CN113712984B - 一种基于pnpt1的小分子抑制剂组合在制备抗病毒药物中的应用 - Google Patents
一种基于pnpt1的小分子抑制剂组合在制备抗病毒药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于PNPT1的小分子抑制剂组合在制备抗病毒药物中的应用。一种抗病毒药物组合物，以五没食子酰葡萄糖和毛花甙丙为有效成分。五没食子酰葡萄糖及毛花甙丙单独或联合使用均可显著抑制DNA及RNA病毒的复制能力，具有极重要的临床应用潜力和价值。
Description
技术领域
本发明属于化合物新用途领域，涉及一种基于PNPT1的小分子抑制剂组合在制备抗病毒药物中的应用。
背景技术
病毒通常由核酸及蛋白质外壳构成，部分病毒还具有囊膜结构。根据不同病毒所含核酸的种类、转录和合成蛋白质的方式的不同进一步分为DNA病毒和RNA病毒以及逆转录病毒。病毒为颗粒状的非细胞结构，通常以纳米为单位，需寄生生活。病毒侵入宿主细胞后，借助宿主细胞提供各种生物原料如：核苷酸、氨基酸、核糖体及能源系统等，以病毒核酸为控制中心，合成子代病毒所需核酸与蛋白质等成分，最后在宿主细胞内装配成结构完整、具有一定侵染力的病毒粒子，这个过程即为病毒的复制。无论是DNA病毒还是RNA病毒，在核酸复制及转录过程中均会不可避免地产生大量地双链RNA(dsRNA)。当病毒感染时，dsRNA激活PKR介导的整合应激反应，抑制细胞内蛋白质的合成，促使细胞凋亡，进而遏制病毒复制。
PNPT1是一种高度保守的多核苷酸磷酸化酶，具有从3’端到5’端降解RNA的核糖核酸外切酶活性。PNPT1在包括人在内的高等哺乳动物的几乎所有的组织和器官中都有表达，其在细胞内主要存在于线粒体内，其主要功能是降解双链RNA，阻止双链RNA被释放到细胞质中激活PKR等模式识别受体，避免激活天然免疫反应，阻止细胞凋亡。
综上所述，开发基于抑制PNPT1酶活性的小分子抑制剂可以通过促进机体的天然免疫反应，发挥广谱的抗病毒作用。与疫苗相比，小分子药物生产迅速、产能大且性质稳定，储存及运输方便，且给药途径多样。本发明首先基于VirtualFlow药物虚拟筛选平台筛选出一系列针对PNPT1的小分子抑制剂，随后通过特异检测dsRNA的抗体进一步筛选出能够抑制dsRNA降解的小分子抑制剂进行后续抗病毒实验研究。
五没食子酰葡萄糖(Pentagalloyl glucose,PGG)是一种天然产物，广泛存在于天然药物和食用植物，如诃子、五倍子、白芍、石榴等中。自古以来其被广泛用于治疗蚊虫叮咬、糖尿病、慢性腹泻、中毒和抗HSV病毒和狂犬病毒感染等疾病，其毒理及副作用较为明确，用于临床安全性较高。然而，其抗病毒活性的潜在机制仍未明确。目前也尚未公开其能够抑制腺病毒、冠状病毒。
毛花甙丙(Lanatoside C,Lanc)是强心苷的一种，作为强心药已在临床长期应用，其安全性，药物代谢特性，毒副作用已经明确。目前也尚未见关于毛花甙丙具有抗病毒活性的报道。
发明内容
本发明目的在于提供五没食子酰葡萄糖及毛花甙丙在制备抗病毒药物中的应用。
本发明的另一目的是提供一种抗病毒药物组合物。
本发明的又一目的是提供毛花甙丙在制备抗病毒药物中的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
五没食子酰葡萄糖及毛花甙丙在制备抗病毒药物中的应用。
两种药物联合使用后，10μM五没食子酰葡萄糖及0.05μM毛花甙丙显著抑制病毒的复制能力。
作为本发明的一种优选，所述的病毒选自腺病毒、冠状病毒或新冠状病毒中的任意一种或多种。
一种抗病毒药物组合物，以五没食子酰葡萄糖和毛花甙丙为有效成分。
作为本发明的一种优选，所述的抗病毒药物组合物还包含药学上允许的辅料。
作为本发明的一种优选，所述的抗病毒药物组合物被制备成药学上允许的任意剂型。
作为本发明的一种优选，所述的剂型为片剂、胶囊、注射剂。
毛花甙丙在制备抗病毒药物中的应用。
毛花甙丙作为抗病毒的小分子PNPT1抑制剂，，该抑制剂在0.05-1μM的浓度下可以显著抑制病毒的复制，所述抑制剂毛花甙丙结构式如下：
作为本发明的一种优选，所述的病毒选自腺病毒、冠状病毒或新冠状病毒中的任意一种或多种。
五没食子酰葡萄糖在制备抗腺病毒、冠状病毒或新冠状病毒的药物中的应用。
五没食子酰葡萄糖作为抗病毒的小分子PNPT1抑制剂，在10-100μM的浓度下可以显著抑制病毒的复制，所述五没食子酰葡萄糖结构式如下：
本发明的有益效果：
本发明以小分子药物库为基础，筛选针对PNPT1的小分子抑制剂进行抗病毒应用，筛选出两个PNPT1小分子抑制剂五没食子酰葡萄糖及毛花甙丙，这两种药物单独使用和联合使用均可显著抑制病毒复制能力，且具有广谱的抗病毒作用，具有极重要的临床应用潜力和价值。本发明中发现五没食子酰葡萄糖及毛花甙丙可以通过抑制PNPT1活性激活机体自身免疫反应发挥广谱抗病毒作用，这为病毒新发传染病的防控提供了强有力的技术支撑。通过联合使用这2种PNPT1小分子抑制剂，可以显著降低单独使用抑制剂的药物浓度，使临床用药更加安全。
附图说明
图1本发明的PNPT1小分子抑制剂组合的筛选主要流程。
图2显示五没食子酰葡萄糖及毛花甙丙抗腺病毒感染。
图3显示五没食子酰葡萄糖及毛花甙丙抗小鼠冠状病毒感染。
图4显示五没食子酰葡萄糖及毛花甙丙抗新型冠状假病毒感染。
具体实施方式
本发明首先从PDB蛋白质结构数据库(Protein Data Bank,PDB)下载PNPT1蛋白质结构(PDB NO.3U1K)，利用VirtualFlow药物虚拟筛选平台分析ChemBridge、Enamine和PubChem等化合物数据中可以结合PNPT1蛋白RNase PH结构域或者三聚体形成关键结合位点的小分子化合物。随后将筛选后的小分子抑制剂作用于肺腺癌细胞系A549上24h后，使用能够特异识别dsRNA结构的J2抗体进行免疫荧光染色，进一步筛选能抑制dsRNA降解的小分子抑制剂进行后续的抗病毒研究(图1)。
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1五没食子酰葡萄糖及毛花甙丙抗腺病毒感染实例。
腺病毒病毒粒外形呈立体对称的二十面体，直径70～90纳米，无包膜，外层由252个壳粒组成衣壳，其中240个壳粒是六邻体，另12个壳粒称五邻体，位于病毒粒的12个顶端。腺病毒基因组为线型dsDNA(双链DNA)，与内部蛋白结合构成核心。本研究通过构建包含腺病毒基因组序列的pAd-5/eGFP质粒(Stratagene，US)，将其转染至293T细胞后收集并纯化病毒(汉恒生物科技(上海)有限公司)。
实验具体步骤为：
(1)病毒感染并给药处理：使用腺病毒以MOI＝0.1感染人肺腺癌细胞系A549，3h后去掉含病毒的培养基，PBS清洗2遍，分别加入含不同浓度五没食子酰葡萄糖(0，10，25，50，100μM)或含不同浓度毛花甙丙(0，0.05，0.1，0.25，0.5，1μM)的培养基，继续培养24h；
(2)收取细胞并提取DNA：PBS清洗2遍后，加入2μl含蛋白酶K的DNA裂解液后混匀，置于55℃孵育2小时；短暂离心后加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，简短离心后加入吸附柱CB3中，12,000rpm离心30秒；随后使用GD及漂洗液PW除去蛋白质等杂质；最终滴加50μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm离心2分钟，获得DNA溶液。
(3)定量PCR方法检测病毒基因组表达：使用病毒基因组特异性引物(表1)，对细胞中病毒基因组进行定量PCR检测。
表1引物序列
| 引物名称 | F | R |
| 腺病毒引物 | TGAAAATGGAGGGCAAGGCA | GTTATCACCATTGCCTGCGG |
数据分析与处理：具体实验结果见图2。根据图中的结果，五没食子酰葡萄糖在10μM时可以显著抑制腺病毒的复制能力，且对细胞的活力没有显著影响；毛花甙丙在0.05μM时可以显著抑制腺病毒的复制能力，且对细胞的活力没有显著影响；随着药物浓度的升高，抑制病毒复制的能力也随之增加；当联合使用10μM五没食子酰葡萄糖和0.05μM的毛花甙丙时，抑制腺病毒复制能力显著强于单独使用单一药物，且对细胞活力没有明显影响。
实施例2五没食子酰葡萄糖及毛花甙丙抗小鼠冠状病毒感染实例。
小鼠肝炎冠状病毒(MHV-A59)属冠状病毒科冠状病毒属，为单股RNA病毒。MHV-A59作为乙型冠状病毒属的原型种，是冠状病毒分子机制和致病性研究的理想模型。本研究通过构建包含MHV-A59病毒基因组序列的pMH54-MHV-A59质粒(Stratagene，US)，将其转染至L2细胞后收集并纯化病毒(汉恒生物科技(上海)有限公司)。
实验具体步骤为：
(1)病毒感染并给药处理：使用小鼠肝炎冠状病毒以MOI＝0.1感染小鼠神经细胞系Nero-2A，3h后去掉含病毒的培养基，PBS清洗2遍，分别加入含不同浓度五没食子酰葡萄糖(0，10，25，50，100μM)或含不同浓度毛花甙丙(0，0.05，0.1，0.25，0.5，1μM)的培养基，继续培养24h；
(2)收取细胞并提取RNA：PBS清洗2遍后，加入1ml的QIAzol lysis Reagent，混匀；室温放置5min，然后每份加入200ul氯仿，剧烈震荡15s，室温2-3min，12,000g,4℃,离心15min；将水相转移到新的2ml的离心管，再加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀，过RNA吸附柱，并用RTW缓冲液和PRE缓冲液洗涤除去蛋白质等杂质；每份用30ul DEPC水将吸附柱上的RNA洗脱下来；通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4.5ul样品RNA溶液、2μl 5×AMV buffer、1μl 10mM each dNTP mixture(Takara公司)、0.5μl RNase Inhibitor(Takara公司)、1μl AMV(Takara公司)以及1μl随机引物(Takara公司)。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟。
(3)定量PCR方法检测病毒基因组表达：使用病毒基因组特异性引物(表2)，对细胞中病毒基因组进行定量PCR检测。
表2引物序列
| 引物名称 | F | R |
| 小鼠冠状病毒引物 | CAGATCCTTGATGATGGCGTAGT | AGAGTGTCCTATCCCGACTTTCTC |
数据分析与处理：具体实验结果见图3。根据图中的结果，五没食子酰葡萄糖在10μM时可以显著抑制小鼠肝炎冠状病毒的复制能力，且对细胞的活力没有显著影响；毛花甙丙在0.05μM时可以显著抑制小鼠肝炎冠状病毒的复制能力，且对细胞的活力没有显著影响；随着药物浓度的升高，抑制病毒复制的能力也随之增加；当联合使用10μM五没食子酰葡萄糖和0.05μM的毛花甙丙时，抑制小鼠肝炎冠状病毒复制能力显著强于单独使用单一药物，且对细胞活力没有明显影响。
实施例3五没食子酰葡萄糖及毛花甙丙抑制新型冠状病毒S蛋白复制实例。
新型冠状病毒(COVID-19)是一种包膜病毒，由刺突(S)蛋白、膜(M)蛋白、包膜(E)蛋白和核衣壳(N)蛋白四种结构蛋白组成。其中S蛋白负责病毒附着并进入目标细胞，从而启动感染过程。在SARS-CoV感染过程中，S蛋白在诱导保护性体液免疫和细胞免疫中起关键作用。因此，S蛋白被认为是新型冠状病毒治疗中最为有效的治疗靶点。本研究通过构建包含COVID-19S蛋白基因组序列的pFV-CoV-S质粒，将其转染至293T细胞后收集并纯化病毒(北京擎科生物科技有限公司)。
实验具体步骤为：
(4)病毒感染并给药处理：使用新型冠状假病毒以MOI＝0.1感染人肺腺癌细胞系A549，3h后去掉含病毒的培养基，PBS清洗2遍，分别加入含不同浓度五没食子酰葡萄糖(0，10，25，50，100μM)或含不同浓度毛花甙丙(0，0.05，0.1，0.25，0.5，1μM)的培养基，继续培养24h；
(5)收取细胞并提取RNA：PBS清洗2遍后，加入1ml的QIAzol lysis Reagent，混匀；室温放置5min，然后每份加入200ul氯仿，剧烈震荡15s，室温2-3min，12,000g,4℃,离心15min；将水相转移到新的2ml的离心管，再加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀，过RNA吸附柱，并用RTW缓冲液和PRE缓冲液洗涤除去蛋白质等杂质；每份用30ul DEPC水将吸附柱上的RNA洗脱下来；通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4.5ul样品RNA溶液、2μl 5×AMV buffer、1μl 10mM eachdNTP mixture(Takara公司)、0.5μl RNase Inhibitor(Takara公司)、1μl AMV(Takara公司)以及1μl随机引物(Takara公司)。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟。
(6)定量PCR方法检测病毒基因组表达：使用病毒基因组特异性引物(表3)，对细胞中病毒基因组进行定量PCR检测。
表3引物序列
| 引物名称 | F | R |
| 人冠状病毒引物 | GATGCTGTCCGTGATCCACA | CCCGCCGAGGAGAATTAGTC |
数据分析与处理：具体实验结果见图4。根据图中的结果，五没食子酰葡萄糖在10μM时可以显著抑制新型冠状病毒S蛋白的复制能力，且对细胞的活力没有显著影响；毛花甙丙在0.05μM时可以显著抑制新型冠状病毒S蛋白的复制能力，且对细胞的活力没有显著影响；随着药物浓度的升高，抑制病毒S蛋白复制的能力也随之增加；当联合使用10μM五没食子酰葡萄糖和0.05μM的毛花甙丙时，抑制新型冠状病毒S蛋白复制能力显著强于单独使用单一药物，且对细胞活力没有明显影响。
Claims (2)
1.五没食子酰葡萄糖和毛花甙丙按照10：0.05的摩尔比的组合在制备抗腺病毒药物中的应用。
2.五没食子酰葡萄糖及毛花甙丙按照10：0.05的摩尔比的组合在制备抗病毒药物中的应用，所述的病毒选自小鼠肝炎冠状病毒或新型冠状病毒。
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