CN114989263B - 与SARS-CoV-2刺突蛋白特异性结合的多肽KVp-N及其制备方法与应用 - Google Patents
与SARS-CoV-2刺突蛋白特异性结合的多肽KVp-N及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114989263B CN114989263B CN202110224252.2A CN202110224252A CN114989263B CN 114989263 B CN114989263 B CN 114989263B CN 202110224252 A CN202110224252 A CN 202110224252A CN 114989263 B CN114989263 B CN 114989263B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- protein
- kvp
- cov
- sars
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 116
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 114
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 113
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 title claims abstract description 6
- 101001028244 Onchocerca volvulus Fatty-acid and retinol-binding protein 1 Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 43
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims abstract description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 13
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 108010058865 angiotensinase Proteins 0.000 claims description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 12
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 3
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 claims description 3
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 67
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 description 21
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 102000053723 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 12
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 10
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 9
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 8
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 7
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 7
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 4
- 238000003380 quartz crystal microbalance Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 101800000904 Spike protein S1 Proteins 0.000 description 3
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 2
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000594 epithelial cell of lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 210000002588 alveolar type II cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了一种与SARS‑CoV‑2刺突蛋白特异性结合的多肽KVp‑N及其制备方法与应用，为含有以下氨基酸排列的多肽：GDGVYYPRDVFDS SVLDSTQR。该多肽通过与S1蛋白的结合，可以阻断SARS‑CoV‑2病毒与其宿主细胞表面的关键靶标蛋白血管紧张素酶(ACE2)蛋白的结合，从而有潜力为新型冠状病毒肺炎的治疗提供可行的靶向药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种与SARS-CoV-2刺突蛋白(尤其是SARS-CoV-2表面刺突S1蛋白)特异性结合的多肽，命名为KVp-N，以及该多肽的制备方法与应用。
背景技术
近年在全球蔓延并暴发大流行的新型冠状病毒肺炎(简称新冠肺炎)，病原是一种新型冠状病毒SARS-CoV-2。当前对于新型冠状病毒肺炎的治疗药物主要是广谱的抗病毒药物和对症的药物，尚缺少有效的靶向药，因而急需开发针对新型冠状病毒肺炎的治疗药物。
发明内容
本发明的目的，第一方面，提供一种与SARS-CoV-2刺突蛋白特异性结合的多肽，命名为多肽KVp-N，为含有以下氨基酸排列的多肽：GDGVYYPRDVFDSSVLDSTQR。
其末端用含巯基的肽片段修饰；优选的，所述含巯基的肽片段的氨基酸排列为CCPPPP。
所述多肽的氨基酸排列的通式为：
GDGVYYPRDVFDSSVLDSTQR、或
CCPPPPGDGVYYPRDVFDSSVLDSTQR。
第二方面，本发明提供了制备上述多肽的方法，使用标准固相多肽合成方法合成得到。
第三方面，本发明提供了上述多肽在制备治疗新型冠状病毒肺炎药物中的应用，优选的，所述新型冠状病毒为SARS-CoV-2。
第四方面，本发明提供了上述多肽在制备用于阻断SARS-CoV-2表面刺突S1蛋白与血管紧张素酶2(ACE2)结合的阻断剂中的应用。
所述血管紧张素酶2(ACE2)存在于纤毛支气管上皮细胞或II型肺细胞表面。
该应用中，利用所述多肽特异性地阻断SARS-CoV-2表面刺突S1蛋白与血管紧张素酶2(ACE2)结合。具体为：
利用所述多肽特异性地与SARS-CoV-2表面刺突S1蛋白结合，以阻断SARS-CoV-2表面刺突S1蛋白与血管紧张素酶2(ACE2)结合。或
利用所述多肽特异性地与SARS-CoV-2表面刺突S1蛋白亚基的RBD结构域结合，以阻断SARS-CoV-2表面刺突S1蛋白与血管紧张素酶2(ACE2)结合。
基于以上几方面内容，经实验证明，本发明提供的与SARS-CoV-2表面刺突S1蛋白特异性结合的多肽通过与S1蛋白的结合，可以阻断SARS-CoV-2病毒与其宿主细胞表面的关键靶标蛋白血管紧张素酶(ACE2)蛋白的结合，从而有潜力为新型冠状病毒肺炎的治疗提供可行的靶向药物。
附图说明
图1为多肽KVp-N1对S1蛋白的结合能力检测曲线；
图2为多肽KVp-N1对RBD蛋白的结合能力检测曲线；
图3为与多肽KVp-N1共孵育后S1蛋白结合人肺癌细胞系A549细胞能力的WesternBlot检测胶图；
图4为与多肽KVp-N1共孵育后RBD蛋白结合A549细胞能力的Western Blot检测胶图；
图5为与多肽KVp-N1共孵育后S1蛋白结合293T-ACE2+细胞能力的Western Blot检测胶图；
图6为与多肽KVp-N1共孵育后RBD蛋白结合293T-ACE2+细胞能力的Western Blot检测胶图；
图7为与多肽KVp-N1或多肽KVp-N1N共孵育后SARS-CoV-2假病毒对293T-ACE2+细胞的感染率统计结果柱状图；
图8为与不同浓度的多肽KVp-N1N共孵育后SARS-CoV-2假病毒对293T-ACE2+细胞的感染率统计结果柱状图；
图9为多肽KVp-N1对293T-ACE2+细胞活性影响的统计结果柱状图；
图10为多肽KVp-N1N对293T-ACE2+细胞活性影响的统计结果柱状图。
具体实施方式
研究已经证实，SARS-CoV-2通过其表面刺突蛋白S1亚基的RBD结构域与纤毛支气管上皮细胞和II型肺细胞表面的血管紧张素酶2(ACE2)结合，致细胞感染，从而使人罹患新型冠状病毒肺炎，且目前没有用于治疗该疾病的特效药。
本发明通过人工合成的方式制备得到一类与SARS-CoV-2表面刺突蛋白S1亚基或其RBD结构域特异性结合的多肽，命名为多肽KVp-N，其可为氨基酸排列通式为GDGVYYPRDVFDSSVLDSTQR(记为KVp-N1N)的多肽；或者在KVp-N1N的末端用肽片段CCPPPP修饰，可为氨基酸排列通式为CCPPPPGDGVYYPRDVFDSSVLDSTQR(记为KVp-N1)的多肽，在KVp-N1中引入巯基，目的是通过巯基使多肽与含金元素的物质(例如金纳米颗粒)结合，以利于在应用中例如对多肽进行检测与识别。实验验证了该多肽可阻断S1蛋白与ACE2蛋白的结合，从而阻止SARS-CoV-2感染上皮细胞和肺细胞，可用作靶向治疗新型冠状病毒肺炎的药物。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
除非特别指明，以下实施例中所用的磷酸盐缓冲液均为1×PBS溶液(pH＝7.4)。
实施例1：多肽及其制备
该实施例通过标准固相多肽合成方法制备得到本发明提供的靶向SARS-CoV-2表面刺突蛋白S1的两条多肽，代号分别为KVp-N1N和KVp-N1，统称为KVp-N，两者的氨基酸排列如下表1所示。
表1：多肽的氨基酸排列
| 编号 | 代号 | 排列 |
| 1# | KVp-N1N | GDGVYYPRDVFDSSVLDSTQR |
| 2# | KVp-N1 | CCPPPPGDGVYYPRDVFDSSVLDSTQR |
经高效液相色谱法和质谱的鉴定，确证得到的产品为表1中的目标多肽，两条多肽均为白色粉末，纯度均≥98％。其中代号为KVp-N1的多肽为在代号为KVp-N1N的多肽的末端引入CCPPPP修饰，这种修饰使得在多肽KVp-N1中引入了巯基，该巯基使多肽KVp-N1可以与金(例如金纳米颗粒)结合(例如实施例2利用该结合实现对多肽结合能力的检测)。
为了验证表1中所示的多肽(KVp-N1N和KVp-N1)的生物学效应，在以下所有实施例中均用完全培养基(商购)将多肽KVp-N1N和KVp-N1配制成浓度为10mM的母液；以及为了检测多肽KVp-N的结合能力，用双蒸水(ddH2O)将多肽配制成浓度为0.5mg/mL的多肽溶液。
实施例2：多肽KVp-N的结合能力
该实施例利用石英晶体微天平法(QCM)检测实施例1合成制备的多肽KVp-N1(该检测中需利用在该多肽中引入的巯基)与SARS-CoV-2的S1蛋白或其RBD段(均购自北京义翘神州科技股份有限公司)的结合能力，其中使用的四通道耗散型石英微天平购自Biolin Scientific。
实验2.1：多肽KVp-N与S1蛋白的结合能力
(1)使用清洗液(浓硫酸和双氧水体积比3:1)清洗四通道耗散型石英微天平的金涂层石英芯片3次，每次三分钟，并用ddH2O冲洗；
(2)按照四通道耗散型石英微天平操作说明，将浓度为0.5mg/mL的KVp-N1多肽溶液与金涂层石英芯片室温孵育30min使多肽KVp-N1分子通过巯基结合在金涂层石英芯片上；
(3)用ddH2O冲洗芯片，并用氮气吹干。将芯片嵌入反应室，以PBS配制的浓度为13nM的S1蛋白为流动相，经过管路流经金涂层石英芯片，QCM检测S1蛋白与多肽KVp-N1的结合。
结果如图1所示，可见S1蛋白流动相流经管路时，金涂层石英芯片振荡频率降低，表明S1蛋白结合到了多肽KVp-N1上。
实验2.2：多肽KVp-N与RBD段蛋白的结合能力
实验2.2的具体操作与上述实验2.1的操作相同，不同之处仅在于使用以PBS配制的浓度为20nM的RBD蛋白溶液替换S1蛋白溶液作为流动相。
多肽KVp-N1与RBD段的结合能力的QCM检测结果如图2所示，可见RBD蛋白流动相流经管路时，金涂层石英芯片振荡频率降低，表明RBD蛋白结合到了多肽KVp-N1上。
综上实验结果，证明多肽KVp-N(KVp-N1和KVp-N1N)能与SARS-CoV-2的S1蛋白或其RBD段结合。
实施例3：多肽KVp-N阻止S1蛋白、RBD蛋白与靶细胞的结合
该实施例中以人肺癌细胞系A549细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)和过表达ACE2蛋白的293T细胞(293T-ACE2+)(购自北京义翘神州科技股份有限公司)为靶细胞验证模拟实施例1合成制备的多肽KVp-N阻止SARS-CoV-2的S1蛋白或RBD蛋白与靶细胞的结合效应。
实验3.1：多肽KVp-N对S1蛋白与人肺癌细胞系A549细胞结合能力的影响
(1)将A549细胞以2×105cells/well的密度接种于6孔板中，37℃培养箱中过夜培养，使细胞贴壁；
(2)将S1蛋白用PBS稀释至1μM的S1蛋白溶液，再将其在室温下与0.1μM、1μM、10μM、100μM(分别由10mM的KVp-N1多肽母液经完全培养基稀释制备)的多肽KVp-N1共孵育1h，同步设置不与多肽KVp-N1共孵育的S1蛋白溶液作为对照组；
(3)将上述S1蛋白与多肽KVp-N1的混合液加入到细胞培养体系中，使其中的S1蛋白终浓度均为10nM；
(4)共培养1h后，用PBS洗两遍，用RIPA裂解液裂解细胞抽提总蛋白，用WesternBlot方法检测总蛋白中S1蛋白的含量。
结果如图3所示，可见对照组有较强的S1蛋白阳性信号，表明S1蛋白与A549细胞发生了结合；而当S1蛋白先与多肽KVp-N1孵育1h，再加入到细胞培养体系中，S1蛋白信号的强度明显降低，表明在1nM至1000nM的多肽浓度范围内，多肽KVp-N1抑制了S1蛋白对A549细胞的结合。
实验3.2：多肽KVp-N对RBD蛋白与人肺癌细胞系A549细胞结合能力的影响
实验3.2的具体操作同上述实验3.1，不同之处仅在于用RBD蛋白溶液替换S1蛋白溶液与不同浓度的KVp-N1多肽溶液共孵育。
Western Blot方法检测总蛋白中RBD蛋白的含量的结果如图4所示，可见对照组有较强的RBD蛋白阳性信号，表明RBD蛋白与A549细胞发生了结合；而与多肽KVp-N1孵育之后的RBD蛋白在A549细胞上的结合量显著少于对照组，表明多肽KVp-N1抑制了RBD蛋白对A549细胞的结合。
实验3.3：多肽KVp-N对S1蛋白与细胞系293T-ACE2+细胞结合能力的影响
实验3.3的具体操作同上述实验3.1，不同之处仅在于用293T-ACE2+细胞替换A549细胞作为靶细胞。
Western Blot方法检测总蛋白中S1蛋白的含量的结果如图5所示，可见对照组有较强的S1蛋白阳性信号，表明S1蛋白与293T-ACE2+细胞发生了结合；而当S1蛋白先与多肽KVp-N1孵育1h，再加入到细胞培养体系中，S1蛋白信号的强度明显降低，表明多肽KVp-N1抑制了S1蛋白对293T-ACE2+细胞的结合。
实验3.4：多肽KVp-N对RBD蛋白与人肺癌细胞系293T-ACE2+细胞结合能力的影响
实验3.4的具体操作同上述实验3.2，不同之处仅在于用293T-ACE2+细胞替换A549细胞作为靶细胞。
Western Blot方法检测总蛋白中RBD蛋白的含量的结果如图6所示，可见对照组有较强的RBD蛋白阳性信号，表明RBD蛋白与293T-ACE2+细胞发生了结合；而与多肽KVp-N1孵育之后的RBD蛋白在293T-ACE2+细胞上的结合量显著少于对照组，表明多肽抑制了RBD蛋白对293T-ACE2+细胞的结合。
综上实验结果，证明多肽KVp-N(KVp-N1和KVp-N1N)能阻止S1蛋白或其RBD结构域与靶细胞(人肺癌细胞系A549细胞和人肺癌细胞系293T-ACE2+细胞)的结合。
实施例4：多肽KVp-N对SARS-CoV-2假病毒的中和能力
该实施例利用假病毒中和法检测实施例1制备的多肽KVp-N(KVp-N1和KVp-N1N)对SARS-CoV-2侵染细胞的阻断效应，其中所使用的SARS-CoV-2假病毒(PSV)购自吉满生物科技(上海)有限公司，其带有荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)标签，具体包括以下操作。
(1)将293T-ACE2+细胞接种于96孔板中，每孔2×104个细胞，过夜培养使其贴壁；
(2)将带有荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)标签的假病毒(＞106copies/mL)分别与10μM的多肽KVp-N1和KVp-N1N(分别由10mM的KVp-N1和KVp-N1N多肽母液经完全培养基稀释制备)混合孵育1h，以及分别与剂量梯度为100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、1nM(分别由10mM的KVp-N1N多肽母液经完全培养基稀释制备)的多肽KVp-N1N混合孵育1h；
(3)将混合孵育后的假病毒多肽混合液加入到步骤(1)的细胞培养体系中感染293T-ACE2+细胞，37℃下感染1h后换用正常培养基继续培养47h。培养结束后，PBS洗一次细胞，采用荧光素酶检测试剂盒(普洛麦格公司，货号E1500)检测化学发光，并据此计算不同组别中假病毒的感染率。
结果如图7所示，其中PSV表示未与多肽孵育的SARS-CoV-2假病毒的感染率，KVp-N1和KVp-N1N分别表示使用10μM的多肽与SARS-CoV-2假病毒混合孵育后SARS-CoV-2假病毒对293T-ACE2+细胞的感染率，明显可见，同等剂量下，多肽KVp-N1和多肽KVp-N1N均具有较强的和基本相同的假病毒中和能力。图8示出了使用1nM～100μM的剂量范围的多肽KVp-N1N与SARS-CoV-2假病毒共孵育后假病毒SARS-CoV-2对293T-ACE2+细胞的感染率，可见在不同的剂量浓度下，多肽KVp-N1N均显示出对假病毒较强的中和能力，且中和能力在50％左右。
综上实验结果，证明多肽KVp-N(KVp-N1和KVp-N1N)对SARS-CoV-2假病毒具有较强的中和能力，中和能力在50％左右。
实施例5：多肽KVp-N的细胞毒作用
该实施例利用293T-ACE2+细胞检测实施例1制备的多肽KVp-N1和KVp-N1N的细胞毒作用，具体包括以下操作。
(1)取对数期生长的293T-ACE2+细胞，调整细胞密度为105cells/mL，接种于96孔板中，每孔100μL；
(2)取多肽KVp-N1和KVp-N1N分别加入细胞培养体系中，使培养基中的多肽终浓度分别为1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM，37℃培养48h；
(3)培养结束后弃上清后用PBS洗一次，每孔加入cell counting kit-8(CCK-8)工作液(CCK-8工作液是由CCK8原液和完全培养基按体积比为1:10混合得到，CCK8原液购自Dojindo Molecular Technologies公司)120μL。混匀后37℃孵育3h后检测450nm及630nm(参比波长)处的吸光值，计算细胞活率。
结果如图9和图10所示，其中图9为多肽KVp-N1在所检测的剂量范围内对293T-ACE2+细胞活率的影响，图10为多肽KVp-N1N在所检测的剂量范围内对293T-ACE2+细胞活率的影响。可见多肽KVp-N(KVp-N1和KVp-N1N)在所检测的剂量范围内对293T-ACE2+细胞活率的影响均不大，结合图7和图8所示的结果，在所检测的剂量范围内的多肽对假病毒SARS-CoV-2具有较佳的中和能力，因此在所检测的1nM～100μM剂量范围内，多肽对293T-ACE2+细胞无细胞毒作用，且具有良好的SARS-CoV-2假病毒中和能力。
综上实施例结果可见，本发明提供的多肽KVp-N可以与SARS-CoV-2病毒的S1蛋白及其RBD段结合，并由此可以阻断SARS-CoV-2病毒的S1蛋白及其RBD段与其靶标(例如纤毛支气管上皮细胞和II型肺细胞表面的血管紧张素酶2(ACE2))的结合，并因此可以阻止SARS-CoV-2病毒感染上皮细胞和肺细胞，并表现出对SARS-CoV-2假病毒较强的中和能力。
罹患新型冠状病毒肺炎的感染机理是SARS-CoV-2病毒通过其表面刺突蛋白S1亚基的RBD结构域与纤毛支气管上皮细胞和II型肺细胞的血管紧张素酶2(ACE2)结合，导致细胞被感染。因此本发明提供的多肽KVp-N不仅仅可以用于制备阻断SARS-CoV-2病毒的S1蛋白及其RBD段与ACE2结合的阻断剂，还可以用于制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物，实现靶向治疗新型冠状病毒肺炎的目的。
本发明提供的多肽具有分子量较低、生物活性高、在体内不易产生蓄积等特点，不仅本身可以作为药物，还可用于与其他药物分子(如抗炎药物、抗感染药物等)复合使用，且复合时与其他药物的相互作用较少；同时还具有易于合成和分子修饰、生产成本较低等优势，因此可以大规模生产和应用。
本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原材料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。
Claims (8)
1.一种与SARS-CoV-2刺突蛋白特异性结合的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为：GDGVYYPRDVFDSSVLDSTQR。
2.一种与SARS-CoV-2刺突蛋白特异性结合的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为：CCPPPPGDGVYYPRDVFDSSVLDSTQR。
3.一种制备权利要求1或2所述多肽的方法，其特征在于，使用标准固相多肽合成方法合成得到。
4.权利要求1或2所述多肽在制备治疗新型冠状病毒肺炎药物中的应用，其中所述新型冠状病毒为SARS-CoV-2。
5.权利要求1或2所述多肽在制备用于阻断SARS-CoV-2表面刺突S1蛋白与血管紧张素酶2结合的阻断剂中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述血管紧张素酶2存在于纤毛支气管上皮细胞或II型肺细胞表面。
7.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，利用所述多肽特异性地与SARS-CoV-2表面刺突S1蛋白结合，以阻断SARS-CoV-2表面刺突S1蛋白与血管紧张素酶2结合。
8.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，利用所述多肽特异性地与SARS-CoV-2表面刺突S1蛋白亚基的RBD结构域结合，以阻断SARS-CoV-2表面刺突S1蛋白与血管紧张素酶2结合。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110224252.2A CN114989263B (zh) | 2021-03-01 | 2021-03-01 | 与SARS-CoV-2刺突蛋白特异性结合的多肽KVp-N及其制备方法与应用 |
| PCT/CN2022/078627 WO2022184056A1 (zh) | 2021-03-01 | 2022-03-01 | 与SARS-CoV-2刺突蛋白特异性结合的多肽、多肽组合物及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110224252.2A CN114989263B (zh) | 2021-03-01 | 2021-03-01 | 与SARS-CoV-2刺突蛋白特异性结合的多肽KVp-N及其制备方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114989263A CN114989263A (zh) | 2022-09-02 |
| CN114989263B true CN114989263B (zh) | 2023-07-25 |
Family
ID=83018298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110224252.2A Active CN114989263B (zh) | 2021-03-01 | 2021-03-01 | 与SARS-CoV-2刺突蛋白特异性结合的多肽KVp-N及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114989263B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111825750A (zh) * | 2020-05-21 | 2020-10-27 | 谭骏 | Ace2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用 |
| GB202017058D0 (en) * | 2020-10-27 | 2020-12-09 | Kymab Ltd | Antibodies and uses thereof |
| CN112321686A (zh) * | 2020-11-16 | 2021-02-05 | 北京大学深圳研究生院 | 一种靶向新冠肺炎病毒刺突蛋白的稳定多肽及其用途 |
| WO2022184056A1 (zh) * | 2021-03-01 | 2022-09-09 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 与SARS-CoV-2刺突蛋白特异性结合的多肽、多肽组合物及其制备方法与应用 |
-
2021
- 2021-03-01 CN CN202110224252.2A patent/CN114989263B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111825750A (zh) * | 2020-05-21 | 2020-10-27 | 谭骏 | Ace2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用 |
| GB202017058D0 (en) * | 2020-10-27 | 2020-12-09 | Kymab Ltd | Antibodies and uses thereof |
| CN112321686A (zh) * | 2020-11-16 | 2021-02-05 | 北京大学深圳研究生院 | 一种靶向新冠肺炎病毒刺突蛋白的稳定多肽及其用途 |
| WO2022184056A1 (zh) * | 2021-03-01 | 2022-09-09 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 与SARS-CoV-2刺突蛋白特异性结合的多肽、多肽组合物及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| sars cov-2: structure, biology, and structure-based therapeutics development;Mei-Yue Wang等;Front Cell Infect Microbiol;第10卷;第587269页 * |
| Synthetic neutralizing peptides inhibit the host cell binding of spike protein and block infection of SARS-CoV-2;Tao Wang等;Journal of Medicinal Chemistry;第64卷(第19期);第14887–14894页 * |
| 新型冠状病毒SARS-CoV-2研究进展;夏立秋;;激光生物学报(01);第5-14页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114989263A (zh) | 2022-09-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | Extracellular vesicles derived from melatonin‐preconditioned mesenchymal stem cells containing USP29 repair traumatic spinal cord injury by stabilizing NRF2 | |
| WO2022184056A1 (zh) | 与SARS-CoV-2刺突蛋白特异性结合的多肽、多肽组合物及其制备方法与应用 | |
| CN112321686B (zh) | 一种靶向新冠肺炎病毒刺突蛋白的稳定多肽及其用途 | |
| Bird et al. | Mucosal delivery of a double-stapled RSV peptide prevents nasopulmonary infection | |
| CN107188929B (zh) | 一种酶响应性自组装肽及其应用 | |
| Yang et al. | Drug repurposing of itraconazole and estradiol benzoate against COVID‐19 by blocking SARS‐CoV‐2 spike protein‐mediated membrane fusion | |
| WO2013026334A1 (zh) | 阻止细胞dna合成、抑制细胞增殖的多肽及其用途 | |
| CN103788211B (zh) | 双功能肽、所述双功能肽与核酸分子形成的复合物以及治疗肿瘤的药物组合物 | |
| CN108341854B (zh) | 一种肿瘤靶向的新型多肽及其用途 | |
| CN114989263B (zh) | 与SARS-CoV-2刺突蛋白特异性结合的多肽KVp-N及其制备方法与应用 | |
| CN114989255B (zh) | 与SARS-CoV-2刺突蛋白特异性结合的多肽KVp-R及其制备方法与应用 | |
| CN114989245B (zh) | 与SARS-CoV-2刺突蛋白特异性结合的多肽KVp-C及其制备方法与应用 | |
| WO2022246873A1 (zh) | 一种抗SARS-CoV-2的药物及应用 | |
| CN114989264B (zh) | 与SARS-CoV-2刺突蛋白特异性结合的多肽组合物及其制备方法与应用 | |
| Shan et al. | E2F1-induced long non-coding RNA MCF2L-AS1 modulates Cyclin D1 mRNA stability through ELAVL1 to induce Gefitinib resistance in non-small cell lung cancer | |
| CN105267948A (zh) | 肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物在制备防治肠道病毒71型感染药物中的应用 | |
| Hu et al. | Down regulation of human positive coactivator 4 suppress tumorigenesis and lung metastasis of osteosarcoma | |
| CN116987152B (zh) | 一种结合沙贝冠状病毒s蛋白rbd结构域的环肽及其应用 | |
| Belouzard et al. | Large scale screening discovers clofoctol as an inhibitor of SARS-CoV-2 replication that reduces COVID-19-like pathology | |
| CN108795945A (zh) | 自组装核酸适配体dna纳米火车及其制备方法和应用 | |
| CN115475154B (zh) | 棉酚及其衍生类似物在制备抗新型冠状病毒及其类似rna病毒产品的应用 | |
| JP2016222605A (ja) | 腫瘍細胞の放射線感受性を増大させる合成ペプチド及びその利用 | |
| Faghirabadi et al. | Intracellular delivery of antiviral shRNA using penetratin-based complexes effectively inhibits respiratory syncytial virus replication and host cell apoptosis | |
| CN105288655A (zh) | 液泡分选蛋白4a在制备防治肠道病毒71型感染药物中的应用 | |
| CN114634551B (zh) | 多肽及其在制备拮抗野生型p53与MDM2结合的抗癌药物中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |