CN113447651A - 筛选SARS-CoV病毒的抑制剂的方法和试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种筛选SARS‑CoV病毒的抑制剂的方法，包括以下步骤：准备SARS‑CoV‑2病毒刺突蛋白的刺突受体结合结构域编码的糖基化多肽和血管紧张素转化酶2，糖基化多肽和/或血管紧张素转化酶2被标记底物标记；在不含有待测样品的反应体系中，使糖基化多肽与血管紧张素转化酶2复合而形成参照复合物；在含有待测样品的反应体系中，使糖基化多肽与血管紧张素转化酶2复合而形成待测复合物；分别对参照复合物和待测复合物进行量化特征参数的检测；利用测得的对应量化特征参数的差值表征抑制剂对SARS‑CoV病毒的抑制程度。利用上述方法可以实现SARS‑CoV病毒的抑制剂的高灵敏度检测。

Description

筛选SARS-CoV病毒的抑制剂的方法和试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及筛选SARS-CoV病毒的抑制剂的方法和试剂盒及其应用。

背景技术

冠状病毒于2019年开始发生传播，至今，由冠状病毒引起的冠状病毒疾病(COVID-19)仍然是全球紧急的公共卫生问题，截至2020年12月，全世界至少报告了7600万冠状病毒疾病病例，其中，死亡例达到160万以上。尽管，几种针对冠状病毒的疫苗已经处于临床试验阶段，但在预期的一段时间内，感染冠状病毒以及由此致死的人数都将继续上升，这将对社会健康和经济发展造成灾难性影响。目前，已对多种药物进行了针对COVID-19的抑制性效果测试，如 Remdesivir.RTM。但是，在这些药物中，很少能够在临床试验中对COVID-19显示出强大抑制效果。因此，COVID-19患者的医院护理将在世界范围内变得司空见惯，并且在严重情况下治疗诸如细胞因子风暴和器官衰竭等并发症将需要加大对新疗法功效的研究。

COVID-19的病原体是急性呼吸综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)，属于冠状病毒科病毒的成员，该病毒会在哺乳动物中引起呼吸系统，肝脏，肠道和神经系统疾病。在2002年之前，冠状病毒仅被称为人类的次要病原体，约占普通感冒的15-25％。然而，由新型冠状病毒SARS-CoV引起的2002年SARS严重暴发的出现，促使公众对由冠状病毒引起的疾病保持警惕。迄今为止，存在七种已知的人畜共患病冠状病毒，它们可引起人类疾病，其中冠状病毒MERS-CoV， SARS-CoV和SARS-CoV-2被确定为严重急性呼吸系统综合症的病因。

如上所述，COVID-19由SARS-CoV-2病毒引起，感染的关键步骤是病毒进入人宿主细胞时，由病毒颗粒表面上的SARS-CoV-2Spike(S)蛋白的受体结合域(RBD)与人体细胞表面上的血管紧张素I转换酶2(ACE2)受体相互作用所致。SARS-CoV-2对人体细胞上的受体血管紧张素转换酶2(ACE2)具有足够的亲和力，可将其用作细胞进入的机制。研究表明，SARS-CoV-2与原始SARS 病毒株相比对人ACE2具有更高的亲和力。跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)引发的初始刺突蛋白引发对于SARS-CoV-2的进入至关重要。SARS-CoV-2病毒体附着到靶细胞后，该细胞的蛋白酶TMPRSS2切开病毒的刺突蛋白，使S2亚基中的融合肽和宿主受体ACE2暴露。融合后，内体在病毒体周围形成，将其与宿主细胞的其余部分分离。当内体的pH降低或宿主组织半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶将其裂解时，病毒粒子会逸出。然后，病毒体将RNA释放到细胞中，并迫使细胞产生并传播病毒的拷贝，从而感染更多的细胞。

当前，可以使用的一种针对SARS-CoV-2病毒的测试是Barnhizer&Faro的测试(美国专利序列号10/844,442)。该测试是经典的酶联免疫球蛋白夹心测定法，为将源自人ACE2蛋白的多肽片段固定在微量滴定板的表面上，利用细菌表达的SARS-CoV-2Spike(S)蛋白受体结合域的片段(S1RBD)与其接触，在去除未结合的S1RBD之后，使用标记的抗S1RBD抗体检测ACE2-S1RBD复合体。但是，该测试的灵敏度较低，需要微克数量的主要目标才能获得可检测的信号。

感染的关键步骤是病毒进入人宿主细胞时，这是由病毒颗粒表面上的SARS-CoV-2Spike(S)蛋白的受体结合域(RBD)与人体细胞表面血管紧张素转化酶2(ACE2) 之间的相互作用。鉴定小分子、抗体(例如病毒中和抗体)或其他干扰S1RBD- ACE2复合物形成的生物分子可以帮助开发预防或治疗COVID-19的药物。因此，需要一种灵敏度高的高通量测试方法，在不需要大量靶多肽的情况下，能够有效鉴定可能存在的S1RBD-ACE2结合抑制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供筛选SARS-CoV病毒的抑制剂的方法和试剂盒及其应用，以提高对SARS-CoV病毒具有抑制效果的化合物的检测灵敏度。

根据本发明的一个方面，提供一种筛选SARS-CoV病毒的抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，准备SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的刺突受体结合结构域编码的糖基化多肽和血管紧张素转化酶2，糖基化多肽和/或血管紧张素转化酶2被标记底物标记；步骤二，在不含有待测样品的反应体系中，使糖基化多肽与血管紧张素转化酶2复合而形成参照复合物；步骤三，在含有待测样品的反应体系中，使糖基化多肽与血管紧张素转化酶2复合而形成待测复合物；步骤四，分别对参照复合物和待测复合物进行量化特征参数的检测；步骤五，利用步骤四测得的对应量化特征参数的差值表征抑制剂对SARS-CoV病毒的抑制程度。

优选地，抑制剂为小分子、抗体或多肽中的至少一种。

优选地，糖基化多肽包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

优选地，糖基化多肽的糖基化位点包括N343-糖基化位点。

优选地，糖基化多肽通过哺乳动物细胞表达获得。

优选地，糖基化多肽被标记底物标记，标记底物为具有Fc区的免疫球蛋白 G。

优选地，标记底物为辣根过氧化酶。

根据本发明的另一个方面，提供一种试剂盒，包括：SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的刺突受体结合结构域编码的糖基化多肽、血管紧张素转化酶2、包含若干个微孔的微量滴定板、洗涤缓冲液、分析稀释剂、标记底物反应液、反应终止液；其中，糖基化多肽和/或血管紧张素转化酶2被标记底物标记。

优选地，糖基化多肽通过哺乳动物细胞表达获得。

优选地，糖基化多肽包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

优选地，糖基化多肽的糖基化位点包括N343-糖基化位点。

可选地，在上述试剂盒中：微孔的表面包被有糖基化多肽，血管紧张素转化酶2上缀合有标记底物。

优选地，标记底物为血管紧张素转化酶2为重组ACE2多肽的纯化的细胞外结构域；标记底物为辣根过氧化物酶；标记底物反应液为含有3,3‘，5,5’-四甲基联苯胺的缓冲液；反应终止液为0.2M硫酸。

根据本发明的另一个方面，提供一种利用上述试剂盒筛选SARS-CoV病毒的抑制剂的方法，包括以下步骤：步骤一，将血管紧张素转化酶2于分析稀释剂中形成溶液，将由此形成的溶液分为测试组溶液和对照组溶液，将待测样品溶于测试组溶液；步骤二，分别向不同的微孔中加入测试组溶液和对照组溶液，孵育；步骤三，弃去微孔内的反应液并利用洗涤缓冲液洗涤微孔；步骤四，向微孔中加入标记底物反应液，孵育，向微孔中加入终止液，立即在450nm的入射光下读取微孔中的溶液的吸光度；步骤五，以对应于对照组溶液的吸光度与对应于测试组溶液的吸光度的差值表征抑制剂对SARS-CoV病毒的抑制程度。

可选地，在上述试剂盒中：微孔的表面包被有血管紧张素转化酶2，糖基化多肽上缀合有标记底物。

优选地，标记底物为具有Fc区的免疫球蛋白G；试剂盒还包括有辣根过氧化物酶偶联的抗免疫球蛋白G的Fc区域的抗体；标记底物反应液为含有3,3‘， 5,5’-四甲基联苯胺的缓冲液；反应终止液为0.2M硫酸。

根据本发明的另一个方面，提供一种利用上述试剂盒筛选SARS-CoV病毒的抑制剂的方法，包括以下步骤：步骤一，将糖基化多肽于分析稀释剂中形成溶液，将由此形成的溶液分为测试组溶液和对照组溶液，将待测样品溶于测试组溶液；步骤二，分别向不同的微孔中加入测试组溶液和对照组溶液，孵育；步骤三，弃去微孔内的反应液并利用洗涤缓冲液洗涤微孔；步骤四，向微孔中加入辣根过氧化物酶偶联的抗免疫球蛋白G的Fc区域的抗体和标记底物反应液，孵育，向微孔中加入终止液，立即在450nm的入射光下读取微孔中的溶液的吸光度；步骤五，以对应于对照组溶液的吸光度与对应于测试组溶液的吸光度的差值表征抑制剂对SARS-CoV病毒的抑制程度。

感染的关键步骤是病毒进入人宿主细胞时，这是由病毒颗粒表面上的 SARS-CoV-2Spike(S)蛋白的受体结合域(RBD)与人体细胞表面血管紧张素转化酶2(ACE2)之间的相互作用。

根据本发明的另一个方面，提供一种利用上述试剂盒检测SARS-CoV病毒的方法，包括以下步骤：步骤一，向微孔中加入待测样品，孵育；步骤二，利用洗涤缓冲液洗涤微孔；步骤三，向微孔中加入缀合有辣根过氧化物酶的血管紧张素转化酶2，孵育；步骤四，利用洗涤缓冲液洗涤微孔；步骤五，向微孔中加入标记底物反应液，孵育。

附图说明

图1为对应实施例1构建的包被有不同来源蛋白与与重组人ACE2的结合情况统计图；

图2为对应实施例1的大肠杆菌中表达与人HEK293T培养细胞表达的 S1RBD与ACE2的结合情况图；

图3为实施例2的实验(1)的去糖基化对ACE2/S1RBD结合情况统计图；

图4为实施例2的实验(2)中经过不同的去糖化酶处理的S1RBD与ACE2 的结合情况统计图；

图5为实施例2的去糖基后的蛋白SDS-PAGE图；

图6为实施例3中不同突变位点的S1RBD与ACE2的结合情况统计图；

图7为实施例3的同突变位点的S1RBD蛋白的SDS-PAGE图；

图8为实施例4中野生型与三个突变体在伪病毒系统对病毒感染的效价变化，图中每组数据所包括的条形图由左至右分别对应标签WT、N331Q、N343Q、 N331/343Q；

图9为实施例4中带有野生型的刺突蛋白及其三个突变体进入A549细胞或 Vero细胞的侵染活性情况统计，图中每组数据所包括的条形图由左至右分别对应标签WT、N331Q、N343Q、N331/343Q；

图10为实施例5中单克隆抗体的中和活性统计图，图中每组数据所包括的条形图由左至右分别对应标签2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、 100ng/mL、0ng/mL；

图11为实施例5中单克隆抗体的中和活性统计图，图中每组数据所包括的条形图由左至右分别对应标签2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、 100ng/mL、0ng/mL；

图12为实施例5中单克隆抗体的中和活性统计图，图中每组数据所包括的条形图由左至右分别对应标签1600ng/mL、800ng/mL、400ng/mL、200ng/mL、 100ng/mL、0ng/mL；

图13为实施例5中单克隆抗体的中和活性统计图，图中每组数据所包括的条形图由左至右分别对应标签2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、 100ng/mL、0ng/mL；

图14为实施例5中使用带有SARS-COV-2S蛋白的伪病毒系统进行中和抗体筛选的结果统计图；

图15为实施例6中S1RBD-ACE2结合测定法进行中和抗体筛选的结果统计图，图中每组数据所包括的条形图由左至右分别对应标签1600ng/mL、800ng/mL、 400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、0ng/mL；

图16为实施例7中小分子抑制剂对S1RBD-ACE2结合的抑制能力统计图，图中每组数据所包括的条形图由左至右分别对应标签200ug/mL、20ug/mL、 2ug/mL、0.2ug/mL、0.02ug/mL、0.002ug/mL、0ug/mL；

图17为实施例7中小分子抑制剂对伪病毒系统感染细胞的阻断能力统计图，图中每组数据所包括的条形图由左至右分别对应标签0、100ug、10ug、1ug、 0.1ug、10ng、1ng、0.1ng；

图18为实施例9所提供的方法一的原理示意图；

图19为实施例9所提供的方法二的原理示意图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。在下述实施例中，所使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而并非旨在进行限制。

针对以下实施例所提供数值范围，则每个干预值到下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定，否则该范围的上限和下限与该所述范围内任何其他声明值或干预值之间，都包括在披露范围内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在较小范围中，并且也应包括在本公开内容之内，但要遵守所述范围内任何明确排除的限制。在所述范围包括一个或两个极限的情况下，排除那些所包括的极限中的一个或两个的范围也包括在本公开中。

除非另有说明，否则以下实施方案中所技术均属于采用本领域技术内现有的医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药理学等技术。

在本实施例向本领域普通技术人员提供的方案中所涉及的参数(例如，数量，温度等)，已尽力确保关于参数数值的准确性，但是应该考虑一些本领域内可接受的误差和偏差。除非另有说明，否则份为重量份，温度为℃，压力为大气压或接近大气压。标准温度和压力定义为20℃和1个大气压。

在详细描述本公开的实施例之前，应理解，除非另外指出，否则本公开不限于特定的材料，试剂，反应材料，制造工艺，尺寸，频率范围，应用或用途。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意于限制。在本公开中，还可能以逻辑上可能的不同顺序执行步骤。还可以将本公开的实施例应用于涉及超出本文描述的示例的测量的附加实施例，这并不旨在进行限制。此外，除了本文描述的示例之外，本公开的实施例可以与其他测量技术组合或集成，这并非旨在进行限制。

应当注意，在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”，“一种”和“该”并不旨在对数量进行限制，还包括复数对象，除非上下文另外明确排除。

本说明书中引用的每个申请和专利，以及每个申请和专利中引用的每个文件或参考文献(包括在进入诉讼程序的专利、引用申请的文件)，以及每个PCT和外国专利，与这些申请和专利中的任何一个相对应和/或要求其优先权的美国专利申请或专利，以及在每个申请引用的文献中引用或引用的每个文献，均明确地通过引用并入本文。此外，本文的参考文献清单或文本本身中引用的文件或参考文献以及上述文件(包括任何制造商的说明书，说明等)中引用的每篇文档或参考文献均明确地通过引用并入本文。

在描述各种实施例之前，除非另外指出，否则所涉及的技术术语按照如下的定义：

ELISA，酶联免疫球蛋白夹心分析；TMB，3,3,5,5'-四甲基联苯胺； SARS-CoV-2，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2；COVID-19，冠状病毒病2019； S1RBD，SARS-CoV-2病毒刺突蛋白(S1)的刺突受体结合结构域。

如本文所用，术语“特异性结合”是指与其他分子的识别相比明显少的一种分子中的两种不同分子的特异性识别。通常，分子在其表面上或在空腔中具有引起两个分子之间的特异性识别的区域。特异性结合的示例是抗体-抗原相互作用。

本文所用的术语“抗体”是指与另一分子的特定空间和极性组织特异性结合并因此被定义为与另一分子的特定空间和极性组织互补的免疫球蛋白。该抗体可以是单克隆抗体，多克隆抗体或重组抗体，并且可以通过本领域众所周知的技术来制备，例如宿主的免疫和血清的收集(多克隆)，或者通过制备连续的杂交细胞系并收集分泌的蛋白(单克隆)，或通过克隆和表达核苷酸序列或其诱变形式，至少编码天然抗体特异性结合所需的氨基酸序列。抗体可以包括完整的免疫球蛋白或其片段，该免疫球蛋白包括各种类型和同种型，例如IgA，IgD，IgE，IgG1， IgG2a，IgG2b和IgG3，IgM，IgY等。其片段可以包括Fab，Fv和F(ab')2，Fab'，scFv等。另外，可以适当地使用免疫球蛋白或其片段的聚集体，聚合物和缀合物，只要维持对特定分子的结合亲和力即可。

抗体可以源自任何来源，包括但不限于鼠种，大鼠，兔，鸡，人或任何其他来源(包括人源化抗体)。产生可以特异性识别并结合的抗体的技术是本领域已知的。

如本文所用，术语“抗原”是指与抗体结合并诱导抗体上的至少一个共享构象表位的任何实体。抗原可以是蛋白质，肽，抗体，小分子，脂质，碳水化合物，核酸和过敏原。抗原可以是纯净形式，也可以是抗原与其他成分混合在一起的样品。特别地，本公开的方法旨在检测特异性识别并结合SARS-CoV-2病毒的S 和/或N多肽的表位的人或动物免疫球蛋白。

如本文所用，术语“严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)”是指引起冠状病毒病2019(COVID-19)的冠状病毒株，所述冠状病毒病是引起 COVID-19大流行的呼吸道疾病。SARS-CoV-2，之前被临时名称称为2019新型冠状病毒(2019-nCoV)，也被称为人冠状病毒2019(HCoV-19或hCoV-19)。 SARS-CoV-2是巴尔的摩IV类正链单链RNA病毒，在人类中具有传染性。

每个SARS-CoV-2病毒体的直径为50-200nm。像其他冠状病毒一样， SARS-CoV-2具有四种结构蛋白，分别称为S(穗)，E(包膜)，M(膜)和N (核衣壳)蛋白。N蛋白保留RNA基因组，而S，E和M蛋白共同形成病毒包膜。在原子水平成像的刺突蛋白负责使病毒附着在宿主细胞的膜上并与之融合。具体而言，其S1亚基催化附着，即S2亚基融合。

如本文所用，术语“生物样品”可以指源自血液，优选外周血(或循环血) 的样品。血液样品可以是全血、通过手指刺或干血样品获得的血液、血浆、血清或此类流体的增溶制剂，其中细胞组分已被裂解以将细胞内内容物释放到缓冲液或其他液体介质。

如本文所用，术语“结合”是指第一多肽分子和第二多肽之间类型的非共价相互作用。结合相互作用的强度或亲和力可以根据相互作用的解离常数(Kd) 表示，其中较小的Kd代表较大的亲和力。所选多肽的结合特性可以使用本领域众所周知的方法定量。一种这样的方法需要测量两个相互作用的多肽的复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物伴侣的浓度，相互作用的亲和力以及相等地影响两个方向上的速率的几何参数。因此，“开速率常数”(Kon)和“开速率常数”(Koff)都可以通过计算浓度和缔合和解离的实际速率来确定。Koff/ Kon的比率使得能够消除与亲和力无关的所有参数，因此等于解离常数Kd。

如本文所用，术语“表面”是指固体支持物，例如微量滴定板的孔的底部的表面。所涉及的固体载体可以是多孔的或无孔的，平面的或非平面的，并且包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯载体。作为另一个实例，本发明的多肽可以有效地连接至用于ELISA的微量滴定板的表面。

如本文所用，术语“标签”是指与分子例如肽或多肽缀合的部分，其需要标记但不一定具有连接的标记。标签可以允许标签或标记的部分特异性结合标签。标签可以是被标记部分可以结合的小分子，例如肽的较大分子，肽可以但不限于六组氨酸链、多肽链如的多肽或组合，抗体的Fc区的任何其可通过适当选择的标记部分。

“可检测地标记”是指多肽或其片段，其包含引发物理或化学反应的部分，荧光团或染料，其反应结果可以用肉眼观测或通过诸如而不限于色度计，UV分光光度计等设备检测。

如本文所用，术语“包被于微孔表面”是指在特定位置附着于底物的多肽，使得其可以经受洗涤或其他物理或化学处理而不会脱落。作为微孔表面的固体支持物及其固定方法是本领域已知的。

如本文所用，术语“表达的”和“表达”是指从基因转录以产生至少部分地与基因的两条核酸链之一的区域互补的RNA核酸分子。如本文所用，术语“表达的”或“表达的”也指从所述RNA核酸分子的翻译以产生蛋白质，氨基酸序列或其一部分。如本文所用，术语蛋白质或核酸的“片段”是指氨基酸序列的任何部分。

如本文所用，术语“免疫球蛋白”是指一类蛋白质，其表现出抗体活性并以高度特异性结合至其他分子(例如，抗原和某些细胞表面受体)。免疫球蛋白可分为五类：IgM，IgG，IgA，IgD和IgE。IgG是体内最丰富的抗体类别，并呈扭曲的“Y”形构型。除IgM外，免疫球蛋白由通过链内和链间二硫键连接的四个肽链组成。IgG由通过非共价二硫键连接的两条多肽重链(H链)和两条多肽轻链(L链)组成。

术语“Fc区”可以结合许多效应分子和其他蛋白质，包括提供体液免疫应答和细胞介导的效应系统之间联系的细胞Fe受体(Hamano等人，(2000) J.Immunol.164：6113-6119；Coxonet等，(2001)Immunity 14：693-704；Fossatiet 等，(2001)Eur。J.Clin。Invest。31：821-831)。Fc 1受体对IgG分子具有特异性，包括Fc 3RI，Fc 3R IIa，Fc 3R IIb和Fc 3RIII。这些同种型以不同的亲和力与单体和免疫复合的IgG结合。术语“多肽”包括蛋白质及其片段。多肽在本文中作为氨基酸残基序列公开。

本文所用的术语“重组”是指核酸分子，是指基因组，cDNA，半合成或合成来源的多核苷酸，由于其来源或操作，其：(1)与所有或全部不相关与多核苷酸天然相关的部分；和/或(2)与除其本质上所连接的多核苷酸以外的多核苷酸连接。就蛋白质或多肽而言，术语“重组”是指通过表达重组多核苷酸产生的多肽。

如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变以外，构成该群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原具有高度特异性。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”不应解释为要求通过任何特定方法产生抗体。

如本文所用，术语“小分子”是指分子量小于约2kDa的有机化合物，包括有机金属化合物，不是多核苷酸，多肽，多糖或由多种组成的合成聚合物。重复单元。

本文所用的术语“多肽”是指氨基酸的任何聚合物链。术语“肽”和“蛋白质”与术语多肽可互换使用，并且还指氨基酸的聚合物链。术语“多肽”涵盖天然或人工蛋白质，蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体的或聚合的。除非另有说明，否则本文中“多肽”的使用旨在涵盖多肽及其片段和变体(包括变体的片段)。

如本文所用，术语“样品”以其最广义使用。如本文所用，“生物样品”包括但不限于来自生物或先前生物的任何数量的物质。这些生物包括但不限于人类，小鼠，大鼠，猴子，狗，兔子和其他动物。这类物质包括但不限于血液(例如全血)，血浆，血清，尿液，羊水，滑液，内皮细胞，白细胞，单核细胞，其他细胞，器官，组织，骨髓，淋巴结和脾脏。

术语“对照”是指已知不包含分析物(“阴性对照”)或包含分析物(“阳性对照”)的组合物。阳性对照可以包含已知浓度的分析物。“对照”，“阳性对照”和“校准物”在本文中可以互换使用，是指包含已知浓度的分析物的组合物。“阳性对照”可用于建立测定性能特征，并且是试剂(例如分析物)完整性的有用指示。

如本文所用，术语“特异性”和“特异性”是在特异性结合对的成员(例如，抗原(或其片段)和抗体(或其抗原反应片段))之间相互作用的情况下。短语“特异性结合”和类似短语是指抗体(或其抗原反应性片段)特异性结合分析物(或其片段)而不特异性结合其他实体的能力。

如本文所用，术语“血管紧张素转化酶2(ACE2)”是附着于位于肺，动脉，心脏，肾脏和肠的细胞的细胞膜上的酶。ACE2蛋白包含一个N端肽酶M2域和一个C端collectrin肾氨基酸转运蛋白域。ACE2是单程I型膜蛋白，其酶活性结构域暴露在肺和其他组织的细胞表面。ACE2的细胞外结构域被另一种称为 sheddase的酶从跨膜结构域切割，所产生的可溶性蛋白释放到血流中并最终作为尿液排出。

实施例1

实验设置方式：本实施例所采用的蛋白分别由人HEK293T培养细胞和大肠杆菌表达获得，分别采用重组SARS-CoV-2S蛋白S1RBD结构域、重组 SARS-CoV-2S蛋白S2结构域、重组SARS-CoV-2S核衣壳(N)蛋白、P24蛋白包被微量滴定板，制作SARS-CoV-2S蛋白S1RBD结构域包被的微量滴定板、 SARS-CoV-2S蛋白S2区域包被的微量滴定板、N蛋白包被的微量滴定板、P24 蛋白包被的微量滴定板。分别使上述制得的微量滴定板与重组人ACE2温育。

实验结果：如图1所示，通过比对利用来自不同来源细胞表达得到的不同重组蛋白包被的微量滴定板与ACE2的结合情况，无论是来自人HEK293T培养细胞表达得到的重组蛋白还是来自大肠杆菌表达得到的重组蛋白，由重组 SARS-CoV-2S蛋白S1结构域包被的微量滴定板与ACE2结合的信号值最高，由此证明，SARS-CoV-2S蛋白与ACE2特异性结合的区域是S1结构域(S1RBD)。此外，在参加本实施例设置的温育实验的微量滴定板中，由哺乳动物细胞表达的重组SARS-CoV-2S蛋白S1RBD包被的微量滴定板所获得的结合信号值明显高于由其他蛋白(区域)包被的微量滴定板所获得的结合信号值，从而说明通过在人HEK293T培养细胞中表达产生的重组SARS-CoV-2S1RBD与人ACE2结合，具有显着更强的亲和力。分别将利用来自人HEK293T培养细胞、大肠杆菌表达得到的SARS-CoV-2S1RBD包被的微量滴定板与不同剂量的ACE2经过温育后得到的产物进行吸光度测试(入射光为450nm)，结果如图2所示，与大肠杆菌表达的S1RBD相比，人HEK293T培养细胞表达的S1RBD显示出明显的依赖于剂量的结合活性。这些数据表明真核生物特异性翻译后修饰影响ACE2/S1RBD 结合亲和力。

实施例2

实验设置方式：

本实施例用于进行实验的重组SARS-CoV-2S蛋白为人HEK293T培养细胞表达的重组SARS-CoV-2S蛋白，本实施例所涉及的去糖基化处理指的是去除N 和O-连接聚糖。

实验(1)：分别采用未经去糖基化处理以及经过去糖基化处理的重组 SARS-CoV-2S蛋白的S1RBD包被96孔微量滴定板，向不同的微量滴定板中分别加上未经糖基化处理以及经过去糖基化处理的ACE2，进行ACE2/S1RBD结合反应。

实验(2)：为了进一步研究哪些聚糖键在ACE2与S1 RBD结合中起作用，用特异性靶向不同糖基化键的去糖基化酶处理了S1RBD。利用使用不同的去糖基化酶处理S1RBD蛋白，所采用的去糖基化酶包括：PNGase F，O-糖苷酶，α2-3、 6、8、9神经氨酸酶A，β1-4个半乳糖苷酶S，β-N-乙酰基己糖胺和EndoH。将未去糖基化经处理和利用不同的去糖化酶进行去糖基化的S1RBD蛋白分别包被在不同的96孔板上。将一系列浓度(0、20、40、60、80、100ng/ml)的ACE2 蛋白加入上述96孔板的孔中，并使用抗ACE2抗体和HRP偶联的二抗检测结合的ACE2蛋白。

实验结果：

实验(1)：如图3所示，对于未经去糖基化处理的S1RBD蛋白，随着ACE2 蛋白(包括未经去糖基化处理以及经过去糖基化处理的ACE2)浓度的增加，检测到ACE2/S1RBD的结合信号值(产物与450nm下的吸光度)增加。与此相比，使用去糖基化的S1RBD蛋白包被的96孔板中，随着ACE2蛋白(包括未经去糖基化处理以及经过去糖基化处理的ACE2)浓度的增加，未检测到ACE2/ S1RBD的结合信号值的增加。另一方面，由图3也可以说明，ACE2的去糖基化对ACE2/S1RBD结合的影响极小。综上，S1RBD蛋白糖基化对于ACE2/ S1RBD的结合是必不可少的。

实验(2)：如图4所示，在参试的去糖化酶中，只有用PNGase酶处理切割 S1 RBD的N-连接寡糖，才能显着降低ACE2与S1 RBD的结合亲和力。由此说明S1RBD蛋白的N-连接糖基化对于ACE2/S1RBD的结合必不可少。

通过SDS-PAGE分析对纯化的重组S1RBD和ACE2蛋白进行去糖基化情况。如图5所示：泳道1：蛋白质标准品(kDa)；泳道2：纯化的哺乳动物细胞表达的S1RBD和ACE2蛋白；泳道3：在天然条件下用去糖基化酶处理的蛋白质；泳道4：在变性还原条件下用去糖基化酶处理的蛋白质。去糖基化处理导致蛋白质的迁移率变化。

实施例3

实验设置方式：在S1RBD上的Asn343糖基化位点对于与ACE2结合作用是必不可少的：SARS-CoV-2S蛋白具有22个假定的糖位点，这取决于NXS/T， X≠P基序序列的存在(Zhanget等人，(2020)Mol。细胞蛋白质组学)。在这些位点中，N331和N343位于RBD上，并已被证明是n-糖基化突变为谷氨酰胺时，可显着降低病毒的感染性(Li等人，(2020)Cell182：1284-1294)。为了确定这些残基在结合过程中是否在ACE2/S1RBD分子相互作用中起作用，研究制备了三个突变的S1 RBD重组体：N343Q，N331Q和N343Q/N331Q双突变。利用这些突变体以及野生型S1 RBD分别与ACE2进行温育，测量ACE2/S1RBD 结合活性。

实验结果：如图6所示，ACE2/S1RBD的结合力在采用S1 RBD的N343Q 突变体和N331Q/N343Q突变体的实验组中基本丧失，而在采用N331Q突变体的实验组与采用野生型的实验组所对应的ACE2/S1RBD结合活性变化不大。通过SDS-PAGE分析对纯化的重组S1RBD和ACE2蛋白进行去糖基化情况，结果如图7所示。

实施例4

实验设置方式：构建一种伪病毒系统，该伪病毒系统的病毒颗粒表面表达 SARS-CoV-2S1 RBD，而编码荧光素酶的质粒则是包含在病毒颗粒是内部。当将 S蛋白应用于培养的哺乳动物细胞时，它会结合ACE2受体，病毒颗粒的膜和宿主细胞融合，从而将质粒释放到表达萤光素酶的细胞中。本实施例所采用的伪病毒系统包括S1RBD的野生型版本，除此以外，还包括突变型的伪病毒，伪病毒在S1RBD的病毒表面突变版本上表达，即N343Q突变、N331Q突变和N343Q/ N331Q双重突变。分别使带有SARS-COV-2野生型的刺突蛋白以及N331Q突变体、N343Q突变体和N331/343Q突变体进入A549细胞或Vero细胞。感染后24小时，通过测定细胞裂解物中的萤光素酶活性以及与野生型的发光相对比来分析进入伪病毒的变化。

实验结果：测量被感染细胞内的萤光素酶活性(图8和图9)表明，S1RBD 的N331和N343处的双重糖基化缺失导致病毒感染性大幅降低(抑制率>80％)。此外，N331Q处的单个缺失引起了S1RBD的感染性反生了适度的下降，然而下降的幅度较小，降低了不到20％。而N343Q处的单个缺失引起了S1RBD的感染性下降幅度约为50％。这些数据表明，S1RBD中的双重糖基化突变(N331Q 和N343Q)显着降低了感染性，由此说明S1 RBD区的两个糖基化位点可能参与受体的结合或维持RBD区的构象。

实施例5

实验设置方式：使用带有SARS-COV-2S蛋白的伪病毒系统进行中和抗体筛选。利用伪病毒中和试验(PVNT)分析筛选小鼠抗S1RBD单克隆抗体的中和活性，采用商业中和抗体MM57(Sinobio)用作阳性对照。本实施例所开展的 PVNT实验的实验温度为37℃，利用伪病毒携带SARS-COV-2S糖基化蛋白的部分参试抗体通过接种进入A549细胞，在感染后24小时，通过确定细胞中裂解物的萤光素酶活性来测量发光相对比率得到抑制率百分比。

实验结果：图10～13展示了参试抗体的浓度系列PVNT实验结果，一系列浓度。横向比对各参试抗体在不同浓度下的PVNT实验结果，结果如表1和图 14所示，其中，单克隆抗体807、814、844和845对SARS-COV-2-S感染的抑制率达到50％以上，能够阻止SARS-COV-2-S进入A549细胞。

表1本实施例参试抗体的SARS-COV-2-S感染的抑制情况统计

实施例6

实验设置方式：分别利用实施例5所采用的抗体进行中和抗体筛选实验。将每种参试抗体的系列稀释液(1600、800、400、200、100、0ng/ml)将其与ACE2 蛋白混合，然后添加到S1RBD蛋白包被的96孔板中。洗涤除去未结合的ACE2，并用抗ACE2抗体和HRP偶联的二抗。然后在450nm处测量样品呈黄色的强度，计算并显示出样品与单独的ACE2对照的信号比(OD)。

实验结果：如图15所示，单克隆抗体807对ACE2和S1RBD的结合表现出明显的抑制作用。

实施例7

本发明方法与伪病毒系统验证SARS-COV-2S蛋白与ACE2结合抑制物的应用比较

实验设置方式：

实验(1)：以卡莫司他(Camostat mesylate)和DMSO作为阴性对照，鉴定扎鲁司特(Zafirlukast)和头孢哌酮(Cefoperazone)对ACE2和S1RBD结合的抑制能力。分别将待测化合物的系列稀释液(200ug/ml、20ug/ml、2ug/ml、0.2ug/ml、 0.02ug/ml、0.002ug/ml、0ug/ml)与ACE2蛋白混合，然后添加到S1RBD蛋白包被的96孔板中。洗涤除去未结合的ACE2，并用抗ACE2抗体和结合了HRP的二抗检测结合的ACE2。然后在450nm处测量样品呈黄色的强度，计算并显示出样品与单独的ACE2对照的信号比(OD)。

实验(2)：分别利用扎鲁司特(Zafirlukast)、头孢哌酮(Cefoperazone)、卡莫司他(Camostat mesylate)、DMSO参与应用SARS-COV-2S蛋白的伪病毒系统开展的PVNT，所采用的宿主细胞为A549。

实验结果：实验(1)的结果如图16所示，Zafirlukast对ACE2和S1RBD的结合表现出明显的抑制作用。而实验(2)的结果如图17所示，Zafirlukast对假病毒进入宿主A549细胞具有阻断作用。本实施所构建的S1RBD-ACE2结合系统与伪病毒系统都能够验证Zafirlukast对SARS-COV-2S蛋白与ACE2结合的抑制能力，而采用Cefoperazone或作为阴性对照的两种化合物进行的实验均未观察到抑制 SARS-COV-2S蛋白与ACE2结合的作用效果。图17为不同浓度条件下的抑制剂对 SARS-COV-2S蛋白与ACE2结合的抑制作用。

实施例8

为了确定中和测试用于测量COVID-19患者血清的中和活性，从康复患者中获得15份血清并使用PVNT分析进行测试。结果表明，它们均以浓度依赖的方式抑制SARS-COV-2-S-的进入，，而对VSV-G-(水泡性口炎病毒)并无表现抑制效果，当健康人的血清用作正常对照时，未观察到抑制作用。由此证明， COVID-19患者血清对SARS-COV-2-S表现出高水平的中和活性(对 SARS-COV-2-S的进入具有阻断作用)。

实施例9

SARS-CoV-2的S蛋白的一个显着特征是，它被多达100个N-连接的聚糖广泛修饰，这一过程是通过病毒劫持宿主的糖基化途径而发生的。病毒结构(例如 S蛋白)的糖基化通过掩盖抗原表位而有助于病毒宿主逃避免疫。结构数据和糖蛋白组学分析一起提出，刺突蛋白的广泛糖基化屏蔽了中和抗体的进入(Xionget 等人，(2018)J.Virol.92(4)：1-16)。重要的是，在进入宿主细胞期间，S蛋白上的聚糖可能在S的稳定性以及由此产生的宿主细胞受体相互作用和细胞膜融合中都没有发挥重要作用。基于此，迫切需要表征SARS-CoV-2S蛋白糖基化的相对影响，以鉴定与ACE2相互作用的分子基础，以及聚糖对SARS-CoV-2感染性的影响。

本实施例提供的测试方案原理与ELISA的原理相似，其依据是：衍生自SARS-CoV-2(Covid-19)病毒刺突蛋白的受体结合结构域(S1RBD)的糖基化多肽片段并且对血管紧张素转换酶2(ACE2)的细胞外结构域具有亲和力。本实施例提供两种筛选SARS-CoV病毒的抑制剂的方式，其所对应的检测原理分别如图18和图19所示。

方法一，如图18，将哺乳动物细胞表达的糖基化S1RBD多肽固定在固相载体的表面，向固相载体表面添加含有ACE2和待测抑制剂的混合物，孵育，混合物中的抑制剂将和ACE2相互竞争与S1RBD多肽复合，活性较高的抑制剂将阻止ACE2与S1RBD多肽复合。

以下将基于方法一的反应原理以具体说明本实施例所提供的用于筛选 SARS-CoV病毒的抑制剂的实际操作方式。采用表面包被有糖基化S1RBD多肽的固相载体，为了检测或鉴定潜在的抑制剂，在不存在怀疑是抑制剂的化合物的情况下进行第一测定，将哺乳动物ACE2蛋白的片段(最有利地是人ACE2衍生的多肽)与固相载体进行孵育，洗涤除去未与糖基化S1RBD多肽结合的ACE2 多肽，然后将抗ACE2特异性IgG抗体加至孔中。将辣根过氧化物酶标记的(例如)抗IgG抗体在3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物存在的情况下添加到孔中。与第一次测试同时进行第二次平行测试，其中将一定量的怀疑是抑制剂的化合物哺乳动物ACE2蛋白的片段一起添加到固相载体表面，进行孵育，洗涤除去未与糖基化S1RBD多肽结合的ACE2多肽，然后将抗ACE2特异性IgG抗体加至孔中。将辣根过氧化物酶标记的(例如)抗IgG抗体在3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物存在的情况下添加到孔中。在上述过程中，抗ACE2抗体首先结合与固定在表面的S1RBD结合的ACE多肽，然后结合标记的抗IgG抗体与TMB溶液反应，产生与结合的ACE2量成比例的蓝色。蓝色的强度与结合的 ACE2的数量成正比。加入终止溶液可终止HRP-TMB反应，导致颜色由蓝变黄。然后在450nm处测量黄色的强度。对比上述两次测试得到的产物的颜色，与第一次测试的产物相比，第二次测试的产物的黄色深度降低的程度可以表明待测抑制剂的抑制强度。

方法二，如图19，将ACE2固定在固相载体的表面，向固相载体表面添加含有免疫球蛋白Fc区标签标记的哺乳动物细胞表达的糖基化S1RBD多肽和待测抑制剂的混合物，孵育，混合物中的抑制剂将和S1RBD多肽相互竞争与ACE2 复合，活性较高的抑制剂将阻止S1RBD多肽与ACE2复合。

以下将基于方法二的反应原理以具体说明本实施例所提供的用于筛选 SARS-CoV病毒的抑制剂的实际操作方式。采用表面包被有ACE2的固相载体，为了检测或鉴定潜在的抑制剂，在不存在怀疑是抑制剂的化合物的情况下进行第一测定，利用缀合有免疫球蛋白IgG的糖基化S1RBD多肽与固相载体孵育，洗涤除去未与ACE2结合的糖基化S1RBD多肽，然后将对免疫球蛋白Fc区特异的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗免疫球蛋白G(IgG)抗体与3,3'，5,5'一起应用到孔中-四甲基联苯胺(TMB)底物。与第一次测试同时进行第二次平行测试，其中将一定量的怀疑是抑制剂的化合物与缀合有免疫球蛋白IgG的糖基化 S1RBD多肽一起添加到固相载体表面，进行孵育，洗涤除去未与ACE2结合的糖基化S1RBD多肽，然后将对免疫球蛋白Fc区特异的辣根过氧化物酶(HRP) 缀合的抗免疫球蛋白G(IgG)抗体与3,3'，5,5'一起应用到孔中-四甲基联苯胺 (TMB)底物。在上述过程中，与HRP结合的抗IgG抗体将与结合到固定在固相载体表面的ACE2多肽上的S1RBD多肽特异性结合，与TMB溶液反应，并产生蓝色，蓝色的强度与结合的S1RBD的数量成正比。加入终止溶液可终止 HRP-TMB反应，导致颜色由蓝变黄。然后在450nm处测量黄色的强度。对比上述两次测试得到的产物的颜色，与第一次测试的产物相比，第二次测试的产物的黄色深度降低的程度可以表明待测抑制剂的抑制强度。

本实施例提供的两种测试方法中，两个相互作用的组分的取向可以等同地用于检测S1RBD/ACE2相互作用的抑制剂。但是，ACE2多肽固定在表面的方向 (方法二)，既可以可用于检测S1RBD/ACE2复合的抑制剂，也可用于检测用 S1RBD试剂添加到孔中的样品中的病毒或游离刺突蛋白，相当于提供了一种快速灵敏且特异性的SARS-CoV-2测定法，用于检测来自怀疑患有SARS-CoV-2 (Covid-19)的受试者的生物样品中的完整SARS-CoV-2(Covid-19)病毒颗粒。

实施例10

本实施例提供一种试剂盒，包括：

固定有重组ACE2细胞外结构域的微量滴定板(A项)，上述微量滴定板为 96孔(12条x 8孔)ACE2微孔板；

25ml洗涤缓冲液(B项)，上述洗涤缓冲液为20x浓缩溶液(20x：氯化钾， 0.4％；氯化钠，16％；磷酸二氢钾；0.4％，磷酸二钠；吐温20，1.0％)；

检测抗体(C项)；

25μL HRP偶联的抗Fc区抗体浓缩物(D项)，上述抗体浓缩物为1000x浓缩的HRP偶联的抗山羊IgG；

15mL分析稀释剂(E2项)，所述分析稀释剂为5x浓缩磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，用于稀释测试试剂，其中含有0.15％5-溴-5-硝基-1,3-二恶烷(BND)； 7.5％牛血清白蛋白(BSA)；1.25％Tween-20；

S1RBD标志蛋白(F项)，2小瓶纯化的人重组糖基化S1RBD标志蛋白(1 小瓶足以测定一半微孔板)；

12m标志物反应液(H项)，上述标志物反应液为3,3'，5,5'-四甲基联苯胺 (TMB)一步底物试剂；

8mL反应终止液(I项)，上述反应终止液为0.2M硫酸。

本实施例所提供的试剂盒的最佳储存方式为：

试剂盒应保存在-20℃或更低的温度下，并在装运之日起6个月内使用。初次使用后，应将洗涤缓冲液(B项)，分析稀释剂(E2项)，标志物反应液(H 项)，反应终止液(I项)保存在4℃下，以避免重复的冻融循环。将未使用的孔放回装有干燥剂包的袋中，沿整个边缘重新密封并在-20℃下储存。S1RBD标志蛋白(F项)应存储在-80℃下。检测抗体(C项)和HRP偶联的抗Fc区抗体浓缩物(D项)在2-8℃下最多可保存1个月(在-20℃下最多可保存6个月，避免重复冻融循环)。

上述试剂盒与以下设备配合使用：能够测量450nm吸光度的酶标仪、摇床、移液器(可输送2μl至1ml的体积)、1-25毫升用于调试或校准移液器的试剂、 (100毫升和1升)量筒、蒸馏水或去离子水、准备样品稀释液的试管。

本实施例利用本实施例所提供的试剂盒对测试待测物A对S1RBD-ACE2复合物的抑制能力进行测试。

1.处理组设置方式：

将测试试剂(例如，潜在的抑制剂，例如但不限于小分子或抗体)与S1RBD 标签蛋白浓缩物混合，然后用1x稀释的稀释剂稀释混合物以制成1x S1RBD标记蛋白的工作浓度。每个样品应包含相同的1x S1RBD标记蛋白质浓度。

所有样本至少要重复运行两次。对于初始实验，可以进行系列稀释(例如5 倍至5000倍)以确定要使用的最佳测试试剂量。

为了测试待测物A抑制S1RBD-ACE2结合的能力，在六个独立的试管中稀释100mM储备液以创建20mM，2mM，0.2mM，0.02mM，0.002mM和0mM 的稀释系列：

分别向所设置的六个试管中加入2.5μL S1RBD标志蛋白浓缩液和197.5uL 1x分析稀释液(E2项)，彻底混合。将化合物A的储备液分别稀释至20mM，2 mM，0.2mM，0.02mM，0.002mM，分别取上述稀释液各50μL加入至上述其中五个独立的试管中，设置一个试管(空白对照)不加入化合物A，分别将每支试管中的物料彻底混合。对每个连续的浓度重复此步骤。对于每种稀释液，使用 225μl 1x S1RBD-tag蛋白工作溶液和25μl的先前浓度，直到达到最终浓度。在下次传输之前，将各管彻底混合。

2.前处理操作

2.1使用前，将所有试剂和样品置于室温(18-25℃)；

2.2E2项在使用前应用去离子水或蒸馏水稀释5倍。

2.3B项包含可见的晶体，则温热至室温并轻轻混合直至溶解，将20mL 洗涤缓冲液(B项)利用去离子水或蒸馏水稀释，得到400mL 1x洗涤缓冲液；

2.4应用1x分析稀释剂将S1RBD标签蛋白工作溶液稀释100倍：摇晃装有S1RBD标志蛋白(F项)的小瓶，在装有S1RBD标志蛋白的小瓶中加入100 μL 1x分析稀释液(E2项)，利用移液器上下吸液以轻柔地混合，以制备S1RBD- 标志蛋白浓缩液(浓缩液可以在4℃下保存1-2天或在-80℃下保存一个月)。

2.5应用1x分析稀释剂将HRP结合的抗Fc区抗体浓缩物稀释1000倍：摇晃装有HRP的抗Fc区抗体的样品瓶，以将样品瓶中的内容物富集在容器的底部，将5uL的HRP偶联的抗Fc区抗体浓缩物加入5mL 1x分析稀释剂的试管中，向试管中加入分析稀释剂，利用移液器上下吸液以轻柔地混合，以制备1000倍稀释的HRP偶联的抗Fc区抗体溶液。

3.检测操作

3.1使用前，将所有试剂置于室温(18-25℃)。

3.2在微量滴定板(A项)的微孔中加入100mL待测样品(含或不含 S1RBD-ACE2复合抑制剂的S1RBD蛋白)，注意，建议所有样品至少重复两次。

3.3用板夹将微孔盖好，在室温下孵育2.5小时，或在4℃下振荡过夜。

3.4弃去微孔中的反应液，并用1x洗涤溶液洗涤4次，每次的洗涤操作如下：用移液器或自动清洗机在每个微孔中加入1x清洗缓冲液(300uL)进行清洗；在每次洗涤后，需要将微孔中的液体彻底清除，在最后一次洗涤后，通过抽吸或倾析除去所有剩余的1x洗涤缓冲液，然后用干净的纸巾将其吸干微孔内的液体吸干并倒置板。

3.5向每个微孔中加入100μL制备的上述过程中制备的经过1000倍稀释的稀释的HRP偶联的抗Fc区抗体溶液，室温摇动孵育1小时。

3.6弃去微孔中的溶液，按照步骤3.4的步骤重复洗涤。

3.7向每个微孔中加入100μL TMB一步底物试剂(H项)，在黑暗中摇晃，在室温下孵育30分钟。

3.8向每个孔中加入50μL终止溶液(I项)，立即在450nm的入射光下读取吸光度。

本实施例所提供的试剂盒可用于本公开的快速、简单、灵敏地表征在潜在抑制剂存在下S1RBD-ACE2复合物的结合亲和力。体外酶联免疫吸附测定可以同时测量多种试剂和条件。例如，该试剂盒可用于筛选抑制剂活性和药物，疫苗开发以及测试潜在的治疗性抗体。

实施例11

本实施例提供一种试剂盒，包括：

固定有重组哺乳动物细胞生成的(糖基化)COVID19 S蛋白RBD结构域的微量滴定板(A项)，上述微量滴定板为96孔(12条x 8孔)ACE2微孔板；

25ml洗涤缓冲液(B项)，上述洗涤缓冲液为20x浓缩溶液(20x：氯化钾， 0.4％；氯化钠，16％；磷酸二氢钾；0.4％，磷酸二钠；吐温20，1.0％)；

检测抗体，山羊抗ACE2抗体(C-1项)；

25μL HRP偶联的抗Fc区抗体浓缩物(D-1项)，上述抗体浓缩物为1000x 浓缩的HRP偶联的抗山羊IgG；

15mL分析稀释剂(E2项)，所述分析稀释剂为5x浓缩磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，用于稀释测试试剂，其中含有0.15％5-溴-5-硝基-1,3-二恶烷(BND)； 7.5％牛血清白蛋白(BSA)；1.25％Tween-20；

ACE2蛋白(F项)，2小瓶纯化的人重组ACE2蛋白(1小瓶足以测定一半微孔板)；

12m标志物反应液(H项)，上述标志物反应液为3,3'，5,5'-四甲基联苯胺 (TMB)一步底物试剂；

8mL反应终止液(I项)，上述反应终止液为0.2M硫酸。

本实施例所提供的试剂盒的最佳储存方式为：

试剂盒应保存在-20℃或更低的温度下，并在装运之日起6个月内使用。初次使用后，应将洗涤缓冲液(B项)，分析稀释剂(E2项)，标志物反应液(H 项)，反应终止液(I项)保存在4℃下，以避免重复的冻融循环。将未使用的孔放回装有干燥剂包的袋中，沿整个边缘重新密封并在-20℃下储存。ACE2蛋白(F项)应存储在-80℃下。检测抗体(C项)和HRP偶联的抗Fc区抗体浓缩物(D项)在2-8℃下最多可保存1个月(在-20℃下最多可保存6个月，避免重复冻融循环)。

上述试剂盒与以下设备配合使用：能够测量450nm吸光度的酶标仪、摇床、移液器(可输送2μl至1ml的体积)、1-25毫升用于调试或校准移液器的试剂、 (100毫升和1升)量筒、蒸馏水或去离子水、准备样品稀释液的试管。

本实施例利用本实施例所提供的试剂盒对测试待测物A对S1RBD-ACE2复合物的抑制能力进行测试。

1.处理组设置方式：

将测试试剂(例如，潜在的抑制剂，例如但不限于小分子或抗体)与ACE2 蛋白混合，然后用1x稀释的稀释剂稀释混合物以制成1x ACE2蛋白的工作浓度。每个样品应包含相同的1x ACE2蛋白浓度。

所有样本至少要重复运行两次。对于初始实验，可以进行系列稀释(例如5 倍至5000倍)以确定要使用的最佳测试试剂量。

为了测试待测物A抑制S1RBD-ACE2结合的能力，在六个独立的试管中稀释100mM储备液以创建20mM，2mM，0.2mM，0.02mM，0.002mM和0mM 的稀释系列：

分别向所设置的六个试管中加入2.5μL ACE2蛋白和197.5uL 1x分析稀释液 (E2项)，彻底混合。将化合物A的储备液分别稀释至20mM，2mM，0.2mM， 0.02mM，0.002mM，分别取上述稀释液各50μL加入至上述其中五个独立的试管中，设置一个试管(空白对照)不加入化合物A，分别将每支试管中的物料彻底混合。对每个连续的浓度重复此步骤。对于每种稀释液，使用225μl 1x ACE2 蛋白溶液和25μl的先前浓度，直到达到最终浓度。在下次传输之前，将各管彻底混合。

2.前处理操作

2.1使用前，将所有试剂和样品置于室温(18-25℃)；

2.2E2项在使用前应用去离子水或蒸馏水稀释5倍。

2.3B项包含可见的晶体，则温热至室温并轻轻混合直至溶解，将20mL 洗涤缓冲液(B项)利用去离子水或蒸馏水稀释，得到400mL 1x洗涤缓冲液；

2.4应用1x分析稀释剂将ACE2蛋白溶液稀释100倍：摇晃装有ACE2 蛋白的小瓶，在装有S1RBD标志蛋白的小瓶中加入100μL 1x分析稀释液(E2 项)，利用移液器上下吸液以轻柔地混合，以制备S1RBD-标志蛋白浓缩液(浓缩液可以在4℃下保存1-2天或在-80℃下保存一个月)。

2.5应用1x分析稀释剂将山羊抗ACE2抗体(C-1项)浓缩物稀释55倍：摇晃装有C-1项的样品瓶，以将样品瓶中的内容物富集在容器的底部，样品瓶中加入100μL1 x分析稀释剂(E2项)，利用移液器上下吸液以轻柔地混合。

2.6应用1x分析稀释剂将HRP偶联的抗山羊IgG(D-1项)稀释1000倍：摇晃装有D-1项的样品瓶，以将样品瓶中的内容物富集在容器的底部，将5ul的 HRP结合的抗山羊IgG浓缩液(D-1项)加到装有5mL 1x分析稀释剂的试管中，利用移液器上下吸液以轻柔地混合。

3.检测操作

3.1使用前，将所有试剂置于室温(18-25℃)。

3.2在微量滴定板(A项)的微孔中加入100mL待测样品(含或不含S1RBD-ACE2复合抑制剂的S1RBD蛋白)，注意，建议所有样品至少重复两次。

3.3用板夹将微孔盖好，在室温下孵育2.5小时，或在4℃下振荡过夜。

3.4弃去微孔中的反应液，并用1x洗涤溶液洗涤4次，每次的洗涤操作如下：用移液器或自动清洗机在每个微孔中加入1x清洗缓冲液(300uL)进行清洗；在每次洗涤后，需要将微孔中的液体彻底清除，在最后一次洗涤后，通过抽吸或倾析除去所有剩余的1x洗涤缓冲液，然后用干净的纸巾将其吸干微孔内的液体吸干并倒置板。

3.5向每个微孔中加入100μL制备的上述过程(步骤2.5)中制备山羊抗ACE2 抗体稀释液，室温摇动孵育1小时。

3.6弃去微孔中的溶液，按照步骤3.4的步骤重复洗涤。

3.7向每个微孔中加入100μL TMB一步底物试剂(H项)，在黑暗中摇晃，在室温下孵育30分钟。

3.8向每个孔中加入50μL终止溶液(I项)，立即在450nm的入射光下读取吸光度。

本实施例所提供的试剂盒可用于本公开的快速、简单、灵敏地表征在潜在抑制剂存在下S1RBD-ACE2复合物的结合亲和力。体外酶联免疫吸附测定可以同时测量多种试剂和条件。例如，该试剂盒可用于筛选抑制剂活性和药物，疫苗开发以及测试潜在的治疗性抗体。

SEQUENCE LISTING

<110> 瑞博奥（广州）生物科技股份有限公司

<120> 筛选SARS-CoV病毒的抑制剂的方法和试剂盒及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 669

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gln Thr Gly Lys

405 410 415

Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val

420 425 430

Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr

435 440 445

Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu

450 455 460

Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn

465 470 475 480

Gly Val Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln

485 490 495

Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser

500 505 510

Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser

515 520 525

Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu

530 535 540

Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe

545 550 555 560

Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp

565 570 575

Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly

580 585 590

Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val

595 600 605

Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala

610 615 620

Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val

625 630 635 640

Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn

645 650 655

Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys

660 665

Claims (18)

1.一种筛选SARS-CoV病毒的抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，准备SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的刺突受体结合结构域编码的糖基化多肽和血管紧张素转化酶2，所述糖基化多肽和/或所述血管紧张素转化酶2被标记底物标记；

步骤二，在不含有待测样品的反应体系中，使所述糖基化多肽与所述血管紧张素转化酶2复合而形成参照复合物；

步骤三，在含有待测样品的反应体系中，使所述糖基化多肽与所述血管紧张素转化酶2复合而形成待测复合物；

步骤四，分别对所述参照复合物和所述待测复合物进行量化特征参数的检测；

步骤五，利用所述步骤四测得的对应所述量化特征参数的差值表征所述抑制剂对SARS-CoV病毒的抑制程度。

2.如权利要求1所述筛选SARS-CoV病毒的抑制剂的方法，其特征在于：所述抑制剂为小分子、抗体或多肽中的至少一种。

3.如权利要求1所述筛选SARS-CoV病毒的抗体或抑制剂的方法，其特征在于：所述糖基化多肽包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

4.如权利要求3所述筛选SARS-CoV病毒的抗体或抑制剂的方法，其特征在于：所述糖基化多肽的糖基化位点包括N343-糖基化位点。

5.如权利要求4所述筛选SARS-CoV病毒的抑制剂的方法，其特征在于：所述糖基化多肽通过哺乳动物细胞表达获得。

6.如权利要求2～5任一项所述筛选SARS-CoV病毒的抑制剂的方法，其特征在于：所述糖基化多肽被标记底物标记，所述标记底物为具有Fc区的免疫球蛋白G。

7.如权利要求1所述筛选SARS-CoV病毒的抑制剂的方法，其特征在于：所述标记底物为辣根过氧化酶。

8.一种试剂盒，其特征在于，包括：SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的刺突受体结合结构域编码的糖基化多肽、血管紧张素转化酶2、包含若干个微孔的微量滴定板、洗涤缓冲液、分析稀释剂、标记底物反应液、反应终止液；其中，所述糖基化多肽和/或所述血管紧张素转化酶2被标记底物标记。

9.如权利要求8所述试剂盒，其特征在于：所述糖基化多肽通过哺乳动物细胞表达获得。

10.如权利要求9所述试剂盒，其特征在于：所述糖基化多肽包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

11.如权利要求10所述试剂盒，其特征在于：所述糖基化多肽的糖基化位点包括N343-糖基化位点。

12.如权利要求8所述试剂盒，其特征在于：所述微孔的表面包被有所述糖基化多肽，所述血管紧张素转化酶2上缀合有标记底物。

13.如权利要求12所述试剂盒，其特征在于：

所述标记底物为血管紧张素转化酶2为重组ACE2多肽的纯化的细胞外结构域；

所述标记底物为辣根过氧化物酶；

所述标记底物反应液为含有3,3‘，5,5’-四甲基联苯胺的缓冲液；

所述反应终止液为0.2M硫酸。

14.一种利用权利要求13所述试剂盒筛选SARS-CoV病毒的抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，将所述血管紧张素转化酶2于所述分析稀释剂中形成溶液，将由此形成的溶液分为测试组溶液和对照组溶液，将待测样品溶于所述测试组溶液；

步骤二，分别向不同的所述微孔中加入所述测试组溶液和所述对照组溶液，孵育；

步骤三，弃去所述微孔内的反应液并利用所述洗涤缓冲液洗涤所述微孔；

步骤四，向所述微孔中加入所述标记底物反应液，孵育，向微孔中加入所述终止液，立即在450nm的入射光下读取微孔中的溶液的吸光度；

步骤五，以对应于所述对照组溶液的吸光度与对应于所述测试组溶液的吸光度的差值表征所述抑制剂对SARS-CoV病毒的抑制程度。

15.如权利要求8所述试剂盒，其特征在于：所述微孔的表面包被有所述血管紧张素转化酶2，所述糖基化多肽上缀合有标记底物。

16.如权利要求15所述试剂盒，其特征在于：

所述标记底物为具有Fc区的免疫球蛋白G；

所述试剂盒还包括有辣根过氧化物酶偶联的抗免疫球蛋白G的Fc区域的抗体；

所述标记底物反应液为含有3,3‘，5,5’-四甲基联苯胺的缓冲液；

所述反应终止液为0.2M硫酸。

17.一种利用权利要求16所述试剂盒检测SARS-CoV病毒的抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，将所述糖基化多肽于所述分析稀释剂中形成溶液，将由此形成的溶液分为测试组溶液和对照组溶液，将待测样品溶于所述测试组溶液；

步骤二，分别向不同的所述微孔中加入所述测试组溶液和所述对照组溶液，孵育；

步骤三，弃去所述微孔内的反应液并利用所述洗涤缓冲液洗涤所述微孔；

步骤四，向所述微孔中加入所述辣根过氧化物酶偶联的抗免疫球蛋白G的Fc区域的抗体和所述标记底物反应液，孵育，向微孔中加入所述终止液，立即在450nm的入射光下读取微孔中的溶液的吸光度；

步骤五，以对应于所述对照组溶液的吸光度与对应于所述测试组溶液的吸光度的差值表征所述抑制剂对SARS-CoV病毒的抑制程度。

18.一种利用权利要求16所述试剂盒检测SARS-CoV病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，向所述微孔中加入待测样品，孵育；

步骤二，利用所述洗涤缓冲液洗涤所述微孔；

步骤三，向所述微孔中加入缀合有辣根过氧化物酶的血管紧张素转化酶2，孵育；

步骤四，利用所述洗涤缓冲液洗涤所述微孔；

步骤五，向所述微孔中加入所述标记底物反应液，孵育。

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