KR101341640B1

KR101341640B1 - 단백질 미세 구조 분석 방법 및 단백질 미세 구조 분석용 어레이

Info

Publication number: KR101341640B1
Application number: KR1020100010765A
Authority: KR
Inventors: 홍효봉
Original assignee: 한국전자통신연구원
Priority date: 2010-02-05
Filing date: 2010-02-05
Publication date: 2013-12-16
Also published as: JP2011164105A; KR20110091104A; US20110195867A1

Abstract

본 발명의 단백질 미세 구조 분석 방법은 표적 물질의 미세 구조에 관계없이 표적 물질의 포획이 가능한 포획 물질을 기판에 고정시키는 단계; 표적 물질과 포획 물질을 결합시켜 제1 복합체를 형성하는 단계; 제1 복합체를 복수 종류의 프로브 분자 중 1종의 프로브 분자와 각각 결합시켜 복수 개의 제2 복합체를 형성하는 단계; 복수 개의 제2 복합체에 발색 반응을 수행하여 제1 복합체와 프로브 분자의 결합 친화도를 측정하는 단계; 측정된 결합 친화도와 기존의 결합 친화도 데이터를 비교하여 표적 물질을 확정하는 단계를 포함한다. 따라서 고가의 장비나 숙련된 기술 없이 비교적 간단한 장비나 시약을 가지고 간단하게 표적 단백질의 미세 구조를 분석할 수 있다.

Description

단백질 미세 구조 분석 방법 및 단백질 미세 구조 분석용 어레이{The analying method of protein microstructure and array for the same}

본 발명은 단백질의 구조 분석 방법에 관한 것으로, 특히 단백질의 미세 구조 변화를 분석할 수 있는 방법에 관한 것이다.

질병의 원인이 되는 인플루엔자 바이러스(influenza virus)중 특히 문제가 되는 A 타입(type)의 경우 바이러스의 표면의 단백질(protein)에 의해 바이러스의 종류가 결정된다. 주로 HA(hemagglutinin)와 NA(neuroamidase)의 종류에 의해 바이러스의 서브 타입(sub-type)이 정해지는데 현재까지 15 내지 16종의 HA와 9종의 NA가 알려져 있다.

인플루엔자 A 바이러스는 보통 상기 2가지의 단백질의 약자를 이용하여 표기한다 (예: H1N1, H5N1등). 이론적으로는 200여 가지의 인플루엔자 바이러스가 존재할 수 있지만 현재까지 인간에게 치명적인 결과를 가져오거나 전세계적으로 문제가 된 서브 타입은 1918년 2~5천만명(일부 report는 약 7천만명 이상 사망)이 사망했다고 알려진 H1N1을 포함하여 3~4가지 정도라고 할 수 있다. 그리고, 인간에게 직접적으로 감염은 안 된다고 알려진 H5N1의 경우는 H1N1에 비해 인간에 대한 피해는 적었지만 변종의 출현으로 인하여 가금(닭이나 오리) 산업에 치명적인 결과를 가져왔고, 또한 동남아 국가에서는 인명의 손실을 유발하기도 하였다.

이러한, 바이러스의 감염에 대해 신속하게 대응하기 위해서는 문제가 되는 바이러스의 종류를 신속하게 판단하는 것이 중요하다. 실제로 인류는 항상 바이러스 감염에 노출되어 왔고 주기적으로 인플루엔자 바이러스(보통 1년에 한두 번 유행하는 감기(flu)를 계절성 독감(seasonal flu) 이라고 함)가 유행하기도 한다. 따라서, 감염력이 매우 높거나 인간에게 치명적인 바이러스의 경우 정확한 진단이 되어야만 신종 인플루엔자 바이러스의 감염을 초기에 차단하고 적절한 진료를 할 수 있다.

하지만, 인플루엔자 A 바이러스에 대한 감염의 경우 종류에 상관없이 증상이 매우 유사해서 실제 임상 진단만으로는 계절성 독감인지 아니면 대유행(pandemic) 또는 유행성(epidemic) 독감인지를 구별하기가 쉽지 않다.

현재까지 인플루엔자 A 바이러스의 정확한 판별을 위해서 사용되는 방법은 RT-PCR(Real Time Polymerase Chain Reaction)을 이용한 유전자 감별 방식과 면역학적 방법(주로 ELISA나 웨스턴 블롯)을 이용하는 것이 가장 일반적이다. 하지만, RT-PCR을 이용하는 경우, 우선 바이러스의 유전적 정보가 대부분 알려져 있어야 하고, 매우 고가의 시약 및 효소 등이 필요할 뿐만 아니라, 증폭 후 다시 분석을 해야 하는 등 시간과 자원이 많이 소모되는 단점이 있다.

ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)와 WB(Western Blot)의 경우는 비교적 간단히 단백질의 종류를 파악 할 수 있는 장점이 있지만, 적절한 항체(antibody)가 확보되어 있어야 하고, 어떠한 종류의 항체를 사용하느냐에 따라 비특이적 결합(non-specific binding)에 의해 목표 단백질(target protein)의 종류를 정확히 구별하지 못하는 경우도 발생한다.

인플루엔자 바이러스를 측정할 때에는 사람의 혈액이나 분비물 또는 인후 부분의 시료를 채취한다. 따라서, 측정자는 실제로 이 사람이 인플루엔자 A 바이러스에 감염이 되었는지 아니면 다른 바이러스에 의해 감염이 되었는지 알 수가 없고 또한 얼마만큼의 바이러스가 있는지 알 수가 없다. 따라서, 일반적인 ELISA 분석은 측정자가 사용한 항체로 검출할 수 있는 바이러스 또는 바이러스성 단밸질의 존재 유무만 판별할 수 있다.

일반적으로 항원-항체 반응(antibody-antigen, Ab-Ag)을 판별하기 위해 사용되는 발색 또는 형광 표지 물질(label compound) 들의 경우, 결합 여부는 알 수 있지만 실제 단백질의 미세 구조 변화(예: 1-2개의 아미노산 변화)는 감지하는 것이 거의 불가능하다. 실제로 이러한 변화는 MALDI-TOF와 같은 고가의 분석 장비를 사용하더라도 분석하기가 매우 어려운 경우가 많다. 하지만, 인플루엔자 A 바이러스의 경우는 면역 반응(immunogenic reaction)을 유도하는 에피토프(epitope)에서 1~2개의 아미노산의 변화가 감염 특성을 결정하는 경우가 대부분이다. 따라서 단백질의 미세한 구조 변화를 측정할 필요가 있다.

도 1은 일반적인 단백질 분석 방법을 설명하는 구조도이다.

도 1을 참조하면, 종래의 ELISA 또는 WB 등의 단백질 분석 방법은, 우선 기판(105)에 첫 번째 1차 항체(110)를 고정화한다.

그 다음 고정된 1차 항체(110)에 항원(120)을 결합시킨다.

다음으로 두 번째 1차 항체(110)를 다시 한번 항원(120)에 결합시킨다. 이렇게 1차 항체를 항원에 두 번 결합시키는 이유는 비특이적 결합의 가능성을 줄이고 반응 감도를 높이기 위해서이다.

그 후, 두 번째 1차 항체(110)에 2차 항체(130)를 결합시키고, 2차 항체(130)에 표지 물질로서 HRP(140)를 결합시킨다. 2차 항체(130)의 끝부분에 결합된 HRP(140)는 이를 화학적으로 처리하여 나오는 빛을 통해 항원(120)을 검출할 수 있다.

마지막으로, 기질(substrate)을 이용하여 발색 반응을 일으킨 후 반응을 확인하면 항원(120)의 존재 유무를 확인할 수 있다.

요약하면, 일반적인 ELISA 방법으로 측정할 경우 1차 항체(primary antibody) 및 2차 항체(secondary antibody)가 항원(antigen)에 결합하면 항체를 생산한 동물의 IgG-HRP와 기질을 이용하여 발색 반응을 일으킬 수 있다. 하지만, 이러한 방식의 경우 미세한 아미노산의 차이를 확인할 수 없다는 문제점이 있다.

도 2는 도 1의 방법에 의한 단백질 분석 결과를 설명하는 그래프이다.

도 2를 참조하면, 일반적인 ELISA 방법으로 단백질(예를 들면, 바이러스 또는 바이러스성 단백질) 분석을 수행한 경우(항체는 시료 1에 해당하는 항원에 대해 토끼(rabbit)을 이용하여 생산된 것이다), 이론적으로는 시료 1에 대한 신호만 있어야 하나, 시료 2 내지 시료 4 역시 세기(intensity)의 차이는 있으나 신호의 확보가 가능한 것을 볼 수 있다. 따라서, 측정자가 단백질의 농도나 종류를 모를 경우 거짓 양성(positive false)의 오류가 발생할 수 있다. 실제로 H1N1 및 H5N1 바이러스는 분석 키트(kit)의 이러한 오류로 인하여 계절 독감과 구별이 되지 못하고 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 항체를 이용하여 1차로 특정 단백질을 선별(screening)하고, 특정 단백질과 다양한 종류의 저분자 물질과의 결합 친화도를 이용하여 단백질의 미세한 구조를 분석할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 실시예에 따른 단백질 미세 구조 분석 방법은,

표적 물질의 미세 구조에 관계없이 상기 표적 물질의 포획이 가능한 포획 물질을 기판에 고정시키는 단계;

상기 표적 물질과 상기 포획 물질을 결합시켜 제1 복합체를 형성하는 단계;

상기 제1 복합체를 복수 종류의 프로브 분자 중 1종의 프로브 분자와 각각 결합시켜 복수 개의 제2 복합체를 형성하는 단계;

상기 복수 개의 제2 복합체에 발색 반응을 수행하여 상기 제1 복합체와 상기 프로브 분자의 결합 친화도를 측정하는 단계;

측정된 상기 결합 친화도와 기존의 결합 친화도 데이터를 비교하여 상기 표적 물질을 확정하는 단계;

를 포함한다.

실시예에 있어서, 상기 프로브 분자는

아미노산 이량체(amino acid dimer)를 포함할 수 있다.

이 실시예에 있어서, 상기 아미노산 이량체는

TRP-TRP, SER-HIS, GLU-ILE, SER-PRO, ASN-GLU, GLY-TRP, MET-ALA, MEY-LYS, PHE-GLY, ILE-LEU로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

이 실시예에 있어서, 상기 프로브 분자는

하기의 <구조식 1>로 구성될 수 있다.

<구조식 1>

NH2 - (amino acid 1) - (amino acid 2) - PEG - Biotin

실시예에 있어서, 상기 발색 반응을 수행하는 단계는,

상기 제2 복합체의 상기 프로브 분자에 표지 물질을 결합시키는 단계;

결합된 상기 표지물질과 기질을 반응시켜 발생 반응을 일으키는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시예에 있어서, 상기 표지 물질은

HRP(HorseRadish Peroxidase)일 수 있다.

이 실시예에 있어서, 상기 기질은

TMB(TetraMethyl Benzidine)일 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 단백질 미세 구조 분석용 어레이는,

삭제

표적 물질의 미세 구조에 관계없이 상기 표적 물질과 결합하여 제1 복합체를 형성하는 포획 물질; 및

상기 제1 복합체의 상기 표적 물질에 1종씩 결합하여 복수 개의 제2 복합체를 형성하는 복수 종류의 프로브 분자;

를 포함하고, 상기 복수 개의 제2 복합체에서의 상기 표적 물질과 상기 프로브 분자의 결합 친화도에 따라 상기 표적 물질의 미세 구조가 결정된다.

실시예에 있어서, 상기 프로브 분자는

아미노산 이량체(amino acid dimer)를 포함할 수 있다.

이 실시예에 있어서, 상기 아미노산 이량체는

실시예에 있어서, 상기 제2 복합체의 상기 프로브 분자에 결합하여 상기 제1 복합체와 상기 프로브 분자의 결합 친화도를 측정하기 위한 발색 반응을 수행하는 표지 물질

을 더 포함할 수 있다.

이 실시예에 있어서, 상기 표지 물질은

기질을 산화시켜 발색 반응을 수행할 수 있다.

이 실시예에 있어서, 상기 기질은

TMB(TetraMethyl Benzidine)일 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 인플루엔자 A 바이러스 진단용 바이오 센서는 본 발명의 실시예에 따른 단백질 미세 구조 분석용 어레이를 이용하여 제작될 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 단백질 미세 구조 분석 방법에 의하면,

단순한 결합 여부만 파악하는 기존의 면역학적인 방법으로는 판별이 되지 않거나 어려웠던 인플루엔자 A 바이러스(influenza A virus)의 서브 타입(sub-type)의 신종 바이러스를 확인할 수 있다.

또한, 기타 유전적 부동(genetic drift) 또는 유전적 이동(genetic shift)로 인한 단백질의 미세한 구조 변화로 인해 서브 타입의 판별이 어려운 경우에, 다양한 종류의 저분자와 특정 단백질의 결합을 통하여 얻어진 정보를, 1차 선별용으로 사용되는 항체의 종류와 종합하여 데이터베이스(DB)를 만듦으로써 고가의 장비나 숙련된 기술 없이 비교적 간단한 장비나 시약을 가지고 간단하게 특정 단백질(주로 분석하고자 하는 대상 단백질)의 미세 구조 변화까지 확인할 수 있고, 이를 통해 바이러스의 서브 타입을 분석할 수 있다.

따라서 인플루엔자 A 바이러스와 같이 유전적 변화로 인하여 단백질 구조에 미세한 변화가 발생하는 병원성 바이러스 또는 미생물의 병원성 및 감염성 여부를 판별할 수 있고, 인플루엔자 바이러스뿐만 아니라 암이나 기타 질병의 원인이 되는 생체 단백질의 구조 변화도 감지할 수 있으며, 또한 판별용 분석 시스템을 개발할 수 있다.

생체 물질(예를 들면, DNA, 단백질, 펩티드 등)의 생산에 관여하는 산업에서는 고가의 장비 없이 시퀀스(sequence)의 이상 유무를 판단할 수 있다. 또한, 현재 사용되는 간이 분석 방법(QA/QC)보다 사용이 편리하며, 가격 대비 좀더 정밀한 분석 자료를 제공할 수 있다.

또한, 군, 경찰, 소방 등 화생방 위험에 노출되어 있으면서 정밀한 분석 장비를 사용할 수 없는 특수 환경에서도 정확한 생화학적 위험 요소를 제공할 수 있다.

도 1은 일반적인 단백질 분석 방법을 설명하는 구조도이다.
도 2는 도 1의 방법에 의한 단백질 분석 결과를 설명하는 그래프이다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 실시예에 따른 단백질 미세 구조 분석용 어레이에서의 반응을 개략적으로 설명하는 도면이다.
도 4a 및 도 4b는 도 3a 및 도 3b의 어레이에서의 단백질 미세 구조 분석 결과를 개략적으로 설명하는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 단백질 미세 구조 분석 방법을 설명하는 흐름도이다.
도 6는 도 5의 단백질 미세 구조 분석 방법에 의한 단백질 미세 구조 분석 결과를 설명하는 그래프이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서에 기재된 "…부" 등의 용어는 적어도 하나의 기능이나 동작을 처리하는 단위를 의미한다.

도 3a 및 도 3b는 본 발명의 실시예에 따른 단백질 미세 구조 분석용 어레이에서의 반응을 설명하는 도면이고, 도 4a 및 도 4b는 도 3a 및 도 3b의 어레이에서의 단백질 미세 구조 분석 결과를 개략적으로 설명하는 그래프이며, 도 5는 본 발명의 실시예에 따른 단백질 미세 구조 분석 방법을 설명하는 흐름도이다.

도 3a, 3b, 및 도 5를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 단백질 미세 구조의 분석 방법은 우선, 표적 물질(220a, 220b)의 미세 구조 변화에 관계 없이 표적 물질(220a, 220b)의 1차 선별(screening)이 가능한 포획 물질(210)을 기판(205)에 고정시킨다(S510). 기판(205)은 실리콘 웨이퍼 또는 유리 플레이트일 수 있다.

여기서 표적 물질(220a, 220b)은 분석하고자 하는 단백질, 항원, 바이러스(virus), 또는 바이러스성 단백질(viral protein)일 수 있다. 상세하게는 인플루엔자 A 바이러스일 수 있다.

포획 물질(210)은 표적 물질(220a, 220b)을 1차적으로 선별할 수 있다는 점에서 1차 포획 물질이라고 할 수도 있다.

포획 물질(210)은 표적 물질(220a, 220b)의 미세 구조에 관계없이 표적 물질(220a, 220b)을 선별할 수 있는 물질이며 상세하게는, 분석하고자 하는 항원 즉, 인플루엔자 A 바이러스의 서브 타입에 관계 없이 인플루엔자 A 바이러스와 결합할 수 있는 항체 또는 수용기(receptor)일 수 있다.

이후, 표적 물질(220a, 220b)과 포획 물질(210)을 결합시켜 제1 복합체를 형성한다(S520). 표적 물질(220a, 220b)은 항원일 수 있고, 포획 물질(210)은 항원과 결합하는 항체일 수 있으므로 표적 물질(220a, 220b)과 포획 물질(210) 사이의 반응은 항원-항체 반응이라고 할 수 있다.

이와 같이, 분석하고자 하는 항원과 결합할 수 있는 항체를 기판(205)에 고정시킴으로써 미세 구조의 변화(차이)에 관계없이 1차적으로 분석을 원하는 항원을 선별할 수 있다.

다음으로 항원-항체 반응에 의한 제1 복합체 즉, 항원-항체 복합체(antigen-antibody complex)를 어레이 형태로 구비되는 서로 다른 복수 종류의 프로브 분자(probe molecules)(231~234) 중 한 종류의 프로브 분자와 각각 결합시켜 복수 개의 제2 복합체를 형성한다(S530).

각각의 프로브 분자(231-234)는 항원-항체 복합체와 따로 반응시킨다. 프로브 분자(231-234)는 항원-항체 복합체의 항원과 개별적으로 반응하기 위해 복수 개의 셀(cell)을 포함하는 어레이 타입(array type)으로 구비될 수 있다. 하나의 셀(cell)은 한 종류의 프로브 분자를 포함한다. 또한, 각각의 프로브 분자(231-234)는 항원-항체 복합체의 항원과 반응하기에 충분한 농도로 구비될 수 있다.

도 3a 및 3b에는 4가지 종류의 프로브 분자를 사용하는 것으로 나타나 있으나, 개시된 프로브 분자의 종류 및 개수는 이해를 돕기 위해 예시한 것이다. 10가지 또는 20가지 종류의 프로브 분자를 사용해도 좋으며, 프로브 분자의 종류 및 개수는 표적 물질(220a, 220b)을 분석하기에 충분한 수이면 되고, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 프로브 분자(231-234)는 펩티드 결합으로 연결된 아미노산 이량체(amino acid dimer)를 포함하는 구조일 수 있다.

상세하게는, 프로브 분자(231-234)는 포획 부위(capturing part, -NH_2-AA), 링커 부위(linker part, PEG), 고정화 부위(immobilization part, 비오틴)를 포함할 수 있다. 프로브 분자(231-234)의 구조를 구조식으로 나타내면 다음과 같다.

'NH₂ - 제1 아미노산(amino acid 1) - 제2 아미노산(amino acid 2) - PEG(Poly Ehylene Glycol) - 비오틴(Biotin)'

상기 구조식에서 링커 부위 및 고정화 부위는 다른 물질을 사용할 수 있다. 예를 들면, 링커 부위는 길이가 상이한 알킬 구조의 물질, DNA 등과 같이 일반적인 링커로 사용될 수 있는 물질을 포함할 수 있으며, 고정화 부위는 비오틴 외에도, -NH₂, -COOH-, -OH 등의 특정 작용기를 이용할 수 있다.

프로브 분자(231-234)에 포함되는 아미노산 이량체는 TRP-TRP, SER-HIS, GLU-ILE, SER-PRO, ASN-GLU, GLY-TRP, MET-ALA, MEY-LYS, PHE-GLY, ILE-LEU로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 아미노산 이량체는 조합 가능한 수백 개의 아미노산 이량체 중, 분석하고자 하는 단백질의 미세 구조 변화에 따라 선택되는 것이며, 분석하고자 하는 단백질이 인플루엔자 A 바이러스인 경우에는 서브 타입에 따라 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 프로브 분자가 아미노산 이량체를 포함하는 경우를 예로 들어 설명하였지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 프로브 분자는 저분자 물질이며, 바람직하게는 펩티드 결합을 가질 수 있다. 펩티드 결합을 갖는 물질은, 2개 내지 10개, 바람직하게는 2개 내지 5개, 보다 바람직하게는 2개 내지 3개, 가장 바람직하게는 2개의 아미노산으로 이루어진 작은 펩티드(small peptide)를 포함할 수 있다.

이후, 복수 개의 제2 복합체에 발색 반응을 수행하여 제1 복합체(항원-항체 복합체)와 프로브 분자(231-234)의 결합 친화도(binding affinity)를 측정한다(S540).

발색 반응은 제2 복합체의 프로브 분자(231-234)에 표지 물질(미도시)을 결합시키고, 제2 복합체의 프로브 분자(231-234)에 결합된 표지물질을 기질(substrate)과 반응시켜 이루어진다. 본 발명에서 사용되는 TMB 등의 기질은 표지 물질(예: HRP)에 의해 산화되는데 산화된 TMB는 여기 상태(excited state)가 되었다가 바닥 상태(ground state)로 되면서 그 때의 에너지를 빛을 통하여 방출시킨다. 제1 복합체 즉, 항원-항체 복합체와 각각의 프로브 분자가 결합한 정도에 따라 방출되는 에너지에 따른 색상 변화 정도에 차이가 있다. 이에 따라 항원-항체 복합체와 프로브 분자의 결합 친화도를 측정할 수 있고, 이에 대한 프로파일(profile)을 작성할 수 있다.

다음으로, 측정된 결합 친화도와, 항원(또는 단백질)들에 대한 기존의 결합 친화도 데이터를 비교하여 표적 물질의 미세 구조를 확정한다(S550).

도 4a 및 도 4b에 도시된 반응 패턴에 따른 그래프를 참조하면, 도 3a에서 사용된, 예를 들면 A 타입의 인플루엔자 바이러스는 제1 프로브 분자(231) 한 개와, 제2 프로브 분자(232) 3개와, 제4 프로브 분자(234) 2개와 각각 결합한 것을 볼 수 있다. A 타입의 인플루엔자 바이러스는 제3 프로브 분자(233)와는 결합하지 않았다.

한편, 도 3b에서 사용된, 예를 들면 B 타입의 인플루엔자 바이러스는 제1 프로브 분자(231) 내지 제4 프로브 분자(234) 한 개와 각각 결합한 것을 볼 수 있다.

이와 같이, 인플루엔자 바이러스(상세하게는 인플루엔자 A 바이러스)의 서브 타입에 따라 각각의 프로브 분자와 결합하는 정도(결합친화도)가 다르기 때문에 반응 패턴이 다르게 나타나는 것을 알 수 있다. 이 반응 패턴을 이용하여 인플루엔자 바이러스의 서브 타입을 알아낼 수 있다.

요약하면, 1종의 항체에 공통적으로 결합할 수 있는 서브 타입이 다른 항원들의 서브 타입을, 종류가 다른 프로브 분자(예: 아미노산)들과 상기 항원들과의 결합 친화도를 이용하여 구별할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 단백질 미세 구조 분석 방법에서는, 단백질의 미세 구조의 변화를 분석하기 위하여 미리 분석하고자 하는 단백질들에 대한 결합 친화도를 데이터 베이스화하여 저장해 놓는다. 단백질의 많은 결합 가능 부분(예를 들면, 에피토프 또는 결합 자리(binding site))들이 프로브 분자에 대하여 가지고 있는 다양한 결합 친화도를 분석하고, 저장된 결합 친화도에 대한 데이터와 미지의 단백질에 대한 측정된 결합 친화도 신호 패턴을 비교하여 미지의 단백질이 어떤 단백질인지 알아낼 수 있다.

<실시예>

1) 재료(Materials)

분석하고자 하는 단백질(항원)과 1차적으로 결합하여 단백질을 선별하는 포획(capturing)용 항체로는 인플루엔자 A 바이러스를 측정할 때 사용되는 ProSci 3427를 사용하였다.

표적 물질(Target molecules)인 인플루엔자 A 바이러스의 서브 타입(sub-type)의 에피토프는 모두 한국 ㈜PEPTRON에서 합성하였다. 항체와 재조합 단백질(recombinant protein)은 ProSCI에서 구매하였고 기타 펩티드는 모두 합성하였다.

사용되는 시료들은 각각 1^st: Origin →A/Duck/Singapore/3/97 (H5N1), 2^nd: Origin →A/Vietnam/1203/2004 (H5N1), 3^rd: Origin →A/Swine/Iowa/15/30 (H1N1), 4^th: Origin →A/Puerdorico/8/34 (H1N1)이다.

그리고, 음성 표준(negative standard)으로는 BSA(Bovine Serum Albumin)을 이용하였고, 양성(Positive)으로는 재조합 단백질을 이용하였다. 시료로 사용된 각 항원들의 아미노산 서열은 다음의 <표 1>과 같다.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

I

C

Y

P

E

N

F

N

D

Y

E

L

K

H

L

II

C

Y

P

G

D

F

N

D

Y

E

L

K

H

L

III

C

Y

P

G

D

F

I

D

Y

E

L

R

E

Q

IV

C

Y

P

G

E

F

I

D

Y

E

L

R

E

Q

(Glycine(Gly,G), Alanine(Ala,A), Valine(Val,V), Leucine(Leu,L), Isoleucine(Ile,I), Proline(Pro,P), Phenylalanine(Phe,F), Tyrosine(Tyr,Y), Tryptophan(Trp,W), Cysteine(Cys,C), Methionine(Met,M), Serine(Ser,S), Threonine(Thr,T), Lysine(Lys,K), Arginine(Arg,R), Histidine(His,H), Aspartate(Asp,D), Glutamate(Glu,E), Asparagine(Asn,N), Glutamine(Gln,Q))

2) 방법(Method)

아래의 <표 2>에는 본 발명에서 이용되는 버퍼(Buffer)들이 설명되어 있다. <표 2>에 개시된 버퍼를 만드는 방법은 모두 ProSci사의 매뉴얼을 따랐다.

(1) 1차 항체 고정화

①인플루엔자 A 바이러스의 1차 선별을 위한 항체 원액을 카보네이트 버퍼(Carbonate buffer, pH 9.4)에 농도가 1.0ug/ml 되게 녹인다.

②1분 이상 쉐이킹(shaking)한 후에, 96 웰 마이크로 플레이트(96 well micro plate, Nunc 사의 high affinity)에 100.0ul씩 분주한다.

③24간 동안 23℃ 습도는 80%의 항습기(humidity chamber)에 정치 배양한다.

④배양 후 PBS 0.02 % 티머졸(thimersol)또는 DI water(ph 7.4)으로 2회 세척(washing) 한다.

⑤세척 후 PBS 블러킹 버퍼(PBS blocking buffer)를 200ul씩 분주한 후 2시간 동안 부드럽게 쉐이킹(shaking)하면서 배양한다.

⑥배양 후 다시 PBS 0.02% 티머졸를 이용하여 2회 이상 세척한다.

(2) 표적 물질 주입

세척한 후에 준비된 표적 물질 용액(target solution, 본 실험에서는 바이러스성 단백질의 펩티드 용액)을 100 ul씩 분주한다.

표적 물질 용액의 준비는 다음과 같다.

①우선, 합성된 경우는 200 ug/ml가 되게 PBS 버퍼에 희석(dilution) 한다. 실제로는 1.0 mg/5ml를 준비하였다(Stock 1).

②Stock 1을 20배 희석 버퍼(dilution buffer)에 희석한다.

③다음으로는 150 ul를 3000 ul의 희석 버퍼에 녹인다.

④이렇게 준비된 표적 물질 용액 100 ul를 분주한다.

분주할 때에는 2번의 실험을 위해 동일한 플레이트(plate)를 2개 준비한다. 2번의 실험을 수행하는 이유는 실험 오차를 줄이기 위함이다.

분주 방법은 아래의 <표 3>에 기재된 내용에 따른다. <표 3>의 각 셀은 마이크로 플레이트(microplate)를 나타낸다.

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
B	I
C	II
D	III
E	IV
F	BSA
G	Recombinant protein
H

*흰색 부분은 실험에 사용하지 않는 부분이다.

1시간 동안 부드럽게 쉐이킹하면서 배양한 후에, PBS 워싱 버퍼(PBS washing buffer)를 이용하여 5회 세척하고, PBS 0.02% 티머졸을 이용하여 3회 세척한다.

(3) 아미노산 이량체(amino acid dimer) 주입

①배양 후에 아미노산 이량체 용액(dimer+biotin) 150uM 용액을 100 ul식 분주한다. 분주된 이량체(dimer)의 종류는 다음과 같다.

1) TRP-TRP 2) SER-HIS 3)GLU-ILE 4)SER-PRO 5)ASN-GLU 6)GLY-TRP 7)MET-ALA 8)MEY-LYS 9)PHE-GLY 10) ILE-LEU

2번 컬럼(column)에 1번 이량체 용액, 3번 컬럼에 2번 이량체 용액 순으로 10가지 이량체 용액을 모두 주입한다.

②그 후, 이량체 용액을 PBS 버퍼를 이용하여 희석한다.

③다시 1시간 동안 부드럽게 쉐이킹하여 배양(70~80 rpm)한다.

④배양이 끝나면 다시 PBS 0.02% 티머졸을 이용하여 3회 세척한다.

(4) HRP(horseradish peroxidase) 주입

①세척이 끝나면 PBS buffer을 이용하여 1:5000으로 희석한 스트렙트아비딘-HRP(streptavidin-HRP)용액을 100 ul씩 분주한다.

②분주 후 다시 워싱 버퍼(Washing buffer)로 5회 세척하고, 이어서 PBS 0.02% 티머졸로 3회 세척한다.

본 실험에서 사용되는 PBS 0.02% 티머졸은 방부제로 사용될 수 있기 때문에 일반적인 PBS에 비하여 기타 잡균이 자라는 것을 방지할 수 있는 효과가 있다.

(5) TMB(tetramethyl benzidine) 주입

TMB 용액(TMB solution)을 넣고 15분 정도 반응시킨 후, 마이크로 플레이트 리더기(Micro plate reader)를 이용하여 분석한다.

즉, 본 발명의 실시예에 따른 단백질 미세 구조 분석 방법은, 1차 항체를 이용하여 항원을 선별한 다음, 여기에 다양한 종류의 프로브 분자(예를 들면, 아미노산 이량체 등의 저분자 물질)를 하나의 셀에 한 종류씩 포함하는 어레이를 만든 다음, 각각의 프로브 분자의 결합 친화도의 차이를 확인하고 이를 이용하여 미세한 차이를 확인함으로써 확인이 어려운 단백질의 미세 구조의 변화를 확인할 수 있다.

도 6은 도 5의 단백질 미세 구조 분석 방법에 의한 단백질 미세 구조 분석 결과를 설명하는 그래프이다.

도 6은 이와 같은 본 발명의 실시예에 따른 단백질 미세 구조 분석 방법을 이용하여 4가지의 바이러스 성 단백질의 에피토프를 분석한 결과이다. X축의 번호는 아미노산 이량체의 종류를 나타낸다. 각 번호별 아미노산 이량체의 종류는 다음과 같다.

도 6을 참조하면, 제1 시료는 아미노산 이량체의 결합 친화도가 1번이 가장 높고, 5번, 2번, 4번, 3번의 순서로 낮아지는 것을 볼 수 있다. 제2 시료는 아미노산 이량체의 결합 친화도가 1번이 가장 높고, 2번, 4번, 5번, 3번의 순서로 낮아지는 것을 볼 수 있다. 제3 시료는 아미노산 이량체의 결합 친화도가 1번이 가장 높고, 2번, 4번, 6번, 3번의 순서로 낮아지는 것을 볼 수 있다. 제4 시료는 아미노산 이량체의 결합 친화도가 1번과 4번이 비슷하고, 2번이 그 다음으로 높으며, 3번과 6번이 다음으로 높은 것을 볼 수 있다.

이와 같이, 시료의 종류마다 결합 친화도의 신호 패턴이 다른 것을 알 수 있다. 따라서, 데이터베이스에 저장된 결합 친화도에 대한 데이터와 미지의 단백질에 대한 측정된 결합 친화도 신호 패턴을 비교하여 미지의 단백질이 어떤 단백질인지 알아낼 수 있다.

이상에서 설명한 본 발명의 실시예는 장치 및 방법을 통해서만 구현이 되는 것은 아니며, 이러한 구현은 앞서 설명한 실시예의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가라면 쉽게 구현할 수 있는 것이다.

이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

표적 물질의 미세 구조에 관계없이 상기 표적 물질의 포획이 가능한 포획 물질을 기판에 고정시키는 단계;
상기 표적 물질과 상기 포획 물질을 결합시켜 제1 복합체를 형성하는 단계;
상기 제1 복합체를 복수 종류의 프로브 분자 중 1종의 프로브 분자와 각각 결합시켜 복수 개의 제2 복합체를 형성하는 단계;
상기 복수 개의 제2 복합체에 발색 반응을 수행하여 상기 제1 복합체와 상기 프로브 분자의 결합 친화도를 측정하는 단계;
측정된 상기 결합 친화도와 기존의 결합 친화도 데이터를 비교하여 상기 표적 물질을 확정하는 단계;
를 포함하는 단백질 미세 구조 분석 방법.
제1항에 있어서,
상기 프로브 분자는
아미노산 이량체(amino acid dimer)를 포함하는 단백질 미세 구조 분석 방법.
제2항에 있어서,
상기 아미노산 이량체는
TRP-TRP, SER-HIS, GLU-ILE, SER-PRO, ASN-GLU, GLY-TRP, MET-ALA, MEY-LYS, PHE-GLY, ILE-LEU로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 미세 구조 분석 방법.
제3항에 있어서,
상기 프로브 분자는
하기의 <구조식 1>로 구성되는 단백질 미세 구조 분석 방법.
<구조식 1>
NH2 - (amino acid 1) - (amino acid 2) - PEG - Biotin
제1항에 있어서,
상기 발색 반응을 수행하는 단계는,
상기 제2 복합체의 상기 프로브 분자에 표지 물질을 결합시키는 단계;
결합된 상기 표지물질과 기질을 반응시켜 발생 반응을 일으키는 단계를 포함하는 단백질 미세 구조 분석 방법.
제5항에 있어서,
상기 표지 물질은
HRP(HorseRadish Peroxidase)인 단백질 미세 구조 분석 방법.
제5항에 있어서,
상기 기질은
TMB(TetraMethyl Benzidine)인 단백질 미세 구조 분석 방법.
표적 물질의 미세 구조에 관계없이 상기 표적 물질과 결합하여 제1 복합체를 형성하는 포획 물질; 및
상기 제1 복합체의 상기 표적 물질에 1종씩 결합하여 복수 개의 제2 복합체를 형성하는 복수 종류의 프로브 분자;
를 포함하고,
상기 복수 개의 제2 복합체에서의 상기 표적 물질과 상기 프로브 분자의 결합 친화도에 따라 상기 표적 물질의 미세 구조가 결정되는 단백질 미세 구조 분석용 어레이.
제8항에 있어서,
상기 프로브 분자는
아미노산 이량체(amino acid dimer)를 포함하는 단백질 미세 구조 분석용 어레이.
제9항에 있어서,
상기 아미노산 이량체는
TRP-TRP, SER-HIS, GLU-ILE, SER-PRO, ASN-GLU, GLY-TRP, MET-ALA, MEY-LYS, PHE-GLY, ILE-LEU로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 미세 구조 분석용 어레이.
제8항에 있어서,
상기 제2 복합체의 상기 프로브 분자에 결합하여 상기 제1 복합체와 상기 프로브 분자의 결합 친화도를 측정하기 위한 발색 반응을 수행하는 표지 물질
을 더 포함하는 단백질 미세 구조 분석용 어레이.
제11항에 있어서,
상기 표지 물질은
기질을 산화시켜 발색 반응을 수행하는 단백질 미세 구조 분석용 어레이.
제12항에 있어서,
상기 기질은
TMB(TetraMethyl Benzidine)인 단백질 미세 구조 분석용 어레이.
청구항 제8항 기재의 단백질 미세 구조 분석용 어레이를 이용하여 제작되는 인플루엔자 A 바이러스 진단용 바이오 센서.