CN115925826A - 一种抗新型冠状病毒的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及预防或治疗新冠病毒的多肽及其应用，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本发明的多肽对新冠病毒原始毒株及多种变异毒株均具有较强的抑制效果，可作为制备预防和/或治疗新冠病毒引起疾病的药物或疫苗，预期该多肽对未来出现的新的变异毒株及sarbecovirus也具有预防和/或治疗的潜力。

Description

一种抗新型冠状病毒的多肽及其应用

本申请是原申请号为202110939740.1，发明名称为“一种抗新型冠状病毒的多肽及其应用”，申请日为 2021年8月16日的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及用于预防或治疗新冠病毒的多肽、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的表达载体、转化的细胞以及包含上述的药物组合物，以及它们在制备预防和/或治疗新冠病毒的药物或疫苗中的应用。

背景技术

目前，虽然已有多种针对SARS-CoV-2的疫苗和单克隆抗体药物获得紧急使用许可，但是多数研究表明它们对新冠病毒变异毒株，例如Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)和Gamma (P.1)等，表现出下降的保护效果，因而亟待开发针对目前流行以及未来出现的新的变异毒株的广谱药物或疫苗。

目前已报道有多种新冠相关冠状病毒（属于sarbecovirus），如蝙蝠源RaTG13、RmYN02、ZC45、ZXC21等，穿山甲源GX/P2V/2017和GD/1/2019，研究表明RaTG13 、GX/P2V/2017、GD/1/2019等也存在感染人的潜力，因而也亟需研发针对这些相关冠状病毒的药物或疫苗。

发明内容

发明目的

本发明的目的在于提供用于预防或治疗新冠病毒的多肽、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的表达载体、转化的细胞以及包含上述的药物组合物，以及它们在制备预防或治疗新冠病毒的药物或疫苗中的应用。

冠状病毒刺突（S）蛋白在介导病毒入侵过程中发挥着重要作用，分为S1和S2两个亚基；其中S1亚基负责识别受体，S2亚基介导病毒囊膜与宿主细胞膜的膜融合。S2中的七肽重复序列HR1和HR2通过形成六螺旋束结构发挥膜融合功能，研究表明加入外源的HR1或HR2多肽能够抑制病毒本身的HR1和HR2六螺旋束结构的形成，进而抑制膜融合过程。本发明的多肽正是基于SARS-CoV-2的S蛋白的HR2区域进行设计的，其能够有效抑制S蛋白介导的膜融合过程，进而抑制新冠病毒的感染。

解决方案

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种用于抗新冠病毒的多肽，所述多肽为P3多肽及由其衍生的P3-1多肽、P3-2多肽、P3-3多肽、P3-4多肽和P3-5多肽中的至少一种，其中，

P3多肽的氨基酸序列：ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL（如SEQ ID NO: 1所示）；

P3-1多肽的氨基酸序列：ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLKEL（如SEQ ID NO:2所示）；

P3-2多肽的氨基酸序列：VDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL（如SEQID NO: 3所示）；

P3-3多肽的氨基酸序列：VKFGDISGINASVVNIKEEIDRLYEVVKNLNESLIDLQEL（如SEQID NO: 4所示）；

P3-4多肽的氨基酸序列：ISGINASVVNIKEEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL（如SEQ ID NO:5所示）；

P3-5多肽的氨基酸序列：ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKELNESLIDLQEL（如SEQ ID NO:6所示）。

在优选的具体实施方案中，所述多肽为选自P3-1多肽、P3-2多肽、P3-3多肽和P3-4多肽中的至少一种；更优选地，所述多肽为P3-3多肽。

在另一个优选的具体实施方案中，所述多肽连接有载体蛋白，例如人血清白蛋白；加入所述载体蛋白的目的包括延长多肽在体内的半衰期等。

第二方面，本发明提供了一种编码如第一方面所述的多肽的多核苷酸。

优选地，所述多核苷酸为DNA或mRNA；

在具体的实施方案中，所述多核苷酸包含选自如SEQ ID NO: 7-12所示的核苷酸序列；

具体地，编码P3多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示；编码P3-1多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO: 8所示；编码P3-2多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO: 9所示；编码P3-3多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示；编码P3-4多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示；编码P3-5多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示。

SEQ ID NO:7：

ATTAGCGGCATTAACGCCTCTGTGGTGAACATTCAGAAGGAGATTGACAGACTGAACGAGGTGGCCAAGAACCTGAACGAGTCTCTCATTGACCTGCAGGAGCTG；

SEQ ID NO:8：

ATTAGCGGCATTAACGCCTCTGTGGTGAACATTCAGAAGGAGATTGACAGACTGAACGAGGTGGCCAAGAACCTGAACGAGTCTCTCATTGACCTGAAGGAGCTG；

SEQ ID NO:9：

GTGGACCTGGGCGACATTAGCGGCATTAACGCCTCTGTGGTGAACATTCAGAAGGAGATTGACAGACTGAACGAGGTGGCCAAGAACCTGAACGAGTCTCTCATTGACCTGCAGGAGCTG；

SEQ ID NO:10：

GTGAAGTTCGGCGACATTAGCGGCATTAACGCCTCTGTGGTGAACATTAAGGAGGAGATTGACAGACTGTACGAGGTGGTGAAGAACCTGAACGAGTCTCTCATTGACCTGCAGGAGCTG；

SEQ ID NO:11：

ATTAGCGGCATTAACGCCTCTGTGGTGAACATTAAGGAGGAGATTGACAGACTGAACGAGGTGGCCAAGAACCTGAACGAGTCTCTCATTGACCTGCAGGAGCTG；

SEQ ID NO:12：

ATTAGCGGCATTAACGCCTCTGTGGTGAACATTCAGAAGGAGATTGACAGACTGAACGAGGTGGCCAAGGAGCTGAACGAGTCTCTCATTGACCTGCAGGAGCTG。

第三方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含如上述第二方面所述的多核苷酸。

优选地，所述核酸构建体还包含与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。

第四方面，本发明提供了一种表达载体，其包含如上述第三方面所述的核酸构建体。

第五方面，本发明提供了一种转化的细胞，其包括如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体或如上述第四方面所述的表达载体。

第六方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如上述第一方面所述的多肽、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的转化的细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

优选地，所述药物组合物为鼻腔喷雾制剂或口服制剂或胃肠外制剂的形式；

进一步优选地，所述口服制剂选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂和丸剂；

进一步优选地，所述胃肠外制剂为可注射或可推注制剂；

优选地，所述药物组合物为疫苗组合物。

第七方面，本发明提供了一种如上述第一方面所述的多肽、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的转化的细胞或如上述第六方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗新冠病毒感染的药物或疫苗中的应用。

优选地，所述新冠病毒为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株和/或sarbecovirus；

进一步优选地，所述SARS-CoV-2变异毒株为D614G、Alpha (B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma (P.1)、Kappa (B.1.617.1)和/或Delta (B.1.617.2)毒株，所述sarbecovirus为β冠状病毒sarbecovirus亚属病毒。

第七方面，本发明提供了一种预防或治疗新冠病毒的方法，其包括：向有需要的受试者施用预防或治疗有效量的如上述第一方面所述的多肽、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的转化的细胞或如上述第六方面所述的药物组合物。

优选地，所述新冠病毒为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株和/或sarbecovirus；

进一步优选地，所述SARS-CoV-2变异毒株为D614G、Alpha (B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma (P.1)、Kappa (B.1.617.1)和/或Delta (B.1.617.2)毒株，所述sarbecovirus为β冠状病毒sarbecovirus亚属病毒。

有益效果

本申请的发明人基于SARS-CoV-2 病毒的S蛋白的HR2区域，设计出多肽P3，并对其进行一系列改造（包括一个或多个氨基酸的增加或替换）形成衍生肽P3-1、P3-2、P3-3、P3-4和P3-5，多肽P3及各衍生肽对SARS-CoV-2原始毒株及多种变异毒株具有较强的抑制效果，可作为制备预防或治疗新冠病毒的药物或疫苗，预期该多肽对未来出现的新的变异毒株及sarbecovirus也具有预防或治疗的潜力。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1是SARS-CoV-2及其相关冠状病毒S蛋白的HR1和HR2区序列比对图；

图2是本发明的不同多肽对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株假病毒的抑制效果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

以下，对本发明进行详述。

本发明基于SARS-CoV-2 S蛋白的HR2区域，设计出多肽P3，并对P3多肽进行了一系列的改造（包括一个或多个氨基酸的增加或替换），改造后的多肽分别命名为P3-1、P3-2、P3-3、P3-4和P3-5。通过本领域常规使用的方法直接合成得到。

实验仪器和材料：

HEK293T细胞(购自ATCC细胞库) 。

假病毒包装骨架病毒G*VSV-delG (购自武汉枢密脑科学技术有限公司)。

真核系统蛋白pCAGGS表达载体（由苏州金唯智公司提供）。

Hela hACE2细胞(申请人构建的hACE2稳转细胞系，见实施例1)。

多肽P3，其编码序列为SEQ ID NO:1，由深圳翰宇药业有限公司合成。

多肽P3-1，其编码序列为SEQ ID NO:2，由深圳翰宇药业有限公司合成。

多肽P3-2，其编码序列为SEQ ID NO:3，由深圳翰宇药业有限公司合成。

多肽P3-3，其编码序列为SEQ ID NO:4，由深圳翰宇药业有限公司合成。

多肽P3-4，其编码序列为SEQ ID NO:5，由深圳翰宇药业有限公司合成。

多肽P3-5，其编码序列为SEQ ID NO:6，由深圳翰宇药业有限公司合成。

上述六种多肽的序列见表1，其中加粗部分为相对多肽P3增加或替换的氨基酸。

表1.六种多肽的氨基酸序列

本发明的SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株假病毒为发明者实验室包装得到（参见实施例2）。

实施例1

Hela hACE2细胞系的构建

首先，将hACE2基因与flag标签融合表达，序列经人工合成(由苏州金唯智提供合成服务)后，连入pLVX慢病毒表达载体上，获得hACE2表达载体pLVX-hACE2。

细胞系构建如下：

a.细胞准备：提前一天在6孔细胞培养板中铺HEK293T细胞，使第二天细胞汇合密度达到80%-90%。

b. 转染：取各目的质粒（pLVX-hACE2及慢病毒包装质粒psPAX2和pMD2.G）按2:2:1的比例混合，按质粒与PEI的比例为1:3混匀后转染，4-6h后，将细胞培养液更换为含2% FBS的DMEM培养基，继续培养48h。

c. 收毒及感染：将细胞培养上清，其中含有包装好的慢病毒，经0.45μm无菌滤器过滤，以去除细胞碎片，加入提前一天准备好的Hela细胞中。

d. 克隆筛选：使用含有2μg/ml嘌呤霉素的培养基培养Hela细胞，筛选阳性克隆。

e. 单克隆细胞系的建立：通过流式分选的方法将单克隆细胞分选至96孔细胞培养板中，继续培养至在显微镜下可见单细胞团，扩大培养后，经目标基因测序等方法确认。

实施例2

截短的S蛋白的表达质粒的制备

1）将编码SARS-CoV-2原始毒株（WT）及变异毒株（D614G、Alpha (B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma (P.1)、Kappa (B.1.617.1)和Delta（B.1.617.2））的S蛋白的后18位氨基酸的核苷酸去掉，分别得到核苷酸序列SARS-CoV-2-WT-S-del18、D614G-S-del18、B.1.1.7-S-del18、B.1.351-S-del18、P.1-S-del18、B.1.617.1-S-del18、B.1.617.2-S-del18（其序列分别如SEQ ID NO:13-19所示），并由苏州金唯智公司进行合成。

2）分别将1）中获得的各核苷酸序列克隆到pCAGGS表达载体上，得到表达质粒pCAGGS-SARS-CoV-2-WT-S-del18、pCAGGS-D614G-S-del18、pCAGGS-B.1.1.7-S-del18、pCAGGS-B.1.351-S-del18、pCAGGS-P.1-S-del18、pCAGGS-B.1.617.1-S-del18、pCAGGS-B.1.617.2-S-del18。

SARS-CoV-2原始毒株及变异毒株假病毒的包装

a.细胞准备：在10 cm细胞培养皿中铺HEK293T细胞，使第二天细胞汇合密度至80%左右。

b. 转染：取上述步骤2）中获得的各S蛋白的表达质粒，用PEI转染30μg质粒/10cm细胞培养皿，目的质粒与PEI按1:3比例混匀后转染，4-6h换培养液（含10% FBS的DMEM培养基），37℃培养24h。

c. 加毒：将假病毒包装骨架病毒G*VSV-delG（购自武汉枢密脑科学技术有限公司）加入上述转染后的HEK293T细胞，37℃孵育2 h，换培养液（含10% FBS的DMEM培养基），并加入VSV-G抗体（表达该抗体杂交瘤细胞购自ATCC细胞库），在培养箱中继续培养30 h。

d. 收毒：收上清3000 rpm离心10 min, 在超净工作台中经0.45 μm无菌滤器过滤，去除细胞碎片，分装，-80℃冰箱冻存。

经过上述步骤，分别得到SARS-CoV-2原始毒株（SARS-CoV-2 WT）及变异毒株（D614G、Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)、Gamma (P.1)、Kappa (B.1.617.1)及Delta(B.1.617.2)）的假病毒。

实施例3

多肽对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株假病毒抑制效果评价

本实施例旨在测定多肽P3及其5条衍生多肽 (P3-1、P3-2、P3-3、P3-4和P3-5)对原始毒株（SARS-CoV-2 WT）及变异毒株（D614G、Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)、Gamma(P.1)、Kappa (B.1.617.1)及Delta (B.1.617.2)）的假病毒的抑制效果。

实验分组：Hela hACE2细胞（空白对照组，细胞未感染病毒）；Hela hACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+DMEM培养基（阴性对照组，细胞感染了病毒，但未用多肽处理）；Hela hACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+多肽P3（P3处理组）；Hela hACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-1（P3-1处理组）、Hela hACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-2（P3-2处理组）；Hela hACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-3（P3-3处理组）；Hela hACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-4（P3-4处理组）；Hela hACE2细胞+原始毒株或变异毒株假病毒+P3-5（P3-5处理组）。

多肽原液配制：分别将多肽P3、 P3-1、P3-2、P3-3、P3-4和P3-5先用DMSO配置成10mM母液，再用含10% FBS的DMEM培养基将母液稀释成20 μM，作为进一步梯度稀释的原液。

多肽梯度稀释液的配制：用含10% FBS的DMEM培养基将上述20 μM的各多肽原液以2倍的倍比稀释，共稀释9个梯度（分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156、0.078、0.039μM），每个梯度3个复孔，每孔50 μL。

假病毒用量的确定：将SARS-CoV-2原始毒株或变异毒株假病毒原液及一系列稀释液在Hela hACE2细胞上进行定量，将出现1000个FFU时的稀释度作为评价多肽抑制效果时的病毒用量（稀释倍数介于6~20倍之间）。

病毒抑制效果的测定方法为：

a.在96孔细胞培养板中铺Hela hACE2细胞，培养使第二天细胞汇合密度达到80-90%。

b. 根据上述实验分组，取上述各多肽梯度稀释液，加入等体积（50 μL）的定量的假病毒稀释液，混匀后，在37℃孵育1 h。

c. 将步骤a中的96孔细胞培养板上清小心弃去，加入步骤b中的多肽-假病毒混合液（100 μL/孔），在培养箱中继续培养15 h-24h。

d. 利用高内涵显微镜统计被感染的细胞数，计算各多肽在不同浓度下的抑制率，再利用GraphPad计算出各多肽的EC₅₀（如图2所示），结果见表2；并计算出衍生多肽P3-1~5相较于多肽P3对SARS-CoV-2原始毒株假病毒抑制效果的提升倍数，结果见表3。

表2.  多肽对SARS-CoV-2原始毒株及其变异毒株假病毒抑制效果（EC₅₀）

表3.  衍生多肽P3-1~5相较于多肽P3对SARS-CoV-2原始毒株假病毒抑制效果的提升倍数

从表2、表3可知，P3多肽对SARS-CoV-2原始毒株及多种变异毒株均具有很好的抑制效果（0.45 μM≤EC₅₀≤ 1.39μM），相比于P3多肽，衍生多肽P3-1、P3-2、P3-3和P3-4对SARS-CoV-2原始毒株及多种变异毒株的抑制效果均具有不同程度的提升，尤其是多肽P3-3提升最为明显。P3-5的抑制效果虽略有下降，但是其对Kappa变异毒株的抑制效果略高于P3。

从表2、表3可知，本发明的多肽能够用于预防或治疗由新冠病毒引起的疾病，推测也可以广泛用于sarbecovirus引起的疾病。

在SARS-CoV-2入侵宿主细胞的过程中，本发明的多肽通过抑制S蛋白介导的膜融合过程抑制病毒入侵，适用于对新冠病毒原始毒株及变异毒株，例如D614G、B.1.1.7(Alpha)、B.1.351(Beta)、P.1(Gamma)、Kappa (B.1.617.1)或Delta (B.1.617.2)的治疗或预防，推测对sarbecovirus及未来出现的新的新冠病毒变异毒株也有抑制作用，具有潜在的广泛应用价值。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种抗新冠病毒的多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。

2.根据权利要求1所述的抗新冠病毒的多肽，其特征在于，所述的多肽连接有载体蛋白；优选地，所述的载体蛋白为人血清白蛋白。

3.一种编码权利要求1至2任一项所述的多肽的多核苷酸。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸为DNA或mRNA；优选地，所述的多核苷酸包含如SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列。

5.一种核酸构建体，其包含权利要求3至4任一项所述的多核苷酸；优选地，还包含与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。

6.一种表达载体，其包含权利要求5所述的核酸构建体。

7.一种转化的细胞，其包括权利要求3至4任一项所述的多核苷酸、权利要求5所述的核酸构建体或权利要求6所述的表达载体。

8.一种药物组合物，其包含权利要求1至2任一项所述的多肽、权利要求3至4任一项所述的多核苷酸、权利要求5所述的核酸构建体、权利要求6所述的表达载体或权利要求7所述的转化的细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；

优选地，所述的药物组合物为鼻腔喷雾制剂或口服制剂或胃肠外制剂的形式；

更优选地，所述的口服制剂选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂和丸剂

更优选地，所述的胃肠外制剂为可注射或可推注制剂

进一步优选地，所述的药物组合物为疫苗组合物。

9.一种权利要求1至2任一项所述的多肽、权利要求3至4任一项所述的核苷酸序列、权利要求5所述的核酸构建体、权利要求6所述的表达载体、权利要求7所述的转化的细胞或权利要求8所述的药物组合物在制备预防和/或治疗新冠病毒的药物或疫苗中的应用；

优选地，所述的新冠病毒为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株和/或sarbecovirus；

更优选地，所述的SARS-CoV-2变异毒株为D614G、Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)、Gamma (P.1)、Kappa (B.1.617.1)和/或Delta (B.1.617.2)毒株；所述的sarbecovirus为β冠状病毒sarbecovirus亚属病毒。

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