KR20220066581A - 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2) 특이적 항체의 역가 측정방법 - Google Patents

사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2) 특이적 항체의 역가 측정방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ELISA 분석법을 이용하여 SARS-CoV-2 특이적 항체의 역가를 측정하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 SARS-CoV-2의 S1 단백질 항원을 이용한 SARS-CoV-2 특이적 항체의 역가 측정방법 및 키트에 관한 것이다. 본 발명에서는 혈청학적 진단법을 응용하여, SARS-CoV-2 S1RBD 단백질을 사용한 ELISA 분석을 수행하였으며, ELISA 시험 결과와 PRNT 시험 결과의 상관관계를 분석한 결과, 강한 양적 상관관계를 나타냄을 확인하였다. 이는 본 발명에 따른 ELISA 분석법이 COVID-19 혈장 치료제 개발에 유용함을 시사한다.

Description

사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2) 특이적 항체의 역가 측정방법{A Method for Measuring Titer of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2(SARS-CoV-2) Specific Antibody}
본 발명은 ELISA 분석법을 이용하여 SARS-CoV-2 특이적 항체의 역가를 측정하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 SARS-CoV-2의 S1 단백질 항원을 이용한 SARS-CoV-2 특이적 항체의 역가 측정방법 및 키트에 관한 것이다.
2019 코로나바이러스 감염증(Coronavirus disease 2019, 코로나-19, COVID-19)은 2019년 12월 중국에서 시작되어 전세계로 전파되었으며, 세계보건기구(WHO)에서는 전염병 대응의 최고 수준인 팬데믹(Pandemic; 세계적 대유행)을 선언하였다(2020.3.11.). WHO는 COVID-19의 원인이 메르스(MERS, Middle East Respiratory Syndrome, 중동호흡기증후군), 사스(SARS, Severe Acute Respiratory Syndrome, 중증급성호흡기증후군)와 같은 코로나바이러스과(Coronaviridae) 베타-코로나바이러스(Beta-coronavirus)의 새로운 유형이라고 밝혔다(2020.1.9.). 국제바이러스 분류위원회(ICTV)는 COVID-19의 병원체를 SARS-CoV의 변종으로 보고 2020년 2월 11일 ‘SARS-CoV-2’로 명명했다.
SARS-CoV-2(사스-코로나바이러스-2, Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, 급성 호흡기 코로나바이러스 2, 2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)는 외피에 스파이크 단백질(Spike protein)을 가지며, 전자 현미경 상에서 왕관과 같은 코로나 모양(crown-like corona)을 띄는, 65-125nm의 크기의 원형 혹은 타원형 바이러스이다. 유전체로서 약 30kb 길이의 단일 가닥 RNA(ssRNA)를 가지며, 바이러스 유전체인 RNA 자체가 전사체로 작용하는 양성 가닥(positive-strand) RNA 유전자에 해당한다(Indwiani Astuti, Ysrafil, Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Reviews, 2020, 14(4), 407-412).
코로나바이러스의 유전체는 4가지 구조 단백질을 코딩한다. 스파이크(Spike; S) 단백질은 숙주 세포의 수용체와 특이적인 결합을 하고, 핵단백질(Nucleoprotein)은 RNA 게놈과 결합하여 뉴클레오캡시드(nucleocapsid; N)를 만들고, 막(membrane; M) 단백질은 membrane과 capsid 사이를 이어주며, 외피(envelope; E) 단백질은 바이러스의 조립 분출에 관여하며 외피를 구성한다(Xiaojie Zhu, et al., Journal of Thoracic Disease, 2013, 5(S2):S142-S148).
Spike 단백질은 S1(머리)과 S2(줄기)로 구성되어 있으며, S1 부분의 Receptor binding domain(RBD)가 숙주 세포의 Angiotensin Converting Enzyme-2 receptor(ACE2)와 결합해 숙주 세포의 세포질 내로 들어간다. 세포질로 들어온 바이러스는 pp1a와 pp1ab라는 단백질을 생산해 replicase를 만들어내며, 비구조단백질들은 replicase-transcriptase complex를 형성해 바이러스의 RNA를 복제한다. 세포질에서 합성된 단백질은 소포체 골지 전달과정을 통해 복제된 RNA와 결합해 세포 밖으로 배출된다.
항체 역가(또는 항체가; antibody titer)는 특정 항원에 대한 항체의 중화활성(neutralizing activity)의 정도를 의미하는 것으로, 혈장 치료제 등에 포함된 항체의 중화활성을 측정함으로써, 해당 치료제의 치료효과를 예측할 수 있다.
특히 최근 전세계적인 팬데믹(Pandemic) 상황 하에서 COVID-19에 감염되었다가 완치된 환자의 혈장을 이용하여 COVID-19 혈장 치료제 등을 개발하기 위해서는 SARS-CoV-2 특이적 항체의 역가 측정이 필수적이다.
한편, 현재 일반적으로 이용되는 플라크 감소 중화항체 분석법(Plaque Reduction Neutralization Test; PRNT)은 plaque assay를 이용하여 검체의 중화 항체역가를 정량하여 측정하는 방법으로, 대량 검체 분석에 있어서 상당한 시간이 걸리고, 검체량과 수행 인원이 많이 필요할 뿐 아니라, 직접 바이러스를 다루어야 할 수도 있다는 점에서 안전성이 떨어진다는 단점이 있다.
이에, 본 발명에서는 혈청학적 진단법을 응용하여, SARS-CoV-2에 대한 특이 항체의 역가를 측정할 수 있는 최적의 항원을 선정하였으며, 이를 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 항체 역가 분석법을 위한 ELISA coating 항원으로 사용함으로써, COVID-19 치료를 위한 혈장 치료제의 항체 역가를 매우 정확하고 효율적으로 측정할 수 있음을 확인하였다.
특히 기존의 플라크감소 중화항체 분석법(PRNT)과의 상관관계 분석을 통해, 본 발명에 따른 ELISA 기술에 기반한 SARS-CoV-2에 대한 항체 역가 측정방법이 높은 정확도와 효율성을 가지고 있음을 확인하였으며, 이에 따라 본 발명에 따른 SARS-CoV-2에 대한 항체 역가 측정방법은 COVID-19 혈장 치료제 개발에 적합한 분석법임을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 특정 SARS-CoV-2 단백질 항원을 이용하여 SARS-CoV-2 특이적 항체의 역가를 측정하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 특정 SARS-CoV-2 단백질 항원과 2차 항체가 포함된 SARS-CoV-2 특이적 항체의 역가 측정키트를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SARS-CoV-2의 단백질 항원, 바람직하게는 S1 단백질 항원을 이용한 SARS-CoV-2 특이적 항체의 역가 측정방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 고체상 지지체에 고정된 SARS-CoV-2의 S1 단백질 항원 및 기질과의 반응에 의해서 발색을 나타내는 검출표지가 접합된 2차 항체를 포함하는 SARS-CoV-2 특이적 항체의 역가 측정키트를 제공한다.
본 발명에서는 혈청학적 진단법을 응용하여, SARS-CoV-2 S1 단백질 항원, 바람직하게는 SARS-CoV-2 S1RBD 단백질 항원을 사용한 ELISA 분석을 수행하였으며, ELISA 시험 결과와 PRNT 시험 결과의 상관관계를 분석한 결과, 강한 양적 상관관계를 나타냄을 확인하였다.
따라서 본 발명에 따른 SARS-CoV-2에 특이적인 항체 역가 측정 방법은 간단하고, 높은 안전성을 유지하면서 매우 정확하다는 장점을 갖는다.
도 1은 PRNT 시험방법에 따른 항체 역가 측정방법의 정확도를 나타내는 도면이다.
도 2는 Indirect ELISA의 원리를 도식화한 도면이다.
도 3은 SARS-CoV-2 S1RBD의 3회 시험 평균값과 PRNT 시험결과에 대한 상관관계 및 회귀분석 결과를 나타낸 도면이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
플라크감소 중화항체 분석법(PRNT; Plaque Reduction Neutralization Test)은 체내 형성된 항체 중 병원체를 중화(무력화)가능한 항체만을 정량적으로 검출하는 시험법이다. 플라크(Plaque)란 세포 내에 바이러스가 침투하여 세포의 대사 활동을 하지 못하게 되어 죽은 세포의 군집을 지칭한다.
ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 항체 역가 분석법은 항체나 항원에 효소를 표지해 효소 활성을 측정해 항원항체 반응을 측정하여 항체 역가를 측정하는 방법을 의미한다.
본 발명에서는, COVID-19 혈장 치료제 내의 SARS-CoV-2에 대한 특이적인(specific) 항체의 역가를 측정할 수 있는 적합한 항원을 선정하고자, S, N, E 항원 총 8종(S항원 5종, N항원 2종, E항원 1종)에 대하여 항원 스크리닝을 실시하였다.
최종 항원으로 선정된 S 항원 S1RBD 및 N 항원(Ray biotech/230-01104)을 사용하여 COVID-19 감염 후, 회복 환자 혈장 내에 존재하는 중화항체의 PRNT 역가 시험결과 값과의 상관관계를 분석하였으며, 그 결과 N 항원을 사용한 ELISA 결과의 PRNT 중화항체 역가 시험결과와의 Pearson 상관계수(r)는 0.54 이상이고, S1RBD 항원을 사용한 ELISA 결과의 PRNT 중화항체 역가 시험결과와의 Pearson 상관계수(r)는 0.769로, 강한 양적 상관관계임을 확인하였으며, 회귀분석에서 R2(R-제곱) 값은 59.2%, P-값은 0.000으로 확인되어 통계적으로 유의함을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, SARS-CoV-2의 S1 단백질 항원을 이용한 SARS-CoV-2 특이적 항체의 역가 측정방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 S1 단백질 항원은 S1RBD(S1 Receptor-Binding Domain)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 S1RBD는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어, 본 발명에 따른 S1RBD는 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어, 특정 아미노산 잔기 위치에서 아미노산 잔기가 보존적으로 치환된 변이체 또는 이의 절편들도 포함하는 의미로 해석된다. 본 명세서에서 “보존적 치환”이란 1개 이상의 아미노산을 해당 PH20 변이체의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 PH20 변이체의 변형을 의미한다.
“보존적 아미노산 치환”은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 해당 기술분야에 규정되어 있으며, 잘 알려져 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 S1RBD는 서열번호 1의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 기능 및/또는 효과를 가지며, 80% 또는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지는 변이체 또는 이의 단편들도 포함하는 의미로 해석된다.
본 발명에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 특이적 항체는 혈장 내에 포함된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, '혈장(blood plasma)'은 혈액의 유형성분인 적혈구, 백혈구, 혈소판 등을 제외한 투명한 중성의 액체로서, 여러 단백질, 이온, 무기질 등이 녹아 있는 용매를 의미한다. 항응고제를 첨가한 혈액을 원심분리하면 위쪽에는 혈장이, 아래쪽에는 혈구 등의 유형 성분으로 나누어지며, 혈장은 전체 혈액의 약 55% 정도를 차지한다.
본 발명에 있어서, 상기 혈장은 개체로부터 유래된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 혈장은 COVID-19(Coronavirus Disease 2019) 감염 후 회복한 개체로부터 유래된 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 개체는 척추동물일 수 있으며, 상기 척추동물은 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 인간 및 비인간 영장류를 포함한 영장류, 낙타, 또는 마우스 및 래트를 포함한 설치류일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체 역가 측정은 기질과의 반응에 의해서 발색을 나타내는 검출표지가 접합된 2차 항체를 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 상기 역가 측정은 간접효소결합면역측정 방법(Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; Indirect ELISA)을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 2차 항체는 인간 IgG 또는 IgA에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 인간 IgG에 특이적으로 결합하는 항-인간 IgG인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항-인간 IgG는 IgG의 Fab 또는 Fc(crystallizable fragment) 특이적인 것일 수 있으며, 전체 IgG(whole IgG) 또는 Fab(fragment antigen binding) 등의 항체 단편일 수 있다. 바람직하게는, 상기 2차 항체는 염소 항-인간 IgG(goat anti-human IgG)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 검출표지는 호스래디쉬 퍼옥시다제(Horseradish peroxidase; HRP), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(colloid gold), 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기질은 TMB(Tetra Methyl Benzidine), ABTS(2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD(o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, Indirect ELISA 시험을 위해, TMB를 기질로 사용하고, human IgG 혹은 Fab을 인지하는 HRP-접합 검출 항체(HRP-conjugated detection antibody)를 이용하였다.
보다 구체적으로, 도 2에 나타낸 바와 같이, SARS-CoV-2 S1RBD 항원이 코팅되어 있는 플레이트에 혈장을 처리하면, SARS-CoV-2 S1RBD 항원에 SARS-CoV-2 특이적 항체가 결합하게 되고, 항원과 결합된 SARS-CoV-2 특이적 항체에 HRP-접합 2차 항체가 결합하게 되어, HRP에 의한 발색반응이 나타나게 된다. 이로부터 혈장 내의 SARS-CoV-2 특이적 항체 역가를 측정할 수 있다.
상기 2차 항체에 검출표지를 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 검출표지로서 HRP를 사용한 경우, 공지된 Nakane 법으로 접합시켜 HRP-접합된 2차 항체를 제조할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 고체상 지지체에 고정된 SARS-CoV-2의 S1 단백질 항원 및 기질과의 반응에 의해서 발색을 나타내는 검출표지가 접합된 2차 항체를 포함하는 SARS-CoV-2 특이적 항체의 역가 측정키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 S1 단백질 항원은 S1RBD(S1 Receptor-Binding Domain)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 S1RBD는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 2차 항체는 인간 IgG 또는 IgA에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 인간 IgG, 더욱 바람직하게는 IgG의 Fab 또는 Fc에 특이적으로 결합하는 항-인간 IgG인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 검출표지는 호스래디쉬 퍼옥시다제(Horseradish peroxidase; HRP), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(colloid gold), 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기질은 TMB(Tetra Methyl Benzidine), ABTS(2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD(o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 특이적 항체의 역가 측정키트에는 검사대상시료를 채취 또는 검출 시약을 적용하기 위한 도구, 항원-항체 결합을 확인하기 위한 시약 또는 장치 등 재조합 항원 단백질 및 항체를 사용하여 생물학적 시료로부터 바이러스의 존재 유무를 확인하는 통상의 검출 또는 진단 키트에 포함될 수 있는 도구, 장치 또는 시약이 더 포함될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
목암연구소에서 제작한 pCIW2(-neo) vector로부터 생산된 S1RBD를 코팅항원으로 사용하여 ELISA 시험을 진행하였다. COVID-19 전염병 회복 환자 혈장 19개를 ELISA 시험법과 PRNT 시험법으로 측정하여, 두 시험법 간의 상관관계를 평가하고자 하였다.
실시예 1: 검체(sample) 정보 및 PRNT 시험결과
시험에 사용된 COVID-19 환자 혈장은 영남대학교 의과대학 미생물학교실에서 획득하였으며(표 1), 플라크감소 중화항체 분석법(Plaque Reduction Neutralization Test; PRNT) 시험결과는 고려대 의과대학 미생물학교실에서 시험한 결과이다.
COVID-19 환자의 혈장 정보 및 PRNT 방법에 의한 ND50 값
No. 검체명 혈장 획득일 ND 50 1)
1 YUMC COVID-19 001 (RS1) 2020.04.17. 500
2 YUMC COVID-19 002 (RS2) 2020.04.17. 805
3 YUMC COVID-19 003 (RS3) 2020.04.17. 905
4 YUMC COVID-19 004 (RS4) 2020.04.17. 417
5 YUMC COVID-19 005 (RS5) 2020.04.17. 1229
6 YUMC COVID-19 006 (RS6) 2020.04.17. 1017
7 YUMC COVID-19 007 (RS7) 2020.04.17. 1640
8 YUMC COVID-19 008 (RS8) 2020.04.17. 1074
9 YUMC COVID-19 009 (RS9) 2020.04.17. 176
10 YUMC COVID-19 010 (RS10) 2020.04.17. 433
11 YUMC COVID-19 011 (RS11) 2020.04.17. 310
12 YUMC COVID-19 012 (RS12) 2020.04.17. 245
13 YUMC COVID-19 013 (RS13) 2020.04.17. 173
14 YUMC COVID-19 014 (RS14) 2020.04.17. 144
15 YUMC COVID-19 015 (RS15) 2020.04.17. 1027
16 YUMC COVID-19 016 (RS16) 2020.04.17. 1207
17 YUMC COVID-19 017 (RS17) 2020.04.17. 1843
18 YUMC COVID-19 018 (RS18) 2020.04.17. 2549
19 YUMC COVID-19 019 (RS19) 2020.04.17. 1382
본 발명에 있어서 ND50(50% Neutralization Dose)은 50%의 중화능을 나타내는 검체 내 항체의 함량을 의미하며, Karber method를 이용하여 ND50 결과를 산출하였다.
PRNT 방법의 정확도 및 직선성을 확인하기 위하여, 상기 수득된 혈장을 2배씩 계단희석하여 CPP-6-C1 내지 CPP-6-C6의 상이한 농도를 갖는 6개 농도의 검액을 준비하였다.
6개 농도에 대해 %Recovery와 R2 평가를 진행하여, 3일에 걸쳐 3회 그 직선성(linearity)을 평가한 결과, 60.4~167.0% 사이에서 기준 범위 내에 있음을 확인하였다(표 2).
Figure pat00001
또한, 이론적으로 산출된 ND50 값을 x축으로, 실제 측정된 ND50 값을 y축으로 하여 각 검체의 R2를 평가한 결과, 0.9814~0.9987의 높은 직선성을 나타냄을 확인하였다(도 1).
본 발명에 있어서, PFU(Plaque Forming Unit)는 단위 부피당 플라크(plaque)를 형성할 수 있는 바이러스의 입자의 수를 기술하기 위해 사용되는 측정 단위를 나타내며, 플라크(plaque)는 세포 내에 바이러스가 침투하여 세포의 대사 활동을 하지 못하게 하여 죽은 세포의 군집을 의미한다.
이러한 결과로부터, PRNT 시험법은 COVID-19 혈장 치료제 중화항체 역가 분석에 적합한 시험법임을 확인하였다.
실시예 2: ELISA 기반 항체 역가 측정 방법
실시예 2-1: 시험 원리
SARS-CoV-2 Spike protein에 대한 항체의 역가를 정량하기 위해 Indirect ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 방법을 이용하였다. SARS-CoV-2 S1RBD로 코팅된 ELISA plate에 검액을 loading하면 검액 내 존재하는 anti-S1RBD antibody가 결합하게 된다. 세척 후, Human IgG-Fab를 인지하는 HRP-conjugated detection antibody를 첨가하여 반응시킨다. 세척 후, 발색기질을 첨가하여 발색하고 stop solution를 첨가하여 반응을 중지 시킨 후, 450nm에서 흡광도를 측정하여 결과를 분석한다(도 2).
본 실험에 사용된 시약은 표 3에 기재된 바와 같다.
실험에 사용된 시약 정보
시약명 제조사 Cat. No. 농도
(mg/mL) 		보관
조건
ELISA Starter Accessory kit Bethyl E101 N/A 2 - 8℃
1M Sulfuric acid (H2SO4) Sigma 320501 N/A 상온
Goat Anti-Human Fab-HRP Sigma A0293 N/A - 20℃ 이하
In-house S1RBD 목암연구소 N/A 0.1
Pooled Human Serum Off the clot(Normal human serum) Innovative Research ISER500ML - 20℃ 이하
상기 ELISA Starter Accessory Kit (Bethyl, Cat. No. E101)는 다음 단계에 의해 제조되어 사용된다.
i) 코팅 buffer (0.05 M Carbonate-Bicarbonate pH 9.6): 100 mL의 정제수에 Carbonate-Bicarbonate 1 capsule내의 내용물을 녹인다.
ii) 세척 buffer (50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 0.05% Polysorbate 20 pH 8.0): 1 L의 정제수에 wash solution 1 packet내의 내용물을 녹인다.
iii) Blocking buffer (50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 1% BSA pH 8.0): 1 L의 정제수에 blocking buffer 1 packet내의 내용물을 녹인다.
iv) 희석 buffer (50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 1% BSA, 0.05% Polysorbate 20): Kit 내 포함된 10% Polysorbate 20 0.5 mL을 앞서 조제한 blocking buffer 100 mL에 녹인다.
또한, ELISA Stop Solution (0.18 M H2SO4)은 다음 단계를 거쳐 제조되어 사용된다.
i) 1M H2SO4: 472.8 mL의 정제수에 27.2 mL의 H2SO4를 천천히 첨가한다.
ii) 410 mL의 정제수에 1M H2SO4 90 mL을 넣고 잘 섞어준다.
실시예 2-2: ELISA 시험과정
코팅 항원으로 사용하기 위한 S1RBD 항원의 아미노산 서열은 서열번호 1과 같다:
S1RBD의 아미노산 서열 (서열번호 1):
MYLGLNYVFI VFLLNGVQSQ PTESIVRFPN ITNLCPFGEV FNATRFASVY AWNRKRISNC VADYSVLYNS ASFSTFKCYG VSPTKLNDLC FTNVYADSFV IRGDEVRQIA PGQTGKIADY NYKLPDDFTG CVIAWNSNNL DSKVGGNYNY LYRLFRKSNL KPFERDISTE IYQAGSTPCN GVEGFNCYFP LQSYGFQPTN GVGYQPYRVV VLSFELLHAP ATVCGPKKST NLVKNKCVNF NFNGLTGTGV LTESNKKFLP FQQFGRDIAD TTDAVRDPQT LEILDITPSH HHHHH
본 실시예에 있어 모든 시액은 사용 전 상온에 꺼내어 온도 조건을 맞춘 이후에 사용되었다.
1) Plate 항원 coating
i) ELISA Starter Accessory Kit 내에 포함된 microtiter wells에서 필요한 수량만큼 꺼내어 프레임에 끼운다.
ii) S1RBD 항원을 coating buffer를 사용하여, 최종농도를 1 μg/mL로 희석한 후, 96 well plate 각 well에 100 μL씩 분주하고 20 - 25℃에서 60분간 반응시킨다.
iii) 반응이 끝난 후 plate 각 well의 용액을 털어서 버리고 multi-pipette을 이용하여 세척액 300 μL씩 넣어 세척하고 바로 well을 뒤집어 털어낸다. 남아있는 용액은 종이타월에 쳐서 제거한다. 세척을 총 5회 실시한다.
iv) Blocking buffer를 각 well에 200 μL씩 loading한 후에 plate sealer로 막고 37°C에서 60분 동안 반응시킨다.
*Note: Blocking buffer를 넣은 plate를 2 - 8℃에서 보관 시 24시간 후까지 사용 가능하다.
v) 반응이 끝난 후 Plate 각 well의 용액을 털어서 버리고 multi-pipette을 이용하여 세척액 300 μL씩 넣어 세척하고 바로 well을 뒤집어 털어낸다. 남아있는 용액은 종이타월에 쳐서 제거한다. 세척을 총 5회 실시한다.
2) 검체 로딩 및 흡광도 측정
i) 검체는 희석 buffer를 사용하여 100배 희석한다.
ii) 검액을 strip의 각 well에 100 μL씩 loading한 후, plate sealer로 막고 1시간 동안 37℃에서 반응시킨다.
iii) 반응이 끝난 후, plate 각 well의 용액을 털어서 버리고 multi-pipette을 이용하여 세척액 300 μL씩 넣어 세척하고 바로 well을 뒤집어 털어낸다. 남아있는 용액은 종이타월에 쳐서 제거한다. 세척을 총 5회 실시한다.
iv) Goat Anti-Human Fab-HRP antibody (Sigma, A0293)를 희석 buffer로 50,000배 희석하여 각 well에 100 μL씩 loading한 후에 plate sealer로 막고 1시간 동안 37°C에서 반응시킨다.
v) 반응이 끝난 후 plate well의 용액을 털어서 버리고 multi-pipette을 이용하여 세척액 300 μL씩 넣어 세척하고 바로 well을 뒤집어 털어낸다. 남아있는 용액은 종이타월에 쳐서 제거한다. 세척을 총 5회 실시한다.
vi) TMB Substrate를 각 well에 100 μL씩 loading 한 후 어두운 곳에서 15분 동안 반응시킨다.
vii) Multi-pipette을 이용하여 stop solution을 각 well에 100 μL씩 loading 한 후 plate를 가볍게 두드려 섞어준다.
viii) Microplate reader를 사용하여 10분 이내에 측정파장 450nm, 참조파장 630nm에서 흡광도를 측정한다.
실시예 3: ELISA & PRNT 상관관계 분석
실시예 3-1: ELISA 시험결과
표 1에 기재된 COVID-19 감염 후 회복한 환자의 혈장 19개를 각 100배 희석한 후, S1RBD ELISA 시험을 진행한 결과를 표 4에 나타내었다. ELISA 3회 시험결과 모두 회복환자 혈장의 OD(Optical Density) 값은 모두 cut off 이상임을 확인하였다.
ELISA 방법 및 PRNT 방법에 따른 결과 비교
RS 1) 검체 ELISA (OD) PRNT (ND 50 )
#1 #2 #3 AVE STDEV CV ( % ) #1
RS1 1.303 1.677 1.551 1.510 0.190 12.6 500
RS2 1.943 2.380 2.179 2.167 0.219 10.1 805
RS3 1.748 2.276 2.035 2.020 0.264 13.1 905
RS4 0.636 0.842 0.773 0.750 0.105 14.0 417
RS5 2.638 3.219 2.968 2.942 0.291 9.9 1229
RS6 1.957 2.465 2.274 2.232 0.257 11.5 1017
RS7 2.194 2.815 2.560 2.523 0.312 12.4 1640
RS8 2.778 3.334 3.025 3.046 0.279 9.1 1074
RS9 0.369 0.465 0.423 0.419 0.048 11.5 176
RS10 1.060 1.289 1.256 1.202 0.124 10.3 433
RS11 0.846 1.051 1.004 0.967 0.107 11.1 310
RS12 0.437 0.548 0.513 0.499 0.057 11.4 245
RS13 0.195 0.217 0.209 0.207 0.011 5.4 173
RS14 0.252 0.307 0.300 0.286 0.030 10.5 144
RS15 0.636 0.801 0.741 0.726 0.084 11.5 1027
RS16 2.648 3.183 2.938 2.923 0.268 9.2 1207
RS17 1.894 2.354 2.187 2.145 0.233 10.9 1843
RS18 2.399 2.887 2.751 2.679 0.252 9.4 2549
RS19 2.374 2.912 2.794 2.693 0.283 10.5 1382
Cut off(Pooled normal serum) 0.055 0.067 0.063 0.062 0.006 9.9
1) RS: Recovered Patient Serum (COVID-19 감염 후 회복한 환자의 혈장)
통계분석 프로그램인 Minitab 17을 사용하여 ELISA 3회 시험 평균값과 PRNT 외주시험결과 값 간의 상관관계를 분석한 결과, Pearson 상관계수(r)가 0.769로 확인되어, 강한 양적 상관관계임을 확인하였다. 또한, 회귀분석 진행 시, R-제곱 값은 59.2%로 확인되었고, P-값은 0.000으로 확인되어 유의수준 0.05 미만임으로 통계적으로 유의함을 확인하였다(도 3).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Green Cross Corporation <120> A Method for Measuring Titer of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2(SARS-CoV-2) Specific Antibody <130> P20-B266 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 295 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S1 Receptor-Binding Domain(S1RBD) <400> 1 Met Tyr Leu Gly Leu Asn Tyr Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr 20 25 30 Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser 35 40 45 Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr 50 55 60 Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly 65 70 75 80 Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala 85 90 95 Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly 100 105 110 Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe 115 120 125 Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val 130 135 140 Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu 145 150 155 160 Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser 165 170 175 Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln 180 185 190 Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg 195 200 205 Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys 210 215 220 Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe 225 230 235 240 Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys 245 250 255 Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr 260 265 270 Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro 275 280 285 Ser His His His His His His 290 295

Claims (15)

  1. SARS-CoV-2의 S1 단백질 항원을 이용한 SARS-CoV-2 특이적 항체의 역가 측정방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 S1 단백질 항원은 S1RBD(S1 Receptor-Binding Domain)인 것을 특징으로 하는 역가 측정방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 S1RBD는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 역가 측정방법.
  4. 제1항에 있어서, SARS-CoV-2 특이적 항체는 혈장 내에 포함된 것을 특징으로 하는 역가 측정방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 혈장은 COVID-19(Coronavirus Disease 2019) 감염 후 회복한 개체로부터 유래된 것을 특징으로 하는 역가 측정방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 역가 측정은 기질과의 반응에 의해서 발색을 나타내는 검출표지가 접합된 2차 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 역가 측정방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 2차 항체는 인간 IgG 또는 IgA에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 역가 측정방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 검출표지는 호스래디쉬 퍼옥시다제(Horseradish peroxidase; HRP), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(colloid gold), 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 역가 측정방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 기질은 TMB(Tetra Methyl Benzidine), ABTS(2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD(o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 역가 측정방법.
  10. 고체상 지지체에 고정된 SARS-CoV-2의 S1 단백질 항원 및 기질과의 반응에 의해서 발색을 나타내는 검출표지가 접합된 2차 항체를 포함하는 SARS-CoV-2 특이적 항체의 역가 측정키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 S1 단백질 항원은 S1RBD(S1 Receptor-Binding Domain)인 것을 특징으로 하는 역가 측정키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 S1RBD는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 역가 측정키트.
  13. 제10항에 있어서, 상기 2차 항체는 인간 IgG 또는 IgA에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 역가 측정키트.
  14. 제10항에 있어서, 상기 검출표지는 호스래디쉬 퍼옥시다제(Horseradish peroxidase; HRP), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(colloid gold), 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 역가 측정키트.
  15. 제10항에 있어서, 상기 기질은 TMB(Tetra Methyl Benzidine), ABTS(2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD(o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 역가 측정키트.
KR1020200152771A 2020-11-16 2020-11-16 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2) 특이적 항체의 역가 측정방법 KR20220066581A (ko)

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