CN107245095A

CN107245095A - 用于抑制十种冠状病毒的多肽抑制剂

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Publication number: CN107245095A
Application number: CN201710453263.1A
Authority: CN
Inventors: 郭德银; 陈宇; 王石雷
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2017-06-15
Filing date: 2017-06-15
Publication date: 2017-10-13
Anticipated expiration: 2037-06-15
Also published as: CN107245095B

Abstract

本发明公开了一种用于抑制十种冠状病毒的多肽抑制剂。属于生物医药技术领域。该多肽抑制剂包括：1）SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或，2）SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经替换、添加和/或缺失一个或几个氨基得到的具有同等功能的由SEQ ID No.1所示序列衍生的序列；或3）SEQ ID No.1所示序列的核心序列，该核心序列为SEQ ID No.2。该多肽抑制剂具有极高的广谱性，能同时抑制十种不同的冠状病毒，因而能在第一时间迅速及时地应对在将来的某个不确定的时间点再次爆发由某种未知的新型冠状病毒引起的传染性呼吸道疾病，克服了目前单一性治疗药物副作用大，容易导致后遗症的缺点。

Description

用于抑制十种冠状病毒的多肽抑制剂

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。特别是涉及一种可用于抑制MERS-CoV等十种冠状病毒的加帽修饰功能及其复制、转录、翻译的多肽抑制剂。

背景技术

冠状病毒(Coronavirus)是一类感染人、家禽、家畜，进而引起呼吸道、消化道炎症、腹泻的致病RNA病毒。本发明涉及的十种冠状病毒分别是传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus简称IBV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmis siblegastroenteritis virus简称TGEV)、猫冠状病毒(feline coronavirus简称 FCoV)、小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus简称MHV)、人冠状病毒229E (Human coronavirus 229E简称HCoV-229E)、人冠状病毒OC43(Human coronavirus OC43简称HCoV-OC43)、SARS冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndromes coronavirus简称SARS-CoV)、人冠状病毒NL63(Human coronavirus NL63简称HCoV-NL63)、人冠状病毒HKU1(Human coronavirus HKU1简称 HCoV-HKU1)、MERS冠状病毒(East Respiratory Syndromes coronavirus简称 MERS-CoV)。其中IBV是人类发现的第一个冠状病毒，主要感染家禽诸如鸡鸭鹅等，致使家禽患呼吸道疾病、肠炎、肾炎等，会导致鸡产蛋的数量和质量大幅下降，从而给养殖户带来巨大的经济损失(Yao et al.,2016)。TGEV是一种在猪群中呈高度传染性，以呕吐、严重腹泻、脱水为主要特征，在两周龄的幼崽中致死率高达90％—100％，在1977年，法国仅由于应付TGEV的暴发就耗用了1000万美元的防治费用，在我国的很多省市也时有发生，给猪养殖户带来了不可估量的损失！FCoV是一种猫肠道冠状病毒，会引起猫肠炎，传染性腹膜炎，致死率极高 (Drechsler et al.,2011)，而且随着人民生活水平的提高，宠物猫越来越受欢迎，因此该病将会越来越受到人们的重视！IBV、TGEV、FCoV目前还没有特效廉价的治疗药物，而MHV虽然目前只是小鼠的一种肝炎病毒，但作为RNA病毒，具有极高的变异性，不排除将来的某一天会由小鼠感染到人的可能，因此预防此病，防患于未然！同时作为一种模式病毒，具有极高的研究价值！而由SARS冠状病毒 (SARS-CoV)感染引起的严重急性呼吸综合症(SevereAcute Respiratory Syndromes，简称SARS)和由MERS冠状病毒(MERS-CoV)感染引起的中东呼吸道综合症(East Respiratory Syndromes,简称MERS)尤为严重(Al-Hazmi,2016)，它们均能引起人的严重呼吸道传染病，以发热、干咳、胸闷为主要症状，严重者出现快速进展的呼吸系统衰竭，传染性极强、病情进展快速(Ziebuhr,2003)。2003 年，SARS冠状病毒世界范围爆发时，致死率达到10％，尤其在成年人中更是高达50％，造成了严重的社会恐慌和经济损失。十年后的2012年，在沙特阿拉伯发现了首例MERS冠状病毒，随后波及27个国家和地区，2015年5月20日，韩国确认MERS病例，截止2016年8月，WHO报道全球共有1791例MERS病例，其中640 例死亡，致死率高达36％(Al-Hazmi,2016)。目前针对MERS-CoV和SARS-CoV仍无有效的疫苗和特异性治疗方法，且冠状病毒的广泛存在和高重组率易发生新发野生型病毒，因而是全世界面临的主要健康威胁之一。而人的另外四种冠状病毒 HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1的相关研究甚少，所以一种广谱性的治疗药物迫在眉睫！

目前针对MERS和SARS冠状病毒的治疗方法，主要分为三类：1.免疫调节因子，如干扰素，利巴韦林等；2.阻止病毒入侵细胞分子，如S蛋白的单克隆抗体，针对S蛋白关键融合区域的多肽等；3.抑制病毒复制分子，如病毒聚合酶特异性抑制剂，广谱性蛋白酶抑制剂等。这些方法中，免疫调节因子和广谱性蛋白酶抑制剂均是非特异性治疗方法，副作用较大，治愈的病人容易留下后遗症，且治疗效果存在较大的个体差异性(Al-Hazmi,2016；Groneberg et al.,2005；Tong, 2009；Zumla et al.,2016)。

病毒RNA 5’末端的帽子结构具有稳定病毒RNA，指导RNA定位，起始病毒蛋白翻译，逃逸免疫识别等重要功能，是病毒复制转录所必须的(Banerjee,1980； Daffis et al.,2010；Furuichi and Shatkin,2000；Lewis and Izaurralde,1997； Muthukrishnan etal.,1975；Schwer et al.,1998；Shatkin,1976；Shimotohno et al., 1977；Zust et al.,2011)。因此，如何有效抑制病毒加帽系统，成为开发抗病毒药物的一个新领域(Dong etal.,2008；Shuman,2001；Shuman,2002)，目前已经有一些广谱的抑制病毒加帽系统的药物，如AdoHcy、Sinfungin、ATA等(Bouvet et al., 2010)。但是这些非特异性的抑制药物容易对宿主本身的加帽系统造成影响，有较大的副作用，因此未能进入实际使用阶段。

MERS和SARS冠状病毒的基础研究目前取得了一定的进展，对复制和转录的机制有了一定的了解，并且对各蛋白的结构和功能也有一些深入的研究，其中对冠状病毒RNA基因组5’末端帽子结构的合成研究取得了突破性的进展。最近研究发现，冠状病毒非结构蛋白nsp16在与病毒另一个非结构蛋白nsp10相互作用之后，具有2’-O-甲基转移酶(2’-O-MTase)活性，参与冠状病毒RNA5’末端 Cap-1型帽子合成(Bouvet et al.,2010；Lugari etal.,2010；Pan et al.,2008)。而冠状病毒单独的非结构蛋白nsp16几乎检测不到活性，只有猫冠状病毒(FCoV)非结构蛋白nsp16能检测到极低的2’-O-MTase活性(Decroly et al.,2008)。冠状病毒非结构蛋白nsp10作为nsp16的刺激因子，本身不具有2’-O-MTase功能，但nsp10 能够结合核酸并且参与RNA的复制和转录，发挥重要的调节功能(Donaldson etal.,2007a；Donaldson et al.,2007b；Matthes et al.,2006)，且SARS-CoV nsp10结构已经得到解析(Joseph et al.,2006；Su et al.,2006)。由于绝大多数冠状病毒的两个非结构蛋白nsp16与nsp10相互作用之后，才具有2’-O-MTase活性，因此是一个很好的广谱性的潜在药物靶点。

发明内容

为了克服现有技术存在的问题，本发明提供了一种高效、特异、广谱性的可用于MERS-CoV等十种冠状病毒防治的病毒加帽系统多肽抑制剂。

本发明的第一方面，提供一种多肽的用途，用于制备阻止冠状病毒的nsp10 与nsp16结合的组合物，其氨基酸序列为：1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或，2)SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列经替换、添加和/或缺失一个或几个氨基得到的具有同等功能的由SEQ ID No.1所示序列衍生的序列；或3)SEQ ID No.1 所示序列的核心序列，该核心序列至少包括N CVKMLTPKTG TGIAISVKPE。优选所述核心序列为N CVKMLTPKTG TGIAISVKPE。

进一步地，所述的冠状病毒分别是传染性支气管炎病毒(infectious bronchitisvirus简称IBV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus简称TGEV)、猫冠状病毒(feline coronavirus简称FCoV)、小鼠肝炎病毒(mouse hepatitisvirus简称MHV)、人冠状病毒229E(Human coronavirus 229E简称 HCoV-229E)、人冠状病毒OC43(Human coronavirus OC43简称HCoV-OC43)、 SARS冠状病毒(Severe AcuteRespiratory Syndromes coronavirus简称 SARS-CoV)、人冠状病毒NL63(Humancoronavirus NL63简称HCoV-NL63)、人冠状病毒HKU1(Human coronavirus HKU1简称HCoV-HKU1)、MERS冠状病毒(East Respiratory Syndromes coronavirus简称MERS-CoV)。

为了实现上述目的，本发明以SARS冠状病毒非结构蛋白nsp10和nsp16复合物晶体结构(图1)为设计基础，结合我们先前的研究(Ke et al.,2012；Wang et al.,2015)，用合成多肽竞争结合十种冠状病毒非结构蛋白nsp16，阻止nsp10与 nsp16的结合，从而抑制十种冠状病毒nsp16甲基转移酶(2’-O-MTase)的活性，阻止十种冠状病毒RNA被加工成Cap-1型帽子。结果表明，在所设计的系列多肽中，SEQ ID No.1所示的序列(TCP21)及其核心序列SEQ ID No.2(P21)具有阻止nsp10与nsp16结合的作用，并呈现抑制十种冠状病毒nsp16甲基转移酶 (2’-O-MTase)活性的作用，最终抑制冠状病毒的复制。

本发明的第二方面，提供一种用于抑制冠状病毒的药物组合物，其包含上述多肽与一种以上药学上可接受的赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、或稳定剂。

上述多肽可以通过人工直接合成，或者通过基因工程的手段体外表达获得。

本发明的第三方面，提供编码上述多肽核心序列的基因，其核苷酸序列如 SEQ IDNo.3所示。

进一步地，含有所述基因的表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞。

进一步地，上述基因、表达载体或者宿主细胞，通过基因工程的手段体外表达获得的多肽均可以直接或间接制备抗冠状病毒药物。因此，本发明还包括它们在制备抗冠状病毒药物中的应用。

本发明还提供一种抑制冠状病毒加帽修饰或复制转录的方法，包括使用所述的多肽抑制nsp10与nsp16的结合。

本发明提供多肽抑制剂，通过多肽可以抑制10种冠状病毒的两个非结构蛋白之间的相互作用来抑制冠状病毒加帽系统的活性，最终抑制冠状病毒的复制，而对宿主本身不产生影响和副作用，使得该多肽抑制剂具有很高的特异性和应用前景。

附图说明

图1显示nsp10和nsp16复合物共结晶的晶体结构。

(A)nsp16-nsp10复合体晶体结构。其中nsp10为绿色(箭头所示区域)，nsp16为淡蓝色(箭头所示以外区域)，两者均以飘带模式显示。(B)nsp10以飘带模式显示，nsp16以表面电荷模式显示。(C)nsp10和nsp16均以表面电荷模式显示。1—表面正电荷区，2—表面负电荷区。

图2显示的是纯化的十种冠状病毒nsp10/16的Western Blot图。

(A)十种冠状病毒nsp10；(B)十种冠状病毒nsp16；为了后续检测多肽对 nsp10/16活性的抑制效果。

图3显示多肽的设计原理。

(A)nsp10/16具有2’-O甲基转移酶活性，所以如果多肽抑制剂能抑制nsp10 和nsp16之间的相互作用，那么冠状病毒RNA的第一个碱基的2’-O位置的甲基化就会被抑制，进而导致冠状病毒的RNA的复制翻译等均会受到抑制。根据文献报道，MERS-CoV nsp10与nsp16相互作用的区域在40——107之间，所以我们在这个区间设计了八条多肽，分别命名为P57(40-96)、P41(40-80)、P36 (45-80)、P29(68-96)、P21(40-60)、P16(65-80)、P8(93-100)、P4(93-96)。图3显示的是纯化的十种冠状病毒nsp10/16的Western Blot图。

(A)十种冠状病毒nsp10。(B)十种冠状病毒nsp16。为了后续检测多肽对 nsp10/16活性的抑制效果。

图4显示合成的多肽抑制剂的筛选过程。

(A)检测合成的八条多肽对MERS冠状病毒nsp10/16活性的抑制效果，结果表明P57、P41、P29、P21、P16这五条多肽有较好的抑制效果。(B)检测筛选的五条多肽对MHVnsp10/16活性的抑制效果，结果表明P29、P21这两条多肽有较好的抑制效果。(C)检测这两条多肽对SARS冠状病毒nsp10/16活性的抑制效果，结果表明只有P21这一条多肽有较好的抑制效果。

图5显示合成的多肽抑制剂TCP21对抑制MERS冠状病毒非结构蛋白nsp16与底物SAM的结合有剂量依赖效应。

IC50＝30.4μM，终浓度大于100μM的TCP21能够完全抑制MERS nsp16甲基转移酶活性。

图6显示合成的多肽抑制剂TCP21对十种冠状病毒nsp16甲基转移酶(即加帽酶系统)的抑制效果。

除了FCoV的nsp16具有较低的活性外，其他九种冠状病毒单独的nsp10 和nsp16并没有2’-O甲基转移酶活性，只有nsp10和16共同作用下才具有2’-O 甲基转移酶活性，加了终浓度为200μM的TCP21后，抑制效果均超过了50％，其中对FCoV、SARS-CoV和MERS-CoVnsp10/16的抑制接近100％。

图7显示多肽抑制剂TCP21的细胞毒性实验。

多肽浓度依次设置了100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、1000μM 这6个梯度与对照(0μM)相比，L2、Calu-3、BHK-21、Neuro 2A和Vero E6zaiza 这5种细胞毒性的百分数在低于500μM时毒性均不超过20％。表明TCP21这条多肽并没有呈现出明显的细胞毒性。

图8显示多肽抑制剂TCP21抑制冠状病毒MHV和SARS-like CoV在细胞中的

复制。

多肽TCP21的浓度梯度依次为10μM、50μM、100μM、150μM、200μM，在200μM时多肽对两种病毒的抑制效率均接近100％，其中MHV的IC50＝

19.1μM，SARS-like CoV的IC50＝16.9μM。

图9显示多肽抑制剂TCP21抑制冠状病毒MHV的小鼠实验。

注射多肽TCP21这组小鼠(10只)全部存活下来，而只注射MHV的这组小鼠(10只)截止第7天全部死亡。表明TCP21对小鼠有很好的保护效果。

图10显示重组多肽抑制剂TCP21与合成的TCP21抑制效果比较

分别将重组表达的多肽抑制剂TCP21和合成的TCP21在MERS-CoV上进行实验，表明单独的nsp10和nsp16没有2’-O甲基转移酶活性，只有二者同时存在时才具有此活性，而加入重组表达的TCP21和化学合成的TCP21后具有相同的抑制效果，均达到了80％左右。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。【实施例1】多肽抑制剂的设计及验证

1、以SARS冠状病毒非结构蛋白nsp10和nsp16复合物晶体结构为参考进行分析以及多肽抑制的原理

图1所示为nsp10和nsp16复合物共结晶的晶体结构图。图1A中，绿色的为nsp10，淡蓝色的为nsp16，可以看出，两者通过蛋白表面相互作用，形成一个复合体。根据我们的之前的研究表明，nsp10促进了nsp16与底物(病毒RNA) 的结合以及与底物SAM的结合，从而激活的nsp16的2’-O-MTase甲基转移酶活性。图1B显示的是nsp16的表面电荷分布图，其中蓝色区域为带正电荷表面(例如箭头1所示区域)，红色区域为带负电荷表面(例如箭头2所示区域)。由于病毒RNA带负电荷，因此可以结合到nsp16表面带正电荷的RNA结合沟中(图 1B的箭头1所示区域)。nsp10与nsp16结合之后，扩展了病毒RNA结合沟的面积(图1C的箭头1所示区域)，使病毒RNA与nsp16-nsp10复合体的结合更加紧密，导致nsp16活性的增强。

根据以上所述原理，如果清楚nsp10和nsp16结合面的具体信息，即可设计特异的多肽竞争结合到nsp16的表面，从而阻止nsp10的结合，达到抑制nsp16 的2’-O-MTase甲基转移酶活性的目的。

将十种冠状病毒nsp10/16基因序列克隆在pET-30a载体上，在大肠杆菌BL21 中诱导表达，纯化的十种冠状病毒nsp10/16的Western Blot图见图2A、B。

2、多肽抑制的设计原理与合成

图3A表示冠状病毒RNA的Cap-0型和Cap-1型帽子的形成过程。在“0”型帽子形成之后，RNA第一个碱基的2’-O位置被冠状病毒的nsp10/16甲基化形成“1”型帽子结构。所以多肽的作用原理就是抑制nsp10和16间的相互作用，从而抑制“1”型帽子结构的形成，进而抑制RNA的复制转录和翻译，同时能被宿主的免疫系统识别并降解。图3B表示的是十种冠状病毒nsp10的一级氨基酸序列比对，红色框内表示MERS nsp10和16相互作用的区域位于nsp10的40-107这个区间。图3C表示MERS nsp10空间结构的预测，兼顾图A的甲基化原理和图 B的保守型氨基酸，尽可能的包含至少一个完整的螺旋和/或折叠，进而设计了八条多肽，这八条多肽的设计信息如下：

表2八条多肽的设计信息

八条多肽均通过人工合成方式获得。通过实验发现，多肽溶解度较高，所以在合成的过程中不需要引入N端氨基化，C端乙酰化修饰。通过各种系统测试证明，多肽P21具有较好的广谱性抑制效果，其他对照组多肽则没有广谱性抑制效果(实施例2～3)，符合设计原理及要求。

【实施例2】P21的筛选过程。

试剂配制：

10×反应缓冲液：500mM Tris-HCl(pH 7.5),50mM KCl,10mM MgCl₂,10 mM DTT,400units RNase inhibitor,0.01mM SAM

同位素³H底物：S-adenosyl[methyl-3H]methionine(67.3Ci/mmol,0.5μCi/μl)

病毒RNA底物：m7GpppA-RNA(来源于MERS冠状病毒RNA)

RNA纯化填料：活化好的DEAE-Sephadex^TM A-25

实施步骤：

1.在25μl的反应体系中[50mM Tris-HCl(pH 7.5),1mM MgCl₂,5mM KCl, 1mMDTT,40units RNase inhibitor,0.01mM SAM]加入纯化好的MERS冠状病毒非结构蛋白nsp16(3.3μM)和nsp10(10μM)。

2.在反应中分别加入终浓度为200μM的多肽P57、P41、P29、P21、P16、 P8、P4，以及其他对照组分别混合均匀。

3.在每个反应体系中加入0.5μCi S-adenosyl[methyl-3H]methionine(67.3 Ci/mmol,0.5μCi/μl)，分别混合均匀。

4.在每个反应体系中加入2μg m7GpppA-RNA(MERS冠状病毒RNA)底物。

5.37度孵育1.5个小时。

6.用RNA纯化填料(活化好的DEAE-Sephadex^TM A-25)制作纯化柱，纯化反应后的病毒RNA。

7.用液体闪烁计数器，检测³H同位素的含量，计数出抑制效果。

8.挑选出对MERS-CoV nsp10/16抑制效果超过50％的多肽，按照上述试验方法分别检测对MHV和SARS-CoV nsp10/16的抑制效果。

实施结果：如图4中显示，A图显示多肽抑制剂P57、P41、P29、P21、P16 对MERS-CoVnsp10/16抑制效果超过了50％,B图显示P29和P21对MHV nsp10/16抑制效果超过50％，C图显示只有P21对SARS-CoV nsp10/16有较好的抑制效果，且抑制效果达到了80％，说明在多肽抑制剂P21具有潜在的广谱性。【实施例3】P21的N端连接引导肽Tat(YGRKKRRQRRR)之后的多肽抑制剂 TCP21体外浓度依赖实验。

试剂配制：

10×反应缓冲液：500mM Tris-HCl(pH 7.5),50mM KCl,10mM MgCl₂,10 mM DTT,400units RNase inhibitor,0.1mM SAM

同位素³H底物：S-adenosyl[methyl-3H]methionine(67.3Ci/mmol,0.5μCi/μl)

病毒RNA底物：m7GpppA-RNA(来源于MERS冠状病毒RNA)

RNA纯化填料：活化好的DEAE-Sephadex^TM A-25

TCP21：采用固相合成的方法合成，纯度达到98％。

实施步骤：

1.在25μl的反应体系中[50mM Tris-HCl(pH 7.5),1mM MgCl₂,5mM KCl, 1mMDTT,40units RNase inhibitor,0.01mM SAM]加入纯化好的MERS冠状病毒非结构蛋白nsp16(1.6μM)和nsp10(9.6μM)。

2.在反应中分别加入0-200μM的多肽抑制剂TCP21，TCP21的氨基酸序列如SEQ NO:1所示。

4.在每个反应体系中加入2μg m7GpppA-RNA(MERS冠状病毒RNA)底物。

5.37度孵育1.5个小时。

实施结果：如图5所示，随着TCP21浓度的升高，MERS-CoV nsp10/nsp16 逐渐降低，当浓度超过100μM时，活性完全被抑制。据此计算出来的IC₅₀＝30.4 μM。

【实施例4】TCP21抑制MERS等十种冠状病毒非结构蛋白nsp16的甲基转移酶活性(病毒RNA加帽系统活性)

试剂配制：

同位素³H底物：S-adenosyl[methyl-3H]methionine(67.3Ci/mmol,0.5μCi/μl)

病毒RNA底物：m7GpppA-RNA(来源于MERS冠状病毒RNA)

RNA纯化填料：活化好的DEAE-Sephadex^TM A-25

实施步骤：

1.在25μl的反应体系中[50mM Tris-HCl(pH 7.5),1mM MgCl₂,5mM KCl, 1mMDTT,40units RNase inhibitor,0.01mM SAM]加入纯化好的MERS等十种冠状病毒非结构蛋白nsp16(1.6μM)和nsp10(9.6μM)。

2.在反应中分别加入100和200μM的多肽抑制剂TCP21，以及其他对照组分别混合均匀，TCP21的氨基酸序列如SEQ NO:1所示。

4.在每个反应体系中加入2μg m7GpppA-RNA(MERS冠状病毒RNA)底物。

5.37度孵育1.5个小时。

实施结果：如图6中显示，单独的nsp10和nsp16均没有甲基转移酶活性 (FCoV除外)，200μM的多肽抑制剂TCP21(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)能有效抑制十种冠状病毒非结构蛋白nsp16的甲基转移酶活性(病毒RNA 加帽系统活性)，说明多肽抑制剂TCP21具有很好的广谱性。

【实施例5】多肽抑制剂TCP21的细胞毒性

实施步骤：

在37℃的细胞培养箱中用96孔板培养L2细胞(孔)。

2.当细胞浓度达到60％左右时，分别加入终浓度为100μM、150μM、200μM、300μM、400μM、500μM、1000μM的多肽抑制剂TCP21，继续培养24h。

3.24h后，移除旧培养基，换成100μL新鲜的含10％FBS的DMEM，然后加入10μLCCK8，一个小时后测OD值，对照和实验组均设三个复孔，实验重复三次。

实施结果：如图7所示，当多肽浓度达到100μM时，与对照相比，细胞毒性百分比均在0附近，没有显著性的差异。表明TCP21这条多肽并没有呈现出明显的细胞毒性。

【实施例6】多肽抑制剂TCP21抑制冠状病毒MHV在L2细胞中的复制

小鼠肝炎病毒(MHV)与MERS等其他九种冠状病毒同属于冠状病毒科成员，其加帽系统具有相同的属性。因此多肽抑制剂也可以用于其他冠状病毒的防治。以MHV为例，在多肽抑制剂前引入先导肽Tat修饰，合成新的多肽抑制剂 TCP21，以便提高多肽抑制剂进入细胞内的效率。

实施步骤：

按正常细胞培养方法培养L2细胞至80％—90％饱和水平。

用MHV病毒感染L2细胞2小时。

去掉病毒感染液，用PBS洗三遍，加入正常细胞培养液，并在细胞培养液中加入终浓度为10μM、50μM、100μM、150μM、200μM的多肽抑制剂TCP21。

实施结果：通过对比观察，加入多肽抑制剂TCP21的细胞，在MHV病毒感染下，连续观察24个小时，未出现细胞病变效应(CPE)，说明细胞得到很好的保护。在16h后收样，通过蚀斑实验测病毒滴度，进而得到TCP21对MHV 复制的抑制效果，如图8所示。结果表明多肽在16h时抑制效果达到最大，与对照组相比病毒滴度可降低将近2个数量级，抑制效果接近100％且IC₅₀＝19.1 μM。

同理，我们在Calu-3细胞中检测了多肽抑制剂TCP21抑制冠状病毒 SARS-like-CoV的复制，且IC₅₀＝16.9μM。

【实施例7】多肽抑制剂TCP21抑制冠状病毒MHV的小鼠实验

实施步骤：

首先购买C57BL/6雄性小鼠，实验分Mock(PBS)、MHV+TCP21和 MHV+PBS三组，通过肝脏注射，MHV的用量是1*10⁶PFU,TCP21的用量是0.01 mg/g，然后连续观察14天，统计小鼠的存活率。

实验结果：Mock(PBS)和MHV+TCP21组处理的小鼠存活率100％，而 MHV+PBS组即只注射病毒不注射多肽组在第7天全部死亡，表明多肽TCP21 对感染MHV的小鼠具有很好的保护效果。

【实施例8】多肽抑制剂TCP21的体外表达

实施步骤：

分别将多肽抑制剂TCP21编码基因克隆到蛋白表达载体pET30(a)、 pGEX-6P-1和PBE2上，进而在大肠杆菌和枯草芽孢肝菌中成功表达。P21基因序列如SEQ ID No.3，通过聚合酶链式反应从MERS冠状病毒非结构蛋白nsp10 的基因序列中扩展而来。重组的多肽P21的N端带有引导肽Tat，C端带有6×His 标签(或GST标签)，通过大肠杆菌和枯草芽孢杆菌蛋白表达系统，进而表达纯化得到重组多肽抑制剂TCP21。

实施结果：如图10所示，重组TCP21和合成的TCP21具有同样的抑制效果。

参考文献：

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SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> 用于抑制十种冠状病毒的多肽抑制剂

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Asn Cys Val Lys Met

1 5 10 15

Leu Thr Pro Lys Thr Gly Thr Gly Ile Ala Ile Ser Val Lys Pro Glu

20 25 30

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Asn Cys Val Lys Met Leu Thr Pro Lys Thr Gly Thr Gly Ile Ala Ile

1 5 10 15

Ser Val Lys Pro Glu

20

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> MERS冠状病毒

<400> 3

aattgcgtca agatgctgac gccgaaaacc ggcacgggta ttgccatcag cgtgaagccg 60

gaa 63

<210> 4

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Asn Cys Val Lys Met Leu Thr Pro Lys Thr Gly Thr Gly Ile Ala Ile

1 5 10 15

Ser Val Lys Pro Glu Ser Thr Ala Asp Gln Glu Thr Tyr Gly Gly Ala

20 25 30

Ser Val Cys Leu Tyr Cys Arg Ala His Ile Glu His Pro Asp Val Ser

35 40 45

Gly Val Cys Lys Tyr Lys Gly Lys Phe

50 55

<210> 5

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Asn Cys Val Lys Met Leu Thr Pro Lys Thr Gly Thr Gly Ile Ala Ile

1 5 10 15

Ser Val Lys Pro Glu Ser Thr Ala Asp Gln Glu Thr Tyr Gly Gly Ala

20 25 30

Ser Val Cys Leu Tyr Cys Arg Ala His

35 40

<210> 6

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Leu Thr Pro Lys Thr Gly Thr Gly Ile Ala Ile Ser Val Lys Pro Glu

1 5 10 15

Ser Thr Ala Asp Gln Glu Thr Tyr Gly Gly Ala Ser Val Cys Leu Tyr

20 25 30

Cys Arg Ala His

35

<210> 7

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 7

Tyr Gly Gly Ala Ser Val Cys Leu Tyr Cys Arg Ala His Ile Glu His

1 5 10 15

Pro Asp Val Ser Gly Val Cys Lys Tyr Lys Gly Lys Phe

20 25

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 8

Gln Glu Thr Tyr Gly Gly Ala Ser Val Cys Leu Tyr Cys Arg Ala His

1 5 10 15

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 9

Lys Gly Lys Phe Val Gln Ile Pro

1 5

<210> 10

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 10

Lys Gly Lys Phe

1

Claims

1.一种多肽的用途，其特征在于，用于制备阻止冠状病毒的nsp10与nsp16结合的组合物，其氨基酸序列为：1）SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或，2）SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经替换、添加和/或缺失一个或几个氨基得到的具有同等功能的由SEQ ID No.1所示序列衍生的序列；或3）SEQ ID No.1所示序列的核心序列，该核心序列为SEQ ID No.2。

2.根据权利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，所述的冠状病毒分别是传染性支气管炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猫冠状病毒、小鼠肝炎病毒、人冠状病毒229E、人冠状病毒OC43、SARS冠状病毒、人冠状病毒NL63、人冠状病毒HKU1、MERS冠状病毒。

3.一种用于抑制冠状病毒的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的多肽与一种以上药学上可接受的赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、或稳定剂。

4.一种编码权利要求1所述多肽核心序列SEQ ID No.2的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

5.含有权利要求4所述基因的表达载体。

6.含有权利要求5所述载体的宿主细胞。

7.权利要求4所述基因、权利要求5所述表达载体或权利要求6所述宿主细胞，通过基因工程的手段体外表达获得的多肽在制备抗冠状病毒药物中的应用。

8.一种抑制冠状病毒加帽修饰或复制转录的方法，其特征在于，包含使用权利要求1或7所述的多肽抑制nsp10与nsp16的结合。