CN111671742B - 丙戊酸钠在制备人冠状病毒感染肺炎治疗药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了丙戊酸钠(VPA)在制备呼吸道病毒感染性疾病治疗药物中的应用，以及根据应用制备的含有丙戊酸钠的药物制剂。所述制剂对包括新型冠状病毒在内的呼吸道病毒感染引发的原发性和/或继发性肺部感染有显著的预防及治疗效果。

Description

丙戊酸钠在制备人冠状病毒感染肺炎治疗药物中的应用

技术领域

本发明公开了一种化合物的医学用途，属于医药制品领域。

背景技术

病毒是一类由核酸与蛋白质构成，没有典型细胞结构，寄生于活细胞内，以复制方式增殖的病原微生物。临床数据显示，感染类疾病中病毒感染导致的疾病占总数的75％以上，其中，以呼吸道病毒感染最为常见。能够引起呼吸道病毒感染的病毒较多，以冠状病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒或腺病毒等最为常见。目前对于病毒性呼吸道感染的治疗仍以对症处理为主，尚缺乏理想可靠的预防手段和治疗方案。

冠状病毒(Coronaviruses，CoV)可引起普通感冒、中东呼吸综合征(Middle-EastRespiratory Syndrome，MERS)和严重急性呼吸道综合征(Severe Acute RespiratorySyndrome，SARS)等多种疾病。其中，MERS和SARS均起源于人畜共患，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引发冠状病毒病2019(Coronavirus Disease 2019，COVID-19)，SARS-CoV-2是Beta-CoV谱系B的成员，与SARS-CoV基因组序列有75％至80％同源性，且与多种蝙蝠冠状病毒同源性高。

在没有疫苗或特效疗法的情况下，全球科研人员正在探索各种医学干预措施，以控制持续的COVID-19的全球流行。SARS-CoV-2感染主要导致肺炎和上/下呼吸道感染，主要的临床症状是发烧和咳嗽，其他症状还包括呼吸急促，肌肉疼痛/疲劳，精神错乱，头痛，危重症患者会出现急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，最终导致呼吸衰竭。流行病学和临床特征报告显示，COVID-19危重症患者预后差，病死率高。因此，抑制炎症反应，维持细胞存活，预防呼吸窘迫是阻止病程恶化、提高COVID-19危重症治愈率、降低死亡率的关键。

丙戊酸钠(VPA)是一种新型独特的抗癫痫药，其对中枢神经系统副作用较小，是治疗癫痫大、小发作和肌阵挛性发作的首选药物之一。

鉴于目前缺乏治疗和/或预防呼吸道病毒尤其是新型冠状病毒感染导致原发性和/或继发性肺部感染和/或呼吸窘迫的有效药物，因此，本发明的目的就是提供一种能够有效治疗和/或预防呼吸道病毒尤其是新型冠状病毒感染引发的原发性和/或继发性肺部感染和/或呼吸窘迫的药物应用。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了丙戊酸钠在制备呼吸道病毒感染性疾病治疗药物中的应用。

在一个优选的实施方案中，所述病毒感染性疾病的病原包括：冠状病毒，甲、乙、丙型流感病毒，1-5型副流感病毒，呼吸道合胞病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，风疹病毒，鼻病毒或腺病毒。

在一个更为优选的实施方案中，所述冠状病毒包括SARS-CoV-2、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。

其次，本发明还提供了根据上述应用制备的一种药物制剂，所述药物制剂含有丙戊酸钠和制药学上可接受的载体。

在一个优选的实施方案中，所述丙戊酸钠按照15–500mg/kg体重的剂量制备。

在一个更为优选的实施方案中，所述丙戊酸钠按照60–180mg/kg体重的剂量制备。

在一个尤为优选的实施方案中，所述制剂为口服制剂。

在另一个优选的实施方案中，所述制剂为注射制剂。

更为优选地，所述注射制剂包括静脉注射制剂、肌肉注射制剂、皮下注射制剂或腹腔注射制剂。

在又一个优选的实施方案中，所述制剂为雾化制剂。

本发明的研究显示，VPA对冠状病毒xCOV和新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的细胞具有保护作用；VPA能够显著降低人冠状病毒229E肺炎小鼠模型肺指数，其中，VPA高、中、低剂量组小鼠肺指数显著降低，与模型对照组比较有显著性差异，抑制率分别为45.17％、45.71％、40.99％。VPA还能显著降低小鼠肺组织病毒载量，其中中剂量组与模型对照组比较有显著性差异。VPA能够显著升高病毒感染小鼠的CD4⁺ T淋巴细胞、CD8⁺ T淋巴细胞百分比水平，明显降低小鼠肺组织中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-β含量，显著改善肺部炎症反应；VPA治疗能改善LPS诱导的呼吸窘迫小鼠模型的肺部炎症，降低血液MIP1α水平。以上研究显示，VPA在呼吸道病毒尤其是新型冠状病毒感染导致的原发性和/或继发性肺部感染疾病和/或呼吸窘迫中发挥重要的预防和/或治疗作用。考虑到目前缺乏VPA在治疗和/或预防呼吸道病毒尤其是新型冠状病毒感染引起的原发性和/或继发性肺部感染和/或呼吸窘迫中的应用，因此，本发明提供的丙戊酸钠在制备呼吸道病毒感染性疾病治疗药物中的应用，根据应用制备的含有丙戊酸钠的药物制剂对于治疗和/或预防呼吸道病毒尤其是新型冠状病毒感染引发的原发性和/或继发性肺部感染和/或呼吸窘迫方面具有重要的应用价值。

附图说明

图1.不同浓度VPA对xCOV病毒感染Vero细胞的保护作用镜检图；

图2.不同浓度VPA对xCOV病毒感染Vero细胞中病毒基因组含量影响的对照图；

图3.VPA对人冠状病毒肺炎小鼠模型肺指数影响的对照图；

图4.VPA对人冠状病毒肺炎小鼠模型病毒载量影响的对照图；

图5.VPA对人冠状病毒感染引起肺炎小鼠的外周血CD4⁺ T淋巴细胞影响的对照图；

图6.VPA对人冠状病毒感染引起肺炎小鼠的外周血CD8⁺ T淋巴细胞影响的对照图；

图7.VPA对人冠状病毒感染引起肺炎小鼠的肺组织中IL-2含量影响的对照图；

图8.VPA对人冠状病毒感染引起肺炎小鼠的肺组织中IL-10含量影响的对照图；

图9.VPA对人冠状病毒感染引起肺炎小鼠的肺组织中TNF-α含量影响的对照图；

图10.VPA对人冠状病毒感染引起肺炎小鼠的肺组织中IFN-β含量影响的对照图；

图11.VPA对Vero细胞抗人新型冠状病毒感染的保护作用对照图；

图12.VPA对LPS诱导呼吸窘迫小鼠模型肺指数影响的对照图；

图13.VPA对LPS诱导呼吸窘迫小鼠模型的HE病理切片图；

图14.VPA对LPS诱导呼吸窘迫小鼠模型血液中细胞因子含量影响的对照图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。

实施例1.VPA对冠状病毒(xCOV)感染细胞的保护作用

本实施例采用从穿山甲中分离培养出的冠状病毒xCOV感染Vero细胞模型评价VPA对冠状病毒感染细胞的保护作用，进而探索VPA用于制备抗冠状病毒尤其是SARS-CoV-2感染救治药物的可能性。

1.1实验方案：

1.1.1细胞系：Vero细胞

1.1.2病毒：从穿山甲中分离培养出的冠状病毒xCOV(该病毒对人没有致病性，可以在普通实验室培养，而且该病毒与SARS-CoV-2的亲缘关系大大优于SARS病毒，因此可以作为理想的SARS-CoV-2的抗病毒药物筛选模型)，该病毒不感染人，安全可靠。

1.1.3 VPA对冠状病毒(xCOV)感染细胞的保护实验：用无菌PBS或HEPES将药物干粉稀释至1000μM，用细胞培养液稀释成浓度为100ug/ml的储液，最终工作浓度为100、50、25、12.5、6.25μM，共5个梯度。在48孔培养板中培养Vero细胞，培养24h后在孔板中加入含不同浓度VPA药物的细胞培养液，浓度分别为100、50、25、12.5、6.25μM，并以MOI＝0.01接种xCOV病毒，每个药物浓度重复三个复孔，病毒接种后72h，镜检观察细胞病变，抽提上清和细胞中核酸，检测xCOV拷贝数。

1.2实验结果

图1细胞观察表明12.5μM和25μM VPA处理组细胞饱满，12.5μM和25μM VPA处理对病毒感染细胞凋亡有抑制作用。图2表明12.5μM和25μM VPA处理组的细胞内病毒基因组含量低于0μg/ml组，表明VPA对xCOV病毒有抑制作用。

综上，在Vero细胞中，VPA对xCOV病毒感染具有抑制作用。xCOV病毒与新型冠状病毒SARS-CoV-2同属冠状病毒，且序列相似性很高，因而，可以预期VPA对SARS-CoV-2病毒的抑制作用。

实施例2.VPA对人冠状病毒229E小鼠肺炎模型的治疗实验

本实施例采用人冠状病毒229E感染BALB/c小鼠的肺炎模型评价VPA对冠状病毒感染肺炎的治疗作用，进而探索VPA用于制备抗冠状病毒肺部感染救治药物的可能性。

2.1实验方案

2.1.1药物：阳性药物为磷酸氯喹片，受试药物为VPA。

2.1.2实验动物

2.1.3毒株及细胞

2.1.3.1病毒毒株：人冠状病毒229E(HCoV-229E)，-80℃冰箱保存备用。

2.1.3.2细胞株：人胚肺成纤维细胞MRC5，液氮保存备用。

2.1.4评价VPA对人冠状病毒229E小鼠肺炎模型的治疗作用：

2.1.4.1药物配置及给药方案：VPA给药剂量为60mg/kg、120mg/kg、180mg/kg。试验前配制成6mg/ml、12mg/ml、18mg/ml浓度的药液，按0.1ml/10g腹腔注射，每日1次，连续4天。磷酸氯喹片给药剂量依据临床剂量换算得0.5g/60kg/d×11＝0.09g/kg/d，按照20ml/kg/d，灌胃服药，每日1次，连续4天。

2.1.4.2病毒传代：取已长成单层MRC-5细胞的25cm²培养瓶，弃掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，加入细胞维持液5ml，再加入HCoV-229E病毒液200μl，置37℃5％CO₂培养箱中培养72～96h，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，直至80％细胞出现明显病变(CPE)后，将细胞培养瓶置于-80℃低温冰箱冻存，病毒液反复冻融3次后，用于病毒滴度测定。

2.1.4.3病毒滴度测定：取已长成单层MRC5细胞的96孔板，弃掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞3遍后，按10倍倍比(10^-1～10^-8)稀释接种不同滴度的HCoV-229E病毒液，共8个稀释度，100μl/孔，每个稀释度做4个复孔，同时设正常细胞对照。96孔板置37℃、5％CO₂培养箱中培养72～96h，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，并记录各孔的细胞病变情况。按Reed-Muench法计算50％细胞病变浓度(TCID50)。

2.1.4.4人冠状病毒肺炎小鼠模型构建及给药：BALB/c小鼠60只，按体重随机分为正常对照组，模型对照组，氯喹对照组，VPA高、中、低剂量组，每组10只，雌雄各半。除正常对照组外，其他各组小鼠乙醚轻度麻醉后，以100TCID50 HCoV-229E滴鼻感染，50μl/只，隔日1次，共感染2次。初次感染当天，各给药组给药，每天1次，连续4天。末次给药后一天称量体重后，眼眶采血(抗凝)，解剖取肺并称量肺重，-80℃保存。

2.1.4.5给药治疗后的检测指标：

计算肺指数及抑制率，小鼠称量体重后取血，解剖取肺组织并称量肺重，具体计算公式如下：

肺指数＝肺湿重(g)×100/体重(g)

肺指数抑制率＝(模型对照组肺指数-给药组肺指数)/(模型对照组肺指数-正常对照组肺指数)×100％

实时荧光定量RT-PCR法检测肺组织中核酸含量。TRIzol法提取-80℃保存的各组小鼠肺组织，以DEPC-H₂O作为阴性对照，对阳性对照品进行10、100、1000倍梯度稀释，试剂配制：18μl HCoV-229E核酸荧光PCR检测混合液，1μl内部对照品，1μl RT-PCR酶，PCR扩增条件参数设置为：45℃×10min；95℃×15min；95℃×15sec，60℃×60sec，循环40次；反应体系25μl。

具体计算方法见附表：

核酸检测计算方法

流式细胞术检测小鼠外周血淋巴细胞比例。对小鼠摘眼球取血，离心裂解分离得到小鼠外周血白细胞，利用流式细胞术检测小鼠外周血CD4⁺ T、CD8⁺ T淋巴细胞比例。抗体情况如下：FITC标记抗小鼠CD3e、PE标记抗小鼠CD19，PerCP-Cy5.5标记抗小鼠CD4、APC标记抗小鼠CD8a，每管细胞的配制体积为：抗体各0.3μl，封闭液50μl。ELISA法检测小鼠肺组织中炎性因子。使用超声细胞破碎仪对50mg肺组织进行匀浆获得样品蛋白。对样品进行2倍稀释后利用ELISA实验检测各组样品中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-β等细胞因子的含量。

2.2实验结果

图3为VPA对人冠状病毒肺炎小鼠模型肺指数影响的对照图，其中1为正常对照组，2为模型对照组，3为氯喹对照组，4为VPA高剂量组(180mg/kg/d)，5为VPA中剂量组(120mg/kg/d)，6为VPA低剂量组(60mg/kg/d)。图3显示模型对照组小鼠肺指数显著增加，与正常对照组比较有显著性差异；VPA高、中、低剂量组小鼠肺指数显著降低，与模型对照组比较有显著性差异；抑制率分别为45.17％、45.71％、40.99％。

图4为VPA对人冠状病毒肺炎小鼠模型病毒载量影响的对照图，其中1为正常对照组，2为模型对照组，3为氯喹对照组，4为VPA高剂量组(180mg/kg/d)，5为VPA中剂量组(120mg/kg/d)，6为VPA低剂量组(60mg/kg/d)。从图4可以看出，与正常对照组比较，模型对照组小鼠肺组织病毒载量显著增加；VPA高、中剂量组小鼠肺组织病毒载量显著降低，其中中剂量组与模型对照组比较有显著性差异。

图5为VPA对人冠状病毒感染引起肺炎小鼠的外周血CD4⁺ T淋巴细胞影响的对照图，图6为VPA对人冠状病毒感染引起肺炎小鼠的外周血CD8⁺ T淋巴细胞影响的对照图，图5-6中，1为正常对照组，2为模型对照组，3为氯喹对照组，4为VPA高剂量组(180mg/kg/d)，5为VPA中剂量组(120mg/kg/d)，6为VPA低剂量组(60mg/kg/d)。图5-6结果显示：模型对照组小鼠外周血CD4⁺ T淋巴细胞、CD8⁺ T淋巴细胞百分比显著降低，与正常对照组比较有显著性差异；VPA高剂量组CD4⁺ T淋巴细胞、CD8⁺ T淋巴细胞百分比显著升高；中剂量CD8⁺ T淋巴细胞百分比显著升高。

图7-10分别为VPA对人冠状病毒感染引起肺炎小鼠的肺组织中IL-2含量、IL-10含量、TNF-α含量、IFN-β含量影响的对照图，图7-10中，1为正常对照组，2为模型对照组，3为氯喹对照组，4为VPA高剂量组(180mg/kg/d)，5为VPA中剂量组(120mg/kg/d)，6为VPA低剂量组(60mg/kg/d)。图7-10结果显示：模型对照组小鼠肺组织IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-β含量显著升高,与正常对照组比较有显著性差异；VPA三个剂量组均可明显降低小鼠肺组织中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-β含量，其中高剂量组IL-2、IL-10、IFN-β含量，中剂量组IL-2、TNF-α含量以及低剂量组IL-2、IL-10、IFN-β含量降低与模型对照组比较有显著性差异。

综上所述，VPA能够显著降低人冠状病毒229E肺炎小鼠模型肺指数，其中，VPA高、中、低剂量组小鼠肺指数显著降低，与模型对照组比较有显著性差异，抑制率分别为45.17％、45.71％、40.99％。VPA还能显著降低小鼠肺组织病毒载量，其中中剂量组与模型对照组比较有显著性差异。VPA能够显著升高病毒感染小鼠的外周血CD4⁺ T、CD8⁺ T淋巴细胞百分比水平，明显降低小鼠肺组织中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-β含量，显著改善肺部炎症反应，表明VPA可用于治疗冠状病毒感染肺炎。

实施例3.VPA对人新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染细胞的保护作用

本实施例采用新型冠状病毒分离株感染Vero细胞模型评价VPA对新型冠状病毒感染的抑制效果，确定VPA用于制备抗冠状病毒尤其是新型冠状病毒感染救治药物的可能性。

3.1实验方案

3.1.1细胞系：Vero细胞

3.1.2病毒：新型冠状病毒分离株。

3.1.3 VPA抗新型冠状病毒的药效学评价实验：在48孔板中铺Vero细胞，三孔重复，并加入12.5ug/ml浓度的药物(100μl/孔)并接种新型冠状病毒(MOI＝0.01)，对照组接种新型冠状病毒(MOI＝0.01)不加入VPA药物。接种病毒后37℃5％CO₂孵育，第三天后镜检细胞病变。

3.2实验结果

图11的细胞观察表明12.5μg/ml VPA对新型冠状病毒感染细胞凋亡有抑制作用，12.5μg/ml VPA处理组细胞饱满，活细胞数量较多，阴性对照组细胞凋亡明显，剩余活细胞较少，表明VPA对人新型冠状病毒感染的Vero细胞具有保护作用，对新型冠状病毒有抑制作用。

实施例4.VPA对LPS诱导的呼吸窘迫小鼠模型的治疗作用

本实施例采用LPS诱导BALB/c小鼠呼吸窘迫模型评价VPA对肺炎引起的呼吸窘迫的治疗作用，进而探索VPA用于制备肺部感染导致呼吸窘迫救治药物的可能性。

4.1实验方案

4.1.1建模制剂：LPS(Sigma)，建模剂量浓度为7.5mg/kg。

4.1.2实验动物：BALB/c小鼠，8-10周，雄性。

4.1.3实验药物：VPA，药物治疗剂量分为：高剂量组(180mg/kg)和低剂量组(120mg/kg)。

4.1.4评价VPA对LPS诱导呼吸窘迫小鼠模型的治疗作用：

LPS诱导呼吸窘迫小鼠模型的建立：BALB/c小鼠40只，按体重随机分为正常对照组，模型对照组，VPA高(180mg/kg)、低(120mg/kg)剂量组，每组10只。除正常对照组外，其他各组小鼠轻度麻醉后，以7.5mg/kg LPS滴鼻感染，50μl/只，共感染1次。初次感染当天，各给药组给药，每天1次，连续2天。末次给药后一天称量体重后，眼眶采血，解剖取肺泡灌洗液，取肺并称量肺重，福尔马林浸泡，制备病理切片并行HE染色。

4.1.5给药治疗后的检测指标：

小鼠称量体重后取血，解剖取肺组织并称量肺重，计算肺指数。HE染色观察各组肺部病理改变。利用多功能液相芯片分析系统确定血液中TNF、IL-6、IL-10、IFNg、MIP-1α、IL-1、CCL4、MMP8、GRANZ-B含量。

4.2实验结果：

4.2.1图12显示(图12中，1为正常对照组，2为模型对照组，3为VPA低剂量120mg/kg/d，4为VPA高剂量180mg/kg/d。)；与正常对照组(0.595±0.058)相比，模型对照组(1.074±0.131)小鼠肺指数明显增加；VPA高剂量组(1.022±0.096)、VPA低剂量组(1.066±0.188)与模型对照组比较小鼠肺指数略有降低。

4.2.2图13和表1结果显示，与空白对照组相比，模型对照组肺脏发生急性炎症反应，程度为中度至重度；与模型对照组相比，VPA低剂量给药组疗效不明显，仅个别动物可见减轻，VPA高剂量给药组可见轻微疗效，表现为未见重度炎症反应，轻度炎症反应动物只数增加。

表1各组出现急性炎症反应、出血及水肿的小鼠比例(阳性动物只数/总动物只数)

4.2.3图14显示，与空白对照组相比，模型对照组血液TNF、IL10、MMP8、MIP1α水平显著增加；与模型对照组相比，VPA两个剂量治疗组的TNF、IL10、MMP8、MIP1α含量降低；其中，VPA高剂量治疗组MIP1α含量显著降低。

综上，VPA对小鼠肺炎导致的呼吸窘迫有治疗作用，提示VPA可以用于制备呼吸道病毒感染引发呼吸窘迫的救治药物。

Claims (1)

1.丙戊酸钠在制备呼吸道病毒感染性疾病治疗药物中的应用，其特征在于，所述呼吸道病毒感染性疾病的病原为冠状病毒，所述冠状病毒为HCoV-229E、HCoV-NL63。