CN112552379B - 合成肽在制备防治新型冠状病毒感染药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有抑制新型冠状病毒感染活性的合成肽及其在制备预防或治疗新型冠状病毒感染药物中的用途，本发明的合成肽具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。通过实验证实，该合成肽能够抑制新型冠状病毒对靶细胞的感染，并且可以有效阻断病毒蛋白和基因组RNA在靶细胞中的表达与复制，从而证实了本发明的合成肽具备有效阻断SARS‑CoV‑2对宿主细胞的感染能力。此外，通过细胞毒性实验，本发明各浓度的合成肽对细胞正常的生理功能不会产生任何影响，安全性高。因此，本发明为新冠肺炎的预防和治疗提供了新的思路，具备潜在的良好的临床应用价值。

Description

合成肽在制备防治新型冠状病毒感染药物中的用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种具有抑制新型冠状病毒感染活性的合成肽、其在制备抗新冠肺炎药物中的潜在医学应用以及以该合成肽为基础活性成分的药物。
背景技术
近年来，生物活性肽研究已成为全球医药研制的热点之一。它不仅具有来源广泛、安全性好、靶向专一和生物活性强等优点，而且具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤、抗血栓、抗氧化、降低胆固醇等多种生理功能，成为当前国际药品与保健品行业竞相追逐的研究对象，应用发展前景十分看好。随着生物技术与多肽合成技术的日臻成熟，越来越多的多肽药物被开发并应用于临床。
由于多数生物活性肽都是分离自各种动物、植物和微生物，其本身就属于动物生理活性调节因子，不易产生耐药，甚至有替代某些抗生素的趋势，且不会对环境造成污染，这也是研究者们发掘其药用、食用及保健作用的关键所在。此外，肽类物质的结构类型呈现多样化，具有强大的药物活性筛选潜力，可利用半合成、全合成等方法进行人工合成，并能保持其真实结构和活性功能。
当前，病毒性疾病已成为威胁人类健康和生命安全的重大威胁之一。虽然临床上已研发有多种抗病毒药物，但是大部分病毒感染仍然缺乏有效的治疗办法，无法治愈。近些年的相关研究表明，最早在先天免疫系统中发现的多肽还可通过抑制病毒入侵、病毒蛋白合成以及提高宿主免疫功能等方面来发挥抗病毒效应，从而为抗病毒药物的研发提供了新的来源，尤其是在针对病毒入侵环节的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)抑制肽成功应用于临床治疗之后，多肽药物更是成为抗病毒研究的焦点(Gómara MJ,Haro I.Updating the useof synthetic peptides as inhibitors of HIV-1entry.Current MedicinalChemistry,2014,21(10):1188-1200)。
研究者们通过不同的方法，尝试建立多种寻找病毒抑制肽的方法，包括从病毒自身编码的结构蛋白氨基酸序列或从噬菌体展示文库中筛选(Castel G, Chtéoui M,HeydB,Tordo N.Phage display of combinatorial peptide libraries：application toantiviral research.Molecules,2011,16(5): 3499-3518；Skalickova S,Heger Z,Krejcova L,Pekarik V,Bastl K,Janda J,Kostolansky F,Vareckova E,Zitka O,AdamV,Kizek R.Perspective of Use of Antiviral Peptides against InfluenzaVirus.Viruses,2015,7(10): 5428-5442.)。比如，针对I类包膜病毒(如HIV-1、中东呼吸综合征冠状病毒 (MERS-CoV)和流感病毒等)入侵靶细胞的过程中形成六股螺旋结构这一特点，设计研制的肽类抗病毒药物可特异性地抑制该类病毒的感染，像源自HIV跨膜蛋白gp41七肽重复结构的C34或T20多肽可强烈抑制HIV感染；通过对噬菌体展示文库或随机肽库的反复筛选，也已获得了针对流感病毒、单纯疱疹病毒、汉坦病毒、肠道病毒71型、辛诺柏病毒等多种病毒的抑制肽。
新型冠状病毒又称严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratorysyndrome coronavirus，SARS-CoV-2)属于冠状病毒科、β冠状病毒属，是引起新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19) (以下简称新冠肺炎)的病原体。SARS-CoV-2主要通过空气飞沫和接触传播，感染者以发热或干咳为主，多数患者呈轻症状态，但老年患者或有其他严重基础疾病的患者可发展成重症肺炎。
由于SARS-CoV-2传染性强，人群普遍易感，被列为全球性大流行病。据估计，目前全球已有212个国家和地区先后暴发了COVID-19疫情。截至2020年 11月12日，COVID-19已造成全球5197多万人感染，死亡128万多例，给全球的社会经济造成了不可估量的重大损失，也是全球最为关切的突发公共卫生事件。因此，尽快开发新型的SARS-CoV-2抗病毒药物及其前体，对于COVID-19 大流行的应对具有重要的实际意义。
目前，临床上针对SARS-CoV-2感染主要采用对症疗法，依然没有特异性治疗药物和预防疫苗。SARS-CoV-2表面的刺突S蛋白可被多种宿主蛋白酶(如细胞表面跨膜丝氨酸蛋白酶TMPRSS、胰蛋白酶等)剪切形成S1、S2两个亚基，其中S1负责与宿主细胞ACE2受体结合，而S2则介导病毒膜融合。以已经通过冷冻电镜解析出三维结构的S蛋白为靶标，设计合成一些可以靶向S蛋白受体结合区域或者膜融合区域的多肽分子，从而阻止S蛋白与靶细胞受体血管紧张素转化酶2(ACE2)的结合或S蛋白介导的病毒膜融合。有报道指出，利用该策略，已经筛选出一些具有抗病毒活性的多肽分子。SARS-CoV-2 S蛋白属于I类融合蛋白。位于S2亚基中的两个七肽重复序列(HR1和HR2)通过互作形成六聚体螺旋束(6-HB)这种四级结构，从而将两个远距离的疏水序列簇，即HR1之前的内部融合肽和HR2之后的高度保守且富含色氨酸的膜近端外部区域，拉到彼此附近，形成异六聚体式的融合核心，使得S2三聚体在融合后呈玫瑰花样结构，从而进行构象重排。与此同时，6-HB的形成使S2亚基构象转换，暴露出膜融合的另一关键介质——融合肽，它的暴露与膜插入是启动融合的必要条件。已有研究报道称，以HR1和HR2之间形成的6-HB为靶标，设计抑制该六聚体形成的多肽及其衍生物，通过盐键和氢键与HR1或者HR2互作,可以阻止6-HB的形成，从而高效抑制冠状病毒(包括SARS-CoV、SARS-CoV-2和MERS-CoV)感染宿主细胞，提示该类多肽化合物有望发展成为新型的冠状病毒感染预防或治疗药物。由此可见，作为病毒入侵的主要决定因素，靶向S蛋白本身或其与靶细胞的相互作用(如受体结合、膜融合)，可作为COVID-19药物研发策略的主要方向。因此，对于我国SARS-CoV-2患者的预防和治疗，仍需要进一步深入研究，以便开发出新型且可行的治疗药物方案。
发明内容
本发明是为解决上述问题而进行的，从前期自行设计的随机肽库中筛选出一种能抑制SARS-CoV-2感染的生物活性肽。本发明的另一目的在于，提供该生物活性肽在制备预防或治疗新型冠状病毒感染药物中的用途，以及其作为抗新型冠状病毒感染药物活性组分的用途。
本发明的主要技术方案是：以非洲绿猴肾细胞系(Vero-E6)作为SARS-CoV-2 感染的靶细胞，以基于SARS-CoV-2表面刺突蛋白S的假型病毒和分离培养的真病毒两套系统为感染模型，以期筛选出能抑制SARS-CoV-2感染能力的生物活性肽。经研究发现本发明提供的合成肽在SARS-CoV-2感染Vero-E6细胞中发挥着重要的抑制作用，它能下调病毒蛋白的表达，阻断病毒基因组RNA的复制，从而显著降低SARS-CoV-2的感染活性。
本发明提供的一种活性物质，其特征在于：选自如下(a)-(d)中的任一一项：
(a)为具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的合成肽；SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具体为：RHSAIDEAFASHVYFLEACL；
(b)为(a)中上述合成肽的盐；
(c)为(a)中上述合成肽或(b)中上述合成肽的盐的功能性衍生物；
(d)为(a)中上述合成肽或(b)中上述合成肽的盐的类似物；
上述类似物通过一种或多种氨基酸的取代、增加或缺失得到。
进一步地，本发明还提供了上述活性物质的用途，其特征在于：用于制备预防或治疗新型冠状病毒感染的药物。
进一步地，本发明还提供了上述活性物质的用途，其特征在于：用于制备阻断病毒蛋白和基因组RNA在靶细胞中的表达与复制的药物。
进一步地，本发明还提供了上述活性物质的用途，其特征在于：用于制备抑制或下调新型冠状病毒基因组RNA复制量的药物。
进一步地，本发明还提供了上述活性物质的用途，其特征在于：用于制备阻断病毒蛋白在靶细胞中表达的药物。
进一步地，本发明还提供了上述活性物质的用途，其特征在于：上述药物，还包括药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
进一步地，本发明还提供了上述活性物质的用途，其特征在于：上述药物的剂型为经胃肠道给药剂型，以及经胃肠道以外给药途径剂型。
进一步地，本发明还提供了上述活性物质的用途，其特征在于：上述药物的给药剂型选自注射给药剂型、呼吸道给药剂型、滴鼻剂、皮肤给药剂型、黏膜给药剂型、腔道给药剂型、自散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂。
进一步地，本发明还提供了上述活性物质的用途，其特征在于：上述合成肽在药物中的用量为10-8-100％。
本发明的作用和效果：
在本发明中，该合成肽为包含20个氨基酸的肽段，主要靶向作用于位于 SARS-CoV-2病毒颗粒表面的刺突蛋白与宿主细胞的互作环节。通过多组实验证实，该合成肽能够抑制SARS-CoV-2对靶细胞的感染，并且可以有效阻断病毒蛋白和基因组RNA在靶细胞中的表达与复制，从而证实了本发明的合成肽具备有效阻断SARS-CoV-2对宿主细胞的感染能力。此外，通过细胞毒性实验，本发明各浓度的合成肽对细胞正常的生理功能不会产生任何影响，安全性高。也就是说，该抗SARS-CoV-2合成肽具有副作用小，活性高，合成、纯化工艺简单方便，生产成本不高的特点。
本发明还提供了一种抑制新型冠状病毒复制的方法，即通过将该病毒暴露于新型冠状病毒蛋白抑制量的合成肽、或其治疗上可接受的含上述肽的组合物中，或者通过给哺乳动物细胞使用病毒学上有效量的抗新冠肺炎的合成肽、或其治疗上可接受的含上述肽的组合物来实现。
由此，本发明为新冠肺炎的预防和治疗提供了新的思路，具备潜在的良好的临床应用价值。
附图说明
图1为荧光显微镜检测不同浓度的合成肽ASP-1对SARS-CoV-2pp入侵靶细胞的影响；
其中，图A为不同浓度的合成肽处理后对SARS-CoV-2假病毒感染性抑制的普通光学显微镜和荧光显微镜检测图；
图B为不同浓度的合成肽处理细胞后对SARS-CoV-2假病毒感染的抑制率图；
CTRL：以不加合成肽的等量病毒感染的细胞组作为病毒感染阳性对照组；
DMSP：以DMSO处理Vero-E6细胞组作为阴性对照组；
与对照组相比，***，P<0.001。
图2为免疫荧光法检测不同浓度的合成肽ASP-1对SARS-CoV-2感染的影响；
其中，图A为不同浓度的合成肽处理后对SARS-CoV-2病毒感染性抑制的荧光检测图(所用一抗为新冠患者阳性血清)；
图B为不同浓度的合成肽处理细胞后对病毒感染的抑制率图；
CTRL：以不加合成肽的等量病毒感染的细胞组作为病毒感染阳性对照组；
DMSO：以DMSO处理的Vero-E6细胞组作为阴性对照组(DMSO)；
与对照组相比，*，P<0.05；**，P<0.01。
图3为培养细胞中加入不同浓度的合成肽ASP-1的细胞毒性检测结果；
CTRL：以DMSO处理的Vero-E6细胞组作为实验对照组。
图4为Western blot法检测加入50、25μM的合成肽ASP-1对SARS-CoV-2 感染能力的影响；
其中，图A为检测新型冠状病毒刺突蛋白(Spike)表达图；
图B为对A图结果进行灰度扫描获得的半定量结果图；
Mock：未加病毒感染的细胞作为实验空白对照组；
CTRL：以不加合成肽的等量病毒感染的细胞组作为病毒感染阳性对照组；
DMSO：以DMSO处理的Vero-E6细胞组作为阴性对照组；
与对照组相比，***，P<0.001。
图5为荧光定量PCR(real-time PCR)法检测加入25、50μM的合成肽 ASP-1对SARS-CoV-2复制能力的影响；结果显示为相对于实验对照组，各实验组中新型冠状病毒基因组RNA水平的相对变化检测图。
其中，CTRL：以不加合成肽的等量病毒感染的细胞组作为病毒感染阳性对照组；
DMSO：以DMSO处理的Vero-E6细胞组作为阴性对照组；
与对照组相比，***，P<0.001。
具体实施方式
以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如PCR方法，那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2ndedition， Cold spring Harbor Laboratory Press。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练技术操作人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明，具体实施方式文中上述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：合成肽抑制SARS-CoV-2感染的有效浓度筛选实验
1.1 Vero-E6细胞的病毒感染实验
正常的Vero-E6细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中培养，且细胞培养液中添加2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、100μg/mL的链霉素和100U/mL的青霉素。
对于SARS-CoV-2假型病毒(SARS-CoV-2pp)感染实验：感染前一天，将 Vero-E6细胞按3×104个/孔接种于96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2培养箱培养过夜。次日，先将培养上清吸出，用预温PBS润洗2次，然后以MOI＝0.1接种适量病毒，37℃感染6h，弃去病毒液，并用预温PBS润洗3次，换成新鲜培养基， 37℃继续培养48h，荧光显微镜下观察计数SARS-CoV-2感染阳性细胞。
对于SARS-CoV-2感染实验：感染前一天，将Vero-E6细胞按3×104个/孔接种于96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2培养箱培养过夜。次日，先将培养上清吸出，用预温PBS润洗2次，然后以MOI＝1接种适量的病毒(生物安全P3实验室中进行操作，下同)，37℃感染1h，弃去病毒液，并用预温PBS润洗3次，换成新鲜培养基，37℃继续培养24h，免疫荧光法检测SARS-CoV-2感染阳性细胞。
1.2合成肽对SARS-CoV-2感染的抑制实验
基本方法同上。分别将12.5，25，50，100μM浓度的合成肽ASP-1(氨基酸序列为SEQID NO:1)加入上述接种的病毒液中，感染细胞1h或6h后，弃去病毒液，换成新鲜培养液继续培养24h或48h，免疫荧光法检测或荧光显微镜下观察计数病毒感染情况。
1.3免疫荧光染色检测SARS-CoV-2抗原表达
Vero-E6细胞感染病毒后继续培养，然后采用免疫荧光法检测病毒抗原的表达，具体步骤如下：
1)细胞固定：将96孔板中的培养液移去，加入PBS清洗细胞2次，将整块孔板浸没于预冷甲醇中，于-20℃条件下固定20min，用预冷的PBS清洗细胞3次。
2)透膜：固定后的细胞每孔加入100μl 0.1％TritonX-100，室温孵育15min，用预冷PBS洗涤细胞3次。
3)封闭：每孔加入100μL 3％BSA，于室温下孵育1h。
4)一抗孵育：每孔加入灭活的新冠肺炎患者阳性血清(1:100，3％BSA稀释)100μL，室温孵育1h，用预冷的PBS洗涤细胞3次。
5)二抗孵育：每孔加入AF488荧光标记抗人IgG(1:1000，3％BSA稀释)100 μL，室温避光孵育1h，用预冷的PBS避光洗涤细胞2次。
6)标记细胞核：每孔加入细胞核荧光染料DAPI(1:5000，PBS稀释)，室温避光孵育15min，用预冷的PBS避光洗涤细胞3次。
7)荧光显微镜下检测、拍照并计算绿色AF488阳性细胞克隆数。
1.4实验结果
将上述浓度的合成肽加入SARS-CoV-2细胞感染系统中作为合成肽组，同时以不加合成肽的等量病毒感染的细胞组作为病毒感染阳性对照组(CTRL)，以 DMSO处理的细胞组作为阴性对照组(DMSO)。感染后24h或48h，通过细胞免疫荧光染色法或直接荧光显微镜检测各浓度合成肽对病毒感染的抑制情况。
结果如图1和图2所示，加入合成肽组与CTRL组相比，体系中加入12.5、25、50或100μM的合成肽后均能明显抑制SARS-CoV-2病毒的感染能力；随着加入合成肽浓度的增加，抑制效果越显著，抑制效率可达到约29％-82％(*，P<0.05； **，P<0.01；***，P<0.001)。
实施例2：合成肽的细胞毒性实验
采用CCK-8方法检测加入合成肽对Vero-E6细胞增殖的影响，具体步骤如下：
收集处于对数生长期的Vero-E6细胞，以每孔约3×104个的密度接种于96孔板。待细胞生长过夜后，加入实施例1中各浓度的合成肽，继续培养48小时，然后CCK-8法检测细胞增殖情况。具体检测方法为：弃去细胞中原有的培养基，每孔加入含10μL CCK-8的新鲜培养基110μL，置于37℃培养箱继续培养3h，然后用多功能酶标仪在450nm波长处检测各孔的吸光度值。实验独立重复3次，计算平均值和标准误。
实验结果如图2所示，各组不同浓度的合成肽加入细胞后，对细胞没有产生明显的细胞毒性(P＞0.05)，说明各浓度的合成肽对细胞正常的生理功能并未产生影响，可用于后续实验。
实施例3：合成肽抑制SARS-CoV-2蛋白表达的实验
3.1合成肽对SARS-CoV-2感染的抑制实验
感染前一天，将Vero-E6细胞按2×105个/孔接种于24孔细胞培养板，置于 37℃、5％CO2培养箱培养过夜。次日，先将培养上清吸出，用预温PBS润洗2次，以MOI＝1的病毒量接种SARS-CoV-2，其中加入100μM的上述合成肽ASP-1，感染细胞1h后，弃去病毒液，换成新鲜培养液继续培养48h，蛋白免疫印迹法检测病毒蛋白的表达情况。
3.2蛋白免疫印迹法检测SARS-CoV-2 Spike蛋白的表达
3.2.1细胞样品的制备
各对照组与合成肽处理组细胞弃去培养液后，用预温的PBS洗2～3次，每孔加100μL蛋白裂解液，反复吹打细胞促其裂解，转移至Ep管中，加入25μL 5×Loading buffer，于100℃煮10min左右，以12000rpm离心2min，弃沉淀，取上清(含细胞的总蛋白)进行SDS－PAGE电泳。
3.2.2蛋白免疫印迹法(Western blot)检测
(1)溶液配制
30％Acr/Bis：29.2％Acr，0.8％Bis，过滤后于4℃保存；
4×分离胶缓冲液：36.3g Tris，10％SDS 4mL，加H2O约180mL，用浓HCl 调整pH至8.8，定容至200mL；
4×浓缩胶缓冲液：6.55g Tris，10％SDS 4mL，加H2O约80mL，用浓HCl调整pH至6.8，定容至100mL；
电泳缓冲液：3.03g Tris，14.41g Gly，1g SDS，加H2O溶解，定容至1000mL；
Loading buffer：1M Tris-HCl(pH6.8)1.2mL，10％SDS 4mL，巯基乙醇 1mL，甘油2mL，溴酚蓝0.2mg，加H2O至20mL；
SDS－PAGE浓缩胶(上层胶)：2.4mL水，1.0mL 4浓缩胶缓冲液，0.6ml 30％ Acr/Bis，50μL 10％过硫酸铵溶液，10μL TEMED；
SDS－PAGE分离胶(12.5％下层胶)：4.2mL水，3.0mL 4分离胶缓冲液，4.8ml 30％Acr/Bis，100μL10％过硫酸铵溶液，10μL TEMED。
(2)SDS－PAGE蛋白电泳
1)聚丙烯酰胺凝胶的制备——按照产品说明书安装聚丙烯酰胺凝胶板，先加入7mL分离胶溶液，在胶面上加水覆盖，待胶凝固后倾去覆盖液，擦干后加入浓缩胶，插上合适尺寸梳子，待其凝固后进行电泳。
2)12.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳——将上述制备好的细胞样品和预染色的蛋白分子量Marker加入上样孔，80－100V/cm电压下电泳，直至溴酚蓝到达分离胶的底端，停止电泳，取出凝胶，切去浓缩胶。
(3)Western blot检测
将上述经12.5％SDS-PAGE进行总蛋白分离的下层凝胶，根据预染蛋白分子量Marker条带大小的指示，截取相应大小的目的条带，通过电转仪将蛋白转移到PVDF膜上。
用含5％脱脂牛奶的封闭液对膜上的非特异性结合位点进行封闭，然后与合适的一抗(抗-SARS-CoV-2 Spike的鼠源单抗和抗-GAPDH的兔源多抗，均为1:1000 稀释)4℃轻摇孵育过夜。用TBST缓冲液洗膜三遍后，与辣根过氧化物酶(HRP) 标记的二抗(羊抗鼠或抗兔IgG，均为1:1000稀释)室温作用孵育2小时后，用 TBST缓冲液洗膜三遍，再利用HRP-ECL发光法进行底物显色，并拍照分析。
3.3免疫荧光法检测SARS-CoV-2抗原的表达
方法基本同1.3。主要区别在于，所用一抗为新冠肺炎康复者的特异性血清；二抗为AF488荧光标记抗人IgG。
3.4实验结果
将100μM的合成肽加入SARS-CoV-2细胞感染系统中，同时以不加合成肽的等量病毒感染的细胞组作为病毒感染阳性对照组(CTRL)；以DMSO处理的细胞组作为阴性对照组(DMSO)。感染后48h通过Western blot法检测该合成肽对病毒蛋白表达的影响。
结果如图4所示，与对照(CTRL和DMSO)组相比，感染体系中加入100μM的合成肽ASP-1后，新型冠状病毒刺突蛋白spike的表达显著降低(见图4A)，灰度扫描获得的蛋白半定量结果图也进一步确证了上述结果(***，P<0.001，见图4B)。
实施例4：合成肽抑制SARS-CoV-2基因组复制能力的实验
4.1合成肽对SARS-CoV-2复制的抑制实验
方法基本同3.1。感染前一天，接种Vero-E6细胞于24孔培养板。次日，以 MOI＝1的病毒量接种SARS-CoV-2，其中加入100μM的合成肽ASP-1，感染1h后弃去病毒液，继续培养24h，荧光定量PCR法检测病毒基因组RNA复制情况。
4.2荧光定量PCR(real-time PCR)法检测SARS-CoV-2mRNA的复制
4.2.1抽提总RNA准备
购置无核酶的实验材料(如试管、tip头和Ep管)，或用已消毒的0.1％DEPC 水浸泡实验材料两小时以上，然后用无菌去离子水冲洗干净，尽量不残留DEPC，再对待用材料进行高压灭菌，室温保存备用。
4.2.2抽提细胞中总RNA
利用Invitrogen公司的总RNA抽提试剂盒，按常规的异硫氰酸胍法提取获得细胞中的总RNA。方法如下：
对于上述经不同处理的Vero-E6细胞，先吸弃旧的培养液，每孔加入1mL的 TRIzol溶解细胞，反复吹打几次，待细胞充分溶解后，用移液管将细胞裂解物转移至无核酶的Ep管。将细胞裂解样品在15～30℃条件下孵育5分钟，使核蛋白体完全分解。按每1mL TRIzol加入0.2mL氯仿，盖紧管盖，用力摇晃15sec充分混匀，室温静置5min进行分层。于2～8℃12000rpm离心15min。将上层无色的水样层转移至一个新的无核酶的Ep管中。按每1mLTRIzol加入0.5mL异丙醇沉淀RNA。颠倒混匀，室温静置10min，然后2～8℃12000rpm离心10min，弃上清，加入75％乙醇洗涤RNA沉淀，2～8℃7500rpm离心5min，弃上清，空气干燥5-10min RNA沉淀，加入50μL不含RNA酶的无菌超纯水溶解RNA样品。整个过程须勤换手套，谨防RNA酶污染。
4.2.3逆转录制备cDNA
利用TaKaRa逆转录试剂盒获取对照组与实验组细胞的cDNA，具体步骤如下：
在PCR管中加入如下反应体系，
Figure BDA0002865304040000121
轻柔混匀，置于37℃反应15分钟，然后置于85℃加热5秒灭活逆转录酶。
4.2.4荧光定量PCR法检测
设计引物，检测SARS-CoV-2基因组复制水平。GAPDH作为检测用内参。引物序列如下：
SARS-CoV-2-F：
AGCTTTCGGCAGACGTGGTC(SEQ ID NO:2)
SARS-CoV-2-R：
CTTCCATGCCAATGCGCGAC(SEQ ID NO:3)
GAPDH-F：
TGGGCTACACTGAGCACCAG(SEQ ID NO:4)
GAPDH-R：
AAGTGGTCGTTGAGGGCAAT(SEQ ID NO:5)
然后，利用TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行检测，反应体系如下：
Figure BDA0002865304040000131
利用Rotor Gene 3000A仪器进行两步法扩增，设置程序为95℃预变性2min，进行40个PCR循环，95℃5sec，60℃30sec。
实验数据分析：PCR产物量的变化采用比较Ct值法来进行相对定量。该法前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到Ct值来反应起始模板的量，一个循环(Ct＝1)的不同相当于起始模板数2倍的差异。
定义：ΔCt＝Ct目的基因-Ct内标
ΔΔCt＝(Ct目的基因-Ct内标)已处理-(Ct目的基因-Ct内标)未处理
RQ＝2-ΔΔCt
利用Excel或Prism里的统计分析工具，计算各组的平均值和标准差，两组之间用T检验，P<0.05认为有统计学意义，P<0.01认为差异显著。将合成肽处理组与DMSO对照组进行T检验分析比较。
4.3实验结果
将100μM的合成肽加入SARS-CoV-2细胞感染系统中，同时以不加合成肽的等量病毒感染的细胞组作为病毒感染阳性对照组(CTRL)；以DMSO处理的细胞组作为阴性对照组(DMSO)。感染后24h通过荧光定量PCR法检测该合成肽对病毒基因组RNA复制的影响。
结果如图5所示，与对照(CTRL和DMSO)组相比，感染体系中加入100μM的合成肽ASP-1后，新型冠状病毒基因组RNA复制水平显著降低(***，P<0.001)。
经上述实施例可以发现，本发明对的随机肽库进行病毒感染抑制实验筛选，结果发现本发明提供的合成肽能够抑制SARS-CoV-2对靶细胞的入侵与感染(参见说明书附图1和附图2)，并且可以有效阻断病毒蛋白和基因组RNA在靶细胞中的表达与复制(参见实施例3和4)，证实本发明的合成肽可以有效阻断 SARS-CoV-2对宿主细胞的感染能力。由此，本发明提供的合成肽具有能够阻断病毒蛋白和基因组RNA在靶细胞中的表达与复制的用途。
序列表
<120> 合成肽在制备防治新型冠状病毒感染药物中的用途
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg His Ser Ala Ile Asp Glu Ala Phe Ala Ser His Val Tyr Phe Leu
1               5                   10                  15
Glu Ala Cys Leu
            20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agctttcggc agacgtggtc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttccatgcc aatgcgcgac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgggctacac tgagcaccag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagtggtcgt tgagggcaat 20

Claims (8)

1.一种活性物质，其特征在于：为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的合成肽。
2.如权利要求1所述活性物质的用途，其特征在于：
用于制备预防或治疗新型冠状病毒感染的药物。
3.如权利要求1所述活性物质的用途，其特征在于：
用于制备阻断新型冠状病毒的Spike蛋白和基因组RNA在靶细胞中的表达与复制的药物。
4.如权利要求1所述活性物质的用途，其特征在于：
用于制备抑制或下调新型冠状病毒基因组RNA复制量的药物。
5.如权利要求1所述活性物质的用途，其特征在于：
用于制备阻断新型冠状病毒的Spike蛋白在靶细胞中表达的药物。
6.如权利要求2-5任一所述活性物质的用途，其特征在于：
所述药物还包括药学上可接受的赋形剂或稀释剂。
7.如权利要求2-5任一所述活性物质的用途，其特征在于：
所述药物的剂型为经胃肠道给药剂型，或经胃肠道以外给药途径剂型。
8.如权利要求2-5任一所述活性物质的用途，其特征在于：
所述药物的给药剂型选自注射给药剂型、皮肤给药剂型、黏膜给药剂型、腔道给药剂型、自散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂。
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