CN112137993A - 盐酸舍曲林及其衍生物在制备抗新型冠状病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，公开了盐酸舍曲林及其衍生物在制备预防和/或治疗冠状病毒药物中的应用。该盐酸舍曲林分子式为C₁₇H₁₈Cl₃N，CAS号为79559‑97‑0，化学名称为(1S‑顺式)‑4‑(3,4‑二氯苯基)‑1,2,3,4‑四氢‑N‑甲基‑1‑萘胺盐酸盐。本发明首次发现盐酸舍曲林靶向SARS‑CoV‑2，阻断病毒颗粒与受体之间的相互作用，从而抑制SARS‑CoV‑2进入靶细胞，为非典型肺炎(COVID‑2019)的预防和治疗提供一种新的小分子药物，其在活性浓度范围内没有细胞毒性，能够剂量依赖的抑制SARS‑CoV‑2的进入，可以用于制备预防和/或治疗SARS‑CoV‑2的药物。

Description

盐酸舍曲林及其衍生物在制备抗新型冠状病毒药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及盐酸舍曲林及其衍生物在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。

背景技术

2019-新型冠状病毒，即“2019-nCoV”或“SARS-CoV-2”，是持续爆发的非典型肺炎(COVID-2019)的原因。此后，这种病毒对全球健康构成了大威胁。世界卫生组织于2020年1月30日宣布SARS-CoV-2疫情为国际关注的公共卫生突发事件。因此，如果SARS-CoV-2的传播和毒力不被控制，或者没有开发有效的治疗方法，这种流行病有可能对全球经济产生重大影响。

冠状病毒分为α类、β类、γ类和δ类。其中，β冠状病毒具有被包膜包裹的单链RNA基因组，并对人类具有致病性。β冠状病毒包括引起严重急性呼吸综合征(SARS)的SARS-CoV，以及引起中东呼吸综合征(MERS)的MERS-CoV。与SARS-CoV和MERS-CoV一样，最近爆发的SARS-CoV-2也属于β冠状病毒属，为线性单链RNA病毒(ssRNA)，并且流行病学迄今表明，SARS-CoV-2比SARS-CoV或MERS-CoV更具传染性。面对新的冠状病毒肺炎流行，已采用多种方法来制定预防和治疗措施，包括全灭活疫苗、亚单位疫苗，基于RNA的疫苗，病毒载体疫苗，单克隆中和抗体，融合抑制剂等，其中大部分是针对S蛋白。然而，由于其高传染性和致病性，SARS-CoV-2应在生物安全三级(BSL-3)设施中处理，这限制了抗病毒措施的发展。

SARS-CoV-2的基因组大小约30千碱基，与其他冠状病毒一样，编码多种结构和非结构性蛋白质。结构蛋白包括穗(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白。其中S蛋白是SARS-CoV-2中最大的结构蛋白，主要负责病毒附着和进入靶细胞，从而启动感染过程。因此，能够破坏S蛋白与受体之间相互作用的策略可能具有重要的治疗价值。

发明内容

为了克服现有技术存在的问题，本发明的第一方面的目的，在于提供盐酸舍曲林及其衍生物在制备预防和/或治疗冠状病毒药物中的应用。

本发明的第二方面的目的，在于提供盐酸舍曲林及其衍生物在制备抑制冠状病毒进入细胞的制剂中的应用。

本发明的第三方面的目的，在于提供一种预防和/或治疗冠状病毒药物。

本发明的第四方面的目的，在于提供一种抑制冠状病毒进入细胞的制剂。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供盐酸舍曲林及其衍生物在制备预防和/或治疗冠状病毒药物中的应用。

盐酸舍曲林是一种选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)，是选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)类的抗抑郁药，其分子式为C₁₇H₁₈Cl₃N，CAS号为79559-97-0，化学名称为(1S- 顺式)-4-(3,4-二氯苯基)-1,2,3,4-四氢-N-甲基-1-萘胺盐酸盐，结构式如式(I)。临床上主要用于成人门诊患者的重度抑郁症以及成人和儿童的强迫症，恐慌症和社交焦虑症的治疗。

所述衍生物包括盐酸舍曲林在药学上可以接受的盐、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。

所述盐酸舍曲林的浓度优选为0.03～10μM；更优选为0.1～10μM；最优选为0.6～10μM。

所述冠状病毒优选为β冠状病毒；更优选为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV中的至少一种；最优选为SARS-CoV-2。

本发明的第二个方面，提供盐酸舍曲林及其衍生物在抑制冠状病毒进入细胞的制剂中的应用。

所述衍生物包括盐酸舍曲林在药学上可以接受的盐、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。

所述盐酸舍曲林的浓度优选为0.03～10μM；更优选为0.1～10μM；最优选为0.6～10μM。

所述冠状病毒优选为β冠状病毒；更优选为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV中的至少一种；最优选为SARS-CoV-2。

本发明的第三方面，提供一种预防和/或治疗冠状病毒药物，包括盐酸舍曲林和/或其衍生物。

所述预防和/或治疗冠状病毒药物还包括药学上可接受的辅料。

所述辅料优选包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂中的一种或多种。

所述预防和/或治疗冠状病毒药物优选制成固体制剂、注射剂、喷剂、液体制剂、吸入制剂或复方制剂。

所述衍生物包括盐酸舍曲林在药学上可以接受的盐、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。

所述冠状病毒优选为β冠状病毒；更优选为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV中的至少一种；最优选为SARS-CoV-2。

本发明的第四方面，提供一种抑制冠状病毒进入细胞的制剂，包括盐酸舍曲林和/或其衍生物。

所述衍生物包括盐酸舍曲林在药学上可以接受的盐、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。

所述冠状病毒优选为β冠状病毒；更优选为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV中的至少一种；最优选为SARS-CoV-2。

本发明的有益效果是：

本发明首次发现盐酸舍曲林靶向SARS-CoV-2，阻断病毒颗粒与受体之间的相互作用，从而抑制SARS-CoV-2进入靶细胞，为非典型肺炎(COVID-2019)的预防和/或治疗提供一种新的小分子药物。

本发明提供的盐酸舍曲林在活性浓度范围内没有细胞毒性，能够剂量依赖的抑制SARS-CoV-2的进入，可以用于制备预防和/或治疗SARS-CoV-2的药物。

附图说明

图1是不同稀释倍数的假病毒感染能力图：其中，A为不同稀释倍数的SARS-CoV-2假病毒的感染能力图；B为不同稀释倍数的VSV-G假病毒的感染能力图。

图2是不同浓度的盐酸舍曲林对SARS-CoV-2假病毒进入细胞的抑制率图：其中，A为不同浓度的盐酸舍曲林对SARS-CoV-2假病毒进入ACE2-293T细胞的抑制率图；B为不同浓度的盐酸舍曲林对SARS-CoV-2假病毒进入VeroE6细胞的抑制率图。

图3是不同浓度的盐酸舍曲林对SARS-CoV-2假病毒及VSVG假病毒进入细胞的抑制率图。

图4是细胞在不同浓度盐酸舍曲林下的存活率图：其中，A为ACE2-293T细胞在不同浓度盐酸舍曲林下的存活率图；B为VeroE6细胞在不同浓度盐酸舍曲林下的存活率图。

图5是不同浓度的盐酸舍曲林对SARS-CoV-2活病毒进入细胞的抑制率图。

图6是盐酸舍曲林相对SARS-CoV-2假病毒的加入时间对SARS-CoV-2假病毒进入抑制率的影响图。

图7是不同盐酸舍曲林浓度下洗涤细胞及不洗涤细胞对SARS-CoV-2假病毒进入抑制率的影响图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

本实施例中HEK-293T细胞、ACE2-293T细胞和VeroE6细胞购自ATCC。

本实施例中盐酸舍曲林购自TargetMol。

本实施例中PBS优选为0.01M，pH＝7.4的PBS。

本实施例中HEK-293T细胞、ACE2-293T细胞和VeroE6细胞在包含10％胎牛血清(FBS)， 1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养。

本实施例中SARS-CoV-2活病毒(MOI＝0.05)是由武汉病毒研究所分离出的临床分离株 SARS-CoV-2(BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019)。

本实施例中SARS-CoV-2-S包膜质粒是是由复旦大学陆路博士构建并赠予，将优化密码子表达的全长S蛋白的基因插入到pcDNA3.1(+)载体中而构建，具体如下：对Wuhan-Hu-1 菌株(GenBank：MN908947)的spike基因进行密码子优化，得到优化后的spike基因(序列如 SEQID NO.1所示)，将优化后的spike基因通过BamHI和xhoI酶切位点克隆于真核表达质粒 pcDNA3.1(+)(购于优宝生物)，得到pcDNA3.1-SARS-CoV-2-S质粒。

本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

本发明中的术语解释：

选择性指数：选择性指数是通过50％的细胞毒性浓度(CC50)除以50％的病毒抑制浓度(IC50)计算而来的，该指标数值越高则指示该药物有越好的临床应用前景。本发明通过法测定了盐酸舍曲林的CC50，再通过SARS-CoV-2假病毒试验确定IC50值，最终得到了盐酸舍曲林的选择性指数(SI)。

假病毒实验：假病毒实验是指将表达SARS-CoV-2包膜蛋白的SARS-CoV-2包膜质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-S质粒和HIV骨架质粒pNL4-3.luc.RE共转染至HEK-293T细胞，组装只能复制一次的SARS-CoV-2假病毒(SARS-CoV-2PsV)。由于SARS-CoV-2进入靶细胞的过程由包膜蛋白S所介导，因此假病毒实验是一个高度敏感、客观、安全的模拟真病毒进入的实验体系，可用于评价化合物抑制SARS-CoV-2进入靶细胞的活性。HEK-293T细胞由 293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。 HEK-293T细胞转染效率高，蛋白表达水平高，转染后2-3天用碱性磷酸酶分析可较容易地检测到表达的蛋白。瞬时转染293T细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外蛋白的便捷方式。

实施例1SARS-CoV-2假病毒的制备

1)HEK-293T细胞培养：将处于对数生长期的293T细胞以40000个/孔密度接种于6孔细胞培养板，毎孔2mL，37℃，5％CO₂细胞培养箱过夜；

2)次日，待细胞密度达到孔底面积85％左右，可用于转染试验。转染前30min将培养液更换为37℃水浴锅预热的含有10％小牛血清，1％青霉素-链霉素的DMEM培养液；

3)分别向2支无菌1.5mLEP管中加入100μL不含胎牛血清和双抗(青霉素-链霉素)的 DMEM培养基；一支加入8μL PolyJet^TM(美国SignaGen)，得到A溶液；另一支加入3ugpNL4-3.luc.RE质粒(获得于美国国立卫生研究院艾滋病研究与参考试剂计划)和1ugpcDNA3.1-SARS-CoV-2-S质粒，得到B溶液；将A溶液加入B溶液中，混匀，室温孵育15min，得到转染复合物；重复6次转染复合物制备过程；

4)将步骤3)得到的转染复合物分别加入6孔细胞培养板中，轻轻转动六孔板，使其分布均匀；

5)37℃，5％CO₂细胞培养箱培养8h，吸去6孔板上清，加入37℃水浴锅预热含有新鲜10％胎牛血清和双抗(青霉素-链霉素)的DMEM培养液；

6)37℃，5％CO₂细胞培养箱继续培养40h，收集细胞培养上清，3000rpm离心5min，收集病毒上清，分装，保存于-80℃冰箱中。

实施例2VSVG假病毒的制备

1)HEK-293T细胞培养：将处于对数生长期的293T细胞以40000个/孔密度接种于6孔细胞培养板，毎孔2mL，37℃，5％CO₂细胞培养箱过夜；

2)次日，待细胞密度达到孔底面积85％左右，可用于转染试验。转染前30min将培养液更换为37℃水浴锅预热的含有10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素的DMEM培养液；

3)分别向2支无菌1.5mLEP管中加入100μL不含胎牛血清和双抗(青霉素-链霉素)的 DMEM培养基；一支加入8μL PolyJet^TM(美国SignaGen)，得到A溶液；另一支加入3ugpNL4-3.luc.RE质粒(获得于美国国立卫生研究院艾滋病研究与参考试剂计划)和1ugVSV-G质粒(获得于美国国立卫生研究院艾滋病研究与参考试剂计划)，得到B溶液；将 A溶液加入B溶液中，混匀，室温孵育15min，得到转染复合物；重复6次转染复合物制备过程；

4)将步骤3)得到的转染复合物分别加入6孔细胞培养板中，轻轻转动六孔板，使其分布均匀；

5)37℃，5％CO₂细胞培养箱培养8h，吸去6孔板上清，加入37℃水浴锅预热含有10％胎牛血清和双抗(青霉素-链霉素)的DMEM培养液；

6)37℃，5％CO₂细胞培养箱继续培养40h，收集细胞培养上清，3000rpm离心5min，收集病毒上清，分装，保存于-80℃冰箱中。

实施例3假病毒感染能力测定

1)将ACE2-293T细胞以20000个/孔接种于96孔细胞培养板中，毎孔100μL，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h至细胞长成单层；

2)将实施例1、2收集的病毒原液分别用含10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素的DMEM 培养基2倍倍比稀释(分别稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍)，加入到96孔细胞培养板中，每个稀释度3个复孔，终体积为200μL；同时，设置细胞对照孔(Mock，不加假病毒，仅加含10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素的DMEM培养基，终体积为200μL)；

3)在37℃，5％CO₂细胞培养箱继续培养48h后，弃去上清，用200μL/孔PBS缓冲溶液洗涤一遍；

4)按照Luciferase荧光素酶报告检测试剂盒(Biovision)说明书操作，检测病毒的感染能力：每孔加入50μL的细胞裂解液，至于振荡器上振荡15min；分别吸取30μL96孔细胞培养板中的细胞裂解液，加入到96孔平底荧光素酶检测板中，然后加入50μL的荧光素酶底物，迅速用酶标仪检测化学发光值的大小，以细胞对照孔(Mock)化学发光值的2.5倍作为cutoff 值，化学发光值大于cutoff均视为阳性；结果如图1所示：病毒原液稀释最大倍数(32倍) 的荧光素酶读数大于cutoff值，表明SARS-CoV-2假病毒及VSVG假病毒具有很强的感染能力。

实施例4盐酸舍曲林对SARS-CoV-2毒株假病毒进入的抑制作用

1)以20000个/孔将ACE2-293T细胞和10000/孔VeroE6细胞分别接种于96孔细胞培养板中，毎孔100μL，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h至细胞长成单层；

2)将50μL 2倍倍比稀释的盐酸舍曲林(浓度分别为10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.15625μM、0.078125μM、0.0390625μM，用DMEM培养液(不含胎牛血清和双抗)稀释)与50μL实施例1得到的SARS-CoV-2假病毒经2倍稀释得到病毒液在室温下孵育30min；

3)将步骤2)得到的假病毒与盐酸舍曲林的混合物分别加入到步骤1)中含有长成单层细胞的96孔平底培养板中；同时，设置阴性对照组和阳性对照组(其中阴性对照组添加100uL2 倍倍比稀释的盐酸舍曲林，阳性对照组添加100uL实施例1得到的SARS-CoV-2假病毒经2 倍稀释得到病毒液；在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养48h，弃上清，用PBS缓冲液洗涤一次；

4)按照Luciferase荧光素酶报告检测试剂盒(Biovision)说明书操作，检测病毒的感染能力：每孔加入50μL的细胞裂解液，至于振荡器上振荡15min；分别吸取30μL96孔细胞培养板中的细胞裂解液，加入到96孔平底荧光素酶检测板中，然后加入50μL的荧光素酶底物，迅速用酶标仪检测化学发光值的大小；

5)根据化学发光值的大小，判断盐酸舍曲林抑制病毒进入的活性。

化合物抑制率(％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100

E代表实验组的化学发光值，N代表阴性对照组的化学发光值，P代表阳性对照组的化学发光值。化合物的半数抑制浓度(IC50)作为化合物的抗SARS-CoV-2假病毒活性的指标。

结果如图2、3所示：随着盐酸舍曲林浓度的增加，对SARS-CoV-2毒株假病毒进入细胞的抑制作用越强；当浓度为10μM时，对SARS-CoV-2毒株假病毒进入VeroE6细胞的抑制率接近100％，对SARS-CoV-2毒株假病毒进入ACE2-293T胞的抑制率接近90％；因此，盐酸舍曲林具有抑制SARS-CoV-2PsV进入的效果。

实施例5盐酸舍曲林对VSVG假病毒进入的抑制作用

1)以20000个/孔将ACE2-293T细胞和10000/孔VeroE6细胞分别接种于96孔细胞培养板中，毎孔100μL，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h至细胞长成单层；

2)将50μL 2倍倍比稀释的盐酸舍曲林(浓度分别为10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.15625μM、0.078125μM、0.0390625μM，用DMEM培养液(不含胎牛血清和双抗)稀释)与50μL实施例2得到的VSVG假病毒经10倍稀释得到病毒液在室温下孵育30min；

3)将步骤2)得到的假病毒与盐酸舍曲林的混合物分别加入到步骤1)中含有长成单层细胞的96孔平底培养板中；同时，设置阴性对照组和阳性对照组(其中阴性对照组添加100uL2 倍倍比稀释的盐酸舍曲林，阳性对照组添加100uL实施例2得到的VSVG假病毒经10倍稀释得到病毒液；在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养48h，弃上清，用PBS缓冲液洗涤一次；

4)按照Luciferase荧光素酶报告检测试剂盒(Biovision)说明书操作，检测病毒的感染能力：每孔加入50μL的细胞裂解液，至于振荡器上振荡15min；分别吸取30μL96孔细胞培养板中的细胞裂解液，加入到96孔平底荧光素酶检测板中，然后加入50μL的荧光素酶底物，迅速用酶标仪检测化学发光值的大小；

5)根据化学发光值的大小，判断盐酸舍曲林抑制病毒进入的活性。

化合物抑制率(％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100

E代表实验组的化学发光值，N代表阴性对照组的化学发光值，P代表阳性对照组的化学发光值。结果如图3所示：盐酸舍曲林对VSVG假病毒没有抑制作用。

实施例6细胞毒性研究

采用MTT法进行细胞毒性实验，具体方法如下：将ACE2-293T细胞和VeroE6细胞分别接种于96孔细胞培养板中，毎孔100μL，细胞数为20000个/孔，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h至细胞长成单层；用DMEM培养液(不含胎牛血清和双抗)将盐酸舍曲林稀释成9个不同浓度(分别为10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.15625μM、 0.078125μM、0.0390625μM)，每孔分别加入100μL不同浓度盐酸舍曲林稀，每孔总体积200μL，同时设正常细胞对照组(加入100μL DMEM培养液(不含胎牛血清和双抗))，置于37℃、 5％CO₂温箱中继续培养48h，吸掉96孔细胞培养板中的上清，然后加入稀释后的0.1mg/mL 的MTT 150μL/孔，继续培养4h，酶标仪于570nm处测定吸光度值，得到细胞存活率，结果如图4所示：ACE2-293T细胞和VeroE6细胞在0.0390625μM～10μM的盐酸舍曲林中细胞存活率都在90％以上；并进一步计算半数细胞死亡浓度CC50；同时，计算选择性指数，结果如表1所示：盐酸舍曲林对抑制SARS-CoV-2PsV进入VeroE6细胞的选择性指数高于50，对抑制SARS-CoV-2PsV进入ACE2-293T细胞的选择性指数高于19。

表1盐酸舍曲林对细胞活力的影响及抗病毒活性

实施例7体外抗SARS-COV-2活病毒实验

1)以10000个/孔将Vero E6细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，在37℃，5％ CO₂细胞培养箱中培养24h至细胞长成单层；

2)将50μL 2倍倍比稀释的盐酸舍曲林(浓度分别为10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.15625μM、0.078125μM、0.0390625μM，用DMEM培养液稀释(不含胎牛血清和双抗))与50μLSARS-CoV-2活病毒(MOI＝0.05)加入Vero E6细胞96孔细胞板中，同时设置阴性对照组和阳性对照组(其中阴性对照组添加100μL2倍倍比稀释的盐酸舍曲林，阳性对照组添加100μL SARS-CoV-2活病毒(MOI＝0.05))，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养48h；

3)48h后，每孔收集100μL上清液，根据提取试剂盒(MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit，TaKaRa)的说明书提取病毒RNA；

4)用30μLRNase-free water洗脱总RNA，以及使用微量紫外分光光度计测量mRNA的浓度和纯度；

5)选用带有gDNA eraser的逆转录试剂盒(PrimeScript RT Reagent Kit，TaKaRa)将提取到的总mRNA逆转录为cDNA，具体操作如下：

a)用gDNA eraser消化3μL总RNA以去除被污染的DNA；

b)以50μL反应体系合成第一链cDNA；反应体系如下：5×PrimeScript RT MasterMix 10.0μL、总mRNA 2500ng、RNase free ddH₂O补充至50.0μL；

c)按上述配制方法配制好体系后，瞬离使体系混合后；放于PCR仪中反应进行逆转录获取cDNA，程序设置如下：37℃15min；85℃5s；4℃60min；

6)取步骤5)逆转录产物cDNA每管2μL在带有TB Green^TMPremix Ex Taq II的StepOnePlus^TMReal-time PCR system上进行qRT-PCR反应，每个反应设3个复孔，反应体系如下：cDNA模板50ng；上游引物(10μM)0.4μL；下游引物(10μM)0.4μL；TB Green^TM Premix ExTaq II10.0μL；dd H₂O补充至20μL；其中，上游引物S_RBD F为：

5’-CAATGGTTTAACAGGCACAGG-3’(SEQ ID NO.2)；下游引物S_RBD R为：

5’-CTCAAGTGTCTGTGGATCACG-3’(SEQ ID NO.3)；

7)按步骤6)配置好反应体系后，用涡旋仪稍稍混匀，然后瞬离使得体系集中；使用罗氏LC480 PCR仪进行实验，根据仪器说明，设置参数如下：预变性95℃30s，1个循环；54℃15s，72℃30s，40个循环；

8)GraphPadPrism6软件绘制了病毒进入抑制率(抑制率％＝[1-(实验组的RNA拷贝数- 阴性对照组的RNA拷贝数)/(阳性对照组的RNA拷贝数-阴性对照组的RNA拷贝数)]×100) 与药物浓度的剂量-反应曲线，得出半数有效浓度(EC50)(相当于实施例4中IC50)；并计算 SI，结果如图5所示：盐酸舍曲林对抑制SARS-COV-2活病毒进入VeroE6细胞的选择性指数高于20。

实施例8时间点加入实验

1)以20000个/孔将ACE2-293T细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h至细胞长成单层；

2)用DMEM培养液(不含胎牛血清和双抗)将盐酸舍曲林稀释到终浓度为2.5uM备用，分别于加入50μL实施例1得到的SARS-CoV-2假病毒经2倍稀释得到病毒液的前30min和之后的0、0.5、1、2、4、6、8h加50μL稀释好的盐酸舍曲林溶液至步骤1)中的96孔细胞培养板中，同时，设置阴性对照组和阳性对照组(其中阴性对照组添加100uL浓度为2.5uM 的盐酸舍曲林，阳性对照组添加100uL实施例1得到的SARS-CoV-2假病毒经2倍稀释得到病毒液；置于37℃、5％CO₂温箱中培养48h，弃去上清，用PBS缓冲溶液洗涤一次；

3)按照Luciferase荧光素酶报告检测试剂盒(Biovision)说明书操作，检测病毒的感染能力：每孔加入50μL的细胞裂解液，至于振荡器上振荡15min；分别吸取30μL96孔细胞培养板中的细胞裂解液，加入到96孔平底荧光素酶检测板中，然后加入50μL的荧光素酶底物，迅速用酶标仪检测化学发光值的大小；

4)根据化学发光值的大小，判断药物抑制病毒进入的活性。

化合物抑制率(％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100

E代表实验组的化学发光值，N代表阴性对照组的化学发光值，P代表阳性对照组的化学发光值。

结果如图6所示：盐酸舍曲林对抑制SARS-CoV-2假病毒进入细胞的效果与盐酸舍曲林的加入时间相关；当在接触SARS-CoV-2假病毒前加入盐酸舍曲林，其抑制率最高；盐酸舍曲林可以在早期抑制SARS-CoV-2的进入。

实施例9两种结合试验

1)以20000个/孔将ACE2-293T细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h至细胞长成单层；

2)用DMEM培养液(不含胎牛血清和双抗)将盐酸舍曲林分别稀释到终浓度为10uM和5uM，分别加入步骤1)中细胞长成单层的96孔细胞培养板中，每孔100μL，37℃、5％CO₂细胞培养箱中放置1h，DMEM培养液(不含胎牛血清和双抗)洗三遍，然后每孔分别加入 150μLDMEM培养液(含有10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素)和50μL实施例1得到的 SARS-CoV-2假病毒经2倍稀释得到病毒液；同时设置正常的进入抑制试验(用DMEM培养液(不含胎牛血清和双抗)将盐酸舍曲林分别稀释到终浓度为10uM和5uM，分别加入步骤 1)中细胞长成单层的96孔细胞培养板中，每孔100μL，37℃、5％CO₂细胞培养箱中放置 1h，然后每孔分别加入150μLDMEM培养液(含有10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素)和50μL 实施例1得到的SARS-CoV-2假病毒经2倍稀释得到病毒液；置于37℃、5％CO₂温箱中培养48h，弃去上清，用PBS缓冲溶液洗涤一次；

3)按照Luciferase荧光素酶报告检测试剂盒(Biovision)说明书操作，检测病毒的感染能力：每孔加入50μL的细胞裂解液，至于振荡器上振荡15min；分别吸取30μL96孔细胞培养板中的细胞裂解液，加入到96孔平底荧光素酶检测板中，然后加入50μL的荧光素酶底物，迅速用酶标仪检测化学发光值的大小；

4)根据化学发光值的大小，判断药物抑制病毒进入的活性。

化合物抑制率(％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100

E代表实验组的化学发光值，N代表阴性对照组的化学发光值，P代表阳性对照组的化学发光值。

结果如图7所示：当ACE2-293T细胞不被洗涤时，盐酸舍曲林能较强的抑制SARS-CoV-2 的进入；但当ACE2-293T细胞被洗涤后，其抑制能力明显下降，几乎为0；可见，盐酸舍曲林对病毒进入的抑制主要靶向于SARS-CoV-2，阻断病毒颗粒与受体之间的相互作用，从而抑制SARS-CoV-2的进入。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> 盐酸舍曲林及其衍生物在制备抗新型冠状病毒药物中的应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3882

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggggtctc tgcaaccgct ggccaccttg tacctgctgg ggatgctggt cgcttccgtg 60

ctagcccagt gcgtgaacct gaccacaagg acccagctgc cccctgccta taccaattcc 120

ttcacacggg gcgtgtacta tcccgacaag gtgtttagaa gctccgtgct gcactctaca 180

caggatctgt ttctgccttt ctttagcaac gtgacctggt tccacgccat ccacgtgagc 240

ggcaccaatg gcacaaagcg gttcgacaat ccagtgctgc cctttaacga tggcgtgtac 300

ttcgcctcta ccgagaagag caacatcatc agaggctgga tctttggcac cacactggac 360

tccaagacac agtctctgct gatcgtgaac aatgccacca acgtcgtgat caaggtgtgc 420

gagttccagt tttgtaatga tcctttcctg ggcgtgtact atcacaagaa caataagagc 480

tggatggagt ccgagtttcg cgtgtattct agcgccaaca attgcacatt tgagtacgtg 540

tcccagccat tcctgatgga cctggagggc aagcagggca atttcaagaa cctgagggag 600

ttcgtgttta agaatatcga tggctacttc aagatctact ctaagcacac cccaatcaac 660

ctggtgcgcg acctgccaca gggcttcagc gccctggagc cactggtgga tctgcccatc 720

ggcatcaaca tcacccggtt tcagacactg ctggccctgc acagaagcta cctgacacct 780

ggcgactcct ctagcggatg gaccgcagga gctgccgcct actatgtggg ctatctgcag 840

ccaaggacct tcctgctgaa gtacaacgag aatggcacca tcacagacgc agtggattgc 900

gcactggacc ccctgagcga gaccaagtgt acactgaagt cctttaccgt ggagaagggc 960

atctatcaga catccaattt cagggtgcag cccaccgagt ctatcgtgcg ctttcccaat 1020

atcacaaacc tgtgcccttt tggcgaggtg ttcaacgcaa ccaggttcgc aagcgtgtac 1080

gcatggaata ggaagcggat cagcaactgc gtggccgact atagcgtgct gtacaactcc 1140

gcctctttca gcacctttaa gtgctatggc gtgtccccca caaagctgaa tgacctgtgc 1200

tttaccaacg tgtacgccga ttctttcgtg atcaggggcg acgaggtgcg ccagatcgca 1260

ccaggacaga caggcaagat cgcagactac aattataagc tgcctgacga tttcaccggc 1320

tgcgtgatcg cctggaacag caacaatctg gattccaaag tgggcggcaa ctacaattat 1380

ctgtaccggc tgtttagaaa gtctaatctg aagccattcg agagggacat ctctacagag 1440

atctaccagg caggcagcac cccatgcaat ggagtggagg gctttaactg ttatttccct 1500

ctgcagagct acggcttcca gccaacaaac ggcgtgggct atcagcccta ccgcgtggtg 1560

gtgctgagct ttgagctgct gcacgcacct gcaacagtgt gcggaccaaa gaagtccacc 1620

aatctggtga agaacaagtg cgtgaacttc aacttcaacg gactgaccgg cacaggcgtg 1680

ctgaccgagt ccaacaagaa gttcctgccc tttcagcagt tcggcaggga catcgcagat 1740

accacagacg ccgtgcgcga ccctcagacc ctggagatcc tggacatcac accatgctct 1800

ttcggcggcg tgagcgtgat cacacctggc accaatacaa gcaaccaggt ggccgtgctg 1860

tatcaggacg tgaattgtac cgaggtgccc gtggcaatcc acgcagatca gctgacccct 1920

acatggcggg tgtacagcac cggctccaac gtgttccaga caagagccgg atgcctgatc 1980

ggagcagagc acgtgaacaa ttcctatgag tgcgacatcc ctatcggcgc cggcatctgt 2040

gcctcttacc agacccagac aaactctcca aggagagccc ggagcgtggc atcccagtct 2100

atcatcgcct atacaatgag cctgggcgcc gagaacagcg tggcctactc taacaatagc 2160

atcgccatcc ctaccaactt cacaatctcc gtgaccacag agatcctgcc agtgtccatg 2220

accaagacat ctgtggactg cacaatgtat atctgtggcg attctaccga gtgcagcaac 2280

ctgctgctgc agtacggcag cttttgtacc cagctgaata gagccctgac aggcatcgcc 2340

gtggagcagg acaagaacac acaggaggtg ttcgcccagg tgaagcagat ctacaagacc 2400

ccacccatca aggactttgg cggcttcaat ttttcccaga tcctgcccga tccttccaag 2460

ccttctaagc ggagctttat cgaggacctg ctgttcaaca aggtgaccct ggccgatgcc 2520

ggcttcatca agcagtatgg cgattgcctg ggcgacatcg ccgccagaga cctgatctgt 2580

gcccagaagg ctaatggcct gaccgtgctg cctccactgc tgacagatga gatgatcgca 2640

cagtacacaa gcgccctgct ggcaggcacc atcacatccg gatggacctt cggcgcagga 2700

gccgccctgc agatcccctt cgctatgcag atggcctatc ggttcaacgg catcggcgtg 2760

acccagaatg tgctgtacga gaaccagaag ctgatcgcca atcagtttaa ctccgccatc 2820

ggcaagatcc aggacagcct gtcctctaca gcctccgccc tgggcaagct gcaggatgtg 2880

gtgaatcaga acgcccaggc cctgaatacc ctggtgaagc agctgagctc caacttcggc 2940

gccatctcta gcgtgctgaa tgacatcctg agccggctgg acaaggtgga ggcagaggtg 3000

cagatcgacc ggctgatcac aggcagactg cagtctctgc agacctacgt gacacagcag 3060

ctgatcaggg cagcagagat cagggcaagc gccaatctgg cagcaaccaa gatgtccgag 3120

tgcgtgctgg gccagtctaa gagagtggac ttttgtggca agggctatca cctgatgtcc 3180

ttcccacagt ctgcccctca cggagtggtg tttctgcacg tgacctacgt gccagcccag 3240

gagaagaact tcaccacagc accagcaatc tgccacgatg gcaaggcaca ctttcccagg 3300

gagggcgtgt tcgtgagcaa cggcacccac tggtttgtga cacagcgcaa tttctacgag 3360

cctcagatca tcaccacaga caatacattc gtgtccggca actgtgacgt ggtcatcggc 3420

atcgtgaaca ataccgtgta tgatcctctg cagccagagc tggacagctt taaggaggag 3480

ctggataagt acttcaagaa tcacacctcc ccagacgtgg atctgggcga catcagcggc 3540

atcaatgcct ccgtggtgaa catccagaag gagatcgaca ggctgaacga ggtggccaag 3600

aatctgaacg agagcctgat cgatctgcag gagctgggca agtatgagca gtacatcaag 3660

tggccctggt atatctggct gggcttcatc gccggcctga tcgctatcgt gatggtgacc 3720

atcatgctgt gctgtatgac atcctgctgt tcttgcctga agggctgctg tagctgtggc 3780

tcctgctgta agtttgatga ggacgattcc gagccagtgc tgaagggcgt gaagctgcac 3840

tacaccggcg gcaccgagac atctcaggtg gcccccgcct aa 3882

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caatggttta acaggcacag g 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctcaagtgtc tgtggatcac g 21

Claims (10)

1.盐酸舍曲林及其衍生物在制备预防和/或治疗冠状病毒药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述冠状病毒为β冠状病毒。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述衍生物包括盐酸舍曲林在药学上可以接受的盐、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的应用，其特征在于：所述盐酸舍曲林的浓度为0.03～10μM。

5.盐酸舍曲林及其衍生物在制备抑制冠状病毒进入细胞的制剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

所述冠状病毒为β冠状病毒；

所述盐酸舍曲林的浓度优选为0.03～10μM。

7.一种预防和/或治疗冠状病毒药物，其特征在于：包括盐酸舍曲林和/或其衍生物。

8.根据权利要求7所述的预防和/或治疗冠状病毒药物，其特征在于：

所述预防和/或治疗冠状病毒药物还包括药学上可接受的辅料；

所述预防和/或治疗冠状病毒药物优选制成固体制剂、注射剂、喷剂、液体制剂、吸入制剂或复方制剂。

9.根据权利要求7或8所述的预防和/或治疗冠状病毒药物，其特征在于：

所述冠状病毒为β冠状病毒。

10.一种抑制冠状病毒进入细胞的制剂，其特征在于：包括盐酸舍曲林和/或其衍生物；

所述冠状病毒优选为β冠状病毒。

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