JP2021514190A - コード化リボ核酸の器官保護発現および調節のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

１つ以上の標的器官内の１つ以上のポリペプチドの発現のための単離されたｍＲＮＡ配列であって、当該配列は、少なくとも１つのコード配列と、少なくとも第１の非翻訳領域（ＵＴＲ）配列と、複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位配列をコードする少なくとも１つのコード化配列を含む。ｍｉＲＮＡ結合部位配列のそれぞれが、第１のＵＴＲ配列内、そのすぐ５’側またはそのすぐ３’側に位置し、ｍｉＲＮＡ結合部位配列が、標的器官（複数可）内の少なくとも第１および第２の細胞型におけるコード配列の差次的発現を可能にする。特に、肝臓、脳、肺、乳房、膵臓、結腸、および腎臓の癌などの疾患の治療において、組成物を使用するための方法が、提供される。【選択図】図１９Ｂ

Description

本発明は、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）送達技術、ならびにこれらのｍＲＮＡ送達技術を様々な治療的、診断的、および予防的適応において使用する方法に関する。そのような送達系は、独立した介入として、または他の治療成分と組み合わせて使用されてもよい。

遺伝子療法は、疾患を治療するために患者の細胞にコード化ポリヌクレオチドを導入するプロセスである。例えば、変異したおよび／または機能のない遺伝子は、標的細胞において無傷のコピーと置換することができる。遺伝子療法は、コード化ポリヌクレオチドを標的細胞に導入するためにウイルスベクターに依存することが多いが、ウイルスを使用せずにポリヌクレオチドを細胞に送達する他の技術が存在する。ウイルスの利点として、可能なトランスフェクション率が比較的高いこと、およびウイルスが標的細胞に侵入する結合タンパク質を制御することにより、ウイルスを特定の細胞型に標的化する能力が挙げられる。対照的に、コード化ポリヌクレオチドを細胞に導入する非ウイルス法は、トランスフェクション率が低いという問題がある場合があり、また、特定の器官および細胞型に発現を標的化するための選択肢が限られている。しかしながら、ウイルス介入の性質は毒性および炎症のリスクを伴うが、導入された因子の発現の期間および程度の制御も限定される。

生物学的アプローチに基づく腫瘍治療は、多くの多様な機構を用いて、例えば、とりわけ、直接的な細胞溶解、細胞傷害性の免疫エフェクター機構、および血管虚脱によって、癌をより正確に標的化および破壊することができるため、従来の化学療法薬に優る利点を有する。結果として、そのようなアプローチの可能性に関する臨床研究の数が大幅に増加している。しかしながら、広範囲にわたる治療活性に起因して、複数のパラメータが治療可能性に影響を及ぼす場合があるため、前臨床および臨床研究は複雑であり、したがって治療の失敗の理由または治療活性を増強する可能性のある方法論を定義することは困難である。的確な活性、腫瘍特異性を維持し、副作用を低減することも、そのような実験的かつ強力な治療法の大きな課題である。

非臨床状況であっても、特定の標的組織または器官において、ポリペプチドなどの特定の遺伝子産物の発現を誘導する能力がしばしば所望される。多くの場合、標的組織または器官は１つより多くの細胞型を含み、そのような場合、異なる細胞型において異なる程度に遺伝子産物を発現すること、すなわち、異なる細胞型において差次的発現を提供することもしばしば所望される。インビトロおよびインビボでポリヌクレオチドを導入する方法が存在するが、それらは上で論じたのと同じ限界を有する。

ＷＯ−２０１７／１３２５５２−Ａ１は、マイクロＲＮＡ結合部位を含む操作されたゲノムを持つ組換え腫瘍溶解性ウイルスについて記述している。

ＵＳ−２０１３／１５６８４９−Ａ１は、哺乳動物の細胞または組織で対象となるポリペプチドを発現させるための方法に関し、この方法は、当該哺乳動物の細胞または組織を、対象となるポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを含む製剤と接触させることを含む。ＷＯ−２０１６／０１１３０６−Ａ２は、マイクロＲＮＡ結合部位を含み得る少なくとも１つの末端修飾を含む核酸の設計、調製、製造、および／または製剤を記述している。前述の先行技術は、同時投与される治療剤または因子で治療される対象の身体における単一または複数の種類の器官の効果的な保護を確実にする問題に対処していない。

したがって、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド配列を特定の器官および／または組織に送達するための方法および組成物、ならびに特定の細胞において送達されたポリヌクレオチド配列の発現を調節する方法をさらに開発する必要がある。

第１の態様では、１つ以上の標的器官内で１つ以上のポリペプチドを発現させるための単離されたｍＲＮＡ配列が、提供される。この配列は、少なくとも１つのポリペプチドと、少なくとも第１の非翻訳領域（ＵＴＲ）配列と、複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位配列と、を含む。ｍｉＲＮＡ結合部位配列のそれぞれが、第１のＵＴＲ配列内、そのすぐ５’側またはそのすぐ３’側に位置する。ｍｉＲＮＡ結合部位配列が、標的器官（複数可）内の少なくとも第１および第２の細胞型におけるコード配列の差次的発現を可能にする。

ｍＲＮＡ配列は、２つより多く、好適には３つより多く、典型的には４つより多くの結合部位配列を含み得る。複数のｍｉＲＮＡ結合部位配列は、少なくとも２つの実質的に類似の配列を含み得、および／または複数のｍｉＲＮＡ結合部位配列は、少なくとも２つの実質的に異なる配列を含み得る。

いくつかの実施形態において、複数のｍｉＲＮＡ結合部位配列は、ｍｉＲＮＡ−１２２、ｍｉＲＮＡ−１２５ａ、ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１９９、ｍｉＲＮＡ−１２４ａ、Ｌｅｔ−７、ｍｉＲＮＡ−１４８ａ、ｍｉＲＮＡ−１４８ｂ、ｍｉＲＮＡ−３７５、ｍｉＲＮＡ−１４３、ｍｉＲＮＡ−１４５、ｍｉＲＮＡ１９２、ｍｉＲＮＡ１９４、ｍｉＲＮＡ−２０４、ｍｉＲＮＡ２１５、ｍｉＲＮＡ−３０ｂ、およびｍｉＲＮＡ−３０ｃからなる群のうちの少なくとも１つ以上から選択されるｍｉＲＮＡ配列に実質的に相補的である。複数のｍｉＲＮＡ結合部位配列のうちの少なくとも１つは、配列番号１〜７のうちの１つ以上、好適には配列番号１を含み得る。

いくつかの実施形態において、結合部位配列は、配列番号１、２、３、４、および５のそれぞれを含むか、または配列番号１、２、５、６、および７のそれぞれを含む。

いくつかの実施形態において、第１および第２の細胞型は、非新生物細胞、形質転換細胞の表現型、前癌性の表現型、および新生物の表現型からなる群からの異なる選択である。標的器官（複数可）は、肝臓、脳、肺、乳房、膵臓、結腸、および腎臓からなる群から選択され得る。

いくつかの実施形態において、１つ以上のポリペプチドのうちの少なくとも１つは、治療増強因子を含む。治療増強因子は、
（ｉ）ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５ ＣＸＣＬ９、およびＣＸＣＬ１０のうちの１つ以上から選択される免疫応答および炎症に関与するサイトカイン（またはそれらのリガンド）、
（ｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ９のうちの１つ以上から選択される樹状細胞活性化剤、
（ｉｉｉ）ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１６０、２Ｂ４、Ｔｉｍ−３、ＧＰ−２、Ｂ７Ｈ３、およびＢ７Ｈ４のうちの１つ以上から選択されるそれらの細胞受容体およびそれらのリガンドを標的とする分子、
（ｉｖ）ＴＧＦ β阻害剤、
（ｖ）Ｔ細胞膜タンパク質３阻害剤、
（ｖｉ）プログラム死１（ＰＤ１）、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤＬ２）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、およびリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）の阻害剤、ならびに
（ｖｉｉ）ＮＦ−κＢ阻害剤、からなる群から選択され得る。

ｍＲＮＡは、１つより多くのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み得る。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、配列番号１８〜２９からなる群のうちの１つから選択される配列を含む。

別の態様では、本明細書に記載される単離されたｍＲＮＡ配列と、送達粒子と、送達粒子内に含まれる配列と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物が、提供される。送達粒子は、アミノアルコールリピドイド粒子、リポソーム、エクソソーム、細胞由来の小胞、およびポリマー粒子からなる群の少なくとも１つから選択され得る。

いくつかの実施形態において、送達粒子は、標的器官（複数可）のうちの１つ以上を標的とする。そのような場合、送達粒子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、糖タンパク質、脂質、小分子、および核酸から選択される標的化剤を含み得、標的化剤は、標的器官（複数可）の細胞と優先的に会合する。

なおさらなる態様では、本明細書に記載のｍＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド発現ベクター構築物が、提供される。

さらに別の態様では、本明細書に記載のｍＲＮＡ配列またはポリヌクレオチド発現ベクター構築物を含むウイルスベクターが、提供される。

別の態様は、癌の治療のための方法を提供し、本方法は、本明細書に記載の単離されたｍＲＮＡ配列、組成物、ベクター構築物、またはウイルスベクターを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。

本方法は、治療または治療薬を対象に施すことをさらに含み得る。治療または治療薬は、化学療法、放射線療法、生物学的因子、腫瘍溶解性ウイルス、小分子薬、ＣＡＲ−Ｔまたは養子細胞療法、およびそれらの組み合わせから選択され得る。本方法の実施形態において、対象は、ヒトであるか、または非ヒト動物である。

ある特定の実施形態において、癌は、肝臓、脳、肺、乳房、膵臓、結腸直腸、および腎臓の癌、好適には肝癌からなる群の少なくとも１つから選択される。肝癌は、原発性肝癌または続発性肝癌を含み得る。原発性肝癌は、肝細胞癌、肝芽腫、胆管細胞癌、および血管肉腫からなる群から選択され得る。続発性肝癌は、既知または未知の原発性固形腫瘍からの転移性肝癌であり得る。

本方法は、腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与することをさらに含み得る。そのような実施形態において、単離されたｍＲＮＡ配列は、腫瘍溶解性ウイルスの有効性を高める治療薬をコードし得る。腫瘍溶解性ウイルスは、１つ以上の病原性遺伝子の変異によって弱毒化されている可能性があり、そのような実施形態において、ｍＲＮＡ配列は、１つ以上の病原性遺伝子、またはその等価物もしくはホモログをコードし得る。いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスのボルティモア分類の第Ｉ〜ＶＩＩ群のいずれか１つから選択される。腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス、マラバウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、コクサッキーウイルスＡ２１、パルボウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、ワクシニアウイルス、およびアデノウイルスのうちの１つ以上を含む群から選択され得る。典型的には、腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルスである。

記載される方法は、いくつかの実施形態において、ＣＡＲ−Ｔまたは適応細胞療法を対象に投与することをさらに含み得る。そのような実施形態において、単離されたｍＲＮＡ配列、組成物、ベクター構築物、またはウイルスベクターは、
（ｉ）ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５ ＣＸＣＬ９、およびＣＸＣＬ１０のうちの１つ以上から選択される免疫応答および炎症に関与するサイトカイン（またはそれらのリガンド）、
（ｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ９のうちの１つ以上から選択される樹状細胞活性化剤、
（ｉｉｉ）ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１６０、２Ｂ４、Ｔｉｍ−３、ＧＰ−２、Ｂ７Ｈ３、およびＢ７Ｈ４のうちの１つ以上から選択されるそれらの細胞受容体およびそれらのリガンドを標的とする分子、
（ｉｖ）ＴＧＦ β阻害剤、
（ｖ）Ｔ細胞膜タンパク質３阻害剤、
（ｖｉ）プログラム死１（ＰＤ１）、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤＬ２）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、およびリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）の阻害剤、ならびに
（ｖｉｉ）ＮＦ−κＢ阻害剤、からなる群から選択される１つ以上の免疫調節分子をコードし得る。

本方法は、他の実施形態において、細胞チェックポイント阻害剤を対象に投与することをさらに含む。再び、そのような実施形態において、単離されたｍＲＮＡ配列、組成物、ベクター構築物、またはウイルスベクターは、
（ｉ）ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５ ＣＸＣＬ９、およびＣＸＣＬ１０のうちの１つ以上から選択される免疫応答および炎症に関与するサイトカイン（またはそれらのリガンド）、
（ｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ９のうちの１つ以上から選択される樹状細胞活性化剤、
（ｉｉｉ）ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１６０、２Ｂ４、Ｔｉｍ−３、ＧＰ−２、Ｂ７Ｈ３、およびＢ７Ｈ４のうちの１つ以上から選択されるそれらの細胞受容体およびそれらのリガンドを標的とする分子、
（ｉｖ）ＴＧＦ β阻害剤、
（ｖ）Ｔ細胞膜タンパク質３阻害剤、
（ｖｉ）プログラム死１（ＰＤ１）、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤＬ２）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、およびリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）の阻害剤、ならびに
（ｖｉｉ）ＮＦ−κＢ阻害剤、からなる群から選択される１つ以上の免疫調節分子をコードし得る。

さらなる態様では、本明細書に記載の単離されたｍＲＮＡ配列、ベクター構築物、またはウイルスを含む組成物、または本明細書に記載の組成物は、医療で使用するために提供される。

別の態様では、本明細書に記載の単離されたｍＲＮＡ配列、ベクター構築物、またはウイルスを含む組成物、または本明細書に記載の組成物は、癌の治療における使用のために提供され、好適には、癌は、肝臓、脳、肺、乳房、膵臓、結腸直腸、および腎臓の癌からなる群から選択される。

本発明は、添付の図面を参照することによりさらに説明される。
本発明の一実施形態によるリピドイドカプセル化ｍＲＮＡ組成物の投与方法の概略図を示す。 ＤＮＡ合成ベクターを産生するためのクローニング方法の一例を示しており、該ベクターは、本発明の実施形態によるｍＲＮＡ構築物を生成するために使用された。 本発明の実施形態で使用され、かつ図４に示されるｍＲＮＡ構築物の３つのバリアント、およびコード配列の３’側に位置するＵＴＲ配列内のまたは該配列に隣接する一対のｍｉＲＮＡ結合配列（ここではｍｉＲ−１２２に結合する配列）の挿入点の可能な選択肢を示す。 図３に示すｍＲＮＡ構築物を生成するためのＤＮＡプラスミド、鋳型プラスミド、および合成ベクターの例を示す。 図３に示すように、ｍＲＮＡ構築物バリアントを生成するための合成ベクターの生成に使用され得る方法の例を示す。 図３に示すように、ｍＲＮＡ構築物バリアントを生成するための合成ベクターの生成に使用され得る方法の例を示す。 図３に示すように、ｍＲＮＡ構築物バリアントを生成するための合成ベクターの生成に使用され得る方法の例を示す。 本発明の実施形態による送達粒子の調製に使用することができる成分化合物の例の化学式を示す。 本発明の実施形態による、ｍＲＮＡを含む送達粒子のナノ製剤の調製方法を示す。 本発明の実施形態によるｍＲＮＡを含み、図８に示されるカプセル化成分化合物をさらに含む、送達粒子の断面の構造を示す。 健康なヒト肝細胞培養（ヒト接着可能肝細胞、ＨＭＣＰＰ５）、ヒト肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）、およびヒト肝芽腫（ＨｅｐＧ２）細胞からの細胞に、本発明の実施形態による組成物をインビトロでトランスフェクトした実験の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。２つの送達粒子を投与した：１つは蛍光タンパク質ｍｃｈｅｒｒｙをコードするｍＲＮＡを含み（ｍＲＮＡ−ｍＣｈ−ＤＭＰ^ＣＴｘ）、もう１つは蛍光タンパク質ｍｃｈｅｒｒｙをコードするｍＲＮＡを含有するが、標的細胞中のｍｉＲＮＡ−１２２含有量によって差次的発現が制御される（ｍＲＮＡ−ｍＣｈ−１２２−ＤＭＰ^ＣＴｘ）。 図１０Ａの実験に従ってトランスフェクトした細胞の４８時間後の蛍光強度の定量化を示す。結果は、平均値±標準偏差として示される。統計的有意性は、ｔ検定を用いて決定した。アスタリスクは、トランスフェクト細胞におけるｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２の発現の統計的有意差を示している（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。 ヒト肝細胞（ＨＭＣＰＰ５）に、図１０Ａで使用した送達粒子を複数回（ＭＰＴ）または１回（ＳＴ）トランスフェクトした実験の結果のグラフを示す。ｍＣｈｅｒｒｙの発現は、トランスフェクションの２４、２８、７２、９６、１４４時間後に測定される蛍光強度のレベルによって決定される。結果は、平均値±標準偏差として示される。統計的有意性は、ｔ検定を用いて決定した。アスタリスクは、トランスフェクト細胞におけるｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２の発現の統計的有意差を示している（＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０５）。 トランスフェクション後２４時間に示されたｍＣｈｅｒｒｙの相対発現レベルを用いて、健康なマウス肝細胞（ＡＭＬ１２細胞株）に図１０Ａで使用した送達粒子をインビトロでトランスフェクトした実験の結果を示す蛍光顕微鏡画像を示す。 図１２Ａ、およびさらなるトランスフェクション後の時点である７２時間の結果について、カウントされたピクセル％としての蛍光強度の定量化を提供するグラフを示す。 ヒト肝細胞（ＨＭＣＰＰ５）、ヒト肝芽腫（ＨｅｐＧ２）、およびヒト肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）細胞に、ｍｉＲＮＡの差次的発現制御下で２５ｋＤａ分子量の例示的なヒトポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む本発明の実施形態による組成物をトランスフェクトした２つの実験（１回目の実行および２回目の実行）のウエスタンブロットの結果を示す。 単純ヘルペスウイルスバリアントＲ７０４１が、肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）および肝芽腫（ＨｅｐＧ２）のモデル由来のヒト細胞の生存率に与える影響を示す。相対的な細胞生存率に対するウイルス適用の効果が示されている。 肝細胞癌のモデル由来のヒト細胞を本発明の実施形態による組成物および方法で処理し、次いでＭＴＳ比色分析により試験したインビトロ実験の時間割を示す。 肝芽腫（図１６Ａ）のモデル由来のヒト細胞を、図１５の時間割に従って、ウイルス単独で、または本発明の実施形態による組成物と組み合わせて処理したインビトロ実験の結果を示す。組成物は、ＵＳ３をコードするｍＲＮＡを含む送達粒子である（ＵＳ３ ｍＲＮＡ ＤＭＰ^ＣＴｘ）。細胞生存率に対する治療の効果が示される。 肝細胞癌（図１６Ｂ）のモデル由来のヒト細胞を、図１５の時間割に従って、ウイルス単独で、または本発明の実施形態による組成物と組み合わせて処理したインビトロ実験の結果を示す。組成物は、ＵＳ３をコードするｍＲＮＡを含む送達粒子である（ＵＳ３ ｍＲＮＡ ＤＭＰ^ＣＴｘ）。細胞生存率に対する治療の効果が示される。 ヒト肝細胞癌のマウスモデルを使用したインビボ実験の結果を示す。図１７Ａは腫瘍増殖を示す（Ｈｅｐ３Ｂ細胞はルシフェラーゼで標識されている）。 ヒト肝細胞癌のマウスモデルを使用したインビボ実験の結果を示す。図１７Ｂは、ｍＣｈｅｒｒｙをコードするｍＲＮＡを用いた健康なマウス肝臓の蛍光顕微鏡画像を示す：ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤＭＰ^ＣＴｘ−ｍｉＲＮＡ１２２組成物を使用した場合、経口は検出されなかった。 図１７Ａに示されるのと同じマウスモデルを使用したインビボ実験の免疫組織化学顕微鏡の結果を示す。ＵＳ３をコードするｍＲＮＡを含む送達粒子（ＵＳ３ ｍＲＮＡ ＤＭＰ^ＣＴｘ ｍｉＲＮＡ−１２２）は、尾静脈を介して投与され、腫瘍性組織におけるＵＳ３タンパク質のより濃い染色によって証明されるように、非罹患肝細胞と腫瘍性肝組織との間で差次的発現を提供する。腫瘍組織と非罹患組織の境界は破線で示されている。 本発明によるｍＲＮＡ構築物において使用することができるｍｉＲＮＡ結合部位配列の例を示す。 ５つまでの結合部位が含まれる、本発明のいくつかの実施形態によるｍＲＮＡ構築物の例の一般的な概略図を示す。 本発明によるｍＲＮＡ構築物において使用することができる結合部位配列の組み合わせの例を示す。 本発明によるｍＲＮＡ構築物において使用することができる結合部位配列の組み合わせの例を示す。 いくつかの実施形態による、複数のポリペプチドのコード配列を含むコード配列の特定の組み合わせ、および結合部位を示す。

別段の指示のない限り、本発明の実施は、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、および化学的方法の従来技術を使用するものであり、これらは当業者の能力の範囲内である。そのような技術は、例えば、Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ １−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ １６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）、Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ Ａ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ，１９９０，Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、およびＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ ａｎｄＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどの文献においても説明されている。これらの一般的な教科書の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明を説明する前に、本発明の理解を助ける多くの定義が提供される。本明細書で引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、記載される要素のいずれかが必ず含まれ、他の要素も同様に任意選択的に含まれ得ることを意味する。「〜から本質的になる」は、記載される要素が必ず含まれ、列挙される要素の基本的および新規の特性に実質的に影響を及ぼす要素が除外され、他の要素が任意選択的に含まれ得ることを意味する。「〜からなる」は、列挙されるもの以外の全ての要素が除外されることを意味する。これらの用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。

「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド配列に適用される場合、配列がその起源である天然生物から除去され、したがって、外来のまたは望ましくないコード配列または調節配列を含まないことを意味する。単離された配列は、組換えＤＮＡプロセスおよび遺伝子操作されたタンパク質合成システムにおける使用に適している。そのような単離された配列は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびゲノムクローンを含む。単離された配列は、タンパク質をコードする配列のみに限定され得るか、またはプロモーターおよび転写ターミネーターなどの５’および３’調節配列を含んでもよい。本発明をさらに説明する前に、本発明の理解を助ける多くの定義が提供される。

「ポリヌクレオチド」は、各ヌクレオチドの３’および５’末端がホスホジエステル結合によって結合された、ヌクレオチドの一本鎖または二本鎖の共有結合配列である。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基で構成され得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、インビトロで合成的に製造されてもよいか、または天然源から単離されてもよい。ポリヌクレオチドのサイズは、典型的には、二本鎖ポリヌクレオチドの場合は塩基対の数（ｂｐ）として、または一本鎖ポリヌクレオチドの場合はヌクレオチドの数（ｎｔ）として表される。１０００ｂｐまたはｎｔは１キロベース（ｋｂ）に等しい。約４０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチドは、典型的には「オリゴヌクレオチド」と称される。本明細書で使用される「核酸配列」という用語は、各ヌクレオチドの３’および５’末端がホスホジエステル結合によって結合された、ヌクレオチドの一本鎖または二本鎖の共有結合配列である。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基で構成され得る。核酸配列は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含んでもよく、インビトロで合成的に製造されてもよいか、または天然源から単離されてもよい。本明細書で「ポリヌクレオチド」とも称される核酸配列のサイズは、典型的には、二本鎖ポリヌクレオチドの場合は塩基対の数（ｂｐ）として、または一本鎖ポリヌクレオチドの場合はヌクレオチドの数（ｎｔ）として表される。１０００ｂｐまたはｎｔは、１キロベース（ｋｂ）に等しい。約４０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチドは、典型的には「オリゴヌクレオチド」と称され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などによるＤＮＡの操作に使用されるプライマーを含み得る。

本明細書で使用される「核酸」という用語は、各ヌクレオチドの３’および５’末端がホスホジエステル結合によって結合された、ヌクレオチドの一本鎖または二本鎖の共有結合配列である。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基で構成され得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含んでもよく、インビトロで合成的に製造されてもよいか、または天然源から単離されてもよい。核酸は、修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、例えばメチル化されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、または翻訳後修飾、例えば７−メチルグアノシンによる５’キャッピング、切断およびポリアデニル化などの３’プロセシング、ならびにスプライシングを受けたＲＮＡをさらに含み得る。核酸はまた、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）などの合成核酸（ＸＮＡ）も含み得る。本明細書で「ポリヌクレオチド」とも称される核酸のサイズは、典型的には、二本鎖ポリヌクレオチドの場合は塩基対の数（ｂｐ）として、または一本鎖ポリヌクレオチドの場合はヌクレオチドの数（ｎｔ）として表される。１０００ｂｐまたはｎｔは、１キロベース（ｋｂ）に等しい。約１００ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチドは、典型的には「オリゴヌクレオチド」と称され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などによるＤＮＡの操作に使用されるプライマーを含み得る。本発明の特定の実施形態において、核酸配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。

本発明によれば、本明細書に記載の核酸配列に対する相同性は、単に１００％の配列同一性に限定されない。多くの核酸配列は、明らかに低い配列同一性を有するにもかかわらず、互いに対して生化学的または機能的等価性を示し得る。本発明において、相同な核酸配列は、低ストリンジェンシーの条件下で互いにハイブリダイズするものであるとみなされる（ＳａｍｂｒｏｏｋＪら、上記参照）。これに関して、２つの配列に関する「実質的に類似」という用語は、配列が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の類似性を有することを意味する。同様に、２つの配列に関して「実質的に相補的」という用語は、配列が完全に相補的であること、または塩基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％が相補的であることを意味する。すなわち、ハイブリダイズすることを目的とする配列の塩基間でミスマッチが発生する可能性があり、これは、塩基の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、または最大３０％で発生する可能性がある。

例えば、発現構築物において核酸配列に適用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、意図する目的を達成するために協調して機能するように配列が配置されることを示す。例として、ＤＮＡベクターにおいて、プロモーター配列が転写の開始を可能にし、これは連結されたコード配列を介して終止配列まで進行する。ＲＮＡ配列の場合、１つ以上の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と称される結合されたタンパク質コード配列に対して配置され得る。所定のｍＲＮＡは、１つより多くのＯＲＦ、いわゆるポリシストロン性ＲＮＡを含んでもよい。ＵＴＲは、作動可能に連結されたコード配列ＯＲＦに対して５’側または３’側に位置し得る。ＵＴＲは、コザックコンセンサス配列、開始コドン、シス作用調節エレメント、ポリＡテール、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ｍＲＮＡ寿命を調節する構造、ｍＲＮＡの局在化を指示する配列などの、天然に見られるｍＲＮＡ配列において典型的に見られる配列を含む場合がある。ｍＲＮＡは、同じまたは異なる複数のＵＴＲを含み得る。

本発明の文脈における「ポリペプチドを発現する」という用語は、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列がコードするポリペプチドの産生を指す。典型的には、これは、配列が送達される細胞のリボソーム機構による供給されたｍＲＮＡ配列の翻訳を伴う。

本明細書で使用される「送達粒子」という用語は、カプセル化、マトリックス内での保持、複合体の形成または他の手段によって治療成分を含むことができ、コード核酸配列などの治療成分を標的細胞に送達することができる粒子を指す。送達粒子はマイクロスケールであり得るが、特定の実施形態において、典型的にはナノスケール、すなわちナノ粒子であり得る。ナノ粒子は、典型的には少なくとも５０ｎｍ（ナノメートル）、好適には少なくとも約１００ｎｍであり、典型的には最大でも１５０ｎｍ、２００ｎｍであるが、任意選択的に最大３００ｎｍの直径である。本発明の一実施形態において、ナノ粒子は、少なくとも約６０ｎｍの平均直径を有する。これらのサイズの利点は、粒子が細網内皮系（単核食細胞系）クリアランスの閾値を下回ること、すなわち、粒子が身体の防御機構の一部として食細胞によって破壊されないほど小さいことを意味することである。これにより、本発明の組成物の静脈内送達経路の使用が容易になる。

ナノ粒子の組成物の代替的な可能性として、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、リポソームなどの脂質またはリン脂質に基づく粒子；タンパク質および／または糖タンパク質に基づく粒子、例えば、コラーゲン、アルブミン、ゼラチン、エラスチン、グリアジン、ケラチン、レグミン、ゼイン、大豆タンパク質、カゼインなどの乳タンパク質など（Ｌｏｈｃｈａｒｏｅｎｋａｌ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｖｏｌｕｍｅ ２０１４（２０１４））；ならびに金、銀、アルミニウム、酸化銅などの金属または金属化合物に基づく粒子が挙げられる。

特に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含むポリマーは、核酸の送達のために調査されてきた。ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）からなるナノ粒子ベクターも、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との共製剤において、核酸送達に適していることが示されている（Ｋａｃｚｍａｒｅｋ ＪＣ ｅｔ ａｌ Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２０１６；５５（４４）：１３８０８−１３８１２）。そのような共製剤の粒子は、ｍＲＮＡを肺に送達するために使用されてきた。

セルロース、キチン、およびキトサンなどの多糖類ならびにそれらの誘導体に基づく粒子も検討されている。キトサンは、キチンの部分脱アセチル化によって得られるカチオン性の直鎖状多糖類であり、この物質を含むナノ粒子は、生体適合性、低毒性および小さいサイズなどの薬物送達に有望な特性を備えている（Ｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２４，１９９８−Ｉｓｓｕｅ １１）。上記の構成要素間の組み合わせが使用され得ることが想定されている。

参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１０／０３３１２３４、ＵＳ２０１１／０２９３７０３およびＵＳ２０１５／０２０３４３９は、アミンをエポキシド末端化合物と反応させることによるアミノアルコールリピドイドの生成を記載している。ナノ粒子を含む複合体、ミセル、リポソーム、および粒子は、これらのリピドイドを用いて調製することができ、それらの化学構造のために、ヒトまたは動物対象の体内の標的細胞型への「カーゴ」（例えば、ｍＲＮＡをコードするなどの核酸）の送達に特に適している。第３級アミンがプロトン化に利用可能であり、カチオン性部分を形成することを考慮すると、アミノアルコールリピドイド化合物を含む送達プラットフォームは、正味の負電荷を有するカーゴ分子の送達における使用に特に適している。例えば、アミノアルコールリピドイド化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のポリヌクレオチドカーゴを対象または標的細胞または組織に送達するための微粒子組成物の調製に使用することができる。好適な粒子は、微粒子、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、またはミセルの形態であり得る。

アミノアルコールリピドイドに基づく送達粒子は、コードｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドカーゴと相互作用するために利用可能な第３級アミンを保有する。ポリヌクレオチドまたはその誘導体を、ポリヌクレオチド／リピドイド複合体を形成するのに適した条件下でアミノアルコールリピドイド化合物と接触させる。リピドイドは、負電荷を有するポリヌクレオチドと複合体を形成するように、少なくとも部分的にプロトン化されていることが好ましい。このようにして、ポリヌクレオチド／リピドイド複合体は、カーゴポリヌクレオチドの細胞および組織への送達に有用な粒子を形成する。ある特定の実施形態において、複数のアミノアルコールリピドイド分子は、ポリヌクレオチド分子と関連し得る。複合体は、少なくとも１個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、または好適には少なくとも１００個のアミノアルコールリピドイド分子を含み得る。複合体は、最大でも１０，０００個、最大でも５０００個、最大でも２０００個、最大でも１０００個、最大でも５００個、または典型的には最大でも１００個のアミノアルコールリピドイド分子を含み得る。

当業者は、粒子の集団が粒子サイズ分布の原理に従うことを理解するであろう。粒子サイズ分布を説明するために広く使用されている、当該技術分野で認識されている方法は、例えば、平均直径、および所与の試料の粒子サイズの範囲の平均直径を表すために一般的に使用されるＤ５０値などのＤ値を含む。ある特定の実施形態において、ナノ粒子の直径は、１０〜５００ｎｍの範囲であり、より好適には粒子の直径は、１０〜１２００ｎｍ、特に５０〜１５０ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、少なくとも約１０ｎｍ、好適には少なくとも約３０ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、平均直径が約１５０ｎｍ未満であり、平均で５０ｎｍを超える平均直径を有する。

粒子はさらに、送達粒子の標的細胞型への結合を促進する標的化剤と関連し得る。本明細書で使用される「標的」という用語は、体内の特定の器官、組織、または細胞型内の細胞のトランスフェクションと関連し、それを促進することを目的とする、送達粒子を含むなどの物体または組成物を指す。特定の実施形態において、送達粒子（送達ナノ粒子など）は、そのカーゴを特定の器官、組織または細胞型にのみ送達するように標的化され得る。標的化は、例えば、標的とする物体を特定の組織に直接送達することによって地理的であってもよいか、または標的細胞もしくは組織と優先的に会合する標的化剤もしくは結合部分を介して化学的に媒介されてもよい。

薬学的組成物を特定の細胞に向かわせる様々な標的化剤が当該技術分野で既知である（例えば、Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ．２１７：６１８，１９９３、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １４，Ｉｓｓｕｅ １，Ａｐｒｉｌ−Ｍａｙ １９９４，１１３−１３５、Ｆｉｕｍｅ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １４，Ｉｓｓｕｅ １，Ａｐｒｉｌ−Ｍａｙ １９９４，５１−６５を参照されたい）。標的化剤は粒子全体に含まれていても、表面のみに局在していてもよい。標的化剤は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、糖タンパク質、脂質、小分子、核酸などであり得る。標的化剤は、特定の細胞もしくは組織を標的とするために使用され得るか、または粒子のエンドサイトーシスもしくは食作用を促進するために使用され得る。標的化剤の例としては、抗体、抗体の断片、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のｇｐ１２０エンベロープタンパク質、炭水化物、受容体リガンド、シアル酸が挙げられるが、これらに限定されない。標的化剤が粒子全体に分布している場合、標的化剤は、粒子を形成するために使用される混合物または複合物に含まれてもよい。標的化剤が表面にのみ位置する場合、標的化剤は、標準的な化学技術、例えば共有結合、疎水性、水素結合、ファンデルワールス、ビオチン−アビジン結合、または他の相互作用を用いて形成される粒子に関連し得る。

本発明の特定の実施形態の微粒子組成物は、カプセル化用の生分解性非毒性ポリマーまたは生体適合性材料の特定の選択または配合によって制御され得る期間にわたってカプセル化されたｍＲＮＡカーゴを好適に送達し得る。例えば、微粒子組成物は、カプセル化されたｍＲＮＡカーゴを少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、または少なくとも１日にわたって放出し得る。微粒子組成物は、カプセル化されたｍＲＮＡカーゴを最大でも２日間、最大でも３日間、または最大でも７日間にわたって放出し得る。

本明細書で使用される「罹患」という用語は、「罹患細胞」および／または「罹患組織」のように、異常、不健康または病態を示す組織および器官（またはその一部）および細胞を示す。例えば、罹患細胞は、ウイルス、細菌、プリオン、または真核生物の寄生虫に感染している場合があり、有害な突然変異を含む場合があり、かつ／または癌性、前癌性、腫瘍性もしくは新生物性であり得る。罹患細胞は、それ以外の点では正常であるかまたはいわゆる健康な細胞と比較した場合に、変化した細胞内ｍｉＲＮＡ環境を含み得る。特定の場合において、罹患細胞は病理学的に正常であり得るが、疾患の前駆状態を表す変化した細胞内ｍｉＲＮＡ環境を含む。罹患組織は、別の器官または器官系からの罹患細胞によって浸潤された健康な組織を含む場合がある。例として、多くの炎症性疾患は、それ以外の点では健康な器官がＴ細胞および好中球などの免疫細胞による浸潤に供される病態を含む。さらなる例として、狭窄性または硬化性の病変の対象となる器官および組織は、近接した健康な細胞および罹患細胞の両方を含み得る。

本明細書で使用される「癌」という用語は、特定の組織において始まる原発性癌、または他の場所からの転移によって広がった続発性癌であり得る悪性腫瘍を含む組織の新生物を指す。癌、新生物、および悪性腫瘍という用語は、本明細書において互換的に使用される。癌は、新生物内に位置するか、または新生物に関連する特性を示す、組織または細胞を意味し得る。新生物は、典型的には、正常組織および正常細胞とそれらを区別する特性を有する。そのような特性には、ある程度の退形成、形態の変化、形状の不規則性、細胞接着性の低下、転移する能力、および細胞増殖の増加が含まれるが、これらに限定されない。「癌」に関連し、またしばしば「癌」と同義である用語は、肉腫、癌腫、悪性腫瘍、上皮腫、白血病、リンパ腫、形質転換、新生物などを含む。本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、前悪性腫瘍、および／または前癌性腫瘍、ならびに悪性癌を含む。

本明細書で使用される「健康な」という用語は、「健康な細胞」および／または「健康な組織」のように、それ自体は罹患しておらず、典型的には正常に機能する表現型に近い組織および器官（またはその一部）ならびに細胞を示す。本発明の文脈において、「健康な」という用語は相対的であり、例えば、腫瘍に冒された組織中の非新生物細胞は、絶対的な意味で完全に健康ではない可能性があることが理解できる。したがって、「不健康な細胞」は、それ自体は新生物性、癌性または前癌性ではないが、例えば、硬化性、炎症性、感染性であり得るか、または別様に罹患している可能性のある細胞を意味するために使用される。同様に、「健康または不健康な組織」は、全体的な健康状態に関係なく、腫瘍、新生物細胞、癌性細胞もしくは前癌性細胞のない組織またはその一部、あるいは上記の他の疾患を意味するために使用される。例えば、癌性および線維性組織を含む器官の文脈において、線維性組織内に含まれる細胞は、癌性組織と比較して比較的「健康」であると考えられ得る。

代替の実施形態において、細胞、細胞型、組織および／または器官の健康状態は、ｍｉＲＮＡ発現の定量化によって決定される。癌などの特定の疾患の種類において、特定のｍｉＲＮＡ種の発現が影響を受け、影響を受けていない細胞と比較して上方制御され得るかまたは下方制御され得る。ｍｉＲＮＡトランスクリプトームにおけるこの違いは、相対的な健康状態を特定するため、ならびに／または健康な細胞、細胞型、組織、および／もしくは器官の疾患状態への進行を追跡するために使用することができる。疾患状態は、新生物細胞への様々な形質転換段階を含み得る。本発明の実施形態において、異なる細胞型におけるタンパク質発現を制御するために、所与の器官または器官系内に含まれる細胞型のｍｉＲＮＡトランスクリプトームの差次的変動が利用される。

本明細書で使用される場合、「器官」という用語は、「器官系」と同義語であり、生理学的機能、解剖学的機能、恒常性維持機能、または内分泌機能などの生物学的機能を提供するために、対象の体内で区画化され得る組織および／または細胞型の組み合わせを指す。好適には、器官または器官系は、肝臓または膵臓などの血管が発達した器官を意味し得る。典型的には、器官は、少なくとも２つの組織型、および／またはその器官に特徴的な表現型を示す複数の細胞型を含む。

本明細書で使用される「治療用ウイルス」という用語は、時には直接的なウイルス溶解（腫瘍溶解）によって、癌細胞に感染して死滅させることができるが、宿主の抗腫瘍応答の刺激による間接的な死滅も含むウイルスを指す。腫瘍溶解性ウイルスは、健康な細胞と比較して、癌細胞を含む罹患細胞における活性が高いことを特徴とすることが多い。

腫瘍溶解性ウイルスの例は、表１に提供されるものおよびそのサブタイプを含む。

本発明の実施形態において、ウイルスは、ウイルスのボルティモア分類の第Ｉ〜ＶＩＩ群のいずれか１つから選択することができる（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｄ（１９７１）。“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ”．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ Ｒｅｖ．３５（３）：２３５−４１）。本発明の特定の実施形態において、好適なウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルスゲノムを有することを特徴とするボルティモア第Ｉ群、一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムを有するＩＶ群、および一本鎖のマイナス鎖ＲＮＡゲノムを有するＶ群から選択され得る。

本明細書で使用される「病原性遺伝子」または「病原性因子」という用語は、それが感染する細胞内での腫瘍溶解性ウイルスまたは細胞溶解などの治療用ウイルスの複製を助ける遺伝子または遺伝子産物を指す。「複製因子」という用語は、本明細書において同義語として使用される。病原性因子は、典型的には、ウイルスゲノムによってコードされるウイルス遺伝子であり得る。病原性因子は、細胞内免疫系の抑制および回避、ウイルスゲノム複製、ビリオンの拡散または伝播、構造コートタンパク質の産生またはアセンブリ、潜在状態のウイルスの活性化、ウイルス潜伏の防止、および宿主細胞プロセスの引継ぎなどの機能に関与している可能性がある。いくつかの病原性因子は、ウイルスゲノムが欠如している場合、これらの遺伝子の機能を補うことができる細胞または他の等価物を有する。いくつかのウイルスは、複製、細胞の溶解、および拡散の能力を高める外因性の病原性遺伝子で修飾することができる。

本発明の特定の実施形態において、ｍＲＮＡ配列は、腫瘍におけるビリオン複製を優先的に増強する１つ以上のタンパク質またはポリペプチドの差示的発現により、器官内に位置する腫瘍における同時投与されたウイルスの腫瘍溶解能を増強または維持する。このようにして、ｍＲＮＡは、複製の増加および／または直接的な腫瘍溶解効果の増加および／またはウイルス子孫の増加および／または適応抗腫瘍免疫応答により、腫瘍溶解性ウイルスの生物学的活性を増強する１つ以上の因子をコードし得る。本発明のさらなる実施形態において、組成物は、腫瘍内の宿主免疫細胞と腫瘍溶解性ウイルスとの間の相互作用を制御する遺伝子産物をコードし得る。さらなる実施形態において、本発明の組成物を使用して、腫瘍溶解性ウイルス活性の差次的パターン、ならびにビリオンを介して、外因的に、または本発明の送達粒子を介して投与される免疫共刺激分子の発現を調節する、遺伝子産物を産生することができる。

本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、天然でまたは合成手段によってインビトロで生成されるかどうかにかかわらず、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基のポリマーである。約１２アミノ酸残基長未満のポリペプチドは、典型的には「ペプチド」と称され、約１２〜約３０アミノ酸残基長のポリペプチドは「オリゴペプチド」と称され得る。本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、天然に存在するポリペプチド、前駆体形態、またはプロタンパク質の産物を意味する。また、ポリペプチドは、グリコシル化、タンパク質分解切断、脂質化、シグナルペプチド切断、プロペプチド切断、リン酸化などを含み得るが、これらに限定されず、成熟または翻訳後修飾プロセスを受けることもできる。「タンパク質」という用語は、１つ以上のポリペプチド鎖を含む高分子を指すために本明細書において使用される。

本明細書で使用される「遺伝子産物」という用語は、本明細書に記載の本発明のｍＲＮＡ構築物内に含まれる少なくとも１つのコード配列またはＯＲＦの産物を指す。遺伝子産物（複数可）は、ポリペプチドまたはタンパク質を含んでもよい。複数の遺伝子産物の産生をもたらす、ポリシストロン性ｍＲＮＡ構築物が、使用され得る。複数のＯＲＦが、機能的に協働し得る、または多様な生物学的および潜在的に治療効果を有する複合体および／または多量体タンパク質を形成し得る様々な製品の原位置での生成をもたらし得ることが理解される。

ｍＲＮＡを細胞に直接送達すると、細胞内のポリペプチドおよび／またはタンパク質などの所望の遺伝子産物の直接的かつ制御可能な翻訳が可能になる。ｍＲＮＡの提供は、ｍｉＲＮＡ媒介性の制御（後述の特定の実施形態に詳述）などの細胞発現調節機構の使用を具体的に可能にするだけでなく、エピソームのまたはゲノムに挿入されたＤＮＡベクターが提供する可能性のある標的細胞のトランスクリプトームの潜在的な恒久的変化ではなく、産物の有限かつ消耗可能な供給も説明する。

本発明の実施形態において、全体として核酸配列に組織特異性および安定性を付与し得る１つ以上の非翻訳領域（ＵＴＲ）と作動可能に組み合わせて、少なくとも１つのポリペプチドをコードする配列を含むｍＲＮＡ配列が提供される。「組織特異性」は、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質産物の翻訳がＵＴＲの存在に従って調節されることを意味する。調節は、ｍＲＮＡのタンパク質産物への検出可能な翻訳の許可、低減、または阻止さえも含む。ＵＴＲは、ｍＲＮＡに対して直接シスに、すなわち、同じポリヌクレオチド鎖上に連結され得る、代替の実施形態において、遺伝子産物をコードする第１の配列が提供され、第１の配列の一部にハイブリダイズするさらなる第２の配列が提供され、これは、全体として核酸配列に組織特異性を付与する１つ以上のＵＴＲを含む。この後者の実施形態において、ＵＴＲは、遺伝子産物をトランスにコードする配列に作動可能に連結される。

本発明の特定の実施形態によれば、非罹患肝組織、例えば、健康な肝細胞において、遺伝子産物の発現を防止するまたは減少させるのに必要であるように、作動可能に連結されたそのような関連核酸配列を含むｍＲＮＡが提供される。そのため、リボソーム動員ならびに組織および／または器官特異的発現に必要な５’キャップおよびＵＴＲ（典型的にはそうであるが、ＯＲＦの３’に限定的に位置付けられるものではない）、ならびにそれぞれ１つ以上のＯＲＦを定義する開始コドンおよび終止コドンを含む、ｍＲＮＡ構築物または転写物が提供される。構築物が非罹患肝臓、肺、膵臓、乳房、脳、腎臓、および／または結腸ＧＩ管に導入されると、遺伝子産物の発現が妨げられるかまたは減少される。対照的に、前述の器官内に含まれる腫瘍性またはその他の疾患細胞は、典型的には、正常な非罹患肝細胞の発現パターンに適合せず、全く異なるｍｉＲＮＡトランスクリプトームを有する。ｍＲＮＡに含まれる遺伝子産物（複数可）は、これらの異常な細胞で特異的に翻訳されるが、隣接する健康な細胞では翻訳されない。上記の器官へのｍＲＮＡ構築物の送達は、本明細書に記載の粒子送達プラットフォームを介して、または当該技術分野で公知の任意の適切な方法で達成され得る。細胞型特異的発現は、後により詳細に説明するようなマイクロＲＮＡ調節機構を介して媒介され得る。

本明細書で定義される「治療成分」または「治療薬」は、治療的介入の一部として個々のヒトまたは他の動物に投与されたときに、その個々のヒトまたは他の動物に対する治療効果に寄与する分子、物質、細胞、または生物を指す。治療効果は、治療成分自体によって、または治療的介入の別の成分によって引き起こされ得る。治療成分は、コード核酸成分、特にｍＲＮＡであり得る。コード核酸成分（複数可）は、以下に定義されるように、治療増強因子をコードし得る。治療成分はまた、薬物、任意選択的に小分子またはモノクローナル抗体（もしくはその断片）などの化学療法薬を含んでもよい。いくつかの実施形態において、治療成分は、組換えによって修飾された免疫エフェクター細胞などの細胞、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞を含んでもよい。本発明の他の実施形態において、治療薬は、腫瘍溶解性ウイルスまたはウイルスベクターなどの治療用ウイルスを含む。

「治療効果」という用語は、対象に投与された物質、分子、組成物、細胞または生物を含む薬理学的または治療的に活性な薬剤によって引き起こされる、動物対象、典型的にはヒトにおける局所的または全身的効果を指し、「治療的介入」という用語は、そのような物質、分子、組成物、細胞または生物の投与を指す。したがって、この用語は、疾患の診断、治癒、緩和、治療もしくは予防における使用、または動物もしくはヒト対象の望ましい身体的もしくは精神的発達および状態の増強における使用を意図した任意の薬剤を意味する。「治療有効量」という句は、任意の治療に適用可能である妥当な利益／リスク比で所望の局所的または全身的効果をもたらすそのような薬剤の量を意味する。ある特定の実施形態において、薬剤の治療有効量は、その治療指数、溶解度などに依存するであろう。例えば、本発明の特定の治療薬は、そのような治療に適用可能である妥当な利益／リスク比を生じるのに十分な量で投与され得る。癌の治療の特定の状況において、「治療効果」は、固形腫瘍量の減少、癌細胞の数の減少、観察される転移の数の減少、平均余命の増加、癌細胞増殖の減少、癌細胞生存の減少、腫瘍細胞マーカーの発現の減少、および／または癌性状態に関連する様々な生理学的症状の改善を含むが、これらに限定されない、様々な手段によって顕在化し得る。

一実施形態において、治療が施される対象は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、霊長類、非ヒト哺乳動物、飼育動物または家畜、例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギなど）であり、好適にはヒトである。さらなる実施形態において、対象は、癌の動物モデルである。例えば、動物モデルは、ヒト由来の癌、好適には肝臓、肺、膵臓、乳房、脳、腎臓、および／または結腸−ＧＩ管癌の同所性異種移植動物モデルであり得る。

本発明の方法の特定の実施形態において、対象は、治療的ウイルス療法、化学療法、放射線療法、標的療法、および／または抗免疫チェックポイント療法等の治療処置をまだ受けていない。さらに別の実施形態において、対象は、前述の治療法などの治療処置を受けている。

さらなる実施形態において、対象は、癌性組織または前癌性組織を除去するための手術を受けている。他の実施形態において、癌性組織は除去されておらず、例えば、癌性組織は、外科的介入を受けた場合に対象の生命を損なう可能性がある組織などの体の手術不能領域、または外科的処置が恒久的な危害のかなりのリスクを引き起こすであろう領域に位置し得る。

いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、「治療増強因子」をコードし得る。本発明によれば、治療増強因子は、所与の細胞、好適には標的細胞に対して治療効果を発揮する別の同時投与される治療剤の能力を増強または促進し得る遺伝子産物またはポリペプチドである。標的細胞またはその近傍に導入されると、治療増強因子の発現は、同時投与される治療薬と協同し、それによって治療薬の治療活性を可能にするかまたは増強し得る。いくつかの実施形態において、治療増強因子は、同時投与された腫瘍溶解性ウイルスの癌細胞を溶解する能力を増強し得る。本発明の他の実施形態において、治療増強因子は、対象自身の免疫応答を支援または補充するために、腫瘍微小環境の変化をもたらし得る。この後者の実施形態において、腫瘍微小環境の変化は、腫瘍溶解性ウイルスまたはＣＡＲ−Ｔまたは他の養子細胞ベースの治療薬の同時投与を支援し得る。いくつかの実施形態において、治療増強因子は、プロドラッグの活性形態への変換を可能にし得る。

本発明の特定の実施形態による組成物中に複数の治療増強因子を組み合わせることができる。そのような実施形態において、各治療増強因子のコード配列は、別個のｍＲＮＡ分子に存在してもよい。いくつかの実施形態において、１つより多くの治療増強因子の配列が、同じｍＲＮＡ分子上に存在し得る。そのような場合、ポリシストロン性ｍＲＮＡ分子は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）などの全てのコード配列の発現に必要な配列をさらに含む。

複数の異なるｍＲＮＡ分子が１つ以上の送達系に含まれる実施形態において、各送達系（例えば、粒子、リポソーム、ウイルスベクターシステム）は、「ペイロード」として１つまたは１つより多くの種類のｍＲＮＡ分子を含み得ることが企図される：すなわち、特定の実施形態における全ての送達ペイロードが、必ずしも前記実施形態で提供されるｍＲＮＡ分子の全てを含むとは限らない。このようにして、本明細書に記載の標的化剤を用いて、異なる送達系およびそれらに関連する配列を異なる標的細胞に向けることも可能であると考えられる。

本発明の特定の実施形態のｍＲＮＡ構築物は、例えばＤＮＡプラスミドであり得るポリヌクレオチド発現構築物から合成され得る。この発現構築物は、ｍＲＮＡ構築物の転写が起こり得るように、転写の開始に必要な任意のプロモーター配列および対応する終止配列を含んでもよい。そのようなポリヌクレオチド発現構築物は、それ自体で本発明の実施形態を含むことが企図される。

ｍＲＮＡによってコードされる遺伝子産物は、典型的にはペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。特定のタンパク質が１つより多くのサブユニットからなる場合、ｍＲＮＡは、１つ以上のＯＲＦ内の１つまたは１つより多くのサブユニットをコードし得る。代替の実施形態において、第１のｍＲＮＡは、第１のサブユニットをコードすることができ、第２の同時投与ｍＲＮＡは、原位置で翻訳されるとマルチサブユニットタンパク質遺伝子産物の集合をもたらす第２のサブユニットをコードし得る。

ｍＲＮＡによってコードされる遺伝子産物は、治療効果をもたらすのに適した任意の種類のものであり得る。癌の治療に関連して、ｍＲＮＡによってコードされる遺伝子産物は、癌細胞によって発現されたときに癌細胞の破壊を引き起こすかまたは助ける遺伝子を好適に含み得る。

ｐ５３などの腫瘍抑制遺伝子が、本発明の構築物によって提供され得る。ｐ５３は、アポトーシスおよびゲノム安定性を含む細胞プロセスにおいて役割を果たす。それは、ゲノム損傷に応じてＤＮＡ修復プロセスの活性化に関与し、細胞の増殖および繁殖を阻止することができる。

アポトーシスによる細胞死を促進する遺伝子、いわゆる自殺遺伝子は、発現すると細胞にアポトーシスのプロセスを活性化させるが、本発明の組成物および構築物によって提供されてもよい。癌細胞は、しばしばこれらのアポトーシス関連遺伝子の変異したおよび／または機能のない形態を保有しているため、外部シグナルに応答してアポトーシスを起こすことはできない。自殺遺伝子療法は、非毒性化合物またはプロドラッグの致死薬への変換を可能にする遺伝子の導入を指す場合もある（Ｄｕａｒｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１２）。本発明の実施形態によれば、そのような遺伝子産物は、新生物細胞などの罹患細胞に選択的に導入することができ、誘導アポトーシスまたは他の無毒性化合物もしくはプロドラッグの送達による破壊についてそれらをマーキングすることができる。

本発明の特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、ＰＤ−１受容体（ＣＤ２７９）またはそのリガンドＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１；ＣＤ２７４）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ；ＣＤ２７３）の阻害剤などの、プログラム細胞死経路の阻害剤をコードすることができる。したがって、ｍＲＮＡは、標的器官内の罹患細胞または新生物細胞内のＰＤ−１／ＰＤＬ−１またはＰＤ−１／ＰＤＬ−２軸に結合するか、または別様にその機能に干渉するタンパク質またはポリペプチドをコードしてもよい。適切なタンパク質またはポリペプチドは、ＰＤ−１受容体、ＰＤＬ−１、ＰＤＬ−２、またはリガンドと受容体の複合体に結合するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、またはその抗原結合断片、または他の抗原結合マイクロタンパク質を含む。この効果は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）経路のタンパク質またはポリペプチド阻害剤、別のいわゆる免疫チェックポイントの使用によっても観察され得る。いずれかまたは両方の経路の阻害は、患者の健康に確実に利益をもたらし得る腫瘍微小環境内の免疫応答の変化をもたらすことが分っている。さらに、対象の免疫応答を調節することにより、本発明の組成物は、放射線療法または化学療法などの他の抗癌治療アプローチとの併用療法において特定の有用性を示し得る。ＦＤＡが承認した抗ＰＤ１経路阻害剤は、ペンブロリズマブおよびニボルマブを含む。既知の抗ＰＤＬ−１阻害剤は、ＭＰＤＬ−３２８０Ａ、ＢＭＳ−９３６５５９、およびアテゾリズマブを含む。抗ＣＴＬＡ４治療阻害剤は、イピリムマブおよびトレメリムマブを含む。本発明の組成物は、これらの細胞における差次的なｍｉＲＮＡ環境を利用することにより、対象の標的器官内の罹患細胞にそのようなプログラム細胞死経路の阻害剤またはその機能的模倣物を選択的に送達するために使用され得る。

キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）は、免疫細胞、典型的にはＴリンパ球であり、癌細胞を標的とする受容体を発現するように修飾されている。

エクスビボで作製された自己抗原特異的Ｔ細胞の移植を伴う養子免疫療法は、ウイルス感染および癌を治療するための有望な戦略である。養子免疫療法に使用されるＴ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞の増殖または遺伝子工学によるＴ細胞のリダイレクションによって作製され得る（例えば、Ｐａｒｋ，Ｔ．Ｓ．，Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．”Ｔｒｅａｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ．”Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９（１１）：５５０−７）を参照されたい。

免疫エフェクター細胞としても知られるＴ細胞における新規特異性は、トランスジェニックＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の遺伝子導入によって成功裏に生成されている（例えば、Ｊｅｎａ，Ｂ．，Ｇ．Ｄｏｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．”Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ Ｔ−ｃｅｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｂｙ ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ａ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．”Ｂｌｏｏｄ １１６（７）：１０３５−４４）を参照されたい）。ＣＡＲは、少なくとも３つの部分からなる合成受容体である：細胞外抗原認識ドメイン（外部ドメインとも称される）、膜貫通ドメイン、および細胞内Ｔ細胞活性化ドメイン（内部ドメインとも称される）。いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、特定のクラスのＴ細胞、例えば、健康な細胞に影響を及ぼすことなく腫瘍細胞を選択的に標的とするＴ細胞のサブタイプである、γδＴ細胞を含む。ＣＡＲにより、リンパ腫や固形腫瘍を含む様々な悪性腫瘍に由来する腫瘍細胞の表面に発現された抗原に対してＴ細胞をリダイレクトすることに成功している（Ｊｅｎａ，Ｄｏｔｔｉら、上記参照）。いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、ＣＡＲ依存性のエフェクター機能を損なうことなく、内因性αβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現を排除して移植片対宿主応答を防止するようにＣＡＲ−Ｔ細胞が操作された自己Ｔ細胞集団を少なくとも含む。いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、少なくとも同種Ｔ細胞集団を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、少なくとも自己Ｔ細胞集団および同種Ｔ細胞集団を含む。

一般的に、細胞外抗原認識ドメインは、特定の標的、典型的には腫瘍関連標的に結合する抗体、受容体、またはリガンドドメインからの単一の融合分子内の１つ以上のシグナル伝達ドメインに関連する標的化部分である。いくつかの実施形態において、細胞外抗原認識ドメインは、柔軟なリンカーによって結合されたモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変断片を含む、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインの単鎖断片バリアント（ｓｃＦｖ）であるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態において、いくつかの実施形態において、細胞外抗原認識ドメインは、リンカー、例えばＩｇＧ１ヒンジリンカーなどの柔軟なリンカーによって膜貫通ドメインに連結される。いくつかの態様において、膜貫通はＣＤ２８膜貫通ドメインであるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態において、内部ドメインは、例えば、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞の生存を高め、かつ増殖を増加させることによって免疫応答を高めるように設計された共刺激ドメインと、Ｔ細胞が所望の標的に結合するときにＴ細胞を活性化するように設計された内部Ｔ細胞活性化ドメインとを含む。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメイン、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）共刺激ドメイン、ＩＣＯＳ共刺激ドメイン、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせであるか、またはそれらに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内Ｔ細胞活性化ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）ドメインまたはその生物学的に活性な部分を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞活性化は免疫細胞活性化をもたらし、炎症および／または免疫応答を促進するようにＴ細胞によって炎症性サイトカインが放出される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞活性化は細胞傷害活性をもたらし、癌細胞アポトーシスを促進するようにＴ細胞によって細胞毒が放出される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞活性化は増殖をもたらし、細胞の発達および分裂を促進するようにＴ細胞によってインターロイキンが放出される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞活性化は、免疫細胞活性化、細胞傷害活性、および／または増殖のうちの少なくとも２つの組み合わせをもたらす。

いくつかの実施形態において、細胞外抗原認識ドメインは、ＣＤ１９に特異的に結合する。Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）の大部分がＣＤ１９を均一に発現するのに対して、非造血細胞だけでなく、骨髄、赤血球、およびＴ細胞、ならびに骨髄幹細胞上では発現が見られないため、ＣＤ１９は、免疫療法の魅力的な標的である。Ｂ細胞悪性腫瘍のＣＤ１９を標的とする臨床試験が進められており、有望な抗腫瘍反応を示している。臨床試験で評価されている現在のＣＡＲ−Ｔ療法の多くは、ＣＤ１９特異的マウスモノクローナル抗体ＦＭＣ６３のｓｃＦｖ領域に由来する特異性を持つキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞を使用する（例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｌｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）；．“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＤ１９ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｂ ｌｉｎｅａｇｅ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｍａ．”Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７ Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；３４（１６−１７）：１１５７−６５、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｔｏｐｐ ｅｔ ａｌ．（２００３）．“Ｔ−ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｃａｎ ｂｅ ｒｅｎｄｅｒｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ＣＤ１９：ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−Ｂ−ｌｉｎｅａｇｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｅｆｆｅｃｔ．”Ｂｌｏｏｄ．２００３ Ｆｅｂ １５；１０１（４）：１６３７−４４、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊｅｎａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：ＷＯ２０１３／１２６７１２）を参照されたい）。

いくつかの実施形態において、細胞外抗原認識ドメインは、ＣＤ２２に特異的に結合する。ＣＤ２２は、レクチンのＳｉｇｌｅｃファミリーに属する膜貫通型リン糖タンパク質であり、そのＮ末端の７つの細胞外免疫グロブリンドメインでシアル酸と特異的に結合する。主に、Ｂ細胞の活性化およびシグナル伝達の阻害受容体として作用し、Ｂ細胞とＴ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）との相互作用を調節する。ＣＤ１９と同様に、ＣＤ２２はＢ細胞系統制限マーカーであり、プレＢ細胞期から成熟Ｂ細胞期までのＢリンパ系細胞によって明示的に発現される。しかしながら、形質細胞に分化する間に消失する。ＣＤ２２は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫等の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の様々なサブタイプを含む、ほとんどのＢ細胞悪性腫瘍で普遍的に発現する。Ｂ細胞悪性腫瘍の魅力的な治療標的としてＣＤ２２を標的にすることは、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体（例えば、エプラツズマブ）および免疫毒素（例えば、ＢＬ２２、ＨＡ２２）の臨床試験での肯定的な結果によって確認されている。ＣＤ２２は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞による治療後にＣＤ１９発現が消失したＡＬＬ細胞で発現することが示されており、抗ＣＤ２２ ＣＡＲ−Ｔ細胞を抗ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔの併用療法および／または後続療法に適したものにする。

しかしながら、多くの臨床研究により、癌治療のためのＣＡＲ Ｔ細胞の養子移入の可能性が示されていても、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）および「オンターゲット、オフ腫瘍」効果に関連するリスクも上昇している。

本明細書のいくつかの実施形態で提供されるｍＲＮＡ送達組成物は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の安全性および有効性を改善するのに有用である。例えば、本明細書に記載の実施形態のｍＲＮＡナノ粒子送達系は、特定の免疫細胞、またはＣＡＲ−Ｔ細胞などの免疫細胞の修飾されたサブセットを腫瘍微小環境に動員するために使用され得る。さらに、ｍＲＮＡナノ粒子送達系は、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現を阻害し、移植片対宿主病を回避するために、および／またはこれらの細胞の免疫チェックポイント遺伝子を選択的に削除して、抑制性腫瘍環境における抗ガン活性を強化するために使用され得る。（例えば、Ｍｏｆｆｅｔｔ，Ｃｏｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）“Ｈｉｔ−ａｎｄ−ｒｕｎ ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｙｔｏｒｅａｇｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｍＲＮＡ ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．８：３８９を参照されたい。）

いくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡは、ＣＡＲ−Ｔ細胞を対象の特定の部位に誘引するために使用される。いくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡは、免疫細胞の腫瘍微小環境への不十分な移動を克服するために使用される。特定のケモカインに応答して、異なる免疫細胞サブセットが腫瘍微小環境に移動し、時空間的に腫瘍免疫応答を調節する。いくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡは、ＣＡＲ−Ｔ細胞活性化を増強するために使用される。さらに、ケモカインは、腫瘍微小環境内の腫瘍細胞および血管内皮細胞を含む非免疫細胞を直接標的とすることができ、腫瘍細胞の増殖、癌幹細胞様の細胞特性、癌の浸潤性および転移を調節することが示されている。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、マクロファージもしくは樹状細胞等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、またはそれらの任意の組み合わせである。

いくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍微小環境への不十分な移動を克服し、標的外のＣＡＲ−Ｔ活性を防止するために使用され得る。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、腫瘍微小環境に送達され、コードｍＲＮＡは、ＣＡＲ−Ｔ細胞を腫瘍微小環境に引き付けるか、さもなければ補充する遺伝子産物をコードする。いくつかの態様において、コードｍＲＮＡは、ケモカインを発現する。非限定的な例として、１つ以上のコードｍＲＮＡは、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＸＣＬ１、およびそれらの任意の組み合わせなどのＴ細胞を誘引する１つ以上のケモカインをコードし得る。自己免疫疾患においてなど、逆の効果が所望される状況では、コードｍＲＮＡは上記因子の遮断薬、拮抗薬、および／または阻害剤を発現することができる。

いくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡは、腫瘍微小環境において一時的に発現される。いくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡは、例えば、活性化Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの腫瘍応答における免疫細胞の生存、増殖、および／または分化の調節に関与するサイトカインまたは他の遺伝子産物をコードする。非限定的な例として、コードｍＲＮＡは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、ＴＧＦ−β、およびそれらの任意の組み合わせなどのサイトカインをコードし得る。この場合も同様に、自己免疫疾患においてなど、逆の効果が所望される状況では、コードｍＲＮＡは、上記因子の遮断薬、拮抗薬、および／または阻害剤を発現することができる。

本発明のいくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡは、コードｍＲＮＡの一時的な発現を提供するために、ＣＡＲ−Ｔまたは他の養子細胞療法と併せて送達される。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｍＲＮＡ送達系は、遺伝子編集剤をコードするｍＲＮＡを標的細胞集団に送達する。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、遺伝子座を標的とし、標的細胞集団において産生される１つ以上の内因性遺伝子の発現を妨害する配列特異的ヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）関連遺伝子座を標的とする配列特異的ヌクレアーゼをコードし、それによってＴＣＲ内の１つ以上のドメインの発現を妨害する。

いくつかの実施形態において、記載のｍＲＮＡ送達系は、操作されたＴ細胞を所望の表現型に向けてプログラムする１つ以上の薬剤をコードするｍＲＮＡを送達するために使用され得る。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、所望のＴ細胞表現型に特徴的なマーカーおよび転写パターンを誘導するために使用され得る。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、ＣＡＲ−Ｔ治療を改善することが示されている、ＣＤ２６Ｌ＋中央記憶Ｔ細胞（Ｔｃｍ）の発生を促進するために使用され得る。（例えば、上記のＭｏｆｆｅｔｔ，Ｃｏｏｎを参照）。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、各々が約２０〜２５ヌクレオチドを含有する非コードＲＮＡのクラスであり、そのうちのいくつかは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の相補性配列に結合し、それらのサイレンシングをもたらすことによって遺伝子発現の翻訳後調節に関与していると考えられる。これらの配列は、本明細書において、ｍｉＲＮＡ結合部位、またはｍｉＲＮＡ結合部位配列とも称される。特定のｍｉＲＮＡは、その発現において高度に組織特異的である：例えば、ｍｉＲ−１２２とそのバリアントは、肝臓に豊富に存在し、他の組織ではまれにしか発現されない（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ（２００２），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２，Ａｐｒ）。

したがって、ｍｉＲＮＡ系は、細胞に導入された核酸を標的組織の選択された細胞型において発現抑制し、他の細胞で発現させることができる堅牢なプラットフォームを提供する。標的細胞に導入されるｍＲＮＡ構築物の、特にＵＴＲ内に、またはそのすぐ５’側もしくは３’側に、特定の所与のｍｉＲＮＡ配列の結合部位を含めることにより、特定の導入遺伝子の発現を一部の細胞型において低減または実質的に排除できる一方で、他の細胞型では依然として発現させることができる（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｖｏｌｕｍｅ １０，ｐａｇｅｓ ５７８−５８５（２００９））。「すぐ」という用語の使用は、「非常に近接した」または「とても近い」などの用語と同義であると理解されたい。ＵＴＲ配列に対する５’側または３’側の位置に言及する場合、典型的には約２０個まで、好適には５０個以下の介在ヌクレオチド塩基が、ｍｉＲＮＡ結合配列と隣接するＵＴＲとの間に配置され得るバリアントを包含する。そのようなｍｉＲＮＡ結合部位配列の１つまたは複数がｍＲＮＡ構築物に含められ得ることが企図される。複数のｍｉＲＮＡ結合部位配列が存在する場合、この複数は、例えば、２つより多い、３つより多い、典型的には４つより多いｍｉＲＮＡ結合部位配列を含み得る。これらのｍｉＲＮＡ結合部位配列は、ｍＲＮＡ構築物内の指定されたＵＴＲ内、その５’側、または３’側に、連続して、タンデムに、または所定の位置に配置することができる。複数の結合部位配列は、リンカー配列で分離されてもよく、リンカー配列は変化してもよく、または特定の配列、例えば「ｕｕｕａａａ」を含んでもよい。いくつかの実施形態において、結合部位配列間にリンカー配列が存在しない場合がある。ｍＲＮＡ配列の他の部分には、ＯＲＦの停止コドンおよびＵＴＲまたは結合部位の間などのリンカー配列を組み込むことができる。

ｍｉＲＮＡ−１２２は、健康な非罹患肝組織に豊富に存在するにもかかわらず、大部分の肝癌および罹患細胞では減少される（Ｂｒａｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ；３８（６）：７５２−７６３，Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ Ｎａｔｕｒｅ ２００９；１０ ５７８）。上記の方法により、標的組織が肝臓である場合、それらの３’ＵＴＲ内にまたはそれに隣接してｍｉＲＮＡ−１２２結合部位（例えば、配列番号１）を含めることにより、導入されたｍＲＮＡ配列の翻訳が、癌性肝細胞では促進され得、トランスフェクトした健康な細胞では減少され得るまたは実質的に排除され得ることが分かった。

同様に、他のｍｉＲＮＡ結合部位配列を使用することによって、癌細胞と他の器官の健康な細胞との間でそのようなｍＲＮＡの異なる翻訳も可能である。好適な候補には、ｍｉＲＮＡ−１２５、ｍｉＲＮＡ−１２４ａ、ｍｉＲＮＡ−Ｌｅｔ７、ｍｉＲＮＡ−３７５、ｍｉＲＮＡ−１４３、ｍｉＲＮＡ−１４５、ｍｉＲＮＡ−１９２、ｍｉＲＮＡ−１９４、ｍｉＲＮＡ−２０４、ｍｉＲＮＡ−２１５、およびｍｉＲＮＡ−３０ｂ，ｃの結合部位が含まれる（これらに限定されない）。表２は、差次的発現が示されているｍｉＲＮＡ配列のさらなる（非限定的な）例を示す。

ｍｉＲＮＡ−１２５は、肝細胞癌（Ｃｏｐｐｏｌａ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１７；８）、乳癌（Ｍａｔｔｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ２００６；５）、肺癌（Ｗａｎｇ ｅｗｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｊ ２００９）、卵巣癌（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１６；７）、胃癌（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｒｅｐ ２０１４；１０）、結腸癌（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ ２０１５；７５）、および子宮頸癌（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１５；６）、神経芽細胞腫、髄芽腫（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００９；１２４）、膠芽腫（Ｃｏｒｔｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２０１０；４９）、および網膜芽細胞腫（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ；Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌ ２０１６；２８）などのいくつかの固形腫瘍で下方調節されている。

いくつかのｍｉＲＮＡ種は、非罹患脳細胞（例えばニューロン）と比較して多形性膠芽腫細胞（Ｚｈａｎｇｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｉｏｌ Ｍｅｄ ２００９；８７／Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ２００８；１２３６）でも差次的に発現され、ｍｉＲＮＡ−１２４ａは、最も調節不全のうちの１つである（Ｋａｒｓｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｃａｎｃｅｒ ２０１２；３、Ｒｉｄｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１１；７、Ｇａｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７；６７／Ｓｉｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｍｅｄ ２００８；６）。

肺癌では、最近のメタ分析により、非小細胞肺癌におけるＬｅｔ−７（およびｍｉＲＮＡ−１４８ａおよびｍｉＲＮＡ−１４８ｂ）の下方調節が確認された（Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍａｒｋｅｒｓ ２０１８）。

同様に、ｍｉＲＮＡ−３７５の発現は、健康な膵臓細胞と比較して、膵臓癌細胞で下方調節されていることがわかった（Ｓｈｉｄｕｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１３；１）。

別の実施形態において、ＩＬ−１２分泌細胞を使用すると、ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性を増強することができる。理論によって拘束されることを望むものではないが、腫瘍におけるＩＬ−１２誘発ＩＦＮγ蓄積は、ＣＡＲ−Ｔまたは他の宿主免疫細胞（例えばＮＫ細胞）の腫瘍への浸透を促進し、それによって治療効果を高めると考えられている（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ Ｄ．ｅｔ ａｌ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１２：１８／Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１１；７１／Ｋｅｒｋａｒ ＳＰ．Ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０１１；１２１／Ｊａｃｋｓｏｎ ＨＪ．Ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１６；１３）。したがって、本発明の実施形態によれば、ｍＲＮＡは、ＩＬ−１２またはその機能的等価性もしくはその誘導体をコードすることによって、腫瘍微小環境におけるＩＬ−１２の外因性発現を促進するために使用され得る。

導入されたポリヌクレオチドの疾患特異的発現に関連して、特定の疾患で破壊される、すなわち、非罹患細胞と比較して罹患細胞（腫瘍細胞など）で上方制御または下方制御される、任意のｍｉＲＮＡ配列の結合配列は、本発明での使用に適していると考えられる。表２は、本発明の実施形態において使用され得るこの種の腫瘍関連ｍｉＲＮＡ結合配列のさらなる非限定的な例について論じている。しかしながら、本発明は、所定のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのクラスが、所定の器官または器官系内の第２の細胞型に対して第１の細胞型において下方制御される場合のみに限定されないことを理解されたい。対照的に、器官または器官系内に含まれる第１および第２の細胞型の間に調節性ｍｉＲＮＡの差次的発現パターンが存在することが必要であるにすぎない。本明細書に記載の組成物および方法を使用して、ｍｉＲＮＡの差次的発現を利用することができ、それらの細胞におけるタンパク質産物の対応する差次的翻訳を可能にすることができる。

健康な細胞と癌細胞との間で同様の差次的なｍｉＲＮＡ発現の証拠が見つかった癌の例としては、乳癌（Ｎｙｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ，ＢＭＣ Ｍｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００９ Ｊｕｎ ９；２：３５）、卵巣癌（Ｗｙｍａｎ ｅｔ ａｌ，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，２００９；４（４）：ｅ５３１１）、前立腺癌（Ｗａｔａｈｉｋｉ ｅｔ ａｌ，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，２０１１；６（９）：ｅ２４９５０）、および子宮頸癌（Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７ Ｊｕｌ １；６７（１３）：６０３１−４３）が挙げられる。ＷＯ２０１７／１３２５５２ Ａ１は、様々な癌細胞において発現レベルが異なる広範囲のｍｉＲＮＡを記載している。

膵臓では、ｍｉＲＮＡ−３７５の発現は、正常な膵臓細胞において高いが、罹患組織および／または癌性組織では著しく低いことが示されている（Ｓｏｎｇ，Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．２０１３）。この発現は、癌の病期に関連することが示されており、より進行した癌では発現がさらに減少する。ｍｉＲＮＡ−３７５は、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ−１（ＰＤＫ１）ｍＲＮＡを標的とし、ＰＩ ３−キナーゼ／ＰＫＢカスケードに影響を与えることにより、膵臓β細胞のグルコース誘導性の生物学的応答の調節に関与していると考えられる（Ｅｌ Ｏｕａａｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５７：２７０８−２７１７，２００８）。ｍｉＲＮＡ−３７５の抗増殖効果は、この推定上の作用様式に関与しており、癌細胞における下方制御を説明し得る。

ｍｉＲＮＡ配列のバリアントおよび多型が見られること、およびｍｉＲＮＡファミリーが同様の特性を持つことが知られている。本発明では、特定のｍｉＲＮＡ配列および関連する結合部位の全ての適切なバリアントおよびファミリーメンバーを、適切な場合に使用することができることが想定されている。一方で、明らかに密接に関連しているｍｉＲＮＡ配列は、異なる発現プロファイルを有し得（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１７ Ｎｏｖ ２８）、状況によっては、参考文献を参照して、特定の置換が適切かどうかを判断する必要がある。例えば、Ｌｅｔ−７は、Ｌｅｔ−７ａからＬｅｔ−７ｋのように表すことができる、関連する多数のバリアントを持つ幅広いファミリーの一部である。

腫瘍溶解性ウイルスまたはＣＡＲ−Ｔ療法などの免疫療法で患者を治療すると、オフターゲット効果の可能性があるため、安全上の問題が生じ得る。コードｍＲＮＡ配列の提供による特定のポリペプチドの発現でさえ、特定の器官に悪影響を及ぼし得る。したがって、肝臓、脳、乳房、肺、膵臓、結腸／ＧＩ管、および腎臓などの健康な組織を保護することは、臨床応用を成功させるために最も重要である。したがって、本発明の組成物は、これまでの「実験的」細胞またはウイルス治療の成功した採用を強化および促進するための可能にする技術プラットフォームを表すことができる。

ｍＲＮＡ構築物における複数のｍｉＲＮＡ結合部位配列の存在は、供給されたポリペプチド（複数可）の差次的発現の改善された効力を可能にする。理論によって拘束されないが、結合する部位の数が増えると、ｍｉＲＮＡの結合、およびその後の分解が高くなると考えられている。複数のｍｉＲＮＡ結合部位は、実質的に同じ結合部位配列の複数のコピーを含むことができ、それによって冗長性が導入される。あるいは、または加えて、複数の結合部位配列は、実質的に異なる配列を含むことができ、それによって、ｍＲＮＡ構築物が１つより多くの種のｍｉＲＮＡによって標的化されることを可能にする。このようにして、上記の器官および関連するｍｉＲＮＡ配列の説明から明らかなように、供給されたｍＲＮＡ構築物の差次的発現は、１つより多くの細胞型および／または１つより多くの器官で達成することができる。どちらのアプローチも、同じ配列または複数の配列内で可能であると見なされる。中間アプローチも想定されており、同じｍｉＲＮＡ配列の標的物となることを目的とするが、同じｍｉＲＮＡ配列の異なるバリアントに結合するために異なる複数の結合配列が含まれる。

複数の結合部位の使用に関連するいくつかの利点には、単一の器官内での、本発明のｍＲＮＡ配列によって供給されるポリペプチドの差次的発現の効率の増加が含まれる。異なる結合部位配列、または１つより多くの組織または器官型に適用可能な配列を使用すると、１つより多くの器官または組織の異なる細胞型で差次的発現を達成することができる。これは、本発明による組成物の全身投与が使用される場合に望ましい可能性があり、１つより多くの器官におけるオフターゲット効果を回避する必要がある。

局所的または標的化された投与でさえ、供給されたｍＲＮＡ構築物が、それらが意図されていなかった器官、組織、および／または細胞に遭遇または蓄積し得る。特に、肝臓および腎臓組織は、これらの器官の生理学的機能のために、投与された組成物を蓄積し得る。これらの場合では、オフターゲット効果を回避するために、これらの組織での発現の低下を可能にし得るｍｉＲＮＡ結合部位配列に供給された構築物に含めることが有利であり得る。逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位配列を適宜選択することによって達成することができる、いくつかの器官、組織、および／または細胞型では発現が促進されるが、その他では促進されないことが望ましくあり得る。

いくつかの実施形態において、１つより多くの異なるｍＲＮＡ配列が、単一の組成物中に提供され得る。これらの異なる配列は、異なるポリペプチド、および／または異なるｍｉＲＮＡ結合配列をコードすることができる。このようにして、単一の組成物は、複数の異なるポリペプチドが発現されることを可能にすることができる。別々のｍＲＮＡ配列でｍｉＲＮＡ結合配列の異なる組み合わせを使用することにより、異なる細胞型または標的器官は、所望の目的に従って、発現するか、または特定のポリペプチドの発現から保護することができる。例えば、肝臓および脳の健康な細胞をポリペプチド「Ａ」の発現から保護する必要があるが、肝臓ではなく健康な脳でポリペプチド「Ｂ」を発現させることが望ましい場合、第１のｍＲＮＡ配列は、「Ａ」の場合、ｍｉＲＮＡ−１２２、ｍｉＲＮＡ−１２５ａ、およびｍｉＲＮＡ−１２４ａの結合部位があり、第２のｍＲＮＡ配列は、「Ｂ」の配列を含み、ｍｉＲＮＡ−１２２およびｍｉＲＮＡ−１２５ａの結合部位を持ち得る。

当業者は、所与の一連の器官および細胞型における発現の任意の組み合わせを達成するために、結合部位、ポリペプチド配列、および複数のｍＲＮＡ配列の組み合わせを考案することができるであろうことが理解され得る。いくつかの例を、図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、および１９Ｅならびに配列番号１〜２９に示す。図１９Ａは、（それぞれ、配列番号１〜７に関連する）ｍｉＲＮＡ−１２２、ｍｉＲＮＡ−１２５ａ、ｍｉＲＮＡ−１２４ａ、Ｌｅｔ−７、ｍｉＲＮＡ−３７５、ｍｉＲＮＡ−１９２、およびｍｉＲＮＡ−１４３の可能なｍｉＲＮＡ結合部位の配列を示す。これらの配列に関連する関連器官および組織型は、上記および表２で論じられている。図１９Ｂは、本発明のいくつかの実施形態によるｍＲＮＡ構築物の概略図を示す。ＯＲＦの前には開始コドンがあり、終止コドンで終わり、その後、一連の最大５つの結合部位配列が続く。この図に示すように、結合部位配列は、リンカーによって分離されても、リンカーによって分離されてもよい。ＯＲＦは、例えばＵＳ３用にコードすることができるが、任意のＯＲＦであり得る。終止コドンの変動性は、任意の実施形態で想定されており、全ての実施形態において、ＯＲＦと結合部位配列との間に終止コドンがなくてもよい。

ｍｉＲＮＡ結合部位配列の特定の組み合わせを、これらの選択の結果として保護が改善された器官と共に、図１９Ｃおよび１９Ｄに示す。これらは、配列番号８〜１６によって例示されることがわかり得る。保護は絶対的ではなく相対的であり、マイクロＲＮＡ発現のレベルは、異なる組織間の器官内、および器官間で変化することが理解されるであろう。民族性、年齢、性別、健康状態、および病理学、ならびに個体間の遺伝的変異および多型に基づいて、変異も集団内に存在するであろう。

一実施形態において、ｍＲＮＡ配列は、配列番号１１を含むことができる。この配列は、マイクロＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ−１２２、ｍｉＲＮＡ−１２５、ｍｉＲＮＡ−１２４ａ、Ｌｅｔ−７、およびｍｉＲＮＡ−３７５の結合配列を含み、これらの配列は、肝臓、脳、肺、膵臓、および乳房などである（がこれらに限定されない）器官の健康な組織内に提供されたポリペプチドの望ましくない発現に対して保護を提供する。同様に、ｍｉＲＮＡ配列ｍｉＲＮＡ−１２２、ｍｉＲＮＡ−１２４ａ、Ｌｅｔ−７、ｍｉＲＮＡ−３７５、ｍｉＲＮＡ−１９２の結合配列を含む配列は、肝臓、脳、肺、膵臓、乳房、および腎臓に対する保護を改善する。結腸直腸癌などの胃腸腫瘍の治療では、肝臓、肺、乳房、膵臓、腎臓、および結腸の健康な組織の保護は、医療用途で重要であろう。

図１９Ｅは、ポリペプチドコード配列および結合部位の特定の組み合わせを示す。すなわち、ＵＳ３コード配列は、配列番号１８〜２６により例示されるように、（例えば、配列番号１８〜２６を含む）図１９Ｂおよび１９Ｃに示される任意の結合部位配列の組み合わせと組み合わせて示され、ＲＲ１コード配列は、例えば、配列番号２７および２８によって例示されるように、配列番号１１および１６の結合部位配列と組み合わせて示される。ＩＬ−１２コード配列は、例えば、配列番号２９により例示されるように、配列番号１１に含まれる結合部位配列と組み合わせて示される。ＵＳ３とＲＲ１の両方、ＵＳ３と抗ＰＤＬ１の両方、ＵＳ３と抗ＰＤＬ１、およびＲＲ１とＩＬ１２の両方のコード配列を含むＯＲＦは、例えば、配列番号１１の結合部位配列と組み合わせて示される。しかしながら、本明細書では、コード配列と複数の結合部位配列の全ての組み合わせが考慮される。特に、ＵＳ３、ＲＲ１、抗ＰＤＬ１およびＩＬ１２のコード配列は、任意の結合部位配列と組み合わせることができる。

いくつかの実施形態において、結合部位配列が、それらを標的とするｍｉＲＮＡ配列とのミスマッチを有することが望ましくあり得る。例えば、ミスマッチは、全標的ｍｉＲＮＡ配列と比較して、結合部位配列の塩基の最大５％、最大１０％、最大２０％、または最大３０％に関して発生し得る。理論によって拘束されることを望むものではないが、細胞内でのｍｉＲＮＡ配列の過剰な取り込みは、一部の細胞型では内因性ｍｉＲＮＡ系の調節不全を引き起こす可能性があると考えられている。このようなｍｉＲＮＡプロファイルの調節不全は、様々な肝疾患に関連している（Ｓｚａｂｏ Ｇ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０１３；１０／Ｓｃｈｕｅｌｌｅｒ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ ２０１８；１９）。提供されている結合部位配列とｍｉＲＮＡ配列との間の相補性の低下により、この潜在的な副作用を軽減することができる。

本発明によって供給されるｍＲＮＡ配列のＵＴＲは、標的器官内の細胞型の１つで発現されるＵＴＲ配列の一部または全部に対して類似性、例えば９０％を超える類似性を有するように選択することができる。特定の細胞型は、発現が上方制御または下方制御される遺伝子を有することができ、ＵＴＲ配列は、例えば、関連するｍＲＮＡ配列の安定性または分解を促進することにより、この調節を媒介することができる。

一例として、癌細胞で上方制御されることが分っている遺伝子に関連するＵＴＲは、これらの癌細胞における安定性および翻訳を促進する、ｍｉＲＮＡ結合部位配列などの１つ以上の特徴を有し得る。供給されるｍＲＮＡ配列に同様の配列を組み込むことにより、癌性細胞における安定性および翻訳を改善することができるが、非癌性細胞および健康な細胞では改善されない。

また、本発明によって治療される癌は、標的組織における続発性癌、すなわち、標的組織以外の場所の癌からの転移であり得ることも考えられる。例えば、肝転移は、食道、胃、結腸、直腸、乳房、腎臓、皮膚、膵臓または肺の癌から発生する可能性があり、腺癌または別の種類の癌であり得る。これらの場合、健康な、非癌性および／または癌性細胞で差次的発現を提供するために、代替のｍｉＲＮＡ配列を選択する必要があるかもしれない。実際、このような場合、転移細胞の組織起源が異なるため、候補ｍｉＲＮＡ配列の選択肢が増える可能性がある。

特定の状況において、標的組織の異なる細胞型において異なる発現を示す１つより多くのｍｉＲＮＡ配列の候補が存在し得ることが可能である。そのような場合、複数のｍｉＲＮＡ結合部位配列がｍＲＮＡ構築物に含まれること、およびこれらの配列が実質的に異なる配列であり得ることが有利である場合がある。しかしながら、複数のｍｉＲＮＡ結合部位配列の各々が実質的に同じ配列であることも想定される。

併用療法
腫瘍溶解性ウイルス
上記のように、腫瘍溶解性ウイルス療法は、時には直接的なウイルス溶解によって、癌細胞に感染して死滅させるためにウイルスを使用するプロセスであるが、宿主の抗腫瘍反応の刺激による間接的な死滅も含む。腫瘍溶解性ウイルスは、健康な細胞と比較して癌細胞における活性が高いことを特徴とすることが多いが、健康な細胞への損傷によって引き起こされるオフターゲット効果が実証されている（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２）。

安全性を高め、オフターゲット効果を減少させるために、例えば、細胞内免疫系の抑制および回避、ウイルスゲノム複製、および宿主細胞プロセスの引継ぎ等の機能に関与する病原性因子または遺伝子の欠失により、腫瘍溶解性ウイルスをそれらの病原性を低下させるように修飾するかまたは選択することができる。ワクチン接種に使用するために過去の産生した安全な形態の生ウイルスは、弱毒化ウイルスの別の源である。他の場合には、特定の突然変異またはさらには追加の遺伝子が、特定の腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解活性を高めることが分かっている。腫瘍溶解性ウイルスにおいて一般的に付加、変異、または欠失される病原性遺伝子の非網羅的な例を表３に示す。

この方法での腫瘍溶解性ウイルスの弱毒化または修飾は、癌細胞に対する腫瘍溶解性ウイルスの選択性において役割を果たし得る：発癌のプロセスは、癌およびウイルス感染の両方に対して保護的役割を果たす遺伝子の不活性化（細胞分割またはアポトーシスの調製による等）を伴うため、記載されるように弱毒化された腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞に通常の抗ウイルス遺伝子が存在しないことに起因して、これらの細胞において病原性を保持することができる。したがって、健康な細胞では、弱毒化ウイルスは通常の抗ウイルス応答を防御することができずに排除されるが、癌細胞ではこの反応はなく、ウイルスは細胞を溶解することができる。しかしながら、このアプローチが完全に効果的であることはめったにない：第一に、癌細胞における抗ウイルス応答の部分的な不活性化は、抗ウイルス活性の完全な欠如よりも一般的であるため（Ｈａｒａｌａｍｂｉｅｖａ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００７）、すなわち、これらの細胞において病原性をさらに減少させることができるため、そして第二に、健康な細胞の感染がなおも発生する可能性があるためである。

同様に、ウイルスは、典型的にはそれらのゲノムを複製するために宿主細胞の細胞機構を利用するが、この機構は、典型的には、自身のゲノムを複製しない、健康で静止状態にある非複製細胞において下方制御され、多くのウイルスは、宿主の機構を再活性化するまたは補う遺伝子を保有する。例えば、リボヌクレオチドからデオキシリボヌクレオチドを生成するには、リボヌクレオチドレダクターゼが必要である：これらの酵素は、典型的には、静止状態にある宿主細胞において下方制御され、いくつかのウイルスは、デオキシリボヌクレオチドの供給源を得るために、この種類の独自の酵素の遺伝子を保有する。複製中の癌細胞はこれらの酵素を再活性化させる可能性があるため、自身のリボヌクレオチドレダクターゼ酵素遺伝子を欠失した弱毒化した腫瘍溶解性ウイルスは、依然として癌細胞内で複製することができる。しかしながら、上記と同様の理由から、このアプローチは、健康な細胞を感染から保護するまたは癌細胞の病原性を回復させる際に完全に効果的ではない場合がある。例えば、腫瘍内の全ての細胞が常に複製しているわけではなく、そのため、大部分の癌細胞においてウイルス複製のために十分なデオキシリボヌクレオチドを利用できない可能性がある。

上記に続いで、本発明による組成物または方法が腫瘍溶解性ウイルス療法と併せて使用される場合、本発明の構築物によって提供される治療増強因子は、癌細胞における腫瘍溶解性ウイルスの有効性を高める因子であり得、例えば、ウイルスの複製、またはウイルスが存在する細胞を溶解するウイルスの能力を増強する。特に、例えば、病原性因子の１つ以上の遺伝子の欠失により、腫瘍溶解性ウイルスがその機能を減衰させるように修飾されている場合、治療因子は、欠失した遺伝子を、ウイルス遺伝子産物のコピーである遺伝子産物、または欠失した遺伝子と実質的な相同性を有する遺伝子産物、または別様に遺伝子の欠失を補償う遺伝子産物のｍＲＮＡで置き換えることができる。そのような実施形態において、本発明によって可能となる健康な細胞および癌性細胞における差次的発現によって置換遺伝子産物を癌細胞においてのみ発現させることができ、提供されたｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ結合部位の存在によって阻害される健康な細胞ではなく、これらの細胞においてウイルス活性および溶解を増強させる。

同様の手段により、腫瘍溶解性ウイルスに対する細胞の耐性を高める因子をコードするｍＲＮＡを健康な細胞において優先的に発現させることができ、この場合も同様に、健康な細胞と比較して癌性細胞におけるウイルス活性を促進する。

このアプローチの利点は、腫瘍溶解性ウイルスを使用した以前の治療法とは異なり、どの細胞の抗ウイルス遺伝子およびプロセスが発癌に起因して不活性化され得るかに依存せず、一部の癌細胞において活性化されるが他の細胞では活性化されない細胞複製プロセスにも依存しないことである。その結果、腫瘍溶解性ウイルスからどの病原性遺伝子を欠失させることができるかの範囲がより大きくなる。したがって、腫瘍溶解性ウイルスは、健康な細胞において複製能力を完全に欠くように修飾することができ、欠失させた病原性遺伝子の機能が本発明によって置き換えられた癌細胞において、ウイルスを完全な効力まで回復させることができる。その結果、副作用を軽減し、有効性を高めることができる。同様に、提供されたｍＲＮＡの差次的発現は癌細胞と健康な細胞との間のｍｉＲＮＡ発現の違いに依存するため、例えば、投与時に複製を経験している細胞だけでなく、全てのトランスフェクトした癌細胞において病原性を回復させることができる。

特定の実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、ヘルペスウイルス科の一部であるＨＳＶ−１である。ＨＳＶの弱毒化形態は、ウイルスリボヌクレオチドレダクターゼをコードするＩＣＰ６（Ａｇｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００８）および／またはセリン／スレオニンプロテインキナーゼをコードし、宿主細胞のアポトーシスを阻止することを含むウイルスの生活環におけるいくつかの役割を果たす、ＵＳ３（Ｋａｓｕｙａ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００７）を欠損するように操作または選択することができる。

別の実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、ポックスウイルス科の一部であり、特に、ワクシニアウイルスであり得る。ワクシニアの弱毒化されたバージョンは、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ１およびＲＲ２）のうちの１つ以上のサブユニットおよび／またはチミジンキナーゼ（ＴＫ）を欠損するように操作または選択することができる（Ｂｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）１９８５；３１７．Ｐｕｈｌａｍｍ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０００；７ Ｓｌａｂａｕｇｈ ＭＢ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９８４；５２）。

腫瘍溶解性ウイルスに関連する特定のポリペプチドの特定のコード配列を含む配列の例、ならびに複数のｍｉＲＮＡ結合部位配列は、例えば、配列番号１８〜２８、ならびに図１９Ｂ〜１９Ｄに示されている。

サイトカイン
本明細書に記載の組成物および方法は、疾患に対する免疫応答を誘導するように作用し得ることが企図される。特に、癌細胞に対して免疫応答が誘導され得る。発癌のプロセスは、多くの場合、癌細胞が免疫系を回避しようとする様式に関与し、これらの細胞によって産生および提示された抗原に対する変化を伴う。

いくつかの実施形態において、本発明によって提供されるｍＲＮＡは、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ）であるタンパク質、抗免疫抑制タンパク質、または免疫原性抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される「抗免疫抑制タンパク質」という用語は、免疫抑制経路を阻害するタンパク質である。

本発明は、抗調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）タンパク質または抗骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）タンパク質である抗免疫抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡを供給する組成物を包含する。いくつかの実施形態において、抗免疫抑制タンパク質は、ＶＨＨ由来の遮断薬またはＶＨＨ由来のＢｉＴＥである。

本明細書で使用される「免疫原性抗原」という用語は、炎症性または免疫原性の免疫応答を増加させるタンパク質を指す。特定の実施形態において、抗免疫抑制抗原および免疫原性抗原は、抗腫瘍免疫応答を誘導する。そのようなタンパク質の例として、免疫チェックポイント受容体（例えば、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＰＤ１、ＰＤＬ１など）に結合して阻害する抗体またはその抗原結合断片、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ΙΡΝβ、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦなど）、または活性化受容体に結合して活性化するタンパク質（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＩＩａ、ＦｃγＩＩＩａ、共刺激受容体など）が挙げられる。特定の実施形態において、タンパク質は、ＥｐＣＡＭ、ΙＦΝβ、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、Ａ２Ａ、抗ＦＧＦ２、抗ＦＧＦＲ／ＦＧＦＲ２ｂ、抗ＳＥＭＡ４Ｄ、ＣＣＬ５、ＣＤ１３７、ＣＤ２００、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＳＦ−１Ｒ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、エンドセリンＢ受容体、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−３５、ＩＳＲＥ７、ＬＦＡ−１、ＮＧ２（ＳＰＥＧ４とも称される）、ＳＭＡＤ、ＳＴＩＮＧ、ΤＧＦβ、およびＶＣＡＭ１から選択される。

本発明は、細胞ベースの治療に使用される標的細胞集団に、機能性高分子をコードするｍＲＮＡを供給する組成物を包含する。いくつかの実施形態において、標的細胞集団は、遺伝子操作されたＴ細胞集団である。いくつかの実施形態において、標的細胞集団は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）の集団である。

コードｍＲＮＡは、免疫細胞の集団または免疫細胞集団の組み合わせを対象の特定の部位に誘引するために使用され得る。いくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡおよび送達粒子は、免疫細胞を腫瘍微小環境に誘引するために使用される。いくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡおよび送達粒子は、免疫細胞の腫瘍微小環境への不十分な移動を克服するために使用される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、マクロファージもしくは樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡおよび送達粒子は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を腫瘍微小環境に誘引するために使用される。

コードｍＲＮＡは、ＣＡＲ Ｔ細胞の腫瘍微小環境への不十分な移動を克服するために使用され得る。いくつかの実施形態において、送達粒子は腫瘍微小環境を特異的に標的とし、コードｍＲＮＡはＣＡＲ−Ｔ細胞を腫瘍微小環境に引き付けるか、さもなければ補充する遺伝子産物をコードする。いくつかの態様において、コードｍＲＮＡは、ケモカインを発現する。非限定的な例として、コードｍＲＮＡは、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＸＣＬ１、およびそれらの任意の組み合わせなどのＴ細胞を誘引するケモカインをコードすることができる。自己免疫疾患においてなど、逆の効果が所望される状況では、コードｍＲＮＡは上記因子の遮断薬、拮抗薬、および／または阻害剤を発現することができる。

コードｍＲＮＡは、腫瘍の微小環境に送達され、一時的に発現し得る。いくつかの実施形態において、コードｍＲＮＡは、例えば、活性化Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの腫瘍応答における免疫細胞の生存、増殖、および／または分化の調節に関与するサイトカインまたは他の遺伝子産物をコードする。非限定的な例として、コードｍＲＮＡは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、ＴＧＦ−β、およびそれらの任意の組み合わせなどのサイトカインをコードし得る。この場合も同様に、自己免疫疾患においてなど、逆の効果が所望される状況では、コードｍＲＮＡは、上記因子の遮断薬、拮抗薬、および／または阻害剤を発現することができる。

ｍＲＮＡを供給する組成物は、特定の細胞サブタイプを標的とし、それらに結合すると、受容体媒介性エンドサイトーシスを刺激し、それによって、合成ｍＲＮＡを発現できるようになった細胞に、組成物が保持する合成ｍＲＮＡを導入するように設計することができる。導入遺伝子の核輸送および転写が必要ないため、このプロセスは迅速かつ効率的である。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ送達系は、遺伝子編集剤をコードするｍＲＮＡを標的細胞集団に送達する。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、遺伝子座を標的とし、標的細胞集団において産生される１つ以上の内因性遺伝子の発現を妨害する配列特異的ヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）関連遺伝子座を標的とする配列特異的ヌクレアーゼをコードし、それによってＴＣＲ内の１つ以上のドメインの発現を妨害する。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ送達系は、操作されたＴ細胞を所望の表現型に向けてプログラムする１つ以上の薬剤をコードするｍＲＮＡを送達するために使用され得る。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡナノ粒子送達組成物は、所望のＴ細胞表現型に特徴的なマーカーおよび転写パターンを誘導するために使用され得る。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡナノ粒子送達組成物は、ＣＡＲ−Ｔ治療を改善することが示されているＣＤ２６Ｌ＋中央記憶Ｔ細胞（Ｔｃｍ）の発達を促進するために使用され得る。（例えば、上記のＭｏｆｆｅｔｔ，Ｃｏｏｎを参照）。いくつかの実施形態において、組成物は、標的細胞集団における細胞分化を制御するために１つ以上の転写因子をコードするｍＲＮＡを供給する。いくつかの態様において、転写因子はＦｏｘｏ１であり、ＣＤ８Ｔ細胞がエフェクターからメモリーへと移行する発達を制御する。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ送達組成物は、例えば、Ｔ細胞上に見出される表面抗原等のＴ細胞マーカーに特異的な表面アンカー型標的ドメインを含む。いくつかの実施形態において、表面アンカー型標的ドメインは、ナノ粒子をＴ細胞に選択的に結合し、受容体誘導性エンドサイトーシスを開始してｍＲＮＡナノ粒子送達組成物を内在化する抗原に特異的である。いくつかの実施形態において、表面アンカー型標的ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ８、またはそれらの組み合わせに選択的に結合する。いくつかの実施形態において、表面アンカー型標的ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ８、またはそれらの組み合わせに選択的に結合する抗体であるか、またはそれに由来する。

本発明によって、異なる細胞型、例えば、健康な細胞、非罹患細胞、罹患細胞および癌細胞において、上述の遺伝子産物の差次的発現を達成することができる。この方法により、非罹患細胞または健康な細胞を温存しながら、罹患細胞を標的とした免疫応答を引き起こすことができる。

標的細胞へのコードヌクレオチド配列の導入は、多くの場合、細胞外空間から細胞内環境に所望の物質を移動するための送達剤の使用を必要とする。しばしば、そのような送達剤は、送達粒子の形態であり、食作用を受ける、および／または標的細胞と融合する場合がある。送達粒子は、カプセル化により、またはマトリックスもしくは構造内に物質を含むことにより、所望の物質を含有し得る。

送達粒子は、標的組織の細胞を標的とすることができる。この標的化は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、糖タンパク質、脂質、小分子、核酸などであり得る、送達粒子の表面上の標的化剤によって媒介され得る。標的化剤は、特定の細胞もしくは組織を標的とするために使用され得るか、または粒子のエンドサイトーシスもしくは食作用を促進するために使用され得る。標的化剤の例としては、抗体、抗体の断片、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のｇｐ１２０エンベロープタンパク質、炭水化物、受容体リガンド、シアル酸、アプタマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。

送達粒子は、アミノアルコールリピドイドを含んでもよい。これらの化合物は、ナノ粒子、リポソームおよびミセルを含む粒子の形成に使用することができ、特に核酸の送達に適している。本発明のいくつかの実施形態による粒子を含むナノ製剤の製造の例示的な例は、実施例に見出すことができる。

対象に投与される場合、治療成分は、薬学的に許容されるビヒクルを含む組成物の一部として好適に投与される。許容される薬学的ビヒクルは、水および油などの液体であってもよく、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等の石油、動物、植物または合成起源のものを含む。薬学的ビヒクルは、生理食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであり得る。さらに、補助剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤および着色剤が使用されてもよい。対象に投与される場合、薬学的に許容されるビヒクルは、好ましくは無菌である。本発明の化合物が静脈内投与される場合、水が好適な媒体である。生理食塩水およびデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液も、特に注射液用の液体ビヒクルとして使用することができる。適切な薬学的ビヒクルは、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどの賦形剤も含む。薬学的組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、または緩衝剤も含有し得る。

本発明の医薬品および薬学的組成物は、液体、溶液、懸濁液、ゲル、放出調節製剤（徐放または持続放出など）、エマルジョン、カプセル（例えば、液体またはゲルを含有するカプセル）、リポソーム、微粒子、ナノ粒子、または当該技術分野で既知の他の好適な製剤の形態をとることができる。好適な薬学的ビヒクルの他の例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５に記載される（例えば、１４４７〜１６７６ページを参照されたい）。

本明細書に記載される任意の化合物または組成物について、治療的有効量は、インビトロ細胞培養アッセイから最初に決定され得る。標的濃度は、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の方法を使用して測定される、本明細書に記載の方法を達成することができる活性成分（複数可）の濃度である。

当該技術分野で周知のように、ヒト対象に使用するための治療有効量も動物モデルから決定することができる。例えば、ヒト用の用量は、動物において有効であることがわかっている濃度を達成するように製剤化することができる。上記のように、ヒトの投与量は、化合物の有効性をモニタリングし、用量を上方調整および下方調整することによって調整することができる。上記の方法および他の方法に基づいて、ヒトにおける最大有効性を達成するために用量を調整することは、十分に当業者の能力の範囲内である。

本発明の実施形態は、医薬で使用するために製剤化された組成物を含み得ることが企図される。したがって、本発明の組成物を生体適合性溶液に懸濁させて、患者または動物の細胞上、組織内、または体内の位置を標的とすることができる組成物を形成することができる（すなわち、組成物はインビトロ、エクスビボ、またはインビボで使用することができる）。好適には、生体適合性溶液は、リン酸緩衝生理食塩水または任意の他の薬学的に許容される担体溶液であり得る。１つ以上の追加の薬学的に許容される担体（希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルなど）は、薬学的組成物において本発明の組成物と組み合わせることができる。好適な薬学的キャリアは、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる‘Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ’に記載されている。本発明の薬学的製剤および組成物は、規制基準に適合するように製剤化され、経口的に、静脈内に、局所的に、腫瘍内に、もしくは皮下に、または他の標準的な経路を介して投与することができる。投与は、全身または局所または鼻腔内またはくも膜下腔内であり得る。

本発明のいくつかの実施形態の組成物が、代替の抗腫瘍性またはさもなければ抗癌性の治療成分と別々にまたは組み合わせて投与される実施形態がさらに意図される。これらの成分は、腫瘍溶解性ウイルス、小分子薬、化学療法薬、放射線療法薬、または生物製剤を含み得る。成分は、本発明組成物と同時に投与されてもよく、また送達粒子内に含まれてもよいか、または任意の好適な手段によって、本発明の組成物の投与の前または後に別々に投与されてもよい。

本発明のいくつかの実施形態の組成物は、インビトロおよび／またはエクスビボ法、例えば、実験室設定において、使用され得ることも企図される。インビボ法の例は、本明細書に記載のｍＲＮＡ配列を含む送達系を含む組成物が標的インビトロ細胞に投与され、ｍＲＮＡ配列に含まれるｍｉＲＮＡ結合部位配列によって、標的インビトロ細胞内の異なる細胞型におけるｍＲＮＡのコード配列の差次的発現が可能になる場合である。同様に、本明細書に記載の送達系およびｍＲＮＡ配列を含む組成物が動物から採取された標的エクスビボ試料に投与され、ｍＲＮＡ配列に含まれるｍｉＲＮＡ結合部位配列により、標的サンプル内の異なる細胞型におけるｍＲＮＡのコード配列の差次的発現が可能になる方法も企図される。

本発明のデバイスは、以下の実施例によって例示されるが、決してこれらに限定されない。

一般的なプロトコル
細胞株
ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ−８０６５（商標））およびＨｅｐ３Ｂ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ−８０６４（商標））細胞は、ＡＴＣＣから購入した。細胞を、５％ＣＯ_２の雰囲気中３７℃で、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）（Ｃｅｌｌｇｒｏ，ＵＳＡ）、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ，ＵＳＡ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、およびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ^−１）（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で単層として培養した。ＨｅｐＧ２細胞は、５μｇ／ｃｍ^２のコラーゲン濃度でコラーゲン（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）被覆したプレート上で増殖させた。

ＨＭＣＰＰ５（プールされた接着可能ヒト肝細胞：５人の個々のドナーからの細胞を組み合わせることにより生成された接着可能な初代肝細胞の混合物）は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡから購入した。５％ＦＢＳ、１μＭデキサメタゾン、およびカクテルＡ（ペニシリン／ストレプトマイシン、ヒト組換えインスリン、ＧｌｕｔａＭａｘ、およびＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）を添加したウィリアムＥ培地（ＷＥＭ）に細胞を播種した。播種の２４時間後、５％ＣＯ_２の雰囲気中３７℃で、ＷＥＭ／カクテルＡ培地を、単層として、０．１μＭデキサメタゾンおよびカクテルＢ（ペニシリン／ストレプトマイシン、ＩＴＳ（ヒト組換えインスリン、ヒトトランスフェリン、セレン酸、ＢＳＡ、リノール酸）、ＧｌｕｔａＭａｘ、およびＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）を添加したメンテナンス／インキュベーション培地ＷＥＭに変更した。全ての実験中、ナノ製剤化ｍＲＮＡによるトランスフェクション中を除いて、細胞はＷＥＭ／カクテルＢ培地で培養した。ＷＥＭ／カクテルＢ培地は、３日ごとに新しいものと交換した。タンパク質濃度５μｇ／ｃｍ^２のコラーゲン（Ｇｉｂｃｏ）被覆プレート上のＨＭＣＰＰ５細胞の増殖。

Ａｍｌ１２（マウスの健康な肝細胞）は、ＡＴＣＣ，ＵＳＡから購入した。細胞を、１ｘ１０^５／ウェルの密度で１２ウェルプレートに播種した。

ベクター構築物
ｐＭＲＮＡ−ＣＴＸ−ｍＲＮＡ鋳型の構築
実験で使用した全てのｍＲＮＡのインビトロ合成用のプラスミドｐＭＲＮＡ−ＣＴｘ−ｍＲＮＡ鋳型形成マトリックスは、市販のｍＲＮＡＥｘｐｒｅｓｓ（商標）ｍＲＮＡ合成キット（ＳＢＩ，ＵＳＡ）に従って構築した。全てのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）中で増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｎｉまたはＭａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用して精製した。ｐＤＲＡＷ３２ソフトウェア（ｗｗｗ．ａｃａｃｌｏｎｅ．ｃｏｍ）を使用して、全てのプラスミドの制限地図を作成した。

クローニング方法１−制限エンドヌクレアーゼ
図２に示すように、遺伝子の５’末端のＡＴＧコドンまたは３’末端の終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）の直前で最適な翻訳のためにコザック配列と隣接した１つ以上の遺伝子の配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ社によって合成され（コドン最適化なし）、図２でｐＭＡ−Ｔ−ＣＴｘ−Ｇｅｎｅと示されるプラスミドＤＮＡ（ＤＮＡプラスミドまたはベクターと称される）として供給された。コード配列に隣接する独自の５’および３’ＵＴＲ領域は、全ての合成配列に含まれていた（添付の配列には示されていない）。５’ＵＴＲは合成であり、コザック配列を含有し、３’ＵＴＲはマウスアルファグロビンＵＴＲに基づき、また１２０塩基のポリＡテールを含む。図２に示す合成ベクターをｐＭＲＮＡ−ＣＴｘ−ｍＲＮＡとして作製するために、遺伝子（複数可）を含有するヌクレオチド断片を、制限エンドヌクレアーゼ、ここではＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩを使用してＤＮＡプラスミドから切り出し、ｐＭＲＮＡ鋳型プラスミドのＥｃｏＲＩ／ＮｈｅＩ制限部位にサブクローニングした：この鋳型プラスミドは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるＴ７プロモーター、５’および３’ＵＴＲ、ならびにポリＡ配列を含む。

クローニング方法２−常温核融合
クローニング方法１のようにコザック配列および終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）と隣接した１つ以上の遺伝子の配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ社によって合成され（コドン最適化なし）、プラスミドＤＮＡ ｐＭＡＴ−ＣＴｘ−Ｇｅｎｅとして供給され、このプラスミドの骨格は上記と同じである。ｐＭＲＮＡ−ＣＴｘ−ｍＲＮＡ鋳型ベクターを構築するために、常温核融合クローニングキット（ＳＢＩ，ＵＳＡ）が開発された。簡単に言えば、ＤＮＡプラスミドからの遺伝子配列を、特定のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、プライマーは、遺伝子配列の各末端で相同性のある１４塩基を伸長した。これらの１４塩基は、５’ＵＴＲと３’ＵＴＲとの間に位置するマルチクローニングサイトを切断する制限エンドヌクレアーゼで鋳型プラスミドを消化することによって生成される線状化ベクターの末端と相同性であるように設計された。合成ベクターを産生するために、予測されたＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）により精製し、製造業者のプロトコルに従って常温核融合反応（相同組換え）後にｐＭＲＮＡ鋳型プラスミドに組み込んだ。

ｍｉＲＮＡ結合部位配列を含有する鋳型の構築
ｍｉＲＮＡ結合部位配列を含むｍＲＮＡ配列の生成（ｍｉＲ−１２２を使用した例が図３に示される）について、３つのバリアントを作製する例示的な方法を以下に記載する。バリアント１では、ｍｉＲＮＡ結合部位配列の２つのコピーが、終止コドンと３’ＵＴＲの＋１位との間に含まれる。バリアント２では、ｍｉＲＮＡ結合部位配列の２つのコピーが、３’ＵＴＲの開始点または５’末端に含まれ、バリアント３では、ｍｉＲＮＡ結合部位配列の２つのコピーが、３’ＵＴＲの終了点または３’末端に含まれる。

図４は、プロテインＢを例として用いて、約１４００塩基対の遺伝子であるこれら３つのバリアントを含む合成ベクターの例を示している。

バリアント１
図５に示すように、コザック配列および終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）と上記の方法のように隣接し、さらに終止コドンの後にｍｉＲＮＡ結合部位配列の２つのコピーを含む１つ以上の遺伝子の配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ社によって合成され（コドン最適化なし）、プラスミド（ここでも同様にプロテインＡを用いて示されている）ＤＮＡ ｐＭＡＴ−ＣＴｘ−Ｇｅｎｅとして供給され、このプラスミドの骨格は上記と同じである。次いで、この配列を鋳型プラスミドにクローニングして、上記方法のいずれかにより合成ベクターを作製した。

バリアント２および３
コザック配列および終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）と上記の方法のように隣接し、さらにこの領域の開始点／５’末端（図６に示すバリアント２）またはこの領域の終了点／３’末端（図７に示すバリアント３）のいずれかにｍｉＲＮＡ結合部位配列の２つのコピーを含む、３’ＵＴＲを含む１つ以上の遺伝子の配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ社によって合成され（コドン最適化なし）プラスミドＤＮＡ ｐＭＡＴ−ＣＴｘ−Ｇｅｎｅとして供給され、このプラスミドの骨格は上記と同じである。次いで、この配列を鋳型プラスミドにクローニングして、上記方法のいずれかにより合成ベクターを作製したが、この配列がｍｉＲＮＡ結合部位配列を含有していたため、供給されたＤＮＡ配列からの３’ＵＴＲが最終的な合成ベクターに存在するように、鋳型ベクターから３’ＵＴＲを除去するための制限酵素（ここではＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ）が選択されるように変更した。

インビトロｍＲＮＡ合成によるｍＲＮＡのインビトロ転写（ＩＶＴ）
ｍｉＲＮＡ修飾３’ＵＴＲを用いてまたは用いずにｍＲＮＡのＩＶＴを行うために、市販のｍＲＮＡＥｘｐｒｅｓｓ（商標）ｍＲＮＡ合成キットを使用した。ＩＶＴベクターのＤＮＡ鋳型は、上記のプロトコルに記載される通りに構築した。インビトロｍＲＮＡ合成の手順は、製造業者のプロトコルに従って行った。簡単に言えば、特定の５’および３’プライマー（キットに付属）を用いたＰＣＲ反応を使用して、ＤＮＡ配列にポリＡテールを付加した。インビトロ転写中、ＤＮＡ鋳型に合成されたｍＲＮＡを、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）修飾ヌクレオチド（５−メチルシチジン−５’−三リン酸）でキャッピングした。キャップアナログ、プソイドウリジン−５’−三リン酸およびポリＡテールをインビトロ転写ｍＲＮＡに組み込み、宿主細胞の安定性を高め、免疫応答を低下させた。

ＤＭＰ^ＣＴｘの合成とｍＲＮＡの製剤化
Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社の製剤の送達および修飾のプラットフォーム（ＤＭＰ^ＣＴｘ）は、イオン化可能な脂質様物質Ｃ１２−２００、リン脂質ＤＯＰＥ、コレステロール、および脂質固定ポリエチレングリコールＣ１４−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ２０００混合物の多成分ナノ粒子である。この特定のＤＭＰ^ＣＴｘの組成、Ｃ１２−２００：ｍＲＮＡの比重量比（１０：１）、ならびに脂質様物質、リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧのモル［％］組成（表４）を最適化したところ、インビボで製剤の高い有効性が明らかになった（Ｋａｕｆｆｍａｎ Ｋ．Ｊ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒ．２０１５，１５，７３００−７３０６）。これらの例示的な成分の化学構造を図８に示す。

ＤＭＰ^ＣＴｘを合成するために、図９Ａに示すようなＣ１２−２００（ＷｕＸｉ，Ｃｈｉｎａ）、リン脂質ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎグリセロ−３−ホスホエタノールアミン）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）およびＣ１４−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ２０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）のエタノール溶液（混合液Ａ）、および（１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４．５）中のｍＲＮＡの緩衝水溶液（混合液Ｂ）を調製した。３：１の比のエタノール混合液Ａと水性混合液Ｂの両方を、シリンジポンプおよびマイクロ流体チップデバイスを使用して混合した／組み合わせた（Ｃｈｅｎ Ｄ，ａｔ ａｌ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２，１３４（１６），６９４８−６９５１）。マイクロ流体チップからのナノ製剤化ｍＲＮＡのアルコール溶液を、１．５ｍＬ試験管に収集した。

製剤化後にアルコールを除去するために、ＤＭＰ^ＣＴｘ−ｍＲＮＡ混合物をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｇ２に移し、マグネチックスターラで４時間、室温のＰＢＳ中で透析した。その後、１８ゲージの、１インチ斜角針付きのシリンジを使用して、製剤化ｍＲＮＡを新しい１．５ｍＬ試験管に移し、特性評価ができる状態にした。

ｍＲＮＡカプセル化の有効性を算出するために、製造業者のプロトコルに従ってＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。脂質ナノ粒子の多分散性（ＰＤＩ）およびサイズは、動的光散乱（ＺｅｔａＰＡＬＳ，Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ，Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した。ＤＭＰ^ＣＴｘの表面電荷（ゼータ電位）は、同じ機器を使用して測定した。リンカー（配列番号３０）で接続され、かつコードｍＲＮＡ配列の終止コドンの後に挿入されたｍｉＲ−１２２配列の２つのコピーを有するおよび有しないｍＲＮＡ配列の溶液を、それぞれ１．０５および１ｍｇ／ｍｌストックから調製した。Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社の送達および修飾のプラットフォーム（ＤＭＰ^ＣＴｘ）のサイズ、カプセル化効率、および多分散性を含む、ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣｈ）配列、プロテインＡの配列、約２５ｋＤａのヒトタンパク質を含むｍＲＮＡ配列のカプセル化後のパラメータの例を表５に示す。ＤＭＰ^ＣＴｘによる送達粒子の説明図を図９Ｂに見ることができる。

送達されたｍＲＮＡ構築物のインビトロでの差次的発現
標的細胞に構築物ｍＲＮＡを成功裏にトランスフェクトし、続いて異なる細胞型で差次的発現を駆動する本発明の可能性を調査するために、ｍｉＲＮＡ−１２２結合部位で修飾されたＤＭＰ^ＣＴｘ ｍＲＮＡプラットフォームを肝細胞癌のモデルで使用した。

細胞株のトランスフェクション
蛍光イメージングと定量化
ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３Ｂの単一トランスフェクションを以下のように行った：トランスフェクションの１日前に、ＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３Ｂ細胞をそれぞれ２．７ｘ１０^５／ウェルおよび２ｘ１０^５／ウェルの密度で１２ウェルプレートに別々に播種した（ＥＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）。翌日、ＰＢＳ単独のビヒクル対照、０．５μｇ／ウェルのｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤＭＰ^ＣＴｘ、または０．５μｇ／ウェルのｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２−ＤＭＰ^ＣＴｘ（配列番号３１を含む）のいずれかを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションは、ｍＲＮＡ−ＤＭＰ^ＣＴｘをウェル内の培養培地に直接添加し、必要に応じて培養細胞を穏やかに混合することにより行った。

ＨＭＣＰＰ５（プールされた接着可能ヒト肝細胞）の単一トランスフェクションは、以下のように行った：トランスフェクションの１日前に、ＨＭＣＰＰ５細胞を２．５ｘ１０^５／ウェルの密度で１２ウェルプレートに播種した（ＷＥＭ／カクテルＢ）。翌日、ＤＭＰ^ＣＴｘ（ＰＢＳ）のビヒクル対照、０．５μｇ／ウェルのｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤＭＰ^ＣＴｘ、または０．５μｇ／ウェルのｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２−ＤＭＰ^ＣＴｘのいずれかを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションは、ｍＲＮＡ−ＤＭＰ^ＣＴｘをウェル内の培養培地に直接添加し、必要に応じて培養細胞を穏やかに混合することにより行った。ＨＭＣＰＰ５のトランスフェクション中に、ＷＥＭ／カクテルＢ培地に５％ＦＢＳを添加した。トランスフェクションは、上記の肝癌細胞について説明した様式で行った。トランスフェクションの２４時間後、培地を再びＷＥＭ／カクテルＢに変更した。

健康なヒト肝細胞におけるｍｉＲＮＡ−１２２の構成的活性および発現を評価するために、ＨＭＣＰＰ５細胞の複数のトランスフェクションを以下のように行った：ＨＭＣＰＰ５細胞を上記のように播種および培養し、各トランスフェクションの間隔を４８時間としてｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤＭＰ^ＣＴｘまたはｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２−ＤＭＰ^ＣＴｘで合計３回トラスフェクトした（ＭＰＴ）。トランスフェクションは、上記のように、ＨＭＣＰＰ５の単一トランスフェクションについて記載されたのと同じ様式で行った。

マウスの健康な肝細胞（Ａｍｌ１２、ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）の単一トランスフェクションを以下のように行った：トランスフェクションの１日前に、Ａｍｌ１２細胞を１×１０^５／ウェルの密度で１２ウェルプレートに播種した。翌日、ＤＭＰ^ＣＴｘ（ＰＢＳ）のビヒクル対照、０．５μｇ／ウェルのｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤＭＰ^ＣＴｘ、または０．５μｇ／ウェルのｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２−ＤＭＰ^ＣＴｘのいずれかを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションは、ｍＲＮＡ−ＤＭＰ^ＣＴｘをウェル内の培養培地に直接添加し、必要に応じて培養細胞を穏やかに混合することにより行った。

トランスフェクション後、蛍光イメージングシステム（ＥＶＯＳ（登録商標）ＦＬ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓからのアプリケーション）を使用して、上記の細胞株におけるｍＣｈｅｒｒｙの発現を検出した。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を示す写真は、トランスフェクションの１６、２４、４８、７２、９６、および１４４時間後に撮影した。

培養プレート上の３つのランダム化領域（ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２）から、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ，ＵＳＡ）を使用してｍＣｈｅｒｒｙ蛍光シグナルの定量化を行った。図１０Ｂ、図１１、および図１２Ｂは、そのような定量化の結果を示す。ｍＣｈｅｒｒｙをトランスフェクトしたウェルのピクセル数を１００％に設定した（ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光）。統計的有意性は、スチューデントｔ検定を使用して決定した。結果は、平均値±標準偏差として示される。有意差は、ｐ値＜０．０５で定義した。アスタリスクは、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２をトランスフェクトした細胞と比較して、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙをトランスフェクトした細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の統計的有意差を示す（＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５）。

実施例１：ｍｉＲＮＡ−１２２調節による腫瘍特異的遺伝子発現
ｍｉＲＮＡ−１２２は、豊富な肝臓特異的ｍｉＲＮＡであり、その発現はヒト原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）、ならびにＨｅｐ３ＢおよびＨｅｐＧ２などのＨＣＣ由来細胞株では著しく減少する。この試験の目的は、ｍｉＲＮＡ−１２２を標的とする配列（例えば、図３の上のバリアント１に示されるような配列番号３０）の挿入によるｍＲＮＡ配列の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の修飾が、正常な肝細胞において翻訳抑制および／または脱アデニル化、それに続く外因性ｍＲＮＡのデキャッピングをもたらし得るが、試験したＨＣＣ細胞株ではもたらされないことを実証することであった。

健康な肝細胞における内因性ｍｉＲＮＡ−１２２活性を調べるために、ＨＭＣＰＰ５細胞（５人の個々のドナーからの細胞を組み合わせることにより生成された接着可能な初代肝細胞の混合物であるプールされた接着可能ヒト肝細胞）に、上記の一般的なプロトコルに従って調製したｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙまたはｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２をトランスフェクトした：目的の導入された遺伝子としてｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光タンパク質）を使用し、経時的にｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光タンパク質）の発現を追跡した。図１０Ａに示すように、ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣｈ）の発現は、トランスフェクションの４８時間後に蛍光顕微鏡法により分析した。トランスフェクション後の期間を通して、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙをトランスフェクトしたＨＭＣＰＰ５細胞において（すなわち、ｍｉＲ−１２２配列を導入するための３’ＵＴＲ修飾なしで）ｍＣｈｅｒｒｙの発現が観察され、トランスフェクションおよび翻訳の成功が示された。対照的に、ｍｉＲＮＡ−１２２陽性であることが分っている健康な肝細胞では、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２の発現は、たとえトランスフェクションの３日後であっても、対照非トランスフェクション細胞において見られたレベルと比較して実質的に検出不可能なレベルまで下方制御された。このことは、３’ＵＴＲに挿入されたｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２におけるｍｉＲＮＡ−１２２を標的とする配列（バリアント１）の存在によって、おそらくはレシピエント細胞における翻訳抑制に起因して、ｍＲＮＡの翻訳が妨げられることを示した。

これらの細胞によって示される蛍光シグナルの定量化により、上記が確認された。図１０Ｂに示すように、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２をトランスフェクトした健康な細胞では、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙをトランスフェクトした細胞と比較して蛍光強度が大幅に減少した。

上記の実験で得られた結果は、ｍｉＲＮＡ−１２２の天然発現およびｍｉＲＮＡ−１２２を標的とする配列（バリアント１）との共局在化により、健康な肝細胞のタンパク質発現を効率的に調節することができ、それによって腫瘍特異的遺伝子発現を著しく増加させることを示した。次の実験では、ＨＭＣＰＰ５細胞におけるｍｉＲＮＡ−１２２の構成的発現および活性を評価した。ＨＭＣＰＰ５細胞にｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙまたはｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２を合計３回、それぞれ４８時間の間隔でトランスフェクトした。最初のトランスフェクションの６日後（すなわち、最後のトランスフェクションの４８時間後）に、ｍＣｈｅｒｒｙの発現を蛍光顕微鏡法により決定した。以前と同じように、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ構築物をトランスフェクトした細胞は鮮やかな赤色蛍光を示したが、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２構築物をトランスフェクトした細胞はそうではなかった。図１１では、１回（ＳＴ）および複数回（ＭＰＴ）トランスフェクトした細胞の両方について、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２をトランスフェクトした細胞とｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙをトランスフェクトした細胞との比較が、最終トランスフェクション後５日間の期間にわたって示される。ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２をトランスフェクトした場合、複数回トランスフェクトした細胞は、１回トランスフェクトした細胞と同じ蛍光強度の大幅な減少を示したが、複数回のトランスフェクション後はその効果がより長く持続したことが見て取れる。予想されるように、これは、ｍｉＲＮＡ制御機構によって駆動される差次的発現効果が、繰り返されるトランスフェクション事象に対して堅牢であり、この機構を駆動するために細胞内で利用可能なｍｉＲＮＡ−１２２の量がこれらの時間枠で使い果たされていないことを示す。

ヒト肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂおよび肝芽腫ＨｅｐＧ２細胞株を使用して内因性ｍｉＲＮＡ−１２２活性の効果を調べるために、上記と同様の実験を行った。細胞にｍＲＮＡ配列のｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２（バリアント１）をトランスフェクトするか、または対照トランスフェクションを行った。以前と同じように、４８時間後、図１０Ａに示すように蛍光顕微鏡法を用いて、トランスフェクションしたＨｅｐ３ＢおよびＨｅｐＧ２細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙの発現を決定した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞（図１０Ａ、中央の列）では、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙおよびｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２をトランスフェクトした株の両方においてｍＣｈｅｒｒｙ蛍光が明らかに見られたことから、これらの細胞ではｍｉＲＮＡ−１２２媒介性の翻訳抑制が機能しないことが示される。ＨｅｐＧ２細胞では、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙトをトランスフェクトした細胞においてｍＣｈｅｒｒｙ蛍光が明らかに見られ、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２をトランスフェクトした細胞ではある程度の蛍光が確認されたが、これは部分的にのみ減少したものであり、正常な肝細胞で見られたものよりも著しく高いと考えられた。このことのさらなる証拠は図１０Ｂに示されており、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２をトランスフェクトした株におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の定量化は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞には蛍光の減少が示されないが、ＨｅｐＧ２細胞では約５０％の減少が見られることを示している。

ＨｅｐＧ２細胞に見られる部分的な下方制御は、この株からの細胞が残留ｍｉＲＮＡ−１２２活性を保持することが示されているため、翻訳に対するｍｉＲＮＡ−１２２媒介性の効果をさらに暗示している（Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ”Ｄｅｌｅｔｅｄ”ＭＩＲ１２２ Ｇｅｎｅ ｉｎ ＨｅｐＧ２ Ｃｅｌｌｓ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（３））。

ｍｉＲＮＡ−１２２は脊椎動物種間で強く保存されており、ヒトと同様に、ｍｉＲＮＡ−１２２のレベル低下はマウスの肝細胞癌と関連している（Ｋｕｔａｙ ｅｔ ａｌ，２００６）。したがって、マウスの健康な肝細胞株Ａｍｌ１２を使用してｍｉＲＮＡ−１２２活性の内因性効果を調べた。

健康なマウス肝細胞にも、前述のｍＲＮＡ−Ｃｈｅｒｒｙ配列、すなわちＤＭＰ^ＣＴｘにカプセル化されたｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙまたはｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後および７２時間後に、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光にｍｉＲＮＡ−１２２結合部位配列の挿入の同様の影響が観察された。

図１２Ａに示すように、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙのトランスフェクション後に蛍光が観察された。ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２をトランスフェクションした後、蛍光の顕著な減少が示されたが、ある程度のシグナルはまだ見ることができた。

各処理群の培養プレート上の３つのランダム化領域から、トランスフェクションを行ってから２４時間後および７２時間後のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の定量化（図１２Ｂ）により、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２をトランスフェクトした場合、７０％を超える翻訳抑制が観察されることが示された。

予備的な結論として、上記の実施例は、ナノ粒子送達系の二重標的化機能、およびｍＲＮＡ構築物へのｍｉＲＮＡ−１２２標的配列の包含が、健康な肝細胞と比較して肝細胞癌および肝芽腫細胞におけるタンパク質産物の非常に有意な差次的発現を得るのに十分であることを示している。差次的発現の観察は、ヒトおよびマウスの両方の細胞株において明らかであった。

実施例２：腫瘍特異的遺伝子発現後のタンパク質発現レベル
別の実験において、ウエスタンブロッティングを用いて、トランスフェクション後に最終的に示されるタンパク質発現レベルを以下のように決定した。

細胞株のトランスフェクションと免疫ブロット−プロテインＡ
例示的な２５ｋＤａのヒトタンパク質（「プロテインＡ」と表示）の腫瘍特異的発現レベルを評価するために、肝癌細胞（ＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３Ｂ）と健康な肝細胞（ＨＭＣＰＰ５）の両方を１２ウェルプレートに播種し、実施例１でｍＣｈｅｒｒｙトランスフェクションについて前述したように、ヒトプロテインＡ（２５ｋＤａ）を発現するナノ製剤化ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ−Ａ−ＤＭＰ^ＣＴｘ）、または３’ＵＴＲに２つのｍｉＲＮＡ１２２結合配列（配列番号３０）を含むヒトプロテインＡ（約２５ｋＤａのヒトタンパク質）を発現するｍＲＮＡであるバリアント１（ｍＲＮＡ−Ａ−ｍｉＲＮＡ１２２−ＤＭＰ^ＣＴｘ）を０．５μｇ／ウェルでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、全タンパク質抽出後に免疫ブロットを行った。

免疫ブロットのために、培養培地を除去し、細胞を冷ＰＢＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）で洗浄し、細胞ペレットをプロテアーゼ阻害剤のカクテル（Ｓｉｇｍａ）を含むＲＩＰＡ（放射免疫沈降法）緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）に溶解した。タンパク質濃度は、ブラッドフォード比色法によって決定した。合計１０ｍｇのタンパク質をＮｏｖｅｘ（商標）４〜１２％ミニゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により分離し、エレクトロブロッティング（ｉＢｌｏｔ（登録商標）２ Ｇｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜に転写した。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）中の５％無脂肪粉乳でブロックした後、抗プロテインＡ抗体（１：２０００、Ａｂｃａｍ）、またはβ−アクチン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とともに一晩４℃で膜をインキュベートし、その後適切なＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（１：１００００、Ａｂｃａｍ）と共に１時間室温でインキュベートした。タンパク質抗体複合体は、それぞれＣｌａｒｉｔｙ（商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）およびＬＩ−ＣＯＲ（登録商標）システム（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用して視覚化および画像化した。

上記の結果は図１３に見ることができ、ＤＭＰ^ＣＴｘにカプセル化された以下のトランスフェクション構築物が示される：
図１３のレーン１、４、および７：ビヒクル（モック処理、ＰＢＳのみ）、
図１３のレーン２、５、および８：ｍＲＮＡ−Ａ（プロテインＡの配列を含むｍＲＮＡ）、ならびに
図１３のレーン３、６および９：ｍＲＮＡ−Ａ−１２２構築物（図３に示すように、バリアント１の位置に挿入されたプロテインＡおよびｍｉＲＮＡ１２２の配列を含む）。

トランスフェクションは、ウェル当たり０．５μｇのｍＲＮＡ−ＤＭＰ^ＣＴｘを使用して、上記のように、レーン１〜３の健康な肝細胞（ＨＭＣＰＰ５）、レーン７〜９の肝細胞癌モデルＨｅｐ３Ｂ、およびレーン４〜６の肝芽腫モデルＨｅｐＧ２からの細胞において行った。トランスフェクションの２４時間後に各細胞株からタンパク質を抽出した。１０μｇのタンパク質を各レーンにロードし、２つの独立した実験からデータを取得した。ｍＲＮＡ−Ａをトランスフェクトした場合、試験した全ての細胞株にプロテインＡが検出され、トランスフェクションが成功したことが示された。ｍＲＮＡ−Ａ−１２２をトランスフェクトすると、翻訳抑制は健康な肝細胞でのみ観察されたが、Ｈｅｐ３ＢおよびＨｅｐＧ２細胞では観察されず（レーン３、６、９）、試験した肝癌細胞においてｍｉＲＮＡ−１２２がその機能を果たさないことが示された。しかしながら、ｍＲＮＡ−Ａ−１２２をトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞では、実施例１でｍＣｈｅｒｒｙの発現について以前に見られたパターンと同様に、ｍＲＮＡ−Ａをトランスフェクトした細胞と比較してプロテインＡの発現がわずかに下方制御された。これは、ＨｅｐＧ２細胞の不完全な下方制御を示す露出の高い写真（下）において明確に見ることができる。ＨｅｐＧ２細胞に見られる部分的な下方制御は、この株からの細胞が残留ｍｉＲＮＡ−１２２活性を保持することが示されているため、翻訳に対するｍｉＲＮＡ−１２２媒介性の効果をさらに暗示している（Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ”Ｄｅｌｅｔｅｄ”ＭＩＲ１２２ Ｇｅｎｅ ｉｎ ＨｅｐＧ２ Ｃｅｌｌｓ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（３））。

要約すると、肝臓特異的ｍｉＲＮＡ−１２２標的配列を挿入することによる３’ＵＴＲ ｍＲＮＡの修飾は、ｍＲＮＡ翻訳を肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂおよび肝芽腫ＨｅｐＧ２に著しく限定することができるが、正常なヒト肝細胞ではそうではない。

実施例３：インビトロでの腫瘍溶解性ウイルス併用療法
ここでは、本発明の方法によって可能になり、かつ上記の実施例に示される、提供されたｍＲＮＡ構築物の差次的発現を、腫瘍溶解性ウイルス療法と組み合わせて使用することができることを記載する。特に、腫瘍溶解性ウイルスが病原性遺伝子を除去するように修飾され、健康な細胞におけるその複製能力を弱める場合、本発明を使用して、癌細胞等の罹患細胞でそれらの遺伝子またはその等価物の機能を回復することができる。この可能性を調査するために、ＵＳ３を欠く腫瘍溶解性ウイルスＨＳＶ−１（Ｒ７０４１）（Ｌｅｏｐａｒｄｉ ｅｔ ａｌ，１９９７，ＰＮＡＳ ９４；７８９１−７８９６を参照）と、ＵＳ３をコードするｍＲＮＡ構築物を提供し、ｍｉＲＮＡ−１２２結合部位で修飾されたＤＭＰ^ＣＴｘプラットフォームとの組み合わせを、肝細胞癌のモデルで使用した（配列番号３２）。

一般的なプロトコル：
細胞培養
ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）ＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３Ｂ細胞を、５％ＣＯ_２の雰囲気中３７℃で、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ，Ｃｅｌｌｇｒｏ，ＵＳＡ）、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ^−１）中で単層として培養した。ＨｅｐＧ２細胞は、５μｇ／ｃｍ^２のコラーゲン濃度でコラーゲン被覆したプレート上で増殖させた。

ウイルスの調製
凍結したＲ７０４１ウイルスを３７℃の水浴中で解凍し、バスソニケーター（Ｑ５００ソニケーター、Ｑｓｏｎｉｃａ，ＵＳＡ）を使用して３０秒間超音波処理し、次いで氷に移し、すぐに使用できる状態にした。

ヒトＨＣＣに対するＲ７０４１単独の毒性
ＵＳ３変異体Ｒ７０４１ウイルスは、健康な細胞に対して実質的に無病原性であると考えられ（Ｌｅｏｐａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．１９９７）、免疫不全の無胸腺マウスにおいて良好な安全性さえ示している（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７；１３（１９））。肝細胞癌細胞に対するＲ７０４１ウイルスの有効性のベースラインを確立するために、モデル細胞株を腫瘍溶解性ウイルスのみで処理した。Ｈｅｐ３ＢおよびＨｅｐＧ２株からの細胞を、それぞれウェル当たり１５，０００および１７，０００で、９６ウェルプレートに３通り播種した。

２４時間後、ＭＯＩ０．３７〜０．０００１６９４のウイルスの３倍連続希釈液で細胞を感染させた。感染後９６時間目に、供給業者の指示に従って、試験した細胞株の生存率をＭＴＳアッセイにより測定した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）。９６ウェルプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ３，ＵＳＡ）を用いて、４９０ｎｍで吸光度を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０３を使用して、用量反応曲線および５０％有効量値（ＥＤ_５０）を得た。

図１４に示すように、Ｈｅｐ３ＢおよびＨｅｐＧ２の両方の細胞株は、それぞれＥＤ_５０＝０．０１および０．０２ＭＯＩで、Ｒ７０４１と同様の感受性を示した。しかしながら、Ｈｅｐ３Ｂ細胞株は、ＨｅｐＧ２細胞よりもＲ７０４１に対する感受性が若干高いことが分かった。

ヒトＨＣＣの生存率に対するＲ７０４１とｍＲＮＡ−ＤＭＰ^ＣＴｘの組み合わせ効果
ヒト肝細胞癌に対するＲ７０４１ウイルスとｍＲＮＡ−ＵＳ３−ＤＭＰ^ＣＴｘの組み合わせ効果を評価する前に、０．０４μｇ／ｍＬのｍＲＮＡ−ＵＳ３でのｍＲＮＡ−ＵＳ３−ＤＭＰ^ＣＴｘによるＨｅｐ３ＢおよびＨｅｐＧ２細胞のトランスフェクションが、ＭＴＳアッセイにより測定された細胞生存率に対して著しい効果を与えないことを確認した。

Ｈｅｐ３ＢおよびＨｅｐＧ２細胞を、それぞれウェル当たり１５，０００および１７，０００で、９６ウェルプレートに３通り播種した。２４時間後、ＭＯＩ０．３７から開始して最大０．０００１６９４までのウイルスの３倍連続希釈液で細胞を感染させた。図１５に示すような実験タイムラインに従って、Ｒ７０４１の感染から２４時間および４８時間後に、試験した両方の細胞株に固定用量０．０４μｇ／ｍＬのｍＲＮＡ−ＵＳ３−ＤＭＰ^ＣＴｘを２回トランスフェクトした。トランスフェクション後３日目に、試験した細胞株の生存率を上記のようにＭＴＳアッセイにより測定した。試験した両方のヒトＨＣＣについて、腫瘍溶解性Ｒ７０４１および非毒性用量のｍＲＮＡ−ＵＳ３−ＤＭＰ^ＣＴｘ（０．０４μｇ／ｍＬ）の２つの異なる化合物の組み合わせは、図１６に示すように、より低いウイルス力価で腫瘍破壊を著しく促進した。この図では、０．０４μｇ／ｍＬのｍＲＮＡ−ＵＳ３−ＤＭＰ^ＣＴｘ単独（ｙ軸のバツ印）、様々な希釈率のＲ７０４１単独（灰色の三角形／ひし形）、および組み合わせ（黒丸）について生存率に対する影響が示されている。

上記の実施例は、病原性遺伝子を欠失させた弱毒化腫瘍溶解性ウイルスと、差次的に発現させた欠失遺伝子の代替品の供給により、インビトロでの腫瘍溶解性ウイルス療法の有効性を著しく高めることができることを示している。特に、本発明の組成物と組み合わせた場合に、より低いウイルス力価でより大きな効果が見られた。

実施例４：送達された蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ構築物のインビボでの発現
インビボアプローチに対する本発明の適用可能性を決定するために、同所性ヒト肝細胞癌のマウスモデルを使用した。ｍｉＲＮＡ−１２２結合部位によって駆動される差次的発現は、インビトロで健康なマウスＡｍｌ１２肝細胞に適用可能であることが上で示された（実施例１を参照）。

同所性ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）モデル
動物
６〜８週齢の雌（ＣＢ１７／Ｉｃｓ−ＰｒｋｄｃＳＣＩＤ／ＩｃｒＩｃｏＣｒｌ）Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ＵＫから購入した。全てのインビボ手順は、英国のＣｒｏｗｎＢｉｏでＳｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅによって承認された。

細胞
同所性ＨＣＣモデルを作製するために、ホタルルシフェラーゼを発現するヒトＨｅｐ３Ｂ細胞株の生物発光バリアント（Ｈｅｐ３Ｂ−ｃＬｕＸ）を使用した。細胞は、１０％熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％ＮＥＡＡを添加したＥＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）で培養した：２μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）で毎週細胞を処理した。

肝内注射と腫瘍増殖のモニタリング
麻酔下で、２０μＬの１：１のＰＢＳ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）に懸濁したヒトＨｅｐ３Ｂ−ｃＬｕＸ細胞（２×１０^６）を、２９Ｇ針を使用して肝臓の左葉上部に注射した。注射部位を吸収性ゼラチンスポンジ（ＡＧＳ）で覆い、ＡＧＳを乱すことなく肝臓を腹腔内に戻し、皮膚を縫合して閉じた。生物発光イメージング（ＢＬＩ）により、腫瘍増殖を週２回確認した。

簡単に言えば、マウスに麻酔を施し、イメージングの１５分前に１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリンを皮下注射した。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ４．３．１ソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬＳ，ＵＳＡ）を使用してＢＬＩ画像を取り込み、処理した。マウスの体重を週に３回、または投与前に週に１回測定した。指定された日に、マウスを屠殺し、２％または４％パラホルムアルデヒド溶液（ＰＦＡ）で肝臓を固定した後、さらなる組織病理学的分析のためにＯＣＴ（最適切断温度化合物：包埋培地）で凍結させた。

ｍＲＮＡの製剤化と腫瘍標的化効率の評価
ｍＣｈｅｒｒｙ配列を含むｍＲＮＡ配列、およびｍｉＲＮＡ−１２２を含むｍＣｈｅｒｒｙの配列（配列番号３１）を、「ＤＭＰ^ＣＴｘの合成とｍＲＮＡの製剤化」および表４で前述したように製剤化した。選択的腫瘍標的化と非罹患肝細胞の温存を評価するために、同所性肝癌を有するマウスの尾静脈に製剤化ｍＲＮＡを注入した。簡単に言えば、２０μＬの１：１のＰＢＳ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）に懸濁した２×１０^６のヒトＨｅｐ３Ｂ−ｃＬｕＸ細胞を、上記のように肝臓の左葉上部に注射した。次いで、同じく上記のように、ＢＬＩイメージングによって腫瘍増殖をモニタリングした。８日後、腫瘍が確立されたとき（ＢＬＩ≧６×１０^６）、マウス当たり２０μｇの製剤化ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤＭＰ^ＣＴｘ、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２−ＤＭＰ^ＣＴｘ、またはｍＲＮＡ−Ａ−１２２−ＤＭＰ^ＣＴｘを、尾静脈を介して注射し、血流を戻すことにより送達粒子を肝臓に取り込ませた。２４時間後、最後のＢＬＩを行い、マウスを安楽死させ、肝臓を切除し、局在化する肝臓病変でエクスビボＢＬＩにより画像化した。

組織学
簡単に言えば、エクスビボイメージングの後、腫瘍のある左肝葉を取り除き、２％ＰＦＡで固定し、４℃の３０％ショ糖溶液（ＰＢＳ中、ｐＨ７．４）に浸漬し、ＯＣＴに包埋し、ドライアイス浴で予冷したイソペンタン中で凍結させ、−８０℃で保存した。５μｍの凍結切片（Ｌｅｉｃａ ＣＭ３００，ＵＳＡ）を、ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）またはＨ＆Ｅ（ヘマトキシリンエンドエオシン）染色による核対比染色に供した。腫瘍標的化は、蛍光顕微鏡および／またはソフトウェアを使用して、腫瘍および健康な肝臓におけるｍＣｈｅｒｒｙ対ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２の発現レベルを決定することにより評価した。腫瘍組織および健康な組織は、Ｈ＆Ｅ染色によって決定した。

モックおよびｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤＭＰ^ＣＴｘ、ならびにｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２−ＤＭＰ^ＣＴｘ処理マウスのＢＬＩイメージングによってモニタリングされた腫瘍増殖の例。動物にＤ−ルシフェリンを皮下注射し、１５分後に画像化した。図１７（Ａ）（上のパネル）に示すように、シグナルは動物の中央部にのみ存在していた（示されている動物は組成物による治療前である）。中央部に同様の強度を示す全ての動物を解剖し、肝臓をエクスビボで画像化した：図１７（Ａ）（下のパネル）。腫瘍のある肝臓の左葉を切片化し、ＤＡＰＩで対比染色した。図１７（Ｂ）に示すように、製剤化ｍＲＮＡの注射の２４時間後に、蛍光顕微鏡法を用いて健康な肝細胞および肝腫瘍細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙの発現を決定した。マウスをｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤＭＰ^ＣＴｘで処理したときに、健康な肝細胞においてｍＣｈｅｒｒｙの蛍光が検出された（図１７Ｂ、中央パネル）。ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２−ＤＭＰ^ＣＴｘ（バリアント１）で処理したときに、翻訳抑制が観察された（図１７Ｂ、左パネル）。図１７Ｂは、（左から右に）モック処理、ｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤＭＰ^ＣＴｘ、およびｍＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−１２２−ＤＭＰ^ＣＴｘマウスからの健康な肝細胞を示す。

結論として、本発明の組成物はインビボで投与することができ、標的肝細胞を成功裏にトランスフェクトすることができる。ｍｉＲＮＡ結合部位で修飾すると、非罹患細胞および腫瘍細胞において差次的発現が達成され得る。

実施例５：肝臓における非罹患組織と罹患組織との間の送達されたＵＳ３ ｍＲＮＡ構築物のインビボでの差次的発現
実施例４に記載のインビボマウスモデルを、ＵＳ３ ｍＲＮＡ ＤＭＰ^ＣＴｘ ｍｉＲＮＡ−１２２構築物を含む送達粒子組成物の投与に適用した。Ｈｅｐ３Ｂヒト癌を含有するマウスの肝臓におけるＵＳ３の差次的発現を、抗ＵＳ３ポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学を使用して分析した。その結果を図１８に示す。腫瘍細胞（濃い染色）と非罹患細胞（淡い染色）との間で、ＵＳ３タンパク質レベルに目に見える違いがあることがわかる。病理学者によって独立して確認されたように、差次的発現は腫瘍の境界を描出する。したがって、本発明の組成物は、哺乳動物対象において潜在的な治療増強因子の差次的発現をインビボで成功裏に駆動できると結論付けることができる。

免疫組織化学
新鮮な凍結切片を５μｍ（ミクロン）で切断し、約１時間風乾した後、室温（ＲＴ）で１５分間、４％パラホルムアルデヒドで固定した。水道水を流して切片を洗浄し、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎに移した。切片を２．５％正常馬血清（すぐに使用できる、ＩｍｍＰＲＥＳＳ ＨＲＰ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼポリマー検出キット、Ｖｅｃｔｏｒ ＭＰ−７４０１）と共に２０分間インキュベートした。スライドの水気を切り、１：４００に希釈したＵＳ３に対する一次抗体（Ａｃｒｉｓ ＡＰ５５２６６ＳＵ−Ｎ）と共にインキュベートした。抗体をＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎで希釈し、一次抗体を省いた陰性対照を含め、スライドを抗体希釈液ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎと共に１時間室温でインキュベートした。スライドをＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＥＬＧＡ社製の装置で精製した水で希釈した０．３％過酸化水素で内因性ペルオキシダーゼを１０分間ブロックした。スライドをＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＩｍｍＰｒｅｓｓ抗ウサギＩｇＧ試薬（すぐに使用できる、ＩｍｍＰＲＥＳＳ ＨＲＰ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼポリマー検出キット、Ｖｅｃｔｏｒ ＭＰ−７４０１）とともに３０分間室温でインキュベートした。スライドをＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、色素原ＩｍｍＰＡＣＴ ＤＡＢ（ＩｍｍＰＡＣＴ ＤＡＢペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）基質、Ｖｅｃｔｏｒ ＳＫ−４１０５）と共に５分間インキュベートし、次いで、エルガ水で洗浄し、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで必要に応じて対比染色した。エルガ水でさらに短時間の洗浄を行い、５分間水道水を流して青色に染色した。スライドを脱水し、透明化し、マウントし（９５％ＩＭＳ、９９％ＩＭＳ×２、およびキシレン×２）、次いでカバースリップで覆った。

本発明の特定の実施形態を本明細書において詳細に開示してきたが、これは例として、かつ例示のみを目的として行われたものである。前述の実施形態は、添付の特許請求の範囲の範疇を制限することを意図するものではない。本発明者は、特許請求の範囲によって定義される本発明の主旨および範囲から逸脱することなく、本発明に対して様々な置換、変更、および修正が行われてもよいことが企図される。本発明の実施形態による構築物およびベクターに含まれている任意の非ヒト核酸および／またはポリペプチド配列は、英国、米国、および欧州連合内の供給源から入手されている。本発明者の知る限りでは、アクセスおよび利益共有契約の対象となり得る遺伝資源、または関連する伝統的な知識は、本発明の作成に利用されていない。

Claims (45)

1. １つ以上の標的器官内で１つ以上のポリペプチドを発現させるための単離されたｍＲＮＡ配列であって、前記配列が、
   前記少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのコード配列と、
   少なくとも第１の非翻訳領域（ＵＴＲ）配列と、
   複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位配列と、を含み、
   前記ｍｉＲＮＡ結合部位配列のそれぞれが、前記第１のＵＴＲ配列内、そのすぐ５’側またはそのすぐ３’側に位置し、
   前記ｍｉＲＮＡ結合部位配列が、前記標的器官（複数可）内の少なくとも第１および第２の細胞型におけるコード配列の差次的発現を可能にする、単離されたｍＲＮＡ配列。
2. 前記ｍＲＮＡ配列が、２つより多く、好適には３つより多く、典型的には４つより多くの結合部位配列を含む、請求項１に記載の単離されたｍＲＮＡ配列。
3. 前記複数のｍｉＲＮＡ結合部位配列が、少なくとも２つの実質的に類似した配列を含む、請求項１または２に記載の単離されたｍＲＮＡ配列。
4. 前記複数のｍｉＲＮＡ結合部位配列が、少なくとも２つの実質的に異なる配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたｍＲＮＡ配列。
5. 前記複数のｍｉＲＮＡ結合部位配列が、ｍｉＲＮＡ−１２２、ｍｉＲＮＡ−１２５ａ、ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１９９、ｍｉＲＮＡ−１２４ａ、Ｌｅｔ−７、ｍｉＲＮＡ−１４８ａ、ｍｉＲＮＡ−１４８ｂ、ｍｉＲＮＡ−３７５、ｍｉＲＮＡ−１４３、ｍｉＲＮＡ−１４５、ｍｉＲＮＡ１９２、ｍｉＲＮＡ１９４、ｍｉＲＮＡ−２０４、ｍｉＲＮＡ２１５、ｍｉＲＮＡ−３０ｂ、およびｍｉＲＮＡ−３０ｃからなる群のうちの少なくとも１つ以上から選択されるｍｉＲＮＡ配列に実質的に相補的である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離されたｍＲＮＡ配列。
6. 前記複数のｍｉＲＮＡ結合部位配列のうちの少なくとも１つが、配列番号１〜７のうちの１つ以上を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたｍＲＮＡ配列。
7. 前記複数のｍｉＲＮＡ結合部位配列のうちの少なくとも１つが、配列番号１を含む、請求項６に記載の単離されたｍＲＮＡ配列。
8. 前記結合部位配列が、配列番号１、２、３、４、および５のそれぞれを含むか、または前記結合部位配列が、配列番号１、２、５、６、および７のそれぞれを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたｍＲＮＡ配列。
9. 前記第１および第２の細胞型が、非新生物細胞、形質転換細胞の表現型、前癌性の表現型、および新生物の表現型からなる群からの異なる選択である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離されたｍＲＮＡ配列。
10. 前記標的器官（複数可）が、肝臓、脳、肺、乳房、膵臓、結腸、および腎臓からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたｍＲＮＡ配列。
11. 前記１つ以上のポリペプチドのうちの少なくとも１つが、治療増強因子を含む、請求項１〜１０に記載の単離されたｍＲＮＡ配列。
12. 前記治療増強因子が、
    （ｉ）ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５ ＣＸＣＬ９、およびＣＸＣＬ１０のうちの１つ以上から選択される免疫応答および炎症に関与するサイトカイン（またはそれらのリガンド）、
    （ｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ９のうちの１つ以上から選択される樹状細胞活性化剤、
    （ｉｉｉ）ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１６０、２Ｂ４、Ｔｉｍ−３、ＧＰ−２、Ｂ７Ｈ３、およびＢ７Ｈ４のうちの１つ以上から選択されるそれらの細胞受容体およびそれらのリガンドを標的とする分子、
    （ｉｖ）ＴＧＦ β阻害剤、
    （ｖ）Ｔ細胞膜タンパク質３阻害剤、
    （ｖｉ）プログラム死１（ＰＤ１）、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤＬ２）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、およびリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）の阻害剤、ならびに
    （ｖｉｉ）ＮＦ−κＢ阻害剤、からなる群から選択される免疫調節分子である、請求項１１に記載の単離されたｍＲＮＡ配列。
13. 前記ｍＲＮＡが、１つより多くのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離されたｍＲＮＡ配列。
14. 前記ｍＲＮＡが、配列番号１８〜２９からなる群のうちの１つから選択される配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離されたｍＲＮＡ配列。
15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離されたｍＲＮＡ配列と、送達粒子と、前記送達粒子内に含まれる配列と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
16. 前記送達粒子が、アミノアルコールリピドイド粒子、リポソーム、エクソソーム、細胞由来の小胞、およびポリマー粒子からなる群のうちの少なくとも１つから選択される、請求項１５に記載の組成物。
17. 前記送達粒子が、前記標的器官（複数可）のうちの１つ以上を標的とする、請求項１５または１６に記載の組成物。
18. 前記送達粒子が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、糖タンパク質、脂質、小分子、および核酸から選択される標的化剤を含み、
    前記標的化剤が、前記標的器官（複数可）の細胞と優先的に会合する、請求項１７に記載の組成物。
19. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ配列をコードする、ポリヌクレオチド発現ベクター構築物。
20. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ配列または請求項２０に記載のポリヌクレオチド発現ベクター構築物を含む、ウイルスベクター。
21. 癌の治療のための方法であって、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の単離されたｍＲＮＡ配列、組成物、ベクター構築物、またはウイルスベクターを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
22. 治療または治療薬を前記対象に施すことをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記治療または治療薬が、化学療法、放射線療法、生物学的因子、腫瘍溶解性ウイルス、小分子薬、ＣＡＲ−Ｔまたは養子細胞療法、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記対象が、ヒトである、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記対象が、非ヒト動物である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記癌が、肝臓、脳、肺、乳房、膵臓、結腸直腸、および腎臓の癌からなる群の少なくとも１つから選択される、請求項２１〜２５のいずれか一項記載の方法。
27. 前記癌が、肝癌である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記肝癌が、原発性肝癌または続発性肝癌である、請求項２７に記載の方法。
29. 前記肝癌が、原発性肝癌である、請求項２７または２８に記載の方法。
30. 前記肝癌が、続発性肝癌である、請求項２７または２８に記載の方法。
31. 前記原発性肝癌が、肝細胞癌、肝芽腫、胆管細胞癌、および血管肉腫からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
32. 前記続発性肝癌が、既知または未知の原発性固形腫瘍からの転移性肝癌である、請求項３０に記載の方法。
33. 腫瘍溶解性ウイルスを前記対象に投与することをさらに含む、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記単離されたｍＲＮＡ配列が、腫瘍溶解性ウイルスの有効性を高める治療薬をコードする、請求項３３に記載の方法。
35. 前記腫瘍溶解性ウイルスが、１つ以上のビルレンス遺伝子の変異によって弱毒化されている、請求項３３または３４に記載の方法。
36. 前記ｍＲＮＡ配列が、１つ以上の病原性遺伝子、またはその等価物もしくは相同体をコードする、請求項３５に記載の方法。
37. 前記腫瘍溶解性ウイルスが、ウイルスのボルティモア分類の第Ｉ〜ＶＩＩ群のいずれか１つから選択される、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記腫瘍溶解性ウイルスが、水疱性口内炎ウイルス、マラバウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、コクサッキーウイルスＡ２１、パルボウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、ワクシニアウイルス、およびアデノウイルスのうちの１つ以上を含む群から選択される、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記腫瘍溶解性ウイルスが、単純ヘルペスウイルスである、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 医薬に使用するための、請求項１〜１４、１９、または２０のいずれか一項に記載の単離されたｍＲＮＡ配列、ベクター構築物、もしくはウイルスを含む、組成物、または請求項１５〜１８に記載の組成物。
41. 前記癌が、肝臓、脳、肺、乳房、膵臓、結腸直腸、および腎臓の癌からなる群から選択される、癌の治療に使用するための、請求項１〜１４、１９、または２０のいずれか一項に記載の単離されたｍＲＮＡ配列、ベクター構築物、もしくはウイルスを含む、組成物、または請求項１５〜１８に記載の組成物。
42. ＣＡＲ−Ｔまたは適応細胞療法を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
43. 前記単離されたｍＲＮＡ配列、組成物、ベクター構築物、またはウイルスベクターが、
    （ｉ）ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５ ＣＸＣＬ９、およびＣＸＣＬ１０のうちの１つ以上から選択される免疫応答および炎症に関与するサイトカイン（またはそれらのリガンド）、
    （ｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ９のうちの１つ以上から選択される樹状細胞活性化剤、
    （ｉｉｉ）ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１６０、２Ｂ４、Ｔｉｍ−３、ＧＰ−２、Ｂ７Ｈ３、およびＢ７Ｈ４のうちの１つ以上から選択されるそれらの細胞受容体およびそれらのリガンドを標的とする分子、
    （ｉｖ）ＴＧＦ β阻害剤、
    （ｖ）Ｔ細胞膜タンパク質３阻害剤、
    （ｖｉ）プログラム死１（ＰＤ１）、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤＬ２）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、およびリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）の阻害剤、ならびに
    （ｖｉｉ）ＮＦ−κＢ阻害剤、からなる群から選択される１つ以上の免疫調節分子をコードする、請求項４２に記載の方法。
44. 細胞チェックポイント阻害剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記単離されたｍＲＮＡ配列、組成物、ベクター構築物、またはウイルスベクターが、
    （ｉ）ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５ ＣＸＣＬ９、およびＣＸＣＬ１０のうちの１つ以上から選択される免疫応答および炎症に関与するサイトカイン（またはそれらのリガンド）、
    （ｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ９のうちの１つ以上から選択される樹状細胞活性化剤、
    （ｉｉｉ）ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１６０、２Ｂ４、Ｔｉｍ−３、ＧＰ−２、Ｂ７Ｈ３、およびＢ７Ｈ４のうちの１つ以上から選択されるそれらの細胞受容体およびそれらのリガンドを標的とする分子、
    （ｉｖ）ＴＧＦ β阻害剤、
    （ｖ）Ｔ細胞膜タンパク質３阻害剤、
    （ｖｉ）プログラム死１（ＰＤ１）、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤＬ２）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、およびリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）の阻害剤、ならびに
    （ｖｉｉ）ＮＦ−κＢ阻害剤、からなる群から選択される１つ以上の免疫調節分子をコードする、請求項４４に記載の方法。
    

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