcích gag-pol-env jako hlavní genové produkty: gag jě skupinově specifický antigen; pol je reversní transkriptasa nebó polymerasa; v tomto regionu, v jiném čtecím rámci, je také kódovány virová proteasa, která je odpovědná za postranslační zpracování, například gpl60 na gpl20 a gp41; env je obalový protein; vif je infekční faktor virionu; rev je regulátor exprese virionového proteinu; nef je negativní regulační faktor; vpu je faktor produktivity virionu u; tat je trans-aktivátor transkripce; vpr je virový protein r. Funkce všech těchto prvků je popsána.

V jednom provedení předkládaného vynálezu je gen kódující HIV gag protein přímo navázán na transkripční promotor. Nicméně, exprese gag je potlačena za absence rev díky chybění exportu nesestřižených genů z jádra. Pro pochopení tohoto systému musí být podrobněji popsán životní cyklus HIV.

·· 44

4« • 4 4 4

4 4 • 4 · 4 • 4

4444 44 ♦ 4 4 • 4 4 • ·4 •

4'

V životním cyklu HIV je po infikování hostitelské buňky RNA genom HIV reversně transkribován do provirové DNA, která se integruje do genomové DNA hostitele jako jediná transkripční jednotka. LTR obsahuje promotor, který transkribuje HIV geny v 5' - 3' směru (gag, pol, env), za vzniku nesestřiženého transkriptu celého genomu. Nesestřižený transkript působí jako mRNA, ze které jsou translatovány gag a pol, zatímco pro translaci env kódovaných genů musí proběhnout omezený sestřih. Pro expresi produktu regulačního genu rev musí proběhnout více než jeden sestřih, protože v genomu se, jak je uvedeno na obr.

1, rev a env překrývají. Pro transkripci env musí být ukončena transkripce rev a naopak. Kromě toho, přítomnost rev je nutná pro export nesestřižené RNA z jádra. Aby rev působil tímto způsobem, musí být na transkriptu přítomen rev reaktivní element (RRE) (Malim et al., Nátuře 338: 254 - 257 (1989)).

V polynukleotidové vakcině podle předkládaného vynálezu je obligatorní sestřih určitých HIV genů eliminován tím, že jsou poskytnuty plně sestřižené geny (t.j. je poskytnut kompletní otevřený čtecí rámec pro požadovaný genový produkt bez potřeby přesmyku v čtecích rámcích nebo eliminace nekódujících regionů; odborníkům v oboru je jasné, že při sestřihu určitého genu existuje určitá nejistota v přesné výsledné sekvencí; nicméně pokud se získá funkční kódující sekvence, je tato nejistota přijatelná). Tak je v jednom provedení celá kódující sekvence pro gag sestřižena tak, že není nutná žádná intermitentní exprese žádného genu.

Duální humorální a buněčná imunitní odpověď vyvolaná způsobem podle předkládaného vynálezu je zejména významná pro inhibici HIV infekce, vzhledem ke schopnosti mutace HIV v populaci, stejně jako u infikovaných jedinců. Pro výrobu účinné ochranné vakciny proti HIV je žádoucí vyvolání jak multivalentní ···· · · · · 9 9 9 9 ··· · · · Φ φ··«

Φ ΦΦΦ · Φ φ φφφ · φφφ φφφ • · · · · · φ

ΦΦΦΦ ·· ΦΦ »φ «φ φφ protilátkové odpovědi například proti gpl60 (env je přibližně z 80% konzervován mezi různými HIV-1, kmenech clade B, které j sou prevalentními kmeny v populaci v USA), základnímu neutralizačnímu cíly na HIV, tak vyvolání tvorby cytotoxických T buněk reaktivních s konzervovativní částí gpl60 a vnitřními virovými proteiny kódovanými gag. Vyrobili jsme HIV vakcinu obsahující gpl60 geny vybrané z běžných laboratorních kmenů; z převládajících, primárních virových izolátů zjištěných v infikované populaci; z mutovaných gpl60 navržených tak, aby demaskovaly zkříženě reaktivní epitopy pro neutralizační protilátku; a z jiných representativních HIV genů jako jsou gag a pol geny (asi 95% konzervace mezi HIV izoláty).

Téměř všichni seropozitivní pacienti, jejichž nemoc nepostupuje směrem k imunodeficitnímu stavu, mají anti-gag CTL a přibližně 60% těchto pacientů má mezikmenové, gpl60 specifické CTL. Množství HIV specifických CTL zjišťovaných u infikovaných jedinců, kteří se dostali do stavu známého jako AIDS, je nicméně mnohem nižší, což ukazuje na význam našich zjištění, že je možno indukovat mezikmenové CTL odpovědi.

Imunitní odpovědi indukované env a gag polynukleotidovými vakcinačními prostředky jsou prokázány na myších a na primátech. Sledování produkce protilátek proti env u myší umožňuje potvrzení toho, že daný konstrukt je vhodným způsobem imunogenní, t.j. že velká část vakcinovaných zvířat vykazuje protilátkovou odpověď. Myši jsou také nejjednodušším zvířecím modelem vhodným pro testování indukce CTL pomocí konstruktů a jsou proto použity pro hodnocení toho, zda je určitý konstrukt schopen vyvolat takovou aktivitu. Opice (kočkodani, makakové rhesus, šimpanzi) jsou dalším druhem náležícím k primátům, který je možno použít pro hodnocení protilátek na větších zvířatech jiných než hlodavcích. Tyto druhy jsou také upřednostňovány před • · · • 44 444 myšmi pro testy neutralizačních schopností antiséra z důvodů vysokých hladin endogenních neutralizačních aktivit proti retrovirům pozorovaným v séru myší. Tato data prokazují, že naše vakciny mají dostatečnou imunogenicitu pro dosažení ochrany v pokusech na modelu infekce šimpanzů virem HIV na základě známých protektivních koncentrací neutralizačních protilátek pro tento systém. Nicméně, nově stanovená a přijímaná definice ochrany se ve vědecké komunitě posouvá od sterilizační imunity, která označuje kompletní ochranu před infekcí HIV, k prevenci onemocnění. Mezi koreláty tohoto cíle patří redukovaný titr viru v krvi, jak je měřen PCR, aktivitou HIV reversní transkriptasy, infektivitou vzorků séra, ELISA test na koncentraci p24 nebo jiných antigenů HIV v krvi, zvýšená koncentrace CD4+ T-buněk a prodloužené přežívání (viz například Cohen, J. Science 262: 1820 - 1821, 1993, pro diskusy o definici účinnosti anti-HIV vakciny). Imunogeny podle předkládaného vynálezu také vyvolávají neutralizační imunitní odpovědi proti infekčním (klinickým, primárním polním) izolátům HIV.

ELISA test se použije k určení toho, zda jsou optimalizované vektory gag vakciny exprivující buď secernovaný tPA-gag nebo nativní gag účinné v indukci gag-specifických protilátek. Počáteční in vitro charakterizace gag exprese vyvolané našimi vakcinačními vektory je provedena imunoblotovou analýzou buněčných lyzátů transfektovaných optimalizovaným gag. Tato data potvrdí a kvantifikují gag expresi za použití anti-HIV antiséra pro vizualizaci gag exprese v transfektovaných buňkách.

Vyvolání CTL odpovědí. Virové proteiny, které jsou syntetizovány v buňkách, vyvolávají MHC-1 restrihované CTL odpovědi. Každý z těchto proteinů vyvolává CTL u seropozitivních pacientů. Naše vakciny jsou také schopné vyvolat CTL u myší a makaků rhesus. Imunogenetické charakteristiky myších kmenů jsou • 4 · *44 444

4

4· 44

444«

• 44 •

4 vhodné pro takový výzkum, jak je prokázáno pro virus chřipky NP (viz Ulmer et al., Science 259: 1745 - 1749, 1993). Několik epitopů bylo definováno pro HIV proteiny env, rev, nef a gag (Frankel, F.R. et al., J. Immunol. 155: 4775 - 4782 (1995)) u Balb/c myší, což usnadňuje kultury CTL in vitro a testy cytotoxicity. Alternativně může být použit celý gen kódující gpl60, gpl20, pol nebo gag. Pro další přehled v této oblasti viz HIV Molecular Immunology Database 1995, Korber et al., vyd., Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM, USA. Efektorová funkce T-buněk, jako je například cytotoxicita, sekrece cytokinů pro aktivaci B-buněk a/nebo mobilizace nebo stimulace makrofágů a neutrofilů, je spojena se zralým fenotypem T-buněk.

Měření T_h aktivity. Kultury buněk sleziny od vakcinovaných zvířat se testují na opakovanou reakci na specifické antigeny za přidání rekombinantních proteinů nebo peptidových epitopů. Aktivace T buněk takovými antigeny, presentovanými antigen-presentujícími buňkami sleziny, APC, je sledována podle proliferace těchto kultur nebo podle produkce cytokinů.

Charakter produkce cytokinů také umožňuje klasifikaci odpovědi T_h buněk jako typ 1 nebo jako typ 2. Protože se zdá, že převládající T_h2 odpověď koreluje s vyloučením buněčné imunity u imunokompromitovaných seropozitivních pacientů, je možné definovat typ odpovědi, který je způsoben určitou PNV u pacienta, což umožňuje manipulování s výslednou imunitní odpovědí.

Podle výše uvedených imunologických studií se předpokládá, že naše vakciny jsou účinné u obratlovců v prevencí infekce virulentním HIV. Tyto studie jsou provedeny na modelu HIV /šimpanz po dostatečné vakcinaci těchto zvířat PNV konstruktem, nebo směsí PNV konstruktů skládající se z gpl60IIIB, gaglIIB, neflIIB a revIIIB. Pro tento účel se použije • 0 • 0 • · ·♦· • 0 * 0 0 • 0 0

000 «

0« • ·

I 0 ··· 0

000 kmen IIIB, protože byl stanoven titr letální dávky viru tohoto kmenu pro šimpanze. Nicméně, některé studie navrhují použití jakéhokoliv kmenu HIV a epitopů specifických nebo heterologních k uvedenému kmenu. Druhým modelem vakcinace/infekce, kromě šimpanzího modelu, je scíd-hu PBL myší model. Tento model umožňuje testování lidského lymfocytárního imunitního systému a naší vakciny s následnou infekcí HIV na myším hostiteli. Tento systém je výhodný, protože je snadno adaptován na použití s jakýmkoliv kmenem HIV a umožňuje získání důkazů pro ochranu proti více kmenům primárních polních izolátů HIV. Třetí model infekce využívá hybridních HIV/SIV virů (SHIV), z nichž některé infikují opice makak rhesus a vedou k imunodeficienci končící smrtí (viz Li, J. et al., J. AIDS 5: 639 - 646, 1992). Vakcinace opic makak rhesus naší polynukleotidovou vakcinou je protektivní proti následné infekcí letální dávkou SHIV.

Existuje mnoho bakteriálních a virových genů, které nevyužívají kodony, které jsou optimalizované pro expresi savčích buňkách. Jedním z důvodů je skutečnost, že tyto mikroorganismy obsahují své vlastní polymerasy nebo obsahují specifické proteiny a nebo faktory pro usnadnění transkripce/translace svých genových produktů. Pro bakterie může existovat různý relativní nadbytek specifických tRNA. Je jasné, že in vivo exprese takových genů v DNA vakcině je významně odlišná.

Representativní složky konstruktu zahrnují (ale nejsou omezeny na): HIV env, HIV gag, HIV pol, HIV rev, HIV vpr a HIV nef; geny kódující antigeny exprivované patogeny jinými než je HIV, jako je například, ale bez omezení, nukleoprotein, hemaglutinin, matrix, neuraminidasa a jiné antigenní proteiny chřipkového viru; geny lidského herpes simplex viru; geny lidských papilomavirů; antigeny mykobakterium tuberculosis;

φφ φφ « * φ φ • · t φ φφφ φ φ •φφφ φ· φ φ φ • φ φ * φφφ φ φ >

φφ φ φ > · • φ φ φ φφφ φφφ φ · φφ φφ antigeny viru hepatitidy A, B a C.

Protektivní účinnost polynukleotidových HIV imunogenů proti následné infekci virem je prokázána imunizací za použití nereplíkovatelné plasmidové DNA podle předkládaného vynálezu. Tento postup je výhodný, protože není obsaženo infekční agens, není vyžadováno složení viru a je umožněna selekce determinanty. Dále, protože je sekvence gag a proteasy a několika dalších produktů virových genů konzervována mezi různými kmeny HIV, je možná ochrana před následnou infekcí viruentním kmenem HIV, který je homologní ke kmenu, ze které byl získán klonovaný gen, stejně jako před infekcí heterologním kmenem.

Vynález nabízí prostředek pro indukci mezikmenové protektivní imunity bez potřeby samoreplikujících se agens nebo pomocných činidel. Kromě toho, imunizace polynukleotidy podle předkládaného vynálezu má mnoho výhod. Tento postup pro vakcinaci lze použít pro nádory, stejně jako pro infekční agens, protože CD8+ CTL odpověď je významná pro oba patofyziologické procesy (K. Tanaka et al., Annu. Rev. Immunol. 6: 359 (1988)). Tak může být vyvolání imunitní odpovědi proti proteinu, který je zásadní pro transformační proces, účinným prostředkem pro ochranu před nádory nebo pro imunoterapii. Vyvolání vysokého titru protilátek proti exprivovaným proteinů po injekci virového proteinu a DNA pro lidský růstový hormon naznačuje, že to je snadný a vysoce účinný prostředek pro vyrobení vakcin založených na protilátkách, buď samostatně nebo v kombinaci s vakcinami založenými na indukci cytotoxických T-lymfocytů namířených proti konzervativním antigenům.

Produkce a přečištění DNA konstruktů je snadnější než tradiční způsoby přečištění proteinů, což usnadňuje výrobu kombinovaných vakcin. Tak mohou být připraveny konstrukty ·· *· • · · · • · · • ··· · • · ···· ·· ·· ·· * · · • · · • ··· · • · ·· ·· ·· • · · · • · · · ··· ··· • · ·· ·· rev/gpl60 DNA. Tato skutečnost může být důsledkem známých cytotoxických účinků rev, stejně jako vyšší obtížnosti dosažení rev funkce v myotubulech obsahujících stovky jader (pro expresi gag nebo env proteinu potřebuje být rev protein ve stejném jádru jako rev-dependentní transkript). Nicméně, je možné získat rev-independentní expresi za použití vybraných modifikací env genu.

Obecně naše vakciny využívají primární HIV (IIIB, MN nebo CAM-1) env a gag geny pro optimalizaci exprese v našem generalizovaném vakcinačním vektoru, VIJns, který obsahuje CMV bezprostřední-časný promotor (ΙΕ), BGH polyadenylační místo a pUK skelet. Pro env může být dosaženo různé účinnosti rev-independentní exprese, podle velikosti použitého genového segmentu (například gpl20 vs. gpl60), náhradou přirozeného sekrečního vedoucího peptidu za sekreční vedoucí peptid z genu pro tkáňově specifický plasminogenový aktivátor (tPA) a expresí vzniklého chimérického genu pod kontrolou CMVIE promotoru s introněm A CMV.

Jak bylo uvedeno výše, považujeme realizaci následujících prvků za zásadní pro maximalizaci úspěchu tohoto programu: (1) přípravu vektorů založených na env, které jsou schopné vyvolat silnější tvorbu neutralizačních protilátek u primátů; (2) přípravu gag a env vektorů, které vyvolají silné odpovědi T-lymfocytů jak jsou charakerizovány CTL a efektorovými funkcemi helperů u primátů; (3) použití env a gag genů z klinicky relevantních kmenů HIV-1 ve vakcinách podle předkládaného vynálezu a charakterizace imunologických odpovědí, zejména neutralizace primárních izolátů, kterou vyvolají; (4) demonstraci ochrany na zvířecím modelu jako je model šimpanz/HIV (IIIB) nebo makak rhesus/SHIV, za použití vhodných optimalizovaných vakcin; a (5) určení trvání imunitních • 99 • 9 odpovědí, které je vhodné pro klinické použití. Významný pokrok byl učiněn v realizaci první tří bodů a pokračují pokusy, které mají určit, zda současné vakcinační konstrukty pro gpl60 a gag zlepší počáteční výsledky.

Příklad 2: Vektory pro výrobu vakciny

A. Expresní vektor VIJneo

Je nutné dostranit amp^ gen pro antibiotickou selekci bakterií nesoucích VIJ, protože ampicilin nemůže být použit ve fermentačních nádobách pro průmyslovou výrobu. Amp^r gen z pUC skeletu VIJ se odstraní trávením restrikčními enzymy SspI a EamllO5I. Zbytek plasmidu se přečistí elektroforesou na agarosovém gelu, tupě se zakončí T4 DNA polymerasou a potom se zpracuje telecí střevní alkalickou fosfatasou. Komerčně dostupný kan^ gen, odvozený z transposonu 903 a obsažený v plasmidu pUC4K, se exciduje pomocí restrikčního enzymu Pstl, přečistí se elektroforesou na agarosovém gelu, tupě se zakončí T4 DNA polymerasou. Tento fragment se liguje s VIJ skeletem a získají se plasmidy s kan^r genem v jakékoliv orientaci, které se označí VIJneo č. 1 až 3. Každý z těchto plasmidů se ověří restrikční analýzou a DNA sekvencováním spojovacích regionů. Zjistilo se, že · f každý z těchto plasmidů produkuje stejné-množství.plasmidu jako VIJ. Exprese heterologních genových produktů je pro tyto VIJne vektory také srovnatelná s VIJ. Jako expresní konstrukt jsme vybrali VIJneo#3, který je zde dále označen jako VIJneo, který obsahuje kan¹⁷ gen ve stejné orientaci jako amp^r gen ve VIJ.

B. Expresní vektor VIJns

Sfil místo se přidá k VIJneo pro usnadnění integračních studií. Komerčně dostupný Sfil linker o délce 13 párů baží (New

England Biolabs) se přidá v KpnI místě uvnitř BGH sekvence vektru. VIJneo se linearizuje KpnI, přečistí se na gelu, tupě se zakončí pomocí T4 DNA polymerasy a liguje se na tupě zakončený Sfil linker. Klonální izoláty se vyberou podle restrikčního mapování a ověří se sekvencováním za použití linkeru. Nový vektor se označí VlJns. Exprese heterologních genů ve VIJns (s Sfil) je srovnatelná s expresí stejných genů ve VIJne (s KpnI).

C. VIJns-tPA

Pro získání heterologní vedoucí peptidové sekvence pro secernované a/nebo membránové proteiny je VIJn modifikován tak, aby obsahoval vedoucí sekvenci lidského tkáňově specifického plasminogenového aktivátoru (tPA). Dva syntetické komplementární oligomery jsou tepelně zpracovány a jsou ligovány do VIJn, který se tráví BglII. Tyto oligomery mají přesahující baze, které jsou vhodné pro ligaci do sekvencí štěpených BglII. Po ligaci je upstream BglII místo zrušeno, zatímco downstream místo pro BglII je zachováno pro následné ligace. Oba spoje, stejně jako celá tPA vedoucí sekvence, jsou ověřeny DNA sekvencováním. Dále, pro přizpůsobení našemu konvenčnímu optimalizovanému vektoru VIJns (= VIJneo s Sfil místem) se Sfil restrikční místo umístí v KpnI místě uvnitř BGH terminačního regionu VIJn-tPA poomocí tupého zakončení KpnI místa T4 DNA polymerasou a potom ligací Sfil linkeru (katalogové č. 1138, New England Biolabs). Tato modifikace se ověří restrikčním trávením a elektroforesou na agarosovém gelu.

D. Příprava vektoru VIR

V další snaze o optimalizaci našeho základního vektoru pro vakcinaci se připraví derivát VIJns, který se označí jako VIR.

Cílem konstrukce tohoto vektoru je získání vakcinačního vektoru minimální velikosti, t.j. bez zbytečných DNA sekvencí, který si zachová celkové optimalizované expresní charakteristiky heterologního genu a vysoký plasmidový výtěžek, který je dosažen při použití VIJ a VIJns. Z literatury, stejně jako z pokusů, jsme určili, že (1) regiony v pUC skeletu obsahující element rozpoznávající počátek replikace E. coli, mohou být odstraněny bez ovlivnění plasmidového výtěžku z bakterie; (2) 3'-region kan^r genu po kanamycinovém otevřeném čtecím rámci může být odstraněn, pokud je místo něj insertován bakteriální terminátor; a (3) -300 bp z 3’-poloviny BGL terminátoru může být odstraněno bez ovlivnění jeho regulační funkce (po původním KpnI restrikčním místě uvnitř BGH elementu).

VIR se připraví za použití PCR pro syntézu tří segmentů DNA z VlNns, které představují CMVintA promotor/BGH terminátor, element rozpoznávající počátek replikace a elementy resistence na kanamycin, v příslušném pořadí. Restrikční místa jedinečná pro každý segment se přidají ke každému segmentu za použití PCR oligomerů: SspI a Xhol pro CMVintA/BGH; EcoRV a BamHI pro kan^r gen; a Bell a Sáli pro oři¹²'. Tato restrikční místa byla vybrána proto, že umožňují přímou ligaci každého segmentu získaného PCR bez následné ztráty každého místa: EcoRV a SspI ponechávají tupě zakončené DNA, které jsou kompatibilní pro ligaci, zatímco BamHI a Bell ponechávají komplementární přesahující konce, stejně jako Sáli a Xhol. Po získání těchto segmentů PCR se každý segment tráví vhodnými restrikčními enzymy uvedenými výše a potom se segmenty ligují v jedné reakční směsi obsahující všechny tři segmenty DNA. 5'-konec ori¹⁷ je navržen tak, že obsahuje T2 rho-independentní terminační sekvenci, která je normálně přítomná v tomto regionu, takže poskytuje ukončovací informaci pro gen resistence na kanamycin. Ligovaný produkt se ověří restrikčním trávením (> 8 enzymů) a DNA sekvencováním spojů. DNA plasmidový výtěžek a heterologní exprese při použití virových genů ve VIR je stejná jako při použití VIJns. Čistá redukce velikosti vektoru je 1346 bp (VIJns =4,86 kb; VIR = 3,52 kb).

Příklad 3: Návrh syntetických genových segmentů pro zvýšení exprese gag genu

Genové segmenty se přemění na sekvence mající identické translatované sekvence, ale využívající alternativní kodony, jak je to definováno v R.Lathe, J. Mol. Biol. svazek 183, str. 1 12 (1985), Synthetíc Oligonucleotide Probes Deduced from Amino Acid Sequence Data: Theoretical and Practicai Considerations. Metoda pro zvýšení exprese gag genových segmentů HIV, která je popsána dále, je založena na naší hypotéze, že známá nemožnost účinné exprese tohoto genu v savčích buňkách je důsledkem celkového složení transkriptu. Tak je možno za použití alternativních kodonů kódujících stejnou proteinovou sekvenci odstranit překážky exprese gag. Nahrazení specifických kodonů může být provedeno následujícíh způsobem:

1. Identifikuje se umístění kodonů pro správný čtecí rámec.

2. Srovnají se přirozené kodony s pozorovanou frekvencí v lidských genech.

3. Pokud kodony neodpovídají nej častějším používaným kodonům, provede se náhrada za optimální kodon pro vysoce účinnou expresi v lidských buňkách.

4. Tento postup se opakuje, dokud není nahrazen celý genový segment.

5. Nová genová sekvence se prověří na přítomnost nežádoucích • tt sekvencí vytvořených touto náhradou kodonů (jako je například sekvence ATTTA, neúmyslně vytvořených rozpoznávacích míst pro sestřih intronů, nežádoucích sekvencí pro restrikční enzymy, atd.) a provede se záměna takovými kodony, které eliminují tyto sekvence.

6. Sestaví se segmenty syntetického genu a testuje se zlepšená exprese.

Tato metoda se použije pro výrobu nových syntetických genových segmentů pro HIV gag, za vzniku genu, který obsahuje pouze optimální kodony pro expresi. Ačkoliv výše uvedený postup je souhrnem naší techniky pro návrh genů obsahujících optimalizované kodony pro DNA vakciny, je zřejmé, že podobně účinné vakciny nebo geny se zvýšenou expresí mohou být získány při použití drobných změn postupu nebo drobných změn sekvence.

Příklad 4

I. Konstrukt pro HIV gag vakcinu

Následuje úplný otevřený čtecí rámec pro HIV-1 (CAM-1) gag obsahující optimální kodony:

1	AGATCTACCA	TGGGTGCTAG	GGCTTCTGTG	CTGTCTGGTG	GTGAGCTGGA
51	CAAGTGGGAG	AAGATCAGGC	TGAGGCCTGG	TGGCAAGAAG	AAGTACAAGC
1.01	TAAAGCACAT	TGTGTGGGCC	TCCAGGGAGC	TGGAGAGGTT	TGCTGTGAAC
151	CCTGGCCTGC	TGGAGACCTC	TGAGGGGTGC	AGGCAGATCC	TGGGCCAGCT
201	CCAGCCCTCC	CTGCAAACAG	GCTCTGAGGA	GCTGAGGTCC	CTGTACAACA
251	CAGTGGCTAC	CCTGTACTGT	GTGCACCAGA	AGATTGATGT	GAAGGACACC
301	AAGGAGGCCC	TGGAGAAGAT	TGAGGAGGAG	CAGAACAAGT	CCAAGAAGAA

• ·

		36	• · · • · · · • · • · · · · ·	• · · · • · ta ta ta · · • ta « *« · ·
GGCCCAGCAG	GCTGCTGCTG	GCACAGGCAA	CTCCAGCCAG	GTGTCCCAGA
ACTACCCCAT	TGTGCAGAAC	CTCCAGGGCC	AGATGGTGCA	CCAGGCCATC
TCCCCCCGGA	CCCTGAATGC	CTGGGTGAAG	GTGGTGGAGG	AGAAGGCCTT
CTCCCCTGAG	GTGATCCCCA	TGTTCTCTGC	CCTGTCTGAG	GGTGCCACCC
CCCAGGACCT	GAACACCATG	CTGAACACAG	TGGGGGGCCA	TCAGGCTGCC
ATGCAGATGC	TGAAGGAGAC	CATCAATGAG	GAGGCTGCTG	AGTGGGACAG
GCTGCATCCT	GTGCACGCTG	GCCCCATTGC	CCCCGGCCAG	ATGAGGGAGC
CCAGGGGCTC	TGACATTGCT	GGCACCACČT	CCACCCTCCA	GGAGCAGATT
GGCTGGATGA	CCAACAACCC	CCCCATCCCT	GTGGGGGAAA	TCTACAAGAG
GTGGATCATC	CTGGGCCTGA	ACAAGATTGT	GAGGATGTAC	TCCCCCACCT
CCATCCTGGA	CATCAGGCAG	GGCCCCAAGG	AGCCCTTCAG	GGACTATGTG
GACAGGTTCT	ACAAGACCCT	GAGGGCTGAG	CAGGCCTCCC	AGGAGGTGAA
GAACTGGATG	ACAGAGACCC	TGCTGGTGCA	GAATGCCAAC	CCTGACTGCA
AGACCATCCT	GAAGGCCCTG	GGCCCTGCTG	CCACCCTGGA	GGAGATGATG
ACAGCCTGCC	AGGGGGTGGG	GGGCCCTGGT	CACAAGGCCA	GGGTGCTGGC
TGAGGCCATG	TCCCAGGTGA	CCAACTCCGC	CACCATCATG	ATGCAGAGGG
GCAACTTCAG	GAACCAGAGG	AAGACAGTGA	AGTGCTTCAA	CTGTGGCAAG
GTGGGCCACA	TTGCCAAGAA	CTGTAGGGCC	CCCAGGAAGA	AGGGCTGCTG
GAAGTGTGGC	AAGGAGGGCC	ACCAGATGAA	GGACTGCAAT	GAGAGGCAGG
CCAACTTCCT	GGGCAAAATC	TGGCCCTCCC	ACAAGGGCAG	GCCTGGCAAC
TTCCTCCAGT	CCAGGCCTGA	GCCCACAGCC	CCTCCCGAGG	AGTCCTTCAG
GTTTGGGGAG	GAGAAGACCA	CCCCCAGCCA	GAAGCAGGAG	CCCATTGACA
AGGAGCTGTA	CCCCCTGGCC	TCCCTGAGGT	CCCTGTTTGG	CAACGACCCC

TCCTCCCAGT AAAATAAAGC CCGGGCAGAT CT ID NO:1) • •f • · · • · · • « · · • 9

Příklad 5: In vitro exprese gag vakciny

In vitro exprese těchto konstruktů se testuje na transfektovaných buňkách lidského rhabdomyosarkomu (RD) nebo na 293 buňkách. Kvantitativní hodnocení gag z transfektovaných 293 buněk ukazuje, že vektory VIJns-opt-gag a ViJns-tPA-opt-gag produkují secernovaný gag.

Příklad 6: Test na HlV-gag cytotoxické T-lymfocyty

Zde uvedený způsob ilustuje test, který se použije pr vakcinované myši. V podstatě stejný test může být použit pro primáty s tou výjimkou, že musí být vytvořena linie autologních B buněk, které se použijí jako cílové buňky pro každé zvíře.

To se provede pro lidi za použití viru Epstein-Barrové a pro opice makak rhesus za použití herpes B viru.

Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) se získají buď z čerstvé odebrané krve, nebo ze sleziny, pomocí Ficoll-Hypaque centrifugace pro separaci erytrocytů od bílých krvinek. U myší mohou být použity také lymfatické uzliny. Efektorové CTL mohou být připraveny z PBMC buď in vitro kultivací s IL-2 (20 U/ml) a konkavalinem A (2 ^g/ml) po dobu 6-12 dnů, nebo za použití specifického antigenu a stejného počtu ozářených antigen-presentujících buněk. Specifickým antigenem mohou být buď syntetické peptidy (obvykle velikosti 9-15 aminokyselin), které jsou známé epitopy pro CTL rozpoznávání MHC haplotypu použitých zvířat, nebo konstrukty viru vakcinie zpracované tak, aby exprivovaly vhodný antigen. Cílovými buňkami mohou být buď syngenní buněčné linie, nebo buněčné linie s upraveným MHC haplotypem, které se zpracují tak, aby presentovaly vhodný antigen, jak je popsáno pro in vitro stimulaci CTL. Pro Balb/c myši se pro restimulaci CTL in vitro použije gag peptid, jak jej ·· ·* ·» ·« • · · · 9 0 9 0 ⁹ 990 9 9 9 9900 • 9 9 0 0 popisuje Paterson (J. Immunol., 1995), v koncentraci 10 μΜ, za použití ozářených syngenních splenocytů a tento peptid může být použit pro senzibilizaci cílových buněk během testu cytotoxicity v koncentraci 1 - 10 μΜ při inkubaci při 37 °C po dobu 2 hodin před testem. Pro tyto myši s MHC haplotypem Η-2^ύ jsou vhodnými cílovými buňkami buňky myší mastocytární buněčné linie P815. Antigenem senzibilizované cílové buňky se naplní Na^sxCrO₄, který se uvolňuje z vnitřku cílových buněk po usmrcení CTL, inkubací cílových buněk po dobu 1-2 hodin při 37 °C (0,2 mCi na 5 x 10^s buněk), po které následuje několik promytí cílových buněk. CTL populace se smísí s cílovými buňkami v různých poměrech cílových buněk k efektorovým buňkám,, například v poměru 100:1, 50:1,

25:1, atd., vytvoří se společné pelety a provede se inkubace při 37 °C po dobu 4-6 hodin před odběrem supernatantů, ve kterých se potom stanoví radioaktivita gamma kamerou. Cytotoxicita se potom určí jako procento z celkového množství radioaktivity, která se může uvolnit z cílových buněk (které se určí reakcí s 0,2% Triton X-100), od kterého se odečte radioaktivita, která se samovolně uvolní z cílových buněk.

Příklad 7: Test na protilátky specifické pro HIV gag

ELISA test se použije pro detekci protilátek vytvořených proti HIV, za použití specifického rekombinantního p24 proteinu jako antigenního substrátu. 96-jamková mikrotitrační plotna se potáhne při 4 °C přes noc rekombinantním antigenem v koncentraci 2 gg/ml v roztoku PBS (fosfátem pufrovaného salinického roztoku) za použití 50 ^g/jamku na plotnách za mírného třepání. Antigenem jsou rekombinantní p24 gag (Intracell). Plotny se čtyřikrát propláchnou promývacím pufrem (PBS/0,05% Tween 20) a potom se přidá blokovací pufr v množství 200 ^g/jamku (1% Carnation mléčný roztok v PBS/0,05% Tween 20) na dobu 1 hodiny při teplotě okolí za mírného třepání. Pre-sérum a imunitní sérum se ředí v blokovacím pufru v požadovaných ředěních a do každé jamky se přidá 100 μΐ. Plotny se inkubují po dobu 1 hodiny při teplotě okolí s mírným třepáním a potom se čtyřikrát promyjí promývacím pufrem. Potom se do každého vzorku přidá sekundární protilátka konjugovaná s křenovou peroxidasou (anti-rhesus Ig, Southern Biotechnology Associates; anti-myší a anti-králičí Ig, Jackson Immuno Research) ředěná 1:2000 v blokovacím pufru v množství 100 μΐ na jamku a provede se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě okolí za mírného třepání. Plotny se čtyřikrát promyjí promývacím pufrem a potom se vyvíjejí za přidání 100 μΐ/jamku roztoku o-fenylendiaminu (o-PD, Calbiochem) v koncentraci 1 mg/ml ve 100 mM citratového pufru při pH 4,5. Absorbance_xse odečítá při 450 nm jak kineticky (prvních deset minut reakce), tak v 10 a ve 30 minutě (Thermo-max čtečka mikroploten,

Molecular Devices).

Příklad 8: Test proliferace T buněk

Získají se PBMC a testují se na obnovené odpovědi na specifický antigen podle proliferace PBMC populace. Proliferace je sledována za použití ³H-thymidinu, který je přidán do buněčných kultur na dobu posledních 18 až 24 hodin před odečítáním buněk. Přístroj pro sklízení buněk zachycuje DNA obsahující izotop na filtrech, pokud proběhla proliferace, zatímco buňky v klidové fázi neinkorporují izotop, který není zachycen na filtrech ve volné formě. Jak pro hlodavce, tak pro primáty je 4 x 10^s buněk umístěno na 96-jamkovou mikrotitrační plotnu v celkem 200 μΐ kompletního media (RPMI/10% fetální telecí sérum). Pozadí proliferační odpovědi se určí za použití PBMC a media samotného a nespecifické odpovědi jsou vyvolány za použití lektinů jako je fytohemaglutinin (PHA) nebo konkavalin A (ConA) v koncentracích 1-5 μg/ml a slouží jako pozitivní kontrola. Specifickými antigeny jsou známé peptidové epitopy, • 9

9 •· *· 99 • 9 9 9 · · *

999 9 9 9 9 9 9 • · · · * ·*·· ·· * · 9 9

9 přečištěný protein nebo inaktivovaný virus. Koncentrace antigenů jsou v rozmezí od 1 do 10 μΜ pro peptidy a od 1 do 10 ^g/ml pro protein. Proliferace indukovaná lektinem vrcholí 3. až 5. den inkubace buněčné kultury, zatímco proliferace indukovaná antigenem vrcholí 5. až 7.den. Specifická proliferace probíhá tehdy, pokud je získaná radioaktivita alespoň trojnásobně vyšší, než je radioaktivita pozadí a je často uváděna jako poměr k pozadí neboli stimulační index (SI).

Příklad 9

Strategie, které jsme použili, jsou navržené pro indukci jak cytotoxických T lymfocytů (CTL), tak pro indukci neutralizačních protilátek k HIV, primárně zaměřených na produkty HIV gag genu (konzervovaný z přibližně 95%) a env genu (gpl60 nebo gpl20; konzervovaný z 70 - 80%). gpl60 obsahuje pouze známé epitopy pro neutralizační protilátky na HIV, zatímco význam anti-env a anti-gag CTL odpovědí je zdůrazněn známou asociací nástupu těchto mechanismů buněčné imunity s odstraněním primární viremie po infekci, ke které dochází před nástupem neutralizačních protilátek (Koup et al., J. Virol. 68: 4650 (1994)), stejně jako známou úlohou CTL v udržování stavu bez projevů onemocnění. Ačkoliv je dobře známa genetická diversita HIV, doufáme, že získáme větší šíři neutralizačních protilátek díky použití několika representativních env genů získaných z klinických izolátů a díky použití gp41 (který je konzervován z přibližně 90% a který obsahuje konzervovanější neutralizační epitop 2F5), a zároveň by měl vysoce konzervovaný gag gen vyvolávat mezikmenovou CTL odpověď. Protože tato vakcinační strategie vyvolává jak silnou protilátkovou, tak buněčnou imunitu proti HIV (u primátů jiných než lidí), má tento postup jedinečné výhody ve srovnání s jinými vakcinačními strategiemi proti HIV.

• · • 9

9 9

9

9 9 ·· ·9 * · 9 9

9 9 • 9·· ♦ 9 • 9 9 9 9 9

•9

A. Vývoj HIV-1 gag polynukleotidové vakciny

Na základě našich pokusů s expresí HIV env genu využívajících geny složené z optimálních kodonů pro expresi u lidí je navržen a syntetizován syntetický p55 gag gen (opt gag), který obsahuje optimální kodony díky přibližně 350 silentním mutacím (celkem 1500 nukleotidů) a který je klonován do VIR. Také je konstruována druhá forma opt gag vektoru, který obsahuje sekvenci kódující tPA signální peptid na NH₂-konci, který je podobný peptidu popsanému výše pro HIV env a který také eliminuje jadernou lokalizaci motivu sekvence umístěného v této pozici v přirozeném genu. Tato modifikace byla navržena pro testování toho, zda alterace normálního intracelulárního přenosu pro gag ER/Golgiho sekreční dráhou mění imunogenicitu gag DNA vakciny. Přidání tPA vedoucího peptidu ke gag vede k mnohem vyšší úrovní sekrece gag a secernovaný protein migruje jako forma s vyšší molekulovou hmotností ve srovnání s přirozeným gag. Tato skutečnost naznačuje, že existuje posttranslační modifikace, pravděpodobně glykosylace, která je důsledkem modifikace tPA vedoucím peptidem.

Myši, které byly imunizovány jedním ze dvou optimalizovaných p55 gag konstruktů (VIR-opt gag ± tPA vedoucí sekvence) nebo VIR-gag (přirozený gen) se testují na CTL odpovědi proti gag po jedné injekci (vakcinační dávky 10, 3,3 nebo 1 ^g/myš). Vysoké hladiny anti-gag CTL byly vyvolány oběma VIR-opt gag DNA při všech dávkách, s nejvyšším specifickým zabíjením pro VIR-tPA-opt gag (přibližně 85% @ E/T = 3 při dávce 1 ptg) . Srovnání křivek cytotoxicity pro všechny dávky DNA prokazuje, že vakcinace VIR-tPA-opt gag vyvolává 100-násobně vyšší CTL odpovědi než vakcinace VIR-gag (přirozeným typem). Celkově vykazovala imunitní odpověď pro tři vakcinační skupiny stejné relativní účinnosti pro CTL, T-helperovou a protilátkou odpověď (od nej silnější k nej slabší odpovědi): VIR-tPA-opt gag > VIR-opt gag > VIR gag (přirozený typ). Celkově jsou CTL odpovědi, protilátkové odpovědi a odpovědi T_h buněk mnohem vyšší pro opt gag konstrukty, zejména pokud jsou opatřeny tPA vedoucí sekvencí.

Příklad 10: Způsob léčby

Jedinci, který potřebuje terapeutickou nebo profylaktickou imunizaci proti infekci virem lidské imunodeficience, je injekčně podána HIV DNA kódující celé nebo části env, gag nebo pol genů nebo jejich kombinaci. Injekční podáni může být subkutání, intramuskulární nebo intradermální. HIV DNA může být použita jako primární činidlo pro imunitní odpověď, nebo může být použita pro dosycení imunitní odpovědi. Injekce DNA může předcházet, doprovázet nebo následovat injekci farmaceutického prostředku obsahujícího inaktivovaný HIV, atenuovaný HIV, obsahujícího proteiny odvozené od HIV nebo jejich kombinace.

Příklad 11: Způsob léčby

Jedinec, který potřebuje terapeutickou nebo profylaktickou imunizaci proti infekci virem lidské imunodeficience, je léčen antivirovým činidlem působícím proti HIV nebo jejich kombinací. Léčenému jedinci je podána injekce farmaceutického prostředku obsahujícího DNA HIV podle předkládaného vynálezu.

Claims (11)

1. Syntetický polynukleotid obsahující DNA sekvenci kódující protein jiného než savčího původu nebo jeho fragment, ve kterém DNA sekvence obsahuje kodony optimalizované pro expresi v savčím hostiteli.

2. Polynukleotid podle nároku 1, kde protein je vybrán ze skupiny skládající se z proteinů HIV, proteinů HSV, proteinů HAV, proteinů HBV, proteinů HCV, proteinů HPV, proteinů HSV, proteinů Plasmodií, proteinů Mykobakterií, proteinů Borrelií proteinů rotavirů.

3. Polynukleotid podle nároku 1, kde proteinem je protein HIV.

4. Polynukleotid podle nároku 3, který ma následující sekvenci DNA:

1 AGATCTACCA TGGGTGCTAG GGCTTCTGTG CTGTCTGGTG GTGAGCTGGA 51 CAAGTGGGAG AAGATCAGGC TGAGGCCTGG TGGCAAGAAG AAGTACAAGC 101 TAAAGCACAT TGTGTGGGCC TCCAGGGAGC TGGAGAGGTT TGCTGTGAAC 151 CCTGGCCTGC TGGAGACCTC TGAGGGGTGC AGGCAGATCC TGGGCCAGCT 201 CCAGCCCTCC CTGCAAACAG GCTCTGAGGA GCTGAGGTCC CTGTACAACA 251 CAGTGGCTAC CCTGTACTGT GTGCACCAGA AGATTGATGT GAAGGACACC 301 AAGGAGGCCC TGGAGAAGAT TGAGGAGGAG CAGAACAAGT CCAAGAAGAA 351 GGCCCAGCAG GCTGCTGCTG GCACAGGCAA CTCCAGCCAG GTGTCCCAGA 401 ACTACCCCAT TGTGCAGAAC CTCCAGGGCC AGATGGTGCA CCAGGCCATC 451 TCCCCCCGGA CCCTGAATGC CTGGGTGAAG GTGGTGGAGG AGAAGGCCTT 501 CTCCCCTGAG GTGATCCCCA TGTTCTCTGC CCTGTCTGAG GGTGCCACCC 551 CCCAGGACCT GAACACCATG CTGAACACAG TGGGGGGCCA TCAGGCTGCC 601 ATGCAGATGC TGAAGGAGAC CATCAATGAG GAGGCTGCTG AGTGGGACAG 651 GCTGCATCCT GTGCACGCTG GCCCCATTGC CCCCGGCCAG ATGAGGGAGC 701 CCAGGGGCTC TGACATTGCT GGCACCACCT CCACCCTCCA GGAGCAGATT

9 9· 9 9· » 999

999

751 GGCTGGATGA CCAACAACCC CCCCATCCCT GTGGGGGAAA TCTACAAGAG 801 GTGGATCATC CTGGGCCTGA ACAAGATTGT GAGGATGTAC TCCCCCACCT 851 CCATCCTGGA CATCAGGCAG GGCCCCAAGG AGCCCTTCAG GGACTATGTG 901 GACAGGTTCT ACAAGACCCT GAGGGCTGAG CAGGCCTCCC AGGAGGTGAA 951 GAACTGGATG ACAGAGACCC TGCTGGTGCA GAATGCCAAC CCTGACTGCA 1001 AGACCATCCT GAAGGCCCTG GGCCCTGCTG CCACCCTGGA GGAGATGATG 1051 ACAGCCTGCC AGGGGGTGGG GGGCCCTGGT CACAAGGCCA GGGTGCTGGC 1101 TGAGGCCATG TCCCAGGTGA CCAACTCCGC CACCATCATG ATGCAGAGGG 1151 GCAACTTCAG GAACCAGAGG AAGACAGTGA AGTGCTTCAA CTGTGGCAAG 1201 GTGGGCCACA TTGCCAAGAA CTGTAGGGCC CCCAGGAAGA AGGGCTGCTG 1251 GAAGTGTGGC AAGGAGGGCC ACCAGATGAA GGACTGCAAT GAGAGGCAGG 1301 CCAACTTCCT GGGCAAAATC TGGCCCTCCC ACAAGGGCAG GCCTGGCAAC 1351 TTCCTCCAGT CCAGGCCTGA GCCCACAGCC CCTCCCGAGG AGTCCTTCAG 1401 GTTTGGGGAG GAGAAGACCA CCCCCAGCCA GAAGCAGGAG CCCATTGACA 1451 AGGAGCTGTA CCCCCTGGCC TCCCTGAGGT CCCTGTTTGG CAACGACCCC 1501 (SEQ TCCTCCCAGT ID NO:1). AAAATAAAGC CCGGGCAGAT CT

5. Polynukleotid podle nároku 3, který indukuje neutralizační protilátky pro HIV, specifickou imunitní odpověď T-buněk proti HIV nebo protektivní imunitní odpovědi po vnesení do tkání obratlovců, včetně lidských tkání, in vivo, kde polynukleotid obsahuje gen kódující produkt HIV genů gag, gag-proteasy nebo env.

6. Způsob pro indukci imunitní odpovědi u obratlovce vyznačující se tím, že obsahuje vnesení 1 ng až 100 mg polynukleotidu podle nároku 1 do tkáně obratlovce.

• 4

4 4 ···· 99

Ί. Způsob podle nároku 6vyzn.ačující se tím, že dále obsahuje podání atenuovaného patogenů, usmrceného patogenů, podjednotkových vakcin, proteinových vakcin a jejich kombinací.

8. Imunogenní prostředek pro indukci imunitní odpovědi proti infekci HIV vyznačující se tím, že obsahuje polynukleotid podle nároku 3 a farmaceuticky přijatelný nosič, a volitelně pomocné činidlo.

9. Způsob pro indukci imunitní odpovědi proti HIV u primáta vyznačující se tím, že obsahuje vnesení polynukleotidu podle nároku 3 do tkáně uvedeného primáta a současné parenterální podání cytokinu.

10. Způsob pro indukci buněk presentujících antigen, které stimulují proliferaci a efektorové funkce, včetně sekrece lymfokinů, cytotoxických a pomocných T-buněk, které jsou specifické pro HIV antigeny vyznačuj ící se tím, že obsahuje vystavení buněk obratlovce in vivo působení polynukleotidu podle nároku 3.

11. Způsob léčby pacienta, který potřebuje takovou léčbu, vyznačující se tím, že pacientovi je podán polynukleotid podle nároku 3 v kombinaci s antivirovým činidlem proti HIV.

12. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje polynukleotid podle nároku 1.