CN101374550B - 病原体的非毒株依赖性扩增和针对其的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对样品中存在的、优选来自病原体感染的个体的样品中存在的任何病原体的多种变体(毒株)进行核酸扩增的方法。在优选实施方案中，病原体是逆转录病毒，如HIV。所扩增的病原体核酸可以用于鉴定样品中存在的病原体变体，定量样品中存在的病原体，以及作为核酸疫苗，或者用于制备抗原呈递细胞疫苗。通过本发明的方法产生的核酸或者其编码的蛋白质可以用于转染/庄在抗原呈递细胞。经装载的抗原呈递细胞然后可以用作治疗病原体感染的疫苗。在另一实施方案中，通过本发明方法产生的核酸可以直接用作核酸疫苗而不用先装载进抗原呈递细胞。

Description

病原体的非毒株依赖性扩增和针对其的疫苗
发明领域
本发明涉及病原体的非毒株依赖性(strain-independent)扩增，还涉及患者特异性疫苗和相关组合物。本发明的优选实施方案涉及针对逆转录病毒(如HIV和HCV)的患者特异性疫苗。
发明背景
许多病原体快速突变和重组，使得难以产生有效的疫苗。该问题在病毒病原体，尤其在RNA病毒，如HIV病毒中极其普遍。HIV感染的个体可以含有多种HIV毒株并且通常含有多个HIV准种(quasispecies)。针对治疗受病原体如HIV-1感染的个体的治疗策略面临巨大的难题：从抗病毒剂抗性的病毒毒株的发展，到这些药物的许多副作用，使得连续施用这些治疗极端困难和昂贵。
已经开发了一些治疗性HIV疫苗，然而，这些疫苗的临床试验显示出很小的功效。关于这些疫苗没有成功的一种解释是使用了包括HIV病毒基因组的共有序列的病毒载体作为免疫原。共有序列的存在不一定支持所述序列在引起针对异源病毒的免疫应答中的功效。因为共有序列和自体感染性HIV毒株之间分歧的水平仍然很高并且不断升高，所以基于HIV-1亚型B共有序列的疫苗或者抗病毒试剂不足以治疗HIV感染。此外，看起来可能出现下述情况：那些基于病毒载体的疫苗不靶定在抗原加工和呈递方面最有效的免疫系统细胞，即树突细胞。
许多出版物已经提出：使用载有HIV核酸或者肽的抗原呈递细胞作为HIV疫苗。例如，Huang等人(J Infect.Dis.2003 187：315-319)公开了载有与脂质体复合的HIV蛋白质的树突细胞，以及可能使用此类经装载的细胞作为疫苗。Weissman等人(J Immunol 2000 165：4710-4717)公开了用编码单一克隆的HIV gag序列的mRNA转染树突细胞，导致向I和II类MHC分子递送抗原性gag肽，以及在体外诱导CD4+和CD8+T细胞应答。U.S.5,853,719和U.S.6,670,186(Nair等人)描述了由从患者分离的肿瘤或者病原体获得的RNA用于体外装载自体抗原呈递细胞的用途，和它们作为疫苗的用途。然而，用载有总病原体RNA的抗原呈递细胞接种患者可以增加患者中的病原体负荷。
早已认识到了下述过程中的困难：选出能够从给定抗原的所有变体，尤其是HIV的所有变体扩增核酸的引物。在体内病毒和免疫选择的低保真度逆转录酶引起的HIV基因组的高突变率，使得HIV基因组的特定区域的扩增复杂化。然而，已经开发了可以从多种HIV变体扩增HIV基因组的某些区域的引物。例如，Abravaya等人(J ClinicalMicrobio 2000 38：716-723)公开了HIV-1特异的和HIV-2特异的引物和靶定pol基因中保守序列的探针，用于多路PCR测定法，以检测血浆中的HIV-1组M亚型A、B、C、D、E、F和G，和组O和HIV-2RNA，还公开了此类测定法用于提高血液供应的安全性的用途。
Christopherson等人(Nucleic Acids Res 1997 25：654-658)讨论了内部引物-HIV-1模板错配对用于扩增gag的142个碱基对区域的RT-PCR的影响。在HIV-1模板和长28-30个碱基的引物之间的5到6个错配(但不是2到4个错配)会显著降低RT-PCR的产率。引物被设计为比通常使用的更长以便容纳错配。通过降低退火温度到50℃并实现逐渐升高温度的逆转录步骤，可以使更趋异的HIV-1亚型A和E的扩增的降低的效率提高4倍到10倍。而且，用5-甲基胞嘧啶替代胞嘧啶，或者在可变碱基位置用次黄嘌呤取代，导致同源的和更趋异的HIV-1模板之间产物产率相差4倍以下。以T终止的引物允许在与C、G或者T匹配或者错配时进行扩增。
Michael等人(J Clin Microbiol 1999 37：2557-2563)公开了用于扩增HIV-1gag基因的155个核苷酸序列的引物。选择引物以使得与亚型A到G的30种HIV-1分离物的同源性最大化，并且使得HIV-1与接近该引物的3’末端的引物错配最小。在扩增期间退火温度降低以增加错配耐受性。与以前可获得的测试相比，优化的引物和扩增条件提高了所检测的HIV-1RNA的量，但是降低了亚型A、D、F和G，并且不含有亚型H和J的成员。
U.S.6,001,558公开了下述过程：使用多种引物扩增来自多个HIV-1分离物的LTR和pol区的短片段(＜200个碱基对)，以及来自多个HIV-2分离物的LTR、pol和env的短片段(＜200个碱基对)。然后用多种探针检测扩增产物。引物/探针组合能够检测来自组M和O的5种HIV-1分离物和两种HIV-2分离物。通过如下标准，选择对应于HIV-1的高度保守序列的引物：1)扩增的PCR产物的长度不能超过200个碱基对，因为较小的产物比更大的产物能更有效地扩增，并且对其它反应条件较不敏感；2)引物组必须扩增功能探针区以检测扩增产物；3)引物的3’末端的错配将比5’末端附近的错配远不优选；和4)3’末端稳定性、长度(约23-32个核苷酸)、GC含量和与其它引物和探针相互作用的其它标准。
U.S.6,194,142公开了使用下述引物对体外诊断HIV-1、HIV-2和SIV感染的方法，所述引物对对应于在HIV-1Bru、HIV-1Mal和HIV-1Eli、HIV-2ROD和SIV MAC毒株的gag、pol和env基因之间和HIV-2ROD和SIV MAC的nef2、vif2和vpx之间或者HIV-1Bru、HIV-1Mal和HIV-1Eli的env、nef1、vif1和vpr基因之间保守的序列。具有与HIV变体和SIV对应的变异核苷酸的引物混合物同时用于PCR反应中。
U.S.6,232,455公开了来自31种HIV-1组M(亚型(A，B和D)和组O分离物和HIV-2A和B亚型的14种分离物的共有序列的引物/探针组。HIV-1共有引物/探针组对HIV-1的检测特异，而HIV-2共有引物/探针组对HIV-2的检测特异。
U.S.6,531,588公开了用于扩增来自患者中多个HIV准种的pol的0.7kB、1.57kb或2.1kb区的引物，接种测序以确定患者特异的HIV基因型信息，其用于确定合适的疗法和检测药物抗性。
U.S.2003/0148280公开了用于检测据称所有HIV-1组M、N和O毒株的引物组和探针，所述毒株包括循环的重组形式(CRF，其指亚型之间的重组体)和组间重组体。引物靶定HIV-1gag p24(399bp扩增子)、pol整合酶(864bp扩增子)，和env gp41免疫显性区(IDR；369bp扩增子)。
这些出版物没有一份提出可能使用扩增的自体病原体核酸制备抗原呈递细胞疫苗或者核酸疫苗，所述核酸编码个体中存在的病原体的多个种的特定多肽。本发明解决了长期感受到的、对开发用来治疗自体感染病原体的患者特定疫苗的需要，并提供了额外优点。
发明概述
申请人已经发现了下述核酸扩增方法，其用于扩增：样品(优选来自病原体感染的个体的样品)中存在的任何病原体的多种变体(毒株)。在优选实施方案中，病原体是逆转录病毒，如HIV。扩增的病原体核酸可以用于鉴定样品中存在的病原体变体，定量样品中存在的病原体，和作为核酸疫苗，或者用于制备抗原呈递细胞疫苗。通过本发明方法产生的核酸可以用于转染(装载)抗原呈递细胞。所装载的抗原呈递细胞然后可以用作治疗病原体感染的疫苗。在另一实施方案中，本发明的方法产生的核酸可以直接用作核酸疫苗而不用事先装载到抗原呈递细胞中。
本发明还提供了选择适于扩增病原体的多种变体的引物的方法，所述方法包括：
a.选择用于正向引物退火的第一个区和用于反向引物退火的第二个区，其中所述第一个和第二个区在病原体的可读框和/或表位的侧翼；和
b.选择针对所述第一个和第二个区的候选正向和反向引物，其中所述引物的至少一个被设计为以弥补病原体的多种变体之间的序列变异性。
优选地，候选正向和反向引物被选为：能产生长为200个核苷酸以上，更优选长为至少225、250、300或者更多核苷酸的扩增产物。
在优选实施方案中，扩增的核酸含有转录和终止信号，其用于在体内或者体内有效转录，以产生可以体外或者体内翻译的mRNA。申请人还提供了使用本发明方法产生的核酸(优选mRNA)装载抗原呈递细胞，优选树突细胞的方法。经装载的抗原呈递细胞可用作治疗病原体感染的疫苗。
因此，在另一方面，本发明提供了下述组合物，其包含：抗原呈递细胞，所述细胞经编码下述一种或多种抗原的多种核酸转染过，所述抗原来自哺乳动物中存在的病原体的多种毒株(变体)。核酸可以来自病原体多核苷酸的核酸扩增，该扩增中使用设计成弥补所述病原体变体之间的变异性的许多引物对，并且所述抗原呈递细胞和所述病原体核酸来自所述哺乳动物或者从所述哺乳动物获得。本发明还提供了制备下述抗原呈递细胞的方法和使用本发明的疫苗治疗病原体感染的个体的方法，所述抗原呈递细胞载有感染个体的病原体的多种变体表现性核酸。优选的抗原呈递细胞是树突细胞。
一方面，本发明提供了核酸疫苗，其包含编码来自哺乳动物中存在的病原体的多种变体的一种或多种抗原的多种核酸和可药用载体，其中所述核酸是通过病原体多核苷酸的核酸扩增得到的，所述扩增使用弥补病原体的所述变体之间核苷酸序列变异性的多种引物对进行。
在另一方面，本发明提供了一种方法，用于产生表现(representing)来自病原体的至少两种毒株的一种或多种多肽的病原体扩增子，所述方法包括：(a)组合来自病原体的第一和第二种毒株的多核苷酸，以形成混合物；和(b)扩增所述多核苷酸以产生第一种扩增子和第二种扩增子；其中所述第一种扩增子编码来自所述第一种毒株的多肽，并且所述第二种扩增子编码来自所述第二种毒株的对应多肽。此类扩增子可以用作核酸疫苗，用于转染抗原呈递细胞，和用于产生体体外翻译的病原体多肽。
从病原体的多种毒株扩增靶定的病原体基因和其片段的能力绕开了纯化或者扩增总病原体核酸(如病原体DNA或者RNA基因组、RNA病毒的全长cDNA拷贝等等)的需要。例如，不管基因以核酸片段的形式还是作为连续病原体基因组存在，提供完整HIV基因组作为核酸疫苗或者用于装载到APC中都可以导致感染性病毒的重建。此外，某些病原体核酸或者多肽(例如，HIV nef或vpr)可以具有有害作用，尤其对抗原呈递细胞具有有害作用。具有有害作用的多肽或者编码多肽的核酸可以被清除，或者相对于编码其它病原体多肽的核酸以较低摩尔比存在。因此，可通过提供下述疫苗，来避免病原体感染的不利作用，如持续感染、病毒基因或者蛋白质的组成型表达，所述疫苗包含下述核酸，它们表现来自多种病原体毒株的病原体多肽，但是较完整病原体基因组表现得要少，或者编码少于所有病原体蛋白质的核酸。还可以避免有害的病原体多核苷酸和蛋白质。因此，本发明提供了包含编码来自存在的病原体的多种毒株的一种或多种多肽的核酸的组合物，其中一种或多种病原体多肽不由任何毒株所表现。所述核酸可以代表来自一个或多个个体中存在的多种病原体毒株的多肽。所扩增的病原体核酸可以从来自一个或多个受感染的个体的生物样品中存在的病原体核酸直接产生，或者可以从病原体的克隆的分离物产生。因此，在一方面，本发明提供了分离的抗原呈递细胞(APC)，其包含编码来自个体受试者中存在的病原体的多种毒株的一种或多种多肽的核酸，其中一种或多种病原体多肽不由任何毒株所表现。
在本发明的另一实施方案中，扩增的病原体核酸在体外翻译，并直接用于接种患者，或者装载有APC。病原体多肽或者装载有此类肽的APC以及可药用载体一起可以作为疫苗施用。因此，本发明提供了一种组合物，其中包含来自病原体的多种毒株的病原体多肽，其中一种或多种病原体多肽不由任何毒株所表现。本发明还提供了分离的APC，其包含来自个体受试者中存在的病原体的多种毒株的病原体多肽，其中一种或多种病原体多肽不由任何毒株表现。
在一个实施方案中，本发明提供了制备自体疫苗的方法，其包括：用编码来自下述从病原体感染的个体中或者一个或多个其它个体中存在的病原体的多种毒株的一种或多种病原体多肽的核酸，转染从病原体感染的个体得到的抗原呈递细胞，其中一种或多种病原体多肽不由任何毒株表现。
另一方面，本发明提供了制备自体疫苗的方法，其包括：将从病原体感染的哺乳动物得到或者来自所述哺乳动物的抗原呈递细胞用编码来自所述哺乳动物中存在的病原体的多种变体的一种或多种抗原的核酸转染，其中通过可以弥补病原体的所述变体之间的变异性的许多引物对，通过病原体多核苷酸的核酸扩增得到所述核酸。
在再一方面，本发明提供了治疗病原体感染的哺乳动物的方法，其包括：
a.使用可以扩增哺乳动物中存在的病原体的多种变体的许多引物对，来扩增所述病原体的多种变体的核酸，以产生扩增的病原体DNA；
b.任选地，转录所述扩增的病原体DNA以产生病原体RNA；和
c.向所述哺乳动物施用所述病原体DNA或者所述病原体RNA。
本发明的方法可以用于扩增任何病原体的核酸。此外，可以对扩增的产物加以定量，以确定病原体负载(例如，病毒负载)，并且可以测序以确定个体内的病原体进化。在优选实施方案中，病原体为HCV的HIV。本发明提供了用于扩增HIV的多种变体的引物，其基本上由SEQ ID NO：1-58，60-161和172-371组成；还提供了与选自SEQID NO：1-58，60-161和172-371组成组成的组的核酸具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成的引物；和包含选自由SEQ ID NO：1-58和60-371组成的组的引物和与SEQ ID NO：1-58和60-371有至少75％序列同一性的核酸的组合的引物对；以及含有此类引物对的试剂盒。试剂盒可以还含有一种或多种试剂，所述试剂包括但不限于，热稳定的DNA聚合酶、逆转录酶、脱氧核糖核苷酸三磷酸和CD40LmRNA。一方面，本发明提供了扩增HIV序列的非毒株依赖性的方法，其包括：用本发明的正向引物和反向引物扩增HIV DNA的多种变体。
另一方面，本发明提供了针对HIV的自体疫苗，其能引起治疗性免疫应答，所述应答针对受感染患者的独特病毒物种表达的多种确定的HIV蛋白质变体。在优选实施方案中，本发明提供了患者特异性疫苗，其由下述自体离体(ex vivo)产生的成熟树突细胞组成，所述细胞经过了编码来自自体病毒的多种HIV抗原的RNA的转染。
附图简述
图1.引物编号、5’到3’序列、长度和Tm列表。引物名中的编号对应于在HIV序列数据库(HIV Sequence Database)中具有检索号NC_001802的HIV基因组中的位置，所述数据库由Los AlamosNational Laboratory提供，并且可以在万维网上于下面http网址访问://hiv-web.lanl.gov/content/index。
图2.具有检索号NC_001802HIV的基因组的序列、gag、env、rev、vpr和nef的可读框和蛋白质序列，和引物的位置和方向。提供了正义链(SEQ ID NO：388)和互补链(SEQ ID NO：389)。
图3.使用设计的引物组从pBKBH10S质粒模板扩增gag区。使用下面的引物组：泳道1：FG1:RG1；泳道2：FG1:RG2；泳道3：FG1:RG3；泳道4：FG1:RG4；泳道5：FG1:RG5；泳道6：FG2:RG1；泳道7：FG2:RG2；泳道8：FG2:RG3；泳道9：FG2:RG4；泳道10：FG2:RG5。
图4.每次反应4个HIV亚型的多路PCR扩增。A：在60℃、62℃和65℃进行的PCR反应的琼脂糖凝胶分析。每个泳道中的引物组与图3中描述的相同。B：引物32、33和34的反向互补序列、反向引物组号和Tm。C：pBKBH10S、p93TH253.3、p90CF402.1和p93BR029.4HIV质粒模板在对应于引物32-34的区域中的比对。加下划线的“A”对应于B中显示的引物的反向互补序列中的第6位。
图5.使用多路RT-PCR从非感染性HIV RNA模板扩增GAG区。在二次PCR反应中使用嵌套引物扩增初次PCR产物。用于扩增的引物组在上面每条泳道中指出。
图6.多种HIV准种扩增的pBKBH10S、p93TH253.3、p90CF402.1和p93BR029.4HIV质粒模板的经比对序列。在实施例4中描述的PCR反应中扩增四种独特变体A、B、C和D。
图7.(a)对用RT-PCR从非感染性HIV RNA扩增的HIV VPR、REV和NEF编码区的琼脂糖凝胶分析。在二次PCR反应中，使用嵌套引物扩增初次PCR产物。用于扩增的引物组在上面每条泳道中指出。(b)使用上面每条泳道SEQ ID NOs指出的各引物对扩增的gag区的琼脂糖凝胶分析。
图8.对通过RT-PCR从自受感染的HIV患者的血浆分离的HIVRNA扩增得到的GAG编码区的琼脂糖凝胶分析。在二次PCR反应中使用嵌套引物扩增初次PCR产物。用于扩增的引物组在上面每条泳道中指出。
图9.对通过RT-PCR从自受感染的HIV患者的血浆分离的RNA扩增得到的VPR和REV编码区的琼脂糖凝胶分析。在二次PCR反应中，使用嵌套引物扩增初次PCR产物。用于扩增的引物组在上面每条泳道中指出。
图10.对在从自受感染的HIV患者的血浆分离的RNA扩增的GAG(10A；SEQ ID NO：398)、REV(10B；SEQ ID NO：399)和VPR(10C；SEQ ID NO：400)区中检测的准种的比对。点表示序列相同。
图11.VPR编码区中分离的突变影响HLA表位中的蛋白质序列。
图12.对成熟RNA转染的树突细胞中gag表达的检测。对抗-gag单克隆抗体在对照(MART)细胞(阴影线)、gag转染的细胞(实线)或者ARCA-gag转染的细胞(灰色线)上结合的FACS分析。
图13.GAG蛋白质在HeLa细胞中表达的时程(time course)。对HeLa细胞中GAG蛋白质表达的蛋白质印迹分析。来自未转染的(阴性对照泳道)或者HeLa细胞的裂解物用ARCA(A)64尾RNA转染，并在所指出的时间收获用于分析。P24阳性对照泳道含有25μgp24重组纯化的gag蛋白质。
图14.对成熟RNA转染的树突细胞中REV表达的检测。对抗-rev多克隆抗体在对照(MART)细胞(实心的)、rev-转染的(阴影线)树突细胞上结合的FACS分析。
图15.在HeLa细胞中REV蛋白质表达时程。对来自未转染的HELA细胞和用ARCA A64尾REV转染的HELA细胞的裂解物的蛋白质印迹分析。
图16.对成熟RNA转染的树突细胞中NEF表达的FACS分析。
图17.(a)对来自3名HIV患者的gag、vpr、rev和nef区的琼脂糖凝胶分析。用于每条泳道的引物组如下：
Gag：泳道1F124:R1881；泳道2F304:R1881；泳道3F334:R1881；泳道4F124:R1913；泳道5F304:R1913；泳道6F334:R1913。
Vpr泳道1F4995:R5507，泳道2F5058:R5507；泳道3F4995:R5419；泳道4F5058:R5419。
Rev  泳道1F7750:R8300；泳道2F7830:R8300；泳道3F7911:R8300。
Nef泳道1F8235:R9069；泳道2F8343:R9069。对于每个引物组的组成，见实施例6、7和8。
b)对从扩增的HIV RNA制备的gag、vpr、rev和nef体外转录物的琼脂糖凝胶分析。
图18.(A)从患者3扩增的HIV gag准种的系统树。(B)由从患者1分离的HIV准种扩增的gag p17中氨基酸替代。(C)从患者1扩增的HIV gag准种的系统树。(D)从患者1扩增的HIV rev准种的系统树。(E)从患者1扩增的HIV vpr准种的系统树。
图19.对通过从三名患者扩增的HIV RNA的体外翻译制备的gag、vpr、rev和nef蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶分析。对照泳道显示了通过从对照质粒pBKBH10S扩增的Gag RNA的体外翻译制备的gag蛋白质。
图20.将未成熟DC用四种自体HIV基因(Vpr、Rev、Nef和Gag)以及编码CD40L的RNA共转染，随后在IFN-γ存在下培养以实现完全DC成熟。装载有抗原的成熟DC用于刺激自体HIV患者PBMC。培养6天后，回收PBMC，并用对应于Vpr、Rev、Nef和gag的共有序列的四个个体重叠肽文库(两个池)再刺激。通过对每种个体HIV基因的识别应答的ICS，来确定IFN-g阳性细胞的频率。用四种HIV基因的每一种以1μg RNA/百万DC来负载DC制备物，并且在平行实验中，NEF RNA有效负载减小到0.25μg/百万DC，而其它三种基因每种以1μg RNA/百万DC转染。
图21.仅用5μg eGFP RNA/百万DC(阴性对照)转染未成熟DC，或者随后用gag共有肽脉冲经eGFP转染的DC，作为两个池。备选地，用自体Gag RNA(5ug RNA/百万DC)转染DC。在所有情况中，用CD40L RNA共转染DC，并随后在包含IFN-γ的培养基中培养以实现完全成熟。将载有抗原的DC与以前用CFSE标记的PBMC共培养。6天后，回收PBMC并测定抗原反应性(CFSE低)细胞的频率。此外，通过ICS对CFSE低细胞染色以显示作为CTL效应子功能标记的粒酶B。
图22.临床实验步骤的时间和事件表。
发明详述
本发明涉及从样品中存在的病原体的多数或者全部变体扩增核酸的方法。引物组合物、扩增产物和其衍生物，用于鉴定和定量个体中存在的病原体变体，以及，作为核酸疫苗和基于细胞的疫苗，用于治疗或者预防病原体感染。
在本公开全文中，多种出版物、专利和公布的专利说明书通过引用并入本文。这些出版物、专利和公布的专利说明书的公开内容通过引用并入到本公开文本中，以更完整地描述本发明所属的领域现状。然而，如果发生矛盾的冲突，以本说明书为准。
除非另外指出，本发明的实践使用本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在文献中有详细描述。这些方法在下面的出版物中描述。见，例如，Sambrook等人MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，2nd edition(1989)；CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人eds.(1987))；系列METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)；PCR：A PRACTICAL APPROACH(M.MacPherson等人IRLPress at Oxford University Press(1991))；PCR 2：A PRACTICALAPPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Faylor eds.(1995))；ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL(Harlow和Laneeds.(1988))；USING ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL(Harlow和Lane eds.(1999))；and ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney ed.(1987))。
定义
本文所用的一些术语具有下面定义的含义。说明书和权利要求书中，单数形式“一个(“a”、“an”)”、“这个”包括复数参考，除非上下文中明确指出。例如，术语“一个细胞”包括许多细胞，包括它们的混合物。
所有数字表示，例如，pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，其变动(+)或者(-)0.1的增量。应当理解：尽管不总是明确陈述，但所有数字表示前面都有术语“约”。还应理解：尽管不总是明确陈述，但是本文描述的试剂仅用于示例，并且它们的等同物是本领域已知的。
“扩增”指使用引物和核酸聚合物进行的核酸扩增步骤，其产生靶核酸序列的多个拷贝。此类扩增反应是本领域技术人员已知的，并且包括，但不限于，聚合酶链式反应(PCR，见U.S.4,682,195、4,683,202和4,965,188)、RT-PCR(见U.S.5,322,770和5,310,652)、连接酶链式反应(LCR，见EP 0 320 308)、NASBA或者相似的反应，如U.S.5,399,491中描述的TMA方法和缺口LCR(GLCR，见U.S.5,427,202)。如果核酸靶标是RNA，那么可以使用逆转录酶首先将RNA复制成互补DNA链(见U.S.5,322,770和5,310,652)。“扩增子”指使用扩增步骤合成的核酸。
术语“抗原”是本领域公知的，其包括免疫原性物质，即免疫原，并且包括免疫原或者抗原的多种不同制剂的任一种。
术语“抗原呈递细胞(APC)”指一类能够以抗原-MHC复合体的形式呈递一种或多种抗原的细胞，所述复合体能够被免疫系统的特异效应T细胞识别。APC包括但不限于，巨噬细胞、B细胞和树突细胞，如未成熟树突细胞、成熟树突细胞、类浆细胞树突细胞和朗格汉斯(Langerhans)细胞。
本文所用的术语“基本上由…组成”表示排除对组合具有本质重要性的任何其它元件。因此，基本上由如本文定义的成分组成的组合物将不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物、生物缓冲液和可药用载体，如磷酸缓冲盐水、防腐剂，等等。当用于引物和参考(reference)寡核苷酸的上下文中时，术语“基本上由…组成”指引物将在参考核苷酸的5’末端不具有超过10个的额外核苷酸残基，在参考寡核苷酸的3’末端也不具有超过10个的额外核苷酸残基。例如，基本上由SEQID NO：X的寡核苷酸组成的引物可以在SEQ ID NO：X的5’末端具有0到10个额外核苷酸，在SEQ ID NO：X的3’末端具有1到10个额外核苷酸。优选地，基本上由参考寡核苷酸组成的引物在参考寡核苷酸的5’和3’末端的每端具有不超过5、6、7、8或者9个的额外核苷酸。最优选地，基本上由参考寡核苷酸组成的引物在参考寡核苷酸的5’和3’末端的每端具有不超过1、2、3或者4个的额外核苷酸。
如本文所用的，包含基本上由选自SEQ ID NO：X、SEQ ID NO：Y和SEQ ID NO：Z的寡核苷酸组成的引物的组合物可以含有SEQ IDNO：X、SEQ ID NO：Y和SEQ ID NO：Z的寡核苷酸的一种或者任一组合，在每个寡核苷酸的5’和/或3’末端具有0到10个的额外核苷酸。组合物自身包含此类引物，并且因此可以还含有额外成分。
本文所用的“对应的多肽”是病原体基因的不同等位基因或者其片段编码的多肽。作为假设的实例，病毒的毒株X具有四种基因a、b、c和d，其分别编码多肽A、B、C和D。病毒的毒株Y编码相同的四种基因的不同等位基因，称作a’、b’、c’和d’，其分别编码多肽A’、B’、C’和D’。从而，A和A’是对应的多肽，B和B’是对应的多肽，等等。术语多肽指全长蛋白质及其片段。
本文所用的“表达”指多核苷酸转录成mRNA并翻译成肽、多肽或者蛋白质的过程。如果多核苷酸来自真核生物的基因组DNA，那么表达可以包括mRNA的剪接。表达所需的调节元件包括结合RNA聚合物的启动子序列和用于核糖体结合的翻译起始序列。例如，细菌表达载体可以包括启动子，如lac启动子和用于核糖体结合的转录起始、SD序列和用于翻译起始的起始密码子AUG(Sambrook等人(1989)上文)。类似地，真核表达载体可以包括RNA聚合酶II的异源或者同源启动子、下游加A信号、起始密码子AUG、用于脱离核糖体的终止密码子。此类载体可以通过商业途径或者或者按照本领域已知的方法(例如，下文描述的用于构建一般载体的方法)中描述的顺序装配。
术语“遗传修饰的”指含有和/或表达下述外源基因或者核酸序列，所述序列进而修饰细胞或者其子代的基因型或者表型。换句话说，它指对细胞内源核酸的加入、缺失或者破坏。
“HIV RNA”指基因组HIV RNA和HIV mRNA，以及通过本发明方法制备的HIV扩增子的转录产生的RNA。
“HIV变体”或者“HIV的变体”或者“HIV毒株”指HIV的任何现有的或者新的变体，其包括但不限于，HIV-1和HIV-2、HIV-1组M、N和O、所有HIV亚型(进化枝(clade))，包括HIV-1亚型A1、A2、B、C、C、F1、F2、G、H、J和K，进化枝的变体、其所有准种和循环重组形式。如本文所用的术语“毒株”，相差一个核苷酸的两种HIV分离物被认为是HIV的两种不同的“毒株”。术语“组”(group)通常用于指HIV-1谱系M、N和O。术语“亚型”用于指组内的主要进化枝。在亚型内还有进一步的序列变异性。循环重组形式(CRF)描述了重组谱系，其在HIV流行中起重要作用。CRF成员通常共有相似或相同的镶嵌结构，即它们从相同的重组事件遗传下来。HIV的循环重组形式包括但不限于：
名称           参考毒株             亚型
CRF01_AE       CM240                A，E
CRF02_AG       IbNG                 A，G
CRF03_AB       Kal153               A，B
CRF04_cpx      94CY032              A，G，H，K，U
CRF05_DF       VI1310               D，F
CRF06_cpx      BFP90                A，G，J，K
CRF07_BC       CN54                 B′，C
CRF08_BC       GX-6F                B′，C
CRF09_cpx      96GH2911             还未公布
CRF10_CD       TZBF061              C，D
CRF11_cpx      GR17                 A，CRF01_AE，G，J
CRF12_BF       ARMA159              B，F
CRF13_cpx      96CM-1849            A，CRF01_AE，G，J，U
CRF14_BG       X397                 B，G
CRG15_01B      99TH.MU2079          CRF01_AE，B
CRF16_A2D      KISII5009            A2，D
上面CRF的描述和图谱以及与HIV序列的联系可以见hiv.lanl.gov/content/hiv-db/CRFs/CRF.html。
类似地，“病原体变体”或者“病原体的变体”或者“病原体毒株”或者“病原体的毒株”指病原体的所有变体，其包括患者中可能存在的病原体的所有变体、突变体和重组体。本文所用的病原体的相差一个核苷酸的两种变体认为是病原体的两种不同的毒株。
本文所用的“体内”(in vivo)基因递送、基因转移、基因治疗等等是表示下述过程的术语：向生物(如人或者非人哺乳动物)身体直接引入包含外源多核苷酸的载体，从而在体内向生物引入外源多核苷酸。
术语“分离的”指与下述组分分离，所述组分是细胞的和非细胞的，其中在自然界中通常与多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或者其片段结合。例如，对于多核苷酸而言，分离的多核苷酸是与其通常在染色体中结合的5’和3’序列分离的多核苷酸。如本领域技术人员显而易见的，非天然发生的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或者其片段不需要“分离”以将其与其天然发生的对应物区分。此外，“浓缩的”、“分离的”或者“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或者其片段与其天然发生的对应物可区分，因为每体积的分子浓度或者数目与其天然发生的对应物相比大于“浓缩的”或者小于“分离的”。在一级结构或者例如在糖基化模式中与其天然发生的对应物不同的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或者其片段不必以其分离的形式存在，因为它能与其天然发生的对应物通过一级序列，或者备选地通过另一特征如糖基化模式相区别。尽管没有对本文公开的本发明的每一种实施方案都进行明确陈述，但是应当理解，本发明提供了在下文公开的和在合适条件下的每一种组合物的所有上述实施方案。因此，非天然发生的多核苷酸作为较之分离的天然发生的多核苷酸而言单独的实施方案提供。在细菌细胞中产生的蛋白质作为较之从真核细胞分离的天然发生的蛋白质而言单独的实施方案提供，所述天然发生的蛋白质在所述真核细胞中天然产生。分离的哺乳动物细胞，如抗原呈递细胞与其在哺乳动物中的正常位置分离或者从该位置除去。
“抗原呈递细胞(APC)的装载”指抗原、其表位、肽、蛋白质或者编码前述的核酸被APC摄入。APC可以在体外或者原位装载。
“mRNA”指可翻译的RNA。mRNA将含有核糖体结合位点和起始密码子。优选地，mRNA将还含有5’帽、终止密码子和加A尾。
“多路(multiplex)聚合酶链式反应(PCR)”是PCR的变型，其中使用多种引物对在一次扩增反应中同时扩增两种或多种靶序列。作为非限制性实例，多路扩增包括不同基因、一种基因的不同等位基因和一种基因的不同片段的扩增反应。优化多路PCR条件的方法在Abravaya等人J Clinical Microbiol 2000 38：716-723；Kremer at al.J Clin Microbiol 2004 42：3017-3022；Garcia-Canas等人Electrophoresis 2004 25：2219-2226；and Markoulatos等人J ClinLab Anal 2003 17：108-12中公开，将它们的内容通过引用并入本文。
本文所用的“病原体”指任何致病生物或者病毒，以及其减毒衍生物。
“药物组合物”意在包括活性剂与惰性或活性载体的组合，得到适于在体外、体内或者离体诊断或者治疗用途的组合物。
本文所用的术语“可药用(pharmaceutically acceptable)载体”包括任何标准药物载体，如磷酸缓冲盐溶液、水和乳液，如油/水或者水/油乳液，和多种类型的增湿剂。组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。关于载体、稳定剂、佐剂的实例，见Martin REMINGTON’S PHARM.SCI.，18th Ed.(Mack Publ.Co.，Easton(1990))。
“有效量”是足够实现有益或者所希望的结果的量。在一次或多次施用、应用或者剂量中可以施用有效量。
术语“多核苷酸”和“核酸分子”可互换使用，指核苷酸的任何长度的多聚形式。多核苷酸可以含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物。核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知功能。术语“多核苷酸”包括例如单链、双链和三螺旋分子、基因或者基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。除了天然核酸分子，本发明的核酸分子还可以包含修饰的核酸分子。
“引物”指可以用于扩增反应的长为9到150个核苷酸的寡核苷酸。基本上由SEQ ID NO：X组成的引物将在SEQ ID NO：X的5’末端不具有超过10个额外核苷酸，在SEQ ID NO：X的3’末端也不具有超过10个额外核苷酸。“正向引物”指下述引物，其可通过RNA聚合酶或者DNA聚合酶延长成对应于正义链或者翻译的mRNA的序列的核酸。“反向引物”指下述引物，其可通过RNA聚合酶或者DNA聚合酶延长成与所述有义链或者翻译的mRNA互补的核酸。“引物对”指可以用于扩增反应以产生扩增子的正向和反向引物。
术语“RNA”指核糖核苷酸的任何长度的聚合形式，其中核糖核苷酸或者核糖核苷酸类似物通过磷酸二酯键连接在一起。术语“RNA”包括例如，单链的、双链的和三螺旋分子、初级转录物、mRNA、tRNA、rRNA、体外转录物、体内合成的RNA、支链多核糖核苷酸、任意序列的分离的RNA，等等。
按照下文所述来对序列之间同源性或者序列同一性(这两个术语在本文可互换使用)进行计算。为确定两条氨基酸序列或者两条核苷酸序列的百分比同一性，针对最佳比较的目的莱比对序列(例如，为了最佳比对，可以在第一个和第二个氨基酸间或者核酸序列间之一或两者中都引入缺口，并且为了比较目的可以不考虑非同源序列)。当比对不同长度的两种引物或者候选引物时，较短引物的长度将为较长序列长度的至少60％，甚至更优选至少70％、80％、90％、100％。为了比较启动子引物(例如，T7启动子引物)和聚dT引物之间的百分数同一性，比较中省略编码区。非编码指可读框外的区域。然后比较对应的氨基酸位置或者核苷酸位置上的氨基酸残基或者核苷酸。当第一条序列中的一个位置被与第二条序列中对应位置相同的氨基酸残基或者核苷酸占据时，这两个分子在该位置上是同一的(如本文所用的氨基酸或者核酸“同一性”等同于氨基酸或者核苷酸“同源性”)。两条序列之间的百分比同一性是这些序列共有的同一位置数目的函数，考虑到缺口数目的话，还是每个缺口长度的函数，为条两个序列的最佳比对需要引入所述缺口。
对序列的比较以及对两条序列之间百分数同一性的确定可以使用数学算法完成。在优选实施方案中，使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(1970)48：444-453)算法确定两条氨基酸序列之间的百分数同一性，所述算法已经整合到GCG软件包(可以在万维网上的gcg.com得到)中的GAP程序中，所述确定使用Blossum 62矩阵或者PAM250矩阵，和16、14、12、10、8、6、或者4的缺口长度和1、2、3、4、5或者6的长度权重。在再一个优选实施方案中，使用GCG软件包(可以在万维网上的gcg.com得到)中的GAP程序确定两个核苷酸序列之间的百分数同一性，所述确定使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口权重和1、2、3、4、5或者6的长度权重。尤其优选的一组参数(和如果操作人员不知道哪些参数将用来确定分子是否在本发明内时将使用的一组参数)是使用Blossum 62得分矩阵，缺口打开惩罚为12，缺口延伸惩罚为4，移码缺口惩罚为5。
可以使用已经整合到ALIGN程序(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller(CABIOS，4：11-17(1989))的算法，使用PAM120权重残基表、缺口长度惩罚12和缺口惩罚4来确定两个氨基酸或者核苷酸序列之间的百分数同一性。
本文描述的核酸和蛋白质序列可以用作“查询序列”来对公共数据库进行检索以例如鉴定其它家族成员或者相关序列。此类检索可以用Altschul，等人(1990)J.Mol.Biol.，215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)进行。可以用NBLAST程序，得分＝100，字长＝12进行BLAST核苷酸检索以得到与本发明的病原体核酸分子和引物同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质检索以得到与本发明的EPLIN蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了得到用于比较目的的缺口比对，可以使用如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.，25(17)：3389-3402中描述的Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。见ncbi.nlm.nih.gov。
快速突变的病原体，如HIV，给疫苗接种带来了困难的靶标。以前针对病原体的接种策略针对常见毒株或者共有序列。然而，这些策略不能提供针对快速突变或者重组的病原体的保护或者治疗效果，在所述病原体中，病原体靶标非常易变。开发自体病原体疫苗，如自体HIV疫苗，尤其可以同时靶定感染患者的所有变体的疫苗代表了治疗学中新的范例。用能引导针对个体中存在的特定病原体抗原的免疫应答的疫苗治疗受病原体感染个体的能力应被证明为比针对共有抗原的疫苗(如以前的HIV疫苗)更有效，所述针对共有抗原的疫苗迄今为止显示出几乎不能或者不能介导病毒清除或者抑制病毒负荷。
本发明的一个目的是提供一种用于治疗病原体的患者特异性疫苗接种策略，其中使用弥补个体内存在的病原体变异性的个人化的细胞或者核酸疫苗。该策略依赖于从受感染的受试者扩增病原体核酸，和此类扩增的病原体材料、或者其衍生物在患者特异疫苗中的用途。所扩增的病原体核酸或者其衍生物(例如，体外转录产物、体外转录/翻译产物，或者含有此类扩增的核酸的载体)可以用作自体或者同种异体核酸疫苗，或者加载到自体抗原呈递细胞(APC)，如树突细胞(DC)上，然后将所述施用于患者。此外，扩增的产物可以用于鉴定受感染的个体中存在的病原体变体和监视治疗介入的效果。
聚合酶链式反应(PCR)和其它核酸扩增技术提供了得到编码目的特异病原体病原的DNA的方便和有效的方法。然而，由于一些病原体(尤其逆转录病原体，如HIV)的高突变频率，在本发明之前，设计可以可靠地扩增个体患者中存在的病原体变体的靶定区域的PCR引物是一个重要挑战。例如，尽管在编码区侧翼HIV序列中异质性低得多，但是不存在使得能够为每个目的基因设计一种通用引物对的绝对保守的区域。因此，本发明的方法使用正向和反向抗原体特异性引物库，用于目的病原体基因或者其部分的核酸扩增，从而使得受感染的个体中存在的病原体的多数或者所有毒株将与至少一种正向和一种反向引物反应，以引发不同靶序列的扩增。
本发明提供了病原体核酸的非毒株依赖性的核酸扩增方法，其中使用弥补了引物退火位点处病原体核酸中变异性的多种引物对和扩增条件。使用这些方法，可能从受感染的个体中存在的病原体的几乎所有变体扩增所有或者靶定部分。对个体中存在的全部或者多数病原体的扩增产生扩增子，其可以用于鉴定定量受感染的个体中存在的变体。此类扩增子或者其衍生物可以用于基于细胞的疫苗或者核酸疫苗中，以治疗病原体感染，和/或鉴定受感染的个体中存在的病原体变体。这些扩增产物(扩增子)可以直接使用，或者可以转化成可翻译的RNA，用于原位或者在体外装载到APC，优选自体APC中。从转录物制备的扩增子和体外转录物可以用作核酸疫苗。从此类体外转录物制备的体外翻译的多肽可以用作多肽疫苗和用于装载APC。
病原体核酸的非毒株依赖性的扩增的一个重要方面是选择引物和扩增条件。申请人已经发现了选择能够扩增病原体核酸的不同区域的引物对的方法。为了以非毒株依赖性的方式从易变病原体(如HIV)扩增所选的靶抗原，可以对PCR引物库进行策略性选择，以确保预期靶标的可靠扩增和现有变体的同时共扩增。
靶定用于扩增的自体抗原的数目和对其进行的选择可以根据两个主要因素预测：(1)靶基因的实质区域应该服从使用具有可控复杂性的引物库进行的核酸扩增，和(2)优选地，靶抗原的表达不会不利地影响靶标APC(如DC)的生物学(biology)。通过扩增病原体核酸的特定区域，而不是总的病原体核酸，可能可以选出编码最具免疫原性片段的区域，以及可以避免对免疫系统具有副作用的区域。例如，涉及对树突细胞的抑制的HIV nef基因的部分可以通过选择不扩增负责抑制的nef区域的引物来避免。
可以设计对应于病原体的已知变体的多种引物，用于在靶标基因座杂交。然而，为了控制引物复杂性，首先确定已知的病原体变体之间的保守核苷酸序列是有用的。选择与病原体核酸的保守区域杂交的引物能减少确保扩增个体中存在的病原体的所有或者多数变体所需的引物的数目。引物选择中另一重要的考虑是引物序列的3’的一半中与已知的变体退火位点的错配应被避免或者减到最小，然而，3’末端错配的T通常对扩增没有不利影响。通过降低退火温度可以弥补剩余的3’错配。在引物序列的5’部分的错配可以耐受并且可以通过降低退火温度来弥补。可以优化扩增反应条件以允许扩增受感染的个体中存在的所有病原体变体而避免非特异扩增。因此，使用本发明的引物和/或方法扩增允许鉴定和定量个体中存在的病原体的所有变体。相比，现有技术方法通常低估了存在的病原体的量，因为仅仅鉴定了一种病原体变体。
上述和下面实施例中描述的用于选择能够扩增HIV的多种变体的引物对的方法可以用于选择能够扩增任何病原体的多种变体的引物对。本文描述的引物选择方法包括步骤：选择用于正向引物退火的第一个区和用于反向引物退火的第二个区，其中所述第一个和第二个区域在可读框和/或病原体表位的侧翼；和选择所述第一个和第二个区域的候选正向和反向引物，其中至少一种所述引物设计用来弥补病原体的多种变体之间的序列变异性。
在本发明的一个实施方案中，通过上面的方法设计引物，以从受感染的哺乳动物中存在的病原体的多种变体扩增核酸。所扩增的核酸然后可以用于自体核酸疫苗中，以治疗受相同病原体感染的哺乳动物。备选地，扩增的核酸可以用作同种异体(allogenic)核酸疫苗来治疗受所述病原体感染的不同哺乳动物，或者作为预防性疫苗来预防感染。对于预防性用途，使用从一个或多个个体分离或者衍生的病原体核酸制备的扩增子制备核酸疫苗或者载有核酸的APC。
从而，在一个实施方案中，本发明提供了产生表现来自病原体的至少两种毒株的一种或多种多肽的病原体扩增子的方法，其包括：(a)将来自病原体的第一种和第二种毒株的多核苷酸组合以形成混合物；和(b)扩增所述多核苷酸以产生第一种扩增子和第二种扩增子；其中所述第一种扩增子编码来自所述第一种毒株的多肽，所述第二种扩增子编码来自所述第二种毒株的对应的多肽。例如，可以从一种或多种病原体感染的个体的生物样品、从一种或多种病原体培养物、从克隆的病原体或者克隆的病原体核酸得到第一和第二种毒株的多核苷酸。通过此类扩增子的体外转录产生的扩增子和RNA用作核酸疫苗和用于装载抗原呈递细胞。
在另一实施方案中，本发明提供了核酸疫苗，其包含来自哺乳动物中存在的病原体的多种变体的一种或多种抗原的多种核酸和可药用载体，其中所述核酸通过病原体多核苷酸的核酸扩增得到，该扩增使用可以弥补病原体的所述变体之间变异性的多种引物对。
在另一实施方案中，本发明提供了治疗感染的方法，所述方法包括对所述病原体感染的哺乳动物施用上面的核酸疫苗。
类似地，本发明提供了制备核酸疫苗的方法，其包括：将编码来自哺乳动物中存在的病原体的多种变体的一种或多种抗原的多种核酸与可药用载体组合，其中所述核酸通过病原体多核苷酸的核酸扩增得到，该扩增使用可以弥补病原体的所述变体之间变异性的多种引物对。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的抗原呈递细胞(APC)，其包含编码来自个体受试者中存在的病原体的多种毒株的一种或多种多肽的核酸，其中一种或多种病原体多肽不由任何毒株所表现。作为假的实例，假设病毒具有总共三种基因a、b和c，它们编码多肽A、B和C。该病毒是快速突变的，从受感染的患者分离到该病毒的两种毒株：毒株X和Y。毒株X具有等位基因a’、b’和c’，其编码多肽A’、B’和C’。毒株Y具有相同基因的不同等位基因，它们表示为a*、b*和c*，并且编码变体多肽A*、B*和C*。如上面指出的，上面的抗原呈递细胞包含编码来自病原体的多种毒株(例如，病毒的毒株X和Y)的一种或多种病原体多肽的核酸，但是至少一种病原体多肽不由任何毒株所表现。这意味着APC可以含有表现三种基因的一种或两种的每一种等位基因的多核苷酸。例如，APC可以含有编码A’、A*、B’和B*，但不编码C’或C*的多核苷酸。这里不由任何毒株所表现的病原体多肽是多肽C，其中C’和C*都不表现。本文所用的术语多肽指全长蛋白质和其片段。从而，APC可以含有编码A’、A*、B’、B*的核酸，和C’和C*的对应片段，但不含有C’和C*全部。该方法相对于使用编码所有病原体多肽的核酸的优点是它避免了重建感染性病原体。额外优点是可以特异避免编码对患者或者抗原呈递细胞有害的多肽的核酸。
本发明的核酸疫苗适合施用于哺乳动物。在优选实施方案中，哺乳动物是灵长类，最优选是人。最优选地，将本发明的核酸疫苗施用于其中所述病原体多核苷酸来自该哺乳动物的特定哺乳动物。例如，在优选实施方案中，从受感染的患者分离病原体多核苷酸，并对该患者施用核酸疫苗。
本发明的疫苗包含编码来自病原体的多种变体的一种或多种抗原的多种核酸。核酸可以是单链或者双链RNA或者DNA。在优选实施方案中，核酸是RNA，最优选地，核酸是mRNA。本发明的核酸疫苗将能够在它们所施用的哺乳动物中一种或多种细胞类型中表达。表达是指核酸可以直接翻译(例如，可翻译的RNA)，或者可以转录以产生可翻译的mRNA(或者包含启动子和起始密码子以及可读框的DNA)和/或可以整合到它所引入的哺乳动物细胞的基因组中后转录(例如，线性DNA、DNA载体、RNA病毒载体和DNA病毒载体)。可以通过体内转录(作为初级或者加工的转录物)，或者通过体外转录产生可翻译的mRNA。在优选实施方案中，用于本发明疫苗中的核酸是RNA，最优选地，是mRNA。
术语病原体指涉及疾病的病因的任何病原体或者生物以及其减毒衍生物。此类病原体包括，但不限于，细菌、原生动物、真菌和病毒病原体，如螺旋杆菌属(Helicobacter)，如幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylor)，沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、弯曲杆菌属(Campylobacter)，多种分枝杆菌，如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、鼠疫耶氏菌(Yersinia pestis)、土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)、布鲁氏菌(Brucella)物种、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、葡萄球菌属(Staphylococcus)，如金色葡萄球菌(S.aureus)，链球菌属(Streptococcus)、梭菌属(Clostridum)、白色念珠菌(Candida albicans)、疟原虫属(Plasmodium)、利什曼原虫属(Leishmania)、锥虫属(Trypanosoma)、人免疫缺陷病毒(HIV)、HCV、HPV、CMV、HTLV、疱疹病毒(例如，1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、冠状病毒、水痘-带状疱疹病毒，和EB病毒)、乳头瘤病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒，和风疹病毒。本发明的方法尤其可用于从高度易变的病原体，如病毒病原体，优选逆转录病毒病原体，最优选HIV和HCV扩增核酸。
病原体的变体或者毒株指病原体的任何衍生物。此类衍生物可以通过病原体的突变或者重组或者重组操作发生(或者可能已经发生)。例如，HIV的变体包括已知的和未鉴定的HIV变体，并且包括，但不限于HIV-1组M、N和O，所有HIV亚型或者进化枝，包括HIV-1进化枝A1、A2、B、C、C、F1、F2、G、H、J和K、进化枝的变体、HIV-2的所有变体和其所有重组体和准种。
“病原体的多种变体”或者“病原体的多种毒株”意在包括受感染的个体中存在的病原体的变体。病原体的多种变体可以同时或者分别引入个体中。备选地，多种病原体变体可以通过突变和/或重组在个体内产生。例如，在优选实施方案中，病原体是逆转录病毒，优选HIV。受感染的个体中存在的病原体(HIV)的多种变体可以包括该个体中存在的任何HIV。在此类情况中，HIV的多种变体可以包括HIV-1，包括HIV-1组M、N和O、其亚型、进化种和准种的任一种或全部，以及HIV-1和其变体，和还未鉴定的HIV的进化枝。
抗原是指包含一个或多个免疫原性表位的多肽。例如，本发明的扩增的核酸可以编码一个或多个可读框，或者一个或多个可读框的部分。例如，在一种优选实施方案中，病原体是HIV，并且扩增的核酸编码来自受感染的个体中存在的HIV的每一种或者至少多数变体的一种或多种HIV多肽的一个或多个可读框，或者其部分。优选的HIV多肽是gag、rev、nef、vpr和env和其片段或者表位。vpr的优选的表位(使用NC_001802作为参考序列)由核苷酸5105-5320(编码vpr氨基酸残基1-72)；5138-5320(编码vpr氨基酸残基2-72)；5105-5165(编码vpr氨基酸残基1-20)和5138-5165(编码vpr氨基酸残基12-20)；和其它HIV变体的对应片段编码。额外优选的vpr片段是残基25-40、29-37、30-38、31-39、31-50、34-42、41-49、52-62、53-63、55-70、59-67和62-70。额外的片段和表位可以见因特网网站：(//hiv.lanl.gov/content/immunology/)上可以得到的HIV分子免疫学数据库(HIV Molecular Immunology Database)，其内容通过引用并入本文。
病原体多核苷酸是模板或模板来源，用于扩增编码一种或多种病原体抗原或者表位的核酸。病原体多核苷酸可以是DNA或者RNA。作为非限制性实例，病原体多核苷酸可以是DNA，如病原体基因组、DNA载体或者片段，或者整合到病原体宿主的基因组中的病原体DNA。当病原体多核苷酸是DNA时，它可以直接用作根据本发明方法扩增的扩增模板。
病原体多核苷酸还可以是病原体基因组(例如逆转录基因组)或者病原体mRNA形式的RNA，其可以是剪接的或者未剪接的。例如，对于HIV的情况，核酸可以是DNA，其对应于宿主基因组中整合的病毒DNA，或者对应于病毒整合到宿主基因组之前细胞中存在的HIVcDNA。HIV RNA可以是病毒RNA基因组的形式，其从病毒颗粒分离或者在病毒复制期间从宿主细胞分离，并且还可以是剪接的或者未剪接的HIV mRNA的形式。在优选实施方案中，病毒RNA是从HIV病毒体分离的HIV基因组RNA。对于病原体多核苷酸是RNA的情况，它可以逆转录以产生cDNA，其然后可以作为核酸扩增的模板。
优选地，病原体多核苷酸来自或者得自受感染的个体中存在的多种病原体变体。在该上下文中，“得自”指所述核酸从病原体或者含有病原体核酸的细胞至少部分纯化，或者所述核酸是从病原体核酸扩增得到的。通过从个体中存在的多种病原体变体得到核酸，所得疫苗可以引起针对个体中存在的病原体的可能所有变体的免疫应答。
使用根据本发明方法选择的引物，通过核酸扩增产生的初级扩增子将包含编码病原体抗原或者其表位的DNA。初级扩增子可以不经进一步修饰而用于核酸疫苗。备选地，初级扩增子可以插入到表达盒或者表达载体中，用于核酸疫苗、病毒疫苗或者装载到APC中。在优选实施方案中，初级DNA扩增子被修饰，以体外转录的模板发挥作用。
为了转录模板DNA序列(例如，PCR产物)，模板应该含有RNA聚合酶结合位点或者启动子。此外，为了在真核细胞中有效翻译，转录的RNA优选含有5’帽、包括ATG翻译起始密码子的Kozak序列，和在其3’末端的多聚腺苷酸化序列。优选地，转录的RNA将还含有翻译终止密码子(UAA、UAG或UGA)。这些转录和翻译信号中的一些，如启动子、Kozak序列、起始和终止密码子可以存在于靶标病原体核酸的模板中，并且可以在PCR或者其它扩增反应期间扩增。备选地，这些序列可被包括于用于任一扩增阶段的正向和反向引物中。
如果预期的疫苗是用于原位施用或者装载到APC的mRNA疫苗，那么5’嵌套引物中含有的启动子序列应当适于体外转录。适于体外转录的引物和体外转录方法是本领域技术人员已知的。作为非限制性实例，优选的启动子是对应于通过商业途径可获得的RNA聚合酶的启动子，如T7启动子和SP6启动子。其它有用的启动子是本领域技术人员已知的。如果预期的疫苗含有预期用于靶细胞内转录的核酸，那么5’引物序列中所含启动子应当是在预期的靶细胞中有活性的启动子。此外，对于疫苗含有预期用于靶细胞内转录的核酸的情况，可以从模板扩增启动子和转录起始信号，将其掺入到正向引物，或者通过将扩增子插入到表达表达盒。优选地，启动子允许使用通过可商业途径获得的体外转录试剂盒有效转录。体外转录和翻译方法是本领域技术人员已知的(见，例如，U.S.2003/0194759)。在通常的体外转录反应中，在所有四种核糖核苷三磷酸和帽二核苷酸如m7G(5’)ppp(5’)G或者帽类似物如ARCA存在下，使用噬菌体RNA聚合酶转录DNA模板。
在初级扩增期间使用的引物中或者在随后轮中使用的嵌套引物中，可以包括启动子和翻译起始信号。用于可选的第二轮扩增中的引物的退火靶标可以与用于初级扩增反应中的相同，或者它可以是初级扩增子的内部位点(“嵌套的”)。在优选实施方案中，用于初级或者次级(优选次级)轮的扩增中的正向引物将包含编码启动子(例如，T7启动子)的5’非杂交区(“突出端”)，和与初级扩增子的反义链互补的3’区。通常，正向引物将含有Kozak序列，优选优化的Kozak序列，例如，碱基5’CCACCATGG(SEQ ID NO：59)，其中加下划线的ATG是翻译起始密码子。包括ATG起始密码子的Kozak序列可以在正向引物的5’突出端区，或者在引物的3’退火区，这取决于此类序列是否存在于初级扩增子中。此外，如果初级扩增子含有不够最佳的Kozak序列，那么可以用正向引物对其进行优化，该正向引物具有最佳的(尽管不是完全互补的)Kozak序列。优选地，正向引物的3’部分将与ATG起始密码子立即下游的序列或者初级扩增期间扩增的最5’编码区基本上互补。逆向引物优选在其5’末端含有5’多聚T突出端，其将作为体外转录期间多聚腺苷酸化的模板。反向引物的3’部分将与初级扩增反应中分离的正义序列互补。如果在初级扩增子中不存在合适的翻译终止密码子，那么它可以包括在反向引物的5’突出端部分。使用如上述的引物扩增所得的次级扩增子可以在m7G帽或者其类似物如ARCA(见U.S.2003/0194759)存在下用作体外转录反应的模板。
从而，在另一实施方案中，本发明提供了治疗病原体感染的哺乳动物的方法，所述方法包括：
a.使用可以扩增哺乳动物中存在的病原体的多种变体的多种引物对，扩增该病原体的多种变体的核酸以产生扩增的病原体DNA；
b.任选地将所述扩增的病原体DNA转录以产生病原体RNA；和
c.对所述哺乳动物施用所述病原体DNA或者所述病原体RNA。
配制和向受试者递送所述核酸疫苗的方法是本领域技术人员已知的。见例如，Scheel等人Eur J Immunol(2204)34：537-547；Hoerr等人(2000)Eur J Immunol 30：1-7；Liu et al(2002)Vaccine 20：42-48；Riedl等人(2002)J Immunol 168：4951；Riedel等人(2004)J MolMed 82：144；U.S.5,783,567；U.S.6,603,998；EP0880360；EP1083232；通过引用将其内容并入本文。施用途径包括，但不限于，局部递送、皮肤的电穿孔，以及皮肤、皮下、皮内、粘膜和肌内施用，等等。
作为使用初级或者次级扩增子或者体外转录的RNA作为核酸疫苗的备选方案，可将此类核酸体外装载进抗原呈递细胞。然后被装载的抗原呈递细胞适于作为疫苗。
从而，在另一实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含：抗原呈递细胞，该细胞用编码来自哺乳动物中存在的病原体的多种变体的一种或多种抗原的多种核酸转染，其中所述核酸来自病原体多核苷酸的核酸扩增，该扩增使用可以弥补所述病原体变体之间变异性的多种引物对，并且所述抗原呈递细胞和所述病原体核酸来自或者得自所述哺乳动物。
抗原呈递细胞(APC)包括，但不限于，巨噬细胞、B细胞和树突细胞，如未成熟树突细胞、成熟树突细胞和朗格汉斯细胞。专职抗原呈递细胞，尤其树突细胞(DC)提供了通过影响CD4+和CD8+T细胞刺激细胞介导的免疫的有力载体(Banchereau 1998，Banchereau2000)。它们的功能所固有的：它们有效加工抗原，以呈递在I和II类MHC上，以产生CD4+和CD8+T细胞。通过表面抗原富集技术从外周血或者骨髓分离或者从PBMC的培养物收获的树突细胞可以装载特定候选抗原，并且能够将相关抗原呈递到幼稚或者静止T细胞(Heiser 2000，Mitchell 2000)。优选地，抗原呈递细胞是将接种的个体自体的，并且病原体核酸也是从患者分离或者得到的。
抗原呈递细胞通过哺乳动物受试者产生或在其中产生，或者得自从哺乳动物受试者中分离的细胞。在一种优选实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞。术语“树突细胞(DC)”指在多种淋巴组织和非淋巴组织中发现的(Steinman(1991)Ann.Rev.Immunol.9：271-296)或者从体外树突细胞前体获得的形态上相似的细胞类型的不同群体。树突细胞是最有效的APC，其能提供T细胞活化和增殖必需的信号。树突细胞来自骨髓祖细胞，少数在外周血中循环并且表现为未成熟的朗格汉斯细胞或者终末分化的成熟细胞。在优选实施方案中，树突细胞从单核细胞分化而来。用于分离抗原呈递细胞(APC)，和产生树突细胞前体和成熟树突细胞的方法是技术人员已知的。见，例如，Berger等人J Immunol Methods 2002 268：131-40，美国专利申请20030199673，20020164346和60/522,512，和WO 93/20185，将它们的内容通过引用并入本文。在一种优选实施方案中，通过Romani等人(J Exp Med 1994180：83-93)或Sallusto等人(J Exp Med 1994179：1109-1118)中描述的方法从CD14+外周血单核细胞(PBMC)制备树突细胞，所述文献内容通过引用并入本文。备选地，通过Caux等人(J Exp Med 1996184：695-706)的方法从CD34+细胞制备树突细胞。
用于装载抗原呈递细胞的方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于，电穿孔、被动摄取、脂转染、阳离子试剂、病毒转导、CaPO4等等。见，例如，PCT/US05/22705和美国序列号60/583,579；美国公布号2003/0143743；美国公布号20050008622；美国公布号20040235175；和美国公布号20040214333，将它们的内容引入作为参考。在优选实施方案中，用CD40L mRNA和编码病原体多肽的多种毒株的RNA二者来装载抗原呈递细胞。用于转染抗原呈递细胞的人CD40L cDNA、CD40L蛋白质和优选的CD40L mRNA分别在SEQ IDNO：407和408中显示。在优选实施方案中，mRNA对应于SEQ IDNO：410的核苷酸38-877。优选地，mRNA在5’加帽并且多聚腺苷酸化。在优选实施方案中，帽是ARCA。优选的多聚A尾长度为50-1000个核苷酸，更优选64-900个核苷酸，最优选101-600个核苷酸。在另一实施方案中，用下述多肽装载抗原呈递细胞，所述多肽是通过体外翻译编码来自病原体的多种毒株的病原体多肽的RNA产生的。病原体多肽可以装载进具有CD40L mRNA的抗原呈递细胞。成熟或者未成熟的树突细胞可以在体外被装载。被装载的未成熟树突细胞在接种前可以在体外成熟，或者在体内成熟(使用或不用外源成熟刺激)后接种。备选地，可以将核酸在原位递送到抗原呈递细胞。见，例如，Liu等人(Vaccine 2002 20：42-48)，Lisziewics等人(Vaccine2003 21：620-623)和O’Hagen(Curr Drug Targets Infect Disord 20011：273-286)，其内容通过引用并入本文。
优选地，上面组合物中的抗原呈递细胞是树突细胞。经装载的树突细胞可以用作疫苗来治疗患者中的病原体感染。优选地，病原体和抗原呈递细胞(例如，树突细胞)是所治疗的患者自体的。
在另一实施方案中，本发明提供了制备自体疫苗的方法，所述方法包括：将从病原体感染的哺乳动物得到或者得来的抗原呈递细胞用编码所述哺乳动物中存在的病原体的多种变体的一种或多种抗原的核酸转染，其中使用设计用来弥补病原体的所述变体之间的变异性的多种引物对，通过病原体多核苷酸的核酸扩增得到所述核酸。
本发明还提供了包含上述经装载的抗原呈递细胞的疫苗。在此类疫苗中，经装载的抗原呈递细胞将处于适合治疗性施用给患者的缓冲液中。疫苗可以还包含用于刺激抗原呈递细胞或者T细胞的因子佐剂。配制药物组合物的方法是本领域技术人员已知的。见例如，Remington’s Pharmaceutical Science的最新版本。
本领域技术人员可以确定树突细胞疫苗的最优免疫接种间隔。在优选实施方案中，将用每剂1x106到1x107个活的RNA装载的DC对患者接种5次。为接种所选的剂量水平预期是安全和良好耐受的。
分离、制备、转染、配制抗原呈递细胞和将其施用于患者的方法是本领域已知的。见例如，Fay等人Blood 200096：3487；Fong等人J Immunol 2001b 166：4254-4259；Ribas等人Proc Am Soc ClinOnc 2001 20：1069；Schuler-Thurner等人J Exp Med.2002 195：1279-88.Erratum in：J Exp Med.2003197：395；和Stift等人J ClinOncol 2003 21：135-142，其内容通过引用并入本文。
临床上使用的APC施用途径包括但不限于，静脉内(IV)、皮下(SC)、皮内(ID)，和淋巴管内途径。已经报导了其它APC疫苗的IV、SC和ID给药后的客观临床应答。当前，逐渐倾向于进行ID施用，因为真皮是树突细胞的正常停留处，已知树突细胞从真皮迁移到引流淋巴结。在鼠模型中，SC注射的树突细胞后来被发现在引流淋巴结的T细胞区中并且引发保护性抗肿瘤免疫，其优于IV免疫后引起的保护性抗肿瘤免疫。小鼠实验证据表明，在产生抗肿瘤免疫性或者细胞毒性T淋巴细胞中，树突细胞直接注射到淋巴结优于其它递送途径(Lambert等人Cancer Res 2001 61：641-646，其内容通过引用并入本文)。这表明，应该递送整个树突细胞剂量，从而使得它能影响单个引流淋巴结或者骨盆(而不是将所述剂量在多个部位分配以处理尽可能多的淋巴结)。
为了评估疫苗的免疫原性，通过跟踪CD4+和CD8+T细胞的成熟谱可以监测接种的个体中的免疫应答。例如，通过表达效应器T细胞，CD45 RA+CCR7-的表型并分泌升高水平的IFN-γ和粒酶B的细胞的存在，可以确定HIV特异性效应细胞功能的恢复。通过用经HIV-RNAs转染的树突细胞刺激后细胞产生IL-2和变成低CFSE的能力，可以确定HIV-特异性增殖应答的恢复。HIV特异性记忆T细胞区域的恢复。
使用流式细胞术测定法，通过表面和细胞内标记，可以测量疫苗诱导的特定T细胞的成熟。将通过包括αβTCR、CD45RA、CCR7和CD107的表面标记或者细胞内分子如粒酶B或者γ-IFN的染色来监测CD8+T细胞。CD3、CD4、CCR7和IL-2可以用于监视CD4+T细胞。此类测定法可以用于监视在用包含来自患者的自体HIV序列的肽温育后的免疫应答。对基线处的细胞免疫应答和每次新的接种之前每月测量的细胞免疫应答的比较使得可以确定疫苗对细胞免疫应答的宽度的影响。还可以用CFSE增殖测定法测量免疫应答的宽度(breadth)。
尽管已经描述了HIV抗原编码的数百种CTL表位，但是对自体HIV疫苗的上述因素的考虑导致申请人选择gag(p55)、rev、nef和vpr作为疫苗的主要靶标。然而，使用本发明的方法，还可以靶定其它HIV抗原。上述方法用于选择能够从扩增来自HIV感染的个体的多种毒株的引物。具体地，申请人已经发现能够扩增来自多种HIV毒株的gag、nef、rev和vpr基因的引物。引物序列、引物编号和名称、Tm和长度在图1中显示。这些引物相对于参考HIV基因组(检索号NC001802)的位置在图2中显示。
从而，一方面，本发明提供了包含HIV gag正向引物的组合物，所述引物基本上由选自下述组的寡核苷酸构成，所述组由SEQ IDNOs：1-20、206和207和与SEQ ID NO：1-20、206和207具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成。优选地，序列同一性为至少80％、85％、90％，或者至少95％。
优选的gag正向引物是SEQ ID NOs：1、4、16、17、19和20，其可以用作唯一的正向引物或者以任何组合使用。Gag正向引物的优选组合是SEQ ID NOs：16和17；和19和20。
本发明还提供了包含HIV gag反向引物的组合物，所述引物基本上由选自下述组的寡核苷酸构成，所述组由SEQ ID NOs：21-43、102-113和220-232和与SEQ ID NOs：21-43、102-113和220-232具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成。优选地，序列同一性为至少80％、85％、90％，或者至少95％。
优选的gag反向引物是SEQ ID NOs：21、22、26、27、32-34、36-38、40-41和106-108。gag反向引物的优选组合是SEQ ID NOs：33和41；SEQ ID NOs：32，36，37和40；SEQ ID NOs：21，26和38；SEQ ID NOs：22和27；SEQ ID NOs：32，33和34；SEQ ID NOs：36，37，38，40和41；和SEQ ID NOs：106，107和108。
本发明还提供了包含HIV vpr正向引物的组合物，所述引物基本上由选自下述组的寡核苷酸构成，所述组由SEQ ID NOs：44-58、208和209和与SEQ ID NOs：44-58、208和209具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成。优选地，序列同一性为至少80％、85％、90％，或者至少95％。
优选的vpr正向引物是SEQ ID NOs：44-52。vpr正向引物的优选组合是SEQ ID NOs：44和48；和SEQ ID NOs：57和58。
本发明还提供了包含HIV vpr反向引物的组合物，所述引物基本上由选自下述组的寡核苷酸构成，所述组由SEQ ID NOs：60-73、114-122、196-203、233-241和261-273和与SEQ ID NOs：60-73、114-122、196-203、233-241和261-273具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成。优选地，序列同一性为至少80％、85％、90％，或者至少95％。
优选的vpr反向引物是SEQ ID NOs：196-203和269-273。vpr反向引物的优选组合是SEQ ID NOs：196和197；SEQ ID NOs：198，199和200；SEQ ID NOs：201-203；和SEQ ID NOs：269-273。
本发明还提供了包含HIV rev正向引物的组合物，所述引物基本上由选自下述组的寡核苷酸构成，所述组由SEQ ID NOs：74-88、183-189、210和211和与SEQ ID NOs：74-88、183-189、210和211具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成。优选地，序列同一性为至少80％、85％、90％，或者至少95％。
rev正向引物的优选组合是SEQ ID NOs：87和88；SEQ ID NOs：183和184；SEQ ID NOs：185，186和187；和SEQ ID NOs：188和189。
本发明还提供了包含HIV rev反向引物的组合物，所述引物基本上由选自下述组的寡核苷酸构成，所述组由SEQ ID NOs：89-101、123-129、190-195、242-248和258-260和与SEQ ID NOs：89-101、123-129、190-195、242-248和258-260具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成。优选地，序列同一性为至少80％、85％、90％，或者至少95％。
rev反向引物的优选组合是SEQ ID NOs：190，191和192；和SEQID NOs：193，194和195。
本发明还提供了包含HIV env正向引物的组合物，所述引物基本上由选自下述组的寡核苷酸构成，所述组由SEQ ID NOs：130-132、134-136和212-214和与SEQ ID NOs：130-132、134-136和212-214具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成。优选地，序列同一性为至少80％、85％、90％，或者至少95％。
本发明还提供了包含HIV env反向引物的组合物，所述引物基本上由选自下述组的寡核苷酸构成，所述组由SEQ ID NOs：133、154-159、249和255-258和与SEQ ID NOs：133、154-159、249和255-258具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成。
本发明还提供了包含HIV env反向引物的组合物，所述引物由SEQ ID NO：133的寡核苷酸或与SEQ ID NO：133具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成。优选地，序列同一性为至少80％、85％、90％，或者至少95％。
本发明还提供了包含HIV nef正向引物的组合物，所述引物基本上由选自下述组的寡核苷酸构成，所述组由SEQ ID NOs：138-139、147、148、204和215-218和与SEQ ID NOs：138-139、147、148、204和215-218具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成。优选地，序列同一性为至少80％、85％、90％，或者至少95％。
本发明还提供了包含HIV nef正向引物的组合物，所述引物由选自下述组的寡核苷酸构成，所述组由SEQ ID NOs：140-143和与SEQID NOs：140-143具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成。优选地，序列同一性为至少80％、85％、90％，或者至少95％。
nef正向引物的优选组合是SEQ ID NOs：138，139和204；SEQ IDNOs：140-143；SEQ ID NOs：147-148；和SEQ ID NOs：138和139。
本发明还提供了包含HIV nef反向引物的组合物，所述引物基本上由选自下述组的寡核苷酸构成，所述组由SEQ ID NOs：144-146、149-153和250-254和与SEQ ID NOs：144-146、149-153和250-254具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成。优选地，序列同一性为至少80％、85％、90％，或者至少95％。
nef反向引物的优选组合是SEQ ID NOs：144-146；和SEQ IDNOs：149-151。
为了扩增HIV序列，将一种或多种正向引物与一种或多种反向引物组合。从而，本发明提供了用于扩增HIV的多种变体的引物对组合。这些引物对组合可以含有一种正向引物和一种反向引物(每种引物将通常以一个以上的拷贝存在)。然而，为了确保扩增HIV的多种变体，最有用的引物对组合将含有多种正向引物和多种反向引物。
从而，本发明提供了组合物，其包含：
a.gag正向引物，其包含选自下述组的寡核苷酸，所述组由SEQ IDNOs：1-20、162、164、168、169、206和207和与SEQ ID NOs：1-20、162、164、168、169、206和207具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成；和
b.gag反向引物，其包含选自下述组的寡核苷酸，所述组由SEQ IDNOs：21-43、102-113、172、173和220-232和与SEQ ID NOs：21-43、102-113、172、173和220-232具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成。
优选地，序列同一性为至少80％、85％、90％，或者至少95％。
gag正向引物与gag反向引物的优选组合是SEQ ID NOs：1、32、33和34；SEQ ID NOs：4、32、33和34；SEQ ID NOs：16、17、32、33和34；SEQ ID NOs：1、36、37、38、40和41；SEQ ID NOs：4、36、37、38、40和41和SEQ ID NOs：16、17、36、37、38、40和41。
在另一方面，本发明提供了组合物，其包含：
a.vpr正向引物，其包含选自下述组的寡核苷酸，所述组由SEQ IDNOs：44-58、176、177、208和209和与SEQ ID NOs：44-58、176、177、208和209具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成；和
b.vpr反向引物，其包含选自下述组的寡核苷酸，所述组由SEQ IDNOs：60-73、114-122、196-200、233-241和261-273和与SEQ ID NOs：60-73、114-122、196-200、233-241和261-273具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成。
优选地，序列同一性为至少80％、85％、90％，或者至少95％。
正向和反向vpr引物的优选组合是：SEQ ID NOs：44、48、196和197、或者SEQ ID NOs：44、48、198、199和200、或者SEQ ID NOs：49、196和197、或者SEQ ID NOs：49、198、199和200。
另一方面，本发明提供了组合物，其包含：
a.nef正向引物，其包含选自下述组的寡核苷酸，所述组由SEQ IDNOs：138-143、147、148、204和215-218和与SEQ ID NOs：138-143、147、148、204和215-218具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成；和
b.nef反向引物，其包含选自下述组的寡核苷酸，所述组由SEQ IDNOs：144-146、149-153和250-254和与SEQ ID NOs：144-146、149-153和250-254具有至少75％序列同一性的寡核苷酸。
优选地，序列同一性为至少80％、85％、90％，或者至少95％。
nef正向和反向引物的优选组合是：SEQ ID NOs：138、139、144、145、146和204、或者SEQ ID NOs：140-146、或者SEQ ID NOs：138、139、144、145和146。
另一方面，本发明提供了组合物，其包含：
a.env正向引物，其包含选自下述组的寡核苷酸，所述组由SEQ IDNOs：130-132、134-136和212-214和与SEQ ID NOs：130-132、134-136和212-214具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成；和
b.env反向引物，其包含选自下述组的寡核苷酸，所述组由SEQ IDNOs：133、154-159、249和255-258和与SEQ ID NOs：133、154-159、249和255-258具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成。
优选地，序列同一性为至少80％、85％、90％，或者至少95％。
在实践本发明方法中，可以分离下面的任一种以用作初级核酸扩增中的模板：整合的HIV原病毒、基因组HIV RNA(来自病毒体或者复制HIV病毒体的细胞)、HIV初级转录物和HIV加工的mRNA。然而，在本发明的优选实施方案中，从血液中存在的病毒体分离HIVRNA基因组。env和rev的可读框在HIV基因组中部分重叠，并且在HIV表达的正常过程中，对rev初级RNA转录物中的第一个和第二个rev外显子加以剪接，得到经处理的rev mRNA。因为优选的HIV模板是HIV基因组RNA，所以最实际的是扩增第二个或第二个rev外显子，而不是仅在剪接后符合读框的整个rev基因。因此，在优选实施方案中，本发明提供了适于扩增第二个rev外显子的rev正向和反向引物的组合。
从而，在另一方面，本发明提供了组合物，其包含：
a.rev正向引物，其包含选自下述组的寡核苷酸，所述组由SEQ IDNOs：74-88、183-189、210和211和与SEQ ID NOs：74-88、183-189、210和211具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成；和
b.rev反向引物，其包含选自下述组的寡核苷酸，所述组由SEQ IDNOs：89-101、123-129、190-195、242-248和258-260和与SEQ ID NOs：89-101、123-129、190-195、242-248和258-260具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成。
优选地，序列同一性为至少80％、85％、90％，或者至少95％。
rev正向和反向引物的优选组合是SEQ ID NOs：183、184、190、191和192；和SEQ ID NOs：185、186、187、190、191和192；和SEQ ID NOs：188-192。
在本发明的一个实施方案中，rev正向引物可以与nef反向引物组合以产生编码nef和rev的第二个外显子的一个扩增子。嵌套PCR将用于产生分开的次级nef和rev扩增子。
因此，本发明提供了组合物，其包含：
a.rev正向引物，其包含选自下述组的寡核苷酸，所述组由SEQ IDNOs：74-88、183-189、210和211和与SEQ ID NOs：74-88、183-189、210和211具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成；和
b.nef反向引物，其包含选自下述组的寡核苷酸，所述组由SEQ IDNOs：144-146、149-153和250-254和与SEQ ID NOs：144-146、149-153和250-254具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成。
优选地，序列同一性为至少80％、85％、90％，或者至少95％。
类似地，可能可以产生目的HIV基因的一种或多种连续组合的其它初级扩增子。例如，gag正向引物可以与nef反向引物组合以扩增HIV基因组的大部分。其它非限制性实例是vpr正向引物与nef反向引物的组合；vpr正向引物与rev反向引物的组合；和env正向引物与nef反向引物的组合。
从而，本发明提供了组合物，其包含：
a.正向引物，其包含选自下述组的寡核苷酸，所述组由SEQ IDNOs：1-20、44-58、74-88、130-132、134-136、162-188和189和与SEQ ID NOs：1-20、44-58、74-88、130-132、134-136、162-188和189具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成；和
b.反向引物，其包含选自下述组的寡核苷酸，所述组由SEQ IDNOs：60-73、89-101、114-122、133、144-146、190-192、196-203和269-273和与SEQ ID NOs：60-73、89-101、114-122、133、144-146、190-192、196-203和269-273具有至少75％序列同一性的寡核苷酸组成。
优选地，序列同一性为至少80％、85％、90％，或者至少95％。
上述引物和引物对可以用于扩增HIV核酸，以产生编码被靶定抗原的初级DNA扩增子。
基于这些准则，提供了适于扩增来自HIV的多种变体的gag、vpr、env、rev和nef抗原的正向和反向嵌套引物。这些引物用于初级扩增反应，或者优选地，用于初级扩增后的第二轮核酸扩增中。在优选实施方案中，用上述HIV正向和反向gag、vpr、rev、env和/或nef引物进行初级扩增，然后用下述嵌套引物对进行次级扩增。
从而，本发明提供了包含5’部分和3’部分的正向引物，其中5’部分包含启动子和优化的Kozak序列，3’部分包含包含选自下述组的序列，所述组由
Figure G05830658620070315D000361
(SEQ ID NO：206，用于gag扩增)、
Figure G05830658620070315D000362
(SEQ ID NO：207，用于gag扩增)、
Figure G05830658620070315D000363
(SEQ ID NO：208，用于vpr扩增)、
Figure G05830658620070315D000364
(SEQ ID NO：209，用于vpr扩增)、
Figure G05830658620070315D000365
(SEQ ID NO：210，用于rev扩增)、
Figure G05830658620070315D000366
(SEQ ID NO：211，用于rev扩增)、
Figure G05830658620070315D000367
(SEQ ID NO：212，用于env扩增)、
Figure G05830658620070315D000368
(SEQ ID NO：213，用于env扩增)、
Figure G05830658620070315D000369
(SEQ ID NO：214，用于env扩增)、
Figure G05830658620070315D0003610
(SEQ ID NO：215用于nef扩增)、
Figure G05830658620070315D0003611
(SEQ ID NO：216，用于nef扩增)、TGGGAGCAGTGTCTCA(SEQ ID NO：217，用于nef扩增)和AGGCACAAGAGGAAGAGG(SEQ ID NO：218，用于nef扩增)、AGAGTGATGG(SEQ ID NO：372，用于env扩增)、AGAGTGAAGG(SEQ ID NO：373，用于env扩增)、AGAGTGACG(SEQ ID NO：374，用于env扩增)、AGAGTGAGGG(SEQ ID NO：375，用于env扩增)、AAACAGATGGCAGGTG(SEQ ID NO：376，用于vif扩增)、AAACAGATGGCAGGTA(SEQ ID NO：377，用于vif扩增)、AAACAGATGGCAGGCG(SEQ ID NO：378，用于vif扩增)、AAACAGATGGCAGGGG(SEQ ID NO：379，用于vif扩增)、TCTATCAAAGCAGTAAG(SEQ ID NO：380；用于vpu扩增)；TCTATCAAAGCAGTGAG(SEQ ID NO：381；用于vpu扩增)；TCTATCAGAGCAGTAAG(SEQ ID NO：382；用于vpu扩增)；TCTACCAAAGCAGTAAG(SEQ ID NO：383；用于vpu扩增)；GGAAGGCCAGGGAATTTCC(SEQ ID NO：384，用于pol扩增)、GGAAGGCCAGGGAATTTTC(SEQ ID NO：385，用于pol扩增)、GGAAGGCCAGGGAATTTCC(SEQ ID NO：386，用于pol扩增)和GGAAGGCCAGGAAATTTTC(SEQ ID NO：387，用于pol扩增)构成。优选地，启动子是T7启动子。在上面引物的优选实施方案中，寡核苷酸的5’部分包含T7启动子和优化的Kozak序列，它们一起具有序列
Figure G05830658620070315D000371
(SEQ IDNO：219)，其中T7启动子序列以正常字体显示，优化的Kozak序列以斜体显示。在优选的T7启动子/引物实施方案中，组合的5’和3’部分一起包含选自下述组的序列，所述组由SEQ ID NO：19、20、57、58、87、88、134、135、136、147、148、160、161、290-293、308-311、329-332和356-360组成。
本发明还提供了包含5’部分和3’部分的反向引物，其中5’部分包含具有约30-100个T核苷酸的多聚T寡核苷酸，3’部分包含选自下述组的序列，所述组由5’GTGACGAGGGGTCGTTG(SEQ ID NO：220)、5’GTGACGAGGGGTCGCTG(SEQ ID NO：221)、5’GTAACGAGGGGTCGTTG(SEQ ID NO：222)、5’GTGTCGAGGGGGCGTTG(SEQ ID NO：223)、5’GCTCCTGTATCTAATAGAGC(SEQ ID NO：224)、5’GCTCCTGTATCTAATAAAGC(SEQ ID NO：225)、5’GCTCCTGTATCTAACAGAGC(SEQ ID NO：226)、5’GGTTTCCATCTTCCTGG(SEQ ID NO：227)、5’GGTTTCCATCTTCCTGC(SEQ ID NO：228)、5’GGCTTCCATCTCCCTGG(SEQ ID NO：229)、5’GGTTTCCATTTCCCTGG(SEQ ID NO：230)、5’GGTTTCCATTTTCCTGG(SEQ ID NO：232)、5’GGATAAACAGCAGTTGTTGC(SEQ ID NO：233)、5’GAATAAACAGCAGTTGTTGT(SEQ ID NO：234)、5’GAATAAACAGCAGCTGTTGC(SEQ ID NO：235)、5’ATTCTGCTATGTCGACACCC(SEQ ID NO：236)、5’ATTCTGCTATGTCGGCGCCC(SEQ ID NO：237)、5’ATTCTGCTATGTCGGCACCC(SEQ ID NO：238)、5’ATTCTGCTATGTTGACACCC(SEQ ID NO：239)、5’CTCCATTTCTTGCTCTCCTC(SEQ ID NO：240)、5’CTCCATTTCTTGCTCTTCTC(SEQ ID NO：241)、5’CCTGACTCCAATACTGTAGG(SEQ ID NO：242)、5’CCTGACTCCAATACTGCAGG(SEQ ID NO：243)、5’CCTGACTCCAATATTGTAGG(SEQ ID NO：244)、5’GCATTGAGCAAGCTAACAGC(SEQ ID NO：245)、5’GCATTGAGCAAGCTAACTGC(SEQ ID NO：246)、5’GCATTGAGCAAGTTAACAGC(SEQ ID NO：247)、5’GCATTAAGCAAACTAACAGC(SEQ ID NO：248)、5’ATAGCAAAGCCCTTTC(SEQ ID NO：249)、5’CCAGTACAGGCAAAAAGC(SEQ ID NO：250)、5’CAG TACAGGCGAAAAGC(SEQ ID NO：251)、5’CCAGTACAGGCAAGAAGC(SEQ ID NO：252)、5’GTCAGCAGTCTTT(SEQ ID NO：253)、5’GTCAGCAGTCTCA(SEQ ID NO：254)、5’GACCACTTGCCACCC(SEQ ID NO：255)、5’GACCACTTGCCACTC(SEQ ID NO：256)、5’GACCACTTGCCCCCC(SEQ ID NO：257)、5’CCCTGTCTTATTCTTCTAGG(SEQ ID NO：258)、5’CCCTGTCTTATTCTTACAGG(SEQ ID NO：259)、5’CCCTGTCTTATTCTTGTAGG(SEQ ID NO：260)、5’GCAGTTGTAGGCTGACTTCC(SEQ ID NO：261)、5’GCAGTTGTAGGCTGACTCCC(SEQ ID NO：262)、5’GCAGTTGTAGGCTGGCTTCC(SEQ ID NO：263)、5’AGCGAACAAACAGTAGTTGTTGCAG(SEQ ID NO：264)、5’AGCGAACAAACAGTAGTTGTTGCAA(SEQ ID NO：265)、and5’AGCGATCAAACAGCAGTTGTTGCAG(SEQ ID NO：266)、AGCGAACAAACAGTAGTTGTTGAAG(SEQ ID NO：267)、AGCGATCAAACAGTAGTTGTTGCAG(SEQ ID NO：268)构成。
优选地，5’多聚T长为64个T核苷酸。在优选实施方案中，反向嵌套引物组合物包含选自由SEQ ID NOs：102-129、137、149-153、157-159、193-195、201-203和269-273构成的组的一种或多种寡核苷酸。
在再一个实施方案中，本发明提供了用于扩增HIV的多种变体的试剂盒，其包含：
a)正向引物，其包含选自由SEQ ID NOs：1-20、44-58、74-88、130-132、134-136、138-143、147-148、160-162、164、168、169、176、177、180、183-189和204构成的组的寡核苷酸；和
b)反向引物，其包含选自由SEQ ID NOs：21-43、60-73、89-129、133、137、144-146、149-159、163、167、172、173、178、179、181、182、190-203和220-273构成的组的寡核苷酸。
优选地，试剂盒额外含有适于扩增反应的热稳定DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液(1X或者浓缩的)。此外，试剂盒可以还含有用于扩增的逆转录酶和/或非感染性HIV对照模板。而且，试剂盒将优选含有至少一对正向和反向嵌套引物，用于对初级扩增子进行次级扩增。正向嵌套引物将含有5’启动子，和任选地含有翻译起始密码子的Kozak序列，以及靶定目的初级扩增子的3’序列。反向嵌套引物将含有5’多聚T序列和与目的初级扩增子互补的3’序列，和任选地，翻译终止密码子。试剂盒用于病原体变体的鉴定和定量，以及制备疫苗。
另一方面，本发明提供了非毒株依赖性的扩增HIV序列的方法，其包括：扩增HIV DNA的多种变体，该扩增使用一种或多种正向引物和一种或多种反向引物来进行，所述正向引物包含选自由SEQ IDNO：1-18、44-56、74-86、130-136、138-143和204构成的组的寡核苷酸，所述反向引物包含选自由SEQ ID NO：21-43、60-73、89-101、133、144-146、154-156、190-102、196-199和200构成的组的寡核苷酸。
HIV DNA可以包含整合到宿主细胞基因组的HIV DNA。然而，在优选实施方案中，HIV DNA是通过HIV基因组RNA或者HIVmRNA的逆转录制备的cDNA。用于从受感染的个体分离整合的HIVDNA、HIV基因组RNA和HIV mRNA的方法是本领域技术人员已知的。类似的方法可以用于分离其它目的病原体的核酸。
优选地，HIV核酸从受HIV感染的个体的生物样品分离或者得到，所述个体是将用本发明的疫苗治疗的。本文使用的“生物样品”指可以含有病原体、病原体感染的细胞或者病原体核酸的任何生物样品，其包括但不限于，血液、血浆、血清、外周血单核细胞(PBMC)、精液、阴道分泌物、晶状体液、脑脊液、唾液、奶、腹水、滑液、腹水、羊水、组织、组织培养物等等。
最优选地，含有HIV基因组RNA的病毒体分离自血液或者血清。可对从病毒体得到的基因组RNA进行逆转录以产生HIV cDNA。从受感染的患者分离HIV病毒体的方法以及制备cDNA的方法是本领域技术人员已知的。可以使用随机六聚体或者特异寡核苷酸引物引发HIV RNA的逆转录。然后HIV cDNA可以用作模板，用于上文所述的HIV序列的非毒株依赖性扩增方法。这些相同的方法可以用于从其它病原体的mRNA或者基因组RNA制备cDNA。
通过本发明方法扩增的DNA可以用于核酸疫苗中，或者可以装载进抗原呈递细胞，其然后可以用作疫苗。此外，可以对DNA测序以鉴定样品或者受感染的患者中存在的HIV的变体。从病原体模板或者其cDNA拷贝扩增的DNA称作“初级扩增子”。可以通过初级扩增子插入表达盒、表达载体和/或递送载体中来对其进行修饰，所述表达盒、表达载体和/或递送载体然后可以用作核酸疫苗、病毒载体疫苗等等，或者此类载体可以装载进可以用作疫苗的抗原呈递细胞中。
在一种优选实施方案中，用初级扩增子进行第二轮扩增，该扩增使用含有适于在体外表达和/或在体内表达的转录和翻译信号的嵌套引物。优选地，用DNA进行第二轮扩增，该扩增使用含有1)适于在体外转录的启动子(如T7或者SP6启动子)2)优化的Kozak序列(其包括ATG密码子)的正向嵌套引物，其组合含有翻译终止密码子的互补序列和多聚T尾的反向嵌套引物。嵌套轮扩增得到的次级扩增子可以用作体外转录和5’帽化的模板。所得mRNA可以用于核酸疫苗中，或者装载抗原呈递细胞，该细胞可以用作疫苗。
作为非限制性实例，使用逆转录酶、合适的反应缓冲液和随机六聚体将病原体RNA逆转录成单链cDNA。然后使用多种引物在初级PCR反应中通过PCR将单链cDNA扩增成双链DNA。用初级PCR反应产物进行第二轮的或者嵌套PCR扩增。在该轮扩增中，5’引物含有具有T7 RNA聚合酶结合序列的突出端，3’引物含有具有多聚T序列的突出端。嵌套轮的PCR中突出端区域引入的修饰使得可以在体外转录PCR产物和当递送到DC中时成功的翻译。该过程可以在PCR扩增步骤后中断并且PCR产物可以冷藏用于进一步处理。用QIAquick
Figure G05830658620070315D000401
PCR纯化试剂盒组分(QIAquick
Figure G05830658620070315D000402
柱，PB缓冲液，PE缓冲液，和EB缓冲液)进行cDNA材料的纯化。双链DNA用作标准转录反应中的模板。用RNeasy
Figure G05830658620070315D000411
试剂盒(RNeasy
Figure G05830658620070315D000412
柱，RLT缓冲液，和RPE缓冲液)中的组分进行体外转录的RNA的提纯。将RNA在无核酸酶的水中洗脱。如果必要，进行乙醇沉淀来浓缩RNA。将RNA重悬浮于无核酸酶的水中并使其通过穿过0.8/0.2μm聚醚砜(PES)滤器，然后分配到0.5mL安全锁聚丙烯管中，并在≤-150℃下冷藏用于长期保存。
因此，本发明提供了制备HIV RNA的非毒株依赖性方法，其包括：
a)通过使用正向引物和反向引物扩增HIV DNA的多种变体产生初级扩增子，其中所述正向引物包含选自由SEQ ID NOs：1-18、44-56、74-86、130-132、162-188和189构成的组的寡核苷酸；并且所述反向引物包含选自由SEQ ID NOs：60-73、89-101、133、144-146、190-192和196-200构成的组的寡核苷酸；
b)使用包含5’多聚T尾的反向启动子引物和正向引物扩增所述初级扩增子以产生扩增的表达盒；和
c)转录所述表达盒以产生HIV RNA。
优选地，HIV DNA是通过HIV基因组RNA或者HIV mRNA的逆转录制备的cDNA。在优选实施方案中，正向启动子引物包含T7或者SP6启动子。优选地，正向引物还包含启动子3’的优化的Kozak序列。
可以在体外翻译反应中测试帽化的和多聚腺苷酸化的RNA和/或接着转染到树突细胞或者其它抗原呈递细胞中。可以使用特异抗体在蛋白质印迹分析中检验所翻译的蛋白质的身份。所表达的各抗原以及它们的组合对APC的成熟的负面影响的缺乏可以通过分析细胞外标记来测试。例如，使用流式细胞术标记(例如，HLA DR、CD86、CD83、CD14)通过表型分析可以建立DC成熟的能力。为了消除新近表达的蛋白质影响DC功能的可能性，可以将编码抗原的RNA或者它们的组合与Flu RNA组合共转染，然后在CTL测定法中测试共转染的DC。此类方法是本领域技术人员已知的。
根据本发明的方法制备的帽化的和多聚腺苷酸化的RNA可以在体外或者原位转染进树突细胞或者其它抗原呈递细胞中。此类体外转染的抗原呈递细胞可以用作疫苗。备选地，帽化的和多聚腺苷酸化的RNA可以在体外翻译，然后体外装载进抗原呈递细胞，或者直接用于疫苗中。从而，在另一实施方案中，本发明提供了装载抗原呈递细胞的方法，其包括将抗原呈递细胞与通过本发明方法产生的RNA接触。
下面的实施例意在作为本发明的非限制性实施方案。
               实施例
               实施例1
     对用于扩增HIV的多种变体的引物的选择
对保藏在Alamos National Database的49种全长HIV分离物的分析揭示了HIV基因组中高度易变的区域以及所选抗原的编码序列外的具有较低变异性的区域。这些相对保守的区域多数位于gag、vpr和rev的可读框外，它们被用作为用于设计PCR扩增中的寡核苷酸的模板。因为Alamos National Database中所列出的已鉴定序列中存在的那些突变的额外突变可以在个体患者中发生，所以确定引物退火的多种区域。分析与这些分离物互补的引物。在分离物中具有相对序列保守性的核苷酸区域优选用于引物选择。下面的参数应用于引物设计：引物将具有55℃-62℃的Tm，约17-20bp的长度，不被预测为形成同型二聚体，将缺少二级结构和在BLAST分析中缺少与不同于HIV的序列的同源性。为了使所用的引物减到最小，在引物序列的5’一半的错配被容忍，而在3’一半的错配不允许。为了确保无失败地扩增任何所选抗原，还选择了目的可读框外的一些区域。图1显示了为引物设计所选的区域的图示。引物名称中的数字对应于以所选的检索号NC_001802作为参照时序列内的位置。该参照序列含有突变，该突变截短了VPR，其不存在于多数HIV序列中。
与(NC_001802 225-1838外的)gag上游和下游的所选区域退火的引物将允许扩增gag的整个可读框。已经鉴定了引物的区域后，确定与每个已知的HIV序列互补的每个所选位置的引物。在表1中显示了反向引物组gag 1883的例子，其编码49种分析的分离物的所有互补序列。
表1.选来用于扩增gag的NC_001802的位置1833的反向引物组。因为这是引物的反向组，所以这里显示了反向互补序列。与所有分析的HIV序列互补的可变碱基以斜体显示，其中非共有变体为粗斜体。
为了减小所用引物的数目，我们使用了进一步的选择标准：避免引物序列的3’一半中的错配，然而容忍引物序列的5’一半中的错配。此类错配可以通过降低PCR扩增严格性来补偿。当应用那些选择标准时，该组的引物列表相当大地缩短，如表2所示，其显示了它们的3’一半中不同的引物。
Figure G05830658620070315D000432
表2.为区域gag 1833所选的反向引物的序列。与参照序列NC_001802互补的序列在首行显示。在不同的HIV分离物中发现的区域中的突变以大写粗斜体显示。这里显示了参考序列的反向互补序列。
下表3详述了针对用于Rev.的一组正向引物设计的引物。对从最常见的HIV进化枝分离的多种HIV分离物以及较不常见的分离物的序列比对揭示了相对保守的区域，其在7847和7848位具有可变残基。因此，为了设计与共有B序列(Rev F7830)完全互补但是还可以容纳该频繁的序列转换的引物，设计了额外的备选引物。这些备选引物含有在7847和7848位中通常发现的突变的补偿突变(Rev F 7830.1和RevF 7830.2)。仅设计引物的3’一半携带补偿突变，而允许在残基7830-7840的5’一半的错配。为了确保多种毒株的“无失败”地扩增，分析了目的可读框外的一个以上的区域。例如，使用为区域Rev F7830设计的引物，由于靶区域的缺失，分离物01A1.CM.CM53122将不能扩增。因此，为了弥补，7550和7911位的序列也被用于设计正向Rev引物。
表3
Figure G05830658620070315D000451
为了能够体外转录PCR片段，将修饰该片段以在5’末端插入T7RNA聚合酶结合位点。此外，翻译的成功起始需要在其3’末端加入经优化而含有Kozak序列的翻译起始ATG密码子和多聚(T)64尾。通过将初级PCR反应中所得的PCR片段进行额外嵌套轮的PCR实现初级PCR序列的修饰，其中PCR中使用经修饰的正向和反向引物。正向引物含有编码T7RNA启动子的序列的突出端，以及在抗原的起始ATG密码子的-3、-2和-1位中的碱基ACC。此外，对于HIV基因如Rev而言，当在PCR扩增的第一轮期间还没有扩增ATG密码子的情况下，在嵌套PCR反应期间加入ATG密码子。嵌套的正向引物的3’一半与起始ATG密码子的紧邻下游的序列或者初级PCR扩增期间扩增的最5’编码序列互补。反向引物还在其5’末端含有多聚(T)64突出端，其用作转录期间RNA分子的3’末端多聚腺苷酸化(多聚A)序列的模板。反向引物的3’一半与初级PCR反应中分离的序列互补。
                    实施例2
            确定gag引物的扩增条件
通过将每种抗原的PCR引物复合化，实现了PCR反应数的减小。基于它们的Tm对PCR引物进行分组。然后在PCR反应中于不同温度下测试含有每组正向引物与每组反向引物的排列。为了在引物的最初选择期间降低用感染性材料工作的危险，从NIH AIDS Research andReference Reagent Program得到的相异的非感染性近全长HIV克隆用于测试引物设计和优化反应条件。
10ng非感染性HIV克隆pBKBH10S质粒模板(NIH AIDSResearch & RefeFence Reagent program Cat#194)用于25μL PCR反应液中，该反应液含有1XPfu缓冲液、0.2mM终浓度的每种dNTP，0.4μM终浓度的每种引物和1单位PFU Hot start(Stratagene)聚合酶。反应体系在95℃加热45秒然后进行25轮的95℃45秒、如图3所示退火温度下45秒和72℃3分钟的扩增。最后延伸在72℃进行10分钟。引物组如下所示：正向组1(FG1)：具有SEQ ID NOs：1和4的引物；正向组2(FG2)：具有SEQ ID NOs：16和17的引物；反向组1(RG1)：具有SEQ ID NOs：33和41的引物；反向组2(RG2)：具有SEQ ID NOs：32，36，37和40的引物；反向组3(RG3)：具有SEQ ID NO：34的引物；反向组4(RG4)：具有SEQ ID NOs：21，26，38的引物；反向组5(RG5)：具有SEQ ID NOs：22和27的引物。结果在图3中显示。每种退火温度的泳道1-10含有用图例中指出的引物组进行的PCR反应体系。尽管使用所有这些引物组的扩增在许可的温度54℃和60℃下是成功的，但是一些引物组合不能在较高温度65℃和70℃下产生扩增子。
                    实施例3
      每次反应对HIV的多种变体进行的多路PCR扩增
有证据表明HIV以若干种形式或者准种存在于单个个体中，由于从该个体中存在的压力的突变逃逸机制(CTL或者小分子)而引起所述形式或者准种。还有证据表明患者可以被超感染(superinfected)并且同时含有多种HIV毒株。当前技术的能力能够使用下述条件来扩增患者中存在的所有HIV变体，所述条件的严格程度到足以扩增特定产物，而不加区别的(promiscuous)程度足以允许引物和靶序列之间的单个碱基对核苷酸错配。
为了通过实验测试我们在相同的反应中扩增多种HIV毒株的能力，在一个PCR反应中混合不同的HIV模板。编码该实验中使用的多种HIV分离物的分子克隆编码序列在下面列出。
  克隆名称   来源国家  HIV进化枝   保藏号
  pBKBH10S   法国  B   M15654
  P93TH253.3   泰国  A/E   U51189
  P90CF402.1   中非  A/E   U51188
  P93BR029.4   巴西  B/F   AF005495
从而，一旦如实施例2确定了PCR扩增的反应条件，就通过提供在一个PCR反应中提供编码四种不同分离物的HIV基因组的模板增加PCR反应的复杂性。具体地，在25μL PCR反应物中混合2.5ng每种质粒模板pBKBH10S、p90CF204.1、p93BR029.4和p93TH253.3，每种对应于不同的HIV模板(从NIH AIDS Research & ReferenceReagent program Cat#194、3284、4009和3283得到)。反应条件和引物混合物与实施例2和图3中描述的相同。在该实验中，退火温度为如所指出的60℃、62℃和65℃。结果在图4A中显示。在62℃和65℃下失败的PCR反应(泳道A和B)具有作为共同命名者(denominator)的反向引物34，其是反向引物组3中的唯一引物。通过降低Tm至60℃可以弥补引物-模板错配。
4B显示了分别用于反向引物组2、1和3的反向引物32、33和34的反向互补序列，以及针对每种引物计算的理论Tm。图4C显示了对对应于这些引物的靶区域中四种质粒模板序列的比对。序列分析揭示在用于反应的所有分子克隆中来自靶标引物序列的5’末端的6位含有腺嘌呤(a)。然而，引物34在该位置含有鸟嘌呤(g)，并且引物34和靶序列之间缺少互补性使得不能在严格温度下成功地扩增。对引物34的BLAST分析揭示与从日本分离的HIV的互补性，该HIV的检索号为AB078005，其被包括在我们对全长HIV分离物的最初分析中。注意到下述事实是重要的：尽管引物和靶标之间的错配不在严格条件下扩增，但是降低PCR扩增退火温度的严格性到60℃能导致成功的扩增事件。引物：靶序列中的错配可以通过不加区分的PCR条件弥补这一现象可用作为所选用的用于HIV扩增的策略将获得成功的首先指示。引物33还含有相对于靶序列在4位的错配；然而，该引物是组RG3的成员，该组还含有三个其它成员，它们中的一个或多个与靶序列成功地退火，得到PCR产物。
总之，对应于编码区外的不同区域并且在它们的序列中含有多个序列变异(如果它们一起靶定相同区域)的多路PCR引物与通过改变Tm而改变的PCR反应严格性的组合将确保初级PCR中编码序列的无失败扩增。
                   实施例4
使用多路PCR扩增来自非感染性HIV RNA模板的GAG区域
将含有非感染性近乎全长HIV基因组(NIH AIDS Research &Reference Reagent program Cat#194)的pBKBH10S质粒DNA用XbaI消化，并且用T7RNA聚合酶在体外转录。简言之，将1μg质粒DNA模板在20μl的最终反应体积中转录3到4个小时，接着用DNase Turbo消化30分钟以除去DNA模板。将RNA在RNeasyTM柱(QIAGEN)上纯化，用无RNA酶的水洗脱，将试样分为小份并保藏在液氮冷藏箱中。
所得9.2kb体外转录的RNA的100,000份拷贝用作第一链cDNA合成反应的模板，反应液含有1X SensiscriptTM缓冲液(QIAGEN
Figure G05830658620070315D000491
)，0.5mM终浓度的每种dNTP，10μM终浓度的随机六聚体，10单位RNA酶抑制剂(Ambion
Figure G05830658620070315D000492
)和SensiscriptTM RT(QIAGEN
Figure G05830658620070315D000493
)。将20μL反应物在37℃温育1小时。将cDNA的10,000份拷贝用于每种初级PCR反应体系，所述体系含有1X PFU ultra反应缓冲液(StratageneTM)、0.2mM每种dNTP(StratageneTM)、2.5单位Hot StartPfuUltraTM聚合酶(StratageneTM)、0.4μM如实施例2中所示的引物组FG1、FG2、RG1、RG2、RG3和RG4中和图5中所示正向和反向引物组中的每种正向和反向引物。最终反应体积为25μL。将反应液在95℃变性2分钟然后进行40个如下循环：95℃30秒，54℃30秒，72℃3分钟。使用用嵌套Gag正向T7引物组(GAG F T7；引物19和20)和Gag反向64T引物组(GAG R 64T；引物106，107和108)进行初级扩增得到的模板进行次级PCR扩增。最后一轮后，让反应物在72℃完成10分钟然后冷却到4℃。将4μL每种样品上样到非变性1％琼脂糖凝胶上。图6中所示结果表明使用引物组组合FG1:RG1、FG1:RG2、FG1:RG3、FG2:RG1、FG2:RG2和FG2:RG3进行的多路PCR允许扩增来自pBKBH10S中所含HIV序列的gag编码序列。
                实施例5
    使用本发明的引物可以扩增多种HIV准种
将代表四种HIV准种的每种pBKBH10S、p90CF402.1、p93BR029.4和p93TH253.3 2.5ng在初级PCR反应体系中混合，该反应体系含有1X Pfu缓冲液、0.2mM每种dNTP、每种0.4μM终浓度的引物组FG2和RG2和1单位Pfu Hot start聚合酶(Stratagene)。按实施例2中所述，开始PCR反应。一旦完成，将1μL初级PCR反应物置于次级25μL反应体系中，该反应体系含有1XPfu缓冲液、0.2mM每种dNTP、每种0.4μM终浓度的引物19、0.4μM终浓度的引物36和1单位Pfu hot start聚合酶(StratageneTM)。使用Zero Blunt
Figure G05830658620070315D000501
TOPO
Figure G05830658620070315D000502
PCR克隆试剂盒(InvitrogenTM)对2μL次级PCR产物进行亚克隆。用单独的菌落接种细菌培养物。用QIAquickmini柱(QIAGEN
Figure G05830658620070315D000503
)分离来自那些培养物的质粒DNA，并通过限制性消化对其分析，该限制性消化使用克隆载体中插入序列侧翼的区域中存在的EcoRI位点。含有约1.65kb插入序列的克隆被选用来进一步测序。用Lasergene软件(DNAStar)比对从该分析得到的部分序列。该比对的结果在图6中显示。序列分析表明最终混合物由四种不同的克隆(A、B、C和D)组成，表明本发明能够分离患者中可能存在的多种HIV变体或者准种。
               实施例6
从非感染性HIV RNA扩增VPR、REV和NEF编码区
如实施例4所示，通过来自pBKBH10S的体外转录的RNA的RT-PCR，合成近乎全长的非感染性HIV RNA的第一链cDNA。将从HIV RNA的10,000个拷贝合成的cDNA材料加入每种初级PCR反应体系，该体系含有针对nef、vpr或rev的多重引物。使用初级PCR反应产物作为模板，用下面所示的嵌套T7和64T引物组进行次级PCR反应。(VPR 64T引物231到335对应于SEQ ID NOs：269-273)。反应条件与上述相同，只是最终引物浓度对于nef为0.4μM，对于rev为0.2μM，对于vpr为0.6μM。引物组由下面的引物组成：
Figure G05830658620070315D000511
在图7a中显示了正向和反向引物组合。每种组合导致扩增。
图7b图解了在多种严格性(退火温度)下单独的扩增反应中使用与vpr反向引物60、61、64、65、66、67、68、69和70组合的正向vpr引物44，从体外转录的pBKBH10S RNA扩增vpr编码区。如所预期的，增加退火温度降低了产物产率，并且一些引物在较高温度下不能扩增。从而，降低PCR严格性条件弥补了与引物与模板的错配。
图7c图解了从体外转录的pBKBH10S RNA扩增nef。体外转录的RNA用作反应中的第一链cDNA合成的模板，反应物含有寡聚dT(20)引物、10单位的SuperscriptTM III(InvitrogenTM)、2单位的RNAseoutTM(InvitrogenTM)、0.5mM每种dNTP(ClontechTM)、5mMDTT和SuperscriptTM第一链缓冲液。将反应物在55℃温育1小时。
然后将总体积2.5μL的第一链cDNA反应物加入到含有PFUultraTM HS、PFU缓冲液(StratageneTM)、0.8mM每种dNTP(ClontechTM)和0.4mM Nef引物组NEF F 8235和NEF R 9069(泳道1)或者Nef引物组NEF F 8343和NEF R 9069(泳道2)的初级PCR反应物中，最终反应物体积为50μL。PCR反应物在95℃变性2分钟，然后进行40轮的如下循环：95℃30秒，54℃30秒，和72℃3分钟。最后一轮后，进行72℃10分钟的延伸并通过冷却到4℃停止反应。通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物(图7c)。PCR反应的nef引物组的组成如下：
  NEF正向引物组  NEF反向引物组
  NEF F 8235(引物138、139和204)  NEF R 9069(引物144、145和146)
  NEF F 8343(引物140、141、142和143)
                    实施例7
可以从自受感染的患者的血浆分离的HIV RNA扩增GAG编码区
HIV感染的患者的血浆被用于分离HIV RNA。低速离心以澄清质粒材料后，将其用裂解缓冲液稀释，并在Nucleospin
Figure G05830658620070315D000521
纯化柱上根据生产商(Macherey-Nagel)的说明书纯化。用无核酸酶的水洗脱出RNA，并保存在-86℃备用。向含有1X SuperscriptTM第一链合成缓冲液(InvitrogenTM)、5mM DTT、40单位RNA酶抑制剂、0.5mM每种dNTP、最终1μM引物GAG R1913组和400单位SuperscriptIIITM(Invitrogen)的20μL第一链cDNA合成反应体系中加入所述RNA。反应体系在55℃温育1小时，然后在70℃温育15分钟以使酶失活。向每种PCR反应体系中加入2.5ul RT反应物，使用与上述相同的条件，只是以0.4μM终浓度使用引物并且在PCR循环期间的延长时间为2分钟。每个PCR反应的引物组的组成如下：
  GAGF124
  引物1
  GAGF304
  引物4
  GAGF334
  引物16
  引物17
  GAGR1881
  引物32
  引物33
  引物34
  GAGR1913
  引物36
  引物37
  引物38
  引物40
  引物41
  GAGFT7
  引物19
  引物20
  GAGR64T
  引物106
  引物107
  引物108
向含有1X Pfu缓冲液、0.2mM每种dNTP、2.5单位Pfu HotStart聚合酶(StratageneTM)和0.2μM每种嵌套正向T7启动子引物GAG F 334(SEQ ID NO：19)和反向64T引物GAG R 1881(SEQ IDNO：106)的次级PCR反应体系中加入1μL初级PCR扩增子。结果在图8中显示。使用从慢性感染的HIV患者的血浆分离的模板HIVRNA，用引物组合：F124:R1881、F304:R1881、F334:R1881、F304:R1913和F334:R1913的每一种扩增gag编码区。
                    实施例8
可以从受感染的HIV患者的血浆分离的HIV RNA扩增VPR和REV 编码区
如上面实施例中所述，从血浆分离HIV RNA。向含有1X第一链合成缓冲液(InvitrogenTM)、5mM DTT、40单位RNA酶抑制剂、0.5mM每种dNTP、1μM引物VPR R5507或者Rev R8300组(如下面指出)和400单位SuperscriptTMIII的20μL第一链cDNA合成反应体系中加入RNA。反应体系在55℃温育1小时，然后在70℃温育15分钟以使酶失活。向每种PCR反应物中加入2.5ul RT反应物，使用与上述相同的条件，只是对于VPR使用0.6μM终浓度的引物，对于REV使用0.2μM终浓度，PCR循环期间的延长时间为2分钟。每个PCR反应的引物组的组成如下：
 VPR正向引物   VPR反向引物
 VPR F 4995(引物44和48)   VPR R 5507(引物196和197)
 VPR F 5058(引物49)   VPR R 5419(引物198，199和200)
 VPR F T7(引物57和58)   VPR R 64T全长(引物201，202和203)
 REV正向引物   REV反向引物
 REV F 7750(引物183和184)   REV R 8300(引物190，191和192)
 REV F 7830(引物185，186和187)
 REV F 7911(引物188和189)
 REV F T7(引物87和88)   REV R 64T(引物193，194和195)
向含有1X Pfu缓冲液、0.2mM每种dNTP、2.5单位Pfu Hot Start聚合酶(StratageneTM)和含有64T和T7RNA聚合酶结合位点的引物的次级PCR体系中加入1μL初级PCR反应物，所述引物如下：0.4μM VPR引物VPR F 5090和VPR R 5419和0.6μM Rev引物REVF 7912和REV R 8300。图9中所示结果表明下面的正向引物和反向引物组VPR F 4995:VPR R 5507、VPR F 5058:VPR R 5507、VPR F4995:VPR R 5419和VPR F 5058:VPR R 5419的每一种可以从慢性感染的患者得到的HIV RNA扩增Vpr。类似地，下面的正向引物和反向引物组REV F 7750:REV R 8300、REV F 7830:REV R 8300和REVF 7911:REV R 8300的每一种可以从慢性感染的患者得到的HIV RNA扩增rev。
                    实施例9
来自慢性感染的HIV患者的血浆的HIV RNA的NEF编码区的扩增
如上文所述从血浆材料分离HIV RNA。在含有1X第一链合成缓冲液(InvitrogenTM)、5mM DTT、40单位的RNA酶抑制剂、0.5mM每种dNTP、1μM引物NEF R 9069和400单位SuperscriptTMIII的20μL第一链cDNA合成反应体系中加入所述RNA。反应物在55℃温育1小时，然后在70℃温育15分钟以使酶失活。向每种PCR反应物中加入2.5ul RT反应物，使用与上述相同的条件，只是以0.4μM终浓度使用引物并且在PCR循环期间的延长时间为2分钟。每个PCR反应的nef引物组的组成如下：
  NEF正向引物组  NEF反向引物组
  NEF F 8235(引物138、139和204)  NEF R 9069(引物144、145和146)
  NEF F 8343(引物140、141、142和143)
向含有1X Pfu缓冲液、0.2mM每种dNTP、2.5单位Pfu Hot Start聚合酶(StratageneTM)和0.2μM每种含有64T和T7RNA聚合酶结合位点的引物的次级PCR反应体系中加入1μL初级PCR反应产物，所述引物为：引物NEF F 8343和NEF R 9069。
                实施例10
通过分析从慢性感染的HIV患者扩增的gag、rev和vpr编码序列可 以检测多种HIV准种
如上文所述从患者材料扩增gag编码区。使用多种引物组合(泳道GAG F 124:GAG R 1881，GAG F 304:GAG R 1881，GAG F334:GAG R 1881，GAG F 304:GAG R 1913图8)，对次级嵌套PCR中得到的PCR片段进行亚克隆，并按上文所述对其进行测序。图10C中显示了部分序列的比对。分析表明从该患者的血浆回收了至少7种不同的GAG克隆。
对Rev和VPR的分别的编码序列的比对。对来自Rev和VPR的次级嵌套PCR反应的PCR产物进行亚克隆，并按照针对GAG所述来进行分析。对rev克隆(图10B)和vpr克隆(图10C)的序列分析展示了多种HIV准种的扩增。
                实施例11
VPR的经分离准种在HLA表位的蛋白质序列区中含有氨基酸改变
将对VPR编码序列(Los Alamos National Laboratory HIVSequence Database)预测的HLA表位图与通过从相同的慢性感染的HIV患者扩增得到的分离的VPR克隆的推导的蛋白质序列进行比较。鉴定的氨基酸替代中的两种会影响CTL表位中的蛋白质组成(图11)。
                实施例12
        树突细胞中RNA编码的GAG表达
人树突细胞的分离
使用Lifeblood(Memphis，TN)描述的AutoPBSC步骤，在COBESpectra(Gambro BCT)上收集来自健康志愿者的白细胞分离术样品。使用FicollTM密度梯度(Histopaque-1007 Hybri-Max
Figure G05830658620070315D000562
，Sigma)分离用于白细胞分离术样品的外周血单核细胞(PBMC)，将其在塑料瓶中培养1到2小时以提供贴壁的单核细胞(CD14+)。丢弃非贴壁细胞，在粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)存在下，在X-VIVO-15TM培养基(Cambrex)中将剩余的单核细胞培养6天。单核细胞来源的细胞不断失去CD14的表达，并且获得与未成熟状态中的树突细胞的表型相一致的CD80表达。
在第7天，通过用常规m7G帽类似物和(A)64尾或者ARCA和(A)64尾修饰的gag RNA以5μg RNA/10□个细胞通过电穿孔转染未成熟DC。特别地，将未成熟树突细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，以交换缓冲条件并在缓冲液中重悬浮。通过电穿孔用扩增的病原体RNA转染树突细胞。在4mm gap小杯中进行电穿孔，该小杯含有500μL细胞悬浮液，其中含有4x107个细胞/mL，以300V，100Ω，和150μF的脉冲进行电穿孔。然后将细胞在含有成熟细胞因子IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和地诺前列酮(前列腺素E2)、以及GM-CSF和白介素-4(IL-4)的培养基中培养4小时或者26小时。温育以允许蛋白质表达后，收获细胞，将其固定、透化并用抗-GAG小鼠单克隆抗体(NIH#4121)以1∶20的稀释度染色。用猴抗小鼠IgG-PE二级抗体(Research Diagnostics，Inc.，Flanders，NJ)检测抗体结合。在Becton Dickinson FACSCaliburTM流式细胞仪上用CellquestTM分析程序分析细胞。图12中显示的结果表明根据本发明制备的gagmRNA可以在转染后4到26小时在转染的DC中表达。
                实施例13
        HeLa细胞中GAG蛋白质表达的时程
使用TransmessengerTM(QIAGEN
Figure G05830658620070315D000571
)试剂，用从质粒pBKBH10S扩增的GAG的2μg ARCA和(A)64尾修饰的RNA转染5x105个HeLa细胞。以相同方式处理阴性对照细胞，但是在转染期间不加入RNA。将转染细胞放回到培养基中经过指定的时间期限，之后收获细胞用于蛋白质印迹分析。在等渗的蛋白质提取缓冲液(0.01％triton X-100，150mM NaCl，100mM Tris pH 7.6，5mM EDTA)中裂解细胞。来自每种条件的蛋白质裂解物取25μg，用SDS-PAGE凝胶分离并转移到PVDF膜上，接着用小鼠单克隆的抗-GAG抗体(NIH AIDSResearch & Reference Reagent program Cat#4121)以1∶40稀释度温育。通过按照生产商的推荐用山羊抗小鼠二抗(Santa Cruz Cat#sc-2055)和ECLTM plus试剂(Amersham)温育来显现抗体的结合。200ng重组纯化的GAG p24(Immunodiagnostic)用作阳性对照。图13中显示的结果表明HeLa细胞中的最大蛋白质表达在转染后6到15小时之间观察到。
                实施例14
            树突细胞中REV表达
在第6天收获树突细胞，用5μg RNA/106个细胞的MART或者ARCA(A)64尾REV RNA转染，放回到含有新鲜细胞因子和成熟混合物的培养物中。4小时后，固定转染的细胞，透化(permeabilized)，并用抗-REV绵羊多克隆抗体(Novus Biologicals，cat.#ab9513)以1/1000的稀释度染色。用猴抗绵羊IgG-PE二级抗体(United StatesBiologicals，Swampscott，MA)检测抗体结合。在Becton-DickinsonFACSCaliburTM流式细胞仪上用CellquestTM分析程序分析细胞。图14显示了转染后4小时在DC中rev mRNA的表达。
                实施例15
        HeLa细胞中REV蛋白质表达时程
按照上文所述，用ARCA和(A)64尾修饰的RNA转染HeLa细胞，用于蛋白质印迹分析。在SDS凝胶电泳上分离40μg蛋白质裂解物，并转移到PVDF膜。通过用多克隆绵羊抗-REV抗体(NovusBiologicals Cat#ab9513)以1∶1500的稀释度温育来检测蛋白质。通过使用二级抗绵羊抗体(Santa Cruz Cat#sc-2701)，然后用ECL plus试剂盒(Amersham)显影来显示抗体的结合。图15中显示的结果和来自另一独立实验的结果表明REV蛋白质的最大表达水平为转染后6到20小时之间。
                实施例16
            树突细胞中Nef表达
在第6天收获树突细胞，用4μg RNA/106个细胞的GFP或ARCA(A)64尾NEF RNA电穿孔，放回到含有新鲜细胞因子和成熟混合物的培养物中。4或24小时后，固定转染的细胞，透化，并用抗-Nef兔多克隆抗体(R.Sekaly博士赠送)以1/1000稀释度染色(4小时)或以1/4000稀释度染色(24小时)。用山羊抗兔二级抗体(SouthernBiotechnology Associates，Birmingham，AL)检测抗体结合。在Becton-Dickinson FACSCaliburTM流式细胞仪上用CellquestTM分析程序分析细胞。图16显示的结果表明nef在转染后4和24小时表达。
                实施例17
对来自HIV感染患者的多种HIV RNA抗原准种的成功克隆和在树突 细胞中的表达
为了验证我们的新的多路RT-PCR步骤，我们从HIV感染的患者的血浆扩增四种抗原。在针对每种抗原的RT-PCR中使用从三名患者的保藏的冷冻血浆提取的RNA，所述血浆的HIV效价分别为250,000、146,148和3,221,835个拷贝/mL。下面的T7启动子和64dT引物组用于嵌套PCR。
  GAG正向T7引物组   GAG反向64dT引物组
  引物19和20   引物106、107和108
  VPR正向T7引物组   VPR反向64dT引物组
  引物57和58   引物201、202和203
  REV正向T7引物组   REV反向64dT引物组
  引物87和88   引物193、194和195
  NEF正向T7引物组   NEF反向64dT引物组
  引物147和148   引物149、150和151
图17A图解了对受HIV感染的所有三名患者中所有四种抗原的成功扩增。
在体外转录来自PCR嵌套轮的产物以产生RNA，并成功地转录所有四种抗原(图17b)。这表明在PCR嵌套轮中用T7启动子成功地修饰了所有PCR片段。通过分析从亚克隆的次级PCR片段的序列数据，提供了对用T7 RNA聚合酶结合位点以及多聚T64序列的成功修饰的独立证明，以及对序列同一性的证明。
我们设计了使用正向和反向引物组的策略，用于扩增每个HIV感染的患者独特的多种HIV准种。因为个体患者之间HIV抗原准种的变化，预期不同的引物组将与不同的准种序列退火，从而将以每名患者独特的模式发生扩增。这在关于HIV感染的三名患者中Gag的扩增的图17a中阐明：泳道3中的引物组不产生患者1的任何PCR产物但是导致患者2的明显产物，而泳道6中的引物组不能扩增来自患者2的物质，但是成功地扩增了患者1和患者3的RNA。
为了证实不同的引物组捕获不同的HIV准种，我们对从患者3得到的全长PCR Gag克隆进行了测序和分析，患者3是高度病毒血的(HIV效价为3,221,835个拷贝/mL)。在该实验中，在泳道1、2、4、5和6中得到了Gag的预期大小的不同带(图17a)。克隆次级PCR片段，针对插入序列的存在进行筛选，并测序。通过引物组组合扩增的PCR产物分开克隆，每个引物组总共10个阳性克隆。用Lasergene软件(DNAStar)、Los Alamos HIV Sequence Database和BLAST分析进行核苷酸序列分析。通过用对应的序列与以前报导的序列比较，来估计新近扩增的核苷酸序列的系统发生(phylogenetic)关系。从LosAlamos HIV Sequence Database得到常见HIV进化枝的共有序列并用作参照。使用Clustal V软件比对核苷酸序列。使用Lasergene软件的MegAlign模块构建系统树。对来自患者3的不同Gag克隆的系统发生关系的分析揭示了所捕获的准种的宽多样性(图18A)。更重要的，并且如所预测的，通过用某些组的引物扩增捕获了一些准种，而一些准种则不能被捕获。
我们的疫苗技术抗原的一个潜在的关键优点将是：对能表现在宿主CTL下进化的HVI逃避突变的准种抗原的扩增和抗原呈递，以诱导对最初免疫应答的抗性。在患者1中，我们鉴定了Gag准种中可能引起Gag p17蛋白质的氨基酸替代的序列突变，然后使用Los AlamosMolecular Immunology数据库将这些突变的氨基酸序列与预测的HLA表位比较。在图18b中概述的这些数据表明：一些被捕获的突变导致了位于与抗原呈递有关的HLA表位的相关部分中的氨基酸变换。这将反映抗CTL压力的HIV准种的进化。与之相比，使用我们新近开发的扩增方案，由于HIV突变引起的新的和相关的免疫原性表位将也被被捕获。图18C、18D和18E中显示了针对受HIV感染的患者1的血浆扩增的全长gag、rev和vpr克隆的系统发生关系。
我们已经证实了受转染的真核细胞中RNA的翻译和HIV Gag、Vpr、Rev和Nef抗原蛋白质的表达，这是通过使用从具有HIV感染的至少三名患者分离和扩增的RNA来证实的。在35S甲硫氨酸存在下，针对Gag从HIV感染的患者扩增的帽化和多聚腺苷酸化的RNA在体外翻译。使用变性凝胶通过电泳分离蛋白质，将其转移到PVDF并曝光。将针对Vpr扩增的RNA转染到HeLa细胞，将针对Rev和Nef扩增的RNA转染到树突细胞中。转染后12到15小时，收获并裂解细胞。在SDS-PAGE凝胶上分离完整细胞裂解物，转移到PVDF上并使用每种抗原的特异抗体探测。使用多克隆绵羊抗-Rev抗体(NovusBiologicals)检测Rev蛋白质，使用抗-HIV-1NL4-3Vpr抗血清(1-46)(NIH AIDS Resea rch & Reference Reagent program)检测Vpr蛋白质，使用抗-Nef兔多克隆抗体(R.Sekaly博士赠送)检测Nef蛋白质。这些结果概括于表19中，其表明在使用Gag RNA作为模板的体外翻译反应中检测到了具有合适分子量(56kDa)的蛋白质。对照泳道含有用从非感染性HIV克隆扩增的对应的抗原RNA转染的细胞得到的裂解物。NTC泳道含有从转染的细胞得到的裂解物或者体外翻译混合物，不含有任何RNA。在左边指出了分子标记的分子量。使用从对照质粒pBKBH10S扩增的Gag RNA，通过蛋白质印迹证实了所表达的Gag蛋白质的身份。来自患者1和患者3的Gag RNA在HeLa细胞提取物中翻译。在来自用编码Vpr(10.5kDa)、Rev(11.4kDa)和Nef(23.6kDa)的RNA转染的树突或者HeLa细胞的细胞裂解物中检测到了其它抗原。在患者1中，用抗-Nef抗体识别的特定带是扩散性的(diffuse)，一些物质迁移到较高的分子量。一种可能的解释是存在一种以上的Nef准种，或者Nef的翻译后修饰突变，其产生根据分子量的差异迁移的不同蛋白质。在从用来自患者3的Rev RNA转染的DC得到的裂解物中进行类似的观察。使用抗-Gag单克隆抗体(Beckman Coulter)，通过用来自患者1的Gag RNA转染的DC的FACS分子证实了所表达的Gag蛋白质的身份。对DC进行的细胞内FACS染色收获了电穿孔后4小时的阳性染色细胞。用通过ARCA类似物修饰的RNA转染的细胞中抗体的结合比用以常规m7G帽类似物修饰的RNA转染的细胞的所述结合更高。因为使用了等质量的m7G帽化的RNA或者ARCA修饰的RNA，这表明与m7G帽化的gag mRNA相比，ARCA-帽化的mRNA产生更高的蛋白质表达。从分离自患者的HIV毒株扩增的Vpr已经在树突细胞(数据未显示)以及在HeLa细胞中表达。
前面实施例中的结果表明：(1)可以策略性地设计具有有限复杂性的引物库，以从跨不同进化枝的不同组的模板可信赖地扩增预期的产物，(2)可以进行嵌套PCR以在5’末端加入T7启动子和向3’末端加入寡聚dT尾，(3)通过该方法可以扩增患者血清中存在的多种HIV准种，(4)嵌套PCR产物可以转录成帽化的多聚腺苷酸化的RNA，(5)可以用抗原特异性RNA转染树突细胞，并且表达如通过FACS分析所示的预期蛋白质，和(6)产生的蛋白质具有正确的分子量，如通过转染的细胞的蛋白质印迹分析所示。这些观察一起提供了重要证据，表明我们的疫苗设计策略提供了对多种HIV准种的扩增，用于树突细胞的抗原呈递。此外，通过组合引物组，可能可以提供HIV感染的个体患者独特的完整宽度的HIV准种和CTL所有组成成分，代表了艾滋病疫苗技术中的重要发展。
                 实施例18
用从患者血浆扩增的HIV mRNA转染的树突细胞刺激自体外周血单 核细胞(PBMCs)
使用本发明的引物，通过扩增患者血浆中的HIV毒株来制备自体HIV RNA，以产生HIV DNA，其然后在体外转录，以产生编码vpr、rev、nef和gag多肽的HIV mRNA。用四种自体HIV基因(Vpr、Rev、Nef和Gag)以及编码CD40L的RNA共转染未成熟DC，随后在IFN-γ存在下对其进行培养而实现完全DC成熟。装载有抗原的成熟DC用于刺激自体HIV患者PBMC。培养6天后，回收PBMC，用对应于Vpr、Rev、Nef和gag的共有序列的四个个体重叠肽文库(两个库)对其进行再刺激。通过应答于每种个体HIV基因的识别的ICS来确定IFN-γ阳性CD8+T细胞的频率。向DC制备物装载四种HIV基因的每一种，分别以1μg RNA/百万DC加载(图20，左栏)，在平行实验中，Nef RNA有效负荷减小到0.25μg/百万DC，而其它三种基因每种以1μg RNA/百万DC转染(图20，右栏)。结果表明Nef mRNA有效负荷相对Vpr、Rev和Gag mRNA的减小增强了总体免疫力，而不包含对Nef抗原的免疫应答。
                 实施例19
用自体HIC RNA转染的成熟树突细胞比用共有肽脉冲的成熟DC诱 导更强的回忆(recall)应答
仅用5μg eGFP RNA/百万DC(阴性对照)转染未成熟DC，或者随后用gag共有肽对eGFP转染的DC进行脉冲，作为两个库。备选地，用自体Gag RNA(5μg RNA/百万DC)转染DC。在所有情况中，用CD40L RNA共转染DC，随后用IFN-γ培养以实现完全成熟。装载有抗原的DC与以前用CSSE标记的PBMC共培养。6天后，回收PBMC并确定抗原反应性(CFSE低)细胞的频率。此外，通过作为CTL效应功能标记的粒酶B的ICS染色CFSE低细胞。图21中所示的结果展示了与用gag共有肽脉冲的DC相比，装载有自体HIV gagRNA的DC所诱导的优良的免疫应答。
                实施例19
对装载有编码来自患者中HIV的多种毒株的多肽的RNA的自体树突 细胞疫苗进行的临床试验
本试验的目的是检查对经历HAART治疗的HIV感染的患者施用树突细胞疫苗的安全性和免疫应答。该研究的主要目的是：
·检查在经历HAART治疗的HIV感染患者中多次施用负荷RNA的DC的安全性。
·通过对研究过程中在就诊1(筛选)、就诊2(接种前的基线)时，在第4、8、20、32和第36周的5次接种时和/或在研究结束/中断就诊时8次收集的血样进行细胞内细胞因子染色(ICS)和CSFE T细胞增殖测定，来评估对RNA负荷的DC接种的T细胞应答。
试验设计
在开始治疗期之前将对门诊病人进行治疗前期。患者的合格性将通过筛选评估来评估并在基线(baseline)评价时证实。该期组成为：
·筛选就诊
·抽血
·白细胞分离法就诊[在主管医生决定患者适合白细胞分离法后进行]
·免疫学检测(样品将在就诊2(筛选)和就诊3(接种前基线)时收集)
·基线评价(将在第一天给药时但是在最初施用疫苗前进行)
在治疗期期间，患者将在第0、4、8、20和32个研究周(StudyWeek)时接受皮内疫苗接种。随机化到研究的组(arm)1的患者将接受0.6mL体积中的1.2X107个转染的DC，随机化到研究组2的患者将接受0.6mL体积中的1.2X106个转染的DC。将在每次就诊时进行安全性评估。将在就诊2(筛选)、就诊3(接种前的基线)、每次随后施用后在研究周-4、0、4、8、20、32时，和/或在研究结束/中断就诊(最后疫苗施用后最少2周)时进行免疫学监测。
安全性
·在每次接种前，生命体征(血压、心率、呼吸率、和体温)中从获得的基线值的治疗紧急改变。
·治疗紧急AE的出现。
·每次接种后局部疫苗注射部位反应的治疗紧急改变。
·每次接种前后评估的治疗紧急的腺病、触痛或者炎症(腹股沟的和腋窝的)。
·每次接种前得到的临床实验测试中从基线值(包括通过CTC分级)的治疗紧急改变。
·治疗期期间以周期间隔进行的体检和心电图(ECG)中的治疗紧急改变。
·治疗期期间以周期间隔通过临床病征和症状(例如，疹、血球减少、关节痛)和实验评估(ANA、RF、抗-dsDNA抗体、CH50、抗甲状腺抗体、间接库姆伯斯试验)测量的自身免疫学评价中的治疗紧急改变。
受试者的选择和登记
必须在研究进入前两周内完成用于确定合格性的筛选和评价。
选择标准
通过任何许可的ELISA测试试剂盒记录HIV感染，并在研究进入前任何时间通过蛋白质印迹证实。阳性HIV-1培养物、HIV-1抗原、血浆HIV-1 RNA或者通过不同于ELISA的方法进行的另一种抗体测试作为备选的确证试验是可接受的。
受试者当前接受第一次有效的ART方案，其定义为三种或多种抗逆转录病毒药物的组合，在研究进入前为期≥6个月。如果受试者当前接受的有效ART方案不是它们的第一次有效ART方案，那么患者必须在得到筛选HIV-1 RNA水平之前已经接受当前有效的ART方案至少4周，并且由于除了病毒衰竭之外的原因而必须改变到当前的有效ART方案。
注解：利托那韦与另一种蛋白酶抑制剂组合将视为一种抗病毒剂。
通过相互相隔至少一个月的至少三次测量记录到在研究进入前至少6个月的期限内当前持续的HIV-1 RNA水平≤400个拷贝/mL，其中1个月等于30天，第一次测量在研究进入前至少6个月进行，其它测量在研究进入的6个月内进行。
通过至少两次测量记录到研究进入前至少3个月的期间内当前的持续CD4+T-细胞数≥350个细胞/mm3，其中1个月等价于30天，第一次测量在研究进入前至少3个月进行，第二次测量在研究进入1个月内进行。
在任一ACTG-检验的流式实验室筛选时得到CD4+细胞数≥350个细胞/mm3。
在研究筛选时，通过Roche Amplicor HIV-1 MonitorTMUltraSensitive测定法得到HIV-1RNA水平≤200个拷贝/mL。
男人和女人年龄≥18岁。
在研究进入前30天内得到实验值：
·肌酸酐≤3x ULN。
·AST(SGOT)，ALT(SGPT)，和碱性磷酸酶≤5x ULN。
在实验进入前30天内得到实验值，并且在实验进入的72小时内再次得到实验值。这些值必须在两个分开的时间点得到：
·嗜中性细胞绝对计数(ANC)≥750/mm3。
·血红蛋白＞8g/dL。
·血小板计数≥75,000/mm3。
·对具有生育潜力的所有女性受试者进行阴性妊娠试验。
淘汰标准
研究进入前14天内的任何急性感染或者严重医学疾病。受试者由于严重疾病(需要全身治疗和/或入院)将排除于该研究外，直到受试者完成治疗或者在治疗临床上稳定，根据研究人员的意见，在研究进入前至少14天。
在研究进入6个月内的得到的任何HIV-1 RNA值＞400拷贝/mL。
在研究进入3个月内的得到的任何CD4 T-细胞计数＜350个细胞/mm3。
淋巴结放射史。
以前使用过任何HIV疫苗。
在研究进入前45天内使用羟基脲。
妊娠和哺乳。
在研究进入30天内接受任何免疫调节剂或者抑制剂，包括，但不限于药物如全身性皮质激素；干扰素、白介素；沙立度胺；沙格司亭(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子[GM-CSF])；二硝基氯苯(DNCB)；胸腺素α、胸腺喷丁、异丙肌苷；多核苷酸；ditocarb钠。
对研究药物或者它们的制剂变态反应/过敏。
活跃的药物或者酒精使用或者依赖性，按照研究人员的意见，所述使用或依赖性将干扰对研究要求的遵守。
在研究进入前1年内已知的HIV-1血清转化。
任何不是通过公共途径获得的研究阶段的抗病毒剂。
对患者的治疗
研究药疗法和剂量
疫苗基本由无菌处理的，成熟的，用自体的、经选择的HIV RNA电穿孔的自体树突细胞组成。每种剂量将以冷冻管提供，所述冷冻管含有以1.2x107个细胞/mL(组1)或1.2x106(组2)的浓度悬浮的0.6cc冷藏保存的细胞，以提供悬浮于热失活自体血浆中的10％DMSO和5％葡萄糖中的、装载有自体经扩增的HIV RNA的成熟DC。
剂量理论
通过下述数目来进行对高剂量水平的选择，所述数目是可以从一次白细胞分离法产生的以及可以以至少6种疫苗(5种用于施用，一种用于重量对照)的RNA转导的树突细胞的预期最大数目。选择免疫接种间隔以在合理的时帧内实现多次免疫(其通常需要用来证明免疫学应答)。
剂量和给药
制备用于施用的疫苗
将在临施用于患者前从低温储藏取出疫苗，通过用双手搓动或者握住小瓶来解冻。产品将在3到5分钟内完全解冻。在该步骤中应该谨慎，因为当首先从干燥包装箱(dry-shipper)取出的时小瓶非常冷。
应该在解冻后立即施用疫苗，以便使解冻的细胞接触DMSO的时间最短。
施用前，应该通过轻敲小瓶来温和混合解冻的细胞。必须避免倒转小瓶。混合后，用整体(integral)26号针头(由生产商提供)将疫苗抽入1mL过敏反应试验注射器(每支注射器将抽0.2mL)。
疫苗的施用
应该在注射器充满后立即施用疫苗，以防止由于注射器中细胞沉淀而导致不均匀的剂量递送。
疫苗将皮内施用。将在第0、4、8、20和32个研究周进行施用。
在每个疫苗注射日，整个剂量将针对一个淋巴结盆，以右腋窝开始，然后在四个解剖部位(右腋窝、左腋窝、右腹股沟，和右腹股沟)顺时针方向旋转。将在尽可能靠近关节的四肢的前内侧方面进行注射。对于手臂而言，可以使用肘远端上臂的前表面。
疫苗的施用必须通过三次皮内注射每次递送0.2mL疫苗来递送，总共剂量为0.6mL。每个注射部位必须相互距离约5cm。必须小心缓慢出针以便使回渗最小。回渗百分数必须在三次注射内平均，并且舍入到最近的四分之一并且以患者的CRF记录。在研究期间不允许研究药疗法有剂量变动。
研究治疗分配
患者签了知情同意(Informed Consent)表后，地方工作人员将患者向主办者登记。地方工作人员将分配地方特定(site specific)筛选号，该筛选号是筛选就诊时每名患者唯一的。
证明所有治疗前评价都是可接受的之后，将给予患者ID号并登记。将登记最大20名可评价的患者。白细胞分离术后没有足够细胞来产生至少6剂量的疫苗(5剂用于施用，一剂用于质量对照)的患者将从该研究退出。这些患者将构成产生性(manufacturing)失败，在该研究中将不被替换。对在完成至少5次接种前由于与疾病发展或者疫苗治疗不相关的原因(例如，意外死亡、失去随访)从研究退出或者自己退出的患者不进行评价，它们将被替换。按照研究人员的意见，如果在可以得到第一次疫苗注射前，疾病的发展需要其它疗法，患者将由于该疾病发展而从该研究中断并且将不被替换。
允许的伴随药疗法/治疗
可对患者进行伴随的药疗法，但是伴随的ART、其它免疫抑制剂，或者任何形式的免疫疗法排除在外。在研究期间进行的所有伴随处方和禁止的伴随非处方(OTC)药疗法(例如，局部类固醇，等等)将记录在CRF中。非禁止的伴随OTC药疗法将不记录在CRF中。
研究药疗法处理
疫苗组分的收集和运输
血液/血浆样品收集
白细胞分离术
·患者将在临床场所的白细胞分离术供者中心经历用COBESpectra Leukapheresis System进行的白细胞分离术。如果外周静脉通路不足，那么可以在颈静脉和锁骨下静脉中放置硬质双腔导管。
·在白细胞分离术就诊期间将收集约180mL白细胞分离术产物。
·在白细胞分离术收集期间将收集单独的约150mL自体血浆。
·患者在白细胞分离术之前和之后立即记录他们的血压并且抽血用于差别全部血细胞计数(CBC)。将还对白细胞分离术产物进行差别CBC。
·将按照《研究参考手册》(Study Reference Manual)中提供的标准临床实践和指导用无菌的一次性单次使用细胞单采包收集PBMC。
·将白细胞分离术样品和自体血浆样品运输到生产试验设施中，而不在生产商提供的特定运输容器中进一步处理。这些产品将被保持在受控、受监测、绝缘的容器中，并通过夜晚运输商运输。
·必须在根据《研究参考手册》的教导的步骤当天将白细胞分离术产物运输到生产商。
在生产设施处，将检查白细胞分离术产物以确定它是否可被接受用来疫苗生产。如果该产物不足以产生至少6种疫苗，患者将从该研究中断。
疫苗的保存条件
每剂疫苗将为0.6mL总体积中约1.2x107个细胞(组1)或者0.6mL总体积中约1.2x106个细胞(组2)。每剂疫苗将在冷冻管中提供，所述冷冻管含有以1.2x107个细胞/mL的浓度悬浮的冷藏保存的细胞，以提供悬浮于热失活自体血浆中的10％DMSO和5％葡萄糖中的、装载有自体经扩增的肿瘤总RNA的成熟DC。每个治疗日的疫苗将单独运输。将不在临床场所保持研究药物的储液。冷冻管将在受控的条件下、等于或者低于-150℃的温度下在液氮dry-shipper中运输。冷冻管将保存在该场所的该干燥包装箱中待用。包装箱必须立即返回到生产商以便运输随后的剂量。
时间和事件时间表
在治疗期开始前将对门诊患者进行治疗前期。时间线在图22中显示。治疗前期的总持续时间为6周。治疗前期由下面的就诊组成：
筛选就诊(就诊1)
白细胞分离术就诊(就诊2)
基线评估就诊(就诊3)
治疗期
下面的研究评价将在治疗期期间进行：
免疫学监测
除临床安全性终点之外，还将评估免疫应答。在就诊1(筛选就诊)、就诊3(接种前基线)、在第4、8、20、32个研究周和第36周(就诊8)每次随后的疫苗施用前或者在研究结束/中断就诊(最后疫苗施用后最少2周)时进行免疫学监测。
将在七个时间点收集血样并根据下面的方法通过ICS(测量IFN-γ和IL-2)和通过CFSE T细胞增殖测定应答接种的T-细胞的存在：
制备用于免疫监测分析的PBMC：
设备/供给
1.无菌的50ml聚丙烯管
2.37℃水浴
3.10和25吸量管，单独包装
4.2ml低温瓶
5.-80℃致冷器
6.冷冻容器(Nalgene)
7.液氮致冷器
8.血细胞计数器
试剂
1.人AB血清(Gemini BioProducts)
2.DMSO(Cat#D2650，测试了内毒素的，Sigma)，DMSO在打开后6个月过期
3.RPMI 1640(Life Technologies)
4.人血清白蛋白(5克，cat#A5843，低内毒素，Sigma；orSerologicals Corp.)
为了制备12.5％HAS溶液，在5克瓶中加入40mls RPMI 1640。通过倒转温和混合。不涡旋，因为HSA将起泡沫。将滤器灭菌并在4℃保存长达6个月。
5.测定培养基：MATIS+10％人AB血清
向无菌的500ml瓶中移入：
        250mls RPMI 1640
        250mls EHAA
        10ml Pen/Strep溶液
        25mls 200mM L-谷氨酸
        50ul 0.5M 2-巯基乙醇溶液
        50mls热失活的人AB血清
将瓶子标记日期和首字母。在4℃保存。
6.锥虫蓝(PBS中0.4％，cat#T8154Sigma)
步骤
冷冻PBMC
1.在4℃放置Nalgene冷冻容器。
2.将冷冻管标记：
患者ID
10x106PBMC
抽血日期和技术员首字母
3.将标记的冷冻管置于-20℃致冷器中。
4.对于每个冷冻管，每10x106个PMBC加入1ml的总体积。
5.制备2X冷冻介质：对于20个冷冻管
                  10mls 12.5％HAS溶液
                  2.5mls DMSO
混合并在冰上放置最少30分钟。
6.在冷却的12.5％HAS溶液中以2x107个活淋巴细胞/ml重悬浮加入菲可的PBMC。
7.向细胞悬浮液逐滴加入冷却的2X冷冻介质，伴随温和旋转该管。
8.从-20℃取出冷冻的冷冻管，并每个冷冻管等分1ml。
9.一旦等分PBMC后将冷冻管置于冰上。
10.将冷冻管转移到Nalgene冷冻容器中并置于-80℃致冷器中。
11.为了长期保存，在-80℃冷冻24小时后将冷冻管转移到液氮致冷器中。从不将细胞保存在20℃(甚至暂时保存也不行)。
12.在样品数据库和致冷器binder都记录小瓶位置(箱子号码和slot number)。
解冻PBMC
1.将细胞培养基在37℃水浴中放置约30分钟。
2.按照样品标记50ml离心管并加入8ml温的(22℃到37℃)测定培养基。
3.从液氮致冷器除去冷冻管并直接放置在干冰上。
4.一次解冻不超过2个冷冻管。将冷冻管放置在37℃水浴中直到细胞悬浮液几乎完全熔解或者剩余少量的冰。
5.使冷冻管的外面干燥并用70％乙醇擦拭。
6.向解冻的细胞缓慢加入1ml温的(22℃到37℃)细胞培养基。
7.将细胞悬浮液转移到含有8ml培养基的50ml聚丙烯管中。
8.平衡管并以1200转/分钟离心10分钟。
9.抽吸上清液并将细胞重悬浮在2ml测定培养基中。
10.使用锥虫蓝进行成熟细胞计数以确定PBMC生活力。
ICS方案
设备/供给
无菌的50ml聚丙烯管
无菌的15ml聚丙烯管
1ml 96乙圆底板
试剂
人AB血清(Gemini BioProducts)
RPMI 1640(Life Technologies)
PBS
PBS 2％FCS
15mer HIV和对照肽
布雷菲德菌素A
抗体：CD4 APC-Cy7、CD27-PE、IL-2FITC、IFN-γAPC、CCR7-PECy7、CD28 CyChrome(BD)和CD45 RA ECD(Coulter)
来自HIV感染的个体的PBMC
步骤
1.解冻PBMC(见相关方案)
2.ICS
-分配2.106个细胞/1ml/孔(96孔深圆底板)。我们为每种肽准备5个孔用于6色染色。
-向每个样品(1μg/mL)加入抗-CD28抗体和CD49d(BectonDickinson，San Jose，CA)作为共同刺激剂。
-用SEA(200ng/ml)
或NS(阴性对照)
或肽(5μg/ml)激活细胞
-在37℃温育所有样品。总共温育将为约12小时。
-在37℃温育1-1.5小时后，加入布雷菲德菌素A至终浓度为10μg/ml。
-当总共温育12小时时，将细胞转移到96孔圆底板中。
-用PBS 2％FCS洗涤两次。
-对细胞表面标记染色。100μl PBS 2％FCS中(CD4 APC-Cy7(5μl)，CD27PE(10μl)，CD28CyChrome(20μl)，CCR7-PE Cy7(10μl)，CD45RA CyChrome(10μl)。
-在4℃温育30分钟。
-用PBS 2％FCS洗涤两次。
-加入100μl PBS和100μl 4％多聚甲醛。
-在室温温育30分钟。
-用透化缓冲液(PBS中的0.5％皂甙。每次新鲜制备)洗涤两次。
-加入50μl透化缓冲液。
-在室温温育30分钟。
-在50μl透化缓冲液中针对细胞内细胞因子IL-2FITC(1μl)、IFN-γAPC(10μl)进行染色。
-在室温温育30分钟。
-用PBS 2％FCS洗涤两次。
-加入100μl PBS和100μl 4％多聚甲醛。
-第二天在FACS上分析细胞。
对照：
-未染色的细胞作为阴性对照。
-用于表面染色的同种型对照。
-用于细胞内染色的同种型对照。
-阳性对照。
-透化对照(Perm-a-sure＝识别组成型表达的人细胞蛋白质)：一个样品将被透化，另一个不被透化。
-活化对照：一个样品将保持未刺激，因为没有活化背景对照。
CSFE T细胞增殖测定
试剂：
SEB或SEA原液1mg/mL
5-6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺基酯(CFSE)(MolecularProbes，cat#C-1157)
细胞表面标记：FL2(PE)，FL3(PerCP或Cychrome)和FL4(APC)-缀合的抗体
PBS
染色洗涤缓冲液：PBS 2％FCS
RPMI-10人AB血清(Sigma)。
步骤：
滴定
将CFSE溶解在无水试剂级的DMSO中并在-80℃保存。CFSE的新制剂必须被滴定，以得到最佳的染色结果。为进行滴定，向PBMCs(1x107/mL)加入等体积的浓度为0.5-5μM的CFSE，在黑暗中于室温温和搅拌下温育8分钟。通过加入等体积的HS 1分钟来淬灭反应。细胞用PBS洗涤，并在37℃5％CO2中以1x106/mL在含有10％HS的RPMI中过夜培养，并通过FACS分析测定用不同浓度处理的细胞的荧光强度。最佳CFSE浓度被确定为：在流式细胞术(FL1通道)中所有细胞都以103和104对数单位的荧光强度被染色时的浓度。我们观察到在：染色时和第二天之间荧光强度显著降低，因此仅在上面提到的条件下温育24小时后收集所有滴定结果和实验数据。应该加入FL2(PE)和FL3(PerCP或Cychrome)-缀合的表面标记，以在测试的所有CFSE浓度下设置电压和补偿(如果CFSE荧光太高，那么几乎不可能补偿FL2和FL3)。在我们的实验中，使用的最终CFSE浓度通常在0.5到1.25μM之间变化。
染色
1)将PBMC以1千万/mL重悬浮在PBS中。
2)制备2X CFSE溶液。(如果最终工作溶液为1.5uM，那么制备3uM溶液)。
3)向PBMC加入1倍体积的2X CFSE。
4)在通风厨中无光的条件下温和搅拌下温育8-10分钟。
5)通过用RPMI 10％HS填满管体积来淬灭。
6)收集细胞(7min，1400PRM)并用完全培养基以1百万/ml重悬浮。
7)将细胞分配在96深孔板(1到2百万/孔)中并用SEB(1μg/ml或SEA 50-100ng/mL)作为增殖的阳性对照、10ug/ml一种肽、2ug/ml/肽(当使用肽库时)、2ug/ml重组蛋白质刺激。
8)在37℃温育4到7天。
9)取出800ul上清液并将细胞留在底部。使用多通道自动移液器(pipetman)将细胞转移到96V形底平板中。
10)用PBS 2％FCS(100ul)洗涤。
11)在50μl PBS 2％FCS中对表面标记染色。
12)在室温黑暗中温育20分钟。
13)用PBS 2％FCS(150μl)洗涤。
14)将400μl 2％甲醛重悬浮在PBS 2％FCS中。
15)在流式细胞仪上获取数据。
安全性评估
将通过体格检查评价患者安全性，体格检查包括医疗史、临床实验测试、ECG、生命体征测量和AE评估。安全性变量将包括：于施用树突细胞有关的副作用的发生率和严重性的分级，包括血液学的和血化学参数。这些变量将还包括自身免疫评价、腺病评价，和对局部疫苗注射部位反应的评价。将在整个研究中监测所有安全性程序和评价的结果。
体格检查和医疗史
在筛选就诊期间，医学史将特别注意：1)对身体系统的评价和2)处方药疗法(包括ART)的使用。推荐在筛选就诊时血浆分离置换护士目测评估患者的静脉通路。
体格检查将在筛选就诊、基线评估就诊和治疗期期间每次随后的就诊时进行。体格检查将还在研究中断时进行。将评估在下列类别中的体格发现：神经学上的、心血管的、呼吸的、淋巴的、皮肤、腹部、头、耳、眼、鼻、咽喉和过敏反应。
临床实验评估
将在研究期间的不同时间点收集血液和尿液样品，用于测量和评价临床化学、血液学和尿分析参数。将得到下面参数的值：
临床化学评估
钠
钾
氯化物
肌酸酐
钙
SGOT(AST)(血清谷草转氨酶)
SGPT(ALT)(血清谷-丙转氨酶)
碱性磷酸酶
胆红素(总的)
LDH(仅筛选)(乳酸脱氢酶)
血清白蛋白
血液学评估
差别全部血细胞计数
血小板计数
血红蛋白(Hgb)
血细胞比容
凝血酶原时间(PT)(仅筛选)
部分凝血致活酶时间(PTT)(仅筛选)
尿分析
仅浸渍片(包括蛋白质、葡萄糖、血红蛋白、pH和酮)和显微术(如果临床上指出)。
在研究期间进行的临床实验测试的结果必须由研究人员加以评估，以便确定每名患者参加研究的持续合格性。如果值在正常参考范围之外，那么研究人员必须按照CTC分配毒性级别，并且评估所述值在本研究的背景中是否是临床上显著的。研究人员认为临床上显著的所有异常实验值都必须在CRF的AE页上表示。如果实验异常与医学上定义的诊断或者综合征明显有关，那么诊断或者综合征将记录在AE页上而不是个体实验值中。如果异常值与诊断或者综合征无关，那么实验值将记录在AE页上。
生命体征和体重
生命体征包括收缩和舒张血压、心率、呼吸率、和体温。这些测量以及患者的体重将在筛选就诊、白细胞分离就诊(仅在白细胞分离血压前后)、基线评价就诊、所有给药就诊(对于生命体征，疫苗接种前和接种后第一小时每15分钟时，和接种后第二小时每30分钟)时以及研究中断时测量。将在坐位5分钟后进行生命体征测量。在该5分钟期间内将不进行其它测量或者程序。
自身免疫评价
将通过临床病征和症状(例如，疹、血球减少、关节痛)，以及通过对ANA、RF、抗-dsDNA抗体、CH50、抗甲状腺抗体的实验评估，和间接库姆伯斯试验来测量自身免疫学评价。
腺病评价
将针对大小改变、触痛或者炎症来对引流淋巴结(腋窝的和腹股沟的)加以评价。将在基线评价就诊和每次以后的就诊时进行评价。此外，患者将在两次就诊之间在家中记录淋巴结不适感。
疫苗注射部位反应评价
接种后第一小时每15分钟、接种后第二小时每30分钟，并且接种后48小时由患者在家中进行疫苗注射部位反应评价。给患者卡片用来记录他们的48小时观察。地区人员将电话通知患者在每次接种后2到6天内返回该信息。对于报告≥级别2部位注射反应AE的患者，主要研究人员或者被任命者将要求患者返回到诊所，由受过训练的人员评估注射部位反应。将根据CTC对反应分级并且它们将用AE记录在CRF中。
序列表
<110>Argos Therapeutics，Inc.
   Nicolette，Charles
   Tcherepanova，Irina
   Harris，Jason
   Healey，Don
<120>病原体的非毒株依赖性扩增和针对其的疫苗
<130>MER029WO
<150>US 60/522,310
<151>2004-09-14
<150>US 60/665,130
<151>2005-03-25
<160>408
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>1
actctggtaa ctagagatcc    20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>2
actctgataa ctagagatcc    20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>3
actctggtag ctagagatcc        20
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>4
aattttgact agcggaggc         19
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>5
aaattttgac tagcggaggc        20
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>6
aaatttttga ctagcggagg c      21
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>7
tattttgact agcggaggc         19
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>8
atttttgact agcggaggc         19
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>9
actttgacta gcggaggc          18
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>10
ttttttgact agcggaggc         19
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>11
aatttttgac tagcggaggc        20
<210>12
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>12
attttgacta gcggaggc          18
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>13
aaattttgac tagcggaggc    20
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>14
cattttgact agcggaggc     19
<210>15
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>15
attttgacta gcggaggc      18
<210>16
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>16
agatgggtgc gagagcgt      18
<210>17
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>17
agatgggtgc gagaccgt      18
<210>18
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>18
agagagggtg cgagagcgt                                19
<210>19
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>19
taatacgact cactatagg agaccaccat gggtgcgaga gcgt     44
<210>20
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>20
taatacgact cactataggg agaccaccat gggtgcgaga ccgt    44
<210>21
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>21
gtgacgaggg gtcgttg                                  17
<210>22
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>22
gtgacgaggg gtcgctg                                  17
<210>23
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>23
gtgacgatgg gtcgttg    17
<210>24
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>24
gagacgaggg gtcgttg    17
<210>25
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>25
ttgacgaggg gtcgttg    17
<210>26
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>26
gtaacgaggg ggcgttg    17
<210>27
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>27
gtgtcgaggg ggcgttg    17
<210>28
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>28
gtgacaaggg gtcgttg    17
<210>29
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>29
gtaacgaggg gtcgttg    17
<210>30
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>30
gcaacgaggg gtcgttg    17
<210>31
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>31
gcgacgaggg gtcgttg    17
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>32
gctcctgtat ctaatagagc    20
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>33
gctcctgtat ctaataaagc    20
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>34
gctcctgtat ctaacagagc    20
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>35
gctcctgtgt ctaatagagc    20
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>36
tttggtttcc atcttcctgg    20
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>37
tttggtttcc atcttcctgc    20
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>38
tttggcttcc atctccctgg    20
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>39
tttggcttcc atcttcctgg    20
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>40
tttggtttcc atttccctgg    20
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>41
tttggtttcc attttcctgg    20
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>42
tttggcttcc atcttcctgg                        20
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>43
ttcggtttcc atcttcctgg                        20
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>44
gcaggacata acaaggtagg                        20
<210>45
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>45
gcaggacata gcaaggtagg                        20
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>46
gcaggacata acaaagtagg                        20
<210>47
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>47
gcaggacata acaagatagg                        20
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>48
gcaggacata acaaagtaga                        20
<210>49
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>49
aagataaagc cacctttgcc                        20
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>50
cagataaagc cacctttgcc                        20
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>51
aaggtaaagc cacctttgcc                        20
<210>52
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>52
aagataaggc cacctttgcc    20
<210>53
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>53
actgacagag gatagatgg    19
<210>54
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>54
actgatagag gatagatgg    19
<210>55
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>55
actaacagag gatagatgg    19
<210>56
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>56
actgacagag gacagatgg    19
<210>57
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>57
taatacgact cactataggg agaccaccat ggaacaagcc ccag           44
<210>58
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>58
taatacgact cactataggg agaccaccat ggaacaagcc ccgg           44
<210>59
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Kozak sequence
<400>59
ccaccatgg                                                  9
<210>60
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>60
ggataaacag cagttgttgc                                      20
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>61
gaataaacag cagttgttgt                        20
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>62
ggataaacgg cagttgttgc                        20
<210>63
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>63
gaataaacaa cagttgttgc                        20
<210>64
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>64
gaataaacag cagctgttgc                        20
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>65
attctgctat gtcgacaccc                        20
<210>66
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>66
attctgctat gtcggcgccc    20
<210>67
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>67
attctgctat gtcggcaccc    20
<210>68
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>68
attctgctat gttgacaccc    20
<210>69
<211>20
<212>DNA
<213人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>69
ctccatttct tgctctcctc    20
<210>70
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>70
ctccatttct tgctcttctc    20
<210>71
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>71
ctccattcct tgctctcctc    20
<210>72
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>72
ctctatttct tgctctcctc    20
<210>73
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>73
ttccatttct tgctctcctc    20
<210>74
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>74
acataacaaa ttggctgtgg    20
<210>75
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>75
acatatcaag ttggctgtgg    20
<210>76
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>76
acataacaaa atggctgtgg    20
<210>77
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>77
acataacaaa ctggctgtgg    20
<210>78
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>78
acataacaga ttggctgtgg    20
<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>79
atagtaggag gcttggtagg    20
<210>80
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>80
atagtaggag gcttagtagg    20
<210>81
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>81
atagtaggag gcttgatagg    20
<210>82
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>82
attatcgttt cagacccacc    20
<210>83
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>83
attatcgttt cagacccgcc    20
<210>84
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>84
attatcgttt cagaccctcc    20
<210>85
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>85
attgtcgttt cagacccacc    20
<210>86
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>86
attgtcgttt cagacccgcc                              20
<210>87
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>87
taatacgact cactataggg agaccaccat ggacccacct ccc    43
<210>88
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>88
taatacgact cactataggg agaccaccat ggacccgcct ccc    43
<210>89
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>89
cctgactcca atactgtagg                              20
<210>90
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>90
cctgactcca atactgcagg                              20
<210>91
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>91
cctgactcca atattgtagg    20
<210>92
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>92
cctgaatcca atactgtagg    20
<210>93
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>93
cctggctcca atactgtagg    20
<210>94
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>94
gcattgagca agctaacagc    20
<210>95
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>95
gcattgagca agctaactgc    20
<210>96
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>96
gcattgagca agttaacagc    20
<210>97
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>97
acattaagca agttaacagc    20
<210>98
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>98
gcattaagca aactaacagc    20
<210>99
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>99
gcattgacga agctaacagc    20
<210>100
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>100
gcattaagca agctaacagc                                             20
<210>101
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>101
gcgttgagca agctaacagc                                             20
<210>102
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>102
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
ttttgtgacg aggggtcgtt g                                           81
<210>103
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>103
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
ttttgtgacg aggggtcgct g                                           81
<210>104
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>104
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
ttttgtaacg agggggcgtt g                                           81
<210>105
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>105
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
ttttgtgtcg agggggcgtt g                                            81
<210>106
<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>106
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
ttttgctcct gtatctaata gagc                                         84
<210>107
<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>107
tttttttttttttttttttttttttttttttttttttttt tttttttttt tttttttttt     60
ttttgctcct gtatctaata aagc                                         84
<210>108
<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>108
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
ttttgctcct gtatctaaca gagc                                         84
<210>109
<211>84
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<213>人工序列
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
tttttttggt ttccatcttc ctgg                                         84
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<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttggt ttccatcttc ctgc                                        84
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
tttttttggt ttccatttcc ctgg                                         84
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
tttttttggt ttccattttc ctgg                                         84
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
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<212>DNA
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<220>
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<211>23
<212>DNA
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<220>
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<220>
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<212>DNA
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<213>人工序列
<220>
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<212>DNA
<213>人工序列
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<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<210>172
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<210>173
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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tctgttctga ggaaaattcc ctggcctccc          30
<210>174
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<210>175
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>175
attccctaca atccccaaag tc                  22
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<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<220>
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<212>DNA
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<220>
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<212>DNA
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<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<212>DNA
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<223>合成的寡核苷酸
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>合成的寡核苷酸
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>合成的寡核苷酸
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<211>22
<212>DNA
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<223>合成的寡核苷酸
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>187
tgatagtagg aggcttgata gg    22
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>合成的寡核苷酸
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<212>DNA
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<223>合成的寡核苷酸
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>190
ccctgtctta ttcttctagg       20
<210>191
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>191
ccctgtctta ttcttacagg                                             20
<210>192
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>192
ccctgtctta ttcttgtagg                                             20
<210>193
<211>85
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>193
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttccctg tcttattctt ctagg                                       85
<210>194
<211>85
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>194
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttccctg tcttattctt acagg                                       85
<210>195
<211>85
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>195
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
tttttccctg tcttattctt gtagg                                        85
<210>196
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>196
ttcttcctgc cataggagat gc                                           22
<210>197
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>197
ttcttcctgc cataggaaat gc                                           22
<210>198
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>198
gcagttgtag gctgacttcc                                               20
<210>199
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>199
gcagttgtag gctgactccc                                               20
<210>200
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>200
gcagttgtag gctggcttcc                                              20
<210>201
<211>85
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>201
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
tttttgcagt tgtaggctga cttcc                                        85
<210>202
<211>85
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>202
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
tttttgcagt tgtaggctga ctccc                                        85
<210>203
<211>85
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>203
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
tttttgcagt tgtaggctgg cttcc                                        85
<210>204
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>204
tagctggctg gacagatag                                               19
<210>205
<211>87
<212>DNA
<213>人免疫缺陷病毒
<400>205
aagatagggg ggcaactaaa ggaagctcta ttagatacag gagcagatga tacagtatta  60
gaagaaataa atttgccagg aagatgg                                      87
<210>206
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>206
gtgcgagagc gt                                                      12
<210>207
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>207
gtgcgagacc gt                                                      12
<210>208
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>208
aacaagcccc ag                                                      12
<210>209
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>209
aacaagcccc gg   12
<210>210
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>210
acccacctcc c    11
<210>211
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>211
acccgcctcc c    11
<210>212
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>212
gagtgatgg       9
<210>213
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>213
gagtgaagg       9
<210>214
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>214
gagtgaggg              9
<210>215
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>215
gtggcaagtg gtcaaaaag    19
<210>216
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>216
gtggcaagtg gtcaaaacg    19
<210>217
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>217
tgggagcagt gtctca       16
<210>218
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>218
aggcacaaga ggaagagg     18
<210>219
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>219
taatacgact cactataggg agaccaccat gg    32
<210>220
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>220
gtgacgaggg gtcgttg                     17
<210>221
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>221
gtgacgaggg gtcgctg                     17
<210>222
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>222
gtaacgaggg gtcgttg                     17
<210>223
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>223
gtgtcgaggg ggcgttg                     17
<210>224
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>224
gctcctgtat ctaatagagc    20
<210>225
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>225
gctcctgtat ctaataaagc    20
<210>226
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>226
gctcctgtat ctaacagagc    20
<210>227
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>227
ggtttccatc ttcctgg       17
<210>228
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>228
ggtttccatc ttcctgc       17
<210>229
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>229
ggcttccatc tccctgg                                                 17
<210>230
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>230
ggtttccatt tccctgg                                                 17
<210>231
<211>87
<212>DNA
<213>人免疫缺陷病毒
<400>231
aagatagggg ggcaactaaa ggaagcccta ttagataccg gagcagatga tacagtatta  60
gaagaaataa atttaccagg aagatgg                                      87
<210>232
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>232
ggtttccatt ttcctgg                                                 17
<210>233
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>233
ggataaacag cagttgttgc                                              20
<210>234
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>234
gaataaacag cagttgttgt    20
<210>235
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>235
gaataaacag cagctgttgc    20
<210>236
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>236
attctgctat gtcgacaccc    20
<210>237
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>237
attctgctat gtcggcgccc    20
<210>238
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>238
attctgctat gtcggcaccc    20
<210>239
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>239
attctgctat gttgacaccc    20
<210>240
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>240
ctccatttct tgctctcctc    20
<210>241
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>241
ctccatttct tgctcttctc    20
<210>242
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>242
cctgactcca atactgtagg    20
<210>243
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>243
cctgactcca atactgcagg    20
<210>244
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>244
cctgactcca atattgtagg    20
<210>245
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>245
gcattgagca agctaacagc    20
<210>246
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>246
gcattgagca agctaactgc    20
<210>247
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>247
gcattgagca agttaacagc    20
<210>248
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>248
gcattaagca aactaacagc    20
<210>249
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>249
atagcaaagc cctttc        16
<210>250
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>250
ccagtacagg caaaaagc      18
<210>251
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>251
cagtacaggc gaaaagc       17
<210>252
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>252
ccagtacagg caagaagc      18
<210>253
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>253
gtcagcagtc ttt    13
<210>254
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>254
gtcagcagtc tca    13
<210>255
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>255
gaccacttgc caccc  15
<210>256
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>256
gaccacttgc cactc  15
<210>257
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>257
gaccacttgc ccccc  15
<210>258
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>258
ccctgtctta ttcttctagg                          20
<210>259
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>259
ccctgtctta ttcttacagg                          20
<210>260
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>260
ccctgtctta ttcttgtagg                          20
<210>261
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>261
gcagttgtag gctgacttcc                          20
<210>262
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>262
gcagttgtag gctgactccc                          20
<210>263
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>263
gcagttgtag gctggcttcc          20
<210>264
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>264
agcgaacaaa cagtagttgt tgcag    25
<210>265
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>265
agcgaacaaa cagtagttgt tgcaa    25
<210>266
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>266
agcgatcaaa cagcagttgt tgcag    25
<210>267
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>267
agcgaacaaa cagtagttgt tgaag                                        25
<210>268
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>268
agcgatcaaa cagtagtt tgcag                                          25
<210>269
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>269
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
tttttagcga acaaacagta gttgttgcag                                   90
<210>270
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>270
tttttttttt ttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt   60
tttttagcga acaaacagta gttgttgcaa                                   90
<210>271
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>271
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
tttttagcga tcaaacagca gttgttgcag                                   90
<210>272
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>272
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
tttttagcga acaaacagta gttgttgaag                                   90
<210>273
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>273
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
tttttagcga tcaaacagta gttgttgcag                                   90
<210>274
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>274
ggcttaggca tctcctatgg cag                                          23
<210>275
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>275
ggcttaggca tttcctatgg cag                                          23
<210>276
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>276
agacagtggc aatgagagtg atgg                      24
<210>277
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>277
agacagtggc aatgagagtg aagg                      24
<210>278
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>278
agacagtggc aatgagagtg acgg                      24
<210>279
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>279
agacagtggc aatgagagtg aggg                      24
<210>280
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>280
ttaccctgtc ttattcttct agg                       23
<210>281
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>281
ttaccctgtc ttattcttgt agg    23
<210>282
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>282
ttaccctgtc ttattcgtgt ggg    23
<210>283
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>283
ttaccctgtc ttattcttac agg    23
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>288
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<213>人工序列
<220>
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>291
taatacgact cactataggg agaagacagt ggcaccacca tggagagtga agg        53
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<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>292
taatacgact cactataggg agaagacagt ggcaccacca tggagagtga cgg        53
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<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>293
taatacgact cactataggg agaagacagt ggcaccacca tggagagtga ggg        53
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>294
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
ttttccttcc agtcccccct tttct                                       85
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<211>85
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>295
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
ttttccatcc agtcccccct tttct                                        85
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<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>296
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
tttttttgac cacttgccac ccat                                         84
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<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>297
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
tttttttgac cacttgcccc ccat                                         84
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<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>298
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
tttttttgac cacttgttac ccat                                         84
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<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>299
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
tttttttgac cacttgcctc ccat  84
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<210>301
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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aagacagcag tacagatggc ag    22
<210>302
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>302
aagacagcag tgcaaatggc ag    22
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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aagacagcag tactaatggc ag    22
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>309
taatacgact cactataggg agaccaccat ggaaaacaga tggcaggta    49
<210>310
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>310
taatacgact cactataggg agaccaccat ggaaaacaga tggcaggcg    49
<210>311
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>311
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<210>312
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<210>322
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>323
ctgtgggtac acaggcttgt gt    22
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>324
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>326
gcacaataat gtatggggat tgg    23
<210>327
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>327
gcacaataat gtatgggaat cgg    23
<210>328
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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gcacaataat gtatgggaat ggg                          23
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<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>330
taatacgact cactataggg agatcctcta tcaaagcagt gag    43
<210>331
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>331
taatacgact cactataggg agatcctcta tcagagcagt aag    43
<210>332
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>332
taatacgact cactataggg agatcctcta ccaaagcagtaag    43
<210>333
<211>86
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
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<211>86
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>334
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
ttttctgtgg gtacacaggc atgcgt                                       86
<210>335
<211>86
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>335
tttttttttt ttttttttt ttttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
ttttctgtgg gtacacaagc atgtgt                                       86
<210>336
<211>86
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>336
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
ttttctgtgg gtacacaggc ttgtgt                                       86
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<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>337
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<210>338
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>338
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<210>339
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>339
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>340
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>341
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>342
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<210>343
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>343
aagggctgtt ggaagtgtgg      20
<210>344
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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<210>346
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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cctagtggga tgtgtacttc cga  23
<210>347
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>347
cctagtggga tgtgtatttc tga    23
<210>348
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>348
cctagtggga tgtgcacttc tga    23
<210>349
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>349
cctagtggga tatgtacttc tga    23
<210>350
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>350
cctagtggga tgtatacacc tga    23
<210>351
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>351
ccaagtattg tagagatcct acc    23
<210>352
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>352
ccaagtattg tagagatctt acc                                   23
<210>353
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>353
ccaagtattg tagagaccct acc                                   23
<210>354
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>354
ccaagtattg tagggatcct acc                                   23
<210>355
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>355
ccaagtattg tagtgtccct acc                                   23
<210>356
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>356
taatacgact cactataggg agaccaccat ggggaaggcc agggaatttc c    51
<210>357
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>357
taatacgact cactataggg agaccaccat ggggaaggcc agggaatttt c    51
<210>358
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>358
taatacgact cactataggg agaccaccat ggggaaggcc aggaaatttc c    51
<210>359
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>359
taatacgact cactataggg agaccaccat ggggaaggcc aggaaatttt c    51
<210>360
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>360
taatacgact cactataggg agaccaccat ggggaaggcc agggaatttc c    51
<210>361
<211>87
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>361
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
ttttcctagt gggatgtgta cttctga                                     87
<210>362
<211>87
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>362
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
ttttcctagt gggatgtgta cttccga                                     87
<210>363
<211>87
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>363
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
ttttcctagt gggatgtgta tttctga                                     87
<210>364
<211>87
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>364
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
ttttcctagt gggatgt gca cttctga                                    87
<210>365
<211>87
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>365
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
ttttcctagt gggatatgta cttctga                                      87
<210>366
<211>87
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>366
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt  60
ttttcctagt gggatgtata cacctga                                      87
<210>367
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<213>人免疫缺陷病毒
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acaagctcct tgtactactt ctataaccct atctgtcccc tcagctactg ctatggctgt 960
ggcattgagc aagctaacag cactattctt tagttcctga ctccaatact gtaggagatt 1020
ccaccaatat ttgagggctt cccaccccct gcgtcccaga agttccacaa tcctcgttac 1080
aatcaagagt aagtctctca agcggtggta gctgaagagg cacaggctcc gcagatcgtc 1140
ccagataagt gccaaggatc cgttcactaa tcgaatggat ctgtctctgt ctctctctcc 1200
accttcttct tctattcctt cgggcctgtc gggtcccctc ggggttggga ggtgggtctg 1260
aaacgataat ggtgaatatc cctgcctaac tctattcact atagaaagta cagcaaaaac 1320
tattcttaaa cctaccaagc ctcctactat cattatgaat aattttatat accacagcca 1380
atttgttatg ttaaaccaat tccacaaact tgcccattta tctaattcca ataattcttg 1440
ttcattcttt tcttgctggt tttgcgattc ttcaattaag gagtgtatta agcttgtgta 1500
attgttaatt tctctgtccc actccatcca ggtcgtgtga ttccaaatct gttccagaga 1560
tttattactc caactagcat tccaaggcac agcagtggtg caaatgagtt ttccagagca 1620
accccaaatc cccaggagct gttgatcctt taggtatctt tccacagcca ggattcttgc 1680
ctggagctgc ttgatgcccc agactgtgag ttgcaacaga tgctgttgcg cctcaatagc 1740
cctcagcaaa ttgttctgct gctgcactat accagacaat aattgtctgg cctgtaccgt 1800
cagcgtcatt gaggctgcgc ccatagtgct tcctgctgct cccaagaacc caaggaacaa 1860
agctcctatt cccactgctc ttttttctct ctgcaccact cttctctttg ccttggtggg 1920
tgctactcct aatggttcaa tttttactac tttatattta tataattcac ttctccaatt 1980
gtccctcata tctcctcctc caggtctgaa gatctcggac tcattgttgc tattaccacc 2040
atctcttgtt aatagcagcc ctgtaatatt tgatgaacat ctaatttgtc cactgatggg 2100
aggggcatac attgcttttc ctactttctg ccacatgttt ataatttgtt ttattctgca 2160
tgggagggtg attgtgtcac ttccttcagt gttatttgac ccttcagtac tccaagtact 2220
attaaaccaa gtactattaa acagttgtgt tgaattacag tagaaaaatt cccctccaca 2280
attaaaactg tgcgttacaa tttctgggtc ccctcctgag gattgcttaa agattattgt 2340
tttattattt ccaaattgtt ctcttaattt gctagctatc tgttttaaag tgttattcca 2400
ttttgctcta ctaatgttac aatgtgcttg tctcatattt cctatttttc ctattgtaac 2460
aaatgctctc cctggtcctc tctggatacg gattcttttt cttgtattgt tgttgggtct 2520
tgtacaatta atttctacag atgtgttcag ctgtactatt atggttttag cattgtccgt 2580
gaaattgaca gatctaatta ctacctcttc ttctgctaga ctgccattta acagcagttg 2640
agttgatact actggcctaa ttccatgtgt acattgtact gtgctgacat ttgtacatgg 2700
tcctgttcca ttgaacgtct tattattaca ttttagaatc gcaaaaccag ccggggcaca 2760
ataatgtatg ggaattggct caaaggatac ctttggacag gcctgtgtaa tgactgaggt 2820
gttacaactt gtcaacttat agctggtagt atcattatct attggtatta tatcaagttt 2880
ataaaaaaat gcatattctt tctgcacctt acctcttatg cttgtgctga tattgaaaga 2940
gcagtttttt atctctcctt tctccattat cattctcccg ctactactat tggtattagt 3000
atcattcttc aaatcagtgc actttaaact aacacagagt ggggttaatt ttacacatgg 3060
ctttaggctt tgatcccata aactgattat atcctcatgc atctgttcta ccatgtcatt 3120
tttccacatg ttaaaatttt ctgtcacatt taccaatact acttcttgtg ggttggggtc 3180
tgtgggtaca caggcatgtg tggcccaaac attatgtacc tctgtatcat atgctttagc 3240
atctgatgca caaaatagag tggtggttgc ttccttccac acaggtaccc cataatagac 3300
tgtgacccac aatttttctg tagcactaca gatcatcaac atcccaagga gcatggtgcc 3360
ccatctccac ccccatctcc acaagtgctg atatttctcc ttcactctca ttgccactgt 3420
cttctgctct ttctattagt ctatcaatta acctgtctat ttttctttgt cttaatattt 3480
tcctatattc tatgattact atggaccaca caactattgc tattattatt gctactacta 3540
atgctactat tgctactatt ggtataggtt gcattacatg tactacttac tgctttgata 3600
gagaagcttg atgagtctga ctgttctgat gagctcttcg tcgctgtctc cgcttcttcc 3660
tgccatagga gatgcctaag gcttttgtta tgaaacaaac ttggcaatga aagcaacact 3720
ttttacaata gcaattggta caagcagttt taggctgact tcctggatgc ttccagggct 3780
ctagtctagg atctactggc tccatttctt gctctcctct gtcgagtaac gcctattctg 3840
ctatgtcgac acccaattct gaaaatggat aaacagcagt tgttgcagaa ttcttattat 3900
ggcttccact cctgcccaag tatccccata agtttcatag atatgttgcc ctaagccatg 3960
gagccaaatc ctaggaaaat gtctaacagc ttcattctta agctcctcta aaagctctag 4020
tgtccattca ttgtgtggct ccctctgtgg cccttggtct tctggggctt gttccatcta 4080
tcctctgtca gtttcgtaac actaggcaaa ggtggcttta tcttttttgg tgttattaat 4140
gctgctagtg ccaagtattg tagagatcct accttgttat gtcctgcttg atattcacac 4200
ctagggctaa ctatgtgtcc taataaggcc tttcttatag cagagtctga aaaacagtca 4260
aagtaataca gatgaattag ttggtctgct agttcagggt ctacttgtgt gctatatctc 4320
tttttcctcc attctatgga gactccctga cccaaatgcc agtctctttc tcctgtatgc 4380
agaccccaat atgttgttat taccaatcta gcatccccta gtgggatgtg tacttctgaa 4440
cttattcttg gatgagggct ttcatagtga tgtctataaa accatcccct agctttccct 4500
gaaacataca tatggtgttt tactaaactt ttccatgttc taatcctcat cctgtctact 4560
tgccacacaa tcatcacctg ccatctgttt tccataatcc ctaatgatct ttgcttttct 4620
tcttggcact acttttatgt cactattatc ttgtattact actgcccctt cacctttcca 4680
gaggagcttt gctggtcctt tccaaagtgg atttctgctg tccctgtaat aaacccgaaa 4740
attttgaatt tttgtaattt gtttttgtaa ttctttagtt tgtatgtctg ttgctattat 4800
gtctactatt ctttcccctg cactgtaccc cccaatcccc ccttttcttt taaaattgtg 4860
gatgaatact gccatttgta ctgctgtctt aagatgttca gcctgatctc ttacctgtcc 4920
tataattttc tttaattctt tattcataga ttctactact ccttgacttt ggggattgta 4980
gggaattcca aattcctgct tgattcccgc ccaccaacag gcggccctaa ccgtagcacc 5040
ggtgaaattg ctgccattgt cagtatgtat tgtttttact ggccatcttc ctgctaattt 5100
taaaagaaaa tatgctgttt cctgccctgt ttctgctgga ataacttctg cttctatata 5160
tccactggct acatgaactg ctaccaggat aacttttcct tctaaatgtg tacaatctag 5220
ttgccatatt cctggactac agtctacttg tccatgcatg gcttctcctt ttagctgaca 5280
tttatcacag ctggctacta tttcttttgc tactacaggt ggcaggttaa aatcactagc 5340
cattgctctc caattactgt gatatttctc atgttcatct tgggccttat ctattccatc 5400
taaaaatagt actttcctga ttccagcact gactaattta tctacttgtt catttcctcc 5460
aattcctttg tgtgctggta cccatgccag atagaccttt tcctttttta ttaactgctc 5520
tattatttga ttgactaact ctgattcact ttgatctggt tgtgcttgaa tgattcctaa 5580
tgcatattgt gagtctgtta ctatgtttac ttctaatccc gaatcctgca aagctagata 5640
aattgcttgt aactcagtct tctgatttgt tgtgtcagtt agggtgacaa ctttttgtct 5700
tcctctatta gtaacatatc ctgcttttcc taatttagtc tccctgttag ctgccccatc 5760
tacatagaag gtttctgctc ctactatggg ttctttctct aactggtacc ataatttcac 5820
taagggaggg gtattaacaa actcccactc aggaatccag gtggcttgcc aatactctgt 5880
ccaccatgtt tcccatgttt ccttttgtat gggcagttta aatttaggag tctttcccca 5940
tattactatg ctttctgtgg ttattttttg cactgcctct gttaattgtt ttacatcatt 6000
agtgtgggca cccctcattc ttgcatattt tcctgttttc agatttttaa atggctcttg 6060
ataaatttga tatgtccatt ggccttgccc ctgcttctgt atttctgcta ttaagtcttt 6120
tgatgggtca taatacactc catgtactgg ttcttttaga atctctctgt tttctgccag 6180
ttctagctct gcttcttctg ttagtggtat tacttctgtt agtgctttgg ttcctctaag 6240
gagtttacat aattgcctta ctttaatccc tgggtaaatc tgacttgccc aattcaattt 6300
ccccactaac ttctgtatgt cattgacagt ccagctgtct ttttctggca gcactatagg 6360
ctgtactgtc catttatcag gatggagttc ataacccatc caaaggaatg gaggttcttt 6420
ctgatgtttt ttgtctggtg tggtaagtcc ccacctcaac agatgttgtc tcagctcctc 6480
tatttttgtt ctatgctgcc ctatttctaa gtcagatcct acatacaaat catccatgta 6540
ttgatagata actatgtctg gattttgttt tctaaaaggc tctaagattt ttgtcatgct 6600
actttggaat attgctggtg atcctttcca tccctgtgga agcacattgt actgatatct 6660
aatccctggt gtctcattgt ttatactagg tatggtaaat gcagtatact tcctgaagtc 6720
ttcatctaag ggaactgaaa aatatgcatc acccacatcc agtactgtta ctgatttttt 6780
cttttttaac cctgcgggat gtggtattcc taattgaact tcccagaagt cttgagttct 6840
cttattaagt tctctgaaat ctactaattt tctccattta gtactgtctt ttttctttat 6900
ggcaaatact ggagtattgt atggattttc aggcccaatt tttgaaattt tcccttcctt 6960
ttccatctct gtacaaattt ctactaatgc ttttattttt tcttctgtca atggccattg 7020
tttaactttt gggccatcca ttcctggctt taattttact ggtacagtct caatagggct 7080
aatgggaaaa tttaaagtgc aaccaatctg agtcaacaga tttcttccaa ttatgttgac 7140
aggtgtaggt cctactaata ctgtacctat agctttatgt ccacagattt ctatgagtat 7200
ctgatcatac tgtcttactt tgataaaacc tccaattccc cctatcattt ttggtttcca 7260
tcttcctggc aaactcattt cttctaatac tgtatcatct gctcctgtat ctaatagagc 7320
ttcctttagt tgccccccta tctttattgt gacgaggggt cgttgccaaa gagtgacctg 7380
agggaagtta aaggatacag ttccttgtct atcggctcct gcttctgagg gggagttgtt 7440
gtctctaccc cagacctgaa gctctcttct ggtggggctg ttggctctgg tctgctctga 7500
agaaaattcc ctggccttcc cttgtaggaa ggccagatct tccctaaaaa attagcctgt 7560
ctctcagtac aatctttcat ttggtgtcct tcctttccac atttccaaca gccctttttc 7620
ctaggggccc tgcaatttct ggctgtgtgc ccttctttgc cacaattgaa acacttaaca 7680
atctttcttt ggttcctaaa attgcctctc tgcatcatta tggtagctga atttgttact 7740
tggctcattg cttcagccaa aactcttgcc ttatggccgg gtcctcctac tccctgacat 7800
gctgtcatca tttcttctag tgtagccgct ggtcccaatg cttttaaaat agtcttacaa 7860
tctgggttcg cattttggac caacaaggtt tctgtcatcc aattttttac ctcctgtgaa 7920
gcttgctcgg ctcttagagt tttatagaac cggtctacat agtctctaaa gggttccttt 7980
ggtccttgtc ttatgtccag aatgctggta gggctataca ttcttactat tttatttaat 8040
cccaggatta tccatctttt ataaatttct cctactggga taggtggatt atttgtcatc 8100
catcctattt gttcctgaag ggtactagta gttcctgcta tgtcacttcc ccttggttct 8160
ctcatctggc ctggtgcaat aggccctgca tgcactggat gcactctatc ccattctgca 8220
gcttcctcat tgatggtctc ttttaacatt tgcatggctg cttgatgtcc ccccactgtg 8280
tttagcatgg tgtttaaatc ttgtggggtg gctccttctg ataatgctga aaacatgggt 8340
atcacttctg ggctgaaagc cttctcttct actactttta cccatgcatt taaagttcta 8400
ggtgatatgg cctgatgtac catttgcccc tggatgttct gcactatagg gtaattttgg 8460
ctgacctgat tgctgtgtcc tgtgtcagct gctgcttgct gtgctttttt cttacttttg 8520
ttttgctctt cctctatctt gtctaaagct tccttggtgt cttttatctc tatcctttga 8580
tgcacacaat agagggttgc tactgtatta tataatgatc taagttcttc tgatcctgtc 8640
tgaagggatg gttgtagctg tcccagtatt tgtctacagc cttctgatgt ttctaacagg 8700
ccaggattaa ctgcgaatcg ttctagctcc ctgcttgccc atactatatg ttttaattta 8760
tattttttct ttccccctgg ccttaaccga attttttccc atcgatctaa ttctcccccg 8820
cttaatactg acgctctcgc acccatctct ctccttctag cctccgctag tcaaaatttt 8880
tggcgtactc accagtcgcc gcccctcgcc tcttgccgtg cgcgcttcag caagccgagt 8940
cctgcgtcga gagagctcct ctggtttccc tttcgctttc aggtccctgt tcgggcgcca 9000
ctgctagaga ttttccacac tgactaaaag ggtctgaggg atctctagtt accagagtca 9060
cacaacagac gggcacacac tacttgaagc actcaaggca agctttattg aggcttaagc 9120
agtgggttcc ctagttagcc agagagctcc caggctcaga tctggtctaa ccagagagac 9180
ccct                                                               9184
<210>390
<211>87
<212>DNA
<213>人免疫缺陷病毒
<400>390
aaaataggag gacaactgaa agaagctcta ttagatacag gagcagatga tacagtatta  60
gaagatataa atttgccagg gaaatgg                                      87
<210>391
<211>87
<212>DNA
<213>人免疫缺陷病毒
<400>391
aaagtaggag gacagctaaa agaagctcta ttagacacag gagcagatga tacagtatta  60
gaagacataa atttgccagg aaaatgg                                      87
<210>392
<211>87
<212>DNA
<213>人免疫缺陷病毒
<400>392
aagatagggg ggcaactaaa ggaagctcta ttagatacag gagcagatga tacagtatta  60
gaagaaatga gtttgccagg aagatgg                                      87
<210>393
<211>185
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>共有序列
<400>393
tycttcagag cagaccagag ccaacagccc caccatttct tcagagcaga ccagagccaa  60
cagccccacc agaagagagc ttcaggtctg gggtagagac aacaactccc cctcagaagc  120
aggagccgat agacaaggar mtgtatcctt trrcttccct cagatcactc tttggcaacg  180
acccc                                                              185
<210>394
<211>185
<212>DNA
<213>人免疫缺陷病毒
<400>394
ttcttcagag cagaccagag ccaacagccc caccatttct tcagagcaga ccagagccaa  60
cagccccacc agaagagagc ttcaggtctg gggtagagac aacaactccc cctcagaagc  120
aggagccgat agacaaggag atgtatcctt tggcttccct cagatcactc tttggcaacg  180
acccc                                                              185
<210>395
<211>185
<212>DNA
<213>人免疫缺陷病毒
<400>395
ttcttcagag cagaccagag ccaacagccc caccatttct tcagagcaga ccagagccaa  60
cagccccacc agaagagagc ttcaggtctg gggtagagac aacaactccc cctcagaagc  120
aggagccgat agacaaggaa ctgtatcctt taacttccct cagatcactc tttggcaacg  180
acccc                                                              185
<210>396
<211>149
<212>DNA
<213>人免疫缺陷病毒
<400>396
tccttcagag cagaccagag ccaacagccc caccagcaga gagcttcagg tttggggaag  60
aggtaacaac tccctctcag aaacaggagc cgatagacaa ggagatgtat cctttggctt  120
ccctcagatc actctttggc aacgacccc                                    149
<210>397
<211>149
<212>DNA
<213>人免疫缺陷病毒
<400>397
tccttcagag cagaccagag ccaacagccc caccagaaga gagcttcagg tctggggtag  60
agacaacaac tccccctcag aagcaggagc cgatagacaa ggaactgtat cctttaactt  120
ccctcagatc actctttggc aacgacccc                                    149
<210>398
<211>100
<212>DNA
<213>人免疫缺陷病毒
<400>398
ttagataaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa agacacagca agcagcagct  60
gacacaggaa acagcagcaa gcaggtcagc caaaattacc                        100
<210>399
<211>100
<212>DNA
<213>人免疫缺陷病毒
<400>399
atggacccac ctcccaaccc cgagggaacc cgacaggccc gaaggaatcg aagaagaagg  60
tggagagaga gacagagaca catccggaag attagtggat                        100
<210>400
<211>180
<212>DNA
<213>人免疫缺陷病毒
<400>400
gagcttttag aggagcttaa gaatgaagct gttagacatt ttcccaggcc atggcttcat  60
ggattggggc agcatatcta tgaaacttat ggggatactt ggacaggagt ggaagccata  120
ataagaattc tgcaacaact gctgtttatc catttcagaa ttgggtgtcg acatagcaga  180
<210>401
<211>96
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>401
Met Glu Gln Ala Pro Glu Asp Gln Gly Pro Gln Arg Glu Pro His Asn
1        5           10          15
Glu Trp Thr Leu Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Asn Glu Ala Val Arg
      20            25          30
His Phe Pro Arg Ile Trp Leu His Gly Leu Gly Gln His Ile Tyr Glu
     35           40           45
Thr Tyr Gly Asp Thr Trp Ala Gly Val Glu Ala Ile Ile Arg Ile Leu
  50          55            60
Gln Gln Leu Leu Phe Ile His Phe Arg Ile Gly Cys Arg His Ser Arg
65          70            75            80
Ile Gly Val Thr Arg Gln Arg Arg Ala Arg Asn Gly Ala Ser Arg Ser
          85          90          95
<210>402
<211>40
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>402
Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Asn Glu Ala Val Arg His Phe Pro Arg
1        5           10          15
Pro Trp Leu His Gly Leu Gly Gln His Ile Tyr Glu Thr Tyr Gly Asp
       20           25          30
Thr Trp Thr Gly Val Glu Ala Ile
     35          40
<210>403
<211>21
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>403
Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His
1         5           10           15
Ile Val Trp Ala Ser
        20
<210>404
<211>21
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>404
Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Arg Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His
1         5           10          15
Ile Val Trp Ala Ser
        20
<210>405
<211>18
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>405
Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu
1         5           10          15
Tyr Cys
<210>406
<211>18
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>406
Thr Gly Ser Glu Glu Phe Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu
1        5            10          15
Tyr Cys
<210>407
<211>1816
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>407
cttctctgcc agaagatacc atttcaactt taacacagca tgatcgaaac atacaaccaa  60
acttctcccc gatctgcggc cactggactg cccatcagca tgaaaatttt tatgtattta  120
cttactgttt ttcttatcac ccagatgatt gggtcagcac tttttgctgt gtatcttcat  180
agaaggttgg acaagataga agatgaaagg aatcttcatg aagattttgt attcatgaaa  240
acgatacaga gatgcaacac aggagaaaga tccttatcct tactgaactg tgaggagatt  300
aaaagccagt ttgaaggctt tgtgaaggat ataatgttaa acaaagagga gacgaagaaa  360
gaaaacagct ttgaaatgca aaaaggtgat cagaatcctc aaattgcggc acatgtcata  420
agtgaggcca gcagtaaaac aacatctgtg ttacagtggg ctgaaaaagg atactacacc  480
atgagcaaca acttggtaac cctggaaaat gggaaacagc tgaccgttaa aagacaagga  540
ctctattata tctatgccca agtcaccttc tgttccaatc gggaagcttc gagtcaagct  600
ccatttatag ccagcctctg cctaaagtcc cccggtagat tcgagagaat cttactcaga  660
gctgcaaata cccacagttc cgccaaacct tgcgggcaac aatccattca cttgggagga  720
gtatttgaat tgcaaccagg tgcttcggtg tttgtcaatg tgactgatcc aagccaagtg  780
agccatggca ctggcttcac gtcctttggc ttactcaaac tctgaacagt gtcaccttgc  840
aggctgtggt ggagctgacg ctgggagtct tcataataca gcacagcggt taagcccacc  900
ccctgttaac tgcctattta taaccctagg atcctcctta tggagaacta tttattatac  960
actccaaggc atgtagaact gtaataagtg aattacaggt cacatgaaac caaaacgggc  1020
cctgctccat aagagcttat atatctgaag cagcaacccc actgatgcag acatccagag  1080
agtcctatga aaagacaagg ccattatgca caggttgaat tctgagtaaa cagcagataa  1140
cttgccaagt tcagttttgt ttctttgcgt gcagtgtctt tccatggata atgcatttga  1200
tttatcagtg aagatgcaga agggaaatgg ggagcctcag ctcacattca gttatggttg 1260
actctgggtt cctatggcct tgttggaggg ggccaggctc tagaacgtct aacacagtgg 1320
agaaccgaaa cccccccccc cccccccgcc accctctcgg acagttattc attctctttc 1380
aatctctctc tctccatctc tctctttcag tctctctctc tcaacctctt tcttccaatc 1440
tctctttctc aatctctctg tttccctttg tcagtctctt ccctccccca gtctctcttc 1500
tcaatccccc tttctaacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 1560
acacacacac acacacacac agagtcaggc cgttgctagt cagttctctt ctttccaccc 1620
tgtccctatc tctaccacta tagatgaggg tgaggagtag ggagtgcagc cctgagcctg 1680
cccactcctc attacgaaat gactgtattt aaaggaaatc tattgtatct acctgcagtc 1740
tccattgttt ccagagtgaa cttgtaatta tcttgttatt tattttttga ataataaaga 1800
cctcttaaca ttaaaa                                                 1816
<210>408
<211>261
<212>PRT
<213>人
<400>408
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1         5           10           15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
      20            25           30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
     35            40           45
Arg Leu Asp Lys lle Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
 50           55            60
Phe Met Lys Thr lle Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65          70           75           80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
         85          90           95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu
        100         105          110
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
    115          120          125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
  130           135         140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145          150          155           160
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
         165          170           175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
      180           185          190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
    195          200          205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser lle His
  210           215           220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
225         230          235           240
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe ThrSer Phe
         245          250           255
Gly Leu Leu Lys Leu
       260

Claims (23)

1.分离的成熟树突细胞，其包含编码CD40L和一种或多种多肽的不同等位基因的体外转录的mRNA，所述多肽来自个体受试者中存在的HIV的多种毒株，其中所述mRNA较完整HIV基因组表现得要少。
2.权利要求1的成熟树突细胞，其中所述mRNA得自对HIV多核苷酸的核酸扩增。
3.权利要求2的成熟树突细胞，其中使用设计用来弥补HIV的多种毒株之间的序列变异性的引物，来扩增所述HIV多核苷酸。
4.权利要求1的成熟树突细胞，其中所述多肽包含由：gag多肽、rev多肽、vpr多肽、env多肽、nef多肽、vpu多肽、vif多肽、pol多肽组成的组中的两种或多种。
5.权利要求1的成熟树突细胞，其中所述成熟树突细胞来自或者得自所述受试者。
6.分离的成熟树突细胞，其包含个体受试者中存在的HIV的多种毒株的HIV多肽，其中所述多肽表现的比全部HIV多肽少。
7.权利要求6的成熟树突细胞，其中所述成熟树突细胞来自或得自所述受试者。
8.权利要求6的成熟树突细胞，其中所述HIV多肽包含由：gag多肽、rev多肽、vpr多肽、env多肽、nef多肽、vpu多肽、vif多肽、pol多肽组成的组的两种或多种。
9.包含权利要求1的成熟树突细胞和可药用载体的疫苗。
10.包含权利要求6的成熟树突细胞和可药用载体的疫苗。
11.权利要求9的疫苗在制备用于治疗HIV感染的患者的药物中的用途。
12.权利要求10的疫苗在制备用于治疗HIV感染的患者的药物中的用途。
13.制备自体疫苗的方法，其包括：将来自或者得自HIV感染的个体的树突细胞用编码CD40L和来自所述个体中存在的HIV的多种毒株的一种多种HIV多肽的mRNA转染，其中所述mRNA表现的比完整HIV基因组少。
14.权利要求13的方法，其中通过使用多种引物对进行HIV多核苷酸的核酸扩增，得到所述核酸，所述引物对是设计用于弥补HIV的多种毒株之间的变异性的引物对。
15.权利要求14的方法，其中通过如下步骤选择所述引物：
a.选择用于正向引物退火的第一个区和用于反向引物退火的第二个区，其中所述第一个和第二个区在HIV的可读框和/或表位的侧翼；和
b.选择所述第一个和第二个区的候选正向和反向引物，其中所述引物的至少一个设计成弥补HIV的多种变体之间的序列变异性。
16.核酸疫苗，其包含编码下述一种或多种多肽的不同等位基因的核酸，所述多肽来自受试者中存在的HIV的多种毒株，其中所述核酸表现的比完整HIV基因组少。
17.权利要求16的核酸疫苗，其中所述核酸是RNA。
18.权利要求16的核酸疫苗，其中所述核酸是DNA。
19.权利要求16的核酸疫苗，其还包含编码CD40L的核酸。
20.权利要求16的核酸疫苗，其中使用多种引物对进行HIV多核苷酸的核酸扩增得到所述核酸，所述引物对是设计用来弥补HIV的多种毒株之间的变异性的引物对。
21.权利要求16的核酸疫苗，其中所述多肽包含由：gag多肽、rev多肽、vpr多肽、env多肽、nef多肽、vpu多肽、vif多肽、pol多肽组成的HIV多肽组的两种或多种。
22.权利要求20的核酸疫苗，其中通过如下步骤选择所述引物：
a.选择用于正向引物退火的第一个区和用于反向引物退火的第二个区，其中所述第一个和第二个区在HIV的可读框和/或表位的侧翼；和
b.选择所述第一个和第二个区的候选正向和反向引物，其中所述引物的至少一个设计成弥补HIV的多种变体之间的序列变异性。
23.权利要求16的核酸疫苗在制备用于治疗HIV感染的药物中的用途。
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