HRP970092A2 - Synthetic hiv genes - Google Patents

Description

Područje izuma

HIV vakcine.

Stanje tehnike

1. HIV Infekcija:

Virus-1 ljudske imunodificijencije (HIV-1) je etiološki agens sindroma stečene imunodificijencije i srodnih bolesti. HIV-1 je RNK virus iz obitelji retrovirusa koji je izlaže 5'LTR-geg-pol-env-LTR 31 organizaciju svih retrovirusa. Osim toga, HIV-1 sadrži veliku količinu gena koji imaju regulacijske ili nepoznate funkcije, uključujući i rev gene. Env gen prepisuje šifru viralnog glikoproteinskog omotača koji se prevodi (proces prevođenja-translacija) u 160-kilodaltona (kDa) perkusora (gp 160) koji se tada razdvaja proteazom stanice kako bi se dobilo 120 kDa vanjskog glikoproteinskog omotača (120 g) i 41-kDa transmembranskeg glikoproteinskog omotača (g 41). Gp 120 i gp41 ostaju povezani i dijele se na viralne djeliće na površini HlV-om inficiranih stanica. Gp120 se veže za CD4 receptor koji je prisutan na podlozi pomoćnog T-limfocita, makrofaga ili drugih ugroženih stanica. Nakon spajanja gp120 s CD4, gp41 izaziva stapanje ili fuziju koja omogućava prodiranje virusa.

Infekcija započinje kada se gp120 na čestici virusa spaja sa CD4 receptorom koji se nalazi na površini T4 limfocita ili drugih ugroženih stanica. Virus se na odabranom mjestu spaja sa ciljanom stanicom i reverznom transkripcijom (prepisivanjem šifre) ubacuje svoj RNK genom u dvostruki lanac stanične DNK. Viralna DNK se inkorporira u genetski materijal staničnog jezgra u kojem virusna DNK tada proizvodi novu virusnu RNK, virusne proteine, i nove virusne čestice. Nove čestice koje su nalaze na opni napadnute stanice, dalje se umnožavaju te inficiraju druge stanice.

Uništavanje T4 limfocita, nositelja imuno obrambenog sustava, može prouzročiti progresivno opadanje sposobnosti obrambenog sustava što je i obilježje HIV infekcije. Slabljenje napadnute stanice ozbiljno utječe na sposobnost tijela da se obrani, ali utječe i na smanjenu sposobnost obrane i od drugih virusnih, gljivičnih, parazitskih i sličnih bakterija, uključujući mikrobakterije.

HIV-1 uništava stanice tako što ih inficira putem replikacije, razvija se u njima uništavajući staničnu opnu. HIV-1 može uništiti ciljanu stanicu i ne izravnim putem, širenjem virusnog gp120 na površini zaražene stanice. Od kada CD4 receptor na T stanicama ima jaku sklonost ka spajanju sa gp120, zdrave stanice se izlažu vezi CD4 receptora za gp120 i stapaju s zaraženim stanicama te tvore sincitij. Sincitij ne može opstati.

HIV-1 također može izazvati normalne stanice obrambenog sustava da se suprotstave zaraženim stanicama. Sa ili bez pomoći anti tijela, citotoksične obrambene stanice mogu uništiti zaražene čija površina je obložena virusnim proteinima. Konačno, slobodna gp120 može cirkulirati u krvi osobe koja je zaražena sa HIV-1. Slobodni protein se može vezati za CD4 receptor zaražene stanice, davajući im sposobnost inficiranja i izazivanja reakcije obrambenog sustva.

Infekcija HIV-1 virusom je gotovo uvijek fatalna, a do sada još nije pronađen lijek protiv HIV-1 infekcije. Učinkovite vakcine u sprječavanju širenja HIV-1 infekcije još nisu dostupne. Radi opasnosti od suprotnog učinka ili infekcije, živi oslabljeni virus vjerojatno ne može biti korišten kao vakcina. Većina do sada ispitanih vakcina nije bila učinkovita u sprječavanju infekcije HIV-1. Liječenje HIV-1 Infekcije, sve dok se produžava život oboljelog, ima ozbiljne nus pojave (vanjske utjecaje). Zbog toga je velika potreba za učinkovitim liječenjem i vakcinama u borbi protiv ove smrtonosne infekcije.

Vakcine

Vakcinacija ili cijepljenje je učinkoviti oblik sprječavanja bolesti čija je uspješnost dokazana u nekoliko primjera virusnih infekcija. Odrediti način da se postojeći HIV-1 antigeni ljudskog imuno sustava preusmjere na humoralni i celularni imuno sustav, teška je zadaća. Do danas, svi pokušaji u dobivanju jedinstvene učinkovite vakcine protiv HlV-a bili su bezuspješni. Kod bolesnika oboljelih od AIDS-a, slobodni virus prisutan je samo u manjim nivoima. Prenošenje HIV-1 povećava se interakcijom ili međudjelovanjem na način stanica-stanica putem stapanja i sincitij formacijom. Zbog toga, antitijela koja se proizvode radi suprotstavljanja slobodnim virusima ili virusnim podjedinicama, općenito su učinkovita u uklanjanju virusom zaraženih stanica. Vakcina onesposobljava sposobnost tijela da se "sjeti" antigena. Nakon prvog susreta sa datim antigenom, imuno sustav proizvodi stanice koje će zadržati imunološku memoriju antigena za čitav život pojedinca. Naredno izlaganje antigena potječe na imuno reakciju koja uklanja ili inaktivira organizam sposobnog da izazove bolest (patogen).

Imuno sustav se suočava s patogenima na dva načina: humoralnim ili celularnim posredovanjem. Kod humoralnim odgovora, limfociti proizvode posebna antitijela koja se vežu za antigen tako da spriječe pokretanje patogena-. Celularno posredovanje uključuje citotoksične i pomoćne T limfocite koji na poseban način napadaju i uništavaju zaražene stanice.

Usavršavanje vakcine protiv HIV-1 predstavlja problem zbog toga što HIV-1 inficira neke od istih stanica kojima je potrebna vakcina radi aktiviranja imuno sustava (tj. T4 limfocita). Prednost bi imala vakcina koja bi mogla onemogućiti aktiviranje HlV-a prije slabljenja imuno sustava. Posebno pogodan tip HIV vakcine će proizvesti anti-HIV imuno reakciju koja prepoznaje HIV varijantu i koja je nazočna kod HlV-pozitivnih pojedinaca koji su tek zaraženi.

Najveći izazov u razvitku vakcine protiv virusa, posebno onih s visokim stupnjem mutacije kakav je virus stečene imunodificijencije, protiv kojeg je stvaranje neutralizirajućeg i zaštitnog imuniteta poželjno, odvajanje virusnog proteinskog omotača u odnosu na različite virusne izolatore i lanci. Radi citotoksičnih T-limfocita (CTLs) i u miševa i u ljudi je moguće prepoznavanje epitopa dobivenog iz konzerviranog unutrašnjeg virusnog proteina, koji može biti važan za imuno reakciju protiv virusa, svi napori odnose se na razvitak CTL vakcina koja će omogućiti višestruku zaštitu protiv različitih virusnih lanaca.

Poznato je da CD8+ CTLs uništava virusom zaražene stanice kada njihov T stanični receptor prepoznaje virusne peptide povezane s MHC razredom l molekule. Virusni peptidi dobiveni su iz endogeno sintetiziranog virusnog proteina, bez obzira na proteinsku lokaciju ili funkciju virusa. Zbog toga, prepoznavanjem ili dešifriranjem epitopa iz pohranjenog virusnog proteina, CTLs može priskrbiti zaštitu poprečnih lanaca. Peptidi koji su sposobni da u suradnji s MHC razredom 1 za CTL prepoznavanje pokretača iz proteina koji su prisutni u ili prolaze kroz citoplazmički ili endoplazmički retikulum. Općenito, egzogeni proteini, koji su ulazna šifra endozomalnog procesa (kao u slučaju kada su antigeni predstavljeni MHC razredom II molekula), nisu učinkoviti u odnosu na produkciju CD8+CTL-a.

Mnogo napora potrebno je uložiti kako bi se proizvela reakcija CTL-a koji su korišteni kao vektori repliciranja pri proizvodnji proteinskog antigena unutar stanice ili su usredotočeni na propuštanje peptida u citosol. Ovi pristupi imaju ograničenja koja mogu reducirati svoju primjenu u obliku vakcine. Retrovirusni vektori imaju smanjenu veličinu i građu polipeptida koji se mogu predstaviti stapanjem proteina , dok se održava mogućnost repliciranja rekombinantnog virusa, a učinkovitost vektora kao cjepiva za slijedeću imunizaciju može se odraziti na imunitet samih vektora. Isto tako, virusni vektori i modificirani patogeni sadrže prirođenu opasnost koja može spriječiti njihovu uporabu u ljudi. Nadalje, izbor peptidnih epitopa koji se pojavljuju ovisi o građi MHC gena svakog pojedinca, radi toga, peptidne vakcine mogu ograničiti svoju učinkovitost u odnosu na različitosti MHC haplotipova nižih populacijskih vrsta.

3. DNK vakcine

Benvensity, N., and Reshef, L [PNAS83, 9551-9555, (1986)] su pokazali da se DNK pospješena sa CaCl2 u miševa može biti ubačena intraperitonalno (i.p.), intravenski (i.v.) ili intramuskularno (i.m.). Intramuskularno ubacivanje DNK vektora bez tretiranja sa CaCl2 uzrokuje neprihvaćanje DNK unutar mišićnih stanica i izlaže se DNK prešifriranom proteinu. Plazmidi su se održavali epizomalno i nisu se replicirali. Slijedeće, postojano izlaganje promatrano je nakon i. m. injektiranja u skeletni mišić štakora, riba i primata, i srčani mišić štakora. Tehnika korištenja nukleinskih kiselina kao terapijskih agensa bila je objavljena u WO90/11092 (4. listopada 1990), u kojoj su korišteni ogoljeni polinukleotidi za cijepljenje .kralježnjaka.

Za uspješnost postupka nije neophodno da imunizacija bude intramuskularna. Uvođenje zlatnog mikroprojektila obavljenog s DNK koji inkodira goveđi hormon rasta (BGH) u kožu miša proizvodeći anti-BGH antitijela u miša. Uštrčivać je korišten u transfekciji kože, mišića, masnoće, i staničja sisavaca živih životinja. Mogu se primjeniti različiti postupci za uvođenje nukleida; Intravensko injektiranje DNK: kationski lipozomski kompleks u miša opisali su Zhu et al., [Science 261:209-211 (9. srpanj 1993) koji je rezultat sistematičnog izlaganja kloniranih transgena. Ulmer et al., [Science 259: 1745-1749, (1993)] prijavio je heterološku zaštitu protiv upale izazvane virusnom infekcijom intramuskularnim injektiranjem DNK koji inkodira upalu virusnog proteina.

Potreba za specifičnim terapeutskim i profilaktičkim agensom koji je sposoban da izazove željenu imuno reakciju protiv patogena i agensa tumora susreće se u ovom izumu. Posebna važnost u ovom terapeutskom pristupu je sposobnost da se izazove T-stanična imuno reakcija koja može spriječiti infekciju ili bolest uzrokovanu čak i virusnim lancima koji su heterologni lancima iz kojih se dobiva antigenski gen. To se posebno odnosi na djelovanja HIV-a kao virusa koji se drastično reorganizira mutiranjem te se identificira mnogo virusnih izolatora [vidi, na primjer, LaRosa et al., Science 249:932-935 (1990), prepoznavanje 245 razdvojenih i osamljenih virusa HIV-a]. U odnosu na tu raznolikost preopznavanja, ispitivanjem se pokušavao proizvesti CTLs bazirajući se na imunizaciji peptida.

Tako su, Takahashi et al., [Science 255:333-336 (1992)] podnijeli izvješće o indukciji izvedenoj putem prijelazne-reakcije citotoksičnih T stanica koje prepisuje šifru determinantu HIV omotača (gp160). Kako bilo, ovi naučnici uvidjeli su da postoje teškoće u ostvarivanje prave prijelazne reakcije CTL-a i ukazuju da postoji dihotomija između davanja podataka i restimulacije T stanica, koja je dosta uvjerljiva, a omogućava funkciju čimbenika, uključujući citotoksičnost, iz već pokrenute CTLs.

Wang et al., podnijeli su izvješće o poticanju imuno reakcije u miša protiv HIV-a intramuskularnim cijepljenjem s kloniranim, genomskim (nespletenim) HIV genom. Kako god, nivo imuno reakcije koji je postignut ovom studijom je veoma nizak. U dodatku, Wang et al., građa DNK upotrebljava se kao bitan sastavni dio HlV-a koji inkkodira susjedni Tat/REV-gp160-Tat/REV šifriranu sekvencu. Kao što je detaljno opisano, ovo je pod optimalan sustav za dobivanje visokog stupnja izložene gp160. Isto tako je i potencijalno opasan zbog toga što se stvaranje Tat-a pridonosi širenju Kaposijevog sindroma.

WO 93/17706 opisuje postupak vakcinacije životinja protiv virusa, u kojem se čestice nosači oblažu s genskim sadržajem te se iste obložene čestice ubacuju u životinjske stanice. U odnosu na HIV, bitni cjelokupni genom, manje dugi terminal ponavlja se, i trebao bi se koristiti. Postupak predstavlja ozbiljnu opasnost po primatelja. Općenito se vjeruje da sastav, tj. konstrukcija HIV-a treba sadržavati najmanje 50% HIV genoma kako bi se omogućila djelotvornost vakcine; to omogućavanje predstavlja enzimski dio i virusni regulatorni proteini.od kojih mnogi od njih imaju nepoznate ili nebitne funkcije koje su uklonjene. Zbog toga,ostaje niz nerješivih problema ukoliko se tehnologijom dobivanja gena ne pojavi učinkovita vakcina protiv HIV-a.

Ovaj izum sadrži bilo koji od postojećih od postojećih postupaka za ubacivanje polinukletida u živo staničje koje uzrokuje stavranje proteina. Kako god, ovaj izum omogućava nove imunogene za ubacivanje HIV-a i drugih proteina u antigenski procesiran prolaz kako bi se proizveo HIV-specifičan CTLs i antitijela. Farmaceutski učinkovita je vakcina koja će proizvesti oba i celularna i humoralna anti-HIV tijela i HIV neutraliziranu imuno reakciju. U ovom izumu, spomenuti problemi upućeni su i riješeni privremenim imunogenim polinukleotidima koji, kada se unose u životinjski organizam, su izravno izloženi HIV proteinima i epitopima bez opasnosti vezane uz korištenje ovih postupaka. Tako dobivena imuno reakcija učinkovita je pri prepoznavanju tj. dešifriranju HIV-a, inhibirajući replikaciju HIV-a, identificiranju i uništavanju stanica zaraženih HIV-om, i prijelazno-reakcijom protiv mnogih HIV lanaca.

Uporaba kodona i njegovo značenje

Kodon u doba parenja organizama nije prepušten slučaju, i razlikuje se od organizma do organizma. Ovaj podatak korišten je pri stvaranju i izlaganju sintetskih gena koji imaju zavidan nivo sposobnosti translacije, kako bi se odredilo koja mjesta u genomu predstavljaju mjesta proteinskog koda, za uvođenje translacijskog mjesta pauze unutar heterolognih gena, i ustanovi veza ili iskonsko porijeklo nukleotidnih sekvenci.

Nastanak stranih heterolognih gena u transformiranim organizmima sada je uobičajeno. Veliki broj gena sisavaca, uključujući, na primjer, murinske i ljudske gene, uspješno se ubacuju u jednostanične organizme. Uobičajenim tehnikama u ovom slučaju uvođenje stranih gena koji se izlažu vektoru kakav je plazmid ili faga a koristeći vektor kako bi se gen ubacio u organizam. Izvorni pokretači takvih gena su slično zamijenjeni s jakim pokretačima kompatibilnim s domaćinom u kojeg se ubacuje gen. Sustav sekvenciranja proteina dopušta razbistravanje amino kiselinskih sekvenci čak neznatne količine izvornog proteina. Iz ovih amino kiselinskih sekvenci, DNK sekvence kodiraju kako bi se dobili ovi proteini. DNK sinteza također se brzo odvija, a sintetski geni reagiraju na dobivene DNK sekvence koje se mogu dešifrirati.

Unatoč uznapredovanom znanju u izlaganju sustava i rekombiniranju DNK, znakovita smetnja još postoji onda kada se pokuša proizvesti strani ili sintetski gen u organizmu. Mnogo izvornih, aktivnih proteina, na primjer, je glikolizirano na više načina iz kojih bi se mogli ubaciti u stranog domaćina. Iz tog razloga, eukariotski domaćin kakav je kvasac (Saccharomices cervisi ) može biti domaćin bakterijama koje proizvode mnogo gena sisavaca. Problem glikozilacije je predmet daljnjeg istraživanja.

Drugi problem je mnogo slabije shvaćen. Često prilikom translacije sintetskih gena, koji se sparuju čak i s jakim pokretačima (promotorima), postupak je mnogo manje učinkovit nego što bi se moglo očekivati. Isto tako nije poznat način nastajanja egzogenih gena u organizmu. Čak i ako se genetska šifra prepisuje na dovoljno učinkovit način obnavlja količinu dobivenih proizvoda putem translacije, protein je često nepokretljiv ili različit u odnosu na izvorni protein.

Prepoznatljivo je da se kasniji problem odnosi na stvaranje proteina u različitim organizmima. Rješenje ovog problema je još neshvatljiv, a o mehanizmima koji kontroliraju nakupljanje proteina još se vrlo malo zna.

Problemi koji se odnose na uspješnost tranlacije, ovise o djelotvornosti kodona. Područja na kojima se događa kodiranje proteina u genu kod svih organizama su predmet različitog funkcionalnog djelovanja, a neki od njih ovise o prikladno izvedenom inkodiranju funkcionalnog proteina, korištenjem prikladnih početnih i završnih signala. Kako god, nekoliko osobnosti mjesta na kojima se odvija kodiranje proteina u ovom kontekstu nije dovoljno shvaćeno. Dvije važne klase tih osobina su one koje uključuju uporabu kodona i njegovog sadržaja.

Poznato je da korištenje kodona ima različite učinke i varira u odnosu na različite organizme. Uporaba kodona prikazana na taj način da se odnosi na srodan broj RNK izoakceptora. Geni inkodiraju proteine u nedozvoljeno niskom broju koji pokazuje razliku djelovanja njihovih kodona. Mogućnost sposobnosti kodona promjeni omjer peptida je razmotreno.

Dok su raznolikosti u uporabi kodona povezane s različitim omjerom translacije, izravni učinci odabir kodona translacijom se teško može prikazati. Drugi pretpostavljeni uvjeti za uporabu kodona uključuju povećanje pouzdanosti translacije i optimalne uvjete za sintezu proteina.

Neprikladnom uporabom kodona, bitne činjenice potrebne za prepoznavanje kodon/antikodona pod utjecajem su vanjskih sekvenci samog kodona, pojam koji označava "konteks kodona". Postoji jak utjecaj susjednih nukelotida na učinkovitost sputavanja besmislenih kodona u nedostatku kodona. Jasnije, opširna aktivnost u prirodnim bakterijskim populacijama, sve dok se koristi "terminacija" kodona koji inkodiraju selenocistein i fofsfoserin, zahtijeva da terminacija bude u kontekstu-ovisna. U sličnim kontekstnim učincima prikazan je utjecaj vjerodostojnosti translacije, kao i važnost njenog potjecanja. Statističke analize mjesta na kojima se odvija kodiranje proteina u E. Golf prikazana je drugim djelovanjem "kodon konteksta". Nazočnost posebnog kodona na mjestu koje je pod jakim utjecajem izvjesnih nukleotida susjednih kodona, odražavaju se tako što su različito označeni za gene dobivene u niskom omjeru. Isto tako navedeni učinci su dešifrirani, a predviđena vrijednost statističkih pravila odnosi se na željene nukleotidne dodatke koji ulaze u sastav kodona u relativno malom broju. Zbog toga je ograničena uporaba takvih nukleotida koji nose podatke za izabiranje kodona koji učestvuju u translaciji.

Nastupom automatskog nukleotidnog sekvenciranja moguće je dobiti veliku količinu sekventnih podataka za različite vrste organizama. Prihvatljivo je da ti podatci stvaraju ozbiljne poteškoće. Na primjer, važno je identificirati područja kodiranja genoma koja će povezati podatke iz genetske sekvence u proteinsku sekvencu. Nadalje, porijeklo genoma izvjesnog organizma je od osobite važnosti. Poznato je da su genomi izvjesnih organizama različitog porijekla. Neke sekvence koje su virusne a u stanici domaćina stabilno utjelovljene u genomu eukariotskih stanica. Same po se bi virusne sekvence mogu se utjeloviti i u nekoj drugoj nesrodnoj vrsti. Poznato je da porijeklo gena može biti od važnosti u ispisivanju pogodnih analoga između srodnih gena i njihovih translacijskih proizvoda u drugim organizmima.

Postoji potreba za boljim razumijevanjem kodonskog konteksta koji utječe na translaciju, i postupkom kojim bi se mogao dešifrirati pogodan kodon za bilo koji željeni translacijski učinak. Također postoji potreba za postupkom identificiranja kodonskog mjesta u genomu iz datoteke ili baze podataka nukleotidne sekvence. Isto tako postoji potreba za postupkom kontroliranja nakupljanja proteina s time da se obezbijedi stranom genu da se ubaci u organizam domaćina. Geni se mijenjaju i stvaraju ovisno o uspješnosti procesa translacije.

Drugi aspekt primjene tehnika rekombinacije DNK za dobivanje proteina u mikroorganizmima u proizvodnom i farmaceutskom interesu javlja se fenomen "prednosti kodona". Prije je uočeno postojanje stroja za dobivanje gena koji se je u genteskom smislu djelovao na stanicu domaćina "radeći" na stvaranju datog željenog proizvoda, stupnjevi proizvodnje povećani su u mikroorganizmima koji mogu biti predmet u različitosti, djelomično ovisnih o posebnim drugojačijim oblicima amino kiselinski-određenih genetskih kodova koji su prisutni u ubačenom egzogenom genu. "Triplet" kodon od četiri moguća nukleotida može postojati u 64 različita oblika. Ti oblici omogućavaju informaciju za samo 20 različitih amino kiselina (dok transkripcija potječe terminiranje) što znači da neke amino kiseline imaju više od šest" prekobrojnih", drugačijih kodona dok neki drugi imaju jedan, željeni kodon. Iz nekog razloga, alternativni kodoni nisu svi istovjetno nazočni u endogenoj DNK različitih tipova stanica u kojima treba postojati određeni prirodni poredak ili "prednost" izvjesnih kodona u izvjesnim tipovima stanica.

Kao jedan od primjera, leucin amino kiselina je sastavljena od bilo koje od DNK kodona uključujući CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, i TTG (koji odgovaraju kodonima mRNK, CUA, CUC, CUG, CUU, UUA i UUG). Već je davno zastarjela analiza frekvencije genomskog koda za mikroorganizme koji otkrivaju endogenu DNK E. coli koja uglavnom sadrži CTG leucin-navedenog kodon, dok DNK u kvasca uključuje TTA leucin-navedenog kodona. U pogledu na ovaj poredak, općenito je prihvaćeno da mogućnost dobivanja visokog stupnja leucinom-bogatog polipepida iz E.coli kao domaćina ovisit će o ponavljanju uporabe kodona.

Na primjer, gen obogaćen TTA kodonima biće kod E. coli prisutan u veoma malim količinama, dok CTG-om obogaćeni gen prisutan je u plipeptidu. Slično, kada su stanice kvasca osnova za transformaciju stanica domaćina čime se dobiva leucin-bogati peptid, željeni kodon na ubačenoj DNK biti će TTA.

Učešće prednosti kodonskog fenomena u odnosu na tehniku rekombinacije DNK, fenomen može objasniti mnoge prijašnje nedostatke koji su utjecali na dobivanje egzogenih gena u uspješno transformiranim organizmima domaćina najmanje "željeni" kodon može biti ponovno nazočan u ubačenom genu a sustav stanice domaćina u čilu izlaganja ne mora biti učinkovit. Ovaj fenomen predlaže da sintetski geni koji su imali zadaću da budu uključeni u produkciju željenog kodona stanice domaćina koji proizvodi željeni oblik stranog genetskog u materijala u primjeni tehnike rekombinacije DNK.

5. Promet proteina

Raznolikost funkcije stanica eukariota ovisi o diferencijalnoj građi njihovih opni. Kako bi se proizvela i održala ta građa, proteini moraju biti transportirani iz mjesta sinteze u endoplazmatskom retikulumu koji preusmjerava svoj put kroz stanicu. Za to je potreban promet proteina koji razvijaju izvjesne signale koje mogu prepoznati ili dešifrirati molekularni strojevi odgovorni izbor puta koji je lociran na posebnim mjestima za odvijanje prometa proteina. Sortiranje proteina je potrebno izvesti samo jednom u tijeku njihovog proputovanja kroz biosintetičke prolaze do konačnog odredišta, mjesto stanice na kojoj se odvija njihova funkcija, postaje mjesto njihovog trajnog nastanjenja.

Održavanje intracelularnog integriteta ovisi djelomično od izbora sortiranja i mogućnosti transporta proteina do njihovog odredišta. Tijekom posljednjih par godina, razudba ili disekcija molekularnog stroja za određivanje i lokaliziranje proteina detaljno je proučeno. Opisani sekventni motiv identificiran je na proteinima koji mogu djelovati kao "naljepnice". Broj sortiranih signala nađen je povezan s citoplazmom membranskih proteina.

Kratak opis izuma

Sintetske DNK molekule inkodiraju HIV env i omogućavaju modifikaciju Hiv env. Kodoni sintetskih molekula uključuju stvaranje željenih kodona u stanici domaćina.

Sintetske molekule skrbe oblike stranog genetskog materijala. Sintetske molekule se mogu koristiti kao polinukletidne vakcine koje omogućavaju učinkovitu imunoprofilaksu protiv HIV infekcije preko neutraliziranje antitijela i stanica nositelja imuniteta. Ovaj izum sadrži polinukleotide koji, kada se izravno ubacuju in vivo u kralježnjake, uključujući i sisavce kao šo su primati i ljudi, uzrokuje proizvodnju inkodiranih proteina u tijelo životinja.

Kratak opis slika

Slika 1 prikazuje HIV env kazete-osnovne izložene strategije.

Slika 2 prikazuje DNK vakcinu koja uzrokuje ani-gp120 reakciju.

Slika 3 prikazuje anti-gp120ELISA seruma vakcine murinske DNK.

Slika 4 prikazuje srodno izlaganje gp120 nakon HIV env PNV transfekcije kulture stanice.

Slika 5 prikazuje značenje anti-gp120ELISA reakcije slijedeći tPA-gp/143/optA vs. optB DNK vakcinaciju.

Slika 6 prikazuje neutraliziranje seruma HIV murinskim DNK serumom vakcine.

Slika 7 prikazuje HIV neutralizaciju murinskim serumom HIV env DNK vakcine.

Slika 8 je imuno analiza optimalnog HIV env DNK konstruktora.

Detaljan opis izuma

Sintetske HIV molekule inkodiraju HIV env a sintetske DNK molekule inkodiraju modificirane oblike traženog HIV env. Kodoni sintetskih molekula imaju ulogu da iskoriste željeni kodon koji je smješten u stanici domaćina. Sintetske molekule se mogu upotrijebiti kao polinukleotidne vakcine koje omogućavaju učinkovitu profilaksu protiv HIV infekcije preko neutraliziranje antitijela i stanica nositelja imuniteta. Sintetske molekule mogu se koristiti i kao imunogene smjese. Ovaj izum uključuje polinukleotide, kada se koristi izravno ubacivanje in vivo u kralježnjake, uključujući sisavce kao što su primati i ljudi, uzrokujući proizvodnju inkodiranih proteina unutar životinja.

Kao što je ovdje korišteno, polinukleotid u kombinaciji s nukleinskim kiselinama koje sadrže regulacijske elemente kao što je ubacivanje u živu, stanicu kralježnjaka, polinukleotid je sposoban da izazove stanični strojni sustav da proizvodi produkte translacije inkodirane nukleinskim kiselinama koje sadrže polinukleotide. Jedno utjelovljenje u ovom izumu je da, polinukleotid jeste polidezoksiribonukleinska kiselina koja sadrži najmanje jedan HIV gen vezan za promotor transkripcije ili prepisivanja šifri.

U drugom aspektu ovog izuma, polinukleotidna vakcina (PNV) sadrži poliribonukleinsku kiselnu koja inkodira najmanje jedan HIV gen koji je podvrgnut translaciji od strane staničnog strojnog sustava eukariota (ribozomi, tRNK, i drugi čimbenici translacije). Gdje protein inkodira polinukleotidom je taj koji nije prihvaćen kod patoloških stanja životinja, (tj. heterologni protein) kao što su proteini vezani za virus ljudske imunodificijencije (HIV), etiološki agens sindroma stečene imunodificijencije (AIDS), životinjski imuno sustav aktivira se kako bi izazvao zaštitnu imuno reakciju. Zbog ovih egzogenih proteina koji su dobiveni iz životinjskog staničja, izloženi proteini proizvedeni su iz vodećeg histološki srodnog sustava, MHC,u obliku analoga u vrijeme inficiranja srodnih organizama (HIV). Rezultat je izazivanje imuno reakcije protiv srodnog patogena.

Polinukleotidi koji su predmet ovog razmatranja, kada se unose u biološke sustave, uzrokuju stvaranje HIV proteina i epitopa i proizvode posebnu imuno reakciju. Izazvana reakcija antitijela specifična je za izloženi HIV protein i njegovo neutraliziranje. Nadalje, citotoksički T-limfociti (CTL) koji na poseban način prepoznaju i uništavaju HlV-om zaražene stanice.

Ovo otkriće omogućava postupak uporabe polinukleotida koji, ubacivanjem u staničje sisavaca, uzrokuje stvaranje pojedinačnih stanica, in vivo, zasebnih genetskih proizvoda. Ovo otkriće daje rješenje koje ne zahtijeva višestruku manipulaciju o REV ovisnim HIV genima kako bi se dobili REV-neovisni geni. Dobivanje REV-neovisnog sustava koji je ovdje opisan kao koristan u svojem punopravnom sustavu koji je izložen u pojedinačnim stanicama in vivo jedino željenog genskog proizvoda.

Zbog niza mogućnosti za dobivanje antivirusnog cjepiva u ovom izumu, polinukleoidi su prisutni kao polinukleotidna cjepiva, ili PNV. S time se ne želi reći da dodatna primjena ovih polinukleotida, kao stimulatora imuniteta i anti tumorskih lijekova, nije predmet ovog izuma.

U jednom aspektu, gen koji inkodira genetski HIV proizvod prisutan je u obliku vektora. Vektor sadrži transkripcijski ili prepisivački promotor dešifriran eukariotskom RNK polimerazom, i tranksripcijski terminator na kraju kodinske sekvence HIV gena. Poželjno je da, promotor bude citomegalovirus koji koristi A sekvencu (CMV-intA), koji je isto tako sposoban da dešifrira ili prepozna bilo koji broj drugih poznatih promotora kao što su jaki imunoglobulin, ili drugi eukariotski genski promotori koji se mogu uporabiti. Poželjni transkripcijki terminator je terminator hormona rasta u goveda. Kombinacija CMVintA-BGH terminatora je osobito poželjna.

U pomaganju priprave polinukleotida u prokariotskim stanicama, uključen je antibiotički otporan marker koji je prisutan kao vektor; marker može biti pod transkripisjkom kontrolom prokariotskih promotora tako da se izlaganje markerera ne mora odvijati u eukaritoskim stanicama. Amipcilin-otporni geni, neomicin-otporni geni i drugi farmaceutski antibiotički otporni markeri također se mogu koristiti. Kao pomoćno sredstvo u dobivanju visokog stupnja polinukleotida fermentiranjem u prokariotskim organizmima, prednost ima vektor koji sadrži prokariotski replicirani izvornik i može proizvesti veliki broj preslika. Broj koji je komercijalno pogodan prokariotskim klonirajućim vektorima omogućava te prednosti. Poželjno je da se ukloni ne-bitna DNK sekvenca da bi se onemogućilo repliciranje vektora u eukariotskim stanicama. Smanjivanje opasnosti od sastavljanja u cjelinu sekvencu polinukletidne vakcine u genom primatelja. Posebni promotori staničja ili uvečivaći mogu se koristiti kada je potrebno da se ograniči proizvodnja tj. stvaranje polinukleotida unutar , posebnoj tip staničja.

U jednom ostvarenju, izlaganje vektora pnRSV korišteno je, kada se Raus sarcoma virus (RSV) na dugom terminalu (LTR) koristi kao promotor. U drugom ostvarenju koristi se, V1, pBR322 vektor mutacije u kojem je CMV promotiran a BGH transkripcijski terminator kloniran. U drugom ostvarenju, elementi V1 i pUC19 kombinirani su kako bi proizveli vektor nazvan V1J. U V1J ili drugi poželjni vektor kloniranog HIV gena, kao što je gp120, gp41, gp160, gag, pol, env, ili bilo koji drugi HIV gen koji može izazvati anti-HIV imunu reakciju. U jednom drugom utjelovljenju, ampicilin otporan gen uklonjen je iz V1J i zamijenjen s neomicin otpornim genom, kako bi se dobio novi V1J koji je unutar različitih HIV genima kloniran za uporabu u skladu s ovim izumom. U drugom ostvarenju, vektor V1J, koji je isti kao i novi-VU osim što jedinstveni Sfi1 mjesto ograničenja stvara unutar pojedinačnog Kpn1 mjesta na položaju 2114 novog-V1J. Broj Sfi1 mjesta u ljudskom DNK genomu veoma je nizak (otprilike 1 mjesto naspram 100,000 baza). Zato, ovi vektori omogućavaju pažljivo kontroliranje izlaganja vektora unutar DDK domaćina, jednostavnim Sf1 varenjem izlučenog genoma DNK. U daljnjem pročišćavanju, vektor je V1R. U ovom vektoru,koliko god moguća ne-izvorna DNK je "naslagana" iz vektora koji proizvodi visoko jezgrovit vektor. Ovaj vektor je derivat V1Jns. Ovaj vektor omogućava više načina na koji se vrši ubacivanje, uz manju opasnost od toga da nepoželjne sekvence budu inkodirane i ograničene od strane stanica.

Jedno ostvarenje ovog izuma uključuje genima inkodirani HIV gp160, gp120, gag, i druge genetske proizvode dobivene laboratorijski prilagođenim lancima HIV-a kao što su SF2, IIIB ili MN. Stručnjaci će prepoznati da se uporabom gena iz HIV-2 lanaca koji imaju funkciju analoga na gene HIV1 mogu proizvesti reakciju imuno analoga koja je ovdje opisana za izgrađivanje HIV-1. Postupci kloniranja i manipulacije koji se koriste radi dobivanja tih gena poznati su stručnjacima.

Prepoznatljivo je da se izazivanjem imuno reakcije protiv laboratorijski prilagođenih lanaca HIV-a nije prikladno kako bi se izvršila neutralizacija neutraliziranje izolatora primarnog područja HIV-a. Zbog toga, drugo utjelovljenju ovog izuma, geni iz virulentnih, primarno izoliranog područja HIV-a inkorporira se u polinukleotidni imunogen. To se izvodi pripremanjem cDNK preslika viralnih gena i podkloniranjem samostalnih gena u polinukleotidni imunogen. Sekvence velikog broja gena iz velikog broja HIV vrsta dostupna su GENBANK (genetskoj banci) i takvo , primarno izoliranje područja HIV dostupno je iz National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) koje je predvodio Quality Biological, Inc., [7581 Lindbergh Drive, Gaithersburg, Maryland 20879] koji su omogućili ove vrste dostupnima. Takva sredstva također su dostupna iz World Health Organization (WHO) [Network for HIV Isolation and Characterization, Vaccine Development Unit, Office of Research, Global Programme on AIDS, CH-1211 Geneva 27, Switzerland]. Stručnjaci će shvatiti da je jedna namjena ovog izuma i uporaba in vivo kako i in vitro analize testiranja koja omogućava međusobno djelovanje HIV sekvence sa serologijom HIV neutralizacije, sve dok drugi se mogu dobiti i drugi parametri. Inkorporiranje gena iz primarno izoliranih HIV vrsta, omogućava imunogen koji izaziva imuno reakciju na klinički izolirani virus koji se još nije ustalio u području. Nadalje, sve dok se virulentni izolatori mijenjaju, imunogen se može modificirati tako da daje nove potrebne sekvence.

U skladu s terminologijom, slijedeće izlaganje izuma praćeno je ovdje opisivanjem stvaranja polinukleotidnog imunogena:" Vektor ime-HIV utjecaj-gena dodatnim elementima". Zbog toga, tvorevina gdje je gp160 gen MN lanca kloniran u vektor V1J-neo, ovdje je dat naziv: "V1Jneo-MN-gp160". Dodatni elementi koji su dodani u tvorevinu detaljno su nadalje opisani. Etiološki utjecaj na virusne promjene, odnosi se na gen koji je pogodan za farmacuetsko inkorporiranje koje se može promijeniti. Kako god, kako je dolje prikazano, zbog izazvane CTL reakcije koja omogućava zaštitu protiv heterolognih utjecaja, a njihova varijabilnost je manje kritična u odnosu na imunogen i vakcine ovog izuma. Nadalje, zbog toga što se lakim manipuliranja farmaceutskog sredstva mogu ubaciti u novi gen, ovo je prilagodba koja se dobila korištenjem uobičajenih tehnika u molekularnoj biologiji.

Izraz "promotor" koji je ovdje korišten odnosi se na dešifriranje ili prepoznavanje mjesta na DNK lancu za kojeg se vežu RNK polimeraze. Promotor izgrađuje početni sustav s RNK polimerazom koja inicira i obavlja postupak prepisivanja ili transkripcije. Sustav se može prilagoditi aktiviranjem sekvenci koje su označene kao "povećavatelji" ili inhibirajuće sekvence označene kao "ušutkivači".

Izraz "vođa" koji je ovdje korišten odnosi se na DNK sekvencu na 5' kraju strukture gena koji ej opisan zajedno s genom. Vođa se obično nalazi u proteinu imajući N-terminal peptidni produžetak ponekad nazvan kao pro-sekvenca. Za proteine koji su namijenjeni za druge izlučevine ekstracelularnog medija ili opne, ova signalna sekvenca, koja je općenito hidrofobna, šalje protein u endoplazmatski retikulum iz kojeg je poslan u pogodno odredište.

Izraz "ubacivač" koji je ovdje korišten odnosi se na dio DNK koja se nalazi u sredini gena koji ne sadrži kod amino kiseline u genetskom proizvodu. Preusmjerivač ili "prekursor" ubacivača je odstranjen i zbog toga nije prepisan ili transkribiran u iRNK niti preveden tj. dešifriran u protein.

Izraz "kazeta" koji je ovdje korišten odnosi se na sekvencu ovog izuma koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja se treba dobiti. Kazeta ima slično značenje kao i kazetna vrpca. Svaka kazeta će imati svoju vlastitu sekvencu. Zbog toga međuvezivanjem kazeta vektor će proizvoditi različitu sekvencu. Zbog ukidanja mjesta na 5' i 3' kraju, kazeta će polako biti ubačena, uklonjena ili zamijenjena drugom kazetom.

Izraz "3' ne translatirano područje" ili "3' UTR" odnosi se na sekvencu na "3' kraju strukturnog gena koji je obično prepisan od strane gena. Ovo 31 UTR područje obično sadrži poli A SEKVENCU. Isto tako 3' UTR je prepisan iz DNK koja je odstranjena prije translacije u protein.

Izraz "Ne-kodirajuće područje" ili "NCR" odnosi se na područje koji je produžetak 3’ UTR područja strukturnog gena. NCR područje sadrži transkripcijski terminalni signal.

Izraz "ograničavajuća mjesta" odnosi se na sekvencu posebno rascijepljenog mjesta ograničavajuće endonukleaze.

Izraz "vektor" odnosi se na neka značenja kojim djelići DNK mogu biti ubačeni u organizam domaćina ili staničje domaćina. Postoje različiti tipovi ili vrste vektora uključujući plazmide, bakteriofage i kozmide.

Izraz "učinkovita količina" znači da kada se dovoljna količina injektira kako bi se proizveo primjeren stupanj i nivo plazmida. Stručnjacima je poznato da ti stupnjevi variraju.

Za opisivanje ovog izuma, priskrbljeno je slijedeće pomoćno objašnjenje o HIV-u. Virus ljudske imunodificijencije sadrži genom ribonukleinske kiseline (RNK), koji je predstavljen Slikom 1. Ovaj RNK genom mora biti podvrgnut reverznoj transkripciji prema postupku koji se odnosi na proizvodnju CDNK kopije potrebnoj za kloniranje i manipulaciju prema ovdje korištenom postupku. Na svakom kraju genoma ponavlja se dugi terminal koji se ponaša kao promotor. Između tih terminala, genom inkodira, u različitim oblicima očitavanja, gag-pol-env kao glavni genetski proizvod: gag je skupina posebnog antigena; pol je reverzna transkriptaza, ili polimeraza; isto inkodirana ovim područjem, u jednoj alternativnom obliku očitavanja, nalazi se viralna proteaza koja je odgovorna za post-translacijski postupak, na primjer, gp160 unutar 120 i gp41; env je omotani protein; vif je virionski čimbenik infektivnosti; REV je regulator proizvodnje virionskog proteina; neg je naegativan čimbenik regulacije; vpu je čimbenik virionske produktivnosti "u"; tat je tran-aktivator ili tranksripcija; vpr je viralni protein r. Funkcija svakog od nabrojanih elemenata bila je opisana.

U jednom ostvarenju ovog izuma, gen inkodira HIV ili SIV protein koji je izravno vezan za transkripcijski promotor. Env gen inkodira za opnu vezani protein, gp160, koji je post-translacijski modificiran u gp41 i gp120. gp120 gen može biti na mjestu koje je pod kontrolom citomegalovirusnih promotora. Kako bilo, gp120 nije opnena veza i zbog toga, unatoč izlaganju, može biti izlučen iz stanice. Kako HIV ima namjeru da se pritaji u zaraženoj stanici, opisano je kako su imuno reakcije povezane s staničnom vezom HIV epitopa koje se također proizvesti. Nadalje, poželjno je da vakcina proizvodi membransku vezu, oligomerni ENV antigen koji je slične građe onom koji je dobiven virusnom infekcijom u cilju da proizvodi što učinkovitije reakcije antitijela za virusno neutralizaciju. Postizanje ovog cilja ovdje je moguće izlaganjem in vivo staničnom opnom povezanih epitopa, gp160, kako bi se poboljšao imuno sustav. Kako god, izlaganje gp160 ponavlja se u odsutnosti sudjelovanja REV-a koji ima uloge u ne-eksportu iz jezgra ne-spletenih gena. Radi daljnjeg shvaćanja ovog sustava, životni ciklus HlV-a mora biti opisan u slijedećim detaljem.

U životnom ciklusu HIV-a, koji se nalazi u zaraženoj stanici domaćina, HIV RNK genoma je reverzno transkribiran u provirusnu DNK koja se integrira u genomsku DNK domaćina kao samostalna trankripcijska jedinica. LTR omogućava promotoru koji transkribira HIV gene u smjeru od 5' do 3' (gag. pol, env), koji će tvoriti jedan nespleteni transkript cijelog genoma. Nespleteni transkript ima istu ulogu kao i iRNK iz koje gag i pol se translatiraju ili prevode, dok se ograničavanje splitanja krajeva mora odvijati radi translacije env inkodiranih gena. Za dobivanje regulatornog gena potrebno je izlaganje REV-a, tako što više od jednog splitanja mora dogoditi radi smiještanja genoma, REV i env, kao što je prikazano u Slici 1, djelomično se poklapaju. Kako bi se mogla odvijati transkripcija env, transkripcija REV-a mora stati, i obratno. Nadalje, u nazočnost REV-a potrebna je za eksport nespletene RNK iz jezgra. Za funkciju REV-a u ovom pogledu, kako god, REV reakcijski element (RRE) mora biti nazočan na transkriptu [Malim et al., Nature 338:254-257 (1989)].

U polinukleotidnoj vakcini ovog izuma, obvezno spletanje izvjesnih HIV gena uklonjeno je koristeći se potpuno spletenim genima (tj.: omogućavanje potpuno jasnog očitavanja djelića za traženi genetski proizvod bez potrebe za isključivanjem u očitavanju djelića ili uklanjanjem nekodirajućih područja; čak i nedovoljno izučen kadar u ovom znanstvenom području, mogu prepoznati tren kada se odvija spletanje određenog gena, postoji široki spektar u određivanju sekvence koja se dobiva; no bez obzira, sve dok je moguće priskrbiti funkcionalna kodirajuća sekvenca, ovaj proces je prihvatljiv). Zato, u jednom ostvarenju, cjelokupna kodirajuća sekvenca za gp160 je spletena tako da nije isprekidano izlaganje svakog genetskog proizvoda koji se traži.

Dvojne humoralne i stanične imuno reakcije koje su izazvane prema izumu, posebno su znakovite po toe što inhibiraju HIV infekciju, dajući sklonost HlV-a da mutira unutar vrste, sve dok ne zarazi pojedinca. U cilju da se oblikuje zaštitna vakcina za HIV potrebno je da se priskrbe obje viševalentne rekacije na primjer u gp160 (env je otprilike 80% pohranjena preko virusnog HIV-1, obložen B lancima, koji preovladavaju u US ljudskoj vrsti), glavna neutralizacijska meta na HIV-u, sve dok citotoksične T-stanice mogu reagirati na pohranjene obroke gp160 i, cjelokpne virusne proteine inkodirane gag-om. Proizveli smo HIV vakcinu koja sadrži gp160 gena izabranih iz srodnih laboratorijskih veza; iz prevladavajućih, primarnih virusnih izolatora nađenih unutar zaražene vrste; iz mutiranog gp160 stvorenim da razotkrije poprečne veze (cross-strain), neutralizira anitijela epitopa; i iz drugih predstavnika HIV gena kao što su gag i pol geni (~95% pohranjenog preko HIV izolatora).

U zbilji, svi HIV seropozitivni pacijenti koji nemaju unaprijed omogućen stabilan imunodificijent anti-gag CTLs dok se otprilike 60% takvih pacijenata pokazuje poprečnu-vezu,, s gp160-posebnom CTLs- Prinos HIV posebne CTLs koji je prisutan kod zaraženog pojedinca napreduje do oboljenja poznatog pod nazivom AIDS, no bez obzira, mnogo je manje, pokazaivajući smisao našeg pronalaska da možemo izazvati CTL reakciju poprečnom-vezom.

Imuno reacija uzrokovana vlastitim env i gag polinukleotidnom vakcinom ispitana je na miševima i primatima. Uzrokovanjem proizvodnje antitijela env u miša omogućava potvrđivanje da dobivena tvorevina je pogodni imunogen, tj., kod većine vakciniranih životinja ustanovljena je reakcija antitijela. Miševi su također najpogodnije pokusne životinje za testiranje CTL indukcije iz naših tvorevina i zbog toga se koriste kako bi se izračunao iznos u kojem su stupnju određene tvorevine sposobne za takve aktivnosti. Majmuni (Afrički zeleni, sjeverno indijski majmun, čimpanza) predstavljaju dodatnu vrstu koja uključuje primate za dobivanje antitijela kod većih, životinja koji ne spadaju u vrstu glodavaca. Ove vrste su korisne za analizu antiserumske neutralizacije u miša sa zadaćom da omogući visoki stupanj neturalizirajućih endogenih aktivnosti protiv retrovirusa nazočnih u serumu miša. Ovi podaci pokazuju da je postignut dovoljan imunogenitet našom vakcinom koja omogućava zaštitu u pokusima na čimpanza/HIVIIIB pokusnom uzorku koji se oslanja na poznat zaštitni stupanj neutraliziranja antitijela ovog sustava. Kako god, sadašnja definicija prihvaćena je u znanstvenim krugovima i pokreće se od tzv. "sterilnog imuniteta", kojim je omogućene potpuna zaštita od HIV infekcije, i sprječavanju oboljenja. Broj uzajamnih odnosa ovog dostignuća uključuje reducirane krvne virusne čestice, mjerenjem HIV reverezno transkripcijskom aktivnosti, prevladavajućih, primarnih virusnih izolatora nađenih ELSA analizom p24 ili drugom koncentracijom HIV antigena u krvi, povećavajući CD4+ koncentracije T-stanica, produžavanjem opstanka [vidi, kao primjer, Cohen, J., Science 262:1820-1821, 1993, rasprava o uključenoj definiciji o učinkovitosti anti-HIV vakcine]. Imunogeni iz ovog izuma isto tako proizvode neutralizirajuće imuno reakcije protiv zaraženih (kliničkih, primarnog područja) HIV-om.

Imunologija

A. Reakcija antitijela na env

1. gp160 i gp120. Analiza ELISA uporabljena je kako bi odredila gdje se vektori vakcine izlažu ili izlučuju gp120 ili membransku vezu gp160 koje su učinkovite u proizvodnji env-posebnih antitijela. Početno in vitro karakteriziranje env izlučivanja našim vakcinacijskim vektorima omogućeno je imuno analizom gp160 transfektiranim staničnim lizatom. Ovi podatci potvrđuju i određuju količinu gp160 izlaganja koristeći anti-gp41 i anti-gp120 monoklonirana antitijela kako bi se mogla vidjeti transfektirana stanica izložena gp160. U jednom ostvarenju ovog izuma, gp160 korisniji je od gp120 iz slijedećih razloga: (1) početni gp120 vektor daje nedosljedan imunogenitet u miša i ne reagira kod Afričkog zelenog majmuna; (2) gp160 pridonosi dodatnom neutraliziranju antitijela sve dok su CTL epitopi dobiveni dodavanjem otprilike 190 amino kiselinskih ostataka odgovaraju za uključenje gp41; (3) izlaganje gp160 je mnogo sličnije virusnom env u odnosu na četverostruku vezu i stvaranje, koja može omogućiti oligomerno-ovisnu neutralizaciju epitopa; i (4) našli smo, da, kao uspješnost membranskih veza, utjecaj HA tvorevina koje proizvode neturalizirajuću reakciju antitijela u miša, ulazi u trag, a proizvodnja anti-gp160 kod ne-ljudskih primata prevladava u odnosu na anti-gp120 proizvodnju antitijela. Izbor koji će se tip env koristiti, ili pomiješani pod dijelovi, poželjno ih je odrediti pokusnima koji dolje navedeni.

2. Nazočnost i opsežnost aktivnosti neutraliziranja

ELISA pozitivni antiserum iz majmuna na kojem se vršeni pokusi, prikazana j neutralizacija homologa i heterologa HIV veze.

3.V3 vs, non-V3 neutraliziranje antitijela. Najveće dostignuće za env PNVs je dobivanje novonastalih neutralizirajućih antitijela. Sada je pokazano da antitijela koja su usmjerena da djeluju protiv V3 petlje imaju poseban utjecaj, a serologija ove reakcije korištena je u definiranju veza.

a. Non-V3 neutralizirajuća antitijela odnose se na primarno prepoznavanje beskorisnih, strukturnih epitopa skupa s gp120 koji je odgovoran za vezivanje CD4. Antitijela ovog domena su poliklonalna i više puta neutralizirana s zadaćom da obnove veze mutiranja koje su podvrgnute potrebi virusa da se veže za stanični ligand. Analiza in vitro korištena je kao test za sprječavanje gp120 da se veže za CD4 imoboliziranu na 96 serumskih krvnih pločica iz imuniziranih životinja. Druga in vitro analiza otkriva izravno vezivanje antitijela za sintetske peptide koji zastupaju izabrani V3 koji se imobilizira iz plastične površine. Ove analize su kompatibilne za antiserum za mnoge životinjske vrste koje su ispitivane tijekom našeg izučavanja i opisuju vrste neutralizirajućih antitijela pri dobivanju vakcine sve dok je moguće ostvariti virusno neutraliziranje in vitro.

b. gp41 odredišta na najmanje jednom glavnom neutralizacijskom mjestu, reagira na visoko pohranjeni linearni epitop dešifriran neutraliziranjućim 2F5 monokloniranom antitijelu (komercijalno dostupan iz Viral Testing Systems Corp., Texas Commerce Tower, 600 Travis Street, Suite 4750, Houston, TX 77002-3005 (USA), ili Waldheim Pharmazeutika GbbH, Boltzmangasse 11, A-1091 Wien, Austria), sve dok potencijalna mjesta uključuju dobro pohranjene "peptide fuzije" koji trebaju biti smješteni na N-terminusu gp41. Osim toga, otkrivanje antitijela koji su usmjereni protiv gp41 imunoblota kako je dolje opisano, a testiranje in vitro analizom korišteno je za antitijela koja se vežu za sintetske peptide koji predstavljaju ova područja (mobilizirana na plastici.

4. Sazrijevanje reakcije antitijela. Kod HIV seropozitivnih pacijenata, neutraliziranje reakcije antitijela napreduje od vodećeg anti-V3 kako bi se omogućilo što bolje neutraliziranje antitijela koji se sastoje od strukturne gp120 danog epitopa opisanog gore (#3), uključujući gp41 epitope. Ove vrste reakcije antitijela vođene su u isto vrijeme i kasnijom vakcinacijom.

B. Ponovna aktivnost T-stanica protiv env i gag.

1. Stvaranje reakcija CTL. Virusni proteini koji su sintetizirani unutar stanica daju mogućnost porasta MHC l- onemogućnom CTL reakciji. Svaki od navedenih proteina nazočni su kod CTL seropozitivnih pacijenata. Naše vakcine isto tako omogućavaju prisutnost CTL u miša. imunogenetika mišjih veza su vodeće kod ovih istraživanja, kao što je prikazano kod upale NP-om. Nekoliko epitopa nađeno je u HIV proteinima env, REV, nef i gag u Balb/c miša, zato je neophodna in vitro CTL kultura i citotoksična analiza. Zbog toga se daje prednost singenetskim tumorskim crtama, kao što su murinski mastocitom p815, transfektiran s genima koji su u mogućnost opskrbiti metu za CTL u tijeku in vitro antigenske ponovne stimulacije. Poznati su postupci definiranja imunogena koji su sposobni za izazivanje MHC razreda l-ograničenih citotoksičnih T limfocita. Peptidi okruženi amino kiselinama 152-176 isto tako su sposobni za aktiviranje HIV neutralizirajući antitijela, a ti postupci se mogu korisititi kako bi se identificirao imunogeni epitop za uključenje PNV-a ovog izuma. Drugačije, cjelokupni gen inkodira gp160, gp120, proteazu, ili gag koji se može koristiti. Kao što je ovdje korišteno, čimbenik koji utječe na funkciju T-stanica povezan je s zrelim fenotipom T-stanice, na primjer, citotoksičnosti, citokinskim izlučivanjem za aktiviranje B-stanica, i/ili pojačavanje ili potjecanje makrofaga i neutrofila.

2. Mjerenje TH aktivnosti. Kulture stanica slezene uzete iz vakciniranih životinja testirane su za ponovno dobivanje posebnih antigena dodavanjem drugih rekombinantnih proteina ili peptidnih epitopa. Aktiviranje T stanica takvim agensima odvija se združivanjem antigena slezene predstavljenih stanica, APCs je praćen proliferacijom ovih kultura citokinskom proizvodnjom. Uzorak citokinske proizvodnje isto tako omogućava klasificiranje reakcije TH kao tip 1 ili tip 2. Zbog dominantne TH2 reakcije potrebno je isključivanjem imuniteta stanica u imuno-prilagođenim sreopozitivnim pacijentima, moguće je definirati vrstu reakcije izazvane datom PNV u pacijenta, dozvoljavajući manipilaciju dobivene imuno reakcije.

3. Spriječena vrsta povećane osjeljivosti (hipersenzibilnosti) (DTH). DTH na virusni antigen nakon injektiranja prisutna je u staničnom, vodećem MHC ll-ograničenom imunitetu. Zbog komercijalne pogodnosti rekombinirajućih HIV proteina i sintetskih peptida poznatih epitopa, DTH reakcije su označene u cijepljenim kralježnjacima koristeći se ovim reagensima, kako bi se omogućio in vitro odnos potreban za izazivanje staničnog imuniteta.

Zaštita

Oslanjajući se na gore navedena imunološka istraživanja, predvidivo je da su naše vakcine učinkovite u primjeni na kralježnjake, a u svrhu obrane od virulennog HIV-a. Izučavanja su obavljena na HIVIIIB/čimpanzama kao pokusnim objektima nakon čega je izvršena vakcinacija ovih životinja s PNV tvorevinom, ili mješavinom PNV tvorevine koja sadrži gp160IIIB, gagIIIIB, nefIIIB i REVIIIB. IIIB veza korisna je tako što su kod čimpanzi ustanovljene smrtonosne doze ove veze. Kako god, slična izučavanja su uvidjela korisnost uporabe bilo koje veze HIV-a i posebnih epitopa heterologa datih veza. Druga vakcinacija nad pokusnim predmetom, u odnosu na čimpanze, je scid-hu PBL miš. Na ovom pokusnom modelu moguće je testiranje ljudskog limfocitnog imuno sustava te naše vakcine protiv naznonog HIV-a u domaćinu mišu. Ovaj sustav je u prednosti jer se može lako prilagoditi kroz uporabu s bilo kojom vezom HIV-a i isto tako omogućava zaštitu protiv višestrukih veza primarnog područja izolatora HIV-a. Treći model koristi se kao hibrid HIV/SIV virusa (SHIV), neki od ovih modela prikazani su u inficiranju rezus majmuna te dovode do stanja imunodificijencije koja rezultira smrću [vidi Li, J., et al., J. AIDS 5:639-646. 1992]. Vakcinacija rezusa našom polinukleotidnom vakcinom služi kao zaštita od suočenja sa smrtonosnom dozom SHIVA.

Sažetak o PNV tvorevini

HIV i drugi geni povezani su unutar izloženog vektora koji je podešen za polinukleotidnu vakcinaciju. Osnovna sva vanjska DNK je uklonjena, ostavljajući osnovne elemente transkripcijskog promotora, imunogenih epitopa, transkripcijskog terminatora, bakterijskog izvornika na replikaciju i antibiotike otporne gene.

Izlaganje kasnih HIV gena kao što su env i gag je REV-ovisno i zahtijeva da element (RRE) reakcije REV-a bude nazočan na virusnom genskom transkriptu. Sekretirani oblik gp120 može se dobiti bez nazočnosti REV zamjenom vodećeg gp120 peptida s vodećim heterologom kakav je tPA (plazminogen aktivatorodređene vrste staničja), a pogotovo se preporučuje vodeni peptid kakav je nađen u visokim količinama u proteinima sisavaca kao što je imunoglobulin vodeći peptid. Imamo ubačeni tPA-gp1220 kimerički gen unuta V1 Jns koji učinkovito izlaže izlučenu gp120 u transfektirane stanice (RD, ljudska miosarkomska crta). Monocistronička gp160 ne proizvodi nijedan od proteina transfekcijom ukoliko se ne dodaje REV izloženi vektor.

Predstavne komponente Tvorevine uključuje (ali nije ograničena na):

1. tPA-gp120MN;

3. gp160IIIB;

10. gagIIIB: za anti-gag CTL;

11. tPA-gp120IIIB;

12. gp160 sa strukturnim mutacijama: V1, V2, i/ili V3 brisanjem petlje ili zamjenom

20. Geni inkodiraju antigene koje su izloženi patogenima ili HIV-u, kao što, no nisu ograničeni na, nukleoprotein virusa gripe, hemaglutinin, matriks, neuramnidaze, i druge antigenske proteine; herpes simlex virusne gene; ljudske paplioma virusne gene; tuberkulozne antigene; hepatitis A; B ili C virusne antigene.

Učinkovitost zaštite od polinukleotidnih HIV imunogena protiv mogućnosti virusne infekcije prikazano je imunizacijom sa ne-replicirajućim plazmidom DNK ovog izuma. Prednost toga je sve dok se ne uključi infektivni agens, sakupljanje virusnih dijelova nije preporučljivo, a izbor mjesta je dozvoljen. Nadalje, budući da je unutar virusnih HIV veza pohranjena sekvenca gag i preteeaze ne nekoliko virusnih genetskih proizvoda, zaštita protiv mogućeg izlaganja infekciji virulentnim vezama HIV-a što je homologno, sve dok se mogu dobiti klonirani geni iz heterolognih veza, je onemogućena.

Intramuskularna injekcija DNK izloženog vektora inkodira gp160 koji rezultira dobivanjem zaštite imuniteta protiv izlaganju virusnom djelovanju. Posebno, gp160-posebna antitijela i primarni CTLs su proizvedeni. Imuno reakcija usmjerena je protiv pohranjenih proteina može biti učinkovita usprkos mijenjanju i nagomilavanju različitih omotačkih proteina. Budući da svaki od HIV genetskih proizvoda pokazuje neki stupanj očuvanosti tj. pohranjenosti, i radi dobivanja CTL u reakciji na ekstracelularno izlaganje i MHC procesiranje, predvidljivo je da mnogi virusni geni reagiraju na analoge koji se nalaze u gp160. Zbog toga, mnogi od ovih gena se mogu konirati, kao što je prikazano kloniranjem i sekvenciranjem veza uizloženom vektoru (vidi niže) tako da su te tvorevine imunogeni agensi u pogodnom obliku.

Izum nam nudi značenja omogućavanje zaštite imuniteta poprečnim-vezama bez potrebe za samo-repliciranje agensa ili drugih sastojaka. U nastavku, imunizacija sa nazočnim polinukleotidima nudi niz drugih prednosti. Ovaj pristup vakcinaciji treba biti primjenjiv kod tumora kao kod infektivnih agensa, otkada CD8+CTL reakcija je važna za oba patofiziološka procesa [K. Tanaka et al., Annu. Rev. Immunol. 6, 359 (1988)]. Zbog toga, izazivanje imuno reakcije protiv proteina ključno je za proces transformacije koji je učinkovit za spriječavanje nastajanja zloćudnih tumora ili imunoterapiji. Dobivanje velikog broja antitijela koji se bore protiv izloženih proteina nakon injektiranja virusnog proteina i Ijudksog hormona rasta DNK, predlaže se da jaka potreba za učinkovitim dobivanjem vakcina baziranih na antitijelima, ili odvojeno ili u kombinaciji s vakcinama citotoksičnih T-limfocita koje su meta vodećim sačuvanim ili pohranjenim antigenima.

Lakoća proizvodnje i pročišćavanja DNK tvorevina obavlja se uobičajenim postupcima pročišćavanja proteina, iz toga proizilazi potreba za kombiniranim vakcinama. U svezi s time, višestruka tvorevina inkodiranog gp160, gp120, gp41, ili bilo kojeg drugog HIV gena mogu se dobiti, miješati i su-primjenjivati. Zbog toga što se izlaganje proteina održava injektiranjem DNK, može uščuvati ustrajnost B- i T-stanca u pohrani podataka, te se pobuđuje dugo-životni humoralni i celularni imunitet.

Uobičajene tehnike u molekularnoj biologiji za pripravu i pročišćavanje DNK tvorevina onemogućavaju pripravu DNK imunogena ovog izuma. Dok se uobičajene tehnike u molekularnoj biologije zbog toga dovoljne za proizvodnju proizvoda ovog izuma, posebne tvorevine koje su ovdje nazočne omogućavaju dobivanje novih polinukleotidnih imunogena koji iznenađujuće proizvode neutraliziranje poprečno-vezanih i primarnih HIV izolatora, dajući tako nedokučivost u uobičajenom među aktiviranju čitavog virusa i pod-jedinica proteinskih vakcina.

Prinos izložene DNK ili transkripcijske RNK koja je ubačena u vakcinu primatelja ovisit će o jačini transkripcijskih ili translacijskih uporabljenih promotora iimunogeniteta izloženih genetskih proizvoda. Općenito, imunološki ili profilaktički učinkovita doza od 1 do 100 mg, preporučljivo oko 10 pg do 300 pg pri primjeni izravno unutar mišićnog staničja. Subkutane ili potkožne vakcine, unošenje preko kože, i drugim postupcima primjenjivanja kao što je intraperitonalno, intravenski, ili inhaliranjem koje je također primjenjivo. Svaka mogućnost primjene vakcine je uključena. Slijedeća vakcinacija s HIV polinukleotidnim imunogenom, povezana je s HIV proteinskim imunogenom kao što je gp160, gp120, i geg genetski proizvodi koji su također uključeni. Parenteralna primjena, kao što je intravenska, intramuskularna, subkutana ili druge odnosi se na davanje proteina interleukina-12, skupa s parenteralnim uvođenjem PNV-a ovog izuma po čemu je ovaj izum u prednosti.

Polinukleotidi mogu biti ogoljeni, tako da ne budu u svezi s bilo kojim proteinom, dodatkom ili drugim agensom koji se ubacuje u primateljev'imuno sustav. U tom slučaju, poželjno je da polinuklotidi budu u fiziološki pogodnoj otopini, kakva je, ali nije ograničena na, sterilno slanište ili sterilno puferirano slanište. Drugojačije, DNK može biti povezana s lipozomima, kao što su lecitin lipozomi ili drugi lipozomi poznati stručnjacima, kao što je DNK-lipozomska smjesa, ili DNK može bit povezana s dodatcima poznatim stručnjacima kao povećana imuno reakcija, kao stoje protein ili drugi nositelj. Agensi koji sudjeluju u staničnom preuzimanju DNK, kao što su, no nisu ograničeni, ioni kalcija, koji također mogu pridonijeti napretku. Ovi agensi se općenito odnose na transfekciju pomoćnih reagensa i farmaceutski prihvatljivih nositelja. Tehnike koje se odvijaju pod djelovanjem mikroprojektila obloženih polinukleotidom poznatom stručnjacima također su korisni u svezi s ovim izumom.

Slijedeći primjeri prikazani su brojnim slikama i nemaju nakanu da ograniče ovaj izum u bilo kojem pogledu.

Primjer 1

Opis materijala

Vektori pF411 i pF412: Ovi su vektori subkolonirani iz vektora sP62 koji je dobiven u R. Gallovoj laboratoriji. pSP62 je jedan pogodan reagens potekao iz Biotech Research Laboratiries, Inc. sSP62 ima 12.5 kb Xbal djelića HXB2 genoma subkloniranog iz lambda HXB2. Sali i Xba 1 verenje pSP62 daje HXB2 dijelove: 5'-Xbal/Sa1l, 6.5 kb i 3'-Sa1l, 6 kb. Ovi umetci subklonirani su unutar pUC 18 na Smal i Sali mjestima dajući pF411 (5'-Xbal/Sa1l) i pF412 (3'-Xbal/Sa1l). pF411 sadrži gag/pol a pF412 sadrži tat/rev/env/nef.

Reagensi repliciranja gena:

rekombinantni rev (IIIB), #RP1024-10

rec. gp120 (IIIB), #RP1001-10

anti-rev monoklonirano antitijelo, #RP1029-10

anti-gp120 mAB, #C1, #RP1010-10

Istraživanje AIDS-a i programa reagensa:

anti-gp41 mAB hidroma, Chessie 8, #526

Strategije su određene da izazovu i citotoksične T-limfocite i neturalizirajuću reakciju antitijela na HIV, koje se posebno odnose na HIV gag (~95%sačuvanog) i env (gp160 ili gp120; 70-80% sačuvanih) genetskih proizvoda. gp160 sadrži samo poznato neutralizirajuće antitijelo epitopa na HIV dijelu, dok se važnost anti-env i anti-gag CTL reakcije povezano s navalom ovih staničnih imuniteta, s jasnom primarnom viremijom date infekcije, koja se ostvaruje prvenstveno na neutralizirajuća antitijela, sve dok se uloga CTL u održavanju slobosnog-stanja bolesti. Iz razloga što je HIV na lošem glasu po svojoj genetsko genetskoj raznolikosti, nastojimo omogućiti bolji pristup neutraliziranju antitijela uključujući nekoliko predstavnih env gena dobivenih iz kliničkih izolatora i gp41 (~90%sačuvanog), dok se visoko pohranjeni ili sačuvani gag gen proizvodi poprečnom-vezom rekacije CTL.

Primjer 2

Izlaganje heterologa HIV kasno dobivenog genetskog proizvoda

Strukturni geni HIV-a kao što su env i gag zahtijevaju izlaganje HIV regulacijskih gena, u namjeri da učinkovito proizvedu trajnije proteine. Nađeno je da rev-ovisno izlaganje gena gag proizvodi nizak stupanj proteina i da sam rev može biti otrovan po stanicu. Isto tako postigli smo relativno visok stupanj rev-ovisnog izlaganja gp160 in vitro, te takv vakcina proizvodi nizak stupanj antitijela na gp160 slijedeći in vivo imunizaciju s rev/gp160 DNK. To proizilazi iz poznatih citotoksilnih učinaka rev-a dok se povećava poteškoća dobivanja rev funkcije u miotubulima koji sadrže stotine jezgica (rev protein treba biti u istom jezgru kao i rev-ovisan transkript ta gag ili env proteinsko izlaganje koje se treba obaviti). Kako god, moguće je dobiti rev-ovisno izlaganje koristeći izabranu modifikaciju env i gag gena. Izračunavanje vrijednosti ovih plazmida u svrhu vakcine je na putu.

Općenito, naša vakcina ima primjenu prvenstveno na HIV (IIIB) env i gag gene za optimiziranje izlaganja unutar našeg dobivenog vektora vakcinacije, V1Jns, koji je sastavljen od CMV ranije dobivenog (IE) promotor, BGH polinuklotidnog mjesta, i pUC poporne veze. Variranjem učinkovitosti, koje ovisi o dužini genskog segmenta koji je korišten (npr. gp120 ili gp160), rev-ovisnog izlaganja koje može biti povezano s env zamjenom mjesta njegovog prirođenog vodećeg sekrecijskog peptida s genom koji je aktivator posebnog plazminogena staničja (tPA) a izlaganje rezultira kimerički gen iza CMVIE promotora s CMV uvođenjem A. tPA-gp120 je primjer izlučenog gp120 vektora sastavljenog u tom obliku čija je funkcija dovoljna da proizvede anti-gp120 imuno reakciju u vakciniranom mišu i majmunu.

Poradi izvješća da proteini usidreni na opni mogu uzrokovati viš,e značajnih (i možda mnogo specifičnih za HIV neutralizaciju) reakcija antitijela u usporedbi s izlučenim proteinima, dok se stvaraju dodatni imuno-epitopi, pripravili smo V1Jns-tPA-gp160 i V1 Jms-rev/gp160. tPA-gp160 vektor proizvodi određenu količinu gp160 i gp120, bez dodavanja rev, kako je prikazano imuno analizom transfektiranih stanica, isto tako stupnjevi izlaganja bili su znatno niži kada se pokušao dobiti rev/gp160, rev-ovisno gp160-izloženi plazmid. To je zbog toga što se područja inhibicije (označena kao INS), koja iskazuju rev ovisnost u odnosu na gp160 traskript, odvija na višestrukim mjestima sa gp160 uključujući COOH-terminal gp41 (vidi shemu ispod). Vektor je dobiven za COOH-terminalni skraćeni oblik tPA-gp160, tPA-gp143, koje je bio označen da poveća izlaganje stupnjeva env, eliminiranjem ovih inhibicijskih sekvenci. gp143 također uklanja intracelularno gp41 područje koje sadrži peptidne uzorke (kao što su leu-leu) poznate po tome što uzrokuju razaranje membranskih proteina lizozoma, prije nego staničnu podlogu. Zato, gp143 može očekivati povećanje oba izlaganja env proteina na staničnu podlogu u odnosu na cjelokupnu dućinu gp160 u kojem će ti proteini moći bolje proizvoditi anti-gp160 antitijela putem vakcinacije DNK. tPA-gp143 dalje će biti modificiran opsežnom tihom mutagenezom elemenata sekvenci rev reakcije (RRE) (350 bp) kako bi se uklonila dodatna inhibicijska sekvenca. Ova tvorevina, gp143/mutRRE, dobivena je u dva oblika: uklanjanjem (oblik A) ili osiguravanjem mjesta (oblik B) proteolitičkih rascjepnih mjesta za gp120/41. Oba oblika pripremljena su zbog literarnih radova da primjena vakcine na miša korištenjem nerascjepive gp160 izložene u vakcini, je dobivena u mnogo većim stupnjevima antitijela u odnosu na gp160 rascijepljene oblike.

Količinska ELISA za izlaganje gp160/gp120 u transfektiranoj stanici razvijena je da označi moguću sposobnost izlaganja ovih vektora. In vitro transfekcijom 293 stanica praćene kvantifikacijom stincom-povezanih izlučenjem ostvarenog gp120 dobiveni su slijedeći rezultati: (1) tPA-gp160 izložen je 5-10 manje gp120 od rev/gp160 sličnih omjera zadržanog mjesta intracelularnog vs. prometa na staničnoj položi; (2) tPA-gp143 daje 3-6X bolju sekreciju gp120 od rev/gp160 sa niskom razinom ili stupnjem sa stanicom povezanog gp143, potvrđujući da citoplazmatski rep gp160 uzrokuje intracelularnu retenciju gp160 koja može biti izazvana djelomičnim brisanjem ove sekvence; i, (3) tPA-gp143/mutRRE A i B daje ~10X veće izlaganje razine proteina nego što je to učinio parentalni tPA-gp143 dok je uklanjanje proteolitičkog procesiranja bilo potvrđeno za oblik A.

Poradi toga,, naša strategija za povećanje rev-ovisnog izlaganja koji je dobiven postupno povećava u izlaganju kao i preusmjeravanje za opnu vezanog gp143 ne izbaci iz lizozoma stanice. Važno je naglasiti daje potrebno omogućiti ubacivanje gp120 sekvence dobivene iz različitih virusnih izolatora unutar kazete vektora koja sadrži ove modifikacije koje bilo da se oslanjaju na NH2-terminal (tPA voditelja) ili COOH-terminal (gp41), u kojem nekoliko antigenetskih različitosti postoji između različitih virusnih veza. Drugim riječima, ove generičke tvorevine mogu se lako modificirati ubacivanjem gp120 dobivenog iz različitih primarnih virusnih izolatora kako bi se dobila klinički podobna vakcina.

Da bi se primjenile ove strategije na viruse a u odnosu na svrhu vakcine, te da bi se omogućio pristup našim stajalištima, također smo pripravili tPA-gp120 vektor dobiven iz primarnog HIV izolatora (koji sadrži Sjeverno Američki koncenzus V3 peptidnih krajeva; tropski makrofag i "non-sincitija"-uzrokovanje stvaranja fenotipova). Ovaj vektor daje visoko izlaganje/izlučivanje gp120 sa 293 transfektirane stanice i proizvodi anti-gp120 antitijela u miša pokazujući da se izvršilo kloniranje u funkcionalnom obliku. Primarno izolirani gp160 geni također će biti uporabljeni za izlaganje slično onom kao i za gp160 dobivenog laboratorijskim putem.

Primjer 3

Imuno reakcija na HIV-1 env polinukleotidne vakcine:

Afrički zeleni (AGM) i rezus (RHM) majmuni koji primaju gp120 DNK vakcinu s veoma niskom razinom neturaliziranja antitijela kroz 2-3 vakcinacije, ne mogu se povećati povećanjem broja vakciniranja. Ovi rezultati, dok god predstavljaju upozorenje na polju vakcine HlV-a, oligomerni gp160 je vjerojatno bolji antigen stvaranje neutralizirajući antitijela nego što su to gp120 monomeri (Moore and Ho, J. Virol. 67:863 (1993)), koji nas usredotočuju na dobivanje učinkovitog dobivanja gp-baziranih vektora (vidi gore). Miševi i afrički majmuni također su cijepljeni sa primarnim izolatorom dobivenim iz tPA-gp120 vakcine. Ove životinje pokazale su anti-V3 petide (koristeći homologne sekvence) uzajamnih krajnjih točaka antitijela vrijednosti od 500-5000, pokazujući da dobivena vakcina funkcionalna za kliničku uporabu na virusne izolatore.

gp160-bazirane vakcine, rev-gp160 i tPA-gp160, nisu se pokazale učinkovite pri izazivanju reakcije antitijela miša i primata ili ima veoma mali prinos anittijela. Znakoviti rezultati s tPA-gp143 plazmidom dobivaju se geometrijski označene čestice <103 kod miša i afričkog majmuna nakon dvije vacinacije. Ovi podatci znače da imamo znakovito poboljšan imunogenitet gp160-sličnoj vakcini povećavanjem razine izlaganja. Ova tvorevina, kao i tPA-gp143/mutRRE A i B vektori, nastavit će se kako bi se karakterizirala za reakciju antitijela, posebno za neutraliziranje virusa.

Očito je da, gp120 DNK vakcinacija proizvodi mogućeg pomagatelja reakcije T-stanica u svim limfatičnim dijelovima testiranih (žuč, krv, prepone,zglobovi) s TH1-sličnim citokinskom izlučevinom (tj., g-interferon i IL-2 proizvodnja sa malim ili ne IL-4). Ovi citokini općenito pridonose jakom staničnom imunitetu i povezani su sa održavanjem bolesti-slobodnog stanja na HIV-seropozitivne pacijente. Limfa je prikazana kao primarno mjesto za replikaciju HIV-a, u koji se smiješta veliki broj virusa čak i onih koji se ne mogu dobro otkriti u krvi. Vakcina koja može stvoriti anti-HIV imuno reakciju u ovisnosti o limfnim mjestima, prikazanim u našoj HIV vakcini, može pomoći u spriječavanju uspješne kolonizacije limfatička prateći ppočetnu infekciju.

Kao to je prije ustanovljeno, razmotrili smo ostvarenje slijedeći objektekoji su najbitniji za uvećavanje naših šansi za uspjeh u ovom programu: (1) env-bazirani vektori koji su sposobni za proizvodnju jačeg neturaliziranja reakcije antitijela u primata; (2) gag i env vektori stvarat će jaču reakciju T-limfocita kao što je okarakterizirano CTL-om i pomoćnim funkcijskim čimbenikom u primata; (3) uporaba env i gag gena iz klinički odgovarajuće HIV-veze u našoj vakcini i karakteriziranjem imunoloških reakcija, posebno neutraliziranjem primarnih izolatora koji ih proizvode; (4) prikaz zaštite na životinjskom uzorku kao stoje na čimpanzi/HIV (IIIB) ili rezusu/SHIV, koristeći pogodno ugođenu vakcinu; i, (5) određivanje trajanja imuno reakcije u skladu s kliničkom uporabom. Postignut je značajan napredak na prva od tri predmeta promatranja a pokusi napreduju u smjeru unaprjeđivanja vakcine te djelovanja gp160 i gag kojim će se poboljšati rezultati.

Primjer 4

Vektori za dobivanje vakcine:

A. V1Jneo IZLAGAČKI VEKTOR:

Neophodno je bilo ukloniti amp’ gen koji je korišten za antibiotičku selekciju bakterija koje nakupljaju V1J zbog toga što ampicilin ne mora biti korišten u širokom spektru u odnosu na fermantatore. Amp’ gen iz pUC pomoćne veze V1J uklonjen je varenjem sa Sspl i Eam1105l restrikcijskim enzimima. Navedeni plazmid pročišćen je elektroforezom gela agara, sa krajevima koji su oslabljeni s T4 DNK polimerazom, a tada se tretira sa alkalin fosfatazom iz debelog crijeva. Komercijalno pogodan kanr gen, dobiven iz transpozona 903 koji je sastavljen od pUC4K plazmida, biva odsječen korištenjem Pstl restrikcijskog enzima,, pročišćenoj elektroforezom gela agara, ogoljenih krajeva T47 DNK,polimerazom. Fragment ili djelić je povezan s V1J pomoćnim plazmidom sa kanr genom u smjeru u kojm su dobiveni i označeni kao V1Jneo #'s 1 i 3. Svaki od ovih plazmida potvrđen je analizom varenjem restrikcijskog enzima, DNK sekvenciranjem područja spajanja, a pokazano je da se dobiva slična količina plazmida kao V1J. Izlaganje heterolognih genetskih proizvoda također je usporedivo sa V1J za ove V1Jneo vektore. Posebno izabran V1Jneo#3, koji se ovdje odnosi na V1Jneo, koji sadrži kanr gen ima isto usmjerenje kao ampr gen u V1J kao izlagačka tvorevina.

B. V1Jns izlagački vektor:

Sgi 1 mjesto dodano je V1Jneo kako bi olakšao objedinjavanje izučavanja. Komercijalno pogodan 13 par baze Sfi l koji je veznik (New England BioLabs). dodaje se na Kpn l mjesto sa BGH sekvencom vektora. V1Jneo je izjednačen sa Kpn l, gelom pročišćen, osiromašen T4 DNK polimerazom, i vezan za isječeni kraj Sfi 1 veznika. Klonirani izolatori izabrani su restrikcijom ili ograničenjem raspoređivanja i provjereni sekvenciranjem veznika. Novi vektor označen je kao VUns. Izlaganje heterolognih gena V1Jns (sa Sfi l) usporedno je sa izlaganjem istih gena u V1Jneo (sa Kpn 1).

C. V1Jns-tPA:

S ciljem da se omogući jedna vodeća heterologna sekvenca koja će lučiti i /ili membranske proteine, V1Jn je modificiran u vodeći plazmogenski aktivator ljudskog staničja (tPA). Dva sinteska podudarna ili susjedna oligomera su kaljena a tada vezivana unutar V1Jn koji je bio BgIII provaren. Ovi smisleni i besmisleni oligomeri su 5'-GATC ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GA-3. SEK.ID: 18: i 5'-GAT CTC GCT GGG CGA AAC GAA GAC TGC TCC AGA CAG CAG CAC AGA GCA GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC GAT GGT-3'. Kozakova sekvenca odnosi se na smislene oligomere. Ovi oligomeri imaju baze koje strše kompatibilne za vezanje az BgIII-isprekidanu sekvencu. nakon vezivanja "uzvodna" Bglll mjesta uništena su dok se nizvodni BgIH zadržava tj., osigurava mjesto za slijedeće vazivanje. Oba mjesta na kojima se dešava vezivanje isto su tako označeni kao i cijela vodeća tPA sekvenca koja je provjerena DNK sekvenciranjem. Nadalje, u cilju ostvarenja našeg odgovarajućeg vektora V1Jns (=V1Jneo sa Sfi 1 mjestom), Sfi l restrikcijsko mjesto bilo je smješteno na Kpnl mjestu unutar BGH graničnog područja V1 Jn-tPA siromašenjem ili izrezivanjem krajeva Kpn l mjesta sa T4 DNK polimerazom koja je praćena vezivanjem sa Sfi l veznikom (katalog #1138, New England BioLabs). Ova izmjena potvrđena je restrikcijom varenja i elektoforezom gela agara.

Primjer 5

1. Sastav HIV env vakcine:

Proizvodnja vakcinom izčučenog env-dobivnog antigena (gp120 i gp140):

Izlaganje REV-ovisnog env gena kao što je gp120 izvođeno je kako slijedi: gp120 je PCR-klonirana iz MN veze HlV-a sa drugom izvornom vodećom peptidnom sekvencom (V1Jns-gp120), ili spajanjem s aktivatorom plazmogena staničja (tPA) zamijenjujući ga za izvorni vodeći peptid (V1 Jns-tPA-gp120=. tPA-gp120 izlaganje bilo bi REV-ovisno [B.S. Chapman et al., Nuc. Acids Res. 19, 3979 (1991); trebalo bi skrenuti pozornost na druga vodeća sekvenca može omogućiti sličnu funkciju u prikazivanju gp120 gena REV-ovisnog]. Ovo se postiže pripravom slijedeće gp 120 tvorevine koja sadrži ranije opisane vektore.

Primjer 6

Sastav vakcine gp120:

HIVMN gp120 gen (Medimun) bio je PCR-uvećan koristeći oligomere koji imaju cilj ukloniti prvih 30 amino kiselina iz vodeće peptidne sekvence i olakšati kloniranje u V1Jns-tPA stvorenim kimeričkim proteinima koji sadrže tPA vodeći peptid praćen opstajanjem gp120 sekvence praćene amino kiselinskim ostatkom 30. Ovaj način dopušten je za REV-ovisno gp120 izlaganje i izlučivanje topljive gp120 iz stanica u kojima se zadržava taj plazmid. Smisleni i besmisleni PCR oligomeri koji su ovdje korišteni su 5'-CCC CGG ATC CTG ATC AGA GAA AAA TTG TGGGTC ACA GTC-3', i 5'-C CCC AGG AATC CAC CTG TTA GCG CTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TCT-3'. Kodon zaustavljanja translacije je potcrtan. Ovi oligomeri sadrže BamHI restrikcijske enzime koji su smješteni na samom kraju translacijskog slobodnog očitavajućeg sustava sa BcII 3' označenom mjestu BamHI smislenog oligomera. PCR proizvod varen je kroz sekvence sa Bell koji je praćen BamII i vezan unutar V1Jns-tPA koji je BgIII probavljen, praćen tretiranjem baznom fosfatazom probavnog sustava. Dobiveni vektor sekvenciran eje kako bi potvrdio vezivanje između tPA voditelja i gp120 kodirajuće sekvence, a gp120 izlaganje i izlučivanje potvrđeno je imuno analizom transfektiranih RB stanica.

B. V1Jns-tPA-HIVIIIBqp120:

Ovaj je vektor sličan kao i 1.A. osim toga što je HIV IIIB veza korištena za gp120 sekvencu. Smisleni i besmisleni PCR oligomeri korišteni ovdje su: 5'-GGT ACA TGA TCA ČA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3', i 5'-CCA GAT TGA TCA GAT ATC TTA TCT TTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TC-3'. Ovi oligomeri priskrbljuju smještanje Bell na kraju ubacivanja isto kao što EcoRVje samo smješten uzvodno od Bell mjesta na 3'-kraju. %-kraj Bell mjesta omogućava vezivanje unutar BgIII mjesta V1Jns-tPA kako bi se stvorila izvorna vodeća sekvenca. Proces vezivanja potvrđen je restrikcijskim probavljanjem i sekvenciranjem DNK.

Primjer 7

Sastav gp140 vakcine:

Ove vakcine dobivene su iz PCR, slično kao i tPA gp120 sa tPA voditelem na mjestu izvornog voditelja, ali ima za cilj proizvodnju izlučenog antigena određivanjem gena NH2-kraja transmembranskog peptida (koji stvara karboksiterminal amio kiselinsku sekvencu = NH2-.....TNWLWYIK-COOH). Protivno tomu, gp120-dobivene tvorevine, gp140 tvorevine bi trebale proizvoditi oligomerni antigen i osigurati mjesto gp41-sadržanom neutralizirajućem antitijelu epitopa kao što je ELDKVVA određen sa 2F5 monoklonirajućim antitijelom.

Tvorevine su spravljene u dva oblika (A ili B) ovisno o gp160 proteolitičkom mjestu raskola na vezi između gp120 i gp41 gdje se zadržava (B) ili uklanja (A) pogodno zamijenjenom amino kiselinom kako je opisao Kiwny et al., (Prot. Eng. 2: 219-255 (1988) (divlja vrsta sekvence = NH2-... KAKRRWQREKR...COOH i mutirana sekvenca = NH2-... KAQO NH WQNEHQ...COOH sa mutiranim amino kiselinama koje su potcrtane).

A. V1Jns-tPA-gp41/mutRRE-A/SRV-1 3'-UTR (baziran na HIV-1IIIB):

Ova tvorevina dobivena je PCR korištenjem slijedećih smislenih i besmislenih PCR oligomerima: 5'-CT GAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAAT TTG GGG TTG CTC TGG-3', SEK.ID: :, i 5'-CGC AGG GGA GGT GGT CTA GAT ATC TTA TTA TTT TAT ATA CCA CAG CCA ATT TGT TATG-3' KAKO BI SE DOBIO Avrll/EcoRV segment iz vektora IVB (koji sadrži optimizirani RRE-A segment). 3'-UTR, spravljen kao sintetski segment gena, dobiven je iz Simian Retrovirusa-1 (SRV-1, vidi niže) ubačen je u Sfil mjesto restrikcijskog enzima u kojeg se uvodi odmah 3'- gp41 otvorenog očitavajućeg sustava. Ova UTR sekvenca opisana je prethodno kao olakšavajuća za rev-ovisno izlaganje HIVenvi gag.

B. V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-B/SRV-1 3'-UTR (baziranom na HIV-1IIIB):

Ova tvorevina slična je tvorevini IIA osim što env proteolitička mjesta raskola nisu omogućena koristeći tvorevinu IVC kao početni materijal.

C. V1Jns-tPA-gp140/opt30-A (baziranom na HIV-1IIIB):

Ova tvorevina dobivena je iz IVB probavljenjem restrikcijskog enzima AvrII i SFiI slijedeći vezivanje sintetskog DNK segmenta koji odgovara gp31 ali u usporedbi optimalnim kodonima za translaciju (vidi gp32-opt niže). gp30-opt DNK dobiva se iz gp32-opt putem PCR povećanja koristeći slijedeće smislene ili besmislene oligomere: 5'-GGT AGA CCT AGG GAT CTG GGG CTG CTC TGG-3'; i, 5'-CCA GAT GAT ATC G CCC GGG C TTA TTA TTT GAT GTA CCA CAG CCA GTT GGT GAT G-3'. Ovi DNK segmenti određeni su sa restrikcijskim enzimima AvrII i EcoRV, a vezani su unutar V1Jns-tPA-gp143/opt32-A (IVD) koji je probavljen sa AvrII i SFiI kako bi se uklonio određeni DNK segment.Dobiveni proizvodi praćeni su DNK sekvenciranjem vezivanja i imuno analizom.

D. V1Jns-tPA-gp140/opt30-B (baziranom na HIV-1III

Ova tvorevina slična je tvorevini IIC osim što je osigurano env proteolitičko mjesto rascjepa.

E. V1Jns-tPA-qp140/opt svi-A:

Env gen ove tvorevine sastoji se iz potupno optimalnog kodona. Stalno područje (C1, C5, gp32) su tako opisana u IVB, D, H sa dodatnim sintetskim DNK segmentima koji se sastoje iz optimalnih kodona za translaciju (vidi primjer niže baziran na HIV-1 MN V1-V5).

F. V1Jns-tPA-gp140/opt svi -B:

Ova tvorevina slična je onoj gore NE osim što env amino kiselinska sekvenca iz veza drugačijih no što je NB korišteni su da označe pogodnu vrijednost uporabe kodona koji prolazi kroz nestabilna (V1-V5) područja.

H. V1Jns-tPA-gp140/opt svi-B (ne-IIB veze):

Ova tvorevina slična je tvorevini IIG osim što je osigurano mjesto env proteolitičkog rascjepa.

Primjer 8

Tvorevina gp160 vakcine:

Tvorevine koje su spravljene u dva oblika (A ili B) ovise o gp160 proteolitičkim mjestima rascjepa kao stoje gore navedeno.

A. V1Jns-rev/eni/:

Ovaj vektor je varijacija jednog od gore opisanih u odjeljku D, osim što čitavo tat područje kodiranja u eksonu 1 je izbrisano ovisno o počinjanju REV otvorenog sustava očitavanja. V1Jns-gp160IIIB (vidi odjeljak A. gore) probavljen je sa Pstl i Kpnl restrikcijskim enzimom kako bi se uklonilo 5'-područje gp160 gena. Povećavanje PCR koristi se radi dobivanja DNK segmenta koji inkodira prvi REV ekson ovisno o Kpnl mjestu u gp160 iz HXB2 kolonirano genoma. Smisleni i besmisleni PCR oligomeri bili su 5f-GGT AGA CTG CAG TCA CCG TCC T ATG GCA GGA AGA AGC GGA GAC-3', i 5'-cca cat ča ggt acc cea taa tag act gtg acc-3'. Ovi oligomeri omogućavaju PstI i KpnI mjesta restrikcijska enzimska mjesta na 5'- i 3'-kraju DNK fragmenta. Dobivena DNK probavljena je s PstI i KpnI, pročišćena elektroforezom gela agara, i vezana sa V1Jns-gp160(Pstl/Kpnl). Dobiveni plazmid potvrđen je probavljanjem restrikcijskog enzima.

B. V1Jns-gp160:

HIVIIIB gp160 kloniran je PCR povećavanjem iz plazmida pF412 koji sadrži 3'-kraj polovice HIVIIIB genoma dobivenog iz HIVHIb klona HXB2. PCR smisleni i besmisleni oligomeri su 5'- GGT AGA TGA TCA ACC ATG AGA ACC ATG AGA GTG AAG GAG AAA TAT CAG C-31, i 5'-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3’. Kozakova sekvenca i translacijsko zaustavljanje kodona su potrctani. Ovi oligomeri omogućavaju Bell mjsto restrikcijskog enzima izvan translacijskog otvorenog sustava očitavanja na oba kraja env gena. (BcII-probavljeno mjesto kompatibilno je za vezivanje sa BgIII-probavljenim mjestom slijedećeg gubitka osjetljivosti za oba restrikcijska enzima. BeII izabran je za PCR-klonirajući gp160, te zbog toga taj gen sadrži unutrašnju BgIII isto kao i mjesta BamHI). Besmisleni oligomeri isto su tako ubačeni na EcoRV mjesto koji ima prednost nad gore opisanom Bell mjestu, za drugi PCR-dobiveni gen. Prošireni ili povećani gp160 gen pročišćava se elektroforezom gela agara, probavlja s Bglll i tretira sa alkalinom fosfataze probavnog sustava. Klonirani gen je veličine oko 2.6 kb a svaka veza gp160 sa VUns potvrđena je DNK sekvenciranjem.

C. V1Jns-tPA-gp160 (baziranom na HIV-1IIIB):

Ovaj vektor sličan je onom iz Primjera 1 (C) gore navedenog, osim što puna-duljina gp160, bez izvorne vodeće sekvence, se dobiva PCR-om. Smisleni oligomeri su isti oni koji su korišteni u l.C. a besmisleni oligomeri su 5'-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-31. Ovi oligomeri omogućavaju Bell mjesta ubačenih na samom kraju isto kao i AcoRV uzvodno od BeII mjesta na 3'-kraju. %'-kraj bc11 mjesta omogućava vezivanje unutar BgIII mjesta VUns-tPA kako bi se stvorio kimerički tPA-gp160 gen inkodirane tPA vodeće sekvence i gp160 bez izvorne vodeće sekvence. Vezivanje proizvoda potvrđeno je restrikcijskim probavljanjem DNK sekvenciranja.

D. V1 Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-A (baziranom na HIV-1IIIB):

Ova tvorevina bazira se na IVH, imajući cjelovit optimalan segment kodona za C5 i gp41, prije nego gp32, sa dodatnim podešenim segmentom kodona (vidi niže) koji zamjenjuje C1 na amino kraju gp120 slijedeći tPA voditelja. Novi C1 segment se pridružuje preostalom gp32 segmentu preko SOE PCR koristeći slijedeće oligomere za PCR koja sintetizira pridruženi C1/143 segment: 5'-CCT GTG TGT GAG TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AAG AAT GAT ACT AAT AC-3'. Dobiveni gp143 gen sadrži optimalnu mogućnost uporabe osim za V1-V5 područja i ima jedinstveni Pmel mjesto restrikcijskog enzima smještenog na vezi C1 i V1 za ubacivanje različitih područja iz drugih HIV gena.

E. V1Jns-tPA-gp160/opt41-B (baziranom na HIV-1IIIB):

Env gen ovog sastava u potpunosti je sadržan od optimalnog kodona kao što je gore opisano. Stalna područja (Ca, C5, gp32) su ona opisana u IND, E, korištena kao kazeta (upotrijebljena za sav u potpunosti optimizirani gp160s) dok se promjenjiva područja, V1-V5 dobivaju iz sintetskog DNK segmenta koji sadrži optimalni kodon.

G. V1Jns-tPA-Qp160/opt svi-B:

Ova tvorevina sličan je tvorevini IIF osim što su env proteolitička mjesta rascjepa zadržala oblik.

H. V1Jns'-tPA-gp160/ svi-A (ne-IIIBveze):

Ova tvorevina slična tvorevini INF koja je gore navedena, osim što su env amino kiselinske sekvence iz veza drugačijih od IIIB korištene radi određivanja optimum uporabe kodona kroz promjenjiva područja (V1-V5). l. V1Jns-tPA-gp160/opt svi-B (ne~IIB- veze):

Ova tvorevina je slična IIIH, osim što mjesto env proteolitičkog rascjepanje promijenilo oblik.

Primjer 9

Tvorevina vakcine qp143:

Ove tvorevine dobivene su PCR-om slično kao drugi tPA-sadržanim proizvodom gore opisanim (tPA-gp120, tPA-gp140, i tPA-gp160), sa tPA voditeljem na mjestu izvornog voditelja, ali usmjerenog ka proizvodnji COOH-označenog, membranski-vezanim env (dobivenim intracelularnom amino kiselinskom sekvencom = NH2-NRVRQGYSP-COOH). Ova tvorevina usmjerena je s ciljem kombiniranja povećanog izlaganja env vođenom tPA introdukcijom i smanjivanjem mogućnosti! da transkript ili petidno područje odgovarajućeg intracelularnog omjera env može negativno utjecati na izlaganje stabilnosti proteina/transporta na staničnu podlogu. Tvorevina je dobivena u dva oblika (A ili B) ovisno o tome dali će se gp16o mjesta proteolitičkog rascjepa ukloniti ili opstati kao što je gore opisano. Ostatak gp41 fragmenta dobiven je skraćivanjem gp143 koji se odnosi kao gp32.

A. V1Jns-tPA-gp143:

Ova tvorevina dobivena je PCR korištenjem plazmida pF412 sa slijedećim smislenim ili besmislenim oligomerima: 5'-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3', SEK.ID: :, i 5'-CCA GAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCC CTG CCT CAC TCT GTT CAC-3'. Dobiveni DNK segment sadrži Bell restrikcijsko mjesto na kraju za kloniranje unutar V1 Jns-tPA/BgIII-probavljenog sa SfiI mjestom koji je smješten odmah na 3'- env otvorenog sustava očitavanja. Tvorevine su potvrđene DNK sekvenciranjem spajanjem veza i imuno analizom transfektrianih stanica.

B. V1 Jns-tPA-gp143/mutRRE-A:

Ova tvorevina bazira se na IVA izrezivanjem DNK segmenta koristeći jedinstveno Muni mjesto restrikcijskog enzima i nizvodnog mjesta SfiI gore opisanog. Ovaj segment reagira na omjer gp120 C5 područja i čitavog gp32. Sintetski DNk segment reagira na~350 bp rev reakcijski element (RRE A) gp 160, sadržavajući optimalni kodon za translaciju, koji se pridružuje kako bi se dobio gp32 segment splitanjem preklopnih produžetaka (SOE) PCR-a, tvoreći AvrII mjesto restrikcijskog enzima ' vezivanjem dva segmenta (ali bez promjena u amino kiselinskim sekvencama). Ova PCR reakcije izvedene su koristeći se slijedećim smiselnim i besmiselnim PCR oligomerima za proizvodnju područja koje sadrži gp32: 5'-CT GAA AGA CCA GCA CT CCT AGG GAT TTG GGG TTG CTG TGG-3' i 5'-CCA CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCC CTG CCT CAC TCT GTT CAC-3' (koji je korišten kao besmisleni oligomer za IVA). Mutirani segment RRE (mutRRE-A) prisružen je sekvenci divljeg tipa gp32 putem SOE PCR, koristeći slijedeće smislene oligomere, 5'-GGT AGA CAA TTG GAG GAG CGA GTT ATA gp32 segment. Dobiveni pridruženi segment DNK probavljen je sa MunI i SrfiI restrikcijskim enzimom i vezan je sa gp143/MunI/SrfI probavljenim plazmidom. Dobivena tvorevina potvrrđena je Dnk sekvenciranjem vezivanja SOE PCR vezama i imuno analizom transfektiranih stanica.

C. V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-B:

Ova tvorevina slična je tvorevini IVB, osim što mjesta env proteolitičkog rascjepa je dobivena koristeći se mutRRE-B segment sintetskog gena na mjesto mutRRE-A.

D. V1Jns-tPA-gp143/opt32~A:

Ova tvorevina dobivena je iz IVB AvrII i SrfI probavljanjem restrikcijskog enzima, praćeno vezivanjem segmenata sintetske DNK koja odgovara gp32, ali se sastoji od optimalnog kodona za translaciju (vidi niže gp32 opt). Dobiveni proizvod potvrđen je DNK sekvenciranjem vezivanja veza i imuno analizom.

E. V1Jns-tPA-Qp143/opt32-B:

Ova tvorevina slična je IVD, osim što mjesto env proteolitičkog rascjepa ne mijenja oblik uporabom IVC kao početnog plazmida.

G. V1Jns-tPA-qp143/SRV-1 3f-UTR:

Ova tvorevina slična je IVA, osim što 3'-UTR dobiven iz simijanskog retrovirusa-1 (SRV-1, vidi dolje), je ubačen unutar SfrI mjesta restrikcijskog enzima odmah ubačenog u 3'-gp143 sustava za otvoreno očitavanje. Ova UTR sekvenca prethodno je opisana kao olakšavajuće rev-ovisno izlaganje HIV env i gag.

H. V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32A:

Ova tvorevina bazira se na IVD, imajući potpuno optimizirani segment kodona za C5 i gp32 sa dodatnim optimiziranim segmentom kodona (vidi niže) koji zamjenjuje C1 na amino kraju gp120 slijedeći tPA voditelja. Novi C1 segment pridružen je zadržanom gp143 segmentu preko SOE PCR. koristeći slijedeće oligomere za PCR radi sintetiziranja pridruženo C1/143 segmenta: 5'-CCT GTG TGT GAG TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AAG AAT GAT ACT AAT AC-3'. Dobiveni gp143 gen sadrži optimalnu uporabu kodona, osim za V1-V5 područja i ima jedinstveno Pmel mjesto restrikcijskog enzima smještenog na vezi C1 i V1 za ubacivanje promjenjivih područja iz drugih HIV gena.

I. V1Jns-tPA-gp143/opt/C1/opt32B:

Ova tvorevina slična je IVH, osim što se ne mijenja oblik mjesta env proteolitičkog rascjepa.

J. V1Jns-tPA-gp143/opt svi-A:

Env gen ove tvorevine potpuno se sastoji od optimalnog kodona. Stalno ili nepromjenjivo područje (C1, C5, gp32) opisani su u 4B, D, H s dodatnim segmentima sintetske DNK koja odgovara promjenjivim područjima V1-V5, koja su ubačena koristeći sintetski DNK segment koji se sastoji od optimalnog kodona za translaciju.

K. V1Jns-tPA-qp143/opt svi~B:

Ova tvorevina slična je IVJ, osim što se ne mijenja oblik mjesta env proteolitičkog rascjepa.

L. V1Jns-tPA-gp143/opt sve-A (ne-IIIB veze):

Ova tvorevina slična je gore opisanoj IIIG, osim što env amino kiselinska sekvenca iz veza drugačijih od onih u IIIB, korištena su radi određivanja optimuma uporabe kodona kroz promjenjiva (V1-V5) područja.

M. V1jns-tPA-gp143/opt sve-B (ne-IIIB veze):

Ove tvorevine slične su gore navedenim IIIG, osim što env amino kiselinska sekvenca iz veza drugačijih od IIIB su korištena radi određivanja optimuma uporabe kodona kroz promjenjiva (V1-V5) područja.

Primjer 10

Tvorevine gp143/glvB vakcine:

Ove tvorevine dobivene su iz PCR-a slično kao i druge tPA-sadržane tvorevine gore opisane (tPA-gp120, tPA-gp140, tPA-gp143 i tPA-gp160), sa tPA kao voditeljem na mjestu izvornog voditelja, ali sa zadaćom da proizvodi COOH-ograničenom, membranskom vezom env kao s gp143. No kako bilo, gp143/glyB tvorevina razlikuje se od gp143 po šestoj amino kiselini koja sadrži intracelularno peptidno mjesto, posljednja 4 su ista kao i ona na karboksilnom kraju Ijudksog glikoforinskog B (glyB) proteina (koji proizvodi imntracelularnu amino kiselinsku sekvencu = NH2-NRLIKA-COOH s potcrtanim ostatkom koji odgovara glyB i "R" zajedničkim za env i glyB). Ova tvorevina ima namjenu da omogući dobivanje env izlaganja i usmjeri svoj cilj na staničnu podlogu potpunim uklanjanjem bilo kojeg transkripta ili peptidnog područja koje odgovara intracelularnoj količini env koja bi mogla negativno utjecati na izlaganje ili stabilnosti transporta proteina u staničnu podlogu zamjenom ovog područja s peptidnom sekvencom iz obilno izloženog proteina (glyB) koji ima kratko citoplazmatsko područje ( intracelularna amino kiselinska sekvenca = NH2-RRLIKA-COOH). Tvorevine su dobivene u dva oblika (A ili B) ovisno o tome dali su gp160 mjesta proteolitičkog rascjepa uklonjene ili zadržale oblik kao stoje gore opisano.

A. V1Jns-tPA-gp143/opt32~A/glvB:

Ova tvorevina slična je IVD tvorevini, osim što je slijedeći PCR oligomer korišten radi zamijenjivanja područja intracelularnog peptida gp143 sa gore opisanim glikoforinom B: 5'-CCA GAT GAT ATC G CCC GGG C TTA TTA GGC CTT GAT CAG CCG GTT CAC AAT GGA CAG CAC AGC-3'.

B. V1 Jns-tPA-gp143/opt32-B/glyB:

Ova tvorevina slična je tvorevini VA, osim što mjesta env proteolitičkog rascjepa zadržavaju oblik.

C. V1Jns-tPA-qp143/opt32-B/qlvB:

Ova tvorevina je ista kao i VA, osim što se prvo nepromjenjivo područje (C1) gp120 zamijenjuje optimalnim kodonom za translaciju kao sa IVH.

D. V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-B/glvB:

Ova tvorevina slična je tvorevini VC, osim što mjesto env proteolitičkog rascjepa ostaje isto.

E. V1Jns-tPA-gp143/opt svi A/glvB:

Env gen ove tvorevine u potpunosti se sastoji od optimalnih kodona kao što je gore opisano.

F. V1Jns-tPA-gp143/opt svi B/glvB:

Ova tvorevina slična je tvorevini VE, osim što mjesto env proteolitičkog rascjepa ostaje isto.

G. V1Jns-tPa-gp143/opt sve A/glvB (ne-IIIB veze):

Ova tvorevina slična je gore opisanoj IIIG, osim pto env amino kiselinska sekvenca iz veza drugačijih od IIIB korištenje radi određivanja optimuma uporabe kodona kroz promjenljivo (V1-V5) područje.

H. V1Jns-tPA-gp143/opt sve B/glvB (ne-IIIB veze):

Ova tvorevina slična je VG, osim što mjesto env proteolitičkog rascjepa ostaje ne promijenjeno. Tvorevina HIV env vakcine sa promjenljivim brisanjima petlji:

Ove tvorevine mogu uključiti sve env oblike koji su gore opisani (gp120, gp140, gp143, gp160, gp143/glyB) ali imaju promjenljive petlje unutar gp120 područja izbrisanog tijekom proprave (npr. V1, V2, i/ili V3).

Svrha ovih ograničenja je uklanjanje peptidnih segmenata koji mogu spriječiti otkrivanje pohranjenih neutralizcijskih epitopa kakv je CD4 vezivajuće mjesto. Na primjer, slijedeći oligomer korišten je u reakciji PCR kako bi se dobilo V1A/2 brisanje susjednih C1 i C2 segmenata: 5'-CTG ACC CCC CTG TGT GTG GGG GCT GGC AGT TGT AAC ACC TCA GTC ATT AGA CAG-3'.

Primjer 11

Stvaranje segmenta sintetskog gena za povećanje izlaganja env gena:

Segmenti gena pretvoreni su u sekvencu koja ima iste translatirane sekvence (osim gdje je primjećano) ali sa drukčijom uporabom kodona kao što je opisano od R. Lathe u istraživačkom članku iz J. Molec. Biol. Vol. 183, pp. 1-12 (1985) naslova "Synthetic Oligonucleotide Probes Deduced from Amino Acid Sequence Data.Theoretical and Practical Considerations". Metodologija koja se odnosi na rev-ovisno izlaganje segmenta HIV env gena oslanja se na naše pretpostavke da poznata nesposobnost za izlaganje ovog gena u stanicama sisavaca, posljedica je radnog transkripcijskog sastava. Zbog toga, koristeći alternativne kodone koji inkodiraju istu proteinsku sekvencu, može ukloniti pritisak na izlaganje env u odsutnosti rev. Provjeravanje uporabe kodona unutar env, otkriveno je da visok procenat tih kodona bilo rijetko korišteno visokim izlaganjem ljudskih gena. Primjena posebnog postupka zamijenjivanja kodona može se opisati kao slijedećom primjenom podataka iz Lathe et al.

1. Identificiranjem mjesta kodona za pogodan otvoreni sustav očitavanja.

2. Poređenje divljeg tipa kodona za kontroliranje učestalosti uporabe ljudskim genima (odnosi se na Tabelu 3 u Lathe et al.)

3. Ako kodon nije baš najbolje uposle, treba ga zamijenit sa optimalnim kodonom za visoko izlaganje baziranom na podatcima iz Tabele 5.

4. Ispitivanje trećeg nukleotida novog kodona i prvog nuklotida susjednog kodona odmah sa 3'-prvog. Ako je 5'-CG-3' parni bio dobiven selekcijom novog kodona, treba ga zamijeniti sa izborom iz Tabele 5.

5. Ponoviti ovaj postupak dok se čitavi genetski segment ne zamijeni.

6. Ispitati novu genetsku sekvencu zbog opasnosti od stvaranja neželjenih sekvenci, nepažljivo prepoznavanja mjesta spletenih krajeva, neželjeno mjesto restrikcijskog enzima, itd.) i zamijenom kodona koji uklanjaju te sekvence.

7. Sakupljanje segmenata sintetskih gena i test za poboljšanje izlaganja.

Ovi postupci korišteni su radi stvaranja slijedećeg segmenta sintetskog gena za HIV env koji je sastavljen od optimalnog kodona za uporabu izlaganja: (i) gp120-C1 (opt); (ii) V1-V5 (opt); (iii) RRE-A/B (mut ili opt); i (iv) gp30 (opt) sa postotcima kodonaskih zamijenjenih nuleotida 56/19, 73/26, 78/28, l 61/25 dobiven za svaki segment. Svaki od ovih segmenata detaljno su opisani sa aktualnom sekvncom koja je dolje prikazana.

gp120-C1 (opt)

Ovo je gp120 segment gena stalnog područja 1 (C1) iz zrelog N-kraja na početku V1 koji mora imati uporabu optimalnog kodona za izlaganje.

[image]

MNV1-V5 (opt)

Ovaj segment gena odgovara dobivenoj proteinskoj sekvenci za HIV MN V1-V5 (1066BP) imajući uporabu optimalnog kodona za izlaganje

[image]

[image]

RRE.Mut (A)

Ovo je DNK segment koji odgovara rev reakcijskom elementu (RRE) HIV-1 koji sadrži uporabu optimalnog kodona za izlaganje. "A" oblik također se uklanja poznata mjesta proteolitičkog rascjepa na gp120/gp41 vezi koristeći nukleotidima koji su podebljani tamnim slovima.

[image]

RRE.Mut (B)

Ovo je DNK segment koji odgovara rev reakcijskom elementu (RRE) HIV-1 koji sadrži uporabu optimalnog kodona za izlaganje. «B» oblik zadržava poznata mjesta proteolitičkog rascjepa na gp120/gp41 vezi.

[image]

gp32 (opt)

Ovo je gp32 segment gena iz Avrll mjesta (počevši odmah na kraju RRE) na kraj gp143 koji sadrži optimalni kodon za izlaganje.

[image]

SRV-1 CTE (A)

Ovo je sintetski genski segment koji odgovara 3'-UTR iz simijanskog retrovirus-1 genoma. Ova DNK je smještena na slijedeći položaj 3'-kraja HIV gena kako bi se povećao rev-ovisno izlaganje.

[image]

SRV-1 CTE (B)

Ovo j'e segment sintetskog gena je sličan SRV-1 CTE (A) kao što je gore opisano osim što se pojedinačna nukeoltidna mutacija koristi (označena tamnim slovima) radi uklanjanja ATTTA sekvence. Sekvenca je povezana s povećanjem okretaja mRNK.

[image]

Primjer 11

Izlaganje in vitro gp120 vakcine:

In vitro izlaganje testirano je u transfektrianim ljudskim rabdomisarkomskim stanicama (RD) za ove tvorevine. Količina izlučenog tPA-gp120 iz transfektiranih RD stanica pokazuje da V1 Jns-tPA-gp120 vektor proizvodi izlučeni gp120.

Izlaganje in vivo gp120 vakcine:

Vidi Sliku 12 (podatci su iz pokusa nad mišem):

V1Jns-tPA-gp120MNPNV-izazavani Razred II NHC-reaktivnost antigena gp120 restrikcijskih T limfocita. Balb/c miš bio je vakciniran dva puta sa 200 jigV1 Jns-tPA-gp120MN koji je žrtvovan, a njihova žuč luči za in vitro određivanje pomoćnog reaktivatora rekombinacije T limfocita gp120. Analize proliferacije T stanica izvode se sa PBMC (periferne mononuklearne stanice) koristeći rekombinantni gp120IIIB (repligen, katalog #RP1016-20) na 5 μg/ml sa 4 x 105 stanica/ml. Bočni nivoi 3H-timidina prihvaćene ovim stanicma dobile su se kultiviranjem stanica u samostalnoj sredini, dok je najveća proliferacija izazvana uporabom kodona ConA stimulacije na 2 μg/ml. ConA-izazvana ponovna aktivnost vrha na -3 dana i obuhvaćen na vrijeme sa kontrolnim uzorcima medija dok se antigenom tretirani uzorci su obuhvaćeni periodom od 5 dana sa dodatnom kontrolom medija. Reakcija vakciniranog miša usporedna je s izvornim singeneičkim mišem. ConA pozitivna kontrola daje veoma visoku proliferaciju i za nevakciniranog i za imuniziranog miša kako je i očekivano. Veoma jak pomoćnik Memorijske reakcije T stanica dobiva se tretiranjem gp120 kod vakciniranog miša, dok nevakcinirani miš uopće ne reagira (na pragu za specifičnu reaktivnost na stimulirajućem (SI) <3-4; SI je izračunata kao stvarni prikaz uzorka cpm/medija cpm.). SI 65 l 14 dobiva se za vakcinaciju miša koji se poredi s anti-gp120 ELISA titerom 5643 i 11,900, za te miševe. Zanimljivo, za ova dva miša bolja reakcija za antitijela daju znakovito nižu reaktivnost T stanica nego u miša koji ima niži titaranti tijela. Ovi pokusi pokazuju daje izlučeni gp120 vektor određen korištenjem antigena koji je heterologno usporedan inkodiranju ubrizgavanja PNV (IIIB vs. MN):

Primjer 12

Vakcine qp160

U dodatku izlučene gp120 tvorevine, dobili smo izlaganje tvorevina za potpuno membransko vezivanje gp160. Obrazloženje za gp160 tvorevinu, u dodatku gp120, su (1) više epitopa koji su pogodni za oba CTL stimulansa isto kao l za proizvodnju neutralizirajući antitijela uključuju i gp41, protiv kojih je sposobno monoklonalno neutralizirajuće antitijelo HIV-a (2F5, vidi gore) usmjereno na: (2) građa izvornog proteina može se dobiti u odnosu na virus-proizvodnju gp160; l, (3) uspješnost utjecaja HA tvorevina na membransku-vezu za imunogenitet [Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993; Montgomery, D., et al., DNA 1 Celi Biol., 12: 777-783, 1993]. Gp160 zadržava osnovnu ili supstancijalnu REV ovisnost čak 1 sa heterolognom sekvencom voditelja peptida, tako da se daljnje tvorevine stvaraju radi povećanja izlaganja u odsutnosti REV-a.

Primjer 13

Analiza za HIV citotoksične T-limfocite:

Postupci koji su opisani u ovom odjeljku prikazuju analizu koja je korištena za vakcinaciju mise. Jedna u osnovi slična analiza se može koristiti za uporabu na primate osim da samostalne B stanične crte se moraju omogućiti uza ljudsku uporabu epštajnovog-barovog virusa IB virusa herpesa kod rezus majmuna.

Periferne mononuklearne krvne stanice (PBMC) dobiveni su iz svježe krvi ili žuči korištenjem fikol-hipak centrifugaciju kako bi se razdvojili eritrociti iz bijelih krvnih zrnaca. Kod miša, limfni čvorići se isto tako mogu koristiti. Efektor CTLs može biti dobiven iz PBMC iz in vitro kulture u IL-2 (20 U/ml) l konkanavalina A (2 ^g/ml) za 6-12 dana ili uporabom specifičnog antigena koji se sastoji od sintetskih peptida (obično 9-15 amino kiselina) poznatih epitopa za CTL prepoznavanje za MHC životinjskih haplotipova, ili cjepivom virusne tvorevine izgrađene za izlaganje pogodnog antigena. Stanice koje su meta mogu biti MHC haplotipne stanice koje mogu biti tretirane radi prikaza pgodnog antigena kao što je opisano za in vitro stimulaciju CTLs-a. Za Balb/c miša P18 peptid (ArgIIeHisIIeGlyArgAla PheTyrThr ThrLys Asn, SEK.ID:51:, za HIV MN veze) se može koristiti na 10 μM koncentracije nestimuliranog CTL in vitro, uporabom ozračenih singeničkih splenocita 1 može se koristiti za sintetiziranje stanica koje su meta tijekom citotoksične analize na 1-10 μM inkubacijom na 37°C oko dva sata. Za ove H-2d MHC haplotipove miša, murinska stanična crta mastocitoma, P815, omogućava dobre ciljane stanice. Antigenski sintetizirane stanice koje su meta napunjene su sa Na51CrO4, koji je dobiven iz unutrašnjosti ciljanih stanica uništavanjem CTL-a, inkubiranjem ciljanih stanica za 1-2 sata na 371 (0.2 mCi za ~5 x 106 stanica), slijedeći nekoliko pranja ciljanih stanica. CTL populacija pomiješana je sa ciljanim stanicama na različiti način u odnosu na učinak na ciljane stanice kao što je 100:1, 50:1, 25:1, itd., peletiranjem istovremeno, l inkubiranjem 4-6 sati na 37°C prije dobivanja supernatanta koji se tada analiziraju radi ostvarenja radioaktivnosti uporabom gama mjerača. Citotoksičnost je izračunata u postotcima ukupnog iznosa iz ciljanih stanica (dobivena uporabom 0.2% Triton X-100 tretiranja) iz kojeg proizlazi spontano ostvarenje iz ciljanih stanica koje su oduzete.

Primjer 14

Analiza za HIV specifična antitijela:

ELISA ima zadaću da otkriva proizvodnju antitijela protiv HIV-a koristeći specifičan rekombinantni protein ili sintetski peptid kao agens supstrata. 96 dobro mikrotitarnih pločica oblaže se preko noći na 4°C sa rekombinantnim antigenom na 2 μg/ml u PBS (posoljeni puferirani fosfat) otopini 50 μ/dobro, na neravnoj tvrdoj podlozi. Antigeni se sastoje od rekombinantnih proteina (gp120, rev: Repligen Corp.; gp160, gp41. American Bio-Technologies, Inc.) ili sintetskih peptida (V3 peptida koji odgovara izolacijskog virusnoj sekvenci iz IIIB, itd.: American Bio-Technologies, Inc.: gp41 epitop za monoklonirajuće antitijelo 2F5). Pločice su ispirane četiri puta, uporabom opranog pufera (PBS/0.05% Tween 20), praćen dodavanjem 200 μl/izvoru zaustavljenog pufera (1% otopine karanfilovog mlijeka u PBS/0.05% Tween-20) za 1 sat na sobnoj temperaturi uz miješanje. Pre-serum 1 imuno serum surazblaženi u zaustavljenom puferu na tavidnoj razini razblaživanja I 100 μl po izvoru.Pločice se inkubiraju za 1 sat na sobnoj temperaturi uz miješanje l tada se peru četiri puta sa ispranim puferom. Sekundarna antitijela sprežu se peroksdazom konjske rotkvice, (anti-rezus Ig, Southern Biotechnology Associates; anti-mišji l anti-zečiji Igs, Jackson Immuno Research) razblažen u 1;2000 u zaustavljenom puferu, kojem se dodaje svaki uzorak na 100 μl/po izvoru o-fenilendiaminske (o-PD, Calbiochem) otopine na 1 mg/ml u 100 mM kiselog pufera na pH 4.5 Pločice su pročitane za absorpciju na 450 nm oba kinetička (prvih deset minuta reakcije) u tijeku 10 i 30 minuta krajnjih točaka (Thermo-max očitač mikropločica, Molekularne jedinice).

Primjer 15

Analiza za HIV neutrlizirajuća antitijela:

In vitro analiza neutralizacije HIV izolatora koristi serum dobiven iz vakciniranih životinja s primjerima kako slijedi. Test seruma i pre-imuni serum inaktiviraju se pri toploti od 56 C za 60 minuta prije uporabe. Prinos titracije HIV-1 dodaje se u 1:2 serijsko razblaživanje testa seruma i inkubira se 60 minuta na sobnoj temperaturi prije dodavanja 105 MT-4 ljudskih limfoidnih stanica kod 96 dobro titritanih pločica. Virus/stanična smjesa inkubiraju se 7 dana na 37°C i analizira za virus-povezano uništavanje stanica bojanjem kultura sa tetrazolij bojom. Neutraliziranje virusa praćeno je sprječavanjem umiranja stanica zaraženih virusom.

Primjer 16

Izolacija gena iz kliničkih HIV izolatora:

Virusni HIV gena kolonira se iz zaraženog PBMC-a koji je bio aktiviran tretiranjem ConA. Preporučljivi postupak za dobivanje virusnih gena je povećavanjem PCR-a iz zaraženog staničnog genoma koristeći poseban oligomer koji se nalazi s bočne strane poželjnog gena.

Drugi postupak za dobivanje virusnih gena je pročišćavanjem virusne RNK iz supernatanta zaraženih stanica i pripravom cDNK iz ovih materijala sa slijedećim PCR-om. Ovaj postupak je sličan gore opisanom za kloniranje murinskog B7 gena, osim za PCR oligomere korištene i prepuštenom heksamerima, korištenim za dobivanje cDNK prije no specifičnog primarnog oligomera.

Genomska DNK pročišćava se iz zaraženih staničnih peleta lizom stanice u STE otopini (10 mM NaCI, 10 mM EDTA, 10mM Tris-HCI, pH 8.0) kojoj se proteinaza K i SDS dodaje u količini od 0.1 mg/ml i 0.5% konačnoj koncentraciji. Ova smjesa se inkubira preko noći na 56 C i ekstrahira sa 0.5 količinom-fenola: kloroforma:izoamil alkohola (25:24:1). Vodena faza se tada ubrzava dodavanjem natrij acetata u 0.3 M konačne koncentracije i dva omjera hladnog etanola. Nakon peletiranja DNK iz otopine, DNK se ponovo odgađa u 0.1 X TE otopini (1XTE = 10mM Tris-HCI, pH 8.0, 1mM EDTA). Ovome se dodaje 0.1% SDS sa 2 U RNK-ze A uz inkubiranje od 30 minuta na 37°C. Ova otopina se ekstrahira sa fenol/kloroform/izoamil alkohol i tada se ubrzava etanolom kao i ranije. DNK se suspendira u 0.1% X TE i nakuplja mjerenjem ultravioletnog napajenja ili upijanja na 260 nm. Uzorci se pohranjuju na -20°C dok se ne upotrijebi PCR.

PCR se izvodi putem Perkin-EImer cetusne opreme a postupak zahtijeva slijede smislene i besmislene oligomere za gp160: 5'-GA AAG AGC AGA CAG TGG CAA TGA -3', i 5'-GGG CTT TGC TAA ATG GGT GGC AAG TGG CCC GGG C ATG TGG-3'. Ovi oligomeri dodaju Srfl mjesto na 3'-kraju dobivenog DNk fragmenta. PCR-dobiveni segment klonira se unutar VUns ili V1R vakcinacijskog vektora,V3 područje je potvrđeno DNK sekvenciranjem isto kao vezivanje mjesta na kojem se ono odvija.

Primjer 17

Proliferacijska analiza T stanica:

PBMCs se dobivaju i testiraju za ponovne reakcije specifičkih antigena kao što je određeno proliferacijom unutar PBMC populacije. Proliferacija se odvija uporabom 3H-timidina koji je dodan u staničnu kulturu kroz najmanje 18-24 sati inkubiranja prije ubiranja. Ubiranje stanica zadržava izotopima sadržane DNK na filterima, ako s proliferacije odvija za vrijeme dok se pretpostavljene stanice ne inkorporiraju izotop koji nije zadržan na filteru slobodnog oblika. Druge stanice glodavaca ili primata 4 X 105 peletirane su u 96 dobro mikrititriranim pločicama ukupno 200 μl cjelokupnog medija (RPMI/10% fetusnog goveđeg seruma). Pozadinske proliferacijske reakcije određene su uporabom PBMCs zasebnog medija, dok se nespecifična reakcija dobiva korištenjem lektina kakav je fitohemaglutin (PHA) ili konkanavalin A (ConA) na 1-5 μg/ml količine koja služi pozitivnoj kontroli. Specifični antigen sadrži poznate peptidne epitope, pročišćeni protein, ili neaktivirani virus. Koncentracija antigena je od 1-10 pM za peptide i 10 μg/ml za proteine. Lecitinom izazvani proliferacijski vrhovi za 3-5 dana inkubiranja stanične kulture, dok se ne postigne specifična reakcija vrha za 5-7 dana. Specifična proliferacija se odvijakada su se izvršila radijacijska mjerenja koji su na najmanje trestruko omotani preko pozadinskog medija i često je dan u omjeru pozadine, ili stimulacijskog indeksa (SI). Poznato ej da se HIV gp160 sastoji iz nekoliko peptida koji izazivaju proliferaciju T stanica od kojih su: T1 (KysGlnIIeIIeAsnMetTrpGlnValGlyLys AlaMet TyrAla;T2(HisGluAspIIeIIeSerLeuTr pGlnGluSerLeuLys) i TH4 (AspARgVeIIIeGlu ValValGlnGlyAal Tyr Arg Ala IIe Arg.). Ovi peptidi prikazani su radi poticanja proliferacije PBMC iz antigena-osjetljivog mise, neljudskih primata, i ljudi.

Primjer 18

Dobivanje vektora V1R:

U težnji da se nastavi optimiziranje naš osnovni vakcinacijski vektor, pripravili smo iz izvedenog V1 Jns koji je označen kao V1R. Svrha ove vektorske tvorevine je dobivanje najmanje veličine vektora vakcine, tj., ben neophodnih DNK sekvenci, koji još uvijek zadržavaju osobine izlaganje optimiziranih heterolognih gena i visok prinos plazmida za dobivanje V1J i V1 Jns. Iz stručnih knjiga kao i pokusa zaključili smo (1) područje unutar pUC u potpunosti sadrži izvornu replikaciju E. coli koja se može ukloniti bez utjecaja prinosa plazmida iz bakterije; (2) 3'područje kan’ gena prateći kanamicinski sustav otvorenog očitavanja, može se ukloniti ako je bakterijski uništač ubačen na njegovo mjesto, i, (3) ~300 bp iz 3'-polovice BGH terminatora može se ukloniti bez utjecaja na regulacijsku funkciju (slijedeći izvornu Kpnl restrikciju enzimskih mjesta unutar BGH elementa).

V1R izgrađen je uz pomoć PCR koji sintetizira stablo DNK segmenata iz VUns koji predstavlja CMVintA promotor/BGHterminator. Restrikcijski enzimi, jedinstveni za svaki segment, dodani su na svaki segment uz korištenje PCR oligomera: Sspl i Xhol za CMVintA/BGH; EcoRV i BamHI za kan' gen; i, Bcll i Sall za on’. Ova enzimska mjesta izabrana su radi toga što omogućavaju izravno vezivanje svakog PCr-dobivenog DNK segmenta sa slijedećim gubitkom svakog mjesta.: EcoRV i Sspl napuštaju DNK oslabljenih krajeva koja je pogodna za vezivanje, dok BamHI i Bell napuštaju komplementarne lance kao što čine i Sali i Xhol. Nakon dobivanja ovih segmenata PCR-om, svaki segment je probavljen sa pogodnim restrikcijskim gore označenim enzimom i tada se veže zajedno u posebnoj reakcijskoj smjesi koja se sadrži od svih stabala DNK segmenata. 51-kraj orf stvoren radi uključivanja T2 ovisnog terminatora sekvence, što je obično nađeno u ovom području tako da se može omogućiti terminacijska informacija za kinemicin otporan gen. Vezani proizvodi potvrđeni su probavljanjem restrikcijskog enzima (<8 enzima) isto kao i DNK sekvenciranje vezivanja lanaca. DNK plazmidski prinos i heterologno izlaganje uporabom virusnih gena unutar V1R odnosi se na sličnu onoj za V1Jns. Redukcija mreže u vektorskoj veličini bio je 1346 bp (V1Jns = 4.86 kb; V1R = 3.52 kb), vidi sliku 11, SEK.ID:45:.

PCR oligomerska sekvenca korištena je za sintetiziranje V1R (mjesto restrikcije enzima je potrctano i označeno u zagradama slijedećih sekvenci):

[image]

(za E. coli izvornik replikacije)

Lanci vezivanja sekvencirani su za V1R, uporabom slijedećih oligomera:

[image]

Primjer 19

Heterologno izlaganje HIV kasnih genskih proizvoda:

Hiv strukturni geni kao što je env i gag zahtijevaju izlaganje HIV regulacijskih gena, rev, sa ciljem da rev-ovisno izlaganje proizvodi potpune proteine. Nađeno je da rev-ovisno izlaganje gag ima veoma nizak stupanj prinosa proteina rđa rev sam može biti otrovan za stanicu. Isto tako, postigli smo relativno visok stupanj rev-ovisnog izlaganja gp160 in vitro imunizacijom sa rev/gp160 DNK. Toi se može postići iz poznatog citotoksičnog učinka rev, isto kao i povećanje poteškoća prei dobivanju rev funkcije u miotubulima koje sadrže stotine nukleida (rev proteini trebaju biti u istom jezgru kao i rev-ovisni transkript u cilju dobivanja rev \ gag proteina). Kako god, moguće je priskrbiti rev-ovisno izlaganje uporabom izabrane modifikacije env gena. 1. rev-ovisno izlaganje env:

Općenito, naša vakcina ima primjenu prvenstveno na HIV (IIIB) env i gag gene za optimiziranje izlaganja unutar našeg dobivenog vektora vakcine, V1Jns, koji se sastoji od CMV-ranije povezanih (IE) promotora, BGH-dobivenog polidenilacijom i transkripcijskom terminacijskom sekvencom, i potpunom pUC. Promjenjivi utjecaji, ovisno o tome koja je širina genskog segmenta korištena (na pr., gp120 vs., gp160), rev-ovisnog izlaganja može biti postignuto za env zamjenjivanjem izvornog sekretornog voditelja peptida u obliku gena aktivatora plazmogena staničja (tpA) i izlaganjanje i dobivanje kimeričkog gena iza CMVIE promotora sa CMV uvođenjem A. tPA-gp120 je primjer izlučenog gp120 vektora stvorenog u svrhu dobivanja dovoljne anti-gp120 imuno relacije kod vaciniranih miševa i majmuna.

Radi izvješća o membranskim-vezanim proteinima, može uzrokovati mnogo veću postojeću (i možda mnogo specifičniju za HIV neutraliziranje) reakciju antitijela poređenu sa izlučenim proteinima isto kao i dobivanju dodatnih epitopa, dobili smo V1Jns-tPA-gp160 i V1Jns-rev/gp160. tPA-gp160 vektor proizvodi izvjesnu količinu gp160 i gp120, bez dodavanja rev, kako je prikazano imno analizom transfektiranih stanica, kao i stupnjevima izlaganja koji su mnogo niži nego oni dobiveni za rev/gp160, re\/-ovisno-gp160-izlaganje plazmida'. To se dešava zbog toga, što, inhibicijska područja, koji potvrđuju rev ovisnost nad gp160 transkriptom, odvijajući se na višestrukim mjestima unutar gp160, uključujući na COOH-kraju gp41. Vektor je dobiven za COOH-odrezane krajeve tPA-gp60 (tPA-gp143) koji ima svrhu povećanja stupnja izlaganja env, uklanjanjem ovih inhibicijskih sekvenci. gp143 vektor također uklanja intracelularnog gp41 područje sadržavajući peptidne motive (kao što su Leu-Leu) poznate kao uzročnici razdvajanja membranskih proteina u lizozome umjesto u na staničnu površinu. Zbog toga, gp143 može povećati stupanj izlaganja env proteina (smanjivanjem rev-ovisnosti) i boljim djelovanjem transporta proteina u stanicu u usporedbi sa potpunim gp160 proteinom koji će bolje provoditi gp160 antitijela slijedeći DNK vakcinaciju. tPA-gp143 kasnije se modificira tihom mutagenezom rev reakcijskom sekvencom elementa (RRE) kako bi se uklonila dodatna inhibicijska sekvenca (350 bp) za izlaganje. Ova tvorevina, gp143/mutRRE, dobivena je u dva oblika: uklanjanjem (oblika ) i zadržavanjem (oblik B) mjesta proteolitičkog rascjepa za gp120/41. Oba oblika dobivena su zbog toga što stručna izvješća o tome da vakcinacijom miša nepovezano gp160 izlaganje u vakcini skrbi veći stupanj antitijela za gp16o koji nije rascijepljenog oblika.

Količina ELISA za gp160/gp120 izlaganje u transfektiranoj stanici razvijeno je radi određivanja relativne sposobnosti izlaganja ovih vektora. In vitro transfekcijom stanica, dobivanjem stanica-povezanih vs. izlučeno/dobivenim, gp120 prinos daje slijedeće rezultate: (1) tPA-gp160 izlaže 5-10X manje gp120 od rev/gp160 u sličnom omjeru koje je ostvareno intracelularno iz stanične podloge, (2) tPA-gp143 daje 3-6X veće izlučivanje gp120 od rev/gp160 sa samo nižim stupnjem stično/povezanog gp143, potvrđujući da citoplazmatski kraj gp160 izaziva intracelularnu retenciju gp160 koji može proizaći iz djelomičnog brisanja ove sekvence; i (3) tPA-gp143/mutRRE A i B daju ~10X veće izlaganje nivoa proteina koji nije izvorni tPA-gp143, dok se uklanjanje proteolitičkog procesiranja potvrđuje oblikom A.

Zbog toga, naša strategija za povećavanje rev-ovisnog izlaganja je korak dalje u stupnju izlaganja isto kao i preusmjeravanje za membranu vezanih gp143 sa staničnom podlogom daleko od lizozoma. Važno je naglastiti da ova tvorevina u koju je moguće ubaciti gp120 sekvencu dobivenu iz različitih primarnih virusnih izolatora, unutar vektorske kazete koja sadrži ove COOH-krajeve (gp41), gdje postoji nekoliko antigenskih različitosti između različitih virusnih veza.

2. Izlaganje gp120 dobivenog iz kliničkih izolatora:

Da bi se primjenila strategija izlaganja na viruse zbog kojih se pokušava doći do vakcine, i da bi se potvrdio naš pristup, također smo dobili tPA-gp120 vektor, koji je dobiven iz primarnog HIV izolatora (sadržavajući sjeverno-američki koncenzus V3 peptidni čvor; makrofagski-tropski i nonsicija-izazvane fenotipove). Ovaj vektro daje visoko izlaganje/izlučivanje gp120 sa 293 transfektirane stanice i proizvodi anti-gp120 antitijela u miša tijekom prikazivanja, da je kloniranje u funkcionalnom obliku. Primarni izolatori gp160 geni također se koriste u izlaganju na isti način kao i gp160 iz laboratorijskih veza.

B. Imuno reakcija na HIV-1 env polinukleotidne vakcine

Učinak vakcine usmjeren je na imuno reakciju u mise: Dok su napori za poboljšanje izlaganja gp160 u tijeku, primijenili smo tPA-gp120 DNK tvorevinu da odredi imuno reakciju na način da ih umanji. Intramuskularna i intradermalna vakcinacija uspoređena je za ovaj vektor na dozu od 100, 10 i 1 μg u miša. Vakcinacija drugog puta proizvodi reakciju antitijela (GMT = 103-104) kod svih recipijenata ili primatelja, kroz 2-3 vakciniranja na sva tri stupnja doza. Svaki put određen je za proizvodnju sličnih titer anti-gp120 antitijela sa čistom doza-ovisnom reakcijom. Kako god, promotrili smo veću promjenljivost reakcija za intradermalnu vakcinaciju, posebno na nižim dozama, slijedeći početnu inokulaciju. Pomoćne reakcije T-stanica, označene antigenskio-specifičnom in vitro proliferacijom i izlučivanjem citokina, su veće pri intramuskularnom vakciniranju.Zaključili smo da intradermalna vakcinacija nije u prednosti u odnosu na intramuskularno davanje ove vakcine.

2. gp120 DNK vakcinom-povezani pomoćnik imuniteta T stanica u miša:

gp120 DNK vakcinacija proizvodi potencijalnog pomoćnika prei rekaciji kod T stanica u limfatičnim česticama testiranim (žuč. krv, mezentericima, zglobovima) sa TH1-sličnim citokinskim izlučivanjem (npr., g-interferon i IL-2 proizvodnja sa malim ili ne IL-4). općenito ovi citokini predstavljaju jak stanični imunitet koji je povezan sa održavanjem slobodnog stanja bolesti za HIV-seropozitivne pacijente. Limfni čvorovi pokazali su na primarnim mjestima za HIV replikaciju, nakupljajući veliki broj spremnika virusa, čak i kada virus ne može biti nađen u krvi. Vakcina koja omogućava anti-HIV imunu reakciju na različitim limfnim mjestima, kao što je prikazano sa našom DNK vakcinom, može pomoći u spriječavanju uspješnog koloniziranja limfatika praćeno početnom infekcijom.

3. env DNK vakcinom izazvana reakcija antitijela:

Afrički zeleni i rezus majmn koji primaju gp120 DNK vakcine, pokazuju nizak stupanj neutralizirajući antitijela kroz 2-3 vakciniranja, koja se ne mogu povećati dodatnim vakciniranjem. Ovi rezultati, kao i povećanje opasnosti na polju HIV vakcine, da oligomrički gp160 je najviše odgovoran kao . antigena za dobivanje neutralizirajući antitijela, nego gp120 monomera, usredotočuju nas na mogućnost dobivanja učinkovitog izlaganja gp160-baziranih vektora (vidi gore). Miš i AGM također su vakcinirani sa primarnim izolatorom dobivenfm tPA-gp120 vekcinom. Ove životinje pokazuju anti-V3 peptide (koristeći homolognu sekvencu) istovjetne titerima antitijela u omjeru 500-5000, pokazujući da dobivena vakcina je uporabljiva i funkcionalna za klinički relevantne virusne izolatore.

gp160-bazirana vakcina, rev-gp160 i tPA-gp160 počinjeni su dobivanju reakcije antitijela u miša i ne ljudskih primata ili imju veoma mali prinos titara antitijela. Naši početni rezultati sa tPA-gp143 plazmidskim prinosom geometrijskog titra (GMT) <103 u miša, i AGM praćen je uz dva vakciniranja. Ovi podatci pokazuju da imamo značajno poboljšan imunogenitet gp160-sličnih vakcina povećanjem izlaganja stupnjeva, tj. nivoa, i mnogo učinkovitiji intracelularni promet env u staničnu podlogu. Ova tvorevina, insto kao i tPA-gp143/mutRRE A i B vektori, nastavit će se radi karakteriziranja reakcije antitijela, posebno neutralizacije virusa.

4. env DNK vakcina CTL reakcije u miševa:

Nastavili smo karakterizirati CTL reakcije RHM koji je vakciniran sa gp120 i gp160/IRES/re\/ DNK. Sva četiri majmuna koja su primila vakcinu, pokazuju značajan MHC Razred 1-smanjenu CTL aktivnost (20-35% uništavanje na izloženu metu = 20) tijekom dva vakciniranja. Nakon četvrte vakcinacije aktivnosti se povećavaju od 50-60% uništavajući pod sličnim testirajućim uvjetima, pokazivajući dodatnu reakciju . CTL aktivnosti traju najmanje sedam mjeseci do konačne vakcinacije oko 50% njihovog vrha, pokazujući da se oblikovao dugačak-kraj memorije.

Claims (10)

1. Sintetski polinukeotidi sadrže DNK sekvencu inkodiranu HIV env proteinom ili njegovim dijelom, naznačeni time, što DNK sekvenca sadrži kodon optimiziran za izlaganje u domaćinu sisavaca.

2. Polinukleotidi iz zahtjeva 1, naznačeni time, što s izabrani iz: [image] [image] i njihovim kombiniranjem.

3. Polinukleotidi iz Zahtjeva 1 koji uzrokuju anti HIV neutralizirajuća antitijela, na HIV specifična imuno reakcija T-stanica, ili zaštitne imuno rekacije se događa u staničju kralježnjaka, uključujući ljudsko staničje in vivo, naznačeni time, što polinukleotidi sadrže gen kodirani HIV gag, gag-proteazu, ili env genetski proizvod.

4. Postupak za izazivanje imuno reakcija kod kralježnjaka protiv HIV epitopa, naznačen time, što, sadrže uvođenje između 1 ng i 100 mg polinuklotida iz Zahtjeva 1 unutar tkiva kralježnjaka.

5. Postupak uvođenja imuno rekacije protiv infekcije ili bolesti izazvanih virusnim vezama HlV-a, nazanačen time, što se uvodi polinukleotid iz Zahtjeva 1 g staničje kralježnjaka.

6. Postupak iz Zahtjeva 5, naznačen time, što dalje sadrži primjenu na HIV, ubijanjem HIV, HIV env proteina, HIV gag proteina, HIV pol proteina, i njihove kombinacije.

7. Vakcina protiv HIV infekcije, naznačena time, da sadrži polinukleotide iz Zahtjeva 1 i njihove frmaceutski prihvatljive nosače.

8. Postupak uvođenja anti-HIV imuno rekacije u primata, naznačeno time, što se uvode polinukleotidi iz Zahtjeva 1 u staničje primata uz primjenu interleukina 12 parenteralno.

9. Postupak uvođenja antiegena naznočnog u stanici radi poticanja citotoksika i pomoćnika proliferacije T-stanica na učinkovitu funkciju uključujući limfokinu sekreciju ili izlučivanje specifičnu za HIV antigene, naznačen time, što se stanice kralježnjaka in vivo izlažu polinukleotidima iz Zahtjeva 1.

10. Postupak povećanja izlaganja DNK koja inkodira HIV protein ili njegove dijelove, naznačen time: (a) identificiranjem mjesta kodona za pogodan sustav otvorenog očitavanja; (b) poređenje divljih tipova kodona za promatranje učestalosti uporabe na ljudske gene; (c) zamijenjivanje divljeg-tipa kodaona sa kodonima optimiziranim za visoko izlaganje ljudskih gena, i (d) testiranje za poboljšanje izlaganja.