CN111825750A - Ace2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用 - Google Patents
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Abstract
ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，涉及人医药技术领域，本发明公开了血管紧张素转化酶II（ACE2）受体保护短肽的氨基酸顺序及其赖氨基酸和C‑16脂肪酸修饰后在预防和治疗新型冠状病毒（SARS‑CoV‑2）感染的应用，同时，从分子、细胞及动物水平检测了这些融合的短肽能高效和特异性靶向阻断SARS‑CoV‑2‑S蛋白RBD与ACE2受体相互作用，最终，以鼻内给药方式予ACE2保护性短肽阻止了病毒侵入靶细胞，1、C6KRBD‑GZ5：[C‑16]KKKKKKYLYRLF；2、C6KRBD‑GZ26：KKKKKKYK[C‑16]YRYLRHGKLR；3、C6KRBD‑GZ28：KKKKKK[C‑16]VEGFVEGFNCYFPLQS。
Description
技术领域
本发明涉及人医药技术领域，尤其是涉及ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用。
背景技术
公知的，世界卫生组织将新型冠状病毒肺炎命名为2019年冠状病毒病(COVID-19)，截至2020年5月，迄今为止尚无有效治疗COVID-19的特异性小分子及蛋白短肽药物，最新研究表明新型冠状病毒（SARS-CoV-2）与SARS-CoV一样，通过S蛋白与人细胞表面ACE2受体的相互作用进行病毒内吞，感染人呼吸道上皮细胞，据报道，ACE2的完整分子和/或其跨膜区，作为SARS特异性受体在感染时与SARS-CoV外壳一起被内吞，此过程对病毒感染至关重要，因此，特异性靶向阻断SARS-CoV-2-S蛋白结合ACE2将是预防和治疗COVID-19有效策略，本研究首次针对SARS-CoV-2-S蛋白RBD的新突变氨基酸残基序列，设计保护人源ACE2蛋白短肽，并在N末端添加赖氨酸修饰，计算机模拟显示，3个短肽具有ACE2高非酶活性位点亲和力，因此，本研究拟用C-16脂肪酸与合成短肽融合增效，并从分子、细胞以及动物水平检测这些短肽能否高效并特异性靶向阻断SARS-CoV-2-S 蛋白RBD与ACE2相互作用，最终，为临床预防和治疗SARS-CoV-2感染提供新的思路和科学依据。
ACE2受体蛋白是SARS-CoV-2感染的关键分子，潜在的ACE2受体结合(保护)剂就有望成为新型冠状病毒感染的治疗药物，普遍认为，从病毒进入细胞、复制、产生子代的整个病毒生命周期来看，病毒如何进入细胞是关键，SARS-CoV-2病毒表面S蛋白是病毒进入细胞的关键“钥匙”，可以打开细胞受体ACE2蛋白的“锁”，从而进入细胞并启动其复制过程。因此，本项目拟研发ACE2受体保护性蛋白短肽，通过识别和阻断这个“钥匙”与“锁”的结合而达到阻断病毒进入细胞的作用。
在前期阿尔海默兹病（AD）合成短肽药物的相似研究工作中，我们意外惊奇发现在人载脂蛋白ApoE-LDL受体结合域(RBD)的短肽N-末端额外添加6个赖氨酸所形成的新短肽能够特异性阻断ApoE介导的淀粉样前体蛋白(APP)的内吞作用，并且不影响APPα-分泌酶切割，此外，在C-16脂肪酸融合这一新短肽后，非常显著地增强其对蛋白酶消化的抵抗能力以及与其受体的结合能力，经过生物学实验已证实该短肽能有效阻断内源性ApoE蛋白与APP病理性结合，减少AD样病理变化，改善认知功能。
研究表明SARS-S1蛋白包含一个与ACE2蛋白有着高亲和性的受体结合区域(RBD)，特别是RBD氨基酸残基424-492主要负责识别细胞的受体，2012德国的研究团队设计和发现了SARS-S蛋白RBD短肽(Y438-L443)能抑制ACE2与SARS-CoV的S蛋白结合，阻止了其病毒与靶细胞的融合，最新的研究表明SARS-CoV-2亦含有该受体结合区域，用于与ACE2受体蛋白的结合及后续的细胞膜融合，SARS-S 蛋白RBD进行同源性比较，德国团队还发现SARS-CoV-2-S蛋白RBD包含21个变异氨基酸残基，其中14个变异分别在集中在Y452-K463和V484-S495氨基酸残基，但未进行变异位点阻断的后续研究，基于此，这些差异是否会影响SARS-CoV-2的宿主选择性和传播能力值得进一步研究。
发明内容
为了克服背景技术中的不足，本发明公开了ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，本发明通过设计了28个SARS-CoV-2-S蛋白质RBD区域蛋白短肽(覆盖N440-S495)，同时分别对这些短肽进行了N末端添加赖氨酸修饰，对这些修饰后的短肽进行了短肽与人ACE2受体蛋白结合对接分析，从分子、细胞以及动物水平检测这些脂肪酸化的合成短肽能否高效并特异性靶向阻断SARS-CoV-2-S 蛋白RBD 与ACE2受体相互作用，最终，为研发ACE2保护性短肽用以防止其病毒感染，进一步为临床预防和治疗SARS-CoV-2感染提供新的思路和科学依据。
ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，包括对所有合成并且修饰的短肽进行计算机模拟短肽-ACE2受体蛋白结合对接分析，以筛选出与人ACE2受体蛋白亲和力最高的短肽；
进一步，通过不同蛋白和/或脂肪酸修饰短肽，获得SARS-CoV-2不同阻断强度候选库，并在体外模型中测试不同修饰短肽对SARS-CoV-2的阻断效果；
进一步，采用人源ACE2受体（hACE2）转基因小鼠模型，在体内模型中测试不同修饰的短肽对SARS-CoV-2的阻断作用；
进一步，分子水平研究C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26、C6KRBD-GZ28和C6K（对照）合成短肽在无细胞系统中是否能抑制重组SARS-CoV-2-S 蛋白RBD与ACE2受体结合；
进一步，在无细胞系统中首先确认重组SARS-CoV-2-S 蛋白RBD与人ACE2受体的结合情况重组SARS-CoV-2-S 蛋白（nS蛋白），将其与人重组ACE2受体蛋白于37℃孵育0.5-4小时，然后与鼠或兔抗人ACE2抗体在4℃进行免疫沉淀孵育5-15小时，通过WB检测nS蛋白与ACE2受体结合情况；
进一步，在无细胞系统中确认C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26和C6KRBD-GZ28合成短肽与人重组ACE2受体蛋白的结合情况将合成的短肽（包括对照C6K短肽）分别与人ACE2受体蛋白于37℃孵育0.5-2.5小时，然后与鼠或兔抗人ACE2抗体在4℃进行免疫沉淀孵育5-15小时。通过WB检测每一种合成短肽和ACE2受体结合情况；
进一步，在无细胞系统中进一步确认C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26和C6KRBD-GZ28合成短肽分别竞争性抑制重组SARS-CoV-2-S 蛋白RBD与ACE2受体结合情况在浓度均为100 nM的合成短肽和重组nS蛋白情况下，将每一种合成短肽（包括C6K对照短肽）分别与重组nS蛋白和人ACE2受体同时在37℃孵育0.5-1.5小时，然后与鼠或兔抗人ACE2抗体在4℃进行免疫沉淀孵育5-15小时，通过WB检测每一种短肽和ACE2受体蛋白结合情况；
进一步，从细胞功能水平研究C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26、C6KRBD-GZ28和C6K合成短肽在II型人肺泡上皮（AT2）细胞中是否能阻止重组SARS-CoV-2-S 蛋白RBD与ACE2受体蛋白结合，以及减轻或阻断其诱导的与SARS-CoV-2感染及复制相关基因表达水平；
进一步，ELISA检测合成短肽在AT2细胞中竞争性抑制重组SARS-CoV-2-S 蛋白RBD与ACE2受体结合情况，在正常生理情况下，ACE2催化并灭活血管紧张素II，并产生血管扩张肽血管紧张素1-7 (Ang 1-7)，按照细胞株公司提供的培养条件，在24孔板（5X106/孔）中培养AT2细胞，分别加入每种合成短肽、 ACE2蛋白受体抑制剂DX600和ACE2蛋白受体激活剂黄酮孵育0.5-3小时后，置于不同浓度的重组nS蛋白下处理1-4小时，然后分别再添加人血管紧张素II并继续培养0.5-4小时，最后，在细胞培养的上清液中，通过ELISA试剂盒检测人血管紧张素1-7含量变化；
进一步，检测合成短肽在AT2细胞中竞争性抑制重组SARS-CoV-2-S 蛋白RBD诱导的与SARS-CoV-2复制及传播相关基因表达情况，最近研究发现SARS-CoV-2感染细胞并巧妙地进化到劫持宿主细胞以便其复制和传播，在24孔板（5X106/孔）中培养AT2细胞，分别加入每种合成短肽、 ACE2受体蛋白抑制剂DX600和ACE2受体蛋白激活剂黄酮孵育0.5-3小时后，置于不同浓度的重组nS蛋白下处理1-4小时后，分别提取AT2细胞中的总RNA，通过RT-qPCR检测细胞中涉及“病毒过程的正向调节” 、“病毒生命周期” 、“病毒组装” 以及“病毒基因组复制的正调节” 的相关基因包括：SLC1A5、 CXADR和CAV2等34个基因；
进一步，从动物水平检测C6KRBD-GZx合成短肽在小动物模型中是否可以防止或减轻重组SARS-CoV-2-S RBD蛋白与人ACE2受体结合以及其可能性引起的SARS-CoV-2感染样病理变化，在重组nS蛋白通过小鼠肺部给药系统肺局部给予hACE2转基因小鼠中，检测重组nSRBD与人ACE2受体结合及其SARS-CoV-2感染样病理变化，将三或四月龄大的hACE2转基因小鼠及其推荐的对照小鼠，测试三组剂量的重组nS蛋白有效结合人ACE2受体蛋白的最小剂量：10 µL PBS的50 (最小)、100 （中度）和200 µg/kg (最大)，以1.5、3 和6 µg 重组nS蛋白/小鼠，在对照小鼠和hACE2 转基因小鼠肺局部给与不同剂量的重组nS蛋白或PBS后 6和18小时处死，尸检观察大体标本，取肺组织常规切片使用小鼠抗SARS-CoV-2 S 蛋白抗体和兔抗人ACE2抗体进行免疫组化和免疫荧光染色实验，与对照组比较，主要观察是否外源性重组nS蛋白与人ACE2结合及其改变，另外，观察是否可见到到间质性肺炎病变，水肿、结构破坏、出血，巨噬细胞浸润等可能性SARS-CoV-2感染样病理变化；
进一步，确定C6KRBD-GZx鼻内（i.n.）给药的最小有效剂量，将从C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26和C6KRBD-GZ28合成短肽中筛选出最有效的C6KRBD-GZx进行后续的动物实验工作，测试三组剂量的C6KRBD-GZx有效地结合人ACE2的最小剂量：5 µL PBS的125 (最小)、250 (中度)和500 µg/kg/天 (最大)，以3.75、7.5和15μg 的C6KRBD-GZx剂量分别鼻内给与hACE2转基因小鼠/天，对照组小鼠和hACE2 转基因小鼠鼻内治疗后1周，尸检观察大体标本，取肺组织常规切片使用小鼠抗C-16抗体和兔抗人ACE2受体抗体进行免疫组化和免疫荧光染色，与对照组比较，主要观察C6KRBD-GZx竞争性与人ACE2受体结合，并且ELISA分析人ACE2受体功能活性以及RT-qPCR分析病毒复制相关基因转录mRNA表达谱，以确定C6KRBD-GZx鼻内给药的最小有效剂量；
进一步，在重组nS蛋白肺局部给予hACE2（nS蛋白/hACE2）转基因小鼠中，检测C6KRBD-GZx短肽是否可以阻断重组nS蛋白与人ACE2受体结合以及减轻或抑制其引起的SARS-CoV-2感染样病理变化，确定C6KRBD-GZx是否可以保护hACE2转基因小鼠免受重组nS蛋白与ACE2结合及其引起的SARS-CoV-2感染样病理变化，采用4月龄hACE2小鼠，即在重组nS蛋白肺局部给与前，用C6KRBD-GZx或C6K (对照) 每天鼻内给药并持续1周。然后重组nS蛋白肺局部给与后6和18小时处死进行尸检观察大体标本，取肺组织常规切片进行免疫组化和免疫荧光染色。本实验中，重组nS蛋白的剂量将根据上一步的结果决定。
进一步，新型冠状病毒（SARS-CoV-2）中和性短肽的氨基酸顺序及其赖氨基酸和C-16脂肪酸修饰后在预防和治疗新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染的应用，同时，从分子、细胞及动物水平检测了这些融合的短肽能高效和特异性靶向阻断SARS-CoV-2-S蛋白RBD与ACE2受体相互作用，最终，以鼻内给药方式予新型冠状病毒中和性短肽阻止了其病毒侵入靶细胞，合成短肽为：
C6KACE2-GZ1： KKKKKK[C-16]DKFNHEADELFY
CACE2-GZ14： DK[C-16]FNHEADELFYMYPLQEIQNLTVGKGDFR
CACE2-GZ8： DK[C-16]FNHEADELFY
CACE2-GZ13： DK[C-16]FNHEADELFYMYPLQEIQNLTV
C6KACE2-GZ7: KKKKKK[C-16]DKFNHEADELFYMYPLQEIQNLTVGKGDFR
CACE2-GZ10： GK[C-16]GDFR
C6KACE2-GZ3： KKKKKK[C-16]GKGDFR
C6KRBD-GZ28 KKKKKK[C-16]VEGFNCYFPLQS
(KKKKKK[Pal]VEGFNCYFPLQS)
C6KRBD-GZ26 KKKKKKYK[C-16]YRYLRHGKLR (KKKKKKYK[Pal]YRYLRHGKLR)
C6KRBD-GZ5 [C-16-]KKKKKKYLYRLF ([Pal]KKKKKKYLYRLF)。
由于采用了上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
本发明首次针对SARS-CoV-2-S蛋白RBD（受体结合区域）的新突变氨基酸残基序列，设计保护人ACE2受体蛋白短肽，并在N末端添加赖氨酸进行修饰，计算机模拟结果显示，理性设计的3个短肽具有ACE2高非酶活性位点亲和力，因此，本发明拟合成并用C-16脂肪酸与合成短肽融合增效，并且从分子、细胞以及动物水平检测这些脂肪酸化的合成短肽能高效并特异性靶向阻断SARS-CoV-2-S 蛋白RBD与ACE2受体相互作用，最终，研发ACE2保护性短肽用于阻断RBD-ACE2受体相互作用以防止病毒感染人体，为临床预防和治疗SARS-CoV-2感染提供新的思路和科学依据。
附图说明
图1为本发明的检测合成短肽抑制重组nS蛋白与ACE2受体蛋白结合情况示意图；
图2为本发明的从细胞功能水平检测合成短肽在人肺AT2细胞中阻止重组nS蛋白与ACE2受体蛋白结合，以及减轻或阻断其诱导的与SARS-CoV-2感染及复制相关基因表达水平情况示意图；
图3为本发明的检测C6KRBD-GZx合成短肽在鼻内治疗的hACE2转基因小鼠中是否可以防止或减轻重组nS蛋白与人ACE2受体蛋白结合以及其可能性引起的SARS-CoV-2感染样病理变化示意图；
图4为本发明的计算机模拟短肽-ACE2受体蛋白结合对接的结构信息3D图示意图；
图5为本发明的总淀粉短肽Aβ释放减少示意图；
图6为本发明的抑制ApoE与LDL受体结合域的结合示意图；
图7为本发明的PC-12（低分化）形态示意图；
图8为本发明的复苏培养基细胞状态示意图；
图9为本发明的复苏培养基第二种细胞状态示意图；
图10为本发明的多肽浓度稀释示意图；
图11为本发明的复苏24小时后细胞计数密度示意图；
图12为本发明的050肽处理15分钟对FC12毒力测定示意图；
图13为本发明的细胞计数密度示意图；
图14为本发明的048肽对PC12细胞毒力检测示意图；
图15为本发明的048肽对PC12细胞毒力检测条形示意图；
图16为本发明的049肽对PC12细胞毒力检测示意图；
图17为本发明的050肽对PC12细胞毒力检测示意图；
图18为本发明的050肽对PC12细胞毒力检测条形示意图；
图19为本发明的检测048肽对PC12细胞的毒力示意图；
图20为本发明的检测049肽对PC12细胞的毒力示意图；
图21为本发明的检测048、049、050肽对PC12细胞的毒力示意图；
图22为本发明的通过MTT的实验方法检测对PC12细胞的毒力对比示意图；
图23为本发明的三条合成肽4μM和500μM的浓度分别处理PC12 细胞对比示意图；
图24为本发明的计算机模拟短肽-ACE2受体蛋白结合对接的结构信息3D图第二示意图。
具体实施方式
通过下面的实施例子可以详细的解释本发明，公开本发明的目的旨在保护本发明范围内的一切技术改进。
实施例1，结合附图1-4、24，实施本发明所述的ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，具体步骤为:
从分子水平检测C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26和C6KRBD-GZ28合成短肽抑制重组SARS-CoV-2 S 蛋白RBD与ACE2受体蛋白结合情况 结合附图1，
进一步，从细胞功能水平检测C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26和C6KRBD-GZ28合成短肽在AT2细胞中阻止重组nS蛋白与ACE2受体蛋白结合，以及减轻或阻断其诱导的与SARS-CoV-2感染及复制相关基因表达水平 结合附图2，
进一步，从动物水平检测C6KRBD-GZx合成短肽在hACE2转基因小鼠中是否可以防止或减轻重组nS蛋白与人ACE2受体蛋白结合以及其可能性引起的SARS-CoV-2感染样病理变化结合附图3，
本发明的实验结果如下：
计算机模拟短肽-ACE2受体蛋白结合对接分析(peptide-protein docking analysis)
与深圳晶泰科技有限公司合作，一共进行了21条设计的多肽与蛋白ACE2的对接计算，每条多肽在对接过程中一共进行了1000次独立计算，根据I_sc结合自由能打分项，得到排名前20的对接结构，求取平均值，计算结果如下：
dG_cross: 多肽-蛋白结合能
dSASA_int: 包埋在接触界面的多肽-蛋白溶剂可接触表面积
sc_value: 多肽-蛋白接触表面形状契合系数（range（0-1））
I_sc: 结合自由能打分项
具体的结构信息查看各个多肽对接完成后的pse文件，并用pymol软件打开查看，pse文件中，绿色的蛋白为ACE2，红色肽段为对接之前的原始构象，黄色部分为对接之后的多肽构象及其与ACE2接触界面的氨基酸（pymol中的interface object），同时展示了接触界面存在的氢键作用（pymol中的polar_conts object）；
可以选取dG_cross < -30的多肽进行后续实验验证，dG_cross越小，说明多肽与该受体的结合的状态越稳定，dSASA_int与sc_value分别反映出多肽与受体结合构象的接触面积和形状是否匹配，值越高越好；
进一步，在人载脂蛋白ApoE LDL结合域（ApoE LDL/RBD）的短肽N-末端额外添正电荷氨基酸（赖氨酸）所形成的新短肽能够特异性阻断ApoE介导的淀粉样前体蛋白(APP)的内吞作用（表现为总淀粉短肽Aβ释放减少），结合附图5-6；
实施例2，实施本发明所述的ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，
Biotin 修饰多肽即短肽的信息为: 048、049、050
产品货号:04010049048
BIOTIN-KKKKKK(Pal)VEGFNCYFPLQS
测定序列(三字母代码):
Biotinlyslyslyslyslyslys(Pal)valgluglypheAsncvstvrpheproleuglnser
纯度:95.23% Molecular 重量: 2637.35
溶解度：1mg/ml in 33%ACN/67%H2O
产品货号:04010049049
BiotinKKKKKKYK(Pal)YRYLRHGKLR Sequence
测定序列(三字母代码):
Biotinlyslyslyslyslyslystyrlys(pal)tyrargTyrLeuArgHisGlyLysLeuArg
纯度:97.99% Molecular 重量: 2886.74
溶解度：1mg/ml in 20%ACN/80%H2O
产品货号：04010049050
BIOTINKKKKKK(Pal)YLYRII
测定序列(三字母代码):
Biotinlyslyslyslys1yslys(Pal)tyr1eutyrargleuphe
纯度:97.80% Molecular 重量: 2107.82
溶解度：1mg/ml in 25%ACN/75%H2O
实验用的细胞株：MG63（人骨肉瘤细胞株）、PC12大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤；
细胞名称：PC-12（低分化）
中文名称：大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤
产品货号：YCL-0480
培养条件：RPMI-1640+10% FBS+1% P/S
生长特性：贴壁
细胞形态：多角形
产品规格：1*10^6cells/T25培养瓶
细胞名称：PC-12（低分化）形态如图7所示，
步骤如下：
复苏培养基：DMEM+10%FBS+双抗，T25培养瓶，37℃和5%CO2温箱中培养，时间202005-0711:30am
细胞状态如附图8-9所示；
进一步，多肽浓度稀释
参考浓度：0~10μM
结合附图10所示，
分析根据三条多肽序列疏水性氨基酸排布均匀，采用无菌水进行多肽溶解 C=n/v m=M*n,分别配置5mL储存液1mM 需要称取， m =M*C*V=M*103M/L*5*103L TJ050 = 2107.82*5*106=0.01g TJ049= 2886.74*5*106=0.014g TJ048=2637.35*5*106=0.013g 稀释10个梯度：20uM、10uM、5uM、2.5uM、1.25uM、0.63uM、0.32uM、0.16uM、0.08uM、0uM
储存液：1mM/L 5mL
稀释
1.20uM/L 80uL(1mM/L) +3920uL(培养基）=4mL
2.10uM/L 1mL(20uM/L)+1mL=2mL 3.5uM/L 1mL(10uM/L)+1mL= 2mL
4.2.5uM/L 1mL(5uM/L)+1mL= 2mL 5.1.25uM/L 1mL(2.5uM/L)+1mL= 2mL
6. 0.63uM/L 1mL(1.25uM/L)+1mL= 2mL 7.0.31uM/L 1mL(0.63uM/L)+1mL= 2mL
8.0.16uM/L 1mL(0.31uM/L)+1mL= 2mL 9.0.08uM/L 1mL(0.08uM/L)+1mL= 2mL
10. 0uM/L
实验时间为：2020年5月11日
进一步，复苏 24 h 后细胞计数 计数密度 4.15x106个/mL
如附图11所示，
进一步，分装96孔板，每孔200uL，1.5x103个/孔，培养32h
进一步，吸取培养液，加90uL药物+110uL培养基，培养箱孵育15min；
进一步，再次吸取含药物的培养液、小心用PBS冲23遍后，再加入含MTT的90uL培养液；
进一步，MTT加入培养4h后，结晶可充分形成，这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul甲瓒 溶解液；
进一步，放入培养箱中继续孵育10min，镜下观察，待结晶全部溶解后490nm测吸光度；
050处理15min 实验结果如下，结合附图12所示：
结果显示：整体随着050肽浓度的降低、细胞死亡数量也降低；浓度0.63uM/L 050肽对FC12细胞毒力最低，数据测定也发现一些问题如下：
1、复孔的均一性不好，下次重复时间是注意加样的准确性；
2、高浓度药物和低浓度药物之间细胞死亡的差异不是很大，是否存在药物作用时间不足，下次延长作 用时间；
3、是否存在结晶未被甲瓒溶解液充分，导致假阳性偏高，下次对甲瓒溶解液效果进行镜检以 后再进行酶标仪测定；
实验时间为2020年5月12日；
进一步，细胞计数，计数密度为 2.18x106/mL，如附图13所示；
进一步，分装96孔板，每孔200uL，3x103个/孔，培养24h ；
050处理4h后实验结果如下：
进一步，细胞计数 计数密度 1.88x106/mL；
进一步，分装96孔板，每孔200uL，3x103个/孔，培养24h；
进一步，050、049、048处理4h后实验结果如下：
048的处理如下，结合附图14、15：
049的处理如下，结合附图16：
050的处理如下，结合附图17、18：
结果表明：通过调整加样过程中每个加样孔细胞均一性，再将050、049、048肽提高浓度对PC12细胞进行4h处理，确定在同样的时间过程中，500uM浓度对PC12没有产生显著性影响，是否时间处理不够，
进一步，增加处理时间设计时间轴；
进一步，重复一次上述实验
实验时间为：2020年5月17日
进一步，重复试验 处理4h MTT检测048肽对PC12细胞的毒力 ，如附图19所示，
进一步，重复试验处理4h MTT检测049肽对PC12细胞的毒力，如附图20所示，
| 500uM/L | 250uM/L | 125uM/L | 63uM/L | 32uM/L | 16uM/L | 8uM/L | 4uM/L |
| 1.8275 | 1.3858 | 1.942 | 1.5483 | 1.9085 | 1.5991 | 1.3674 | 2.035 |
| 1.6398 | 1.6256 | 1.8034 | 1.9096 | 1.8833 | 1.7782 | 1.5082 | 2.12 |
| 1.6172 | 1.7114 | 1.7809 | 1.6193 | 1.6519 | 1.7411 | 1.6495 | 2.1285 |
进一步，处理12h MTT检测048、049、050肽对PC12细胞的毒力，如附图21所示，
结果显示：初步判断048、049、050 三条肽对PC12细胞没有毒害作用。
实施例3，结合附图22所示，实施本发明所述的ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，通过MTT的实验方法检测对PC12细胞的毒力影响；将048、049和050三条合成肽分别梯度稀释为500 μM、250 μM、125 μM、63 μM、32 μM、16 μM、8 μM、 4 μM的浓度，然后分别处理相同数量的PC12细胞4h，最后检测样品间吸光值 （Optical Density ）的变化，结果表明：PC12细胞分别在三条合成肽不同浓度的条件 下处理，样品组间不存在显著性差异间（P>0.05）；
结合附图23所示，选取三条合成肽4μM和500μM的浓度分别处理PC12 细胞，相同条件下处理 12h 后，检测样品间吸光值（Optical Density ）的变化，结果表明：增加处理时间后，三条合成肽处理的样品组间（P>0.05），也不存在显著性差异，综上所述：通过不同浓度和不同时间处理分析，三条合成肽对PC12细胞不存在毒力影响。
本发明未详述部分为现有技术，尽管结合优选实施方案具体展示和介绍了本发明，具体实现该技术方案方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，但所属领域的技术人员应该明白，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围内，在形式上和细节上可以对本发明做出各种变化，均为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，包括对所有合成并且修饰的短肽进行计算机模拟短肽-ACE2受体蛋白结合对接分析，以筛选出与人ACE2受体蛋白亲和力最高的短肽，血管紧张素转化酶II（ACE2）受体保护短肽的氨基酸顺序及其赖氨基酸和C-16脂肪酸修饰后在预防和治疗新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染的应用，同时，从分子、细胞及动物水平检测了这些融合的短肽能高效和特异性靶向阻断SARS-CoV-2-S蛋白RBD与ACE2受体相互作用，最终，以鼻内给药方式予ACE2保护性短肽阻止了病毒侵入靶细胞，合成短肽为：
C6KACE2-GZ1： KKKKKK[C-16]DKFNHEADELFY
CACE2-GZ14： DK[C-16]FNHEADELFYMYPLQEIQNLTVGKGDFR
CACE2-GZ8： DK[C-16]FNHEADELFY
CACE2-GZ13： DK[C-16]FNHEADELFYMYPLQEIQNLTV
C6KACE2-GZ7: KKKKKK[C-16]DKFNHEADELFYMYPLQEIQNLTVGKGDFR
CACE2-GZ10： GK[C-16]GDFR
C6KACE2-GZ3： KKKKKK[C-16]GKGDFR
C6KRBD-GZ28 KKKKKK[C-16]VEGFNCYFPLQS
(KKKKKK[Pal]VEGFNCYFPLQS)
C6KRBD-GZ26 KKKKKKYK[C-16]YRYLRHGKLR (KKKKKKYK[Pal]YRYLRHGKLR)
C6KRBD-GZ5 [C-16-]KKKKKKYLYRLF ([Pal]KKKKKKYLYRLF)
进一步，通过不同蛋白和/或脂肪酸修饰短肽，获得SARS-CoV-2不同阻断强度候选库，并在体外模型中测试不同修饰短肽对SARS-CoV-2的阻断效果；
进一步，采用人源ACE2受体（hACE2）转基因小鼠模型，在体内模型中测试不同修饰的短肽对SARS-CoV-2的阻断作用；
进一步，分子水平研究C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26、C6KRBD-GZ28和C6K（对照）合成短肽在无细胞系统中是否能抑制重组SARS-CoV-2-S 蛋白RBD与ACE2受体结合；
进一步，在无细胞系统中首先确认重组SARS-CoV-2-S 蛋白RBD与人ACE2受体的结合情况重组SARS-CoV-2-S 蛋白（nS蛋白），将其与人重组ACE2受体蛋白于37℃孵育0.5-4小时，然后与鼠或兔抗人ACE2抗体在4℃进行免疫沉淀孵育5-15小时，通过WB检测nS蛋白与ACE2受体结合情况。
2.根据权利要求1所述的ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，其特征是：所述的无细胞系统中确认C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26和C6KRBD-GZ28合成短肽与人重组ACE2受体蛋白的结合情况将合成的短肽（包括对照C6K短肽）分别与人ACE2受体蛋白于37℃孵育0.5-2.5小时，然后与鼠或兔抗人ACE2抗体在4℃进行免疫沉淀孵育5-15小时，通过WB检测每一种合成短肽和ACE2受体结合情况。
3.根据权利要求1或2所述的ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，其特征是：所述的无细胞系统中进一步确认C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26和C6KRBD-GZ28合成短肽分别竞争性抑制重组SARS-CoV-2-S 蛋白RBD与ACE2受体结合情况在浓度均为100 nM的合成短肽和重组nS蛋白情况下，将每一种合成短肽（包括C6K对照短肽）分别与重组nS蛋白和人ACE2受体同时在37℃孵育0.5-1.5小时，然后与鼠或兔抗人ACE2抗体在4℃进行免疫沉淀孵育5-15小时，通过WB检测每一种短肽和ACE2受体蛋白结合情况。
4.根据权利要求1所述的ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，其特征是：所述的细胞的功能水平研究C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26、C6KRBD-GZ28和C6K合成短肽在II型人肺泡上皮（AT2）细胞中是否能阻止重组SARS-CoV-2-S 蛋白RBD与ACE2受体蛋白结合，以及减轻或阻断其诱导的与SARS-CoV-2感染及复制相关基因表达水平。
5.根据权利要求1所述的ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，其特征是：所述的合成短肽通过ELISA检测在AT2细胞中竞争性抑制重组SARS-CoV-2-S 蛋白RBD与ACE2受体结合情况，在正常生理情况下，ACE2催化并灭活血管紧张素II，并产生血管扩张肽血管紧张素1-7 (Ang 1-7)，按照细胞株公司提供的培养条件，在24孔板（5X106/孔）中培养AT2细胞，分别加入每种合成短肽、 ACE2蛋白受体抑制剂DX600和ACE2蛋白受体激活剂黄酮孵育0.5-3小时后，置于不同浓度的重组nS蛋白下处理1-4小时，然后分别再添加人血管紧张素II并继续培养0.5-4小时，最后，在细胞培养的上清液中，通过ELISA试剂盒检测人血管紧张素1-7含量变化。
6.根据权利要求4所述的ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，其特征是：所述的合成短肽在AT2细胞中检测竞争性抑制重组SARS-CoV-2-S 蛋白RBD诱导的与SARS-CoV-2复制及传播相关基因表达情况为SARS-CoV-2感染细胞并巧妙地进化到劫持宿主细胞以便其复制和传播，在24孔板（5X106/孔）中培养AT2细胞，分别加入每种合成短肽、ACE2受体蛋白抑制剂DX600和ACE2受体蛋白激活剂黄酮孵育0.5-3小时后，置于不同浓度的重组nS蛋白下处理1-4小时后，分别提取AT2细胞中的总RNA，通过RT-qPCR检测细胞中涉及“病毒过程的正向调节” 、“病毒生命周期” 、“病毒组装” 以及“病毒基因组复制的正调节”的相关基因包括：SLC1A5、 CXADR和CAV2等34个基因。
7.根据权利要求1所述的ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，其特征是：所述的从动物水平检测C6KRBD-GZx合成短肽在小动物模型中是否可以防止或减轻重组SARS-CoV-2-S RBD蛋白与人ACE2受体结合以及其可能性引起的SARS-CoV-2感染样病理变化，在重组nS蛋白通过小鼠肺部给药系统肺局部给予hACE2转基因小鼠中，检测重组nSRBD与人ACE2受体结合及其SARS-CoV-2感染样病理变化，将三或四月龄大的hACE2转基因小鼠及其推荐的对照小鼠，测试三组剂量的重组nS蛋白有效结合人ACE2受体蛋白的最小剂量：10 µL PBS的50 (最小)、100 （中度）和200 µg/kg (最大)，以1.5、3 和6 µg 重组nS蛋白/小鼠，在对照小鼠和hACE2 转基因小鼠肺局部给与不同剂量的重组nS蛋白或PBS后 6和18小时处死，尸检观察大体标本，取肺组织常规切片使用小鼠抗SARS-CoV-2 S 蛋白抗体和兔抗人ACE2抗体进行免疫组化和免疫荧光染色实验，与对照组比较，主要观察是否外源性重组nS蛋白与人ACE2结合及其改变，另外，观察是否可见到到间质性肺炎病变，水肿、结构破坏、出血，巨噬细胞浸润等可能性SARS-CoV-2感染样病理变化。
8.根据权利要求1所述的ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，其特征是：确定C6KRBD-GZx鼻内（i.n.）给药的最小有效剂量，将从C6KRBD-GZ5、C6KRBD-GZ26和C6KRBD-GZ28合成短肽中筛选出最有效的C6KRBD-GZx进行后续的动物实验工作，测试三组剂量的C6KRBD-GZx有效地结合人ACE2的最小剂量：5 µL PBS的125 (最小)、250 (中度)和500 µg/kg/天 (最大)，以3.75、7.5和15μg 的C6KRBD-GZx剂量分别鼻内给与hACE2 转基因小鼠/天，对照组小鼠和hACE2 转基因小鼠鼻内治疗后1周，尸检观察大体标本，取肺组织常规切片使用小鼠抗C-16抗体和兔抗人ACE2受体抗体进行免疫组化和免疫荧光染色，与对照组比较，主要观察C6KRBD-GZx竞争性与人ACE2受体结合，并且ELISA分析人ACE2受体功能活性以及RT-qPCR分析病毒复制相关基因转录mRNA表达谱，以确定C6KRBD-GZx鼻内给药的最小有效剂量。
9.根据权利要求1所述的ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，其特征是：所述的蛋白在重组nS蛋白肺局部给予hACE2（nS蛋白/hACE2）转基因小鼠中，检测C6KRBD-GZx短肽是否可以阻断重组nS蛋白与人ACE2受体结合以及减轻或抑制其引起的SARS-CoV-2感染样病理变化，确定C6KRBD-GZx是否可以保护hACE2转基因小鼠免受重组nS蛋白与ACE2结合及其引起的SARS-CoV-2感染样病理变化，采用4月龄hACE2小鼠，即在重组nS蛋白肺局部给与前，用C6KRBD-GZx或C6K (对照) 每天鼻内给药并持续1周，然后重组nS蛋白肺局部给与后6和18小时处死进行尸检观察大体标本，取肺组织常规切片进行免疫组化和免疫荧光染色，重组nS蛋白的剂量将根据C6KRBD-GZx鼻内给药的最小有效剂量的结果决定。
10.根据权利要求1所述的ACE2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用，其特征是：合成短肽的信息为：048 049 050
产品货号:04010049048
BIOTIN-KKKKKK(Pal)VEGFNCYFPLQS
测定序列(三字母代码):
Biotinlyslyslyslyslyslys(Pal)valgluglypheAsncvstvrpheproleuglnser
纯度:95.23% Molecular 重量: 2637.35
溶解度：1mg/ml in 33%ACN/67%H2O
产品货号:04010049049
BiotinKKKKKKYK(Pal)YRYLRHGKLR Sequence
测定序列(三字母代码):
Biotinlyslyslyslyslyslystyrlys(pal)tyrargTyrLeuArgHisGlyLysLeuArg
纯度:97.99% Molecular 重量: 2886.74
溶解度：1mg/ml in 20%ACN/80%H2O
产品货号：04010049050
BIOTINKKKKKK(Pal)YLYRII
测定序列(三字母代码):
Biotinlyslyslyslys1yslys(Pal)tyr1eutyrargleuphe
纯度:97.80% Molecular 重量: 2107.82
溶解度：1mg/ml in 25%ACN/75%H2O；
进一步，实验用的细胞株：MG63（人骨肉瘤细胞株）、PC12大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤，细胞名称为：PC-12（低分化）
中文名称：大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤
产品货号：YCL-0480
培养条件：RPMI-1640+10% FBS+1% P/S
生长特性：贴壁
细胞形态：多角形
产品规格：1*10^6cells/T25培养瓶；
实验步骤如下：复苏培养基：DMEM+10%FBS+双抗，T25培养瓶，37℃和5%CO2温箱中培养；
进一步，多肽浓度稀释，参考浓度：0~10μM
三条多肽序列疏水性氨基酸排布均匀，采用无菌水进行多肽溶解 C=n/v m=M*n,分别配置5mL储存液1mM 需要称取， m =M*C*V=M*103M/L*5*103L TJ050 = 2107.82*5*106=0.01g TJ049= 2886.74*5*106=0.014g TJ048=2637.35*5*106=0.013g 稀释10个梯度：20uM、10uM、5uM、2.5uM、1.25uM、0.63uM、0.32uM、0.16uM、0.08uM、0uM
储存液：1mM/L 5mL
稀释
20uM/L 80uL(1mM/L) +3920uL(培养基）=4mL
2.10uM/L 1mL(20uM/L)+1mL=2mL 5uM/L 1mL(10uM/L)+1mL= 2mL
2.5uM/L 1mL(5uM/L)+1mL= 2mL 5.1.25uM/L 1mL(2.5uM/L)+1mL= 2mL
0.63uM/L 1mL(1.25uM/L)+1mL= 2mL 0.31uM/L 1mL(0.63uM/L)+1mL= 2mL
0.16uM/L 1mL(0.31uM/L)+1mL= 2mL 0.08uM/L 1mL(0.08uM/L)+1mL= 2mL
10. 0uM/L ；
进一步，复苏 24 h 后细胞计数 计数密度 4.15x106个/mL
如附图11所示，
进一步，分装96孔板，每孔200uL，1.5x103个/孔，培养32h
进一步，吸取培养液，加90uL药物+110uL培养基，培养箱孵育15min；
进一步，再次吸取含药物的培养液、小心用PBS冲23遍后，再加入含MTT的90uL培养液；
进一步，MTT加入培养4h后，结晶可充分形成，这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul甲瓒 溶解液；
进一步，放入培养箱中继续孵育10min，镜下观察，待结晶全部溶解后490nm测吸光度；
将048、049和050三条合成肽分别梯度稀释为500 μM、250 μM、125 μM、63 μM、32 μM、16μM、8 μM、 4 μM的浓度，然后分别处理相同数量的PC12细胞4h，最后检测样品间吸光值（Optical Density ）的变化；
进一步，将048、049和050三条合成肽以4μM和500μM的浓度分别处理PC12 细胞，相同条件下处理 12h 后，检测样品间吸光值（Optical Density ）的变化。
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