CN112516132B - 丹酚酸c或其药物可接受盐在制备抗病毒的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丹酚酸C或其药物可接受盐在制备抗病毒的药物中的应用。本发明首次提出丹酚酸C或其药物可接受盐在制备抗病毒的药物中的应用，提供存在慢性基础疾病的新冠感染者新的治疗手段，该应用扩大了丹酚酸C的使用范围，且为病毒抑制，特别是在全球新冠流行的情况下，为抑制SARS‑CoV‑2提供新的药物。

Description

丹酚酸C或其药物可接受盐在制备抗病毒的药物中的应用

技术领域

本发明属于药学技术领域，具体涉及一种丹酚酸C或其药物可接受盐在制备抗病毒的药物中的应用。

背景技术

近日，由SARS-CoV-2入侵引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)在全球暴发，因其极强传播率和超长潜伏期成为全球首要公共卫生威胁。SARS-CoV-2是一种单链RNA正链包膜β冠状病毒，目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，基因组全长约26～32kb。SARS-CoV-2进入宿主细胞由跨膜刺突S糖蛋白(Spike protein，S)介导，其中S蛋白形成从病毒表面突出的同型三聚体。S蛋白包含两个功能性亚基S1和S2，其中S1负责与宿主细胞受体结合，S2亚基负责病毒膜和细胞膜融合。

目前认为S2蛋白至少具有三种构象：融合前的天然构象，发夹前的中间构象和融合后的发夹构象，通过这些不同的构象驱动病毒与靶细胞的融合。因此，S蛋白抑制剂可以阻止病毒进入宿主细胞，S2亚基介导的多肽融合可作为抗病毒药物筛选的靶点。目前针对该靶点的化合物较少，且无批准上市药物，未曾报道天然产物来源的靶向SARS-CoV-2S蛋白的有效进入抑制剂。

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)，为唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物，其根和根茎皆可入药，依据已分离化合物的特征和理化性质，将其分为两类：脂溶性丹参酮类化合物与水溶性酚酸类化合物。丹参水溶性酚酸类成分主要表现为抗氧化作用，丹酚酸C在丹参中的含量较低，其药理作用研究较少。丹酚酸C(Salvianolic acid C)在抗氧化、抗肝损伤、抗肿瘤及抗血栓等方面有较强药理作用。2016年王跃飞等在专利CN106596432A中公开丹酚酸C的自由基清除活性；2017年杜冠华等在CN109985033A中公开丹酚酸C在制备抗脑卒中药物中的应用；2019年范骁辉等在专利CN110101693A中公开丹酚酸C在制备保护缺血脑组织损伤药物中的应用；2019年唐红进等在专利CN109820889A公开丹酚酸C在制备蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂及预防和/或治疗2型糖尿病药物中的应用，尚无其在预防或者治疗新型冠状病毒方面的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的抗病毒的药物。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：

本发明一方面提供了一种丹酚酸C或其药物可接受盐在制备抗病毒的药物中的应用，所述丹酚酸C分子式为C₂₆H₂₀O₁₀，分子量为492.43，结构式为

本发明另一方面提供了一种丹酚酸C或其药物可接受盐在制备抑制病毒进入靶细胞的药物中的应用，所述丹酚酸C分子式为C₂₆H₂₀O₁₀，分子量为492.43，结构式为

进一步地，所述病毒为冠状病毒。

进一步地，所述病毒为SARS-CoV-2。

本发明再一方面提供了一种抗病毒的药物组合物，其含有作为活性物质的丹酚酸C或其药物可接受盐，所述丹酚酸C分子式为C₂₆H₂₀O₁₀，分子量为492.43，结构式为

本发明再一方面提供了一种抑制病毒进入靶细胞的药物组合物，其含有作为活性物质的丹酚酸C或其药物可接受盐，所述丹酚酸C分子式为C₂₆H₂₀O₁₀，分子量为492.43，结构式为

进一步地，所述病毒为冠状病毒。

进一步地，所述病毒为SARS-CoV-2。

进一步地，所述药物组合物为注射制剂或口服制剂。

进一步地，所述药物组合物为成方制剂注射剂、成方制剂片剂、成方制剂胶囊剂、成方制剂丸剂或成方制剂滴丸剂。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次提出丹酚酸C或其药物可接受盐在制备抗病毒的药物中的应用，提供存在慢性基础疾病的新冠感染者新的治疗手段，该应用扩大了丹酚酸C的使用范围，且为病毒抑制，特别是在全球新冠流行的情况下，为抑制SARS-CoV-2提供新的药物。

本发明丹酚酸C作为抗病毒药物，实验表明丹酚酸C在体外培养细胞Vero-E6上抑制SARS-CoV-2活性的半数有效浓度EC₅₀为3.41μM；丹酚酸C用于抑制SARS-CoV-2的进入阶段，可抑制SARS-CoV-2S蛋白假病毒感染过表达293T/ACE2细胞，其半数有效抑制浓度IC₅₀为5.90μM；丹酚酸C在有效浓度范围内无明显细胞毒性。因此可用作制备抗SARS-CoV-2药物。

附图说明

图1为本发明实施例1中丹酚酸C(Sal-C)在不同浓度时抑制SARS-CoV-2的抑制率曲线图，其中横坐标代表丹酚酸C浓度，纵坐标代表以溶剂组为对照，丹酚酸C对SARS-CoV-2的抑制率，并根据抑制率计算求出丹酚酸C抑制SARS-CoV-2的半数有效浓度EC₅₀值。

图2为本发明实施例2中丹酚酸C(Sal-C)在不同浓度时抑制SARS-CoV-2S蛋白假病毒进入靶细胞的抑制率曲线图，其中横坐标代表丹酚酸C浓度，纵坐标代表以溶剂组为对照，丹酚酸C抑制SARS-CoV-2S蛋白假病毒进入的抑制率，并求得丹酚酸C抑制SARS-CoV-2S蛋白假病毒进入的半数抑制浓度IC50值。

图3为本发明实施例3中丹酚酸C(Sal-C)对靶细胞Vero-E6细胞的存活率曲线图，其中横坐标代表丹酚酸C浓度，纵坐标代表以溶剂组为对照、Vero-E6细胞在给予不同浓度丹酚酸C后的细胞存活百分比。

图4为本发明实施例3中丹酚酸C(Sal-C)对靶细胞293T/ACE2细胞的存活率曲线图，其中横坐标代表丹酚酸C浓度，纵坐标代表以溶剂组为对照、293T/ACE2细胞在给予不同浓度丹酚酸C后的细胞存活百分比。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合附图和具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。

除非另有定义，本文所使用所有技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明说明书中所使用的术语是描述具体的实施例的目的，不限制于本发明。以下实施例主要通过构建SARS-CoV-2活毒与SARS-CoV-2S假病毒体外细胞感染模型，来评价丹酚酸C抗SARS-CoV-2的活性，并确证丹酚酸C具有抗SARS-CoV-2感染的能力，同时具有抑制SARS-CoV-2进入靶细胞的作用，提供一种丹酚酸C在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。

本发明采用的Vero-E6、293T细胞购自美国ATCC，稳定过表达人源SARS-CoV-2受体蛋白ACE2的293T细胞由本单位构建保存。

本发明实施例中采用的细胞生长培养液组成为：DMEM基础培养基，其中添加总体积10％的胎牛血清和总体积1％的氨苄霉素/链霉素，培养液于4℃储存，使用前37℃水浴预热。

本发明实施例中采用的丹酚酸C购自上海陶素生化科技有限公司，纯度>99％。

本发明实施例中采用的SARS-CoV-2由武汉病毒研究所于感染者体内分离并扩增保存。

本发明实施例中假病毒包装质粒及其来源：SARS-CoV-2S假病毒包装骨架质粒pNL4-3.Luc.R-E-为本单位收集鉴定保存，已公开的SARS-CoV-2S蛋白全长核心质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-Sipke由上海复旦大学陆路教授惠赠。

本发明实施例中采用的荧光素酶检测试剂盒购自美国PROMEGA公司，包括荧光素酶底物及细胞裂解液。

药理实验部分

实施例1丹酚酸C体外对SARS-CoV-2的抑制活性检测

1、药物抑制SARS-CoV-2活性测定

1)将对数生长期的Vero-E6细胞接种于48孔板，3*10^5个细胞/孔，37℃、5％CO₂过夜培养。

2)药物预孵：采用含总体积2％胎牛血清的DMEM培养基稀释药物。药物初始浓度设置为50μM(溶剂为DMSO)，三倍倍比稀释药物，每个浓度药物设置3个复孔，共9个药物梯度，分别为50、16.7、5.56、1.85、0.62、0.21、0.07、0.023、0.008μM，设置溶剂二甲基亚砜(DMSO)作为对照组，对照组采用含总体积2％胎牛血清的DMEM培养基稀释，给予药物同体积的二甲基亚砜。去除细胞上清后1)中48孔板中的实验组每孔加入100μl稀释后的药物，对照组加入100μl稀释后的DMSO，置37℃孵育1h。

3)病毒感染：48孔板每孔加入5μl的SARS-CoV-2病毒稀释液(感染复数MOI＝0.05)，并置细胞于37℃继续孵育1h。

4)换液：充分去除感染物上清，细胞用200μl PBS洗一遍。重新在孔中加入200μl对应浓度含药物的培养基，继续培养24h，收取150μl细胞培养上清待测。采用qRT-PCR测定病毒拷贝数。

5)病毒RNA提取具体操作方法(参照Takara MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Code No.9766)：

a)病毒的裂解：在150μl细胞培养上清中，加入50μl PBS(PH7.4)溶液补足至200μl。随后加入200μl的Buffer VGB、20μl的Proteinase K和1.0μl的Carrier RNA，充分混匀，于56℃水浴温浴10分钟充分裂解。向裂解液中加入200μl无水乙醇，充分吸打混匀。

b)将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液。

c)将500μl的Buffer RWA加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

d)将700μl的Buffer RWB加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。(Buffer RWB中已经加入了指定体积的100％乙醇)。沿Spin Column管壁四周加入BufferRWB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。

e)重复操作步骤d。

f)将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心2分钟。

g)将Spin Column安置于新的1.5ml RNase free collection tube上，在SpinColumn膜的中央处加入30μl的RNase free dH₂O，室温静置5分钟。12,000rpm离心2分钟洗脱RNA。

6)病毒RNA逆转录具体操作方法(参照Takara PrimeScriptTM RT reagent Kitwith gDNA EraserCode No.RR047A)：

a)去除基因组DNA反应：按如下成分于冰上配制反应混合液

试剂	体积(μl)
		5*gDNA Eraser Buffer	2.0
gDNA Eraser	1.0
		Total RNA	3.0
RNase Free dH<sub>2</sub>O	4.0
		Total volume	10.0

反应程序：42℃，2min。

b)逆转录反应体系：冰上配置

试剂	体积(μl)
		步骤1的反应液	10.0
PrimeScript RT Enzyme Mix I	1.0
		RT Primer Mix	1.0
5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)	4.0
		RNase Free dH<sub>2</sub>O	补齐至20.0

反应程序：37℃，15min；85℃，5sec。

7)qPCR检测病毒拷贝数：参照Takara TB

Premix Ex Taq^TMII(TliRNaseHPlus，Code No.RR820A)(采用标准曲线法：用已知拷贝数的RBD质粒做标准品，特异性引物靶向RBD)。按照如下成分于冰上配置反应液：

试剂	体积(μl)
		TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2X)	10
Forward Primer(10μM)	1
		Reverse Primer(10μM)	1
ROX Reference Dye(50X)	0.4
		cDNA模板	1
灭菌水	6.6
		Total volume	20

引物序列如下：

RBD上游引物(Forward Primer)：CAATGGTTTAACAGGCACAGG(SEQ ID NO：1)

RBD下游引物(Reverse Primer)：CTCAAGTGTCTGTGGATCACG(SEQ ID NO：2)

在ABI7500定量PCR仪上完成检测：

Stage 1：预变性、Reps：1个循环、95℃,30s；

Stage 2：PCR反应、Reps：40个循环、95℃,5s；

退火：60℃,30～34秒。

2、结果：如图1所示；

根据标准曲线，计算出每个样品的拷贝数。以DMSO组拷贝数作为参照，计算药物处理组抑制率。再根据不同浓度药物处理组抑制率，运用Prism8.0软件，拟合出药物抑制率曲线，并计算出丹酚酸C(Sal-C)作用于SARS-CoV-2的半数有效浓度EC₅₀为3.41μM。

实施例2丹酚酸C对SARS-CoV-2S蛋白假病毒进入的抑制活性检测

1、方法：

1)pNL4-3.Luc.R-E-pcDNA3.1-SARS-CoV-2-Sipke假病毒包装：

对数生长期的HEK-293T细胞4*10^5个/ml，2ml每孔均匀接种于6孔板中。37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养24小时。转染前1小时更换新鲜培养基，分别采用100μl空白DMEM培养基配制质粒稀释液及转染试剂(PolyJet)稀释液，每孔配制比例如下(质粒DNA需采用去内毒素的提取试剂盒抽提)：

pNL4-3.Luc.R-E- 1000ng

pcDNA3.1-SARS-CoV-2-Sipke 500ng

PolyJet 6μl

具体配制方法如下：pNL4-3.Luc.R-E-质粒与pcDNA3.1-SARS-CoV-2-Sipke质粒同时加入到100μl空白DMEM培养基中混匀，PolyJet采用100μl空白DMEM培养基稀释混匀。将PolyJet稀释液加入质粒稀释液中并混匀，室温孵育15分钟，均匀的添加至HEK-293T细胞中，37℃培养48小时后收集上清病毒液，4000rpm离心10分钟，0.45μm无菌滤头过滤，即得到SARS-CoV-2假病毒。

2)假病毒抑制实验：

取对数生长期过表达SARS-CoV-2受体ACE2的293T细胞(293T/ACE2)，按1*10^4个/孔均匀铺于96孔细胞板中。37℃细胞培养箱中培养24小时。

药物初始浓度设置为20μM，给药前采用含总体积2％胎牛血清的DMEM培养基2倍倍比稀释9个浓度梯度(20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.07813μM)，每孔60μl，每个浓度3个复孔，设置DMSO溶剂对照组。将60μl假病毒加入稀释后的药物中，混匀室温作用30分钟，取100μl/孔添加至ACE2/293T细胞中，37℃培养48小时。去除培养基，100μl/孔无菌PBS(PH7.4)洗涤细胞一次，每孔加入50μl 1X细胞裂解液，室温震荡裂解15分钟。转移40μl/孔的裂解上清到96孔白色酶标板中，按照单荧光素酶检测试剂盒说明书加等体积稀释后的荧光素酶底物，立即进行酶标仪检测荧光值，根据荧光值大小，判断丹参素抑制病毒吸附进入的活性。根据荧光值与药物浓度的对应关系计算抑制率，绘制曲线计算药物的半抑制浓度IC₅₀。

2、结果：如图2所示；

以DMSO溶剂组为对照，根据荧光值计算药物处理组的抑制率。再根据不同浓度药物处理组抑制率，运用Prism8.0软件，拟合出药物抑制率曲线，并计算出丹酚酸C(Sal-C)抑制SARS-CoV-2S蛋白假病毒进入靶细胞的半数抑制浓度IC₅₀为5.90μM。

实施例3丹酚酸C的细胞毒性检测

1、方法：

1)细胞接种：

处于对数生长期的Vero-E6、293T/ACE2细胞，调整细胞密度至1*10^4个/孔，分别以100μL/孔接种于96孔板，培养过夜。

2)药物浓度设计：

给药前用含总体积2％胎牛血清的DMEM培养基2倍倍比稀释9个浓度梯度，初始浓度设置为200μM(200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625，0.78125μM)，取每孔100μL稀释后的药物分别加入1)中96孔板中的Vero-E6、293T-ACE2细胞中，每孔终体积200μL。每个药物浓度设置3个复孔。以DMSO溶剂处理组为空白对照。

3)检测吸光度：

孵箱中培养48h后，每孔加入10μL CCK-8工作液，培养箱继续孵育3小时。酶标仪测定450nm处吸光度。

4)根据测得的OD值，分别计算与对照组相比，在各个浓度的药物的作用下，Vero-E6、293T-ACE2细胞的存活率。

2、结果：如图3、4所示；

丹酚酸C(Sal-C)在200μM及有效浓度范围内对Vero-E6细胞(图3)、293T/ACE2细胞(图4)无明显毒性作用。

以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

中国科学院武汉病毒研究所

<120> 丹酚酸C或其药物可接受盐在制备抗病毒的药物中的应用

<130> CP120010257C

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caatggttta acaggcacag g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcaagtgtc tgtggatcac g 21

Claims (2)

1.丹酚酸C或其药物可接受盐作为唯一活性成分在制备抗病毒的药物中的应用，所述丹酚酸C分子式为C₂₆H₂₀O₁₀，分子量为492.43，结构式为

所述病毒为SARS-CoV-2。

2.丹酚酸C或其药物可接受盐作为唯一活性成分在制备抑制病毒进入靶细胞的药物中的应用，所述丹酚酸C分子式为C₂₆H₂₀O₁₀，分子量为492.43，结构式为

所述病毒为SARS-CoV-2。

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