JP2022505884A - ｐ５３ＷＴ腫瘍の処置の方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ｐ５３野生型（ＷＴ）腫瘍を処置する方法に関する。特に、本発明は、マウス二重微小染色体２（ＭＤＭ２）阻害剤、例えばＨＤＭ２０１の、カゼインキナーゼ１アルファ（ＣＫ１α）分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤、例えばレナリドミドと一緒の組み合わせに基づく、ｐ５３ＷＴ腫瘍のための新規の療法を提供する。組み合わせは、固形及び血液ｐ５３ＷＴ腫瘍、例えばメルケル細胞癌（ＭＣＣ）又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の処置において使用され得る。
Description
関連出願及び支援
本出願は、その内容が参照により全体として本明細書に援用される、２０１８年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７５２３８２号明細書に対する優先権及びその利益を主張する。
本出願は、その内容が参照により全体として本明細書に援用される、２０１８年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７５２３８２号明細書に対する優先権及びその利益を主張する。
本発明は、政府支援を受け、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより授与された助成金番号Ｒ０１ ＣＡ０６３１１３ Ｒ０１ ＣＡ１７３０２３及びＰ０１ ＣＡ２０３６５５の下でなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
本発明は、ｐ５３野生型（ＷＴ）腫瘍を処置する方法に関する。特に、本発明は、マウス二重微小染色体２（ＭＤＭ２）阻害剤の、カゼインキナーゼ１アルファ（ＣＫ１α）分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤と一緒の組み合わせに基づく、ｐ５３ＷＴ腫瘍のための新規の療法を提供する。
メルケル細胞癌（ＭＣＣ）は、皮膚の攻撃性神経内分泌癌であり、米国での罹患率は、直近２０年において３倍になっている［１，２］。２００８年、Ｆｅｎｇらは、１０個のＭＣＣ腫瘍のうちの８つにおいてクローン的にインテグレートされたメルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ、ＭＣＰｙＶ）を発見した［３］。ＭＣＶ陽性ＭＣＣは、ＭＣＶゲノムのインテグレートコピーを含有し、スモールＴ抗原（ＳＴ）及びラージＴ抗原（ＬＴ）のトランケート形態を発現する［４］。ＭＣＣ腫瘍関連トランケートＬＴは、Ｎ末端ＬＸＣＸＥ、ＲＢ結合モチーフを保持するが、ウイルス複製に要求されるＣ末端ＤＮＡ結合及びヘリカーゼドメインを欠失する［３］。ＭＣＶ ＳＴ及びトランケートＬＴの発現は、いくつかの細胞タイプにおける増殖及び形質転換を促進し得、ＭＣＣにおけるそれらの発癌的役割と一致する［５］。
原型ポリオーマウイルスサル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）ＬＴは、網膜芽細胞腫関連タンパク質ＲＢ（ＲＢ１）及び細胞腫瘍抗原ｐ５３（ＴＰ５３）に結合し、それらの腫瘍抑制機能を不活性化させる［６］。対照的に、ＭＣＶ ＬＴは、ＲＢに結合するが、ｐ５３に結合しない［６］。ＭＣＣの次世代シーケンシングは、ウイルス陰性ＭＣＣが典型的にはｐ５３及びＲＢ突然変異をＵＶ損傷シグネチャーと共に保有することを明らかにする［７，８］。対照的に、ウイルス陽性ＭＣＣは、通常、野生型ＲＢ及びｐ５３を含有し、ＵＶ損傷についてのエビデンスを含有しない［７，８］。ウイルス陽性ＭＣＣにおける野生型ｐ５３の存在を考慮して、本発明者らは、ＭＣＶ Ｔ抗原がｐ５３活性を機能的に不活性化させ得ることを疑った。
ｐ５３は、広範な癌において突然変異される。代わりに、野生型ｐ５３は、ＭＤＭ２、ｐ５３を標的化するユビキチンリガーゼ又はＭＤＭ４（ＭＤＭＸ）の過剰発現により機能的に不活性化され得る［９，１０］。ＭＤＭ２及びＭＤＭ４の両方は、Ｎ末端ｐ５３結合及びＣ末端ＲＩＮＧドメインを有する類似の構造を有する［１１］。ＭＤＭ４は、ｐ５３を直接ユビキチン化しないが、そのＲＩＮＧドメインは、ＭＤＭ２へのユビキチンの動員を容易にする［１１］。ＭＤＭ４は、ｐ５３への結合を低減させる自己阻害ドメインも有する［１２］。ＭＤＭ４自己阻害相互作用は、カゼインキナーゼ１アルファ（ＣＫ１α、ＣＳＮＫ１Ａ１）により軽減され得る［１３］。
本発明は、対象におけるｐ５３ＷＴ腫瘍の処置における使用のための、ＭＤＭ２阻害剤と、カゼインキナーゼ１アルファ（ＣＫ１α）分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤とを含む新規の組み合わせを提供する。
本発明に係る組み合わせにおいて、ＭＤＭ２阻害剤は、ヌトリン－３、イダサヌトリン（ＲＧ７３８８、ＲＯ５５０３７８１、Ｒｏｃｈｅ）、ＲＧ７７７５（ＲＯ６８３９９２１、Ｒｏｃｈｅ）、ＲＯ５０４５３３７（Ｒｏｃｈｅ）、ＡＭＧ２３２（Ａｍｇｅｎ）、ＤＳ３０３２（ＤＳ３０３２ｂ、Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ）、ＡＬＲＮ－６９２４（Ａｉｌｅｒｏｎ）、ＫＲＴ－２３２（Ｋａｒｔｏｓ）、ＡＴＳＰ－７０４１、ＣＧＭ０９７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びＨＤＭ２０１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）からなる群から選択され得、好ましくはＨＤＭ２０１、即ち（Ｓ）－５－（５－クロロ－１－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－ピリジン－３－イル）－６－（４－クロロ－フェニル）－２－（２，４－ジメトキシ－ピリミジン－５－イル）－１－イソプロピル－５，６－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［３，４－ｄ］イミダゾール－４－オンである。
本発明に係る組み合わせにおいて、カゼインキナーゼ１アルファ（ＣＫ１α）分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤は、サリドマイド、ポマリドミド、レナリドミド及びＳＣ－２４－ＵＲ９９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、即ち４－（３－アミノ－１－（４－クロロ－５－メチル－６－（メチルアミノ）ピリジン－３－イル）－５－フルオロ－１Ｈ－インダゾール－６－イル）ナフタレン－１－オールからなる群から選択され得、好ましくはレナリドミド、即ちＲＥＶＬＩＭＩＤとも称される（ＲＳ）－３－（７－アミノ－３－オキソ－１Ｈ－イソインドール－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオンである。
本発明は、特にＭＤＭ２阻害剤ＨＤＭ２０１とＣＫ１α分解剤レナリドミドとを有するこのような組み合わせを提供する。
本発明に係る組み合わせは、更なる抗癌剤を含み得る。
本発明に係る更なる抗癌剤は、
ＦＬＴ３阻害剤（例えば、ギルテリニブ、キザルチニブ、ミドスタウリン）、
ＢＣＬ２阻害剤（例えば、ナビトクラクス、ベネトクラクス）、
他のＭＤＭ２阻害剤（例えば、ヌトリン－３、イダサヌトリン、ＡＭＧ２３２、ＤＳ－３０３２Ｂ、ＡＬＲＮ６９２４／ＡＴＳＰ７０４１）、
メチル化抑制剤（ＨＭＡ）（例えば、Ｖｉｄａｚａ［アザシチジン、５－アザシチジン］、Ｄａｃｏｇｅｎ［デシタビン］、グアデシタビン）、
アントラサイクリン（例えば、イダルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン）、
抗ＣＤ３３抗体（例えば、Ｍｙｌｏｔａｒｇ［ゲムツズマブ］、バダスツキシマブ）、及び
他の薬剤（例えば、ＡｒａＣ［シタラビン、ａｒａｃｙｔｉｎｅ］）
から選択され得る。
ＦＬＴ３阻害剤（例えば、ギルテリニブ、キザルチニブ、ミドスタウリン）、
ＢＣＬ２阻害剤（例えば、ナビトクラクス、ベネトクラクス）、
他のＭＤＭ２阻害剤（例えば、ヌトリン－３、イダサヌトリン、ＡＭＧ２３２、ＤＳ－３０３２Ｂ、ＡＬＲＮ６９２４／ＡＴＳＰ７０４１）、
メチル化抑制剤（ＨＭＡ）（例えば、Ｖｉｄａｚａ［アザシチジン、５－アザシチジン］、Ｄａｃｏｇｅｎ［デシタビン］、グアデシタビン）、
アントラサイクリン（例えば、イダルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン）、
抗ＣＤ３３抗体（例えば、Ｍｙｌｏｔａｒｇ［ゲムツズマブ］、バダスツキシマブ）、及び
他の薬剤（例えば、ＡｒａＣ［シタラビン、ａｒａｃｙｔｉｎｅ］）
から選択され得る。
本発明に係る組み合わせにより処置することができるｐ５３ＷＴ腫瘍は、固形腫瘍又は血液腫瘍であり得る。固形腫瘍は、肉腫、例えば脂肪肉腫又は軟部組織肉腫、リンパ腫、例えば非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、特にマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、黒色腫、例えば皮膚黒色腫又はブドウ膜黒色腫、芽細胞腫（例えば、神経芽細胞腫）、結腸腫瘍、結腸直腸腫瘍、腎腫瘍及び肝腫瘍又は皮膚癌、例えばメルケル細胞癌（ＭＣＣ）、特にメルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）陽性ＭＣＣであり得る。血液腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又は急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）であり得る。
特に、本発明は、以下の実施形態を提供する。
１．（ａ）マウス二重微小染色体２（ＭＤＭ２）阻害剤と、（ｂ）カゼインキナーゼ１アルファ（ＣＫ１α）分解剤及び／又はマウス二重微小染色体４（ＭＤＭ４）阻害剤とを含む組み合わせ。
２．対象におけるｐ５３野生型（ＷＴ）腫瘍の処置における使用のための、（ａ）ＭＤＭ２阻害剤と、（ｂ）ＣＫ１α分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤とを含む組み合わせ。
３．対象におけるｐ５３ＷＴ腫瘍を処置する方法であって、対象に、（ａ）ＭＤＭ２阻害剤と、（ｂ）ＣＫ１α分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤との組み合わせを投与することを含む方法。
４．ＭＤＭ２阻害剤は、ヌトリン－３、イダサヌトリン（ＲＧ７３８８、ＲＯ５５０３７８１）、ＲＧ７７７５（ＲＯ６８３９９２１）、ＡＭＧ２３２、ＤＳ３０３２（ＤＳ３０３２ｂ）、ＡＬＲＮ－６９２４、ＡＴＳＰ－７０４１、ＣＧＭ０９７及びＨＤＭ２０１、即ち（Ｓ）－５－（５－クロロ－１－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－ピリジン－３－イル）－６－（４－クロロ－フェニル）－２－（２，４－ジメトキシ－ピリミジン－５－イル）－１－イソプロピル－５，６－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［３，４－ｄ］イミダゾール－４－オンからなる群から選択される、実施形態１の組み合わせ、実施形態２の使用のための組み合わせ又は実施形態３の方法。
５．ＭＤＭ２阻害剤は、ヌトリン－３、イダサヌトリン及びＨＤＭ２０１からなる群から選択される、実施形態１の組み合わせ、実施形態２の使用のための組み合わせ又は実施形態３の方法。
６．ＭＤＭ２阻害剤は、ＨＤＭ２０１である、実施形態１の組み合わせ、実施形態２の使用のための組み合わせ又は実施形態３の方法。
７．ＣＫ１α分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤は、サリドマイド、ポマリドミド、レナリドミド、即ちＲＥＶＬＩＭＩＤとも称される（ＲＳ）－３－（７－アミノ－３－オキソ－１Ｈ－イソインドール－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン及びＳＣ－２４－ＵＲ９９、即ち４－（３－アミノ－１－（４－クロロ－５－メチル－６－（メチルアミノ）ピリジン－３－イル）－５－フルオロ－１Ｈ－インダゾール－６－イル）ナフタレン－１－オールからなる群から選択される、実施形態１、４～６のいずれか１つの組み合わせ、実施形態２、４～６のいずれか１つの使用のための組み合わせ又は実施形態３～６のいずれか１つの方法。
８．ＣＫ１α分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤は、レナリドミド及びＳＣ－２４－ＵＲ９９からなる群から選択される、実施形態１、４～６のいずれか１つの組み合わせ、実施形態２、４～６のいずれか１つの使用のための組み合わせ又は実施形態３～６のいずれか１つの方法。
９．ＭＤＭ２阻害剤は、ヌトリン－３、イダサヌトリン及びＨＤＭ２０１からなる群から選択され、ＣＫ１α分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤は、レナリドミド及びＳＣ－２４－ＵＲ９９からなる群から選択される、実施形態１の組み合わせ、実施形態２の使用のための組み合わせ又は実施形態３の方法。
１０．ＭＤＭ２阻害剤は、ＨＤＭ２０１であり、且つＣＫ１α分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤は、レナリドミドである、実施形態１の組み合わせ、実施形態２の使用のための組み合わせ又は実施形態３の方法。
１１．ｐ５３ＷＴ腫瘍は、固形腫瘍である、実施形態２、４～１０のいずれか１つの使用のための組み合わせ又は実施形態３～１０のいずれか１つの方法。
１２．固形腫瘍は、肉腫、例えば脂肪肉腫又は軟部組織肉腫、リンパ腫、例えば非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、特にマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、黒色腫、例えば皮膚黒色腫又はブドウ膜黒色腫、芽細胞腫（例えば、神経芽細胞腫）、結腸腫瘍、結腸直腸腫瘍、腎腫瘍、肝腫瘍及び皮膚癌、例えばメルケル細胞癌（ＭＣＣ）からなる群から選択される、実施形態１１の使用のための組み合わせ又は実施形態１１のいずれか１つの方法。
１３．固形腫瘍は、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）である、実施形態１１の使用のための組み合わせ又は実施形態１１の方法。
１４．メルケル細胞癌（ＭＣＣ）は、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）陽性ＭＣＣである、実施形態１３の使用のための組み合わせ又は実施形態１３の方法。
１５．ｐ５３ＷＴ腫瘍は、血液腫瘍（又は血液悪性腫瘍）である、実施形態２、４～１０のいずれか１つの使用のための組み合わせ又は実施形態３～１０のいずれか１つの方法。
１６．血液腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）及び急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）からなる群から選択される、実施形態１５の使用のための組み合わせ又は実施形態１５の方法。
１７．血液腫瘍は、多発性骨髄腫（ＭＭ）及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）からなる群から選択される、実施形態１５の使用のための組み合わせ又は実施形態１５の方法。
１８．血液腫瘍は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である、実施形態１５の使用のための組み合わせ又は実施形態１５の方法。
１９．ＭＤＭ２阻害剤は、ＨＤＭ２０１であり、ＣＫ１α分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤は、レナリドミドであり、ｐ５３ＷＴ腫瘍は、ＭＣＶ陽性ＭＣＣである、実施形態２の使用のための組み合わせ又は実施形態３の方法。
２０．ＭＤＭ２阻害剤は、ＨＤＭ２０１であり、ＣＫ１α分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤は、レナリドミドであり、ｐ５３ＷＴ腫瘍は、ＭＤＳである、実施形態２の使用のための組み合わせ又は実施形態３の方法。
２１．１つ以上の更なる抗癌剤を更に含む、実施形態１～２０のいずれか１つの組み合わせ／使用のための組み合わせ／方法。
本明細書に記載される組み合わせは、有利な抗癌効果、例えば抗癌効果の増強、毒性の低減及び／又は副作用の低減を提供できる。例えば、第１の治療剤、例えば本明細書に開示される治療剤のいずれか及び第２の治療剤、例えば１つ以上の追加の治療剤又は全ては、単剤療法の用量と比較して同じ治療効果を達成するのに要求されることになるものより少ない投与量で投与され得る。従って、前述の組み合わせ療法を使用して、癌を含む増殖性障害を処置するための組成物及び方法が開示される。
一部の実施形態において、本明細書に記載される組み合わせにより、対象、例えば本明細書に記載される癌を有する対象を処置する方法は、治療レジメンの一部としての組み合わせの投与を含む。ある実施形態において、治療レジメンは、本明細書に記載される１つ以上、例えば２、３又は４つの組み合わせを含む。一部の実施形態において、治療レジメンは、少なくとも１つの相及び任意選択で２つの相、例えば第１相及び第２相において対象に投与される。一部の実施形態において、第１相は、用量漸増相を含む。一部の実施形態において、第１相は、１つ以上の用量漸増相、例えば第１、第２又は第３の用量漸増相を含む。一部の実施形態において、用量漸増相は、例えば、本明細書に記載される通りの２、３、４つ又はそれを超える治療剤を含む組み合わせの投与を含む。一部の実施形態において、第２相は、用量拡大相を含む。一部の実施形態において、用量拡大相は、例えば、本明細書に記載される通りの２、３、４つ又はそれを超える治療剤を含む組み合わせの投与を含む。一部の実施形態において、用量拡大相は、用量漸増相と同じ２、３、４つ又はそれを超える治療剤を含む。
一部の実施形態において、第１の用量漸増相は、２つの治療剤、例えば本明細書に記載される２つの治療剤を含む組み合わせの投与を含み、治療剤の１つ又は両方に関する最大耐量（ＭＴＤ）又は拡大のための推奨用量（ＲＤＥ）が決定される。一部の実施形態において、第１の用量漸増相の前に、対象は、単剤として第１の用量漸増相において投与される治療剤の１つと共に投与された。
一部の実施形態において、第２の用量漸増相は、３つの治療剤、例えば本明細書に記載される３つの治療剤を含む組み合わせの投与を含み、治療剤の１、２つ又は全てに関する最大耐量（ＭＴＤ）又は拡大のための推奨用量（ＲＤＥ）が決定される。一部の実施形態において、第２の用量漸増相は、第１の用量漸増相が終了した後に始まる。一部の実施形態において、第２の用量漸増相は、第１の用量漸増相において投与される治療剤の１つ以上の投与を含む。一部の実施形態において、第２の用量漸増相は、第１の用量漸増相を実施することなく実施される。
一部の実施形態において、第３の用量漸増相は、４つの治療剤、例えば本明細書に記載される４つの治療剤を含む組み合わせの投与を含み、治療剤の１、２、３つ又は全ての最大耐量（ＭＴＤ）又は拡大のための推奨用量（ＲＤＥ）が決定される。一部の実施形態において、第３の用量漸増相は、第１又は第２の用量漸増相が終了した後に始まる。一部の実施形態において、第３の用量漸増相は、第２の用量漸増相において投与される治療剤の１つ以上（例えば、全て）の投与を含む。一部の実施形態において、第３の用量漸増相は、第１の用量漸増相において投与される治療剤の１つ以上の投与を含む。一部の実施形態において、第３の用量漸増相は、第１、第２又は両方の用量漸増相を実施することなく実施される。
一部の実施形態において、用量拡大相は、第１、第２又は第３の用量漸増相が終了した後に始まる。一部の実施形態において、用量拡大相は、用量漸増相、例えば第１、第２又は第３の用量漸増相において投与される組み合わせの投与を含む。ある実施形態において、生検は、用量拡大相において対象から得られる。
理論に束縛されるものではないが、一部の実施形態において、用量漸増相及び用量拡大相を含む治療レジメンは、組み合わせのための新規の薬剤若しくはレジメンの投入、組み合わせの迅速な生成及び／又は許容できる組み合わせの安全性及び活性の評価を可能にすると考えられる。
ここで、本発明者らは、ＭＣＶ ＳＴが転写アクチベーターとして機能して、次いでＭＤＭ４と協調するＭＤＭ２及びＣＫ１αのレベルを増大させて、ＭＣＣにおいてｐ５３機能を阻害することを実証する。本発明者らは、ＭＣＣにおいてＭＤＭ２及びＭＤＭ４の両方を標的化する相乗的有効性を更に実証する。
メルケル細胞癌（ＭＣＣ）は、攻撃性皮膚癌である。ウイルス陰性（メルケル細胞ポリオーマウイルス、ＭＣＶ）ＭＣＣは、ＲＢ及びｐ５３中の不活性化突然変異を含有する一方、ＭＣＶ陽性ＭＣＣは、通常、野生型ＲＢ及びｐ５３を含有する。本発明者らは、ＲＢへのＭＣＶラージＴ抗原結合がｐ５３活性化をもたらす一方、ＭＣＶスモールＴ抗原がＭＤＭ２及びＣＫ１α、ＭＤＭ４のアクチベーターのレベルを増大させることによりｐ５３活性化を低減させることを実証する。レナリドミド又は特異的ＭＤＭ４阻害剤によるＣＫ１αの標的化分解は、ＭＤＭ２阻害剤と相乗的に作用してｐ５３を活性化させ、アポトーシスを誘導する。本発明者らの研究は、ＭＣＣにおけるｐ５３のＭＣＶ制御の背後の機序を明らかにし、ｐ５３野生型腫瘍におけるＭＤＭ２及びＭＤＭ４の組み合わせによる標的化の有用性を実証する。
メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）は、全てのメルケル細胞癌（ＭＣＣ）、皮膚の高攻撃性神経内分泌癌のおよそ８０％に寄与する。ＭＣＶ陽性ＭＣＣは、スモールＴ抗原（ＳＴ）及びラージＴ抗原（ＬＴ）のトランケート形態を発現し、通常、野生型ｐ５３（ＴＰ５３）及びＲＢ（ＲＢ１）を含有する。対照的に、ウイルス陰性ＭＣＣは、ＴＰ５３及びＲＢ１中の不活性化突然変異を含有する。ＭＣＶトランケートＬＴは、ＲＢに結合し、それを阻害し得る一方、ｐ５３に結合しない。本発明者らは、ここで、ＭＣＶ ＬＴがＲＢに結合し、ＡＲＦ、ＭＤＭ２の阻害剤のレベルの増大及びｐ５３の活性化をもたらすことを開示する。しかしながら、ＳＴの同時発現は、ｐ５３活性化を低減させた。
ＭＣＶ ＳＴは、ＭＹＣホモログＭＹＣＬ（Ｌ－Ｍｙｃ）をＥＰ４００クロマチンリモデラー複合体に動員し、特異的標的遺伝子をトランス活性化させる。本発明者らは、ＭＣＶ陽性ＭＣＣ細胞系中のＥＰ４００の枯渇がｐ５３標的遺伝子発現の増大をもたらすことを観察した。本発明者らは、ＭＣＶ ＳＴ－ＭＹＣＬ－ＥＰ４００複合体がｐ５３を機能的に不活性化させ得ることを疑ったが、根本的な機序は、公知でなかった。ＥＰ４００枯渇後のＣｈＩＰ及びＲＮＡ－ｓｅｑ統合分析は、ＭＤＭ２及びＣＫ１α、ＭＤＭ４のアクチベーターをＳＴ－ＭＹＣＬ－ＥＰ４００複合体の標的遺伝子として同定した。更に、ＭＣＶ陽性ＭＣＣ細胞は、高レベルのＭＤＭ４を発現した。ＭＤＭ２阻害剤を、ＣＫ１αを標的化するレナリドミド又はＭＤＭ４阻害剤と組み合わせることは、ｐ５３の相乗的活性化を引き起こし、ＭＣＶ陽性ＭＣＣ細胞及びマウス中のＭＣＣ由来ゼノグラフトにおけるアポトーシス応答をもたらした。これらの結果は、ウイルス陽性ＭＣＣ及び他のｐ５３野生型腫瘍におけるＭＤＭ２及びＭＤＭ４の二重標的化を支持する。
ＬＴは、ｐ５３応答を活性化させ、ＳＴは、それを減衰させる。
正常細胞中のｐ５３に対するＭＣＶ Ｔ抗原の効果を試験するため、ＧＦＰ又はＬＴの腫瘍由来トランケート若しくは全長形態を発現するドキシサイクリン誘導性ベクターをＩＭＲ９０二倍体肺線維芽細胞中に導入した（図１Ａ、Ｓ１Ａ）。ＬＴのトランケート形態としては、それぞれインタクトＬＸＣＸＥモチーフを含有するＬ２１（残基１～２９２をコード）、１６２（残基１～３２０）及び１６８（残基１～２７５）が挙げられる［６］。ＩＭＲ９０中のＬＴ－Ｌ２１又はＬＴ－１６２発現は、ＲＴ－ｑＰＣＲにより評価して、ＡＲＦ並びにＧＤＦ１５及びｐ２１（ＣＤＫＮ１Ａ）を含むいくつかのｐ５３標的遺伝子のレベルを有意に増大させた（図１Ａ）。ＲＢの阻害は、Ｅ２Ｆ転写因子を活性化させ、ＡＲＦのレベルの増大をもたらす［１０］。ＡＲＦは、主要なｐ５３分解Ｅ３リガーゼＭＤＭ２の強力な阻害剤である［１４］。ＬＴ発現は、ｐ５３並びにｐ５３活性化を示すホスホ－セリン１５ｐ５３（Ｐ－ｐ５３）及びｐ２１のタンパク質レベルを増大させた（Ｓ１Ａ）。ＬＴ－１６２の発現も開裂ＰＡＲＰ（＊＊）レベルの増大をもたらし、アポトーシス応答を示した。
正常細胞中のｐ５３に対するＭＣＶ Ｔ抗原の効果を試験するため、ＧＦＰ又はＬＴの腫瘍由来トランケート若しくは全長形態を発現するドキシサイクリン誘導性ベクターをＩＭＲ９０二倍体肺線維芽細胞中に導入した（図１Ａ、Ｓ１Ａ）。ＬＴのトランケート形態としては、それぞれインタクトＬＸＣＸＥモチーフを含有するＬ２１（残基１～２９２をコード）、１６２（残基１～３２０）及び１６８（残基１～２７５）が挙げられる［６］。ＩＭＲ９０中のＬＴ－Ｌ２１又はＬＴ－１６２発現は、ＲＴ－ｑＰＣＲにより評価して、ＡＲＦ並びにＧＤＦ１５及びｐ２１（ＣＤＫＮ１Ａ）を含むいくつかのｐ５３標的遺伝子のレベルを有意に増大させた（図１Ａ）。ＲＢの阻害は、Ｅ２Ｆ転写因子を活性化させ、ＡＲＦのレベルの増大をもたらす［１０］。ＡＲＦは、主要なｐ５３分解Ｅ３リガーゼＭＤＭ２の強力な阻害剤である［１４］。ＬＴ発現は、ｐ５３並びにｐ５３活性化を示すホスホ－セリン１５ｐ５３（Ｐ－ｐ５３）及びｐ２１のタンパク質レベルを増大させた（Ｓ１Ａ）。ＬＴ－１６２の発現も開裂ＰＡＲＰ（＊＊）レベルの増大をもたらし、アポトーシス応答を示した。
ＬＴ及びＳＴは、ＭＣＣ腫瘍においてインテグレートＭＣＰｙＶウイルスＤＮＡからスプライスバリアントとして同時発現される。ＩＭＲ９０細胞系においてこれを模倣するため、本発明者らは、ＳＴを同時発現するＬＴ－Ｌ２１のゲノムバージョンを導入した。ＳＴがＬＴ－Ｌ２１と同時発現された場合、ＬＴ－Ｌ２１のみに対する応答と比較して低いレベルのｐ５３活性化（ｐ２１、ｐ－ｐ５３及びアセチル－リジン３８２又はＡＣ－ｐ５３）が観察された（図１Ｂ、Ｓ１Ｂ）。この結果は、トランケートＬＴがｐ５３を活性化させ得る一方、ＳＴが同時発現される場合にこの応答を低減させ得ることを示す。ＡＲＦのレベルの増大がＲＢへのＬＴ結合を要求したか否かを決定するため、本発明者らは、ＬＴ－Ｌ２１のＬＸＣＸＥモチーフ中の点置換突然変異（Ｅ２１６Ｋ）を導入した。ＨＣＴ１１６細胞中で安定的に発現される場合、Ｌ２１－Ｅ２１６Ｋは、ＲＢを共沈させ得なかったが、ＬＴの異なる領域に結合するＶＰＳ３９への結合を保持した（Ｓ１Ｃ）［５］。ＩＭＲ９０細胞中で発現される場合、Ｌ２１－Ｅ２１６Ｋは、ＡＲＦのレベルも、ｐ２１のレベルも、ｐ５３のレベルも、ＡＣ－ｐ５３のレベルも増大させなかった（図１Ｃ）。これらの結果は、ＲＢへのＬＴ結合がＡＲＦのレベルの増大及びｐ５３応答の活性化に寄与することを示す。注目すべきことに、ＳＴがＬ２１－Ｅ２１６Ｋと同時発現された場合、ＭＤＭ２のレベルの増大が検出されたが、ｐ２１のレベルの増大が検出されなかった。
ＭＤＭ２及びＣＫ１αは、ＳＴ－ＭＹＣＬ－ＥＰ４００複合体の転写標的である。
本発明者らは、ＭＣＶ ＳＴがＭＹＣホモログＭＹＣＬ（Ｌ－Ｍｙｃ）をＥＰ４００クロマチンリモデラー複合体に動員して特異的遺伝子プロモーターに結合させ、それらの発現を活性化させることを近年報告した［１５］。ＭＫＬ－１細胞中でＳＴ－ＭＹＣＬ－ＥＰ４００複合体により調節される遺伝子を同定するため、３つの異なるｓｈＲＮＡを使用するＥＰ４００枯渇後にＲＮＡ－ｓｅｑを実施した［１５］。報告されたＲＮＡ－ｓｅｑ結果を使用して、本発明者らは、公知のｐ５３標的遺伝子の遺伝子発現の変化を評価した［９］。ＥＰ４００枯渇は、ボルケーノプロットにより可視化される通り、ｐ２１（ＣＤＫＮ１Ａ）を含む多くのｐ５３標的遺伝子のレベルの増大をもたらした（図２Ａ）。１．５の倍率変化カットオフを使用して、合計１９８個のｐ５３標的遺伝子のうちの５９個の遺伝子が上方調節され、１７個が下方調節された（表Ｓ１）［９］。ＥＰ４００枯渇はまた、ＭＤＭ２Ｅ３リガーゼ及びＣＫ１αレベルの減少をもたらした（図２Ｂ、Ｓ２Ａ～Ｃ）。ＭＤＭ２及びＭＤＭ４は、ｐ５３のトランス活性化ドメインに直接結合してｐ５３活性化を遮断するＮ末端ｐ５３結合ドメインを含有する［１１］。ＭＤＭ４は、ｐ５３に寄与するそれ自体の活性を調節し得る。ＭＤＭ４のＮ末端ｐ５３結合ドメインは、その中央Ｗモチーフ領域との分子内相互作用を形成し、それによりｐ５３への結合を低減させる［１２］。ＣＫ１α（ＣＳＮＫ１Ａ）は、ＭＤＭ４に結合し、それをリン酸化し、次いでこの自己阻害相互作用を防止し、ＭＤＭ４を活性化させるセリン／トレオニンキナーゼである［１３］。ＲＴ－ｑＰＣＲ及びウエスタンブロッティングは、ＭＫＬ－１細胞中でＥＰ４００ノックダウン時にｐ２１レベルが増大し、ＭＤＭ２及びＣＫ１αレベルが減少したことを裏付けた（図２Ｂ、Ｓ１Ｃ）。
本発明者らは、ＭＣＶ ＳＴがＭＹＣホモログＭＹＣＬ（Ｌ－Ｍｙｃ）をＥＰ４００クロマチンリモデラー複合体に動員して特異的遺伝子プロモーターに結合させ、それらの発現を活性化させることを近年報告した［１５］。ＭＫＬ－１細胞中でＳＴ－ＭＹＣＬ－ＥＰ４００複合体により調節される遺伝子を同定するため、３つの異なるｓｈＲＮＡを使用するＥＰ４００枯渇後にＲＮＡ－ｓｅｑを実施した［１５］。報告されたＲＮＡ－ｓｅｑ結果を使用して、本発明者らは、公知のｐ５３標的遺伝子の遺伝子発現の変化を評価した［９］。ＥＰ４００枯渇は、ボルケーノプロットにより可視化される通り、ｐ２１（ＣＤＫＮ１Ａ）を含む多くのｐ５３標的遺伝子のレベルの増大をもたらした（図２Ａ）。１．５の倍率変化カットオフを使用して、合計１９８個のｐ５３標的遺伝子のうちの５９個の遺伝子が上方調節され、１７個が下方調節された（表Ｓ１）［９］。ＥＰ４００枯渇はまた、ＭＤＭ２Ｅ３リガーゼ及びＣＫ１αレベルの減少をもたらした（図２Ｂ、Ｓ２Ａ～Ｃ）。ＭＤＭ２及びＭＤＭ４は、ｐ５３のトランス活性化ドメインに直接結合してｐ５３活性化を遮断するＮ末端ｐ５３結合ドメインを含有する［１１］。ＭＤＭ４は、ｐ５３に寄与するそれ自体の活性を調節し得る。ＭＤＭ４のＮ末端ｐ５３結合ドメインは、その中央Ｗモチーフ領域との分子内相互作用を形成し、それによりｐ５３への結合を低減させる［１２］。ＣＫ１α（ＣＳＮＫ１Ａ）は、ＭＤＭ４に結合し、それをリン酸化し、次いでこの自己阻害相互作用を防止し、ＭＤＭ４を活性化させるセリン／トレオニンキナーゼである［１３］。ＲＴ－ｑＰＣＲ及びウエスタンブロッティングは、ＭＫＬ－１細胞中でＥＰ４００ノックダウン時にｐ２１レベルが増大し、ＭＤＭ２及びＣＫ１αレベルが減少したことを裏付けた（図２Ｂ、Ｓ１Ｃ）。
ＳＴ、ＭＡＸ（ＭＹＣＬと二量体化する）及びＥＰ４００に対する抗体を用いるＣｈＩＰ－ｓｅｑは、ＭＤＭ２及びＣＫ１αプロモーターの濃縮を明らかにした（Ｓ２Ｅ）［１５］。本発明者らは、ＭＡＸ、ＳＴ及びＥＰ４００についてＣｈＩＰ－ｑＰＣＲを実施し、それらのプロモーターの特異的濃縮を観察した（図２Ｃ）。本発明者らは、ＭＫＬ－１細胞中で特異的ｓｈＲＮＡを使用してＳＴ又はＳＴ及びＬＴを枯渇させ、ＭＤＭ２及びＣＫ１αのレベルがｓｈＲＮＡの発現を減少させることを見出した（図２Ｄ）［１６］。この結果は、ＲＴ－ｑＰＣＲ及びＣｈＩＰデータと一緒に、ＭＤＭ２及びＣＫ１αがＳＴ－ＭＹＣＬ－ＥＰ４００複合体の直接的な転写標的であることを示す。注目すべきことに、ＳＴの枯渇時にＭＤＭ４レベルが減少したが、本発明者らは、ＳＴによるＭＤＭ４の直接的な活性化についてのエビデンスを見出さなかった。ＳＴは、ｐ５３に寄与するＭＤＭ４活性を活性化させるように機能し得るＣＫ１αのレベルを増大させる。
ＭＤＭ２は、ｐ５３標的遺伝子であるため、ＭＣＶ Ｔ抗原は、ｐ５３の活性化によりＭＤＭ２レベルを間接的に増大させることが可能である［９］。この可能性を排除するため、本発明者らは、内因性ｐ５３に結合し、それを不活性化させるｐ５３のドミナントネガティブバージョン（ｐ５３ＤＤ）をＩＭＲ９０細胞中に導入した［１７］。ＩＭＲ９０－ｐ５３ＤＤ細胞をＭＹＣＬ及びＳＴと共にＭＣＶ ＬＴ－Ｌ２１により更に形質導入した［１７］。本発明者らは、ＭＤＭ２及びＣＫ１αプロモーターへのＳＴ結合をＣｈＩＰ－ｑＰＣＲにより検出し、ＭＤＭ２プロモーターに対するＥＰ４００濃縮がＭＣＶ Ｔ抗原の存在下で増大することを観察した（図２Ｅ、Ｓ２Ｆ）。ヌトリン－３によるＭＤＭ２阻害剤処置は、ｐ５３、ｐ５３活性化を示すｐ－ｐ５３及びＰＵＭＡレベルを増大させなかった（図２Ｆ、Ｓ１Ｄ）。ＳＴ－ＭＹＣＬ－ＥＰ４００複合体がｐ５３と無関係にそれらのプロモーターに結合することを更に決定するため、本発明者らは、ＭＫＬ－１中でｓｈＲＮＡを用いてｐ５３を枯渇させ、ＥＰ４００及びＳＴのＣｈＩＰ－ｑＰＣＲを実施した（Ｓ２Ｇ）。本発明者らは、ｐ５３がＭＤＭ２及びＣＫ１αプロモーターに対するＥＰ４００及びＳＴ濃縮に影響しないことを見出した。これらの結果は、ＭＣＶ ＳＴがＭＣＣ及びＩＭＲ９０細胞中でｐ５３と無関係にＭＤＭ２及びＣＫ１αをトランス活性化させることを示す。
ＭＤＭ４は、ウイルス陽性ＭＣＣにおいて過剰発現される。
ＭＤＭ４の過剰発現は、野生型ｐ５３を有する一部の癌において見出すことができる［１８］。本発明者らは、ＭＤＭ４プライマーの３つのセットを使用してＭＣＣ細胞系中の総ＭＤＭ４（全てのスプライスバリアント）、ＭＤＭ４－ＦＬ（全長）及びＭＤＭ４－Ｓ（ＲＩＮＧドメインを欠くショートバリアント）レベルを評価した［１８］。ウイルス陽性（ＭＫＬ－１、ＭＫＬ－２、ＭＳ－１、ＷａＧａ、ＰｅＴａ及びＢｒｏＬｉ）ＭＣＣ細胞系は、ウイルス陰性（ＵＩＳＯ、ＭＣＣ１３及びＭＣＣ２６）ＭＣＣ系と比べて有意に高いレベルの総ＭＤＭ４及びＭＤＭ４ＦＬを有した（図３Ａ）。更に、ＭＤＭ４－ＦＬとＭＤＭ４－Ｓとの比は、ウイルス陽性系において高かった（Ｓ３Ａ）。本発明者らは、それらのＭＣＣ細胞系中のＭＤＭ４－ＦＬタンパク質レベルを評価した。ウイルス陽性ＭＣＣ細胞系は、ウイルス陰性ＭＣＣ細胞系と比較して高いレベルのＭＤＭ４－ＦＬを発現した（図３Ｂ）。注目すべきことに、ウイルス陰性ＵＩＳＯ細胞系は、高いＭＤＭ４－ＦＬとＭＤＭ４－Ｓとの比を有したが、豊富なレベルのＭＤＭ４タンパク質を発現しなかった（図３Ａ、Ｓ３Ａ）。ウイルス陽性ＭＣＣにおけるｐ５３のＬＴの活性化は、ＭＤＭ２又はＭＤＭ４発現への依存性を作出し得る。１０１個のＭＣＣ腫瘍の標的化次世代シーケンシング（オンコパネル）は、ＭＣＶの存在にもかかわらず、ＭＤＭ４の高頻度の低いコピー増加（３～８コピー）を明らかにした（Ｓ３Ｂ）［１９］。
ＭＤＭ４の過剰発現は、野生型ｐ５３を有する一部の癌において見出すことができる［１８］。本発明者らは、ＭＤＭ４プライマーの３つのセットを使用してＭＣＣ細胞系中の総ＭＤＭ４（全てのスプライスバリアント）、ＭＤＭ４－ＦＬ（全長）及びＭＤＭ４－Ｓ（ＲＩＮＧドメインを欠くショートバリアント）レベルを評価した［１８］。ウイルス陽性（ＭＫＬ－１、ＭＫＬ－２、ＭＳ－１、ＷａＧａ、ＰｅＴａ及びＢｒｏＬｉ）ＭＣＣ細胞系は、ウイルス陰性（ＵＩＳＯ、ＭＣＣ１３及びＭＣＣ２６）ＭＣＣ系と比べて有意に高いレベルの総ＭＤＭ４及びＭＤＭ４ＦＬを有した（図３Ａ）。更に、ＭＤＭ４－ＦＬとＭＤＭ４－Ｓとの比は、ウイルス陽性系において高かった（Ｓ３Ａ）。本発明者らは、それらのＭＣＣ細胞系中のＭＤＭ４－ＦＬタンパク質レベルを評価した。ウイルス陽性ＭＣＣ細胞系は、ウイルス陰性ＭＣＣ細胞系と比較して高いレベルのＭＤＭ４－ＦＬを発現した（図３Ｂ）。注目すべきことに、ウイルス陰性ＵＩＳＯ細胞系は、高いＭＤＭ４－ＦＬとＭＤＭ４－Ｓとの比を有したが、豊富なレベルのＭＤＭ４タンパク質を発現しなかった（図３Ａ、Ｓ３Ａ）。ウイルス陽性ＭＣＣにおけるｐ５３のＬＴの活性化は、ＭＤＭ２又はＭＤＭ４発現への依存性を作出し得る。１０１個のＭＣＣ腫瘍の標的化次世代シーケンシング（オンコパネル）は、ＭＣＶの存在にもかかわらず、ＭＤＭ４の高頻度の低いコピー増加（３～８コピー）を明らかにした（Ｓ３Ｂ）［１９］。
ＭＤＭ２及びＭＤＭ４の阻害は、ＭＣＣにおいてｐ５３を活性化させる。
本発明者らは、野生型ｐ５３を含有するＭＫＬ－１、ＷａＧａ、ＰｅＴａ及びＢｒｏＬｉ ＭＣＣ細胞系中の総ｐ５３、Ｐ－ｐ５３、Ａｃ－ｐ５３、ｐ２１及びＰＵＭＡのレベルの増大により示される通り、ヌトリン－３ＭＤＭ２阻害剤処置がｐ５３を活性化させるが、不活性化ｐ５３突然変異を保有するＭＳ－１細胞において活性化させないことを観察した（図２Ｆ、図４Ａ、Ｓ２Ｂ）［２０］。近年の報告は、ＣＲＢＮ（セレブロン）Ｅ３リガーゼがレナリドミドの存在下でユビキチン化のためにＣＫ１αを特異的に標的化し得ることを実証した［２１，２２］。本発明者らは、ＭＣＣ細胞中でレナリドミドがＣＫ１αレベルを減少させ、ｐ５３を活性化させ得たか否かを評価した。ＭＫＬ－１細胞をレナリドミドにより、シクロヘキシミドを用いて又は用いずに処置してタンパク質合成を遮断した。ＣＫ１αレベルは、６時間のシクロヘキシミド処置によってそれほど変化しなかったが、レナリドミドの添加後にレベルが急速に減少した（Ｓ４Ａ）。
本発明者らは、野生型ｐ５３を含有するＭＫＬ－１、ＷａＧａ、ＰｅＴａ及びＢｒｏＬｉ ＭＣＣ細胞系中の総ｐ５３、Ｐ－ｐ５３、Ａｃ－ｐ５３、ｐ２１及びＰＵＭＡのレベルの増大により示される通り、ヌトリン－３ＭＤＭ２阻害剤処置がｐ５３を活性化させるが、不活性化ｐ５３突然変異を保有するＭＳ－１細胞において活性化させないことを観察した（図２Ｆ、図４Ａ、Ｓ２Ｂ）［２０］。近年の報告は、ＣＲＢＮ（セレブロン）Ｅ３リガーゼがレナリドミドの存在下でユビキチン化のためにＣＫ１αを特異的に標的化し得ることを実証した［２１，２２］。本発明者らは、ＭＣＣ細胞中でレナリドミドがＣＫ１αレベルを減少させ、ｐ５３を活性化させ得たか否かを評価した。ＭＫＬ－１細胞をレナリドミドにより、シクロヘキシミドを用いて又は用いずに処置してタンパク質合成を遮断した。ＣＫ１αレベルは、６時間のシクロヘキシミド処置によってそれほど変化しなかったが、レナリドミドの添加後にレベルが急速に減少した（Ｓ４Ａ）。
レナリドミド処置単独は、ｐ５３レベルに対して穏やかな正の効果を有した。しかしながら、ヌトリン－３及びレナリドミドを組み合わせた場合、ｐ５３及びｐ５３標的遺伝子のより大きい増大が、野生型ｐ５３を有する細胞系において観察された（図４Ａ、Ｓ４Ｂ）。本発明者らは、定量的ウエスタンブロッティングによりシクロヘキシミドの存在下でヌトリン－３、レナリドミド又はその両方により処置されたＭＫＬ－１細胞におけるｐ５３安定性を評価した（Ｓ４Ｄ）。レナリドミドは、ヌトリン－３の存在下でｐ５３の安定性を有意に増大させた［２３］。レナリドミドによるＣＫ１αの枯渇は、ｐ５３に寄与するＭＤＭ４の活性を減少させ得る。本発明者らは、レナリドミドが、ＭＤＭ２及びＭＤＭ４をほとんど発現しないウイルス陰性及びｐ５３野生型ＵＩＳＯ細胞中でｐ５３活性化を増強させるか否かを試験した（図３Ａ～Ｂ）。本発明者らは、レナリドミドがＵＩＳＯ細胞中でＣＫ１αレベルを減少させるが、ヌトリン－３によるｐ５３活性化を増強させ得ないことを観察した（図４Ｂ）。
ＣＲＢＮの構造分析は、レナリドミドがＣＫ１αとの相互作用を強力に促進し得る一方、関連化合物サリドマイド及びポマリドミドがＣＫ１αをＣＲＢＮにそれほど動員し得ないことを明らかにした［２２］。レナリドミドと比較して、ポマリドミド及びサリドマイドは、ＭＫＬ－１細胞中でＣＫ１αタンパク質レベルを低減させなかった（Ｓ４Ｃ）。更に、ポマリドミド又はサリドマイドは、ＭＫＬ－１細胞中でヌトリン－３に対するｐ５３応答を増強させなかった（図４Ｃ）。ｐ５３へのＭＤＭ４結合に対するＣＫ１αの寄与を試験するため、本発明者らは、ヌトリン－３及びレナリドミドにより４０時間処置されたＭＫＬ－１細胞から調製された溶解物を用いてＭＤＭ４、ｐ５３及びＣＫ１αについて免疫沈降（ＩＰ）を実施した（図４Ｄ及びＳ４Ｅ）。レナリドミド及びヌトリン－３は、ヌトリン－３のみと比べてＣＫ１αレベルを低減させ、ｐ５３レベルを増大させた。ｐ５３のレベルの増大にかかわらず、ヌトリン－３とのレナリドミド同時処置は、非処置又はヌトリン－３処置対照と比較してＭＤＭ４、ＣＫ１α又は活性化ＭＤＭ２によるｐ５３の共沈を増大させず、ＭＤＭ２を活性化させなかった。これは、ＣＫ１αのレベルの低減がｐ５３へのＭＤＭ４結合を減少させたことを示す。
ＣＫ１αがｐ５３へのＭＤＭ４結合を可能とする場合、本発明者らは、ＣＫ１αの損失がｐ５３へのＭＤＭ４結合を低減させ、ｐ５３活性化を増強させることを予測した［１３］。これを試験するため、本発明者らは、２つの独立したＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡによりＭＫＬ－１中でＣＫ１αを枯渇させ、ヌトリン－３処置後にｐ５３活性化を評価した（図４Ｅ）［２４］。ＣＫ１αのＣＲＩＳＰＲノックアウトは、活性化ＭＤＭ２（ホスホ－セリン１６６、Ｐ－ＭＤＭ２）、Ｐ－ｐ５３、ｐ５３及びｐ２１のレベルの増大により評価してｐ５３活性の増大をもたらし、レナリドミド又はｓｇＲＮＡのいずれかによるＣＫ１αの低減は、ｐ５３活性化を増強させることを示した［２５］。特に、レナリドミドの添加は、ＣＲＩＳＰＲにより完全に枯渇されなかったＣＫ１αタンパク質レベルを低減させ、ｐ５３活性化の標識を更に増大させた。本発明者らは、新たに開発されたＭＤＭ４阻害剤（ＳＣ－２４－ＵＲ９９、ＵＲ９９）がＭＤＭ２阻害剤ヌトリン－３又はＨＤＭ２０１の活性を増強させ得るか否かを試験した（図４Ｆ）［２６］。ＵＲ９９は、ｐ５３へのＭＤＭ４結合を特異的に遮断する。本発明者らは、ＵＲ９９によるＭＤＭ４の阻害がＭＤＭ２阻害剤によるｐ５３活性化を増大させることを見出した。
レナリドミドは、ＭＤＭ２阻害剤と相乗作用してＭＣＣ細胞系中でアポトーシスを誘導する。
ＭＣＣ細胞生存率に対するＭＤＭ２阻害の効果を証明するため、本発明者らは、ＭＫＬ－１（ｐ５３野生型）及びＭＳ－１（ｐ５３突然変異体）細胞をＭＤＭ２阻害剤ヌトリン－３、ＲＧ７３８８又はＡＭＧ２３２により９６時間処置し、ＸＴＴ生存率アッセイを実施した［２７］。ＭＫＬ－１は、３つ全てのＭＤＭ２阻害剤に感受性であったが、ＭＳ－１細胞は、感受性でなかった（図５Ａ）。本発明者らは、レナリドミドをヌトリン－３、ＲＧ７３８８及びＡＭＧ２３２と組み合わせることの効果を試験し、レナリドミドと使用された場合に３つ全てのＭＤＭ２阻害剤の有意に改善された細胞毒性を観察した（Ｓ５Ａ～Ｄ）。Ｃｏｍｐｕｓｙｎ（Ｓ６Ａ）及びＢｌｉｓｓ（図５Ｂ）方法を使用する相乗作用試験は、ヌトリン－３又はＲＧ７３８８とレナリドミド又はＵＲ９９との組み合わせについての相乗作用的活性を明らかにした（Ｓ６Ｂ～Ｆ）［２８～３１］。対照的に、サリドマイドは、ヌトリン－３との組み合わせで使用された場合、相乗作用についてのエビデンスを有さず、ＣＫ１αレベルに対するその比較的低減された効果と一致した（図５Ｂ、Ｓ５Ｅ）。
ＭＣＣ細胞生存率に対するＭＤＭ２阻害の効果を証明するため、本発明者らは、ＭＫＬ－１（ｐ５３野生型）及びＭＳ－１（ｐ５３突然変異体）細胞をＭＤＭ２阻害剤ヌトリン－３、ＲＧ７３８８又はＡＭＧ２３２により９６時間処置し、ＸＴＴ生存率アッセイを実施した［２７］。ＭＫＬ－１は、３つ全てのＭＤＭ２阻害剤に感受性であったが、ＭＳ－１細胞は、感受性でなかった（図５Ａ）。本発明者らは、レナリドミドをヌトリン－３、ＲＧ７３８８及びＡＭＧ２３２と組み合わせることの効果を試験し、レナリドミドと使用された場合に３つ全てのＭＤＭ２阻害剤の有意に改善された細胞毒性を観察した（Ｓ５Ａ～Ｄ）。Ｃｏｍｐｕｓｙｎ（Ｓ６Ａ）及びＢｌｉｓｓ（図５Ｂ）方法を使用する相乗作用試験は、ヌトリン－３又はＲＧ７３８８とレナリドミド又はＵＲ９９との組み合わせについての相乗作用的活性を明らかにした（Ｓ６Ｂ～Ｆ）［２８～３１］。対照的に、サリドマイドは、ヌトリン－３との組み合わせで使用された場合、相乗作用についてのエビデンスを有さず、ＣＫ１αレベルに対するその比較的低減された効果と一致した（図５Ｂ、Ｓ５Ｅ）。
レナリドミドが、ＭＣＣ細胞中でアポトーシスによる細胞死を引き起こすヌトリン－３の能力に影響したか否かを決定するため、本発明者らは、遊離ＢＨ３ペプチドに対する感受性を測定するＢＨ３プロファイリングを実施した［３２］。ヌトリン－３へのレナリドミドの添加は、アポトーシスのためのプライミング効果を増強させた（図５Ｃ）。インビボでのＭＤＭ２及びＭＤＭ４の二重阻害を決定するため、本発明者らは、ＭＫＬ－１ ＭＣＣゼノグラフトをＨＤＭ２０１（インビボ有効性試験に好適）により、レナリドミドを用いて又は用いずに処置した（図５Ｄ、表Ｓ３）。本発明者らは、レナリドミドの添加がＨＤＭ２０１の有効性を大幅に増強させ、ＭＤＭ２及びＭＤＭ４を発現するｐ５３野生型腫瘍のための組み合わせ療法の臨床的有用性についての潜在性を提供することを見出した。本発明者らは、ＭＣＶ Ｔ抗原が、ウイルス陽性ＭＣＣにおいてｐ５３活性を抑制するためのＭＤＭ２、ＭＤＭ４及びＣＫ１αへの依存性を増大させ、治療潜在性を示すモデルを提案する（図５Ｅ）。
レナリドミドは、悪性腫瘍、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）及び多発性骨髄腫（ＭＭ）を処置するために使用されている［２１］。突然変異体ＣＳＮＫ１Ａ１は、レナリドミド処置ＭＤＳにおける芳しくない予後を予測することが報告された［３３］。更に、突然変異体ｐ５３を有するＭＤＳは、野生型ｐ５３を有するＭＤＳと比較してレナリドミドに対して十分に応答せず、急性骨髄性白血病に進行する可能性が高く、レナリドミドの効果は、ＭＤＭ４の不活性化に部分的に依存性であり得ることを示す［３４］。本発明者らの研究は、野生型ｐ５３を含有するＭＣＣにおける並びに他の固形腫瘍及び血液悪性腫瘍におけるレナリドミドとＭＤＭ２阻害剤との組み合わせについての合理的根拠を提供する。
ヒト使用のため、レナリドミドは、例えば、カプセル剤の形態でＲＥＶＬＩＭＩＤの処方情報に従い、例えばＭＭ組み合わせ療法について反復２８日サイクルの１～２１日目の１日１回２５ｍｇ経口；自己ＨＳＣＴ後のＭＭ維持療法について反復２８日サイクルの１～２８日目の１日１回１０ｍｇ継続；ＭＤＳについて１日１回１０ｍｇ；ＭＣＬについて反復２８日サイクルの１～２１日目の１日１回２５ｍｇ経口で経口投与することができる。投薬は、腎損傷の症例における臨床及び実験室所見に基づいて継続又は修正され、開始用量は、クレアチニンクリアランス値に基づいて調整される。
ヒト使用のため、ＨＤＭ２０１は、例えば、カプセル剤の形態で経口投与することができる。特に、経口投与は、高用量間欠レジメン［例えば、レジメンＡ（５０ｍｇ～４００ｍｇのＨＤＭ２０１を３週間サイクルの１日目に投与又はレジメンＢ（５０ｍｇ～１５０ｍｇのＨＤＭ２０１を４週間サイクルの１及び８日目に投与）又はレジメンＣ（５０ｍｇ～５００ｍｇのＨＤＭ２０１を４週間サイクルの１日目に投与］又は低用量拡張レジメン［例えば、レジメンＤ（１０ｍｇ～３０ｍｇのＨＤＭ２０１を４週間サイクルの最初の２週間、１日１回）又はレジメンＥ（１５ｍｇ～５０ｍｇのＨＤＭ２０１を４週間サイクルの最初の週、１日１回）］を使用し得る。
ヒト使用のため、イダサヌトリンは、例えば、カプセル剤の形態で各２８日間処置サイクルの１～５日目に１日１回又は１日２回、経口投与することができる。１日用量は、１００ｍｇ～１０００ｍｇであり得る。
ヒト使用のため、ＳＣ－２４－ＵＲ９９は、例えば、液剤又はカプセル剤の形態で静脈内又は経口投与することができる。投与は、高用量間欠レジメン［例えば、レジメンＡ（１０ｍｇ～１０００ｍｇのＳＣ－２４－ＵＲ９９を３週間サイクルの１日目に投与又はレジメンＢ（５ｍｇ～５００ｍｇのＳＣ－２４－ＵＲ９９を４週間サイクルの１及び８日目に投与）又はレジメンＣ（１００ｍｇ～１０００ｍｇのＳＣ－２４－ＵＲ９９を４週間サイクルの１日目に投与］又は低用量拡張レジメン［例えば、レジメンＤ（１ｍｇ～１００ｍｇのＳＣ－２４－ＵＲ９９を４週間サイクルの最初の２週間、１日１回）又はレジメンＥ（１ｍｇ～２００ｍｇのＳＣ－２４－ＵＲ９９、４週間サイクルの最初の週、１日１回）］を使用し得る。
化学式
本明細書に挙げられる化合物は、以下の化学式により表すこともできる。
本明細書に挙げられる化合物は、以下の化学式により表すこともできる。
表
定義
本明細書で使用されるとき、冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、その冠詞の文法上の指示対象の１つ又は２つ以上（例えば、少なくとも１つ）を指す。
本明細書で使用されるとき、冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、その冠詞の文法上の指示対象の１つ又は２つ以上（例えば、少なくとも１つ）を指す。
用語「又は」は、本明細書では、文脈上特に明らかに指示されない限り、用語「及び／又は」を意味して使用され、且つそれと同義的に使用される。
「約」及び「近似的に」は、概して、測定の性質又は精度を所与として測定された分量についての許容できる誤差の程度を意味するものとする。例示的な誤差の程度は、所与の値又は値の範囲の２０パーセント（％）以内、典型的には１０％以内及びより典型的には５％以内である。
本明細書で使用されるとき、冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、その冠詞の文法上の指示対象の１つ又は２つ以上（例えば、少なくとも１つ）を指す。
用語「又は」は、本明細書では、文脈上特に明らかに指示されない限り、用語「及び／又は」を意味して使用され、且つそれと同義的に使用される。
「約」及び「近似的に」は、概して、測定の性質又は精度を所与として測定された分量についての許容できる誤差の程度を意味するものとする。例示的な誤差の程度は、所与の値又は値の範囲の２０パーセント（％）以内、典型的には１０％以内及びより典型的には５％以内である。
「組み合わせ」又は「～と組み合わせて」とは、その療法又は治療剤を同じ時点で投与しなければならず、且つ／又は一緒に送達するために製剤化しなければならないことを含意するように意図するものではないが、しかし、そうした送達方法は、本明細書に記載される範囲内にある。本組み合わせにおける治療剤は、１つ以上の他の追加の療法又は治療剤と同時、その前又はその後に投与することができる。治療剤又は療法プロトコルは、いかなる順序でも投与することができる。一般に、各薬剤は、その薬剤について決められた用量及び／又はタイムスケジュールで投与されることになる。更に、この組み合わせに利用される追加の治療剤は、単一の組成物で一緒に投与されるか又は異なる組成物で個別に投与され得ることが理解されるであろう。一般に、組み合わせに利用される追加の治療剤は、それが個々に利用されるレベルを超えないレベルで利用されることが予想される。一部の実施形態において、組み合わせに利用されるレベルは、個々に利用されるレベルよりも低くなるであろう。
実施形態において、追加の治療剤は、治療量又は治療量未満で投与される。特定の実施形態において、阻害、例えば成長阻害を実現するために必要な第２の治療剤の濃度は、第２の治療剤が第１の治療剤と組み合わせて投与される場合により低い。特定の実施形態において、阻害を実現するために必要な第１の治療剤の濃度は、第１の治療剤が第２の治療剤と組み合わせて投与される場合、第１の治療剤が個々に投与される場合よりも低い。特定の実施形態において、組み合わせ療法では、阻害を実現するために必要な第２の治療剤の濃度は、単剤療法としての第２の治療剤の治療量よりも低く、例えば１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％又は８０～９０％低い。特定の実施形態において、組み合わせ療法では、阻害を実現するために必要な第１の治療剤の濃度は、単剤療法としての第１の治療剤の治療量よりも低く、例えば１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％又は８０～９０％低い。
用語「阻害」、「阻害剤」又は「アンタゴニスト」は、所与の分子、例えば免疫チェックポイント阻害剤の特定のパラメータ、例えば活性の低下を含む。例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％又はそれを超える活性、例えば所与の分子の活性の阻害、例えば阻害分子がこの用語に含まれる。従って、阻害は、１００％である必要はない。
用語「抗癌効果」は、例えば、腫瘍容積の減少、癌細胞の数の減少、腫瘍転移の数の減少、平均寿命の増加、癌細胞増殖の減少、癌細胞生存の減少又は癌性状態と関連する様々な生理的症状の寛解を含むが、これらに限定されない、様々な手段によって明らかにされ得る生物学的効果を指す。「抗癌効果」は、最初の部分における癌の発生の予防におけるペプチド、ポリヌクレオチド、細胞及び抗体の能力によっても明らかにされ得る。
用語「抗腫瘍効果」は、例えば、腫瘍容積の減少、腫瘍細胞の数の減少、腫瘍細胞増殖の減少又は腫瘍細胞生存の減少を含むが、これらに限定されない、様々な手段によって明らかにされ得る生物学的効果を指す。
用語「癌」は、異常な細胞の急速且つ制御されていない増殖によって特徴付けられる疾患を指す。癌細胞は、局所的に又は血流及びリンパ系を介して体の他の部分に広がることができる。様々な癌の例は、本明細書に記載され、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などが挙げられるが、これらに限定されない。用語「腫瘍」及び「癌」は、本明細書において同義的に使用され、例えば、両方の用語は、固形及び液性、例えば散在性又は循環性腫瘍を包含する。本明細書で使用されるとき、用語「癌」又は「腫瘍」は、前癌性並びに悪性の癌及び腫瘍を含む。本明細書で使用されるとき、用語「癌」は、原発性悪性細胞又は腫瘍（例えば、細胞が最初の悪性腫瘍又は腫瘍の部位以外に対象の体内の部位に転移していないもの）及び二次悪性細胞又は腫瘍（例えば、最初の腫瘍の部位と異なる二次的な部位への悪性細胞又は腫瘍細胞の転移である転移から生じるもの）を含む。
本明細書で使用されるとき、用語「処置する」、「処置」及び「処置している」は、１つ以上の療法の投与によってもたらされる、障害、例えば増殖性障害の進行、重症度及び／若しくは持続期間の低減若しくは改善又は障害の１つ以上の症状（好ましくは１つ以上の認識できる症状）の改善を指す。具体的な実施形態において、用語「処置する」、「処置」及び「処置している」は、必ずしも患者が認識できるとは限らない、腫瘍の成長など、増殖性障害の少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善を指す。他の実施形態において、用語「処置する」、「処置」及び「処置している」は、例えば、認識できる症状の安定化による物理的な、例えば物理的パラメータの安定化による生理学的な又は両方のいずれかの増殖性障害の進行の阻害を指す。他の実施形態において用語「処置する」、「処置」及び「処置している」は、腫瘍サイズ又は癌性細胞数の減少又は安定化を指す。
用語「対象」は、本明細書においてヒトを指す。ヒトは、成人、青年、小児又は幼児であり得る。
本明細書におけるＭＤＭ４阻害剤という用語は、ＭＤＭ－４に優先的に結合し、ｐ５３－ＭＤＭ４結合を破壊し、したがって封鎖ｐ５３タンパク質を放出する阻害剤を指す。
参考文献
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３．Ｆｅｎｇ Ｈ，Ｓｈｕｄａ Ｍ，Ｃｈａｎｇ Ｙ，Ｍｏｏｒｅ ＰＳ（２００８）Ｃｌｏｎａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｅｒｋｅｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）３１９（５８６６）：１０９６－１１００．１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１５２５８６．
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５．Ｓｈｕｄａ Ｍ，Ｋｗｕｎ ＨＪ，Ｆｅｎｇ Ｈ，Ｃｈａｎｇ Ｙ，Ｍｏｏｒｅ ＰＳ（２０１１）Ｈｕｍａｎ Ｍｅｒｋｅｌ ｃｅｌｌ ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ ｓｍａｌｌ ｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｓ ａｎ ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ４ｅ－ｂｐ１ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １２１（９）：３６２３－３６３４．１０．１１７２／ＪＣＩ４６３２３．
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８．Ｈａｒｍｓ ＰＷ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｔｈｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ－ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｅｒｋｅｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ７５（１８）：３７２０－３７２７．１０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－１５－０７０２．
９．Ａｌｌｅｎ ＭＡ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｇｌｏｂａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐ５３－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｉｔｓ ｄｉｒｅｃｔ ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．ｅＬｉｆｅ ３．１０．７５５４／ｅｌｉｆｅ．０２２００．
１０．Ｂａｔｅｓ Ｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ｐ１４ＡＲＦ ｌｉｎｋｓ ｔｈｅ ｔｕｍｏｕｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ＲＢ ａｎｄ ｐ５３．Ｎａｔｕｒｅ ３９５（６６９８）：１２４－５．
１１．Ｎｏｍｕｒａ Ｋ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＭＤＭ２ ＲＩＮＧ ｓｅｐａｒａｔｅｓ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４（７）：５７８－５８７．
１２．Ｂｉｓｔａ Ｍ，Ｐｅｔｒｏｖｉｃｈ Ｍ，Ｆｅｒｓｈｔ ＡＲ（２０１３）ＭＤＭＸ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａｎ ａｕｔｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１０（４４）：１７８１４－９．
１３．Ｃｈｅｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ａｕｔｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＭＤＭＸ ｂｙ ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐ５３ ｍｉｍｉｃｒｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１２（１５）：４６２４－９．
１４．Ｂｅｌｉｖｅａｕ Ａ，Ｙａｓｗｅｎ Ｐ（２００７）Ｓｏｏｔｈｉｎｇ ｔｈｅ ｗａｔｃｈｍａｎ：ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｐ５３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ，Ｔｅｘ．）６（１１）：１２８４－１２８７．１０．４１６１／ｃｃ．６．１１．４２９８．
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３４．Ｓａｆｔ Ｌ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ｐ５３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｌｏｗｅｒ－ｒｉｓｋ ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ｗｉｔｈ ｄｅｌ（５ｑ）．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９９（６）：１０４１－９．
３５．Ｃｒｏｎｉｎ Ｊ，Ｚｈａｎｇ ＸＹＹ，Ｒｅｉｓｅｒ Ｊ（２００５）Ａｌｔｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒｏｐｉｓｍ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ５（４）：３８７－３９８．１０．２１７４／１５６６５２３０５４５４６２２４．
３６．Ｐａｌｌｉｓ Ｍ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｙｎａｍｉｃ ｂｈ３ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｃｏ－ｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉ－ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｇ０２ ａｎｄ ｔｈｅ ｂｈ３ ｍｉｍｅｔｉｃ ａｂｔ－１９９ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．８７４２．
３７．Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｄ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｈｉｐ－ｓｅｑ：Ｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｏ ｄｉｓｃｏｖｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｄｎａ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４８（３）：２４０－２４８．１０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ．２００９．０３．００１．
材料及び方法
プラスミド
ＧＦＰ及びＴ抗原ｃＤＮＡを、Ｄａｖｉｄ Ｒｏｏｔ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド］４１３９４）及びＥｒｉｃ Ｃａｍｐｅａｕ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１７４８６）からそれぞれ入手したｐＬＩＸ－４０２誘導性エンプティ又はｐＬｅｎｔｉ ＣＭＶ Ｂｌａｓｔエンプティベクター（ｗ２６３－１）中にＧａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）クローニングした。ＣＫ１αについてのｓｇＲＮＡクローン（ＢＲＤＮ０００１１４９３１５、ＢＲＤＮ０００１１４５６８０）をＪｏｈｎ Ｄｏｅｎｃｈ及びＤａｖｉｄ Ｒｏｏｔ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド７６１８８、７６１８９）から入手した。ｐＬＫＯ－ｐ５３－ｓｈＲＮＡ－９４１をＴｏｄｄ Ｗａｌｄｍａｎ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド２５６３７）から入手した。
プラスミド
ＧＦＰ及びＴ抗原ｃＤＮＡを、Ｄａｖｉｄ Ｒｏｏｔ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド］４１３９４）及びＥｒｉｃ Ｃａｍｐｅａｕ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１７４８６）からそれぞれ入手したｐＬＩＸ－４０２誘導性エンプティ又はｐＬｅｎｔｉ ＣＭＶ Ｂｌａｓｔエンプティベクター（ｗ２６３－１）中にＧａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）クローニングした。ＣＫ１αについてのｓｇＲＮＡクローン（ＢＲＤＮ０００１１４９３１５、ＢＲＤＮ０００１１４５６８０）をＪｏｈｎ Ｄｏｅｎｃｈ及びＤａｖｉｄ Ｒｏｏｔ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド７６１８８、７６１８９）から入手した。ｐＬＫＯ－ｐ５３－ｓｈＲＮＡ－９４１をＴｏｄｄ Ｗａｌｄｍａｎ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド２５６３７）から入手した。
細胞及び細胞培養
これらの構築物を安定的に発現する細胞系を生成するため、３つのベクターレンチウイルス形質導入系を使用してＩＭＲ９０ヒト肺線維芽細胞、ＨＣＴ１１６結腸癌又はＭＫＬ－１ ＭＣＣ細胞を形質導入した（１５）。ＭＣＣ細胞系をＭａｓａ Ｓｈｕｄａ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）、Ｊｕｅｒｇｅｎ Ｂｅｃｋｅｒ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｒａｚ，Ａｕｓｔｒｉａ）及びＲｏｌａｎｄ Ｈｏｕｂｅｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。２９３Ｔ、ＨＣＴ１１６及びＩＭＲ９０細胞をＡＴＣＣから入手した。ｓｈＲＮＡを誘導的に発現するＭＫＬ－１ ＭＣＣ細胞系の生成並びにｐ５３ＤＤ、ＭＹＣＬ及びｈＴＥＲＴ構築物を使用するＩＭＲ９０形質転換は、既に記載された（１７）。ＩＭＲ９０及びヒト初代包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）を、１５％のＦＢＳ、抗生物質及び非必須アミノ酸が補給されたＤＭＥＭ中で培養し、ＭＣＣ細胞系を、１０％のＦＢＳ及び抗生物質が補給されたＲＰＭＩ中で成長させた。
これらの構築物を安定的に発現する細胞系を生成するため、３つのベクターレンチウイルス形質導入系を使用してＩＭＲ９０ヒト肺線維芽細胞、ＨＣＴ１１６結腸癌又はＭＫＬ－１ ＭＣＣ細胞を形質導入した（１５）。ＭＣＣ細胞系をＭａｓａ Ｓｈｕｄａ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）、Ｊｕｅｒｇｅｎ Ｂｅｃｋｅｒ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｒａｚ，Ａｕｓｔｒｉａ）及びＲｏｌａｎｄ Ｈｏｕｂｅｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。２９３Ｔ、ＨＣＴ１１６及びＩＭＲ９０細胞をＡＴＣＣから入手した。ｓｈＲＮＡを誘導的に発現するＭＫＬ－１ ＭＣＣ細胞系の生成並びにｐ５３ＤＤ、ＭＹＣＬ及びｈＴＥＲＴ構築物を使用するＩＭＲ９０形質転換は、既に記載された（１７）。ＩＭＲ９０及びヒト初代包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）を、１５％のＦＢＳ、抗生物質及び非必須アミノ酸が補給されたＤＭＥＭ中で培養し、ＭＣＣ細胞系を、１０％のＦＢＳ及び抗生物質が補給されたＲＰＭＩ中で成長させた。
細胞生存率アッセイ
ヌトリン－３（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ）、レナリドミド（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ）、サリドマイド（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ポマリドミド（Ｓｅｌｌｅｃｋ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ＡＭＧ２３２（ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ）、ＲＧ７３８８（Ａｉｌｅｒｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ製）、ＨＤＭ２０１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＳＣ－２４－ＵＲ９９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、シクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＭＧ１３２（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）をＤＭＳＯ中で再構成し、培養培地に直接添加した。Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（ＸＴＴ）（Ｒｏｃｈｅ）を製造業者の説明書に従って使用して細胞生存率アッセイを実施し、ＢＨ３プロファイリングをＰａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（３６）に記載の通りに実施した。Ｃｏｍｐｕｓｙｎ及びＳｙｎｅｒｇｙｆｉｎｄｅｒ（２８，２９）を使用して相乗作用試験を実施した。
ヌトリン－３（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ）、レナリドミド（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ）、サリドマイド（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ポマリドミド（Ｓｅｌｌｅｃｋ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ＡＭＧ２３２（ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ）、ＲＧ７３８８（Ａｉｌｅｒｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ製）、ＨＤＭ２０１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＳＣ－２４－ＵＲ９９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、シクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＭＧ１３２（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）をＤＭＳＯ中で再構成し、培養培地に直接添加した。Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（ＸＴＴ）（Ｒｏｃｈｅ）を製造業者の説明書に従って使用して細胞生存率アッセイを実施し、ＢＨ３プロファイリングをＰａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（３６）に記載の通りに実施した。Ｃｏｍｐｕｓｙｎ及びＳｙｎｅｒｇｙｆｉｎｄｅｒ（２８，２９）を使用して相乗作用試験を実施した。
免疫沈降、免疫ブロッティング及び抗体。
細胞のコンフルエント培養物を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により洗浄し、ＥＢＣ溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＮＰ－４０、１：１０，０００－メルカプトエタノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）中において氷上で１０分間再懸濁させ、次いで遠心分離した。澄明化溶解物を抗体及び磁性タンパク質Ａ／Ｇビーズ（ＰｕｒｅＰｒｏｔｅｏｍｅ磁性ビーズ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と一晩インキュベートした。ビーズを高塩濃度ＥＢＣ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＮＰ－４０、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）により５回洗浄し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動前にＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で沸騰させた。免疫沈降及びウエスタンブロッティングを、ＭＤＭ４（１７９１４－１－ＡＰ；Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ）、ＭＤＭ２（ＳＭＰ１４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＫ１α（１７１２５－１－ＡＰ；Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ）、ホスホ－Ｓｅｒ１６６ＭＤＭ２（］３５２１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ホスホ－Ｓｅｒ１５ｐ５３（］９２８４；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、アセチル－Ｌｙｓ３８２ｐ５３（］２５２５；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐ２１（］２９４６；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＰＵＭＡ（］１２４５０；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＶＰＳ３９（ａｂ１０７５７０；Ａｂｃａｍ）、ＰＡＲＰ（］９５４２；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＧＦＰ（］２５５５；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＭＹＣＬ（１４５８４－１－ＡＰ；Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ）、ｐ５３（ＤＯ－１；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ）及びＲＢ１（Ｇ３－２４５；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する抗体を用いて実施した。ＭＣＶ Ｔ抗原に対するマウスモノクローナル抗体Ａｂ３及びＡｂ５をＭＣＶラージＴ抗原残基１～２６０に対して生成し、細菌中でグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として産生した（１７）。Ｏｄｙｓｓｅｙ近赤外線システム（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して定量的ウエスタンブロッティングを実施した。
細胞のコンフルエント培養物を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により洗浄し、ＥＢＣ溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＮＰ－４０、１：１０，０００－メルカプトエタノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）中において氷上で１０分間再懸濁させ、次いで遠心分離した。澄明化溶解物を抗体及び磁性タンパク質Ａ／Ｇビーズ（ＰｕｒｅＰｒｏｔｅｏｍｅ磁性ビーズ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と一晩インキュベートした。ビーズを高塩濃度ＥＢＣ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＮＰ－４０、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）により５回洗浄し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動前にＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で沸騰させた。免疫沈降及びウエスタンブロッティングを、ＭＤＭ４（１７９１４－１－ＡＰ；Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ）、ＭＤＭ２（ＳＭＰ１４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＫ１α（１７１２５－１－ＡＰ；Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ）、ホスホ－Ｓｅｒ１６６ＭＤＭ２（］３５２１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ホスホ－Ｓｅｒ１５ｐ５３（］９２８４；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、アセチル－Ｌｙｓ３８２ｐ５３（］２５２５；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐ２１（］２９４６；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＰＵＭＡ（］１２４５０；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＶＰＳ３９（ａｂ１０７５７０；Ａｂｃａｍ）、ＰＡＲＰ（］９５４２；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＧＦＰ（］２５５５；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＭＹＣＬ（１４５８４－１－ＡＰ；Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ）、ｐ５３（ＤＯ－１；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ）及びＲＢ１（Ｇ３－２４５；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する抗体を用いて実施した。ＭＣＶ Ｔ抗原に対するマウスモノクローナル抗体Ａｂ３及びＡｂ５をＭＣＶラージＴ抗原残基１～２６０に対して生成し、細菌中でグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として産生した（１７）。Ｏｄｙｓｓｅｙ近赤外線システム（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して定量的ウエスタンブロッティングを実施した。
ＣｈＩＰ－及びＲＴ－ｑＰＣＲ
ＣｈＩＰ法を、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（３７）に記載のプロトコルから修正した。ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）及びホルムアルデヒドを用いる二重架橋を使用してＭＫＬ－１細胞又はＩＭＲ９０細胞を架橋させた。架橋後、ＳｉｍｐｌｅＣｈＩＰ緩衝液Ａ及びＢ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用して細胞を溶解させ、ＤＮＡをミクロコッカルヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）により３７℃において３０分間プロセシングし、次いで４℃において５回の２０秒間のパルスで超音波処理した。ＲＴ－ｑＰＣＲのため、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して総ＲＮＡを精製し、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｃＤＮＡを合成した。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩＩ Ｕｌｔｒａ－Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して定量的ＰＣＲを実施した。プライマー情報は、補足表２に見出すことができる。
ＣｈＩＰ法を、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（３７）に記載のプロトコルから修正した。ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）及びホルムアルデヒドを用いる二重架橋を使用してＭＫＬ－１細胞又はＩＭＲ９０細胞を架橋させた。架橋後、ＳｉｍｐｌｅＣｈＩＰ緩衝液Ａ及びＢ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用して細胞を溶解させ、ＤＮＡをミクロコッカルヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）により３７℃において３０分間プロセシングし、次いで４℃において５回の２０秒間のパルスで超音波処理した。ＲＴ－ｑＰＣＲのため、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して総ＲＮＡを精製し、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｃＤＮＡを合成した。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩＩ Ｕｌｔｒａ－Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して定量的ＰＣＲを実施した。プライマー情報は、補足表２に見出すことができる。
ゼノグラフト有効性試験
７～９週齢のＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に１．００ｅ＋００７個のＭＫＬ－１ ＭＣＣ細胞を注射した。腫瘍が２００ｍｍ３のサイズに達したとき、８匹のマウスの群をビヒクル、ＨＤＭ２０１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製、５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．８中４０ｍｇ／ｋｇ、０．５％のメチルセルロース（４００ｃＰ）、経口）、レナリドミド（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、５０ｍｇ／ｋｇ、０．５％のＣＭＣ＋０．２５％のＴｗｅｅｎ ８０、経口）又はＨＤＭ２０１及びレナリドミドの両方により毎日処置した。腫瘍容積が２０００ｍｍ３の最大許容サイズに達したとき、試験を終了した。
７～９週齢のＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に１．００ｅ＋００７個のＭＫＬ－１ ＭＣＣ細胞を注射した。腫瘍が２００ｍｍ３のサイズに達したとき、８匹のマウスの群をビヒクル、ＨＤＭ２０１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製、５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．８中４０ｍｇ／ｋｇ、０．５％のメチルセルロース（４００ｃＰ）、経口）、レナリドミド（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、５０ｍｇ／ｋｇ、０．５％のＣＭＣ＋０．２５％のＴｗｅｅｎ ８０、経口）又はＨＤＭ２０１及びレナリドミドの両方により毎日処置した。腫瘍容積が２０００ｍｍ３の最大許容サイズに達したとき、試験を終了した。
実施された実験の一部及び得られた結果を本発明の詳細な説明のセクションにおいて且つ図面及びその説明において本明細書に開示する。
実施例１
以下の表は、ＭＫＬ－１ ＭＣＣ細胞の生存率の低減における薬物／化合物の種々の組み合わせの相乗作用試験からのデータを提供する。ＭＫＬ－１（野生型ｐ５３を有するウイルス陽性メルケル細胞癌細胞系）を９６時間処置した。ＸＴＴアッセイを実施して非処置細胞に正規化された相対生存率（％応答）を決定した。別々の表は、組み合わせ１．ヌトリン－レナリドミド ２．ヌトリン－ＵＲ９９ ３．ＨＤＭ２０１－ＵＲ９９ ４．ヌトリン－３＋／－レナリドミド；ＲＧ７３８８＋／－レナリドミド；レナリドミド単独 ５．ＨＤＭ２０１＋レナリドミドについてのデータを含む。
以下の表は、ＭＫＬ－１ ＭＣＣ細胞の生存率の低減における薬物／化合物の種々の組み合わせの相乗作用試験からのデータを提供する。ＭＫＬ－１（野生型ｐ５３を有するウイルス陽性メルケル細胞癌細胞系）を９６時間処置した。ＸＴＴアッセイを実施して非処置細胞に正規化された相対生存率（％応答）を決定した。別々の表は、組み合わせ１．ヌトリン－レナリドミド ２．ヌトリン－ＵＲ９９ ３．ＨＤＭ２０１－ＵＲ９９ ４．ヌトリン－３＋／－レナリドミド；ＲＧ７３８８＋／－レナリドミド；レナリドミド単独 ５．ＨＤＭ２０１＋レナリドミドについてのデータを含む。
参照による援用
本明細書において言及される全ての刊行物、特許及び受託番号は、各個別の刊行物又は特許が参照によって援用されることが具体的且つ個別的に指示されたものとして本明細書によって全体として参照により援用される。
本明細書において言及される全ての刊行物、特許及び受託番号は、各個別の刊行物又は特許が参照によって援用されることが具体的且つ個別的に指示されたものとして本明細書によって全体として参照により援用される。
均等物
本発明の具体的な実施形態が考察されているが、上記の本明細書は、例示的なものであり、限定的なものではない。本明細書及び以下の特許請求の範囲を検討すれば、当業者に本発明の多くの変形形態が明らかになるであろう。本発明の完全な範囲は、その均等物の全範囲と併せた特許請求の範囲及びかかる変形形態と併せた本明細書を参照することにより決定されなければならない。
本発明の具体的な実施形態が考察されているが、上記の本明細書は、例示的なものであり、限定的なものではない。本明細書及び以下の特許請求の範囲を検討すれば、当業者に本発明の多くの変形形態が明らかになるであろう。本発明の完全な範囲は、その均等物の全範囲と併せた特許請求の範囲及びかかる変形形態と併せた本明細書を参照することにより決定されなければならない。
Claims (21)
- （ａ）マウス二重微小染色体２（ＭＤＭ２）阻害剤と、（ｂ）カゼインキナーゼ１アルファ（ＣＫ１α）分解剤及び／又はマウス二重微小染色体４（ＭＤＭ４）阻害剤とを含む組み合わせ。
- 対象におけるｐ５３野生型（ＷＴ）腫瘍の処置における使用のための、（ａ）ＭＤＭ２阻害剤と、（ｂ）ＣＫ１α分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤とを含む組み合わせ。
- 対象におけるｐ５３ＷＴ腫瘍を処置する方法であって、前記対象に、（ａ）ＭＤＭ２阻害剤と、（ｂ）ＣＫ１α分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤との組み合わせを投与することを含む方法。
- 前記ＭＤＭ２阻害剤は、ヌトリン－３、イダサヌトリン（ＲＧ７３８８、ＲＯ５５０３７８１）、ＲＧ７７７５（ＲＯ６８３９９２１）、ＡＭＧ２３２、ＤＳ３０３２（ＤＳ３０３２ｂ）、ＡＬＲＮ－６９２４、ＡＴＳＰ－７０４１、ＣＧＭ０９７及びＨＤＭ２０１、即ち（Ｓ）－５－（５－クロロ－１－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－ピリジン－３－イル）－６－（４－クロロ－フェニル）－２－（２，４－ジメトキシ－ピリミジン－５－イル）－１－イソプロピル－５，６－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［３，４－ｄ］イミダゾール－４－オンからなる群から選択される、請求項１に記載の組み合わせ、請求項２に記載の使用のための組み合わせ又は請求項３に記載の方法。
- 前記ＭＤＭ２阻害剤は、ヌトリン－３、イダサヌトリン及びＨＤＭ２０１からなる群から選択される、請求項１に記載の組み合わせ、請求項２に記載の使用のための組み合わせ又は請求項３に記載の方法。
- 前記ＭＤＭ２阻害剤は、ＨＤＭ２０１である、請求項１に記載の組み合わせ、請求項２に記載の使用のための組み合わせ又は請求項３に記載の方法。
- 前記ＣＫ１α分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤は、サリドマイド、ポマリドミド、レナリドミド、即ちＲＥＶＬＩＭＩＤとも称される（ＲＳ）－３－（７－アミノ－３－オキソ－１Ｈ－イソインドール－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン及びＳＣ－２４－ＵＲ９９、即ち４－（３－アミノ－１－（４－クロロ－５－メチル－６－（メチルアミノ）ピリジン－３－イル）－５－フルオロ－１Ｈ－インダゾール－６－イル）ナフタレン－１－オールからなる群から選択される、請求項１若しくは４～６のいずれか一項に記載の組み合わせ、請求項２若しくは４～６のいずれか一項に記載の使用のための組み合わせ又は請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＣＫ１α分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤は、レナリドミド及びＳＣ－２４－ＵＲ９９からなる群から選択される、請求項１若しくは４～６のいずれか一項に記載の組み合わせ、請求項２若しくは４～６のいずれか一項に記載の使用のための組み合わせ又は請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＭＤＭ２阻害剤は、ヌトリン－３、イダサヌトリン及びＨＤＭ２０１からなる群から選択され、前記ＣＫ１α分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤は、レナリドミド及びＳＣ－２４－ＵＲ９９からなる群から選択される、請求項１に記載の組み合わせ、請求項２に記載の使用のための組み合わせ又は請求項３に記載の方法。
- 前記ＭＤＭ２阻害剤は、ＨＤＭ２０１であり、且つ前記ＣＫ１α分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤は、レナリドミドである、請求項１に記載の組み合わせ、請求項２に記載の使用のための組み合わせ又は請求項３に記載の方法。
- 前記ｐ５３ＷＴ腫瘍は、固形腫瘍である、請求項２若しくは４～１０のいずれか一項に記載の使用のための組み合わせ又は請求項３～１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固形腫瘍は、肉腫、例えば脂肪肉腫又は軟部組織肉腫、リンパ腫、例えば非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、特にマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、黒色腫、例えば皮膚黒色腫又はブドウ膜黒色腫、芽細胞腫（例えば、神経芽細胞腫）、結腸腫瘍、結腸直腸腫瘍、腎腫瘍、肝腫瘍及び皮膚癌、例えばメルケル細胞癌（ＭＣＣ）からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用のための組み合わせ又は請求項１１に記載の方法。
- 前記固形腫瘍は、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）である、請求項１１に記載の使用のための組み合わせ又は請求項１１に記載の方法。
- 前記メルケル細胞癌（ＭＣＣ）は、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）陽性ＭＣＣである、請求項１３に記載の使用のための組み合わせ又は請求項１３に記載の方法。
- 前記ｐ５３ＷＴ腫瘍は、血液腫瘍（又は血液悪性腫瘍）である、請求項２若しくは４～１０のいずれか一項に記載の使用のための組み合わせ又は請求項３～１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血液腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）及び急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用のための組み合わせ又は請求項１５に記載の方法。
- 前記血液腫瘍は、多発性骨髄腫（ＭＭ）及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用のための組み合わせ又は請求項１５に記載の方法。
- 前記血液腫瘍は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である、請求項１５に記載の使用のための組み合わせ又は請求項１５に記載の方法。
- 前記ＭＤＭ２阻害剤は、ＨＤＭ２０１であり、前記ＣＫ１α分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤は、レナリドミドであり、前記ｐ５３ＷＴ腫瘍は、ＭＣＶ陽性ＭＣＣである、請求項２に記載の使用のための組み合わせ又は請求項３に記載の方法。
- 前記ＭＤＭ２阻害剤は、ＨＤＭ２０１であり、前記ＣＫ１α分解剤及び／又はＭＤＭ４阻害剤は、レナリドミドであり、前記ｐ５３ＷＴ腫瘍は、ＭＤＳである、請求項２に記載の使用のための組み合わせ又は請求項３に記載の方法。
- １つ以上の更なる抗癌剤を更に含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組み合わせ／使用のための組み合わせ／方法。
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
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