CN101626763A - 使用组蛋白脱乙酰酶（hdac）抑制物的细胞免疫增强 - Google Patents

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Abstract

[技术问题]本发明提供细胞免疫增强子并且提供针对癌发生的应用或针对癌复发的预防性疗法、用于癌症的免疫疗法、对致病微生物感染的治疗等。[技术方案]本发明包含具有组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制活性的物质作为活性组分。

Description

使用组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制物的细胞免疫增强
技术领域
本发明涉及通过使用组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制物提高主要组织相容性复合体(MHC)I类抗原在细胞表面上的表达水平而增强细胞免疫能力的方法。也即，本发明涉及用于使用HDAC抑制物增强细胞免疫的方法。另外，本发明涉及此类方法用于增强细胞免疫以预防癌发生或癌复发的用途、现有癌症的免疫疗法或致病微生物感染的治疗。
背景技术
生物的免疫力基本上划分为依赖于抗体产生的体液免疫和依赖于淋巴细胞靶向细胞损伤的细胞免疫。细胞免疫是在抵抗细胞内感染的致病微生物或细胞疾病如癌症中最重要的免疫力。因此，增强这种细胞免疫能力预计在广泛领域如预防或治疗癌症和治疗致病微生物(如病毒及细菌)感染中发挥效力。
在细胞免疫中，淋巴细胞识别靶细胞，如癌细胞和病毒感染细胞，并且在这些机制中，MHC I类抗原分子发挥重要作用。人MHC称作人白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)。例如，作为癌细胞中来自癌抗原蛋白降解产物的抗原肽或作为病毒等感染细胞中来自毒力因子衍生蛋白降解产物的抗原肽分别与HLA I类分子结合并在细胞表面上出现。在免疫活性细胞中，T细胞通过其细胞表面上的T-细胞抗原受体识别靶细胞表面上的抗原肽/HLA复合体并区分正常细胞和癌细胞/感染细胞。这意味当HLA I类分子的表达被抑制时，借助T细胞的靶细胞识别机制将无法正常作用。
在人的例子下，MHC I类抗原包括两个分子的异二聚体，所述的分子是主要由三种基因即HLA-A、HLA-B和HLA-C编码的重链和由一个基因编码的称作β2-微球蛋白(B2M)的轻链。当B2M未正常表达时，则成熟HLA复合体的形成和至细胞膜表面的运输受到破坏，导致降低全部HLA-A、HLA-B和HLA-C遗传基因座的产物表达。
MHC I类抗原在除睾丸细胞之外的几乎全部体细胞的细胞表面上表达。然而，在某些癌细胞如乳腺癌细胞和前列腺癌细胞中，细胞表面MHC I类抗原的表达往往降低。就MHC I类抗原表达降低的机制而言，因重链或轻链中基因突变所致的下降调节机制是已知的(非专利文件1)，不过其细节未知。另一方面在多种病毒感染中，抑制I类抗原的表达也是已知的并且已经报道了其各种机制。有趣地，已知每种病毒具有多种复杂策略以抑制I类表达。例如，细胞巨化病毒表达可干扰MHC I类途径的4种基因(US3、US2、US11和US6)：US3抑制MHC I类复合体从内质网输出，US2和US11诱导由蛋白酶体迅速破坏MHC I类复合体，并且US6抑制肽输送至内质网，这4种基因均干扰MHC I类的功能(非专利文件2)。HIV病毒不仅通过Tat抑制B2M基因和I类基因的转录(非专利文件3)，还通过Nef改变I类产物的运输途径而干扰MHC I类功能(非专利文件4)。
以这种方式，癌组织和病毒感染细胞通过灵巧地抑制HLA I类抗原分子表达而逃避免疫监视。因此，若这些组织和细胞中I类分子表达得到增加，则预期宿主的细胞免疫能力将升高，从而为癌症和感染的预防及治疗提供明显疗效。
另一方面，最近已知不改变基因碱基序列的外遗传调节作用广泛参与癌发生等。将可调节染色质活性的组蛋白乙酰化视为在外遗传调节作用中发挥重要作用的因素之一，并且可调节组蛋白乙酰化水平的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)作为癌症等的分子靶正在引起人们关注(非专利文件5)。抑制HDAC发挥作用的多种HDAC抑制物是已知的(非专利文件5和非专利文件6)。这些HDAC抑制物对从属各类别的HDAC的特异选择性实际上不是严格的，不过，例如，已经报道曲古抑菌素A(tricostatinA，TSA)抑制I类和II类HDAC，而与II类HDAC相比，丙戊酸(VPA)优选地抑制II类HDAC等(非专利文件5和非专利文件6)。
非专利引用文献1：Seliger，B.等，癌症生物学研究(Semin Cancer Biol.)2002，12：3-13。
非专利引用文献2：Mirandola，P.等，传染病杂志(J Infect Dis.)2006年4月1日；193(7)：917-26。
非专利引用文献3：Carroll，IR.等，分子免疫学(Mol Immunol.)，1999年12月；35(18)：1171-8。
非专利引用文献4：Lubben，NB.等，分子生物学与细胞(Mol Biol Cell.)，2007。
非专利引用文献5：Kim，DH.等，生物化学与分子生物学杂志(J BiochemMol Biol.)，2003年1月31日；36(1)：110-9。
非专利引用文献6：Gottlicher，M.等，欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)2001年11月17日；20(24)：6969-78。
发明内容
技术问题
在癌细胞和致病微生物感染细胞中，MHC I类抗原分子的表达经常降低。因此，病毒感染细胞和癌细胞逃脱了宿主的免疫监视，并且认为这是不能通过活体的免疫能力消除病毒和癌症的原因。为了通过这种免疫能力预防和治疗感染、癌症等，重要的是提高在致病微生物感染细胞或癌细胞中被降低的细胞表面上MHC I类抗原表达水平并且因此已经在寻找解决这个问题的方法。
本发明的发明人发现在众多癌细胞中抵达细胞表面的MHC I类的表达水平被降低，尽管在MHC I类重链和轻链基因中均无突变性改变。他们进一步发现在某些癌细胞中，MHC I类抗原表达抑制的原因归咎于与B2M基因结合的组蛋白脱乙酰化。随后，证实HDAC抑制物在添加至其中B2M表达被降低的细胞时，提高了MHC I类在细胞表面上的表达水平以及B2M蛋白的水平。换而言之，已经证实在其中诱导了MHC I类抗原表达抑制的细胞中，HDAC抑制物的使用提升了与B2M基因结合的组蛋白的乙酰化并提高B2M蛋白的水平，从而导致MHC I类在细胞表面上的表达水平提高。另一方面，就病毒感染中MHC I类表达水平降低而言，已知涉及多个且复杂的如上所述系统。出乎意料地，由于本发明的发明人的深入研究，已经证实组蛋白脱乙酰化抑制物的使用在多种病毒感染系统中均一地引起MHC I类抗原表达水平提高，并且这有助于实现本发明。
技术方案
换句话说，本发明的细胞免疫增强子的特征在于，其包含具有组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制活性的物质作为活性成分。
此外，在本发明的细胞免疫增强子中，具有HDAC抑制活性的物质优选地是丙戊酸。
另外，本发明的细胞免疫增强子优选地用于治疗或预防其中β2-微球蛋白(B2M)的表达在患病部位被抑制的疾病。
可选地，本发明的细胞免疫增强子优选地用于在遭受因细胞侵入性致病微生物/因子所致的感染或存在这种感染风险的受试者中、或在患有疾病或存在患有该疾病风险的受试者中治疗或预防疾病。所述的致病微生物优选地是细胞侵入性细菌。另外，所述致病因子优选地是病毒。进一步，所述病毒更优选地是选自由疱疹病毒科、乳多空病毒科、慢病毒科和副粘病毒科成员所组成的组中的一种或多种病毒。所述疾病优选地是癌症，更优选地是前列腺癌或口腔癌，并且还更优选地是乳腺癌。
其次，本发明的HLA I类表达的增强子以包含具备HDAC抑制活性的物质作为活性成分为特征。
此外，在本发明的HLA I类表达的增强子中，具有HDAC抑制活性的物质优选地是丙戊酸。
随后，本发明的B2M表达的增强子以包含具备HDAC抑制活性的物质作为活性成分为特征。
此外，在本发明的B2M表达的增强子中，具有HDAC抑制活性的物质优选地是丙戊酸。
随后，本发明用于增强细胞免疫的方法以包括给予受试者组合物的步骤为特征，其中所述的组合物含有具备HDAC抑制活性的物质作为活性成分。
此外，在本发明用于增强细胞免疫的方法中，具有HDAC抑制活性的物质优选地是丙戊酸。
此外，本发明用于增强细胞免疫的方法优选地用于治疗或预防其中β2-微球蛋白(B2M)的表达在患病部位被抑制的疾病。
可选地，在本发明用于增强细胞免疫的方法中，受试者优选地被致病微生物感染，并且所述的致病微生物更优选地是病毒，并且所述病毒还更优选地是选自由疱疹病毒科、乳多空病毒科、慢病毒科和副粘病毒科成员所组成的组中的一种或多种病毒。另外，在本发明中，所述疾病优选地是癌症，并且所述癌症更优选地是前列腺癌或口腔癌，并且该癌症还更优选地是乳腺癌。
也即，本发明用于增强细胞免疫的方法可以用于在遭受因包括任意病毒的细胞侵入性致病微生物/因子所致的感染或存在这种感染风险的受试者中或在患癌症(如乳腺癌、前列腺癌、口腔癌等)或存在所述患癌症风险的受试者中预防或治疗疾病。
其次，用于筛选其细胞免疫将通过使用本发明具备HDAC抑制活性的物质而得以增强的受试者的方法以包括以下步骤为特征：从所述受试者获得感染组织或癌组织的步骤，从所述组织提取B2M或编码B2M的mRNA的步骤，以及将所述B2M或所述编码B2M的mRNA的量与对照的量比较的步骤。
另外，用于筛选其细胞免疫将通过使用本发明具备HDAC抑制活性的物质而得以增强的受试者的方法以包括以下步骤为特征：从所述受试者获得感染组织或癌组织的步骤，用所述组织进行染色质免疫沉淀以获得沉淀物，并从所述沉淀中实施B2M的DNA片段的PCR扩增以获得扩增的DNA片段的步骤，以及确定所述扩增片段是否存在的步骤。
此外，在本发明的筛选方法中，具有HDAC抑制活性的物质优选地是丙戊酸。
有利的发明
借助本发明所述细胞免疫增强子、HLA I类表达的增强子、B2M表达的增强子或用于增强细胞免疫的方法，可以提高靶细胞中MHC I类抗原的表达水平。结果，增强了宿主中细胞毒T细胞对靶细胞的杀伤效果。因而，通过使用本发明的方法，可以进行直接治疗或可以提高现有疗法在疾病如微生物感染、癌症等中的治疗效果。
另外，借助用于筛选其细胞免疫将通过使用本发明具备HDAC抑制活性的物质而得以增强的受试者的方法，可以选出其I类抗原表达因HLA I类轻链(B2M)蛋白水平降低而降低的靶细胞，并且因此可以筛选出这样的受试者，该受试者患有其中B2M的表达在患病部位被抑制的疾病或具有发生或复发这种疾病的风险。类似地，可以对疾病(如微生物感染、癌症等)进行治疗并且可以提高现有疗法的治疗效果。
附图说明
图1是显示通过染色质沉淀使结合细胞内B2M基因的组蛋白被脱乙酰化的图。左侧组是其中在TSA存在下培养MCF-7人乳腺癌细胞的实例，并且右侧组是其中在VPA存在下培养HMC-1人乳腺癌细胞系的实例。由于B2M基因在这两种情况中在不处理状态下的抗乙酰化组蛋白抗体免疫沉淀物中几乎检测不到，发现在B2M基因区中组蛋白是脱乙酰化的。已经通过TSA或VPA作用在相同的免疫沉淀物中检测到B2M基因。
图2是显示细胞内B2M蛋白水平因HDAC抑制物而提高的图。左侧组是其中HMC-1人乳腺癌细胞培养的实例并且右侧组是其中MCF-7人乳腺癌细胞系培养的实例，两组分别在TSA存在下培养24小时。在这两种细胞中，证实在未处理状态下处于极低水平的B2M蛋白因HDAC抑制物TSA的作用而明显增加。相反，甚至在未处理状态下以较高水平表达的HLA I类重链和肌动蛋白的水平则没有巨大改变。
图3是显示细胞表面上MHC I类抗原的水平因HDAC抑制物TSA而提高的图。左侧组是其中HMC-1人乳腺癌细胞培养的实例并且右侧组是其中MCF-7人乳腺癌细胞系培养的实例，两组分别在TSA存在下培养24小时。在这两种细胞中，显示在未处理状态下处于极低水平的在细胞表面上的MHC I类抗原因HDAC抑制物TSA的作用而增加约十倍。纵轴表示细胞计数，并且水平轴表示荧光强度。
图4是显示细胞表面上MHC I类抗原的水平因HDAC抑制物VPA而提高的图，其中已经在人中建立所述VPA的安全性。HMC-1人乳腺癌细胞在4mM VPA存在下培养48小时。证实在未处理状态下处于较低水平的在细胞表面上的MHC I类抗原因HDAC抑制物VPA的作用而增加约十倍。纵轴表示细胞计数，并且水平轴表示荧光强度。
图5是这样的图，显示其中细胞表面上的HLA I类抗原(重链和轻链B2M蛋白)表达为阳性的癌症病例(上半部分的两组，病例A)和阴性癌症病例(下半部分的两组，病例B)。左上和左下两组是其中乳腺癌样品用抗HLA I类重链抗体(EMR8-5抗体)进行免疫染色的图，并且右上和右下两组是其中相同乳腺癌样品用抗B2M抗体(EMRB6抗体)进行免疫染色的图。所述图显示在人乳腺癌组织中存在HLA I类阳性癌(病例A)和阴性癌(病例B)。
图6用与图5中的抗体类似的抗HLA I类重链抗体(EMR8-5抗体)进行免疫染色，并且研究了多种类型的人癌组织中HLA I类抗原的细胞表面表达。如该表中所示，表明表达频率根据癌症类型而不同，但是相对于全部癌症类型而言存在其中HLA I类抗原为阳性的癌症和表达为阴性或降低的癌症。应当注意其中HLA I类抗原表达降低的频率尤其在乳腺癌和前列腺癌中较高。
图7是显示HLA I类抗原的表达水平与对照组(VPA(-))相比在VPA给药小鼠(VPA(+))的肿瘤中提高的图。
图8是显示B2M的表达水平与对照组(VPA(-))相比在VPA给药小鼠(VPA(+))的肿瘤中提高的图。
图9是显示与对照组(VPA(-))相比，在VPA(VPA(+))存在下人免疫缺陷病毒(HIV)持续性感染T细胞中HLA I类抗原的表达水平提高的图。
图10是显示与对照组(VPA(-))相比，在VPA(VPA(+))存在下乳头瘤病毒持续性感染上皮细胞系(HeLa细胞)中HLA I类抗原的表达水平提高的图。
图11是显示与对照组(VPA(-))相比，在VPA(VPA(+))存在下伯基特淋巴瘤病毒(EB virus)持续性感染图11B细胞(LG2EBV细胞)中HLA I类抗原的表达水平提高的图。
图12是显示与对照组(VPA(-))相比，在VPA(VPA(+))存在下腮腺炎病毒持续性感染B细胞(Akata-MP1细胞)中HLA I类抗原的表达水平提高的图。
图13是显示与对照组(VPA(-))相比，在VPA(VPA(+))存在下麻疹病毒持续性感染B细胞(Raji-ZH细胞)中HLA I类抗原的表达水平提高的图。
实施本发明的最佳模式
此后，解释本发明的优选实施方式。本发明的第一实施方式涉及含有具备HDAC抑制活性的物质作为活性组分的组合物。
“具备HDAC抑制活性的物质”可以是任意物质，只要它是能够给药给人或动物的HDAC抑制物。例如，具有HDAC抑制作用的药物(agent)之一是丙戊酸(VPA)，其安全性已经在人中充分建立。在VPA的例子中，尽管可能以约1000mg-2400mg每日剂量口服给药至人，不过该剂量可以根据体重和年龄、药代动力学、安全性、效果、目的、给药方法等进行调整。
作为具备HDAC抑制活性的物质，还可以等效地使用除VPA之外任意HDAC抑制物。例如，在本申请提出之时，所述药物如苯基丁酸、FK228(酯肽)、SAHA(辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid))、PXD101、CI-994(N-乙酰地那林)、MGCD0103、匹维耐克斯(Pivanex)、CRA-024781、MS-275、LBH589、MG989、LAQ-824和NVP-LAQ824已经就不同于本发明的另一个用途处在临床试验中，此外，众多HDAC抑制物如TSA、楚普辛(Trapoxin)、CHAP、阿匹西丁(Apicidin)和地普迪辛(Depudecin)是已知的。因此，作为“具备HDAC抑制活性的物质”，可以在本发明的实施中使用与VPA具有等同作用和/或特异性的HDAC抑制物。此类HDAC抑制物可以称作针对I类和/或II类HDAC的抑制物。
另外，使用含有本发明中具备HDAC抑制活性的物质作为活性成分的组合物以治疗或预防其中B2M表达在患病部位被抑制的疾病。例如，当疾病是癌症时，前述患病部位意指癌细胞；若该疾病是感染，意指致病微生物感染的细胞。
此外，虽然不特别地限制待以含有本发明中具备HDAC抑制活性的物质作为活性成分的组合物给药的受试者，不过所述受试者包括癌症患者、具有癌症发生或复发风险的受试者，或受致病微生物(如病毒和其他致病微生物)感染的受试者，或具有所述感染风险的受试者。
在本发明中由致病微生物所致的感染没有特别的限制，并且它包括例如病毒所致感染，其中所述的病毒包含疱疹病毒科的病毒，包括EB病毒、细胞巨化病毒、人合胞体病毒(HSV)、第七种人类疱疹病毒(HHV-7)等；乳多空病毒科的病毒，包括乳头瘤病毒等；细小病毒科的病毒；腺病毒科的病毒；嗜肝DNA病毒科的病毒，包括乙型肝炎病毒(HBV)等；痘病毒科的病毒，小RNA病毒科的病毒，包括属于肠病毒属的柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒(HAV)等；冠状病毒科的病毒，包括SARS病毒；披膜病毒科的病毒；黄病毒科的病毒，包括丙型肝炎病毒(HCV)、西尼罗河热病毒等；狂犬病毒科的病毒；丝状病毒(filovirus)科的病毒；副粘病毒科的病毒，包括麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒(腮腺炎病毒)、副流感病毒等，沙粒病毒科的病毒；布尼亚病毒科，包括汉坦病毒等；正粘病毒科的病毒，包括流感病毒；逆转录病毒科的病毒，包括慢病毒亚科的HIV-1/2、猫免疫缺陷病毒(FIV)和肿瘤病毒亚科的人类T淋巴细胞白血病病毒(HTLV-1/2)等；呼肠孤病毒科的病毒，包括轮状病毒；和其他多种病毒，以及由细菌、支原体、立克次氏体、真菌、寄生虫(如原虫)等所致的感染，并且还是包括其中毒力因子实际上可以不指明的任意感染。换而言之，不特别地限制前述感染，但是这有可能施用于患有如下疾病或具有这些疾病风险的受试者，其中所述的疾病例如是呼肠孤病毒感染、SARS、逆转录病毒感染、黄热病、日本脑炎、登革热、西尼罗河热、牛病毒性腹泻粘膜病、猪霍乱、边界病、丙型肝炎、口蹄疫、脊髓灰质炎(急性脊髓灰质炎)、甲型肝炎、感冒、风疹、辛德比斯病毒感染、马病毒性动脉炎、猴出血热、诺如病毒感染、札幌病毒(sapovirus)感染、兔出血症、猫杯状病毒病、猪水泡疹、戊型肝炎、马尔堡病、埃博拉出血热、狂犬病、水疱性口炎、麻疹、小反刍兽疫、犬瘟热、牛瘟、流行性腮腺炎、梅那哥病毒(Menangle virus)感染、新城疫病、呼吸道合胞病毒(RS virus)感染、人偏肺病毒感染、尼帕病毒感染、流感、赤羽病、汉坦病毒肺综合征、肾综合征出血热、淋巴细胞脉络丛脑膜炎、拉沙热、阿根廷出血热、玻利维亚出血热、艾滋病(AIDS)、成人T-细胞白血病，或水痘、天花、带状疱疹、细胞巨化病毒感染、腺病毒感染、乙型肝炎和其他疾病。
此外，含有本发明中具备HDAC抑制活性的物质作为活性成分的组合物可以在治疗或预防致病微生物感染中单独使用或用作辅药以补充针对本领域技术人员已知的其他感染的治疗和预防作用。
另外，含有本发明中具备HDAC抑制活性的物质作为活性成分的组合物可以在治疗或预防癌症中用作抗癌药和/或用作辅药以补充其他抗癌疗法。在癌症预防中最优选的实施方式是预防癌复发。
尽管不特别地限制作为本发明中治疗或预防主题的癌症，不过可以列出多种癌症如肺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、结肠癌和膀胱癌，优选前列腺癌或口腔癌，更优选乳腺癌。另一方面，本发明的细胞免疫增强子可以优选地在个体病例中应用，只要B2M表达受到抑制，实际上不必是其中经常观察到B2M表达被抑制的疾病(例如乳腺癌和前列腺癌)。
另外，不特别限制抗癌治疗的方法，但是这些方法包括多种疗法，如放疗法、热疗法，化疗法(例如抗癌药，如阿那曲唑、环磷酰胺、伊立替康、阿糖胞苷、紫杉醇、多西他赛、白消安、卡波醌、二溴甘露醇、达卡巴嗪、美法仑、甲基苄肼、去氧氟尿苷、氟尿嘧啶、卡莫氟(camofur)、巯嘌呤、甲氨蝶呤、阿糖胞苷十八烷基磷酸钠、替加氟、卡铂、顺铂、塞替派、多柔比星、表柔比星、阿柔比星、L-天冬酰胺酶、丝裂霉素C、甲羟孕酮、云芝多糖、他莫昔芬、托瑞米芬、长春瑞滨和鬼臼乙叉苷，或使用其药学上可接受盐的那些疗法等)、基因疗法(导入肿瘤抑制基因如p53的那些基因疗法，使用随免疫刺激细胞因子一起所导入的肿瘤细胞的那些基因疗法等)、外科疗法和营养疗法，并且优选地是免疫疗法。在所述免疫疗法中包括使用肿瘤抗原肽的癌症疫苗疗法、通过介体/载体如病毒导入肽抗原或肿瘤-细胞基因至活体的DNA疫苗、利用肿瘤细胞中RNA的RNA疫苗、联合使用细胞因子和树突状细胞作为抗原呈递细胞的疗法、单克隆抗体疗法等。
此外，含有本发明中具备HDAC抑制活性的物质作为活性成分的组合物也可以用于产生药物用来增强细胞免疫。除了用于治疗之外，此类细胞免疫增强子还用于预防、复发预防等，以及改善与本发明的多种疾病相关的疾病状态。
另外，不特别地限制给药含有本发明中具备HDAC抑制活性的物质作为活性成分的组合物的方法，不过，可以向受试者口服给药或胃肠道外给药(例如，静脉内给药(包括静脉内输注给药)、动脉内给药、皮下给药、肌内给药、腹膜内给药、局部给药等)。给药的受试者可以是任意动物，例如蜥蜴、鸡、家鸭、野鸭、小鼠、大鼠、犬、猫、绵羊、山羊、牛、马、猪、猴、人和可以考虑对其给药的其他动物，并且优选地是哺乳动物，包括人。
而且，含有本发明中具备HDAC抑制活性的物质作为活性成分的组合物可以通过与经常使用的药用载体配制在一起而制备。例如，作为活性组分的HDAC抑制物可以制备为用于口服给药的液体口服制剂如糖浆剂，或被加工成提取物、粉末等并与药学上可接受载体掺合以制备口服制剂，如片剂、胶囊剂、糖浆剂、乳剂、颗粒剂和散剂。
就药学上可接受载体而言，采用通常使用的多种物质，例如，可以在固体制剂中掺合赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂，或在液体制剂中掺合溶剂、赋形剂、增溶剂(solubilizing agent)、助溶剂(solubilizer)、乳化剂、悬浮剂、粘合剂等。此外，也可以根据需要添加制剂添加物如防腐剂、抗氧化剂、着色剂和甜味剂。
含有本发明中具备HDAC抑制活性的物质作为活性成分的组合物可以单独地使用，不过因为该组合物用于增强细胞免疫目的，故它可以优选地与抗原特异性疫苗如癌抗原特异性疫苗和病毒的疫苗以及其他抗原非特异性免疫刺激物(例如细胞因子如干扰素)和多种佐剂组合使用。可在组合中使用的药用物质可以或者通过与含有本发明中HDAC抑制物的药用物质混合的方式或者单独地使用。
其次，本发明的第二实施方式涉及用于增强细胞免疫的方法，其包括给药含有具备HDAC抑制活性的物质作为活性组分的组合物至受试者的步骤。即，此方法是一种用于增强受试者中细胞免疫的方法，所述的受试者患有因免疫力降低而衍生的疾病或存在患该疾病的风险，其中所述方法包括以增强细胞免疫的剂量给药组合物至该受试者的步骤，其中所述的组合物含有药学上可接受的载体和具备HDAC抑制活性的物质。
用于筛选受试者的方法也属于本发明的范围并且是第三实施方式，其中所述的受试者患有其中B2M表达在患病部位被抑制的疾病，从而适用于本发明中用于增强细胞免疫的方法，或因此，所述受试者患有其中B2M表达在患病部位被抑制的疾病或具有发生或复发这种疾病的风险，从而适用于本发明用于增强细胞免疫的方法。在这种筛选法中包括以下步骤：
1)从受试者获得患病组织如癌组织的步骤；
2)从上述组织提取B2M或编码B2M的mRNA的步骤；和
3)将B2M或编码B2M的mRNA的量与对照量比较的步骤。
除了通常针对每种器官使用的活组织检查之外，还可以通过洗出液、磨损收集物、体液如血液、脊液、淋巴液、尿、唾液、腹水、胸水和渗出物等获得组织。
随后，可以通过使用本领域技术人员已知的方法，例如通过使用质谱仪或免疫学方法(如ELISA、放射免疫测定法、荧光抗体法、蛋白质印迹法、免疫组织化学染色法或等；遗传方法如RNA印迹法、RT-PCR、微阵列等)或其他方法而进行B2M或编码B2M的mRNA的量比较。
所述筛选法适用于初步筛选，通过此筛选法选出适用于本发明方法的受试者，然而，更严格地，优选进一步进行包括以下步骤的筛选法，或通过从头开始实施所述筛选法进一步缩小待选出的受试者范围。
1)从受试者获得患病组织如癌组织的步骤；
2)用上述组织进行染色质免疫沉淀以获得沉淀物、并从所述沉淀物中进行PCR扩增B2M的DNA片段的步骤；以及
3)评价缩扩增DNA片段存在或不存在的步骤。
存在这样的可能性，即B2M基因表达抑制因其中B2M的DNA片段不由所述方法扩增的受试者中存在HDAC活性所致，并且通过采用本发明的治疗方法以及类似方法所实现的效果是期望的。本文中，“染色质免疫沉淀法”是使结合于染色质的DNA及所述该染色质亲和沉淀的方法，可以使用任意合适的方法，然而，例如可以通过如此方式维持染色质与DNA之间的结合状态，即以交联剂如1％甲醛(例如在室温10分钟)预处理组织细胞，此后利用通常所用的放射免疫沉淀测定缓冲液(RIPA buffer)等裂解所述细胞，并用超声波均质器等剪切所述DNA，随后沉淀使染色质和所结合的DNA片段沉淀(见Assam El-Osta等，(2002)分子生物学和细胞生物学(MOLECULAR ANDCELLULAR BIOLOGY)22(6)第1844-1857页)。
此外，作为本发明第二实施方式的用于增强细胞免疫的方法是用于增强受试者中HLA I类表达的方法，其包括给药含有具备HDAC抑制活性的物质作为活性组分的组合物至该受试者的步骤。这种组合物用于治疗致病微生物(如病毒)感染或作为所述感染的预防药或作为抗癌药在治疗其中B2M被抑制的疾病中(例如在治疗癌症中)使用，或用于辅助该疾病的其他治疗方法，但不限于此。
另外，本发明用于增强细胞免疫的方法是用于增强受试者中B2M表达的方法，其包括给药含有具备HDAC抑制活性的物质作为活性组分的组合物至该受试者的步骤。这种组合物用于治疗或预防癌症，例如单独地或与其他治疗方法组合使用，但不限于此。
除非另外说明，本文中所用的术语具有本领域技术人员通常理解和使用的意义。另外，除非另外说明，文中所用的方法和技术可以根据本技术领域熟知方法的常规用途进行。描述这些方法的参考文献列出为，例如Sambrook等，分子克隆实验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989和2001)；Ausubel等，最新分子生物学实验方法(Current Protocols in Molecular Biology)，格林出版公司(Greene Publishing Associates)(1992和附录)；和Harlow和Lane，抗体使用实验室手册，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1999)等以及在本说明书中描述的供应商所提供的指南手册等。引用的文献如本文中引用的科学文献、专利、专利申请通过引用的方式完整并入。
实施例
此后，本发明在实施例中说明，但是本发明的范围无论如何不受所述实施例限制。
本发明的模式1
本实施例显示，结合至细胞内B2M基因区的组蛋白是脱乙酰化的，并且这种脱乙酰化作用由HDAC抑制物消除。下文显示所述过程。
使用人乳腺癌细胞系即MCF-7细胞和HMC-1细胞分别在100nM TSA(西格玛(Sigma)，USA)存在下培养24小时或在4mM VPA(Sigma，USA)存在下培养48小时，随后根据制造商说明书(阿普斯得特公司(Upstate Inc.)，USA)从所述的细胞提取染色质并利用抗乙酰化组蛋白H3抗体(Upstate Inc.，USA)(见Assam El-Osta等2002，分子及细胞生物学(MOLECULAR和CELLULARBIOLOGY).22(6).第1844-1857页)使该染色质免疫沉淀。使用PCR，用B2M基因特异性引物(GAAAACGGGAAAGTCCCTCT和AGATCCAGCCCTGGACTAGC)扩增与乙酰化组蛋白结合的基因，并在1％琼脂糖凝胶上电泳，随后用透照器(transilluminator)在溴化乙啶存在下检测。结果显示任意癌细胞中的B2M基因区域组蛋白是脱乙酰化的。
当促进通过HDAC抑制物(如TSA和VPA)作用所致的组蛋白乙酰化时，检测到与乙酰化组蛋白在一起的B2M基因(图1)。
本发明的模式2
本实施例证明细胞内B2M蛋白的表达因HDAC抑制物增加。下文显示所述过程。
(1)使用与实施例1中相同的细胞，将MCF-7细胞和HMC-1细胞在HDAC抑制物TSA(100nM)存在下分别培养24小时，随后收获细胞。
(2)1×106个细胞在100ml细胞裂解液(RIPA缓冲液)中裂解，并且收获可溶性部分作为为裂解物。向该裂解物添加十二烷基硫酸钠上样缓冲液(SDS sample buffer)。
(3)将蛋白质样品上样至7.5％十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶上并进行电泳。
(4)将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(密理博(Millipore))上。
(5)所述转移的膜浸没于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的5％脱脂乳内并封闭约1小时。
(6)所述转移的膜浸没于第一抗体(抗泛-HLAI类重链抗体EMR8-5(北斗，札幌(Hokudo，Sapporo))或抗B2M抗体EMRB6(Hokudo，Sapporo)或抗肌动蛋白抗体(达科(DAKO))中，并在室温下温育1小时。
(7)所述转移的膜用PBS-T洗液(0.05％吐温(Tween)20/PBS，pH7.4)洗涤三次。
(8)所述转移的膜浸没于第二抗体即过氧化物酶标记抗小鼠IgG抗体(KPL，USA)中，并在室温下温育1小时。
(9)所述转移的膜用PBS-T洗液(0.05％Tween 20/PBS，pH7.4)洗涤三次。
(10)所述转移的膜浸没于增强化学发光试剂盒(ECL kit)(阿莫仙(Amersham)，USA)的发光溶液中并进行显色反应约1分钟。
(11)发光信号通过对X射线胶片曝光进行检测。
结果证实尽管细胞内HLA重链和肌动蛋白的表达水平在TSA存在或不存在下没有巨大差异，然而B2M蛋白的水平因TSA处理而显著提高(图2)。
本发明的模式3
使用与实施例1和实施例2中相同的细胞，将MCF-7细胞和HMC-1细胞分别在HDAC抑制物TSA(100nM)存在下培养24小时或在HDAC抑制物VPA(4mM)存在下培养48小时，并且通过流式细胞仪(碧迪公司(BectonDickinson))分析表达于所述细胞表面上的MHC I类抗原的水平。下文显示所述过程。
(1)1×106个细胞悬浮在100ml PBS缓冲液中，添加第一抗体(抗泛-HLAI类抗体W6/32(Barnstable，C J.，Bodmer，W.J.，Brown，G.，Galfre，G.，Milstein，C.，Williams，A.F.，和Zeigler，A.(1978)《细胞》(Cell)14，9-20)并在4℃孵育40分钟。
(2)所述细胞用PBS洗涤两次。
(3)向所述悬浮的细胞添加第二抗体(异硫氰酸荧光素(FITC)-标记抗小鼠IgG抗体(KPL，USA))并温育在4℃孵育40分钟。
(4)细胞用PBS洗涤两次，并悬浮在添加1％福尔马林的PBS中，随后通过流式细胞仪分析细胞表面的FITC水平。
结果证实在TSA或VPA存在下，所述细胞表面的MHC I类水平提高约10倍(图3，图4)。
本发明的模式4
在本实施例中，对福尔马林固定的人癌组织进行免疫组织化学染色，并且分析MHC I类抗原在真实的人癌组织中的表达水平。下文显示所述过程。
(1)用20％福尔马林固定剂固定的人乳腺癌组织的石蜡包埋切片，通过乙醇进行脱石蜡。
(2)作为抗原活化的处理，将所述切片浸没在0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中并进行高压灭菌(110℃，5分钟)。
(3)0.5ml的5mg/ml抗HLA I类重链抗体(EMR8-5)或0.5ml的5mg/ml抗b2微球蛋白(B2M)抗体(EMRB6)作为第一抗体逐滴添加在所述切片上并在室温下温育1小时。
(4)所述切片以PBS-T洗液(0.05％Tween 20/PBS，pH7.4)洗涤3次。
(5)将第二抗体过氧化物酶标记抗小鼠IgG抗体(Simple Stain MAX-PO，NICHIREI)滴在所述切片上并在室温下温育30分钟。
(6)所述切片以PBS-T洗液(0.05％Tween 20/PBS，pH7.4)洗涤3次。
(7)所述切片浸没在过氧化氢水溶液和二氨基联苯胺(DAB)底物的混合溶液(单纯染色MAX-PO(Simple Stain MAX-PO)，日冷(NICHIREI))中，并且显色1至2分钟。
(8)所述切片用流水洗涤1分钟。
(9)实施苏木精核染色法(1至2分钟)。
苏木精核染色法按照以下步骤进行。
1.将切片置于水中。
2.将切片置于(滤过的)迈尔斯苏木精(Mayers haematoxylin)中5分钟。
3.在自来水中洗涤。
4.在自来水中“染蓝(blue)”切片。
5.将切片置于1％酸醇(70％乙醇99ml外加1ml浓盐酸)持续几秒。
6.在自来水中洗涤。
7.将切片置于伊红溶液(100ml蒸馏水中的微黄色伊红1.0g)5分钟。
8.在自来水中洗涤。
9.脱水，透明(clear)。
10.在Immumount或DPX中封片。
结果显示存在其中HLA I类重链和B2M蛋白为阳性的癌，如图5上半部分两个表格显示(病例A)和其中HLA I类重链和B2M蛋白为阴性的癌，如图5下半部分两个表格显示(病例B)。
本发明的模式5
通过类似于实施例5的免疫染色方法分析MHC I类抗原在人的多种癌组织中的表达水平。如图6中所示，在41个乳腺癌病例中有35个病例(85％)的HLA I类抗原表达减少或消失，并且每种HLA I类抗原的表达在35个肺癌病例中7个病例(20％)内、57肝癌病例中24个病例(42％)内、15个结肠癌病例中4个病例(27％)内、45个肾细胞癌病例中16个病例(35％)内、53个膀胱癌病例中18个病例(34％)内、78个口腔癌病例中的45个病例内(58％)内、49个前列腺癌病例中的40个病例(82％)内降低或呈阴性。应当指出表达降低的频率在乳腺癌和前列腺癌中明显较高。
本发明的模式6
人乳腺癌细胞系MCF7细胞移植至严重联合免疫缺陷病(SCID)小鼠中。两周后，获得直径约5mm的皮下肿瘤。向一只小鼠供以含有0.4％丙戊酸(VPA，Sigma)的水持续10日，并且向另一只小鼠供应无添加物的水作为对照。十日后，将肿瘤以外科方式切下，并使用10％福尔马林(因为团块小，因此将浓度设置在低于实施例4中的浓度上以防止过度固定)在室温下固定过夜，并且获得石蜡包埋的切片。按照实施例4的方法，用抗HLA I类抗体(EMR8-5)和抗B2M抗体(EMR-B6)处理组织切片以及进行免疫染色。结果，如图6和图7中显示，与对照组相比，HLA I类抗原和B2M的表达水平在给药VPA的小鼠中的肿瘤内提高。从该实验中，证实可以通过口服给药HDAC抑制物VPA提高人乳腺癌组织的MHC I类抗原表达。
本发明的模式7
HIV感染系统的模型
HIV感染的T细胞(从美国标准生物品收藏中心(ATCC)购买的克隆8E5)在添加4mM丙戊酸的培养基(RPMI1640)和无添加物的培养基中培养48小时，并且分别与抗泛-HLA I类抗体、W6/32抗体并与FITC标记抗小鼠IgG抗体反应40分钟，并且将细胞在0.1％福尔马林/PBS中固定。荧光强度由流式细胞仪(FACScan，碧迪公司(Beckton Dickinson))测量。在细胞表面上HLAI类水平于所述HDAC抑制物存在下降低的感染细胞组中观察到表达的恢复。
本发明的模式8
乳头瘤病毒持续性感染的细胞(海拉细胞(HeLa))在添加4mM丙戊酸的培养基(RPMI1640)和无添加物的培养基中培养48小时，并且分别与抗泛-HLAI类抗体、W6/32抗体并与FITC标记抗小鼠IgG抗体反应40分钟，并且将细胞在0.1％福尔马林/PBS中固定。荧光强度由流式细胞仪(FACScan，BecktonDickinson)测量。在细胞表面上HLA I类水平于所述HDAC抑制物存在下降低的感染细胞组中观察到表达的恢复。
本发明的模式9
EB病毒持续性感染的B细胞(LG2EBV细胞)在添加4mM丙戊酸的培养基(RPMI1640)和无添加物的培养基中培养48小时，并且分别与抗泛-HLAI类抗体、W6/32抗体并与FITC标记抗小鼠IgG抗体反应40分钟，并且将细胞在0.1％福尔马林/PBS中固定。荧光强度由流式细胞仪(FACScan，BecktonDickinson)测量。在细胞表面上HLA I类水平于所述HDAC抑制物存在下降低的感染细胞组中观察到表达的恢复。
本发明的模式10
腮腺炎病毒持续性感染的B细胞(Akata-MP1细胞)在添加4mM丙戊酸的培养基(RPMI1640)和无添加物的培养基中培养48小时，并且分别与抗泛-HLA I类抗体、W6/32抗体并与FITC标记抗小鼠IgG抗体反应40分钟，并且将细胞在0.1％福尔马林/PBS中固定。荧光强度由流式细胞仪(FACScan，Beckton Dickinson)测量。在细胞表面上HLA I类水平于所述HDAC抑制物存在下降低的感染细胞组中观察到表达的恢复。
本发明的模式11
麻疹病毒持续性感染的B细胞(Raji-ZH细胞)在添加4mM丙戊酸的培养基(RPMI1640)和无添加物的培养基中培养48小时，并且分别与抗泛-HLAI类抗体、W6/32抗体并与FITC标记抗小鼠IgG抗体反应40分钟，并且将细胞在0.1％福尔马林/PBS中固定。荧光强度由流式细胞仪(FACScan，BecktonDickinson)测量。在细胞表面上HLA I类水平于所述HDAC抑制物存在下降低的感染细胞组中观察到表达的恢复。
在上述的全部病毒感染系统中，尽管没有观察到因给药所述HDAC抑制物所至的B2M表达升高，然而以相似方式观察到MHC I类表达升高。与癌组织中的观察结果相比，所述结果是完全出乎意料的。

Claims (23)

1.细胞免疫增强子，其包含具有组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制活性的物质作为活性成分。
2.根据权利要求1所述的细胞免疫增强子，其中，所述具有组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制活性的物质是丙戊酸。
3.根据权利要求1或2所述的细胞免疫增强子，用于治疗或预防其中β2-微球蛋白表达在患病部位被抑制的疾病。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞免疫增强子，其中，所述的疾病是由致病微生物引起的感染。
5.根据权利要求4所述的细胞免疫增强子，其中，所述致病微生物是病毒。
6.根据权利要求5所述的细胞免疫增强子，其中，所述病毒是选自由疱疹病毒科、乳多空病毒科、慢病毒科和副粘病毒科成员所组成的组中的一种或多种病毒。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞免疫增强子，其中，所述的疾病是癌症。
8.根据权利要求7所述的细胞免疫增强子，其中，所述的癌症是乳腺癌。
9.根据权利要求7所述的细胞免疫增强子，其中，所述的癌症是前列腺癌或口腔癌。
10.人白细胞抗原I类表达的增强子，其包含具有组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制活性的物质作为活性成分。
11.β2-微球蛋白表达的增强子，其包含具有组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制活性的物质作为活性成分。
12.用于增强细胞免疫的方法，其包括给予受试者组合物的步骤，所述的组合物含有具备组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制活性的物质作为活性成分。
13.根据权利要求12所述的用于增强细胞免疫的方法，其中，所述的具有组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制活性的物质是丙戊酸。
14.根据权利要求12或13所述的用于增强细胞免疫的方法，用于治疗或预防其中β2-微球蛋白表达在患病部位被抑制的疾病。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的用于增强细胞免疫的方法，其中，所述的受试者被致病微生物感染。
16.根据权利要求15所述的用于增强细胞免疫的方法，其中，所述的致病微生物是病毒。
17.根据权利要求16所述的用于增强细胞免疫的方法，其中，所述的病毒是选自由疱疹病毒科、乳多空病毒科、慢病毒科和副粘病毒科成员所组成的组中的一种或多种病毒。
18.根据权利要求12至14所述的任一项用于增强细胞免疫的方法，其中，所述的疾病是癌症。
19.根据权利要求18所述的用于增强细胞免疫的方法，其中，所述的癌症是乳腺癌。
20.根据权利要求18所述的用于增强细胞免疫的方法，其中，所述的癌症是前列腺癌或口腔癌。
21.用于筛选其细胞免疫将通过使用具有组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制活性的物质得以增强的受试者的方法，其包括：
1)从所述受试者获得感染组织或癌组织的步骤，
2)从所述组织提取β2-微球蛋白或编码β2-微球蛋白的mRNA的步骤，以及
3)将所述β2-微球蛋白或所述编码β2-微球蛋白的mRNA的量与对照量比较的步骤。
22.用于筛选其细胞免疫将通过使用具有组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制活性的物质得以增强的受试者的方法，其包括：
1)从所述受试者获得感染组织或癌组织的步骤，
2)用所述组织进行染色质免疫沉淀以获得沉淀物，并且从该沉淀物中实施PCR扩增β2-微球蛋白的DNA片段以获得扩增的DNA片段的步骤，以及
3)确定所述扩增片段是否存在的步骤。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中，所述具有组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制活性的物质是丙戊酸。
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