JP2000515368A

JP2000515368A - Ｈｉｖエンベロープポリペプチドおよびワクチン

Info

Publication number: JP2000515368A
Application number: JP10505190A
Authority: JP
Inventors: バーマン，フィリップ・ダブリュー
Original assignee: ジェネンテク・インコーポレイテッド
Priority date: 1996-07-08
Filing date: 1997-07-03
Publication date: 2000-11-21
Also published as: ZA975889B; NZ333500A; AP9901432A0; AP1282A; AU727107B2; IL127701A; TWI221846B; US6090392A; WO1998001564A1; AU3567797A; IL127701A0; ID17767A; OA10954A; CA2259965A1; EP0942988A1

Abstract

(57)【要約】ＭＮ−ｇｐ１２０を用いるワクチン試験のブレイクスルー単離物に由来するｇｐ１２０ボリペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、およびコードされたｇｐ１２０ポリペプチドが提供される。１またはそれ以上の単離物に由来するｇｐ１２０ポリペプチドの、通常ＭＮ−ｒｇｐ１２０と同時の、サブユニットワクチンにおける使用は、ワクチンの種（例えば、ＭＮ−ｒｇｐ１２０）とは十分異なった、そのワクチンがその種に対する保護をもたらさないＨＩＶの種に対する保護をもたらし得る。さらに、そのポリペプチドによって誘導された抗体も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＩＶエンベロープポリペプチドおよびワクチン発明の背景発明の属する技術分野本発明は、ＨＩＶエンベロープポリペプチドおよび該ポリペプチドを含むワクチンに関する。関連技術の記載後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）として同定されるレトロウイルスによって引き起こされる。抗体または細胞性応答の誘導に基づいた保護的な免疫応答を誘導するワクチンを開発するために多大な努力がなされてきた。最近の成果は、安全性の理由から、弱毒化または不活化ウイルスよりはむしろＨＩＶタンパク質をワクチンにおける免疫原として用いているサブユニットワクチンを用いてきた。サブユニットワクチンは、ウイルスの表面上にあるＨＩＶエンベロープタンパク質の一部であるｇｐ１２０を通常含んでいる。ＨＩＶエンベロープタンパク質は詳細にわたって記述されており、数多くのＨＩＶ種に由来するアミノ酸およびＨＩＶエンベロープをコードする核酸配列が知られている（Myers,G.ら,1992．Human Retroviruses and AIDS．A complication and analysis of nucleic acid and amino acid sequences．Los Alamos Natio nal Laboratory，Los Alamos，New Mexico）。ＨＩＶエンベロープタンパク質は、そのカルボキシル末端領域で二重膜中に埋め込まれている約１６０ｋｄの糖タンパク質（ｇｐ１６０）である。Ｎ末端部分のｇｐ１２０は、ビリオンをり巻く水性環境中に突き出ており、Ｃ末端部分のｇｐ４１は膜を貫通している。宿主細胞が介在する過程によって、ｇｐ１６０が開裂し、ｇｐ１２０と内在性膜タンパク質ｇｐ４１が形成する。ｇｐ１２０とｇｐ４１の間には共有結合はないので、ときに遊離のｇｐ１２０がビリオンの表面から放出されて細胞に感染する。ｇｐ１２０分子は、６０，０００ダルトンのポリペプチドコアからなり、Ｎ結合型グリコシレーションにより広範囲に修飾されてその分子のみかけの分子量が１２０，０００ダルトンに増えている。ｇｐ１２０のアミノ酸配列は、５つの超可変領域が散在する５つの比較的に保存的な領域を含んでいる。ｇｐ１２０一次配列の１８個のシステイン残基の位置、および約２４個のＮ結合型グリコシレーション部位のうち１３個の位置が、すべてのｇｐ１２０配列に共通である。超可変領域は、多くのアミノ酸の置換、挿入および欠失を含んでいる。この領域における配列の変化は、様々なウイルス単離物に由来するｇｐ１２０分子の間で３０％までの全配列の可変性をもたらす。この変化にも関わらず、すべてのｇｐ１２０配列は、ウイルスレセプターＣＤ４に結合し、ｇｐ４１と相互作用してウイルスと宿主細胞膜との融合を誘導するウイルスの能力を保っている。ｇｐ１２０は、、免疫攻撃に最も便利でありそうなウイルスタンパクであるので、サブユニットワクチンのためのワクチン候補として集中的な調査の対象とされた。現在、ｇｐ１２０ＭＮ種を用いた臨床試験が進行中である。しかしながら、現在まで、ワクチンの効果を確認または反駁するに十分な規模のヒトのワクチン試験はなかった。ヒトにおける自然感染の条件に厳密に近似したＨＩＶ−１感染のin vivoまたはin vitroモデルがないために、ＨＩＶ−１ワクチン候補の開発が煩わされてきた。いくつかのＨＩＶ−１ワクチン候補（Bermanら，J．Virol．7:4464-9(1992) ;Haigwoodら;J．Virol．66:172-82(1992);Salmon-Ceronら;AIDS Res．and Human Retroviruses 11:1479-86(1995)）は、in vitroで様々な異なったＨＩＶ−１単離物を中和することができる広範な交差反応性のある抗体を導き出すことが記載されている。しかしながら、in vivoの保護的免疫に対するin vitro分析の関連性は確かではない。いくつかのワクチンは、ＨＩＶ−１のホモローガスなおよびヘテロローガスな種による攻撃からの保護をチンパンジーにもたらしたが、保護は、Ｔ細胞系、またはレクチン活性化およびサイトカイン活性化末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣｓ）において行ったin vitro中和分析と常に相関するわけではなかった（Bermanら，Nature 345:622-5(1990);Bruckら;Vaccine 12(12):1141-8(199 4);El-Amadら;AIDS 9:1313-22(1995);Girard ら;J．Virol．69:6239-48(1995);およびFulzら;Science 256:1687-1690(1992)）。チンパンジーの成功した保護は有望であり、ワクチンの効果の信頼性のある指標であることが歴史的にわかっているものの、ＨＩＶ−１感染のすべての実験モデルにおける感染の条件は、ヒトにおける自然感染とかなり異なっている。 in vivoおよびin vitro両方の実験的なＨＩＶ−１感染は、in vitroまたはin vivo感染実験のためにウイルスストックを調製するために必要があるＨＩＶ−１のin vitro増殖によって、培養細胞を樹立するために使用される臨床的標本に存在する突然変異体のスペクトルとは異なったウイルス擬種のスペクトルを生じる遺伝的選択を強いられるという制限を受ける（kusumiら;J．Virol．66:875(1992 );Meyerhansら;Cell 58:901-10(1989)）。これらの不確定性のために、さらに、伝染するウイルスの量、最初の複製に関わる部位と細胞のタイプ、およびウイルス伝播のキネティックスに関するより大きな不確定性のために、ワクチンの効果を信頼性をもって予測するための現在利用可能なin vitroまたはin vivo分析の性能は疑問のあるところである。臨床試験に入っているＨＩＶ−１ワクチン候補の１つは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において製造されたＨＩＶ−１のＮＭ種由来の組換えｇｐ１２０（ＮＭ−ｒｐｇ１２０）である（Bermanら;J．Virol．7:4464-9(1992) ）。今日まで、このワクチンの第１相および第２相の免疫原性および安全性の試験において、およそ４９９人の成人が参加した。このようにして集められたデータは、ＮＭ-ｒｐｇ１２０が安全であり免疫原性があり、０、１および６ヶ月免疫スケジュールにしたがって免疫された人の９５％以上において高い力価の中和抗体を誘導することを大いに示唆している（Belsheら;JAMA 272(6):475-80(1994 );McElrath;Seminars in Cancer Biol．6:1-11(1995)）。しかしながら、これら試験の間に、ＮＭ-ｒｐｇ１２０を受けた９人のワクチン受容者が、危険性の高い行動によりＨＩＶ−１に感染した。感染率の低い群および最小限の規模のプラシーボ対照群におけるこれら試験のような小規模の試験には、ワクチンの効果を確認あるいは効果のないことを証明するのに十分な統計上の力はない。しかしながら、ＨＩＶの更なる種に対する保護のための、ｇｐ１２０または別のＨＩＶタンパク質に基づいた効果的なワクチンが、この疾患の広がりを阻止するために依然として探求されている。背景技術の記載組換えサブユニットワクチンはBermanらＰＣＴ／ＵＳ９１／０２２５０（ＷＯ９１／１５２３８として１９９１年１０月１７日に公開された）に記載されている。さらに、例えばHuら，Nature 328:721-724(1987)(ワクシニアウイルスＨＩＶエンベロープ組換えワクチン)；Arthurら，J．Virol．63(12):5046-5053(1989 )（精製されたｇｐ１２０）；およびBermanら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85 :5200-5204(1988)（組換えエンベロープ糖タンパクｇｐ１２０）を参照。ｇｐ１２０についての多くの配列が知られている。本明細書に引用されるＨＩＶ−１_LA1のＩＩＩＢ亜種(substrain)由来のｇｐ１２０の配列は、Muesingら， “Nucleic acid structure and expression of the human AIDS/Lymphadenopath y retrovirus”，Nature 313:450-458(1985)によって決定されたものである。ＨＩＶ−１のＮＹ−５、Ｊｒｃｓｆ、Ｚ６、Ｚ３２１、およびＨＸＢ２種に由来するｇｐ１２０の配列は、Myersら，“Human Retroviruses and AIDS;A complicat ion and analysis of nucleic acid and amino acid sequences”，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，New Mexico(1992)に記載されている。Ｔｈａｉ単離物Ａ２４４の配列は、McCutchanら，“Genetic Variants of HIV-1 in Thailand”,AIDS Res.およびHuman Retroviruses 8:1887-1895(1992)に記載されている。ＭＮ₁₉₈₄クローンは、Gurgoら，“Envelope sequences of two new United States HIV-1 isolates”，Virol．164:531-536(1988)によって記載されている。本明細書に使用されているＭＮ、ＭＮ−ｒｇｐ１２０、ＭＮクローンまたは単離物は、ＭＮ_GNEを意味する。ＭＮ_GNEアミノ酸配列は配列番号２９である。上記の文献はそれぞれ、その全内容が本明細書の一部を構成する。発明の要約ＭＮ−ｒｇｐ１２０を用いるワクチン試験のブレイクスルー単離物由来のｇｐ１２０ポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列およびコードされたｇｐ１２０ポリペプチドが提供される。１またはそれ以上の単離物に由来するｇｐ１２０ポリペプチドの、一般的にはＭＮ−ｒｇｐ１２０と同時の、サブユニットワクチンにおける使用は、ワクチンの種（例えば、ＭＮ−ｒｇｐ１２０）とは十分異なった、そのワクチンがその種に対する保護をもたらさないＨＩＶの種に対する保護をもたすことができる。さらに、そのポリペプチドによって誘導された抗体も提供される。図面の簡単な説明第１図は、ＨＩＶ−１に感染したワクチン受容者におけるＭＮ−ｒｇｐ１２０に応答する抗体のキネティックスを示すものである。血清を表示した時点で集め、ＭＮ−ｒｇｐ１２０と反応する抗体（○）またはＭＮ−ｒｇｐ１２０のＶ３領域から誘導された合成ペプチド（●）について分析した。矢印は注射した日を示す。プラスの印は、最初のＨＩＶ−１感染が検出されたことを示す。影の領域はＨＩＶ−１感染後に集めたデータを示す。ワクチン受容者Ｃ６から得たデータはパネルＡに示し、Ｃ８はパネルＢ、Ｃ７はパネルＣ、Ｃ１１はパネルＤ、Ｃ１０はパネルＥ、Ｃ１７はパネルＦ、およびＣ１５はパネルＧに示す。第２図は、ＨＩＶ−１に感染したワクチン受容者におけるＣＤ４ブロッキング抗体応答のキネティックスを示す。血清を表示した時点で集め、細胞表面ＣＤ４対する［¹²⁵Ｉ］標識したＭＮ−ｒｇｐ１２０の結合をブロックすることが可能な抗体について分析した。矢印は注射した日を示す。プラスの印は、最初のＨＩＶ−１感染が検出されたことを示す。影の領域は、ＨＩＶ−１感染後に採集したデータを示している。ワクチン受容者Ｃ６から得たデータをパネルＡ、Ｃ８はパネルＢ、Ｃ７はパネルＣ、Ｃ１１はパネルＤ、Ｃ１０はパネルＥ、Ｃ１７はパネルＦ、およびＣ１５はパネルＧに示す。第３図は、ブレイクスルーウイルスに由来するエンベロープ糖タンパク（ｇｐ１２０）の推定アミノ酸配列を示した。プロウイルスＤＮＡ配列をＰＢＭＣｓからＰＣＲによって増幅し、ＰＲＫ５発現プラスミドにクローニングした。感染したワクチン受容者からそれぞれ２つのクローンを、２本鎖のプラスミドＤＮＡから配列決定した。ｇｐ１２０の開始メチオニン残基を基準にして配列の番号付けをしている。比較のため、示した配列は、マチュアの、完全にプロセシングされたエンベロープ糖タンパクの第１２位のアミノ酸（ｇｐ１２０オープンリーディングフレームの第４１位に対応する）で始まっている。影の領域は中和エピトープの配列を示しており、黒い囲み部分はＭＮ−ｒｇｐ１２０と反応するウイルス中和ＭＡｂの結合にとって重要と考えられた多形を示している。保存領域（Ｃ）および可変領域（Ｖ）を配列の上部に示している。囲み部分は、配列の相同性と多形性を示している。第４図は、ブレイクスルーウイルスから調製した組換えｇｐ１２０の免疫沈降を示している。７つのブレイクスルーウイルスに由来する組換えｇｐ１２０は、２９３s細胞の一過性トランスフェクションによって調製した。細胞を³⁵Ｓメチオニンで代謝的に標識し、増殖を調節した培養細胞の上清を、ＭＮ−ｒｇｐ１２０に対するポリクローナル抗血清で免疫沈降させた。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、オートラジオグラフィーで視覚化した。Ｃ８レーンａおよびｂはクローンＣ８．３およびＣ８．６に対応し；Ｃ６レーンａおよびｂはクローンＣ６．１およびＣ６．５；Ｃ７レーンａおよびｂはクローンＣ７．２およびＣ７．１０；Ｃ１７レーンａおよびｂはクローンＣ１７．１およびＣ１７．３；Ｃ１１レーンａおよびｂはクローンＣ１１．５およびＣ１１．７；Ｃ１０レーンａおよびｂはクローンＣ１０．５およびＣ１０．７；Ｃ１５レーンａおよびｂはクローンＣ１５．２およびＣ１５．３に対応する。第５図は、ブレイクスルーウイルスに由来する組換えｇｐ１２０に対するモノクローナル抗体の結合を示す。増殖を調節した培養細胞の上清を、ブレイクスルーウイルスエンベロープ糖タンパクの発現を指図するプラスミドで一過性トランスフェクトした２９３ｓ細胞から集めた。反応したｒｇｐ１２０の濃度は、本明細書に記載のｒｇｐ１２０変異体すべてのアミノ末端におけるＨＳＶ−１糖タンパクＤフラッグエピトープに特異的なＭＡｂ５Ｂ６を用い、ＥＬＩＳＡによって測定した。生じたｒｇｐ１２０調製物を、ｇｐ１２０のＣ末端における保存された配列に特異的なポリクローナル抗体でコーティングしたマイクロタイタープレートのウェル上で捕捉した。ｇｐ１２０と反応するウイルス中和モノクローナル抗体の結合をＥＬＩＳＡにより測定した。Ａは、ＨＳＶ−１糖タンパクＤフラッグエピトープに特異的なＭＡｂ（５Ｂ６）による結合；Ｂは、ＭＮ−ｇｐ１２０のＶ３領域に対するＭＡｂ（１０３４）による結合；Ｃは、ＭＮ−ｇｐ１２０のＶ３領域に対応する合成ペプチドに対して生じたＭＡｂ（５０．１）による結合；Ｄは、ＣＤ４に対するｇｐ１２０の結合をブロックすることが知られているヒトＭＡｂ（１５ｅ）による結合である。第６図は、ＨＩＶ−１のＭＮ種のＭＮクローンに由来する成熟エンベロープ糖タンパク（ｇｐ１２０）（配列番号２９）を示す。超可変領域を太字で示し、ＶおよびＣ領域を示す（Modrowら，J．Virology 61(2):570(1987)に従う）。可能性のあるグリコシレーション部位を（^★）で示す。発明の詳細な説明本発明は、ＨＩＶワクチン試験のブレイクスルー単離物に由来するｇｐ１２０ポリペプチドを提供する。さらに、ｇｐ１２０を発現させるために使用し得るブレイクスルー単離物に由来するｇｐ１２０をコードする新規のオリゴヌクレオチド配列も提供する。サブユニットワクチンにおける、通常ＭＮ−ｒｇｐ１２０と同時の、１またはそれ以上の単離物に由来するｇｐ１２０ポリペプチドの使用は、ワクチンの種（例えば、ＭＮ−ｒｇｐ１２０）とは十分異なった、そのワクチンがその種に対して保護をもたらさないようなＨＩＶ種に対する保護をもたすことができる。１つの態様において、ワクチンは、ＭＮ−ｒｇｐ１２０ポリペプチド（配列番号２９）と、最初のワクチンの種には存在していない、そのワクチンの種のものとは十分異なった中和エピトープを含み、ＭＮ−ｒｇｐ１２０ワクチン接種された人においてＨＩＶ−１感染を引き起こすこと（即ちブレイクスルー感染を生じさこと）が可能であったＭＮ様ウイルスに由来するｇｐ１２０ポリペプチドの使用に基づいている。最初のワクチン種の使用によって、そのワクチン種の中和エピトープとは十分異なった更なる中和エピトープを含み、そのワクチン種により誘導された保護を逃れる集団に存在しているウイルスが実験的に決定される。ワクチンにおける最初の代表的なｇｐ１２０ポリペプチドの使用はふるいとして働き、その結果ワクチン種に対して効果的に保護されないウイルスがワクチンを突破し、最初のワクチン種に対して保護されない、ある地理的な領域における更なる種が実験的に決定される。これらのブレイクスルー単離物に由来するｇｐ１２０の使用は、最初のワクチン種には存在していないさらなる中和エピトープを提供することによってワクチン単離物を補い、したがってその地域における複数の異なったウイルス種に対する保護をもたらすより完全なワクチンを作り出す。従来のＨＩＶ−１ワクチン戦略は、相同性アラインメント分析（homology ali gnmentstudy）に基づく、適当なワクチンポリペプチド候補の選択に基づいていた。しかしながら、中和エピトープのいくつかはコンフォメーションに依存しており、これらエピトープのすべての位置が知られていないので、必然的にこの戦略は、特定の地域のためのワクチンに含めるべき中和エピトープを決定することができない。対照的に、本方法は、選択された代表的な種を使用し、十分に異なるがゆえに最初のワクチン接種計画によってもたらされる保護の障壁を突破する種を実験的に決定する。その地域におけるＨＩＶ種からのより完全な保護をもたらすために、それらの種をワクチンに含有させることができる。さらに、それらの種は、ブレイクスルーウイルスに対する保護をもたらすために単独で使用することができる。別の態様では、本発明は、最初のＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列および最初のＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列を含むワクチンでワクチン接種されたワクチン受容者に由来するブレイクスルー単離物ＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列とを含み、そのＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列が適当な担体中に存在しているワクチンを包含する。好ましくは、最初のｇｐ１２０ポリペプチド配列は、その最初のワクチン（即ちブレイクスルー単離物を生じさせるワクチン）が投与された地理的な地域に由来する単離物に存在する１またはそれ以上のｇｐ１２０ポリペプチドに見られる中和エピトープを含む。より好ましくは、最初のｇｐ１２０ポリペプチド配列は少なくとも１つのその地域にとってより一般的な中和エピトープを含み、最も好ましくは最初のｇｐ１２０ポリペプチド配列は、最も一般的な３つの中和エピトープのうちの少なくとも１つを含む。最初のｇｐ１２０ポリペプチド配列として使用するのに適当なｇｐ１２０ポリペプチド配列には、ｇｐ１２０ＭＮ、Ｔｈａｉ単離物Ａ２４４配列（以下「ｇｐ１２０Ａ２４４」とする）、ｇｐ１２０ＭＮ−ＧＮＥ６（配列番号３１、また「ｇｐ１２０ＧＮＥ６」として当技術分野において知られている）、およびｇｐ１２０ＭＮ−ＧＮＥ８（配列番号３３、また「ｇｐ１２０ＧＮＥ８」として当技術分野において知られている）などが含まれる。ｇｐ１２０ＭＮ、ｇｐ１２０ＭＮ−ＧＮＥ６およびｇｐ１２０ＭＮ−ＧＮＥ８は、北米において、最初のワクチンにおける最初のｇｐ１２０ポリペプチド配列として使用するのに特に好ましい。ｇｐ１２０Ａ２４４は、タイのための、最初のワクチンにおける最初のｇｐ１２０ポリペプチド配列として使用するのに特に好ましい。この態様の変法では、ワクチンは２つの異なる（即ち第１および第２の）ｇｐ１２０ポリペプチド配列またはその断片を、ブレイクスルー単離物ＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列と組み合わせて含む。後者は、第１および第２のＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列のいずれか一方またはその両方でワクチン接種されたワクチン受容者に由来し得る。ワクチンの例には、ｇｐ１２０ＭＮ、ｇｐ１２０Ａ２４４、ｇｐ１２０ＭＮ −ＧＮＥ６（配列番号３１）、およびｇｐ１２０ＭＮ−ＧＮＥ８（配列番号３３）の組み合わせを含有するものが含まれる。ｇｐ１２０ＭＮおよびｇｐ１２０Ａ２４４またはｇｐ１２０ＭＮ−ＧＮＥ８（配列番号３３）と、ブレイクスルー単離物ＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列との組み合わせが特に好ましい。ｇｐ１２０ＭＮを含むワクチンでは、ブレイクスルー単離物ＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列は配列番号２、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６および２８からなる群から選択されるＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列およびその断片であり得る。「サブユニットワクチン」は、ウイルスは含まないが、１またはそれ以上のウイルスタンパク質もしくはウイルスタンパク質の断片を含むワクチンを意味するために、当技術分野におけるのと同様、本明細書において使用される。本明細書に使用される「多価の」なる用語は、ワクチンが、異なったアミノ酸配列を有する少なくとも２つのＨＩＶ単離物に由来するｇｐ１２０を含んでいることを意味する。「ブレイクスルー単離物」または「ブレイクスルーウイルス」なる用語は、ワクチン受容者から単離されたウイルスを意味するために、当技術分野におけるのと同様、本明細書において使用される。「アミノ酸配列」、「ポリペプチド配列」、および「ポリペプチド」は、当技術分野におけるのと同様、本明細書において互換的に使用され、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「オリゴヌクレオチド」もまた同様である。ブレイクスルー単離物由来のポリペプチド本発明のｇｐ１２０ポリペプチドは、下の表１に示した７つのブレイクスルー単離物のアミノ酸配列に対応する。本発明のポリペプチドには、表１に示されたＨＩＶｇｐ１２０アミノ酸配列（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５および２７）およびその断片が含まれる。本発明のポリペプチドには、２またはそれ以上のＨＩＶｇｐ１２０またはｇｐ１６０アミノ酸配列に由来する融合した配列が含まれ得る。ポリペプチドは、フラッグエピトープアミノ酸配列のような別のウイルスタンパク質に結合することもできる。「フラッグエピトープ」なる語は、当技術分野におけるように、モノクローナル抗体によって認識されるエピトープを含むアミノ酸配列を意味するために本明細書に使用される。フラッグエピトープは、モノクローナル抗体によって認識されるフラッグエピトープをそれぞれ有している多くの異なる組換えタンパク質の、単独のモノクローナル抗体アフィニティー精製の使用を容易にする。非常に多くのアミノ酸配列がフラッグエピトープとして機能し得る。単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）糖タンパクＤ（ｇＤ−１）のＮ末端配列を便宜上フラッグエピトープとして使用し、その使用は実施例に詳細に記載されている。フラッグエピトープはＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列のＮ末端に便利に融合する。しかし、別法としてアミノ酸配列をアフィニティー精製するためにｒｇｐ１２０配列における中和エピトープを認識するモノクローナル抗体を使用することができ、フラッグエピトープを省略し得る。さらに、様々なシグナル配列を本発明のポリペプチドに結合することができる。ｒｇｐ１２０はＨＩＶ培養細胞においてある程度分泌されるが、宿主細胞から放出（宿主細胞によって分泌）されるエンベロープ糖タンパクの量は、種ごとに大きく異なる。シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をｒｇｐ１２０をコードするヌクレオチド配列につなぐことにより、様々なシグナル配列をポリペプチドに導入して細胞からのｒｇｐ１２０の分泌を促進させることができる。例えば、ＣｈｉｒｏｎＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチドは、ｒｇｐ１２０の良好な分泌をもたらす組織プラスミノーゲンアクチベータ（ＴＰＡ）由来のシグナル配列を含む。更なるシグナル配列が良く知られており、Kaymanら，J．Virol．68:400-4 10(1984)によって記載されたネズミ白血病ウイルス表面タンパク質ｇｐ７０のＮ末端領域が含まれる。表１は、本発明の７つのブレイクスルー単離物それぞれの２つのクローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。クローンは、Ｃ６.１、Ｃ６.５、Ｃ８.３、Ｃ８.６、Ｃ１５.２、Ｃ１５.３、Ｃ７.２、Ｃ７.１０、Ｃ１１.５、Ｃ１１.７、Ｃ１０.５、Ｃ１０.７、Ｃ１７.１、およびＣ１７.３である。これらの配列は、配列番号１〜２８であり、それぞれのクローンについて、最初の配列番号がヌクレオチド配列であり次の配列番号がアミノ酸配列である。ＭＮのアミノ酸配列およびＭＮ−ＧＮＥ６およびＭＮ−ＧＮＥ８のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を後述の配列表に示す。ＭＮ−ＧＮＥ６の配列表において、終止コドンがアミノ酸残基第５１位にみられる。この終止コドンは、ＭＮまたはＭＮ−ＧＮＥ８または別の単離物に由来する対応するアミノ酸をコードするコドンで置き換えることができる。表１クローンＣ６.１クローンＣ６.５クローンＣ８.３クローンＣ８.６クローンＣ１５.２クローンＣ１５.３クローンＣ７.２クローンＣ７.１０クローンＣ１１.５クローンＣ１１.７クローンＣ１０.５クローンＣ１０.７クローンＣ１７.１クローンＣ１７.３表１の配列表に加えて、第３図は７つの単離物のそれぞれのクローンのアミノ酸配列を示している。種々のクローンに由来する対応する残基を四角で囲んでいる。図では、ＭＮ−ｒｇｐ１２０（配列番号２９）に対し、アミノ酸配列を並べている。１つの態様では、本発明のｇｐ１２０ポリペプチドは、ブレイクスルー単離物のうちの１つの配列と同じアミノ酸配列を有している。別の態様では、以下詳細に記載するように、アミノ酸配列の端が切り取られている。別の態様では、本発明のｇｐ１２０ポリペプチド配列は、ブレイクスルー単離物の配列中に１またはそれ以上のアミノ酸のまたは置換、挿入、または欠失を含むことができる。通常、端が切り取られたアミノ酸配列に存在せず且つエピトープを除去するアミノ酸を除き、本発明のｇｐ１２０ポリペプチドは、その単離物のアミノ酸配列と同じ中和抗体を誘導するポリペプチドの能力を変えないような、ブレイクスルー単離物のアミノ酸配列における変更を含むであろう。一般に、本発明のｇｐ１２０ポリペプチドのアミノ酸配列における置換は、特にその領域が中和エピトープを含んでいるｇｐ１２０のＶ２、Ｖ３およびＣ４領域については、保存的置換である。しかし、特に中和エピトープを含まない領域においては、非保存的置換は企図される。保存的置換は、アミノ酸を、同様の大きさと性質を有するアミノ酸で置換する。例えば、疎水性残基または親水性残基を、それぞれ別の疎水性残基または親水性残基で置換する。アミノ酸は以下の群に分けることができる：正に荷電した残基（Ｋ、ＲおよびＨ）；負に荷電した残基（ＤおよびＥ）；アミド（ＮおよびＱ）；芳香族（Ｆ、ＹおよびＷ）；疎水性（Ｐ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭ）；および非荷電性残基（ＳおよびＴ）。通常、ある群に属する残基を、その群の別の構成要素で置き換える。１つの態様において、ｇｐ１２０のＶ２、Ｖ３およびＣ４領域における決定的なアミノ酸残基は、ブレイクスルー単離物における対応する残基と同一である。ｇｐ１２０のＶ２、Ｖ３およびＣ４領域における決定的なアミノ酸残基は、実験の節に記載されている。別の態様では、ｇｐ１２０のＶ２、Ｖ３およびＣ４領域におけるすべてのアミノ酸残基は、ブレイクスルー単離物配列における対応する残基と同一である。ブレイクスルー単離物由来のｇｐ１２０をコードするオリゴヌクレオチド本発明はさらに、ｇｐ１２０の発現させるために使用できる、ブレイクスルー単離物に由来するｇｐ１２０をコードする新規のオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする。オリゴヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであり得、通常はＤＮＡである。数多くのヌクレオチド配列は、遺伝コードの縮重のために同じアミノ酸配列をコードできるが、便宜上、本発明のオリゴヌクレオチドには表１（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６および２８）に示すようなブレイクスルー単離物のヌクレオチド配列が含まれる。通常、本発明のオリゴヌクレオチドは、約５キロベース（ｋｂ）未満、好ましくは３ｋｂ未満である。コードされたアミノ酸配列を発現させるために、オリゴヌクレオチドを転写ユニット中へ挿入することができる。転写ユニットは、セルラインの製造のためにプラスミド中に挿入、ウイルス（例えばワクシニア）中に挿入、またはＤＮＡワクチンとして直接使用することができる。ワクチンタンパク質の製造に適当な転写ユニットはよく知られている。ｐｓｖＩ６Ｂ５と呼ばれる好ましいベクターを配列番号３２に示す。ベクターは、リンカー配列に連結したＨＳＶ−１ｇＤ１シグナル配列を含んでいる。発現させるｇｐ１２０ヌクレオチド配列は、遺伝子のＫｐｎＩ部位で始まる。すべてのｇｐ１２０またはｇｐ１６０配列はこの部位を含んでいるので、いずれのｇｐ１２０ヌクレオチド配列も、同じようにベクター中へ挿入し発現させることができる。ベクターは、ＳＶ４０由来のポリＡ尾部で終わる。本発明のポリペプチド配列の発現に有用であることに加えて、本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ＨＩＶ単離物を検出する診断に使用することもできる。例えば、中和エピトープをコードするオリゴヌクレオチドまたはその一部は、分岐鎖ＤＮＡ診断においてまたはin situハイブリダイゼーション研究におけるプローブとして使用することができる。ワクチン調製適当な担体中の、選択されたブレイクスルー単離物に由来する本発明のｇｐ１２０ポリペプチドを、サブユニットワクチンを製造するために使用することができる。ポリペプチドは単独で使用できるが、一般的にｇｐ１２０ＭＮを含む多価のサブユニットワクチンとして投与する。本発明の１またはそれ以上のｇｐ１２０ポリペプチドに加えて、ワクチンは一般にＭＮポリペプチド（以下、ＭＮ−ｇｐ１２０）を含む。通常、ワクチンは約３〜５の異なるｇｐ１２０ポリペプチドを含むが、３０またはそれ以上の異なるｇｐ１２０ポリペプチドが使用できる。ワクチンにおいて使用するためのｇｐ１２０ポリペプチドの調製はよく知られており、以下に記載されている。選択されたＨＩＶ単離物の使用を除けば、本方法において調製されるｇｐ１２０サブユニットワクチンは従来技術のｇｐ１２０サブユニットワクチンと異ならない。従来技術のｇｐ１２０サブユニットワクチンに関し、所望の純度の程度および抗体形成を誘導するに十分な濃度のｇｐ１２０を、生理学的に許容される担体と混合する。生理学的に許容される担体は、ワクチン用いられる用量および濃度で受容者に対し無毒である。一般に、ワクチンを注射用、通常は筋肉内または皮下注射用に製剤化する。注射のための適当な担体には滅菌水が含まれるが、好ましくは通常の生理食塩水のような生理学的な塩溶液またはリン酸緩衝生理食塩水もしくはリンガーラクテート（ringer's lactate）のような緩衝化された塩溶液が含まれる。ワクチンには一般的にアジュバントを含む。有用なアジュバントには、細胞毒性Ｔ細胞を刺激するＱＳ２１（Quil1aia saponaria、Cambridge Biotec h，Worcester，MAより商業的に入手可能）およびミョウバン（水酸化アルミニウムアジュバント）が含まれる。細胞性のまたは局所的な免疫を増強する種々のアジュバントも使用できる。特に、サイトカンなどの免疫賦活剤をワクチンに含有させることができる。適当な免疫賦活化サイトカインには、インターロイキン− ２（ＩＬ−２）およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）などのインターロイキンや腫瘍壊死因子α（ＴＨＦ−α）が含まれる。ワクチンに含有させることができるさらなる添加剤には、低分子量のポリペプチド（約１０残基未満）、タンパク質、アミノ酸、グルコースまたはデキストランを含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、およびタンパク質を安定化するまたは微生物の増殖を阻止する他の添加剤が含まれる。ワクチンには、他のＨＩＶタンパク質も含むことができる。特に、ｇｐ４１またはｇｐ４１の細胞外部分またはＰ２４、Ｐ１７、およびＰ５５のようなＨＩＶ −１コアタンパク質がワクチンに存在し得る。ｇｐ４１のアミノ酸配列は、ｇｐ１２０の配列よりも保存的であるが、ｇｐ４１は中和エピトープを含んでいる。好ましくは、ワクチンに存在するｇｐ４１は、ワクチンに存在するＨＩＶ単離物に由来する。ワクチンにおいて使用する単離物由来のｇｐ１６０は、ワクチン中のｇｐ１２０と置き換えるかまたはその単離物由来のｇｐ１２０と一緒に使用することができる。別法として、ワクチンにおけるものとは異なる単離物に由来するｇｐ１６０をさらにワクチンに存在させることができる。本発明のワクチンはさらに、１またはそれ以上の可溶性のｇｐ１２０ポリペプチド配列またはその断片を、細胞毒性Ｔ細胞応答を誘導するタンパク質を発現するように特異的に設計された処理されたウイルスと組み合わせて含有し得る。適当な処理されたウイルスは、例えばCanary Poxウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化ヒトヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルスなど）および、Vari cella Zoster（水痘帯状疱疹ヘルペスウイルス）に由来する。上に記載したような例示的な処理されたウイルスを修飾して細胞毒性Ｔ細胞応答を誘導することが可能ないずれかのＨＩＶタンパク質を発現させることができる。典型的には、ｇｐ１２０／処理されたウイルスのワクチンによる免疫の後に１用量またはそれ以上のｇｐ１２０ポリペプチド配列の投与を行い、免疫応答を高める。所望ならば、ウイルスを処理して１またはそれ以上の本発明のｇｐ１２０ポリペプチド配列またはその断片を発現させ、可溶性のｇｐ１２０ポリペプチド配列とともにまたはなしでワクチンにおいて使用することができる。ワクチン製剤は一般に、合計約３００〜６００μｇのｇｐ１２０を、便宜上、約１．０ｍＬの担体中に含む。好ましい製剤は、６００μｇのミョウバンの２倍の重量のｇｐ１２０ポリペプチドを２回に分けて使用することを含む。しかし、より少ない量（例えば、１回用量あたり５０μｇ）を含む製剤を、一般にミョウバンまたは他のアジュバントとともに使用できる。ワクチンに存在するいずれかの単離物に関するｇｐ１２０の量は、ｇｐ１２０の免疫原性によって異なる。例えば、ＨＩＶのいくつかの種に由来するｇｐ１２０は、ＭＮ種に由来するｇｐ１２０（配列番号２９）より免疫原性が低いであろう。異なる免疫原性を有する２つの種を組み合わせて使用する場合、それぞれのウイルスの量の実験的な滴定を行い、ワクチンにおけるそれぞれの種のｇｐ１２０の百分率を決定することができよう。同様の免疫原性を有する単離物については、大体等しい量のそれぞれの単離物のｇｐ１２０がワクチンに存在するであろう。例えば、好ましい態様では、ワクチンはＭＮおよび本発明の種に由来するｇｐ１２０を、担体約１．０ｍＬ中に１種あたり約３００μｇの濃度で含有する。ワクチンが約３０の単離物に由来するｇｐ１２０を含有する場合、約１０〜約５０μｇが使用できる。多価のワクチンにおける免疫原性タンパク質の相対的な量を決定する方法はよく知られており、例えば多価のポリオワクチンにおける種々の単離物の相対的な割合を決定するために使用されている。本発明のワクチンは、従来技術のＨＩＶｇｒ１２０サブユニットワクチンと同じようにして投与する。具体的には、通常、ワクチンをプロトコルにしたがって０、１および６、８、１２ヶ月目に投与する。好ましいプロトコルには、０、１、６および１２ヶ月目での投与が含まれる。免疫操作の後、年１回または年２回のブーストを投与することができる。しかし、免疫過程の間およびその後は中和抗体レベルが検出され得るので、しかるべくプロトコルを調整する。ワクチンは感染していない人に投与する。さらに、従来技術のＨＩＶワクチンのように、ワクチンを血清陽性の人に投与してウイルスに対する免疫応答を増大させることができる。さらに、宿主中で発現させるためにワクチンのためのｇｐ１２０の種をコードするＤＮＡを適当なビークル中で投与することができることも意図する。この方法では、感染した宿主においてｇｐ１２０を産生でき、免疫を繰り返す必要がない。ｇｐ１２０発現ビークルの調製は以下に記載する。本明細書に記載のｇｐ１２０単離物は、上で記載したワクチンとして使用することができるが、アミノ酸配列もまた、免疫原として使用するために単独でかまたは同じタイプの製剤と組み合わせて使用し、免疫原に存在する単離物を認識する抗体を誘導することができる。免疫原は、ワクチンと同じようにして製剤化され、同じ添加剤等を含有し得る。免疫原によって誘導される抗体は、診断において免疫原におけるＨＩＶ種を検出するためにか、またはその種をアフィニティー精製するために使用し得る。ｇｐ１２０ポリペプチド配列およびケモカインレセプターＣＤ４はＨＩＶ−１に対する主要な細胞レセプターであるが、ＨＩＶ−１の細胞への侵入には十分でない。ＣＤ４とともに必要であるコレセプターが同定されている。これらのコレセプターは、７回膜貫通型Ｇタンパク質結合レセプターのケモカインレセプターファミリーの一員である。ケモカインスーパーファミリーは、アミノ末端のシステイン間隔に基づいてさらに２つの群に分類される。ＣＸＣケモカインは、主に好中球介在性炎症に関与し、ＣＣケモカインは慢性炎症に関わる傾向にある。ＣＣ−ＣＫＲ１−５（当分野でＣＣＲ１−５としても知られている）と呼ばれる少なくとも５つのＣＣケモカインレセプターとＣＸＣ−ＣＫＲ１−４（ＣＸＣＲ１−４としても知られている）と呼ばれる少なくとも４つのＣＸＣケモカインレセプターが同定されている。 αケモカインレセプターfusinとも呼ばれているＣＸＣ−ＣＫＲ−４（ＣＸＣＲ−４）は、Ｔ細胞親和性ＨＩＶ種の侵入コファクターとして働く。βケモカインレセプターと呼ばれているＣＣ−ＣＫＲ−５（ＣＣ−Ｒ５）は、ＣＣ−ＣＫＲ −２ｂおよびＣＣ−ＣＫＲ３などのその関連するファミリー構成員と一緒になってマクロファージ親和性ＨＩＶ−１種の侵入コファクターとして働く。Ｔ細胞親和性種は、初期のＴ細胞およびＴ細胞系に感染し得るがマクロファージには感染しないのに対し、マクロファージ親和性種はマクロファージと初期のＴ細胞に感染し得るがＴ細胞系には感染しない。Ｔ細胞親和性種およびマクロファージ親和性種は、その全内容が本明細書の一部を構成するDengら，Nature 381:661-666（ 1996）においてより十分に議論されている。Ｔ細胞親和性種の例には、ＩＩＩＢおよびＭＮなどの実験室的単離物が含まれる。マクロファージ親和性種には、Ａ２４４、ＧＮＥ６、ＧＮＥ８およびｇｐ１２０ベースのワクチンによって免疫されたワクチン受容者に由来するブレイクスルーウイルスが含まれるがこれらに限られない主要な単離物が含まれる。両親和性種は、両方のタイプのコレセプターを使用でき、ＣＸＣ−ＣＫＲ−４によってかまたは１またはそれ以上のＣＣ−ＣＫＲファミリーの構成員、好ましくはＣＣ−ＣＫＲ−５、ＣＣ−ＣＫＲ−２ｂ、またはＣＣ−ＣＫＲ−３によって細胞に入る。本発明はいずれか一つの理論によって束縛または限定されることを意図しないが、Ｔ細胞親和性およびマクロファージ親和性ＨＩＶ−１種の侵入は、ウイルス種間の細胞親和性の違い、多くのＣＤ４トランスフェクトした非霊長類細胞によるＨＩＶ−１感染に対する耐性、およびヒトの集団の一部のＨＩＶ−１感染耐性の統一的な説明を与えるものとして信じられている。したがって、１つの態様では、（１）マクロファージ親和性のＨＩＶ−１種に由来する第１のｇｐ１２０ポリペプチド配列またはその断片および／またはＴ細胞親和性種に由来する第２のｇｐ１２０ポリペプチド配列またはその断片を、（２）第１および／または第２のＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列でワクチン接種されたワクチン受容者に由来するブレイクスルー単離物ＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列またはその断片といっしょに含んでいるワクチンである。好ましくは、ワクチンは、異なったケモカインレセプターに結合する少なくとも２つのｇｐ１２０ポリペプチド配列を含んでいる。一つの態様では、ワクチンは、異なるケモカインレセプターに結合する第１および第２のｇｐ１２０ポリペプチド配列を含んでいる。さらに、ブレイクスルー単離物ｇｐ１２０ポリペプチド配列は、第１および第２のポリペプチド配列のどちらか一方かまたはその両者に結合したケモカインレセプターとは異なるケモカインレセプターに結合し得る。好ましいＴ細胞親和性種は実験室的単離物であり、最も好ましくはＭＮである。本発明において使用するための好ましいマクロファージ親和性ウイルスはＧＮＥ６およびＧＮＥ８であり、それらは本明細書に開示されるブレイクスルーウイルスの代表であり、それらのｇｐ１２０がＣＸＣ−ＣＫＲ−５のようなＣＣケモカインレセプターへの結合に関与するｇｐ１２０配列（例えばＶ３領域）を認識する抗体の形成を誘導する点においてＭＮとは異なっている。一つの態様では、ＨＩＶ感染は、上記のような、１またはそれ以上のケモカインレセプターに結合するｇｐ１２０ポリペプチド配列または適当なケモカインレセプターに結合する領域を含むその断片をワクチンにおいて投与することにより阻止される。好ましくは、ワクチンはさらに、１またはそれ以上のＣＤ４結合性ｇｐ１２０ポリペプチド配列または適当なその断片も含む。このようなワクチンは、ウイルスｇｐ１２０−ケモカインレセプターまたはウイルスｇｐ１２０−ＣＤ４の結合を阻止する抗ＨＩＶ抗体を誘導する。さらに、このようなｇｐ１２０ポリペプチドは、ＣＤ４またはケモカインレセプターのようなＨＩＶ感染に関わる１またはそれ以上のコレセプターに結合することにより、ＨＩＶ感染を直接阻止することができ、ゆえにＨＩＶ感染の処置において予防的または治療的効果をもたらす。好ましくは、この目的に有用なｇｐ１２０ポリペプチド配列は、Ｔ細胞結合（ＴＣＢ）領域を含んでいる。ＣＣケモカインレセプターファミリーに関して、ケモカインレセプター結合性ｇｐ１２０ポリペプチドの様々な使用を以下に議論する。しかし、当業者は、この議論がＨＩＶ感染におけるコファクターとして働くＣＸＣケモカインレセプターにも同等に適用されるということを認識する。ｇｐ１２０ポリペプチドは、ワクチンまたは免疫原としての使用について記載したように、１またはそれ以上のｇｐ１２０ポリペプチドを含む組成物として使用できる。組成物は、感染の危険性があるかまたはこのような治療が必要な患者に、本明細書に記載された投与量と経路および投与手段を用いて、予防的にまたは治療的に投与できる。但し、長期的な投与が好ましいこともあり、投与量はしかるべく調整することができる。in vivo投与はまた、ウイルスｇｐ１２０に結合し、さらにはさらにウイルスのＣＣ−ＣＫＲへの結合を阻止する抗体を誘導できるということが注目される。ｇｐ１２０ポリペプチドはまた、ＣＣ−ＣＫＲのアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイに使用できる。例えば、単離され、ある表面（例えばプラスティックの皿）に結合するかまたは組換えによりもしくは天然に細胞表面に発現されたＣＣ−ＣＫＲＣＣ−ＣＫＲレセプターに対するｇｐ１２０の結合の阻止についてアンタゴニスト候補をスクリーンできる。アンタゴニストは、ｇｐ１２０に結合するかまたはレセプターに結合し得る。好ましい候補となるアンタゴニストにはｇｐ１２０化合物、小さなｇｐ１２０ペプチド（５〜２０アミノ酸の長さ、好ましくは７〜１０アミノ酸の長さ）またはレセプターに結合するｇｐ１２０のペプチド模擬物、ｇｐ１２０に結合するモノクローナル抗体、およびｇｐ１２０またはレセプターのどちらかに結合する小さな有機分子が含まれる。ｇｐ１２０ポリペプチドによって誘導される抗体はまた、ＣＣケモカインに結合する抗イディオタイプ抗体を誘導するために使用できる。これらの抗イディオタイプ抗体は、抗ｇｐ１２０ポリペプチド抗体に対する結合およびｇｐ１２０がＣＣ−ＣＫＲレセプターに結合することを阻止することについてスクリーンすることができる。このような抗イディオタイプ抗体は、ＣＣ−ＣＫＲレセプターに結合することによりｇｐ１２０を模擬する。このような抗体、好ましくはヒトの抗体は、組み合わせライブラリーに由来するヒトの抗体のような、数多くの方法で得ることができる（例えば、Burtonら，Adv．Immunolo．(1994)57:191-280）。現在、免疫により、内因性の免疫グロブリンを産生することなくヒトの抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を作出することが可能である。例えば、キメラおよびジャームライン突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体産生の完全な阻止をもたらす。このようなジャームライン突然変異マウスにおけるヒトジャームライン免疫グロブリン遺伝子配列の導入は、Jakobovitisら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:2551(1993);Jakobovitsら，Nature 362:255- 258(1993);Bruggermannら，Year in Immuno．7:33(1993)に記載されているように抗原投与によってヒト抗体の産生をもたらす。別法として、McCafferty，Nature 348:552-553(1990)に記載されているファージ展示技術を使用して、免疫されていないドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）領域遺伝子レパートリーからin vitroでヒト抗体および抗体断片を製造することができる。この技術によれば、抗体Ｖ領域遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄのような繊維状バクテリオファージの主要なまたは副次的なコートタンパク質遺伝子のいずれかの中でインフレームで閉じ込め、ファージ粒子の表面上で機能的な抗体断片として展示される。繊維状の粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含んでいるので、抗体の機能的な特性に基づいた選択によって、その特性を示す抗体をコードする遺伝子を選択できる。ファージ展示は、例えばJohnsonら，Current Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993)に概説されているように様々な形式で行うことができる。Ｖ遺伝子断片のいくつかの起源がファージ展示に使用できる。Clacksonら，Na ture，352:624-628(1991)は、免疫されたマウスの脾臓から得られたＶ遺伝子の、小規模のランダムに組み合わせたライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様な配列を単離した。免疫されていないヒトのドナー（または胚細胞）に由来するＶ遺伝子のレパートリーを構築し得る。多様な抗原（自己抗原を含む）の配列に対する抗体は、Marksら，J．Mol．Biol.，222:581-597(1991)、またはGriffith ら，EMBO J.，12:725-734(1993)に記載された技術に本質的に従って単離できるということが示されている。自然の免疫応答では、抗体遺伝子は高い率で突然変異（体細胞超突然変異）を蓄積する。導入された変化のいくつかがより高いアフィニティーをもたらし、高いアフィニティーの表面免疫グロブリンを示しているＢ細胞が優先的に複製され、後の抗原投与の間に分化する。この自然の過程は、「チェーン・シャッフリング(chain shuffling)」として知られる技術（Marksら，Bio/Technol．10:779-78 3(1992)）を用いることにより模擬することができる。この方法では、重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を、免疫されていないドナーから得られた自然に生じたＶ領域の突然変異体（レパートリー）のレパートリーで逐次的に置き換えることによって、ファージ展示によって得られた“一次（primary）”ヒト抗体のアフィニティーを高めることができる。この技術は、ｎＭの範囲のアフィニティーを有する抗体および抗体断片の製造を可能にする。非常に大規模のファージ抗体レパートリーを製造するための方法は、Waterhouseら，Nucl．Acids Res.，21:2265- 2266(1993)に記載されている。従って、ＣＣ−ＣＫＲに結合する抗体は、上記のように組み合わせライブラリーまたは他の系におけるバクテリオファージの表面で発現した抗体またはその断片を、レセプターに対するｇｐ１２０の結合を阻止するｇｐ１２０モノクローナル抗体でスクリーニングすることによって得ることができる。ｇｐ１２０抗体による抗体のスクリーニングに加えて、ランダムまたは組み合わせペプチドライブラリーを本発明のｇｐ１２０抗体またはｇｐ１２０化合物のいずれかでスクリーニングすることができる。１００万〜１０億の異なる配列に及ぶペプチドの大きなコレクションを含んでなるライブラリーからペプチドリガンドを同定する方法が利用可能であり、その配列をモノクローナル抗体または標的分子を用いてスクリーンすることができる。この技術の能力は、ライブラリーにおける非常に多くの配列とカップルしたアミノ酸の化学的多様性に由来する。例えば、Scottら，Cur．Open．Biotechnol．5(1):40-8(1994);Kenanら，Trends Biochem．Sci．(1994)19(2):57-64参照。従って、本明細書に記載したように製造されたモノクローナル抗体、好ましくはヒトのモノクローナル抗体またはその断片は、ＨＩＶ感染または疾患の進行を阻止または処置することによる処置、並びに更なる医薬を同定するためのスクリーニングアッセイにおける使用を提供する。ｇｐ１２０の製造ワクチンのためのｇｐ１２０は、従来技術のＨＩＶサブユニットワクチンと同様にいずれかの適当な手段によって製造し得る。組換えにより製造されたまたは化学的に合成されたｇｐ１２０は、安全性の理由から、ＨＩＶから直接単離されたｇｐ１２０よりは望ましい。ｇｐ１２０の組換えによる製造の方法を以下に記載する。ブレイクスルー単離物に由来するｇｐ１２０をコードし、ｇｐ１２０を発現することができるオリゴヌクレオチドは、慣用の手段によって製造し得る。例えば、ヌクレオチド配列を合成し得る。あるいは、ｇｐ１２０をコードする別のＨＩＶヌクレオチド配列を土台として用い、部位特異的突然変異誘発によるように、いずれか異なる残基で改変することができる。部位特異的突然変異誘発は、Kunk elら，Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)82:488-492(1985)およびZollerら，Nuc．A cids Res．10:6487-6500(1982)に記載されており、よく知られている。好ましい態様では、ヌクレオチド配列は、コードされたタンパク質の発現のためのプロモーターの転写および翻訳条件下で、ｇｐ１２０をコードするＤＮＡを含む発現構築物中に存在する。プロモーターは、哺乳類細胞における発現のための真核プロモーターであり得る。プロモーターを拡張するまたは原核宿主においてｇｐ１２０を製造することを望むならば、プロモーターは原核プロモーターでよい。通常、高レベルの転写と発現をもたらすために強力なプロモーターを使用する。発現構築物は、適当な細胞宿主における安定な染色体外の維持を可能にするベクターの一部であり得るか、または宿主ゲノムに組み込まれてもよい。普通、発現構築物にマーカーを付与してその構築物を含む宿主の選択を可能にする。マーカーは、同じかまたは異なるＤＮＡ分子上に存在し得るが、望ましくは同じＤＮＡ分子上に存在する。発現構築物は、目的の宿主細胞によって認識される複製系に連結することができる。様々な複製系には、レトロウイルス、シミアンウイルス、ウシ乳頭腫ウイルスなどに由来するウイルス複製系が含まれる。さらに、構築物を増幅可能な遺伝子、例えばＤＨＦＲ遺伝子に連結して、ｇｐ１２０の複数のコピーが作られるようにすることができる。構築物の宿主細胞への導入は、その構築物によって異なるが、いずれかの便利な手段によって達成することができる。広く様々な原核および真核宿主をタンパク質の発現に使用することができる。好ましくは、ｇｐ１２０は、天然のｇｐ１２０と同じグリコシレーションおよびジスルフィド結合を生じる哺乳類細胞において発現させる。ｇｐ１２０およびｇｐ１２０の断片の、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ−１）のＮ末端配列を組み込んでいる融合タンパク質としての哺乳類細胞における発現は、Lasky，L．A.ら，1986（組換えエンベロープ糖タンパク質に対する抗体によるＡＩＤＳレトロウイルスの中和）Science 233:209-212およびHaf far，O．K.ら，1991（ＨＩＶ−１ｇｐ１６０の細胞質尾部は細胞膜と合する領域を含んでいる）Virol．180:439-441にそれぞれ記載されている。ｇｐ１２０を発現させるための好ましい方法は、実施例に記載されている。実施例では、ヘテロローガスなシグナル配列をタンパク質の便利な発現のために使用した。しかし、天然のシグナル配列を使用してタンパク質を発現させることもできる。単離、精製された、表１に示されたアミノ酸配列のうちの１つを有する、ｇｐ１２０ポリペプチドは、慣用の方法によって製造することができる。例えば、タンパク質を化学的に合成することができる。好ましい態様では、本発明の発現構築物を使用してタンパク質を哺乳類細胞において発現させることができる。発現したタンパク質は、慣用の手段によって精製することができる。好ましい精製方法は実施例に記載されている。ｇｐ１２０フラグメント本発明はさらに、ワクチン製剤中で使用するための、抗体の誘導に使用するのに適当なｇｐ１２０断片を提供する。本明細書において用いられるように、端が切り取られたｇｐ１２０配列は、ｇｐ１２０のアミノまたはカルボキシ末端のいずれか一方で始まる完全なｇｐ１２０配列の一部がないｇｐ１２０の断片である。本発明の端が切り取られたｇｐ１２０配列にはＣ５領域がない。ｇｐ１２０のＣ５領域はその分子の主要な免疫原性部位である。しかし、その領域に対する抗体はウイルスを中和しない。従って、セロタイピングについての抗体を誘導するのに使用される免疫原から、ｇｐ１２０のこの部分を除去することは有用である。別の態様では、端が切り取られたｇｐ１２０配列にはさらに、カルボキシ末端領域からｇｐ１２０Ｖ５領域のおよそ第４５３位のアミノ酸残基までがない。配列に残っているＶ５領域のその部分が、発現構築物を調製するのに便利な制限部位を提供する。しかし、ｇｐ１２０Ｖ５領域全体がない、端が切り取られたｇｐ１２０配列もまた、抗体の誘導に使用するのに適当である。さらに、ｇｐ１２０のアミノ末端の部分を、その端が切り取られたｇｐ１２０配列から除去することもできる。特に、その端が切り取られたｇｐ１２０配列は、ｇｐ１２０シグナル配列がなくてもよい。端が切り取られたｇｐ１２０配列はカルボキシ末端からｇｐ１２０Ｃ１領域の第１１１位のアミノ酸残基がなくてもよく、Ｃ１領域の大部分が除去されているが便利な制限部位は保存されている。しかし、Ｃ１領域からジスルフィド結合を形成するＶ２システイン残基までの部分をさらに除去することができ、その結果、端が切り取られたｇｐ１２０配列にはカルボキシ末端からｇｐ１２０Ｃ１領域のアミノ酸第１１７位の残基までがなくなる。好ましい態様では、端が切り取られたｇｐ１２０配列には、ｇｐ１２０のアミノ末端からＣ１領域の第１１１位の残基までと、第４５３位の残基からｇｐ１２０のカルボキシ末端までがない。端が切り取られたｇｐ１２０配列は、前に記載されたように、組換え工学により製造することができる。便利には、端が切り取られたｇｐ１２０配列をコードするＤＮＡを、シグナル配列をコードするヘテロローガスＤＮＡ配列に連結する。具体的な問題または状況に対する本発明の教示の適用は、本明細書に含まれる教示に照らしてその分野における通常の技術を有する者の能力の範囲内である。本発明の生成物とその単離のための代表的な方法、使用、および製造の例を、以下に明らかにするが、本発明を限定するものと解釈してはならない。本明細書におけるすべての文献の引用は、参考のため特に本明細書の一部を構成するものとする。実施例材料および方法ヒトのボランティア由来の標本コレクション。国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって支援された第Ｉ相（ＮＩＨプロトコルＡＶＥＧ０１６）および第ＩＩ相（ＮＩＨプロトコルＡＶＥＧ２０１）ＨＩＶワクチン試験に参加している間にＨＩＶ−１に感染した、ＭＮ−ｒｇｐ１２０で免疫された人から血液を集めた。試験における患者の人口統計、および試験の計画は、McElirath;Seminars in Canc er Biol．6:1-11(1995);McElrathら;Abstracts form Eighth Annual Meeting of the National Cooperative Vaccine Development Groups for AIDS. Bethseda，MD 216(1996)に記載されている。標本は、参加施設の試験施設内審議委員会によって承認されたインフォームドコンセントプロトコルに従って得た。実験のセクションでは、ＨＩＶ−１感染の時をＮＩＨＡＩＤＳワクチン評価ネットワークによって提供されたデータに関して特定し、ここではＨＩＶ−１感染を検出するためにＰＣＲ（ＲＮＡ）および／または血清学的分析を用いた。ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質をクローニングするための試料調製。ＨＩＶ−１感染したワクチン受容者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を、ヘパリン化した静脈血から、ＦＩＣＯＬＬ−ＨＹＰＡＱＵＥグラジェント遠心分離によって調製した。細胞数と生存能力を測定した。分離の後、ＰＢＭＣｓをリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、ＰＣＲ溶解緩衝液（５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８.４）、２.５ｍＭＭｇＣｌ、０.１mg/mLゼラチン（Sigma ）、０.４５％ＮＯＮＩＤＥＴＰ４０洗浄剤、０.４５％ＴＷＥＥＮ２０洗浄剤（洗浄剤は両方ともUnited States Biochemical Corp.から商業的に入手可能である）および０.０６ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（Gibco BRL））中に細胞密度６×１０⁶細胞／ｍＬに懸濁して細胞を溶解した。リゼートを５０〜６０℃で１時間インキュベーションした後、１０分間９５℃でプロテイナーゼＫを不活化した。リゼートを冷凍し、使用するまで−７０℃で保存した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅。試料を、以下に記載するネステッド（ nasted）プライマーを用いて２回のＰＣＲ増幅に付した。１回目では、ＰＢＭＣリゼートの２５μＬアリコート（約１μｇのゲノムＤＮＡを含む）を、４００μ Ｍの各ｄＮＴＰ、２００μｇ／ｍＬのＢＳＡ（Sigma Chemical Corporation，RI A grade）および５０ｍＭＫＣｌ中の各プライマー約１００pmole、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８.４）および３ｍＭのＭｇＣｌを含む同体積のＰＣＲ反応ミックスと混合した。最初の１０分間の９５℃での解離段階の後、Ｔａｐポリメラーゼ（ＡＭＰＬＩＴＡＱ，Perkin Elmer Cetus）５単位を５５℃の浸漬段階中に加え、試料をミネラルオイルで被覆した。ＰＣＲプロファイルは以下のとおりである：５５℃で１分間、７２℃で２.５分間および９４℃で１分間を２サイクル、その後、５５℃で３０秒間、７２℃で２.５分間および９４℃で４５秒間を２８サイクル、そして７２℃での伸張段階を５分間。１回目の反応から得られた１０μＬのアリコートを、上記の試薬とプロファイルかまたはＰＣＲオプティマイザーキット（Invitrogen）に記載された試薬とプロファイルのいずれかを用いて、最終反応体積１００μＬ中で適当なネステッドプライマーにより再増幅した。ＰＣＲ反応生成物を、ＱＩＡＱＵＩＣＫスピンカラム（Quiagen Inc.）を用いて精製した。１回目に使用したプライマーペアは、逆方向の１２０.ｏｓ.Ｒ（第７８３６〜７８５９位の５'−ｇｇｔｃｔａｇａａｇｃｔｔｔａＧＣＣＣＡＴＡＧＴＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴ−ＣＣ）（配列番号３６）と組み合わせた、前進方向の１２０.ｏｓ.Ｆ（ＨＩＶＰＶ２２の第６２４８〜６２７０位のホモローガス配列を有する５'−ｇｇｇａａｔｔｃｇｇａｔｃｃＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡ）（配列番号３４）またはＪＭ１１Ａ（第６０４８〜６０７４位の５'−ｃｔｃｇａｇ−ＣＴＣＣＴＧＡＡＧＡＣＡＧＴＣＡＧＡＣＴＣＡＴＣＡＡＧ）（配列番号３５）［Kusumiら；J ．Virol．66:875(1992)］のいずれか一方である。内部のネステッドプライマーは、１２０.ＢＸ.Ｆ（第６３８９〜６４１０位の５'−ｇｇｇｃｇｇａｔｃｃｔｃｇａＧＧＴＡＣＣＴＧＴＲＴＧＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡ；Ｒ：ＡまたはＧ）（配列番号３７）および１２０.ｉｓ.Ｒ（第７８１９〜７８４１位の５'−ｇｇｔｃｔａｇａａｇｃｔｔｔａＴＧＣＴＣＣＹＡＡＧＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＡＣＡ；Ｙ：ＴまたはＣ）（配列番号３８）であった。ヘテロローガスプライマー配列は小文字で示している。ＰＣＲ生成物のサブクローニングおよび組換えエンベロープ糖タンパク質の融合タンパク質としての発現。ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０配列をクローニングし、キメラ遺伝子および融合タンパク質として発現させた。単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）のシグナル配列とマチュアのＮ末端から２７個のアミノ酸が、マチュアｇｐ１２０配列のアミノ酸第１３位に対応するｇｐ１２０遺伝子のＮ末端配列に融合している。ブレイクスルー標本に由来するｇｐ１２０配列を含むＰＣＲ生成物を、ヘテロローガスＰＣＲプライマー尾部中に施した制限部位と、ＨＳＶ− １ｇＤのＮ末端配列中に施したＸｈｏＩ部位処理の組み合わせを用いて、キメラ遺伝子としてｐＲＫ５発現プラスミドにクローニングした。得られた２本鎖ＤＮＡを、Sequence and the dGTP Reagent Kit(United State s Biochemical Corp.)により配列決定した。Bermanら，J．Virol．7:4464-9(199 2);Nakamuraら，AIDS and Human Retrovirus 8:1875-85(1992);およびNakamura ら，J．Virol．67:6179-91(1993)に記載されているように、発現を増強し、タンパク質分析を容易にするためのフラッグエピトープが得られるように糖タンパクＤ由来の配列を与えた。簡潔に言えば、ｇｐ１２０フラグメントを、単純ヘルペスウイルス１型の糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）遺伝子（ｇＤ−１）の５’配列にインフレームで融合し、３ ’末端が翻訳終止コドンに融合するように設計したプラスミド（ｐＲＫ．ｇＤ− ５，ｐＲＫｇＤｓｔｏｐ）に、ＰＣＲ反応によって生じた単離されたＤＮＡ断片をライゲーションした。このｇＤ−１遺伝子の断片は、ＨＳＶ−１タンパク質のシグナル配列とマチュアの形態の２５個のアミノ酸をコードした。哺乳類細胞における発現を可能にするために、キメラ遺伝子断片を、サイトメガロウイルスプロモーターとシミアンウイルス４０ウイルスポリアデニル化部位との間に位置する翻訳終止コドンとクローニング部位とを有するポリリンカーを含んでいるｐＲＫ５発現プラスミド（Eatonら，Biochemistry 291:8343-8347(1986)）へクローニングした。得られたプラスミドを、リン酸カルシウム法（Grahamら，Virology 52:456-46 7(1973)）を用いて、２９３s胚性ヒト腎細胞系（Grahamら，J．Gen．Vriol．36: 59-77(1977)）へトランスフェクトした。増殖を調節した細胞培養培地をトランスフェクションから４８時問後に集め、Bermanら，J．Virol．63:3489-3498(198 9)およびLaemmli，Nature 227:680-685(1970)に記載されているように、可溶性タンパク質をＥＬＩＳＡにより、または培養細胞上清の代謝的に標識されたタンパク質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離してオートラジオグラフィーにより視覚化する特異的放射性免疫沈降により検出した。血清学的分析。Bermanら，J．Virol．7:4464-9(1992);Nakamuraら，AIDS and Human Retroviruses 8:1875-85(1992);およびNakamuraら，J．Virol． 67:6179-91(1993)に記載された血清学的分析を用いて、ｒｇｐ１２０に対する抗体、ｇｐ１２０Ｖ３領域由来の配列に対応する合成ｇｐ１２０Ｖ３領域ペプチドに対する抗体、および細胞表面ＣＤ４に対するＭＮ−ｒｇｐ１２０の結合を阻害することができる抗体について、血清を分析した。ｇｐ１２０およびＶ３ペプチドに結合する抗体の終点力価を、血清の３倍希釈系列を用いて決定した。終点希釈力価は、１：５０に希釈されたプールした正常なヒトの血清の光学密度の平均よりも２倍高い光学密度の値を与える最終の希釈率として定義した。抗体希釈物の間で数値を内挿するコンピュータプログラムによって抗体力価を計算した。ポジティブコントロール標準血清の分析間での変動係数は３５％であった。ブレイクスルーウイルス由来のｒｇｐ１２０に対するモノクローナル抗体の結合。ブレイクスルーウイルス由来のｒｇｐ１２０に対する様々なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の結合を測定するために、Mooreら;AIDS 3:155-63(1989)に記載のされているのと同様のＥＬＩＳＡを使用した。簡潔に言えば、Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏプレート（Maxisorp，certified）を、ｇｐ１２０のＣ末端のペプチドに対するアフィニティー精製したヒツジポリクローナル抗血清（Ｄ７３２４、Internatio nal Enzymes，Fallbrook，CA）でコーティングした（５μｇ／ｍＬとして１００ μＬ、ＰＢＳ中４℃にて一晩）。ＰＢＳ−０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０洗浄剤で１回洗浄した後、プレートをＰＢＳ−１．０％ＢＳＡで３０〜６０分間室温でブロックした。ｇＤ−ｒｇｐ１２０融合タンパク質の等量を含むように希釈した、２９３細胞由来の培養細胞上清を加え、２時間室温でインキュベーションした後、ＰＢＳ−０．０５ＴＷＥＥＮ−２０洗浄剤で３回洗浄した。様々なＭＡｂをＰＢＳ−１．０％ＢＳＡ中で希釈して、希釈したＭＡｂ１００μＬを各ウェルに加えて室温で１時間インキュベーションした。プレートを３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート２次抗体（ヤギ抗マウスまたは抗ヒトＩｇＧ、Cappel）１００μＬと１時間室温でインキュベーションした。３回洗浄した後、プレートを顕色させてＯＤ₄₉₂（４９２ｎｍにおける光学密度）をプレートリーダー中で読み取った。増殖を調節した培養細胞上清を、ＨＳＶ−１糖タンパク質Ｄ融合タンパク質に特異的なＭＡｂ５Ｂ６による結合に基づいて希釈することにより標準化した。ウイルス中和アッセイＨＩＶ−１_MNによるＭＴ４細胞の感染を阻止するワクチン受容者血清の能力を細胞変性分析において測定し、細胞の生存能力を、Robertsonら，J．Virol．Metho ds 20:195-202(1988)に記載されているように、熱量測定用指示染料を用いて定量した。簡潔に言えば、ＨＩＶ−１_MNのウイルスストック（Michael Norcross博士，U.S．Food and Drug Administrationから入手）を慢性的に感染したＨ９／ＨＩＶ−１_MN培養細胞から透明の上清として調製した。ＨＩＶ−１_MNに慢性的に感染したＨ９細胞をペレットにし、元の体積の１／１０の培地に再顕濁した。細胞に結合したウイルスを、Wrinら，J．Viro1．69:39-48(1995)に記載されているように、細胞の急速な撹拌の機械的せん断作用によって解離させた。７日間で細胞溶解殺傷を完結させるに十分なウイルスの量を、試験抗血清の３倍連続希釈物とインキュベーションし、次いで１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ−１６４０細胞培養培地中のＭＴ４Ｔリンパ球細胞に対する攻撃に使用した。培養細胞を５％ＣＯ₂中３７℃で７日間インキュベーションし、次いで細胞の生存能力をＭＴＴ染料によってRobertson，J．Virol．Methods 20:195-202(1988)に記載されているように試験した。ウイルス中和エピトープを５７０〜６５０ｎｍにおけるＯＤの測定によって定量し、次いで終点力価を、保護されない（死滅した）細胞の対照のシグナルより２倍高いシグナルを与える抗血清希釈率の逆数として計算した。これらの力価は、５０％保護として計算した力価の典型的には２倍であった。結果感染した患者の免疫記録。１９９２年以降、危険度が低または中程度の人における第Ｉ相試験、および危険度が中または高い人についての第ＩＩ相試験において、４９９人の成人がＭＮ−ｇｐ１２０で免疫された。ここに記載した実験は、これらの試験期間中に危険性の高い行動によってＨＩＶ−１に感染した９人のうちの最初の７人の遺伝学的および免疫学的特徴付けを含んでいる。ワクチン受容者の試験と状態の要約の一覧を表２Ａに示す。ワクチン受容者の分析の一覧は、表２Ｂに示す。表２ＡＭＮ−ｒｇｐ１２０による免疫後にＨＩＶ−１に感染したワクチン受容者の記載 ^★−Ｍ／Ｈは、男性の同性愛者であることを示す；Ｍ／ＩＤＵは男性の静脈薬物使用者であることを示す。^‡ −免疫ごとに注射したＭＮ−ｒｇｐ１２０の投与量をμｇで示す；ＱＳ２１は、抗原がＱＳ２１アジュバント中で製剤化されたことを示す；Ａｌｕｍは水酸化アルミニウム中で製剤化されたＭＮ−ｒｇｐ１２０を示す。表２ＢＭＮ−ｒｇｐ１２０による免疫後にＨＩＶ−１に感染したワクチン受容者の記載 ○は、最後の免疫からＨＩＶ−１感染の検出までの期間を示す。３つの感染が、２種類の異なるアジュバント（ミョウバンおよびＱＳ２１）中で製剤化されたＭＮ−ｒｇｐ１２０の安全性と免疫原性を比較した第Ｉ相試験（ＮＩＨプロトコルＡＶＥＧ２０１）において起こり、４つの感染が、種々の高リスク群（例えば、静脈薬物使用者、同性愛および両性愛の男性、およびＨＩＶ− １に感染した人のパートナー）におけるＭＮ−ｒｇｐ１２０の安全性と免疫原性を確立することを目的とする第ＩＩ相試験において起こった。試験した７つの感染（表３）のうち、２つ（Ｃ６およびＣ８）は２回の注射後に起こり、３つ（Ｃ７、Ｃ１０）およびＣ１５）は３回注射した後に起こり、そして２つ（Ｃ１１およびＣ１７）は４回の計画された注射を受けた後に起こった。最後の免疫から感染するまでの期間は、２〜１３.５ヶ月であった。表３ＨＩＶ−１に感染したワクチン受容者における免疫追加後のＭＮ−ｒｇｐ１２０抗体力価ピーク＃は、ＨＩＶ−１感染のために分析しなかった標本を示す。ｎａは、試験の利用できなかった試料を示す。太字は、異常に低い抗体力価を示す。ワクチン接種された人におけるｇｐ１２０に対する抗体応答。ＭＮ−ｒｇｐ１２０に対する抗体応答の大きさの大きさと特異性を、免疫レジメ（第１図）の過程において、感染した人全員においてＥＬＩＳＡにより測定した。７人の患者のうち５人は、小さいが再現可能な１次応答（１：１００〜１：２,０００）と強い２次（ブースター）応答（１：７,０００〜１：３２,０００の範囲の力価）を誘導する正常な抗体応答キネティックスを示し、２回目の免疫後に達成されたのと同じかまたはそれよりわずかに高い３回目と４回目の注射後の抗体応答がそれに続いた（第１図、表３）。Ｃ７において観察された抗体応答（第１図Ｃ）は、１回目の注射の後に抗体が検出できず、２回目の注射の後で１：３５０の力価しか検出されなかったという点において異常であった。したがって、Ｃ７は１次免疫には応答せず２回目の注射の後に得られた抗体応答が１次免疫応答を示したようである。この仮説と一致して、３回目の注射は１：９,７０７の力価しか誘導せず、これは２回目の免疫後に通常みられる力価に典型的なものであった。典型的でない抗体応答は、促進された免疫日程に従って０、１および２ヶ月目に免疫された患者Ｃ１５においてもみられた（第１Ｇ図）。予想通り、この患者において見られた抗体力価（１：４,４６０）は２回の免疫後に典型的に達成される力価の最低値であり、３回の免疫についての正常値よりはるかに低かった。Ｃ１５における、３回目の免疫後の効果的なブースター応答の欠落は、ヒヒにおける促進された０、１および２ヶ月の免疫計画が、２次応答が長引いて効果的な３次ブースター応答を同様に誘導し得なかったという過去の試験［Anderson，J ．Infect．Dis．160:960-9(1989)］を考慮すれば、驚くべきことではなかった。Ｃ６（第１Ａ図）およびＣ８（第１Ｂ図）の患者から得た血清と血漿の遡及分析は、彼らが２回目と３回目の免疫の間のある時点でＨＩＶ−１に感染したということを示した。ＨＩＶ−１感染の血清学的証拠は、２回目の注射の２週間後に力価が減少せず、代わりに特徴的でない高い力価のプラトーを形成したｇｐ１２０抗体分析において明らかであった（第１Ａ図および第１Ｂ図）。３回目の注射の後のＭＮ−ｒｇｐ１２０力価における同様のプラトーは、Ｃ７の患者が、３回目の注射を受けた１６週間後の３６週目あたりに感染したことを示唆している（第１Ｃ図）。Ｃ１０（第１Ｅ図）、Ｃ１１（第１Ｄ図）、Ｃ１５（第１Ｇ図）およびＣ１７（第１Ｆ図）の患者は、ＨＩＶ−１感染の典型である、ｇｐ１２０力価における予想外の増加を、３回目かまたは４回目の免疫の後に示した。得られたデータは、ＭＮ−ｒｇｐ１２０抗体応答のための免疫学的プライミングが、ＨＩＶ−１感染から普遍的な保護をもたらすには不十分であることを示している。Ｖ３ドメインに対する抗体力価。ｇｐ１２０に対する抗体応答をさらに特徴付けるために、主要中和決定基（principal neutralizing determinant:ＰＮＤ）を含むＭＮ−ｒｇｐ１２０の合成Ｖ３領域ペプチドに対して抗体力価を測定した。７人の患者のうち５人は、２回目の免疫後に良好なＶ３力価（１：４００〜１：４０００）を示したが、２人の患者（Ｃ７およびＣ１５）は有意の力価を示すまでに３回の免疫を必要とした（第１Ｃ図および第１Ｇ図）。前に観察されたように（１１）、数人の患者（例えばＣ１１、Ｃ１０、Ｃ１７）におけるピークのＶ３力価が継続的な免疫によって減少しているようである（第１Ｄ、１Ｅおよび１Ｆ図）。ＨＩＶ−１感染の後、Ｖ３反応性についての２つのパターンが観察された。３人の患者（Ｃ６、Ｃ７およびＣ１０）が、Ｖ３領域ペプチドに対する力価の大きな増加を示した（第１Ａ、１Ｃおよび１Ｅ図）のに対し、Ｃ８（第１Ｂ図）はＶ３力価の大きな減少を示した。分析の時点では、Ｃ１１、Ｃ１５、およびＣ１７の患者におけるＨＩＶ−１感染に応答したＶ３力価の変化に関して何らかの結論を導くにはデータが不十分であった。得られた結果は、ＨＩＶ−１感染の前の種々の時点でＶ３領域と反応する抗体を形成する能力は、ＨＩＶ−１のすべての種に対して保護的な免疫が妥当に相関しているわけではないということを示している。ＣＤ４阻止力価。ＣＤ４に対するｇｐ１２０の結合をブロックする抗体は、異種のクラスのウイルス中和抗体である。いくつかの抗体が、ｇｐ１２０のＣ４領域に結合することが知られており（Nakamuraら，J．Virol．67:6179-91(1993);A ndersonら，J．Infect．Dis．160:960-9(1989)）、いくつかの抗体はコンフォメーションに依存する不連続なエピトープを認識することが知られている(Berman ら，J．Virol．7:4464-9(1992);Nakamuraら;J．Virol．67:6179-91(1993);McKea tingら;AIDS Research and Human Retroviruses 8:451-9(1992);Hoら，J．Virol ．65:489-93(1991);Barbasら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:3809-13(1994) ）。両方のタイプのエピトープに対する抗体を検出する１つの方法は、細胞表面ＣＤ４に対する［¹²⁵Ｉ］標識したｇｐ１２０の結合を阻止する、ワクチン受容者の血清の能力を測定することである［Nakamuraら，AIDS and Human Retroviruse s 8:1875-85(1992);Nakamuraら，J．Virol．67:6179-91(1993)］。ＣＤ４ブッロク力価は、感染前の７人のワクチン受容者全員において１：１０〜１：３００の範囲のピーク力価で検出された（第２図）。感染前の最後の時点で、７人のワクチン受容者のうちの５人のＣＤ４力価は低かった（１：３０またはそれ以下）。しかし、１人のワクチン受容者（Ｃ１７）は、感染前に約１：３００のＣＤ４ブロック力価を有していた（第２Ｆ図）。したがって、ＣＤ４に対するＭＮ −ｒｇｐ１２０の結合をブロックする抗体の欠如によって、すべての感染を説明することはできない。ＨＩＶ−１感染後、ＣＤ４ブロック力価における大きな増加（１：１００〜１：１,０００）が、７人のうちの５人の患者においてみられた。これには、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０およびＣ１１のワクチン受容者が含まれている。これらの結果は、ＭＮ−ｒｇｐ１２０によって誘導されたＣＤ４ブロック力価が、天然の感染によって誘導される力価より低いことを示している。ウイルス中和活性。抗体で処理されたウイルス（ＨＩＶ−１_MN）とインキュベーションした後にＭＴ−４細胞の生存能力を測定する比色分析を用いて、ＭＮ− ｒｇｐ１２０で免疫された患者に由来する抗血清のウイルス中和活性を測定した。いずれのブレイクスルー感染についても実際の感染した日付は分からず、血清試料は頻繁に集めたものでないため、どのワクチン受容者についても、感染時における中和抗体応答の大きさは分からない。調べた７つの感染のうちで、感染の時期に最も近い血清試料はＣ７から得られたものであり、ＨＩＶ−１感染の検出の３週間前にＨＩＶ−１_MNに対する中和力価が１：１５存在していたものであった（表４）。しかし、他のケースにおいてはすべて、最後の注射から感染の時期までの期間が１０〜２５週間であった表４ＨＩＶ−１に感染したワクチン受容者由来の血清の中和活性 ^★は、免疫を示す。＃は、ＨＩＶ−１陽性を示す。ｎｄは、実施しなかったことを示す。 -は、試料が利用できなかったことを示す。２つの早期の感染に由来する血清を試験したとき（表４）、１人（Ｃ６）は、ＨＩＶ−１感染検出の１０週間前に１：１０のピークの中和力価であったが、もう１人（Ｃ８）は、ＨＩＶ−１感染の１０週間前に１：８０の中和力価を有した。促進された免疫スケジュールにしたがって免疫された患者Ｃ１５は、ＨＩＶ− １感染の１４週前で、３回目の注射後に、１：３５の中和力価を示した。３回目の注射（２４週）の後に１：２００のピークの中和力価を有したＣ１０の患者は、ＨＩＶ−１感染をはじめて示す（７８週）６ヶ月前の５２週目には力価を検出できなかった。Ｃ１１の患者は、ＨＩＶ−１の検出の１４週前は１：９０の中和力価であり、３回目の免疫後は１：５００のピークの中和力価であった。同様にＣ１７の患者は、感染の１４週前に１：１５０の中和力価であり、３回目の免疫後は１：４００のピークの中和力価であった。約２ヶ月間のｇｐ１２０応答の減衰の割合［Belsheら，JAMA 272(6):475-80(1 994)］、並びにＣ１０とＣ１７のワクチン受容者において、１０週間で中和力価が１：１５０から１：１０に減衰したという観察に基づけば、Ｃ８、Ｃ１５、Ｃ１１およびＣ１７における中和力価は、感染前の最後の血清試料と、ＨＩＶ−１検出の時期との間に、１：１０またはそれ未満に減衰したと思われる。これら試験の結果は、すべてのワクチン受容者が、あるレベルのウイルス中和抗体をＨＩＶ−１感染前のある時点で示し、中和応答の大きさが感染時には恐らく低いということを示した。Belsheら，JAMA 272(6):475-80(1994)に記載されているように、一般的に、ＨＩＶ−１に感染した人において観察されるウイルス中和応答の大きさは、非感染のワクチン受容者においてみられる大きさに匹敵するものであった。ウイルスの配列。ワクチン抗原に対するブレイクスルーウイルスの類似性を調べるために、７人すべてのブレイクスルーウイルスに由来するｇｐ１２０のヌクレオチド配列を決定した。エンベロープ糖タンパク質遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてプロウイルスＤＮＡから増幅した。配列は、患者の血液から直接得たグラジェント精製した白血球のリゼートから、中間の組織培養または増幅工程をなんら含むことなく、ＤＮＡの直接増幅によって得られた。完全なｇｐ１２０配列の一覧（１つの標本について２つのクローン）を図３に示す。７つのエンベロープ糖タンパク質はすべて、サブタイプ（クレード）Ｂウイルスに典型的な配列を有していた。ＭＮ−ｒｇｐ１２０に対する全体の相同性は、６９〜８０％に分布した（表５）。表５ＭＮ−ｒｇｐ１２０配列と感染したワクチン受容者由来の配列との比較^★ ^★−データは同一性の百分率で示す。興味深いことに、高いパーセント（７つのうちの４つ）のブレイクスルーウイルスが、ＭＮ−ｇｒｐ１２０と２５〜３０％異なっていた［Myersら，Retroviru ses and AIDS Database，Los Alamos National Laboratory(1992および1995)］。歴史的に、この程度の配列変化は、１０〜２０％の範囲であると予想されるサブタイプ内変化［Myersら，Retroviruses and AIDS Database，Los Alamos Nati onal Laboratory（1992および1995)］よりはむしろサブタイプ間（クレード内）の変化に典型的なものである。ＭＮ−ｒｇｐ１２０に対して最も相同性が高いウイルスのうち２つ（Ｃ６およびＣ８）は、免疫を完了する前の早期の感染として現れ、１つ（Ｃ１７）は遅い感染として起こった。Ｖ３領域における多形。特に興味いのは、中和抗体によって認識されるエピトープを含むことが知られている領域における多形であった。最も特徴化された中和エピトープである主要中和決定基（ＰＮＤ）は、Ｖ３ループの先端に存在している。サブタイプＢウイルスにおいては、約６０％が、ＨＩＶ−１のプロトタイプＭＮ種に対する同一性に基づいたＭＮ血清型を決定する特徴（signature）配列、ＩＧＰＧＲＡＦ（配列番号３９）を有している［Bermanら，J．Virol．7:4464 -9(1992);Myersら，Retroviruses and AIDS Database，Los Alamos National La boratory(1992および1995);LaRosaら，Science 249:932-5(1990)］。ウイルスのうち３つ（Ｃ６、Ｃ８およびＣ１７）は、ＭＮ血清型特徴配列（第３図）を有していた。対照的に、４つのウイルスは、ＰＮＤにおけるラジカルなアミノ酸置換を有する配列［ＩＧＰＧＲＡＷ（Ｃ７）、ＬＧＰＧＳＴＦ（Ｃ１１）、ＩＧＰＧＲＶＬ（Ｃ１０）、およびＩＧＰＧＳＡＦ（Ｃ１５）］（それぞれ配列番号４０〜４３）を有し、したがって“非ＭＮ様”ウイルスとして分類される。注目すべきことに、４つの“非ＭＮ様”配列はそれぞれ珍しく（表６）、サブタイプＢウイルスの最も一般的な“非ＭＮ”変異体に特有なものではなかった [Myersら，Retroviruses and AIDS Database，Los Alamos National Laborato ry（1992および1995)]。表６ＭＮ−ｒｇｐ１２０で免疫されたＨＩＶ−１感染した人における主要中和決定基における多形の頻度^★ ^★−データセットGNEは1９９２年に収集された５２の独立した単離物のコレクションを意味し；データセットLANLは、Myersらによって報告された５１９個の配列のコレクションを意味し；LANL.１はB．Korberら(個人的な文書)によって提供された１６０人の疫学的に関連性のない人のコレクションを意味し；データセットLa Rosaは、La Rosaら，Science 249:932-5(1990)によって報告された配列のデータを意味する。 ^★★−配列が、試験したデータセットに存在しなかった。ブレイクスルーウイルスにマッチするＰＮＤ配列を有するウイルスの普及率は Los Alamos National Laboratory［Myersら，Retroviruses and AIDS Database ，Los Alamos National Laboratory(1992および1995)］によって集められた５１９のサブタイプＢ配列のリストにおいて、高いもので１.３％（Ｃ７）から、低いもので０.２％（Ｃ１１）までに分布している。他の３つの独立に得られたデータセット（表６）において同様に低い頻度が観察された。これらの配列の出現率は、1985年以前に集められたデータセット［La Rosaら，Science 249:932-5(1 990)］と1992年に集められたデータまたは１６０人の疫学的に関連性のない人のセットから得られたデータ［B．Kober，個人的な文書］の間で有意には異なっていなかった。４つのデータのセットはすべて、ＭＮ様ＰＮＤ配列を有するウイルスの普及率が６０％の範囲にあるということと一致していた。このデータに基づいて、７つのブレイクスルー感染のうちの４つが、ワクチンによって阻止されると予想されるウイルスのスペクトルの外側に存在するウイルスによって引き起こされると決定された。ブレイクスルーＶ３領域の他の特徴。ＭＮ−ｒｇｐ１２０と同様、すべてのブレイクスルーウイルスのＶ３領域は、３６アミノ酸の長さであった。しかし、すべての７つのウイルスが、グリコシレーション部位の数とシンシチウム誘導（ＳＩ）特徴配列についてＭＮ−ｒｇｐ１２０と異なっていた。ＭＮ−ｒｇｐ１２０の配列は、Ｖ３領域の第３０６位のＮ結合型グリコシレーション部位を欠いている点において、多少通常と異なっている［Myersら，Retro viruses and AIDS Database，Los Alamos National Laboratory(1992および1995 )］。ＭＮ−ｒｇｐ１２０に対する抗血清は、この位置でグリコシレーション部位を有する様々なウイルス（例えば、ＳＦ−２、ＤＵ６５８７−５、ＤＵ４４８９−５、ＣＣ）を中和することが知られているので［Bermanら，J．Virol．7:44 64-9(1992)］、このグリコシレーション部位の欠失は抗原性には重要ではないと思われる。さらに、ＭＮ−ｒｇｐ１２０のＶ３領域は、シンシチウム誘導ウイルスに典型的な配列多形（第３１１位のＲ、第３２４位のＫ、第３２８位のＫ）［Fouchier ら，J．Virol．66:3183-87(1992)］を有していたのに対し、７つのブレイクスルーウイルスはすべて、非シンシチウム誘導ウイルスに関連する配列を有していた。シンシチウム誘導ウイルスは、疾患の急速な進行［Tersmetteら，J．Virol.62 :2026-32(1988)］とＴ細胞親和性［O'Brien，Nature（London）348:69-73(1990) ;Shioda，Nature（London）349:167-9(1991)］に関連している。今日まで、これらの特性を有するウイルスは、ＭＮ−ｒｇｐ１２０で免疫されたどのボランティアからも回収されていなかった。Ｖ１、Ｖ２およびＣ４領域における多形。過去の研究によって、ｇｐ１２０のＶ１、Ｖ２およびＣ４領域における更なる中和エピトープが同定された［Nakamu raら，J．Virol．67:6179-91(1983);Mckeatingら，AIDS Research and Human Re troviruses 8:451-9(1992);Hoら，J．Virol．65:489-93(1991);Barbasら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 91:3809-13(1994);McKeatingら，J．Virol．67:4932-4 4(1993);Mooreら，J．Virol．67:6136- 6151(1993);Davisら，J．Gen．Virol．74:2609-17(1993)］。これらのうちで最も特徴付けられた中和エピトープは、この領域に結合する抗体はＣＤ４に対するｇｐ１２０の結合をブロックすることが知られていたために特別な注意をひきつけてきたＣ４領域に存在している[Mooreら，AIDS3:155-63(1 989);Mckeatingら，AIDS Research and Human Retroviruses 8:451-9（1992)]。そのエピトープは保存（Ｃ）領域に局在しているため、この領域において自然に起こる多形は、他の中和エピトープよりもはるかに制限される。Nakamuraら，J ．Virol．67:6179-91(1993)は、数多くの中和ＭＡｂの結合は第４２９位におけるＫに依存することを報告した。ＭＮ−ｒｇｐ１２０の配列とＨＩＶ−１の他の種との比較は、ＫのＥへの置換という共通の多形がこの位置で起こることを示した。実際、同じウイルス単離物の亜種が、しばしばこの位置で多形を示している。ＨＩＶ−１_LA1のＨＸＢ２亜種は第４２９位にＫを含んでいるのに対して、ＨＩＶ−１_LA1のＢＨ１０、ＩＩＩＢおよびＬＡＶ亜種は、この位置にＥを含んでいる［Nakamuraら，J．Virol． 67:6179-91(1993)］。同様に、ＨＩＶ−１_MNの１９８４単離物は、この位置でＥを示したのに対して、ＭＮ−ｒ.ｇｐ１２０の製造に使用されたＨＩＶ−１_MNの１９９０単離物はこの位置にＫを有していた。感染したワクチン受容者の配列を試験したとき（第３図）、Ｃ１７の患者由来のウイルスは、ＭＮ−ｒｇｐ１２０と同じように第４２９位いＫを含んでいたのに対し、ワクチン免疫原の異なる他の６つのウイルスは、この位置にＥを有していた。これらの結果は、７つのブレイクスルーウイルスのうち６つが、ＣＤ４をブロックする、ｇｐ１２０のＣ４領域における中和エピトープにおいてワクチン免疫原と異なっていることを示した。モノクローナル抗体による研究によって、ｇｐ１２０のＶ１およびＶ２領域における中和エピトープが明確になった［McKeatingら，J．Virol．67:4932-44(19 93);Mooreら，J．Virol．67:6136-6151(1993);Davisら，J．Gen．Virol．74:260 9-17(1993)］。Ｃ４領域に起こる多形と同様、Ｖ２領域は、ウイルス中和抗体の結合に影響するいくつかの共通した多形を示している。１つのこのような多形が、ネズミＭＡｂ１０２５の結合にとって決定的に重要である第１７１位に起きており、一方、第１８７位の残基は１０８８に代表されるいくつかのＭＡｂの結合にとって重要である。Ｖ２領域配列を試験したとき（第３図）、感染したワクチン受容者のウイルスはすべて、第１７１位のＧがＲで置き換わっており、第１８７位のＥがＩまたはＶで置き換わっていた点でＭＮ−ｒｇｐ１２０と異なっていた。ＭＮ−ｒｇｐ１２０のＶ２領域のこれらの結合部位を認識する抗体は、これらの位置にラジカルなアミノ酸置換を有するウイルスを中和すると予想されないであろう。このように、７つのブレイクスルーウイルスはすべて、ｇｐ１２０のＶ２領域の中和エピトープにおいてＭＮ−ｇｐ１２０と異なっていた。ｇｐ１２０のＶ１領域における他の中和エピトープが報告されている［O'Brie nら，Nature（London）348:69-73(1990);McKeatingら;J．Virol．67:4932-44(19 93)］。ＭＮ−ｇｐ１２０のＶ１領域における中和エピトープは特徴付けられていないが、この領域においてみられたブレイクスルーウイルス間の多形は興味深いものである。特に目を引くのは（第３図）、この領域が２０アミノ酸（Ｃ１７）〜４５アミノ酸（Ｃ６）の長さの範囲に、そしてＮ結合型グリコシレーション部位の数が２〜６の範囲に及んでいることであった。対照的に、ＭＮ−ｒｇｐ１２０のＶ１領域は３１アミノ酸の長さであり、３つのＮ結合型グリコシレーション部位をコードしている。配列データベースを調べることによって、Ｖ２領域における変化はＶ１領域に匹敵することが示唆されるが、ブレイクスルーウイルスのＶ２領域は予想よりも少ない変化を示した。特に、この領域の３つのＮ結合型グリコシレーション部位を含んでいる７つのウイルスのうち６つについては、Ｖ２領域の長さが３６アミノ酸（Ｃ７）〜３９アミノ酸に及んでいた。高度の多形が、配列が２６（Ｃ１０）〜３３（Ｃ１５、Ｃ７）アミノ酸の長さに及び、４または５個のＮ結合したグリコシレーション部位を含んでいるＶ４領域にみられた。ブレイクスルーウイルスに由来するエンベロープ糖タンパク質の抗原性。糖タンパク質抗原性における配列変化の有意性を測定するために、組換えｇｐ１２０を、７人の感染したワクチン受容者全員のウイルスから調製した（第４図）。これらの試験において、一連のＭＡｂを構築し、ＥＬＩＳＡによって、ＭＮ−ｒｇｐ１２０に対するそれらの抗体の結合を、ワクチン受容者由来のｒｇｐ１２０に対するその結合と比較した（表７）。表７ＭＮ−ｒｇｐ１２０に対する結合と比較した、感染患者由来のｒｇｐ１２０に対するＭＡｂ結合の相対的反応性^★ ^★−相対的反応性の値は、２μｇ／ｍＬのＭＡｂ濃度での、患者の単離物に由来するｒｇｐ１２０で得られた光学密度を、ＭＮ−ｒｇｐ１２０についての光学密度で割った比を示す。対照実験では、ＭＡｂ５Ｂ６（すべてのｇｐ１２０タンパク質のＮ末端に融合したＨＳＶｇＤ−１フラッグエピトープに特異的である）の結合を、各単離物由来のｇｐ１２０の量を標準化するために使用した（第５Ａ図）。これらの実験は、等量のｒｇｐ１２０がマイクロタイタープレートのウェル上に捕捉されるような条件下でその分析が行われていることを示した。Ｖ３領域の抗原性構造は、１０３４ＭＡｂ（Nakamuraら，J．Virol．67: 6179-91(1993)に記載されているように、ＭＮ−ｒｇｐ１２０で免疫したマウスから単離した）および５０.１ＭＡｂ（Riniら;Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90: 6325-9(1993)に記載されているように合成Ｖ３領域ペプチドで免疫したマウスから調製した）を用いて調べた。両方のＭＡｂとも強力なウイルス中和活性を示すことが知られている。組換えタンパク質に対する結合を調べたとき、ＭＮ−ｒｇｐ１２０に対するＭＡｂ結合は、どのブレイクスルーウイルスエンベロープタンパク質よりも少なくとも１０倍は高かった（第５ＢおよびＣ図）。驚くべきことに、ＭＮ血清型を決定する配列、ＩＧＰＧＲＡＦ（配列番号３９）を有する３人の患者の単離物に由来するｒｇｐ１２０（Ｃ８、Ｃ６およびＣ１７）は、それらのＭＡｂ結合活性において互いに異なっていた。例えば、Ｃ１７に由来のｒｇｐ１２０に対するＭＡｂ１０３４および５０.１の結合は、Ｃ６およびＣ８由来のｒｇｐ１２０に対する結合より有意に高かった。Ｃ６−ｒｇｐ１２０およびＣ８−ｒｇｐ１２０は５０．１について同等の結合をもたらしたが、１０３４はＣ８−由来のタンパク質よりもＣ６−由来のタンパク質により結合したので、これらＭＡｂによって認識されるエピトープの差異は明らかである。最も低いＭＡｂ反応性は、Ｃ１１およびＣ１５由来のｒｇｐ１２０に関するものである。この結果は、これら２つのウイルスが両方ともＶ３領域の第１８位で、ＲからＳへのラジカルな置換を有しているということを示す配列分析と一致するものである。驚くべきことに、これらＭＡｂは両方とも、Ｃ７およびＣ１０ウイルス由来のｒｇｐ１２０に対して予想以上に優れた結合を示した。ＭＮ−ｒｇｐ１２０と同様、両方のタンパク質ともペンタペプチド、ＩＧＰＧＲ配列（配列番号４４）をＶ３ループに含んでいるが、Ｃ１０由来のｇｐ１２０において第３１９位および第３２０位でＡおよびＦがＶおよびＬに置換されている点、そしてＣ７由来のｇｐ１２０において第３２０位でＦがＷに置換されている点で、ＭＮ−ｒｇｐ１２０と異なっていた。これらの結果は、第３１８位のＲが、これら２つのＭＡｂの結合にとって必須であり、１０３４および５０.１によって認識されるエピトープが第３１９位および第３２０位での疎水的置換によって完全には破壊されないことを示している。配列のデータから予想されるように、ＭＮ−ｒｇｐ１２０のＶ２領域に対するＭＡｂ（１０８８および１０２５）を用いるブレイクスルーウイルスｒｇｐ１２０に対する結合はほとんどなかった。また、ＭＮ−ｒｇｐ１２０のＣ４領域に対するＭＡｂ１０２４は、ＭＮ−ｒｇｐ１２０と同様に第４２９位でＫを含んでいるＣ１７−ｒｇｐ１２０に対して反応性をいくらか示したが、第４２９位の残基にＥを含んでいる他の単離物については反応性を示さないという観察は、配列のデータと一致した。合わせて、これらの実験は、７つのブレイクスルーウイルスのすべての抗原構造が、３つのよく特徴付けられた中和エピトープにおいて、ワクチン免疫原と異なっていることを示した。全体的に異なったパターンの反応性が、Hoら;J．Virol．65:489-93(1991)に記載されているようにＨＩＶ−１感染した人から調製したヒトのハイブリドーマ、ＭＡｂ１５ｅについて観察された。このＭＡｂについて、最も高い結合がＭＮ −ｒｇｐ１２０およびＣ７由来のｒｇｐ１２０に対して達成され、最も低い反応性がＣ１１由来のｒｇｐ１２０の２つのクローン対してみられた。Ｃ１０およびＣ１７由来のｒｇｐ１２０については、中くらいであるが同等の反応性がみられた。これらの結果は、１５ｅエピトープが多形であること、エピト位−プがＭＮ− ｒｇｐ１２０およびＣ７由来のｒｇｐ１２０において保存されているが、Ｃ１１に由来するｒｇｐ１２０で失われていることを示している。興味深いことに、Ｃ６から得られたｒｇｐ１２０の２つの異なるクローンが、抗体結合の著しく異なったパターンを示した。例えば、クローンＣ６.５由来のｒｇｐ１２０はこの抗体に対する強い反応性を示したが、クローンＣ６.１由来のｒｇｐ１２０はこのＭＡｂに対して有意に低い活性を示した。配列のデータの比較（第３図）は、この２つのＣ６クローンが、６つのアミノ酸の位置で異なっていることを示した。配列が分かっている他のウイルスタンパク質に対する結合の比較に基づけば、ｇｐ１２０のＣ３領域の第３５１位でのＩからＫへの置換は、結合活性における違いを説明し得ると思われる。この結果はまた、この位置で正に荷電したＫを同様に含み、なお且つこのＭＡｂについて反応性が弱いＣ１１のクローンの両方と一致している。あるいは、Ｃ４領域の第４３９位でのＩからＴへの置換は、Ｃ６. １とＣ６.５との間の１５ｅ結合における違いを説明し得るであろう。Ｃ４領域のこの位置での多形によって、Ｃ１１の２つのクローンが１５ｅに結合できないことを説明することはできないが、近接した第４３４位でのＭからＴへの置換が影響しているのであろう。考察これらの試験において、ワクチン候補であるＭＮ−ｒｇｐ１２０の第Ｉ相および第ＩＩ相に酸化している間に危険性の高い行動によってＨＩＶ−１に感染した９人のワクチン受容者のうちの７人におけるウイルスおよび免疫応答を分析した。コのような感染は2つのうちの1つの理由で起こると思われる：１）感染時における十分な免疫応答の欠失；または２）ワクチン免疫原によって保護されると思われる抗原スペクトルの外に存在するウイルスによる感染。データは、両方の説明とも観察された感染に関わり得ることを示している（表８）。表８ブレイクスルー感染のまとめ感染のうち２つは、タンパク質サブユニットワクチンによる保護免疫の誘導に典型的に必要な、最低限のワクチンの３回投与を受けなかった人に起こった（例えば、Francisら;Ann．Int．Med．97:362-6(1982)に記載されている、ミョウバンアジュバント中製剤化された肝炎ウイルスＢ）。２つの更なるブレイクスルー感染が、弱いまたは検出不可能な一次応答（Ｃ７）およびブースター応答（Ｃ１５）を示したワクチン受容者において起こった。３回またはそれ以上の保護免疫を受けた後にＨＩＶ−１に感染した３人（Ｃ１０、Ｃ１１およびＣ１７）のうち、少なくとも２人、恐らく３人全員は最後の免疫を受けてから６ヶ月以上後に感染したと思われる。ＭＮ−ｒｇｐ１２０に対する抗体力価は、半減期２〜２．５ヶ月で典型的に減衰するため［Belsheら，JAMA 272(6):475-80(1994);Berman ら，AIDS 8:591-601(1994)］、抗体力価は少なくとも１／８おそらくは１／６４も減衰していたと予想される。したがって、感染時における十分な免疫応答の欠落は、７つのブレイクスルー感染のうち少なくとも６つの有力な説明となる。ＨＩＶ−１による攻撃を受けたｇｐ１６０で免疫されたチンパンジー［McElra thら;Longitudinal Vaccine-Induced Immunity and Risk Behavior or Study Pa rticipants in AVEG Phase II Protocol 201．In:Abstracts from Eighth Annua l Meeting of the National Cooperative Vaccine Deve1opment Groups for AID S．Bethseda，MD 1996:216］およびキメラＳＩＶ／ＨＩＶ−１ウイルス（ＳＨＩＶ）による攻撃を受けた、ｇｐ１２０で免疫されたアカゲザルにおけるワクチン効果の研究から得られたデータは、感染時の中和抗体応答の大きさが保護的免疫の決定的な相関物であることを示唆している。持続する中和抗体力価が、ヒトにおける保護的免疫の有効な相関物であると分かったならば、抗体応答を最大にするように設計された製剤（例えば、新規のアジュバント）または免疫レジメ（頻繁な免疫追加）が、長期間持続する保護を達成するために必要になるであろう。６ヶ月毎のブースターの使用が有利であろう。遅い感染についてのその他考えられる説明は、ワクチンとブレイクスルーウイルスエンベロープ糖タンパク質との間の抗原性の相違である。この説明は、７つのブレイクスルーウイルスのうちの４つが、アミノ酸レベルでＭＮ−ｒｇｐ１２０と２５〜３０％異なっているエンベロープ糖タンパク質を有しているという観察によって支持される。この程度の相違は、歴史的には［Myersら，Retrovirus and AIDS Database，Los Alamos National Laboratory(1992および1995)］サブタイプ間の変化に関連するものであり、同じサブタイプ内のウイルスについて予想される平均１０〜２０％の変化をはるかに超えている。エンベロープ糖タンパク質の多くの領域における配列変化の生物学的有意性は明らかでないが、中和エピトープにおける多形はワクチン効果に影響する量要な因子である。過去の研究［Salmon-Ceronら;AIDS Res．and Human Retroviruses 11:1479-86(1995);Javaherianら，Science 250：1590-3(1990)］は、ＨＩＶ−１エンベロープ由来のワクチンによって誘導され得る中和活性の幅は、Ｖ３領域のエピトープ（例えばＰＮＤ）の配列に決定的に依存することを示している。したがってＨＩＶ−１のＬＡＩ種（プロトタイプ“非ＭＮ様”サブタイプＢウイルス）に基づくワクチン候補は、サブタイプＢウイルスに対し交差中和活性をほとんどかまたは全く示さないのに対し、“ＭＮ様”ＰＮＤ配列（ＩＧＰＧＲＡＦ）（配列番号４４）を含むワクチンは幅広い交差中和活性を示す。７つのブレイクスルーウイルスうち４つがＰＮＤにおいてラジカルなアミノ酸置換を有するエンベロープ糖タンパク質を有していることは、抗原構造の違いがこれらの感染のうちのいくつかを説明するという説明と一致する。ここ２〜３年にわたって、“ＭＮ様”ウイルスにおける多形が、ＰＮＤ以外の中和エピトープで起きていることが明らかになってきている。最もよい例がＣ４領域で起こっており、抗原性が異なる２つの変異体はその領域で第４２９位におけるＫまたはＥいずれか一方の存在によって区別される［Mooreら;AIDS 3:155-6 3(1989)］。７つのブレイクスルーウイルスのうち６つは、それらが第４２９位においてＫではなくＥを含んでいる点でワクチンの種と異なっているので、ＭＮ −ｒｇｐ２０のＣ４領域に対して生じる抗体は７人のワクチン受容者のうちの６人に感染しているウイルスを中和しそうにない。他の中和エピトープは、ｇｐ１２０のＶ１およびＶ２領域に存在していることが知られている。これらの領域は挿入および欠失により可変性が高いが、中和エピトープはMcKeatingら，J．Virol．67:4932-44(1993);Mooreら，J．Virol．67: 6136-6151(1993);およびDavisら，J．Gen．Virol．74:2609-17（1993）によって記載されている。これらのエピトープのいくつかは、ＭＮ−ｒｇｐ１２０の第１４２〜１４４位に対応する位置でトリペプチド配列ＲＤＫを含むＶ２領域のアミノ末端配列がオーバーラップしている［McKeatingら，J．Virol．67:4932-44(19 93);Mooreら，J．Virol．67:6136-6151(1993)］。Ｃ４エピトープと同様、この配列における変化は、同じ親の分離物に由来する異なった亜種の間で起こることが知られている。ワクチン抗原に存在しているＧＤＫ配列よりはむしろＲＤＫ配列を有している点において、７つのブレイクスルーウイルスはすべてＭＮ−ｒｇｐ１２０と異なっているので、ＭＮ−ｒｇｐ１２０のＶ２領域に対する中和抗体はＭＮ−ｒｇｐ１２０で免疫されたワクチン受容者から回収されたウイルスのいずれも中和しなかったであろう。中和エピトープにおける多形が大部分の感染における保護の欠落についての説明になるであろうが、Ｖ３およびＣ４領域でＭＮ−ｒｇｐ１２０と一致しているウイルスによって感染したワクチン受容者Ｃ１７の感染は、これによっては説明されないと思われる。配列の違いがこの場合における保護の欠落の理由であったならば、決定的な相違は、このブレイクスルーウイルスに由来するｇｐ１２０のＶ１領域における通常とは異なる配列に関係するであろう。いくつかの研究は、Ｖ１領域がウイルス中和モノクローナル抗体によって認識されるエピトープを有することを示している［McKeatingら，J．Virol．67:4932-44(1993);Davisら，J ．Gen．Virol．74:2609-17(1993);Kaymanら，J．Virol．68:400-410(1994)］。他の中和部位に関連のあるＶ１エピトープについて分かっていることははるかに少ないが、Ｖ１エピトープはコンフォメーションに依存するようであり、ＨＩＶ−１感染した人に由来する抗血清はＶ１およびＶ２領域におけるエピトープを認識する［McKeatingら，J．Virol．67:4932-44(1993);Kaymanら，J．Virol．68 :400-410(1994)］。Ｃ１７に由来するウイルスのＶ１配列は、ＭＮ−ｒｇｐ１２０または他のいずれかのブレイクスルーウイルスの配列と比較して小さく、そして少ないＮ結合型グリコシレーション部位を含んでいるので注目に値する。同じ理由で、Ｃ１１およびＣ６に由来するエンベロープ糖タンパク質は、ＭＮ−ｒｇｐ１２０または他のブレイクスルーウイルスと比較して有意に大きく、そして多くのグリコシレーション部位を含んでいるので注目に値する。アミノ酸配列の相違から抗原構造の相違の手がかりを得ることができるが、このような多形の結果は抗体結合試験でのみ証明できる。配列の相違を抗原構造の相違と相関させるために、７つのブレイクスルーウイルスそれぞれの２つのクローンに由来するｇｐ１２０を発現させて、そのクローンの抗原性を一連のモノクローナル抗体により調べた。配列のデータから予想されるように、ＭＮ−ｒｇｐ１２０のＶ２領域に対する中和ＭＡｂと反応したブレイクスルーウイルスエンベロープ糖タンパク質はなかった。Ｃ４領域に対するＭＡｂを調べたとき、Ｃ１７エンベロープ糖タンパク質（Ｋ４２９についてＭＮ−ｒｇｐ１２０と一致している）のみが、低かったものの有意の結合を示した。驚くべきことに、サブタイプＢＰＮＤコンセンサス配列ＩＧＰＧＲＡＦ（配列番号！！）を含んでいる３つのブレイクスルーエンベロープ糖タンパク質は、たとえワクチン免疫原に密接に関連したＰＮＤ配列を有していたとしても、３つのＰＮＤに対するＭＡｂのすべてに対して反応性が低かった。したがって、ワクチン受容者分離物のうちの３つがすべて、ＭＡｂ結合を妨害する、認識部位以外の変化を有していると思われる。 in vitroの中和に対する耐性はときとして、中和エピトープのコンフォメーションを変化させてウイルス中和抗体による認識を妨害するような離れた配列における突然変異に帰することが有り得ることが長年知られている［Naraら，J．Vir ol．64:3779-91(1990);Cordonnierら;Nature 340:571-4(1989)］。合わせて、これらの結果は、ブレイクスルーウイルスから回収されたエンベロープ糖タンパクの抗原構造が、ワクチン抗原の構造と有意に異なっているということを示している。ウイルス中和ヒトＭＡｂ、１５ｅの結合に影響すると思われるＣ３領域における残基の局在は新らしい成果であった。このＭＡｂは、不連続なエピトープを認識し、ＣＤ４結合をブロックし、様々なＨＩＶ−１の実験室的および一次的な分離物を中和することが知られている［Hoら，J．Virol．65:489-93(1991);Thali ら，J．Virol．66．5635-5641(1992);Mooreら，AIDS Res．Hum．Retroviruses 9 :1179-1187(1993)］。ブレイクスルーウイルスに由来するエンベロープ糖タンパク質に対する相対的な結合は、この抗体による認識がｇｐ１２０のＣ３およびＣ４領域の残基に決定的に依存しているということを示した。Ｃ３領域の第３５１位で正に荷電したＫのユニークな存在は、ＨＩＶ−１のＣ１１.５、Ｃ１１.７およびＣ６.１種が１５ｅに結合できないことについての共通した説明を与える。あるいは、異なった配置における異なったアミノ酸配列が、１５ｅがＣ６およびＣ１１クローン由来のｒｇｐ１２０に結合できないことを説明となることもある。このタイプの置極が起る唯一の明らかな位置はＣ４領域内にあり、第４３４位のＭがＴで置換され（Ｃ１１）、第４３９位のＩがＴで置換される。本試験は、ＭＮ−ｒｇｐ１２０の現在の製剤はＨＩＶ−１感染に対して効果が１００％に満たないことを示している。ＭＮ-ｒｇｐ１２０に関する過去のin vi troおよびin vivoの研究に基づけば、ヒトにおける天然のＨＩＶ−１感染からの保護は、ウイルス中和抗体の限界濃度、およびワクチン免疫原と攻撃ウイルスとの間の抗原類似性に依存すると予想される。これに関連して、７つのブレイクスルー感染のうち１つ（Ｃ１７）のみが予想外であった。この人は、全過程の免疫を受けたが、少なくとも２つの重要な中和エピトープ（Ｖ３およびＣ４領域）でＭＮ−ｒｇｐ１２０と類似しているウイルスに感染した。この感染は、感染時の抗体応答の大きさまたはブレイクスルーウイルスとワクチン種との間の抗原性の相違、またはこのプロトコルではモニターされなかった感染の情況（例えば、潰瘍性の疾患、急性感染または高ウイルス血症のドナーによる感染）に関係しているであろう。あるいは、この人は、はっきりとした説明のできない真のワクチン不全症なのかもしれない。結局のところ、本明細書に記載されたブレイクスルー感染の分析は、ＨＩＶ− １感染を阻止するためのワクチンとしてのＭＮ−ｒｇｐ１２０の継続的な開発に水を差すようないかなるデータも示さなかった。この結果は、（例えば、更なるブースター免疫による）ワクチンの免疫原性の増強が、長期間の保護的免疫の維持に必要であろうということ、そしてＭＮ−ｒｇｐ１２０に加え、他の免疫原性が異なるウイルスの種に由来するｒｇｐ１２０の添加が保護の幅を広げるのに有用であるという考察を支持するものである。ブレイクスルー感染から得られるウイルスおよびウイルス糖タンパクの有効性によって、多価のワクチン中に包含させるための新たな抗原の同定方法を合理化するための重要な手段が提供されるであろう。ブレイクスルーウイルスから調製された組換えウイルス糖タンパクは、定義づけよって、ＭＮ−ｒｇｐ１２０とは有意に異なり、現在伝播しているウイルスに典型的な抗原構造を有する。このように、ＭＮ−ｒｇｐ１２０とブレイクスルーウイルス由来のｒｇｐ１２０とを組み合わせることは、抗原性の複雑度を補い有意に広げ、そして交差中和活性の幅を広げる効果的な方法である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６および２８からなる群から選択されるＨＩＶｇｐ１２０アミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチドおよびその断片。２．該ポリペプチドがさらにフラッグエピトープ配列を含んでいる、請求項１記載のポリペプチド。３．該フラッグエピトープ配列がＨＳＶｇＤ−１フラッグエピトープ配列である、請求項２記載のポリペプチド。４．該フラッグエピトープ配列がＨＩＶｇｐ１２０アミノ酸配列に融合している、請求項２記載のポリペプチド。５．配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、ＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列をコードする５キロベースを超えないオリゴヌクレオチドおよびその断片。６．該オリゴヌクレオチドが配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５および２７およびその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項５記載のオリゴヌクレオチド。７．該オリゴヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列がさらにフラッグエピトープを含んでいる、請求項５記載のオリゴヌクレオチド。８．該フラッグエピトープがＨＳＶｇＤ−１フラッグエピトープである、請求項５記載のオリゴヌクレオチド。９．該フラッグエピトープがＨＩＶｇｐ１２０アミノ酸配列に融合している、請求項７記載のオリゴヌクレオチド。１０．ｇｐ１２０ＭＮと、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６および２８、およびその断片からなる群から選択されるＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列とを、適当な担体中に含んでなるワクチン。１１．ａ．第１のｇｐ１２０ポリペプチド配列またはその断片；およびｂ．該第１のＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列でワクチン接種されたワクチン受容者に由来するブレイクスルー単離物ＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列またはその断片を含んでなるワクチンであって、該ＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列が適当な担体中に存在しているワクチン。１２．該第１のＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列が、ｇｐ１２０ＭＮ、ｇｐ１２０Ａ２４４、ｇｐ１２０ＭＮ−ＧＮＥ６（配列番号３１）、またはｇｐ１２０ＭＮ−ＧＮＥ８（配列番号３３）を含んでなる、請求項１１記載のワクチン。１３．該ワクチンがさらに、ｇｐ１２０ＭＮ、ｇｐ１２０Ａ２４４、ｇｐ１２０ＭＮ−ＧＮＥ６（配列番号３１）、またはｇｐ１２０ＭＮ−ＧＮＥ８（配列番号３３）を含んでなる第２のｇｐ１２０ポリペプチド配列またはその断片を含んでなるワクチンであって、該第２のＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列が該第１のＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列と異なっている、請求項１２記載のワクチン。１４．該第１のｇｐ１２０ポリペプチド配列がｇｐ１２０ＭＮを含んでなり、該第２のｇｐ１２０ポリペプチド配列がｇｐ１２０Ａ２４４を含んでなる、請求項１３記載のワクチン。１５．該ブレイクスルー単離物が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６および２８、およびその断片からなる群から選択されるＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列を適当な担体中に含んでなる、請求項１４記載のワクチン。１６．該第１のｇｐ１２０ポリペプチド配列がｇｐ１２０ＭＮを含んでなり、該第２のｇｐ１２０ポリペプチド配列がｇｐ１２０ＭＮ−ＧＮＥ８（配列番号３３）を含んでなる、請求項１３記載のワクチン。１７．該ブレイクスルー単離物ＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６および２８、およびその断片からなる群から選択されるＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列を適当な担体中に含んでなる、請求項１６記載のワクチン。１８．該ブレイクスルー単離物ＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチドが該第１および第２のＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列でワクチン接種されたワクチン受容者に由来する、請求項１３記載のワクチン。１９．ワクチン受容者に由来するブレイクスルー単離物に由来するＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド配列またはその断片を、該ワクチン受容者が接種されたワクチンに加えることを含んでなる、ＨＩＶワクチンの製造方法。２０．該第１のｇｐ１２０ポリペプチド配列が、マクロファージ親和性ＨＩＶ− １種に由来する、請求項１１記載のワクチン。２１．該第１のｇｐ１２０ポリペプチド配列が、Ｔ細胞親和性ＨＩＶ−１種に由来する、請求項１１記載のワクチン。２２．該ワクチンがさらに、マクロファージ親和性ＨＩＶ−１種に由来する第２のｇｐ１２０ポリペプチド配列またはその断片を含んでなる、請求項２１記載のワクチン。２３．該第１および第２のｇｐ１２０ポリペプチド配列が異なったケモカインレセプターに結合する、請求項２２記載のワクチン。２４．該第１のｇｐ１２０ポリペプチド配列がＣＣ−ＣＫＲ−５に結合し、第２のｇｐ１２０ポリペプチド配列がＣＸＣ−ＣＫＲ−４に結合する、請求項２４記載のワクチン。２５．該ワクチンがさらに細胞毒性Ｔ細胞応答を誘導するように処理されたウイルスを含んでなる、請求項１１記載のワクチン。