CN111349150A - 一种抑制新型冠状病毒的多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抑制新型冠状病毒的多肽，属于生物医药领域，多肽为2019‑nCov‑P1或2019‑nCov‑P2，分别具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。该多肽能够特异性结合COVID‑19的S蛋白HR2区，进而阻挡病毒与细胞的结合，有效的抑制和控制病毒的感染。本发明还提供上述多肽在制备预防和/或治疗COVID‑19药物中的应用。

Description

一种抑制新型冠状病毒的多肽及其用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种新型冠状病毒的侵入抑制类多肽，特别涉及该多肽及其衍生物在制备预防和/或治疗COVID-19药物中的应用。

背景技术

研究显示，COVID-19是一种新型的冠状病毒，与SARS病毒使用同一种细胞受体ACE-2，该病毒在环境中持续存在时间长。与SARS病毒相比，COVID-19传播更隐秘，传播途径多样且潜伏期更长。上述特点为该病毒的防治工作造成了巨大的困难。目前尚无针对该病毒预防性疫苗及有效治疗药物。因此，针对该病毒的有效预防方法及治疗措施亟待开发。

发明内容

为了解决新型冠状病毒预防及治疗的技术问题，本发明提供了一种抑制新型冠状病毒的多肽，该多肽能够特异性结合COVID-19的S蛋白HR2区，进而阻挡病毒与细胞的结合，有效的抑制和控制病毒的感染。

本发明还提供上述多肽在制备预防和/或治疗GOVID-19药物中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种抑制新型冠状病毒的多肽，所述多肽能够与COVID-19的S蛋白HR2区特异性结合。

本发明从COVID-19与膜融合这个角度来开发抑制病毒侵入的手段，能够在病毒侵入的最开始阶段，阻挡病毒与细胞的结合。目前，还未见对COVID-19有作用的多肽的报道。

具体的，一种抑制新型冠状病毒的多肽，命名为2019-nCov-P1，多肽2019-nCov-P1为(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

(a2)肽(a1)的修饰产物；

(a3)肽(a1)在药学上可接受的盐、酯和前药中的一种。

多肽2019-nCov-P1的氨基酸序列为：NGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASA。细胞学实验显示，NGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASA多肽能够在微摩尔水平显著抑制COVID-19与宿主细胞的结合，从而有效抑制病毒的侵入。

通过研究COVID-19的S蛋白的三维结构，我们进一步改造上述多肽分子，进行关键氨基酸替换实验，发现了一个全新的能够抑制流COVID-19侵入的多肽衍生物。通过结构模拟及分子对接，定量构效关系等，确定该多肽能够以特异性的结合S蛋白C端的HR2 区，从而封闭HR1与HR2的结合，阻止膜融合的发生。

该多肽命名为2019-nCov-P2，多肽2019-nCov-P2为(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

(b2)肽(a1)的修饰产物；

(b3)肽(a1)在药学上可接受的盐、酯和前药中的一种。

多肽2019-nCov-P2的氨基酸序列为：NGNGSTQNELNENQSLISNQFNSANGQIQDSISSTASA。

一种抑制新型冠状病毒的多肽的制备方法，所述多肽通过化学合成法合成。

一种抑制新型冠状病毒的多肽在制备预防和/或治疗冠状病毒感染药物中的应用，所述冠状病毒为COVID-19。

一种预防或治疗COVID-19的药物，所述药物的药效成分包含多肽2019-nCov-P1和/ 或2019-nCov-P2。所述药物还包含药学上可接受的载体和赋形剂，药物剂型为喷剂、口服制剂、注射制剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂和丸剂中的任意一种。

本发明涉及的多肽，都通过ELISA方法确认了与HR2的结合能力。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

1.一种抑制新型冠状病毒的多肽，具体为2019-nCov-P1或2019-nCov-P2，能够与COVID-19的S蛋白HR2区特异性结合，进而封闭HR1与HR2的结合，阻止膜融合的发生，从而在病毒侵入的最开始阶段，阻挡病毒与细胞的结合，有效的抑制和控制病毒的感染。

2.一种预防或治疗COVID-19的药物，包含多肽2019-nCov-P1和/或2019-nCov-P2，从COVID-19与膜融合这个角度，阻挡病毒与细胞的结合，从而有效抑制病毒侵入。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是2019-nCov-P1对新型冠状病毒的抑制效果评价：其中横坐标为2019-nCov-P1 的浓度值(Log值)，纵坐标为病毒抑制效率(随机多肽GFP为0)。

图2是2019-nCov-P2对新型冠状病毒的抑制效果评价：其中横坐标为2019-nCov-P2 的浓度值，纵坐标为病毒抑制效率。

图3是2019-nCov-P2及2019-nCov-P1多肽与新型冠状病毒HR2的结合的测试图。

图4是2019-nCov-P2及2019-nCov-P1多肽的细胞毒性检测结果。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

如前所述，针对该病毒的有效预防方法及治疗措施亟待开发。病毒感染宿主细胞的决定性因素之一是病毒与宿主细胞受体间的结合，这个步骤对于冠状病毒能否有效的侵入宿主细胞起到至关重要的作用。病毒受体指位于宿主细胞表面，负责结合病毒并介导病毒侵入的具有正常生理功能的蛋白质，糖及脂类分子。S蛋白作为新型冠状病毒表面的主要蛋白，负责与病毒宿主细胞受体间的结合，以及病毒与细胞间的膜融合。S囊膜蛋白与宿主细胞的ACE-2受体结合后，通过内吞的方式，侵入细胞，释放遗传物质并最终完成病毒的复制过程。在内吞体中，病毒的S蛋白在酸性条件下会产生变构，暴露出其中的蛋白酶酶切位点，存在于內吞体中的蛋白酶识别并切割该位点，进一步使S蛋白S2的一个疏水螺旋HR1及疏水融合肽暴漏，疏水螺旋HR1会进一步进行折叠，与存在于C端的HR2结合，拉近病毒包膜与细胞膜间的距离，使融合肽插入到细胞膜中，从而导致膜融合的发生。

下面将结合实施例、实验数据和附图对多肽2019-nCov-P2及2019-nCov-P1对COVID- 19的抑制效果进行详细说明。

实施例1

本实施例使用Hun-7细胞及293T细胞，进行多肽2019-nCov-P1对新型冠状病毒的抑制效果实验，具体包括以下步骤：

1、假病毒包装

1.1质粒提取

假病毒体系质粒构建，将全长2019-nCov的S蛋白构建到PSV的多克隆位点中，与骨架质粒pNL-LUR-E-同时转化DH5-a感受态细胞；42摄氏度，热激90秒后，涂布LB平板，氨苄青霉素浓度5微克每毫升；37度培养箱培养过夜。

挑单菌落，接种LB液体培养基，氨苄青霉素浓度5微克每毫升。37度摇床摇菌过夜。

12000离心10分钟，收集菌体，以天根质粒大提试剂盒提取质粒。Nanodrop测量DNA浓度。

1.2包装

观察293T细胞状态，胰酶消化对数生长期细胞至30厘米皿，细胞数为3×106个每皿。加入10％FBS DMEM细胞培养基培养。37度过夜培养。

转染前，以无血清DMEM洗细胞两至三次。加入20毫升DMEM。以30微克pNL-LUR-E-和30微克PSV-S介入到生理盐水中，加入500微升PEI水溶液。剧烈混匀，室温放置15 分钟。加入细胞上清中。37度培养箱培养。

48小时后，收集上清，以0.45微米滤膜过滤上清，去除细胞及碎片。以浓缩管浓缩上清液至适当体积。病毒分装冻存。

2.细胞培养

Hun-7细胞生长至对数生长期，显微镜观察细胞状态，吸去细胞上清；灭菌PBS洗细胞两次；胰蛋白酶使用浓度为百分之0.25-1％。显微镜观察细胞脱落情况；消化时间7分钟；显微镜观察细胞；1000转离心10分钟；弃掉上清，加入适量10％血清DMEM培养基重悬，细胞计数板计数；如果分96孔板，则每孔加入5000个细胞。如果分至10cm培养皿，则每皿加入10毫升培养基。加入10％血清DMEM培养基；37摄氏度，百分之五二氧化碳培养。

3.假病毒感染抑制实验

由于真病毒操作的法律法规，生物危险性的因素，在研究病毒侵入时，人们大都选择假病毒体系。假病毒体系是一种模拟真病毒侵入细胞的病毒体系，是成熟的用来研究和模拟病毒侵入过程的体系，已被广泛应用于筛选目标病毒的侵入抑制类小分子、多肽、抗体或蛋白质大分子等。本研究中，我们构建了COVID-19的假病毒体系，以此来评价所述多肽对COVID-19侵入的抑制效果。

具体如下：

3.110％FBS+DMEM培养Hun-7细胞，37度，百分之五二氧化碳。对数生长期时，胰酶消化细胞，细胞计数，按60％的比例将细胞接种于96孔板。

3.2培养细胞过夜后，显微观察细胞状态及汇合度，弃细胞上清，以DMEM洗细胞两次，每次200微升。

3.3将2019-nCov-P1按不同浓度与病毒液共孵育，注意：所加入的2019-nCov-P1原液以不同浓度配制，以保证加入的2019-nCov-P1溶液为等体积。

3.4按MOI＝10感染细胞，每孔加入10微升孵育后的病毒液，可设置对照组(与2019-nCov-P1缓冲体系孵育的病毒、未孵育的病毒)，设置阴性对照组。

3.5冰上感染1小时，弃上清，以冷DMEM洗两次，加入DMEM培养基100微升，至37 度培养。

3.6另一组细胞加入未孵育的病毒，冰上感染1小时后，弃上清，以冷DMEM洗两次，加入含不同浓度的2019-nCov-P1的DMEM培养基100微升，至37度培养。

3.7培养48小时后，弃上清，以冰PBS洗细胞两次，每次200微升。加入细胞裂解液。

3.8测量荧光素酶强度，测量结果转化为2019-nCov-P1对新型冠状病毒的抑制效率，结果如图1所示(上方为多肽与病毒共孵育组，下方为病毒未与多肽孵育组)。

实施例2

本实施例与实施例1的区别仅在于，将多肽2019-nCov-P1替换为多肽2019-nCov-P2。

2019-nCov-P2对新型冠状病毒的抑制效率如图2所示。

实施例3

Elisa检测多肽与HR2的结合

将HR2多肽包被至96孔板。方法如下，去聚苯乙烯Elisa板室温平衡。以包被液稀释HR2多肽，终浓度0.1微克每微升。包被液成分：无水碳酸钠0.1696克，碳酸氢钠 0.2856克，溶解到100毫升去离子水中，加入终浓度1％SDS。每孔加入100微升蛋白稀释液。4摄氏度包被过夜。弃掉包被液，PBST洗涤，每孔加300微升，静置10分钟，弃掉洗液，加满洗液，重复5次，排干洗涤液。洗涤液PBST：氯化钠8克，12水合磷酸氢二钠2.9克，氯化钾0.2克，磷酸二氢钾0.24克，吐-20 0.5毫升，定容至1升。封闭：以10％BSA封闭ELISA板。每孔加入300微升，4度过夜。洗涤液洗涤5次，方法同上。以包被液稀释不同浓度FITC标记2019-Cov-P1或2019-Cov-P2多肽，对照随机多肽GFP，阳性对照抗体100微升每孔加入到ELISA板中。37摄氏度孵育1小时。以PBST洗涤5次。加入PBST100微升。488纳米读取绿色荧光值，结果如图3所示。阴性对照为非特异性随机多肽。

多肽的化学合成及荧光标记

所述多肽，对照随机多肽GFP

2019-nCov-P1；2019-nCov-P2；

2019-nCov-S-HR2-aa1144- 1207：ELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYE

随机多肽GFP：MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS

2019-nCov-HR2： ELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIK

均化学合成法合成

上述多肽一部分进行C端FITC标记。

实施例4

CCK-8法检测2019-nCov-P2及2019-nCov-P1多肽的细胞毒性：

分对数生长期Hun-7细胞至96孔板，每孔5000个细胞。37度5％二氧化碳培养24小时，以DMEM洗细胞两次，每次100微升，加入不同浓度DMEM稀释的多肽100微升，放置培养箱培养48小时，加入10微升CCK-8溶液，培养1小时，测量450纳米吸收峰，630 纳米吸收为参比波长。细胞毒性检测结果如图4所示。

由图1可知：在1微摩尔浓度下，2019-nCov-P1无显著抑制病毒侵入的效果，在浓度达到100微摩尔时，其抑制效率能够达到百分之80以上。表现出显著的抑制效果。其半数抑制浓度EC50为42.3微摩尔。

由图2可知：在1微摩尔浓度时，2019-nCov-P2对新型冠状病毒的抑制效率能够达到百分之60以上。表现出显著的抑制效果。其对新型冠状病毒假病毒的半数抑制浓度EC50为0.85微摩尔，显著优于2019-nCov-P1。

由图3可知：对照随机多肽GFP无显著结合，而2019-nCov-P2及2019-nCov-P1多肽能够与新型冠状病毒HR2显著结合。主要表现为随多肽浓度的提高，荧光强度的增加。

由图4可知：所述多肽2019-nCov-P2，2019-nCov-P1及对照多肽在实验浓度范围内无显著细胞毒性。

综上可知，多肽2019-nCov-P2，2019-nCov-P1能够与COVID-19的S蛋白HR2区特异性结合，进而封闭HR1与HR2的结合，阻止膜融合的发生，从而在病毒侵入的最开始阶段，阻挡病毒与细胞的结合，有效的抑制和控制病毒的感染。多肽能够在微摩尔水平显著抑制COVID-19与宿主细胞的结合，从而有效抑制病毒的侵入，并且无显著细胞毒性。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种抑制新型冠状病毒的多肽，其特征在于，所述多肽能够与COVID-19的S蛋白HR2区特异性结合。

2.一种抑制新型冠状病毒的多肽，其特征在于，所述多肽为(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

(a2)肽(a1)的修饰产物；

(a3)肽(a1)在药学上可接受的盐、酯和前药中的一种。

3.一种抑制新型冠状病毒的多肽，其特征在于，所述多肽为(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)具有如SEQ ID N0：2所示的氨基酸序列；

(b2)肽(a1)的修饰产物；

(b3)肽(a1)在药学上可接受的盐、酯和前药中的一种。

4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述多肽通过化学合成法合成。

5.如权利要求1-3中任一项所述的多肽在制备预防和/或治疗冠状病毒感染药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述冠状病毒为COVID-19。

7.一种预防或治疗GOVID-19的药物，其特征在于，所述药物的药效成分包含如权利要求1-3中任一项所述的多肽。

8.一种预防或治疗GOVID-19的药物，其特征在于，所述药物的药效成分包含如权利要求2和3所述的多肽。

9.根据权利要求7所述的一种预防或治疗COVID-19的药物，其特征在于，所述药物的剂型为喷剂、口服制剂、注射制剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂和丸剂中的任意一种。

10.根据权利要求7所述的一种预防或治疗COVID-19的药物，其特征在于，还包含药学上可接受的载体和赋形剂。

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