JP2010511597A - ヒストン脱アセチル化酵素阻害活性を有する物質を用いた細胞性免疫増強剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明に係る細胞性免疫増強剤は、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害活性を有する物質を有効成分として含んでなる。
【選択図】 図1
Description
1)対象から癌組織等の疾患部位を取得する工程;
2)前記組織からB2MまたはB2MをコードするmRNAを抽出する工程;
3)前記B2MまたはB2MをコードするmRNAの量を、対照と比較する工程;
以上1)〜3)の工程が含まれる。
1)対象から癌組織等の疾患部位を取得する工程;
2)前記組織からクロマチン沈降を行い、沈降物からB2MのDNA断片のPCR増幅を行う工程;
3)前記増幅されたDNA断片の存在の有無を評価する工程。
(1)上記実施例1と同じ細胞を用いて、HDAC阻害剤TSA(100nM)存在下で24時間、それぞれ培養した後、細胞を回収した。
(2)1×106の細胞を100μLの細胞溶解液(RIPA buffer)に溶解し、可溶性分画をライゼートとして回収する。ライゼートにSDS sample bufferを加えた。
(3)蛋白試料を7.5% SDSポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動した。
(4)ゲル中の蛋白質をPVDF膜(Millipore)に転写した。
(5)転写膜を5%スキムミルク・PBSに浸し、約1時間ブロッキングした。
(6)転写膜を一次抗体(抗pan−HLAクラスI heavy chain抗体EMR8−5(ホクドー、札幌)、または抗B2M抗体EMRB6(ホクドー、札幌)、または抗actin抗体(DAKO)に浸し、室温で1時間インキュベーションした。
(7)転写膜を洗浄液PBS−T(0.05% Tween 20/PBS、pH7.4)で3回洗浄した。
(8)転写膜を二次抗体ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体(KPL、USA)に浸し、室温で1時間インキュベーションした。
(9)転写膜を洗浄液PBS−T(0.05% Tween 20/PBS、pH7.4)で3回洗浄した。
(10)転写膜をECLキット(アマシャム、USA)発光液に浸し、約1分間発色反応させた。
(11)発光シグナルをX線フィルムで検出した。
(1)1×106の細胞を100μLのPBS bufferに浮遊させ、一次抗体(抗pan−HLAクラスI抗体であるW6/32(Barnstable C.J.,Bodmer W.J.,Brown G.,Galfre G.,Milstein C.,Williams A.F.,and Zeigler A.(1978)Cell 14,9−20))を添加し、4℃で40分間インキュベーションした。
(2)細胞をPBSで2回洗浄した。
(3)細胞浮遊液に二次抗体(FITC標識抗マウスIgG抗体(KPL,USA))を添加し、4℃で40分間インキュベーションした。
(4)細胞をPBSで2回洗浄し、1%ホルマリン添加PBSに浮遊させた後、フローサイトメーターによって細胞表面のFITCレベルを解析した。
(1)20%ホルマリン固定液で固定されたヒト乳癌組織のパラフィン包埋切片をエチルアルコールによって脱パラフィン処理した。
(2)抗原賦活化処理として、切片を0.01mol/Lクエン酸buffer(pH6.0)に浸して、オートクレーブ処理(110℃、5分)した。
(3)一次抗体として抗HLAクラスI重鎖抗体(EMR8−5)5μg/mLまたは抗β2マイクログロブリン(B2M)抗体(EMRB6)5μg/mLを0.5mL切片上に滴下し、室温で1時間インキュベーションした。
(4)洗浄液PBS−T (0.05% Tween 20/PBS、pH7.4)で3回洗浄した。
(5)二次抗体ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体(シンプルステインMAX−PO、NICHIREI)を切片上に滴下し、室温で30分間インキュベーションした。
(6)洗浄液PBS−T(0.05% Tween 20/PBS、pH7.4)で3回洗浄した。
(7)切片を過酸化水素水とDAB基質の混合液(シンプルステインMAX−PO、NICHIREI)に浸し、1〜2分間発色反応させた。
(8)切片を流水で1分間洗浄した。
(9)Hematoxylin核染色(1〜2分)を行った。Hematoxylin核染色は、次の手順に倣った。
1.Take sections to water.
2.Place sections in Mayers Haematoxylin(filtrated)for 5 minutes.
3.Wash in tap water.
4.‘Blue’sections in tap water.
5.Place sections in 1% Acid Alcohol(70% Alcohol 99ml plus conc.Hydrochloric Acid 1ml)for a few seconds.
6.Wash in tap water.
7.Place sections in Eosin Solution(Eosin Yellowish 1.0g in Distilled Water 100ml)for 5 minutes.
8.Wash in tap water.
9.Dehydrate,clear.
10.Mount sections in Immumount or DPX.
HIV感染T細胞(clone 8E5,ATCCより購入)を4mM Valproic acid添加培養液(RPMI1640)または無添加培養液で48時間培養した後、抗pan−HLAクラスI抗体であるW6/32抗体とFITC−label抗マウスIgG抗体とを各40分間反応させ、0.1%ホルマリン/PBSにて細胞を固定した。Flow cytometer(FACScan,Beckton Dickinson)にて蛍光強度を測定した。HDAC阻害剤存在下では、細胞表面のHLAクラスIレベルが低下している感染細胞群において発現の回復が観察された。
Claims (23)
- ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害活性を有する物質を有効成分として含んでなる、細胞性免疫増強剤。
- ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害活性を有する物質がバルプロ酸である、請求項1に記載の細胞性免疫増強剤。
- 疾患部位におけるβ2マイクログロブリン発現が抑制されている疾病の治療または予防において用いられる、請求項1または請求項2に記載の細胞性免疫増強剤。
- 疾病が病原微生物による感染症である、請求項1から請求項3のいずれかに記載の細胞性免疫増強剤。
- 病原微生物がウイルスである、請求項4に記載の細胞性免疫増強剤。
- ウイルスが、ヘルペスウイルス、パポーバウイルス、レンチウイルスおよびパラミクソウイルスよりなる群に含まれるウイルスのうち1または複数である、請求項5に記載の細胞性免疫増強剤。
- 疾病が癌である、請求項1から請求項3のいずれかに記載の細胞性免疫増強剤。
- 癌が乳癌である、請求項7に記載の細胞性免疫増強剤。
- 癌が前立腺癌または口腔癌である、請求項7に記載の細胞性免疫増強剤。
- ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害活性を有する物質を有効成分として含んでなる、HLAクラスI発現増強剤。
- ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害活性を有する物質を有効成分として含んでなる、β2マイクログロブリン発現増強剤。
- ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害活性を有する物質を有効成分として含有する組成物を対象において投与する工程を含む、細胞性免疫増強方法。
- ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害活性を有する物質がバルプロ酸である、請求項12に記載の細胞性免疫増強方法。
- 疾患部位におけるβ2マイクログロブリン発現が抑制されている疾病の治療または予防において用いられる、請求項12または請求項13に記載の細胞性免疫増強方法。
- 対象が病原微生物に感染している、請求項12から請求項14のいずれかに記載の細胞性免疫増強方法。
- 病原微生物がウイルスである、請求項15に記載の細胞性免疫増強方法。
- ウイルスが、ヘルペスウイルス、パポーバウイルス、レンチウイルスおよびパラミクソウイルスよりなる群に含まれるウイルスのうち1または複数である、請求項16に記載の細胞性免疫増強方法。
- 疾病が癌である、請求項12から請求項14のいずれかに記載の細胞性免疫増強方法。
- 癌が乳癌である、請求項18に記載の細胞性免疫増強方法。
- 癌が前立腺癌または口腔癌である、請求項18に記載の細胞性免疫増強方法。
- 1)対象から感染組織または癌組織を取得する工程;
2)前記組織からβ2マイクログロブリンまたはβ2マイクログロブリンをコードするmRNAを抽出する工程;
3)前記β2マイクログロブリンまたはβ2マイクログロブリンをコードするmRNAの量を、対照と比較する工程;
を含む、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害活性を有する物質を用いて細胞性免疫を増強する対象をスクリーニングする方法。 - 1)対象から感染組織または癌組織を取得する工程;
2)前記組織からクロマチン沈降を行い、沈降物からβ2マイクログロブリンDNA断片のPCR増幅を行う工程;
3)前記増幅されたDNA断片の存在の有無を評価する工程;
を含む、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害活性を有する物質を用いて細胞性免疫を増強する対象をスクリーニングする方法。 - ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害活性を有する物質がバルプロ酸である、請求項21または請求項22に記載のヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害活性を有する物質を用いて細胞性免疫を増強する対象をスクリーニングする方法。
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