CN113398219A - 橘红痰咳浸膏在制备抑制人冠状病毒感染的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，尤其涉及橘红痰咳浸膏在制备抑制人冠状病毒感染的药物中的用途。本发明提供了橘红痰咳浸膏在制备抑制人冠状病毒感染的药物中的应用，实验表明橘红痰咳浸膏能抑制人冠状病毒诱导炎症因子TNF‑α、IL‑6、IL‑8和IFN‑α的mRNA过度表达，从而抑制人冠状病毒。

Description

橘红痰咳浸膏在制备抑制人冠状病毒感染的药物中的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及了一种药物新用途，具体涉及一种橘红痰咳浸膏在制备抑制人冠状病毒感染的药物中的用途。

背景技术

冠状病毒(CoV)属套氏病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属，为有包膜的正股单链RNA病毒，直径为80-120nm，约有3万个碱基组成，其遗传物质是已知RNA病毒中最大的。冠状病毒由核衣壳蛋白(N蛋白)、受体结合位点的刺突糖蛋白(S蛋白)、小包膜糖蛋白(E蛋白)、负责运输营养物质的膜糖蛋白(M蛋白)、血凝素糖蛋白(HE蛋白)及核糖核酸(RNA)构成。国际病毒分类命名委员会在2012年根据其遗传学差异和血清学特性将冠状病毒分为α、β、γ、δ四群，其中β群冠状病毒又进一步分为A、B、C、D四个组。α、β两群易感染哺乳动物，包含了7种对人类致病的冠状病毒，分别为HCoV-OC43、HCoV-229E、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2；而γ、δ两群则主要感染禽类。

冠状病毒具有较强的传染性和致病性，对于冠状病毒感染患者的治疗，机制尚不明确，治疗难度大，目前尚未研制出特效药，现有的治疗方案以对症和支持治疗为主，难以取得理想的治疗效果。此外，由于冠状病毒是一种RNA病毒，相应的错配修复机制不完善，易发生变异。因此，新冠病毒的药物研发具有重大的社会学和经济学意义。

如CN111671742A公开了丙戊酸钠在制备人冠状病毒感染肺炎治疗药物中的应用，该发明公开了丙戊酸钠对冠状病毒xCOV和新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的细胞具有保护作用；丙戊酸钠能够显著降低人冠状病毒229E肺炎小鼠模型肺指数，其中，丙戊酸钠高、中、低剂量组小鼠肺指数显著降低，与模型对照组比较有显著性差异，抑制率分别为45.17％、45.71％、40.99％。丙戊酸钠还能显著降低小鼠肺组织病毒载量，其中中剂量组与模型对照组比较有显著性差异。丙戊酸钠能够显著升高病毒感染小鼠的CD4⁺T淋巴细胞、CD8⁺T淋巴细胞百分比水平，明显降低小鼠肺组织中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-β含量，显著改善肺部炎症反应；丙戊酸钠治疗能改善LPS诱导的呼吸窘迫小鼠模型的肺部炎症，降低血液MIP1α水平。以上研究显示，丙戊酸钠在呼吸道病毒尤其是新型冠状病毒感染导致的原发性和/或继发性肺部感染疾病和/或呼吸窘迫中发挥重要的预防和/或治疗作用。CN111544442A公开了芦丁作为冠状病毒广谱抑制剂的新用途，其中，芦丁可以作为冠状病毒的广谱抑制剂用于各种冠状病毒感染：例如严重急性呼吸综合症(SARS)，中东呼吸综合症(MERS)以及人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)引发的普通感冒。尤其芦丁可以作为2019新型冠状病毒2019-nCov(COVID-19)的抑制剂，用于预防及治疗2019新型冠状病毒感染。芦丁可以结合2019新型冠状病毒的刺突蛋白S1以及冠状病毒主蛋白酶(3CLpro)、木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLP)，既能够阻断病毒进入细胞，又能够抑制病毒复制，是罕见的新冠病毒的三靶点抑制剂。

橘红痰咳方由化橘红、百部、茯苓、水半夏(制)等8味药组成，具有宣肺化痰、理气止咳之功能，目前市售药品有橘红痰咳煎膏、橘红痰咳液、橘红痰咳糖浆、橘红痰咳颗粒等多种剂型。2011年，周华俊发现橘红痰咳颗粒提取物能明显抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀和鸡蛋清所致的大鼠足跖肿胀，也能抑制大鼠棉球肉芽肿的形成，表明橘红痰咳颗粒提取物具有抗炎作用(中国现代药物应用，2011年5月第5卷第10期)。而橘红痰咳方对于人冠状病毒感染的防治作用此前并未见相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了橘红痰咳浸膏在制备抑制人冠状病毒感染的药物中的用途，本发明研究表明，橘红痰咳浸膏能抑制人冠状病毒诱导炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8和IFN-α的mRNA过度表达，从而抑制人冠状病毒。

本发明提供了橘红痰咳浸膏在制备抑制人冠状病毒感染的药物中的用途。

本发明中，所述橘红痰咳浸膏，包括化橘红、蜜百部、茯苓、水半夏(制)、白前、甘草、苦杏仁和五味子。

本发明中，所述橘红痰咳浸膏的制备方法为常规技术手段，优选地，所述橘红痰咳浸膏的制备方法为：将化橘红和苦杏仁用水蒸气蒸馏，收集馏出液；将药渣与蜜百部、茯苓、水半夏(制)、白前、甘草和五味子混合，加水煎煮至少一次，滤过；合并滤液及馏出液，浓缩后，加入乙醇，使含醇量达75-80wt％，静置，取上清液，浓缩，即得所述橘红痰咳浸膏。

本发明中，所述药物包括橘红痰咳浸膏和制药学上可接受的载体，其中，所述药物的剂型为口服制剂和/或注射制剂。

本发明中，所述抑制包括抑制人冠状病毒诱导炎症因子的表达。

本发明实施例中，以HCoV-229E病毒浸染HuH-7细胞对橘红痰咳浸膏的功能进行验证。

因此，本发明具体提供了橘红痰咳浸膏在制备抑制人冠状病毒HCoV-229E感染的药物中的用途。

本发明所述的抑制包括抑制人冠状病毒HCoV-229E诱导炎症因子的mRNA表达。

其中，所述炎症因子包括TNF-α、IL-6、IL-8和IFN-α。

本发明的有益效果为：

实验证明，本发明的橘红痰咳浸膏在体外对人冠状病毒(HCoV-229E)感染Huh-7细胞致细胞病变具有抑制作用(选择指数SI为10.50)；同时，体外能抑制人冠状病毒(HCoV-229E)诱导炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8和IFN-α的mRNA过度表达，具剂量依赖关系。

附图说明

图1为橘红痰咳浸膏对细胞毒性检测结果。

图2为橘红痰咳浸膏对人冠状病毒HCoV-229E药效检测结果。

图3橘红痰咳浸膏对人冠状病毒HCoV-229E炎症因子TNF-α药效。

图4橘红痰咳浸膏对人冠状病毒HCoV-229E炎症因子IL-6药效。

图5橘红痰咳浸膏对人冠状病毒HCoV-229E炎症因子IL-8药效。

图6橘红痰咳浸膏对人冠状病毒HCoV-229E炎症因子IFN-α药效。

具体实施方式

本发明提供了橘红痰咳浸膏在制备抑制人冠状病毒感染的药物中的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。

其中，橘红痰咳浸膏为广州白云山星群(药业)股份有限公司提供(批号B200501)，所述橘红痰咳浸膏，包括以下原料：化橘红、蜜百部、茯苓、水半夏(制)、白前、甘草、杏仁和五味子；优选为所述橘红痰咳浸膏，包括以下重量份的原料：化橘红200-300份、蜜百部2-30份、茯苓20-30份、水半夏(制)20-30份、白前40-50份、甘草1-10份、杏仁80-100份和五味子10-20份。

所述橘红痰咳浸膏的制备方法为：将化橘红和苦杏仁用水蒸气蒸馏，收集馏出液；将药渣与蜜百部、茯苓、水半夏(制)、白前、甘草和五味子混合，分别加入(药渣与蜜百部、茯苓、水半夏(制)、白前、甘草和五味子总重量的)6-8倍量水、4-6倍量水煎煮二次，滤过，合并滤液及馏出液，浓缩至相对密度1.05-1.25(80℃)，加入乙醇，使含醇量达75-80％，静置18-24小时，取上清液，浓缩至相对密度1.05-1.25(80℃)，即得所述橘红痰咳浸膏。

HuH-7细胞，购自广州呼吸健康研究院呼吸疾病国家重点实验室病毒室。

人冠状病毒HCoV-229E，滴度为TCID₅₀＝10^-5/100μL，购自广州呼吸健康研究院呼吸疾病国家重点实验室病毒室-80℃保存；使用病毒滴度为100TCID₅₀。

实施例1细胞毒性试验(MTT法)

(1)受试药物：如表1所示；

表1药物名称、实验浓度和分组

(2)无菌96孔培养板，每孔加入100μL浓度为2×10⁵cells/mL Huh-7细胞，37℃5％CO₂培养24小时；

(3)96孔板单层细胞用PBS洗涤1次，每孔加入100μL 2倍梯度稀释的药物。空白对照组和正常细胞组每孔加入等体积2％血清培养基，37℃培养4日；

(4)每孔加入浓度为5mg/mL的MTT溶液20μL，继续孵育4小时。弃上清，每孔加入100μL DMSO，低速振荡5分钟，使结晶物充分融解；

(5)选择490nm波长，在酶联免疫仪上测定吸光值，计算抑制率。

抑制率＝(正常组平均OD值-药物组平均OD值)/(正常组平均OD值－空白组平均OD值)×100％。Reed-Meunch法计算药物半数毒性浓度(TC₅₀)。

(6)实验条件：以上实验操作均在BSL-2实验室内完成。

实施例2受试药物抗病毒实验

(1)受试药物：如表2所示

表2药物名称、实验浓度和分组

(2)无菌96孔培养板，每孔加入100μL浓度为2×10⁵cells/mL Huh-7细胞，37℃5％CO₂培养24小时；

(3)培养板实验组和病毒对照组加入100TCID₅₀病毒液100μL/孔，37℃5％CO₂培养箱吸附2h；

(4)2h后，弃去96孔培养板中细胞培养液；受试药物稀释成表2中的各个浓度，每个浓度3个复孔，100μl/孔加入上述药液；

(5)同时设立细胞对照和病毒对照(阴性对照)；

(6)细胞37℃,5％C0₂孵箱孵育3-4天；

(7)光学显微镜下观察细胞病变(CPE),细胞出现病变程度按以下6级标准记录：“-”无病变出现；“±”为细胞病变少于10％；“+”为细胞病变25％；“++”为细胞病变50％；“+++”为75％的细胞出现病变：“++++”为75％以上病变。采用Reed-Muench法或GraphPadPrism8.0计算半数抑制浓度(IC₅₀)。

(8)实验条件：以上实验操作均在BSL-2实验室内完成。

实施例3 RT-qPCR检测炎症因子

(1)受试药物：如表3所示。

表3药物名称、实验浓度和分组

(2)Huh-7细胞接种至6孔板中，分为正常组、病毒组和药效组。细胞长至单层后，弃去培养液，用PBS洗一次，病毒组和药效组接种1000个TCID₅₀的人冠状病毒(HCoV-229E)，正常组和药物对照组加入含2％血清培养基，37℃吸附1小时。

(3)弃去病毒液，药效组加入不同浓度药物溶液1mL，正常组和病毒组加入等体积含2％血清培养基。37℃作用48小时后，弃上清，PBS洗细胞一次，加入TRIzol试剂裂解细胞提取RNA，RT-qPCR检测细胞因子。

(4)实验条件：以上实验操作均在BSL-2实验室内完成。

抗病毒药效结果判定标准：以选择指数

判定药效标准，SI>1表示有效，选择指数越大，抗病毒效果越好。

实验结果

1、药物毒性

MTT实验结果表明，在Huh-7细胞中，橘红痰咳浸膏半数无毒浓度(TC₅₀)为16.45mg/ml，如图1所示。

2、抗病毒药效

通过观察细胞病变(CPE)并记录实验结果，采用Reed-Muench法或GraphPadPrism8.0计算半数有效浓度(IC₅₀)，橘红痰咳浸膏在此次实验的治疗模式中IC₅₀为1.567mg/ml，如图2所示。

3、炎症细胞因子的结果

通过RT-qPCR检测细胞因子mRNA的表达，采用GraphPad Prism8.0分析计算，结果如图3-6所示。

综上可知，上述实验结果表明橘红痰咳浸膏在体外对人冠状病毒(HCoV-229E)感染Huh-7细胞致细胞病变具有抑制作用(选择指数SI为10.50)；体外能抑制人冠状病毒(HCoV-229E)诱导炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8和IFN-α的mRNA过度表达，具剂量依赖关系。

以上是结合具体实施例对本发明进一步的描述，但这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.橘红痰咳浸膏在制备抑制人冠状病毒感染的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人冠状病毒为HCoV-229E。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述橘红痰咳浸膏，包括化橘红、蜜百部、茯苓、水半夏、白前、甘草、苦杏仁和五味子。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述橘红痰咳浸膏的制备方法为：将化橘红和苦杏仁用水蒸气蒸馏，收集馏出液；将药渣与蜜百部、茯苓、水半夏、白前、甘草和五味子混合，加水煎煮至少一次，滤过；合并滤液及馏出液，浓缩后，加入乙醇，使含醇量达75-80wt％，静置，取上清液，浓缩，即得所述橘红痰咳浸膏。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括橘红痰咳浸膏和制药学上可接受的载体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为口服制剂。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射制剂。

8.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述抑制包括抑制人冠状病毒诱导炎症因子的表达。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制包括抑制人冠状病毒诱导炎症因子的mRNA表达。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述炎症因子包括TNF-α、IL-6、IL-8和IFN-α。

Images