CN112724195B - 多肽、包含其的多肽产品、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多肽、包含其的多肽产品、试剂盒及应用。该多肽能够特异性地与SARS‑CoV‑2的刺突蛋白结合，且多肽与刺突蛋白的特异性结合能够被SARS‑CoV‑2的中和抗体竞争性抑制。尤其是SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5所示的多肽，与SARS‑CoV‑2的刺突蛋白的结合能够被中和抗体竞争性地降低或抑制，从而能够用于检测和表征待测样本中是否存在目标抗体。
Description
技术领域
本发明涉及抗体筛选领域，具体而言，涉及一种多肽、包含其的多肽产品、试剂盒及应 用。
背景技术
为控制或阻断新型冠状病毒“SARS-CoV-2”(Severe Acute RespiratorySyndrome Coronavirus 2)传播，急需要开发出相应的遏制新冠病毒传播的药物或检测相关试剂，尤其是 多肽类的相关产品。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种多肽、包含其的多肽产品、试剂盒及应用，为遏制新冠 病毒提供新的检测手段。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种多肽，该多肽能够特异性地与 SARS-CoV-2的刺突蛋白结合，且多肽与刺突蛋白的结合能够被SARS-CoV-2的中和抗体竞争 性抑制。
进一步地，多肽能够特异性地与SARS-CoV-2的刺突蛋白的受体结合区域结合。
进一步地，多肽选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5中的任意一条或多条；优选地，多肽为修饰后的肽段；优选地，修饰为化学基团修饰或氨基酸修饰；优选地，化学基团修饰为PEG修饰；优选地，PEG修饰为直链PEG修饰、具有单官能团的PEG修饰或者具有双官能 团的PEG修饰；优选地，PEG修饰的位点选自多肽的N端、C端、Lys侧链和Cys侧链中的 任意一个或多个；优选地，PEG修饰为分子量为500～40000的PEG修饰；优选地，氨基酸修 饰为亲水性氨基酸修饰或半胱氨酸修饰；优选地，亲水性氨基酸修饰为在多肽的N端、C端 或者NC两端添加1-4个亲水性氨基酸，更优选地，亲水性氨基酸为Glu、Lys、Ser或Gly； 进一步优选地，1-4个亲水性氨基酸选自如下任意一种：Glu-Glu、Lys-Lys或Ser-Gly-Ser；优 选地，半胱氨酸修饰为在多肽的如下任一位置添加半胱氨酸：N端、C端、NC两端或肽链中 间；更优选地，在肽链中间添加半胱氨酸包括在肽链中间插入一个或多个半胱氨酸，或者一 个或多个半胱氨酸以支链形式连接于肽链的中间。
根据本发明的第二个方面，提供了一种检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂，该试剂包括 上述多肽。
根据本发明的第三个方面，提供了一种检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂盒，该试剂盒 包括检测试剂或检测芯片，检测试剂包括上述任一种多肽，或者检测芯片上设置有上述任一 种多肽。
根据本发明的第四个方面，提供了一种多肽产品，多肽产品包括上述任一种多肽。
进一步地，多肽产品还包括多肽稳定剂；优选地，多肽稳定剂包括150～180mMNaCl、 100～140mM的聚赖氨酸盐酸盐及水。
根据本发明的第五个方面，提供了一种检测SARS-CoV-2的试剂盒，试剂盒包括检测试 剂或检测芯片，检测试剂包括上述任一种多肽，或者检测芯片上设置有上述任一种多肽。
根据本发明的第六个方面，提供了上述任一种在制备检测SARS-CoV-2或SARS-CoV-2 的中和抗体的试剂盒中的应用。
根据本发明的第七个方面，提供了一种检测SARS-CoV-2的中和抗体的方法，该方法包 括：将待测样本与荧光标记的SARS-CoV-2的刺突蛋白进行共孵育预处理，得到预处理样本； 将预处理样本、荧光标记的SARS-CoV-2的刺突蛋白分别与上述任一种多肽进行孵育；检测 并判断预处理样本的多肽的荧光信号强度与荧光标记的SARS-CoV-2的刺突蛋白的多肽的荧 光信号强度之间的差值是否满足预设阈值；输出判断结果。
进一步地，预设阈值通过以下方法计算得到：计算上述任一种多肽，优选SEQ IDNO：1 和SEQ ID NO:4所示的两种多肽对应特征的荧光信号强度在各阴性处理样本中和在荧光标记 的SARS-CoV-2的刺突蛋白中的差值，并计算差值的平均值，记为差异均值；选择所有阴性 处理样本对应的差异均值中的最大值作为判断阈值；其中，阴性处理样本为阴性样本与荧光 标记的SARS-CoV-2的刺突蛋白进行共孵育预处理后的样本；优选地，待测样本和阴性样本 均为血清样本；优选地，在计算差值之前，将多肽对应特征的荧光信号强度转换为对数值， 更优选转换为log10值进行计算。
进一步地，在最佳样本浓度下进行共孵育预处理；优选地，最佳样本浓度通过如下方式 确定：采用多个不同浓度的阴性样本和多个不同浓度的阳性样本分别与荧光标记的SARS-CoV-2的刺突蛋白进行共孵育预处理，得到不同浓度下的阴性处理样本和阳性处理样本；利用多肽芯片技术对阴性处理样本和阳性处理样本进行检测，获得在不同浓度下的检测 结果；选择不同浓度下的检测结果中，荧光信号强度在阴性处理样本和阳性处理样本中的差 异最显著的多肽所对应的浓度，即为最佳样本浓度；优选地，在最佳样本浓度下计算判断阈 值；更优选，将荧光信号强度在阴性处理样本和阳性处理样本中的差异最显著的多肽记为最 佳多肽，在最佳样本浓度下利用最佳多肽计算得到判断阈值；进一步优选，最佳样本浓度为 1:5000的稀释倍数，最佳多肽为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:4所示的多肽。
进一步地，上述多肽设置在多肽芯片上。
应用本发明的技术方案，本申请中所筛选的多肽均能与S蛋白的特异性结合，尤其是SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5所示的多肽，且这种结合能够被中和抗体竞争性地降低或抑制， 从而能够用于检测和表征待测样本中是否存在目标抗体。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实 施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了本申请优选实施例中所提供的用于检测新冠病毒S-RBD抗体的肽段的筛选方 法的流程示意图；
图2示出了根据本发明的实施例3中FDLFYVEKG肽段在新冠中和抗体阳性样和阴性样 本检测结果中存在的信号值差异；
图3示出了根据本发明的实施例3中的PFGDLFYLG肽段在新冠中和抗体阳性样本和阴 性样本检测结果中存在的信号值差异。
图4示出了根据本发明的实施例3中的GANEVFVLF肽段在新冠中和抗体阳性样本和阴 性样本检测结果中存在的信号值差异。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。 下面将结合实施例来详细说明本发明。
新冠肺炎由新型冠状病毒(本申请中指SARS-CoV-2)引起。新型冠状病毒属于β属的冠 状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，直径60～140nm。具有5个必需基因，分别针对核 蛋白(N)、病毒包膜(E)、基质蛋白(M)和刺突蛋白(S)4种结构蛋白及RNA依赖性的 RNA聚合酶(RdRp)。核蛋白(N)包裹RNA基因组构成核衣壳，外面围绕着病毒包膜(E)， 病毒包膜包埋有基质蛋白(M)和刺突蛋白(S)等蛋白。刺突蛋白通过结合血管紧张素转化 酶2(ACE-2)进入细胞。体外分离培养时，新型冠状病毒96个小时左右即可在人呼吸道上 皮细胞内发现，而在VeroE6和Huh-7细胞系中分离培养约需4～6天。冠状病毒对紫外线和 热敏感，56℃30分钟、乙醚、75％乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭 活病毒，氯己定不能有效灭活病毒。
为了开发针对SARS-CoV-2的相关检测产品，本申请针对与人受体蛋白hACE2结合的刺 突蛋白，利用多肽芯片技术筛选了一批能够特异性地与刺突蛋白结合的多肽，且多肽与刺突 蛋白之间的结合能够被中和抗体所抑制和减弱。在此基础上，申请人提出了本申请的技术方 案。
多肽芯片是一种基于衬底材料的芯片，芯片上包括预先设计数量、位置和序列的特征， 一个特征是一簇序列相同的多肽，特征与特征之间的多肽序列往往是不一样的，这些特征组 成一个高密度多肽阵列。
多肽芯片技术是基于多肽芯片的检测技术，其利用多肽芯片上的种类繁多的多肽与样本 的接触，然后利用荧光检测技术图像采集技术采集多肽芯片上各个特征信号(具体可表现为 携带各个特征信号的荧光图像)，进而输出芯片中每个特征的信号强度，即多肽芯片检测结果 数据。输出样本检测信号，基于多肽芯片检测结果数据输出的样本检测信号，可实现对与多 肽芯片上的多肽结合的样本中的待测物的分析，样本的分析等。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种多肽，该多肽能够特异性地与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合，且多肽与刺突蛋白的结合能够被SARS-CoV-2的中和抗体竞争性抑制。
在一种优选的实施例中，该多肽能够特异性地与SARS-CoV-2的刺突蛋白的受体结合区 域结合，这种结合能够被SARS-CoV-2的中和抗体竞争性抑制。
在一种优选的实施例中，多肽选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5中的任意一条或多条。 优选SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4。这些多肽均能特异性地与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合，且能够被SARS-CoV-2的中和抗体竞争性抑制。
为进一步提高某些多肽的亲和性，在一些优选的实施例中，上述多肽中的任一条或多条 肽段为修饰后的肽段。具体的修饰可以是化学基团修饰，也可以是氨基酸修饰。优选化学基 团修饰为PEG修饰，优选地，PEG修饰为直链PEG修饰、具有单官能团的PEG修饰或者具 有双官能团的PEG修饰(功能性官能团可以是-NHS、-OH、-Mal、-NH2或-COOH，单官能团选自其中任意一种，双官能团选自其中任意两种)；优选地，PEG修饰的位点选自多肽的N端、C端、Lys侧链和Cys侧链中的任意一个或多个；优选地，PEG修饰为分子量为500～40000 的PEG修饰；优选地，氨基酸修饰为亲水性氨基酸修饰或半胱氨酸修饰。优选地，氨基酸修 饰为亲水性氨基酸修饰或半胱氨酸修饰；优选地，亲水性氨基酸修饰为在N端、C端或者NC 两端添加1-4个亲水性氨基酸；优选地，亲水性氨基酸为Glu、Lys、Ser或Gly；优选地，1-4 个亲水性氨基酸选自如下任意一种：Glu-Glu、Lys-Lys或Ser-Gly-Ser。
上述PEG修饰或亲水性氨基酸修饰能够增加多肽的亲水性。PEG修饰具有半衰期延长、 毒副作用减少以及物理、化学和生物稳定性增强等优势。
在某些实施例中，为了更好地实现对多肽的定向偶联，上述多肽中的任一条或多条肽段 可以为半胱氨酸修饰的肽段。具体地，包括但不限于在肽段的N端、C端或者NC两端添加， 或者在肽段的肽链中间添加半胱氨酸。当在肽段的肽链中间添加半胱氨酸时，一个或多个半 胱氨酸可以插入肽链中间(即插入两个氨基酸残基之间)，也可以将一个或多个半胱氨酸以支 链形式连接于肽链的中间(即作为肽链中间的某个氨基酸的侧链)。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂，试 剂包括上述任一种多肽。上述多肽作为hACE2蛋白的类似蛋白，具有特异性结合SARS-CoV-2 的刺突蛋白的作用，因而如果待测抗体为中和抗体，则可以采用上述多肽来进行检测，其具 体检测的方法与ACE2作为受体进行检测中和抗体的方法相同。比如，可以将上述多肽中的 一条或多条包被在Elisa板上，然后将S蛋白与待测样本进行检测前的混合孵育，之后再将孵 育后的待测样本加入酶标板中进行检测，若样本中存在新冠病毒的中和抗体，则其能竞争性 抑制上述多肽与S蛋白的结合，从而定性检测待测样本是否为新冠中和抗体阳性样本。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂盒， 该试剂盒包括上述任一种多肽。该试剂盒中的多肽的使用方法与上述检测试剂类似。
上述试剂盒，根据具体需要可以制备成多种不同类型的检测试剂盒。但从方便检测，便 于判断检测结果的角度考虑，试剂盒中的多肽多为预包被多肽。优选地，预包被多肽包被于 固相载体上；具体的预包被的固相载体根据需要合理设计。更优选，固相载体包括酶标板(多 为聚苯乙烯材料的)、膜载体或微球；进一步优选地，膜载体包括硝酸纤维素膜(使用最广泛)、 玻璃纤维素膜或尼龙膜，更进一步优选地，膜载体上还包被有阳性对照物，多肽-载体蛋白偶 联物和阳性对照物按检测顺序在硝酸纤维素膜上依次设置。
根据试剂盒的具体检测方法的不同，试剂盒中具体的配套试剂也相应有所不同，但均可 以根据已知试剂盒的配制方式进行组合配套试剂。优选地，上述试剂盒中还包括以下至少之 一：(1)酶标二抗，更优选酶标二抗为HRP标记的二抗(对应于ELISA检测试剂盒)；(2) 胶体金结合垫，胶体金结合垫上包被有胶体金标记的多肽和阳性对照物的特异性结合物(对 应于免疫胶体金检测试剂盒)；(3)标记垫，标记垫上包被有荧光标记的微球，微球上负载有 阳性对照物的特异性结合物(对应于免疫荧光检测试剂盒)。
上述免疫胶体金检测试剂盒和免疫荧光检测试剂盒检测相对更方便，只需要建立阳性对 照的C线和检测样本的T线即可。阳性对照的C线处预包被的阳性对照物，只要是能够随着 待测样本的血清层析过程携带过来的带有检测标记的特异性结合物结合即可，对具体的阳性 对照物的具体多肽或抗体并无特殊限定。优选地，上述阳性对照物选自鼠免疫球蛋白、人免 疫球蛋白、羊免疫球蛋白或兔免疫球蛋白，相应地，阳性对照物的特异性结合物选自抗鼠免 疫球蛋白、抗人免疫球蛋白、抗羊免疫球蛋白或抗兔免疫球蛋白。
上述抗鼠免疫球蛋白根据免疫的对象的不同，可以是羊抗鼠的免疫球蛋白或兔抗鼠的免 疫球蛋白，或者是其他可免疫的动物抗鼠的免疫球蛋白。同样地，抗人免疫球蛋白、抗羊免 疫球蛋白或抗兔免疫球蛋白也可以根据免疫动物的不同，是不同物种来源的抗免疫球蛋白。 上述免疫球蛋白可以是IgM、IgG、IgA、IgD或IgE中的任意一种。这些抗免疫球蛋白抗体可 以是单克隆抗体或多克隆抗体。
上述试剂盒中，根据所需要检测的样本数量的多少，所使用的酶标板的规格也有所不同， 可以在12～384孔酶标板中合理选择。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种多肽产品，包括上述任一种多肽。上述 多肽作为中和抗体的检测试剂，能够通过检测其与SARS-CoV-2的刺突蛋白的特异性结合是 否被抑制或减弱，从而判断待测抗体是否为中和抗体。
上述多肽产品作为检测试剂，为进一步提高其有效成分---多肽的稳定性，该多肽产品中 还包括多肽稳定剂，任何能够维持多肽存储稳定性的试剂或成分均可作为本申请的多肽稳定 剂。
在本申请一种优选的实施例中，上述多肽稳定剂包括150～180mM NaCl、100～140mM的 聚赖氨酸盐酸盐及水。更优选地，多肽稳定剂包括153～158mM NaCl、110～130mM的聚赖氨 酸盐酸盐及水；进一步优选地，多肽稳定剂包括154mM NaCl、126.4mM的聚赖氨酸盐酸盐及 水。具体地，多肽稳定剂中，NaCl的浓度可以是150mM、151mM、152mM、153mM、154mM、155mM、156mM、157mM、158mM、159mM、160mM、161mM、162mM、163mM、 164mM、165mM、166mM、167mM、168mM、169mM、170mM、171mM、172mM、173 mM、174mM、175mM、176mM、177mM、178mM、179mM或180mM；聚赖氨酸盐酸 盐的浓度可以是110mM、111mM、112mM、113mM、114mM、115mM、116mM、117mM、 118mM、119mM、120mM、121mM、122mM、123mM、124mM、125mM、126mM、127 mM、128mM、129mM、130mM、131mM、132mM、133mM、134mM、135mM、136mM、 137mM、138mM、139mM或140mM。
在本申请一种优选的实施例中，上述多肽产品中多肽的浓度为3～10μM，优选为5～8μM， 更优选为5μM。更具体地，可以是3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM。
在本申请第五种典型的实施例中，还提供了一种检测SARS-CoV-2的试剂盒，该试剂盒 包括检测试剂或检测芯片，检测试剂包括上述任一种多肽，或者检测芯片上设置有上述任一 种多肽。此处检测试剂或检测芯片中的多肽为上述能够特异性地与SARS-CoV-2的刺突蛋白 的受体结合区域结合的多肽。更优选为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示的多肽。来源于 感染过或正在感染新冠病毒的待测样本，比如血清样本中，存在中和抗体，因而采用本申请 的多肽，也能够通过抑制多肽与刺突蛋白的结合来检测或筛查人群中新冠病毒的感染情况。
在本申请第六种典型的实施方式中，还提供了上述任一种多肽在制备检测SARS-CoV-2 或检测SARS-CoV-2的中和抗体的试剂盒中的应用。
本申请的多肽，主要是用于检测中和抗体，检测中和抗体可用于判断是否曾经感染过新 冠或目前感染了新冠。当然也不排除可被开发成药物的潜在应用价值。
上述试剂盒根据具体类型的不同，对中和抗体的检测步骤也有所不同。在本申请第七种 典型的实施方式中，提供了一种检测SARS-CoV-2的中和抗体的方法，该方法包括：将待测 样本与荧光标记的SARS-CoV-2的刺突蛋白进行共孵育预处理，得到预处理样本；将预处理 样本与上述任一种多肽进行孵育；检测并判断多肽对应特征的荧光信号强度与荧光标记的 SARS-CoV-2的刺突蛋白中相应的多肽的荧光信号强度之间的差值是否满足预设阈值；输出判 断结果。
优选，上述中和抗体的检测方法可以通过多肽芯片的方法来进行检测。即，多肽设置在 多肽芯片上。通过将待测样本与刺突蛋白预先孵育，若待测样本为中和抗体样本，则能够与 刺突蛋白特异性结合，从而抑制了后续刺突蛋白与多肽的结合，使得在多肽的检测信号强度 减弱或消失，若这种减弱或降低的程度满足了预设阈值，则可判断待测抗体为中和抗体。但 需要说明的是，本申请中并不排除，也可以将所筛选的多肽设置成类似ELISA试剂盒或免疫 胶体金试剂盒类似的产品进行上述中和抗体检测。
上述预设阈值可以通过以下方法计算得到：计算上述多肽中的任一种或以上，优选SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:4所示的两种多肽对应特征的荧光信号强度在各阴性处理样本中和在荧 光标记的SARS-CoV-2的刺突蛋白中的差值，并计算差值的平均值，记为差异均值；选择所 有阴性处理样本对应的差异均值中的最大值作为预设阈值；其中，阴性处理样本为阴性样本 与荧光标记的SARS-CoV-2的刺突蛋白进行共孵育预处理后的样本；优选地，待测样本和阴 性样本均为血清样本；优选地，在计算差值之前，将多肽对应特征的荧光信号强度转换为对 数值，更优选转换为log10值进行计算。
上述多肽相应特征的信号强度进行log10转换的主要目的是用于优化数值分布，其仅是使 信号强度值的具体数值趋于正态化的一种优选的方式，也可以采用其他的使数值趋于正态化 的转换方式(比如，采用原始信号强度值取对数，比如取ln、log2、log20等)，或者采用基于 log10的二次计算方式(比如log10的倒数)，再或者采用分位数转换或RankGuass等。
上述预设阈值的计算方法举例说明如下：如某个阴性处理样本的2条信号肽(优选为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4所示多肽)的信号强度转换为log10值之后分别为4.9和4.7，而 只有病原体的样本中对应的2条信号肽的信号强度转换为log10值之后分别为5.2和4.8，则 各自计算差值为5.2-4.9＝0.3，以及4.8-4.7＝0.1，将2条肽段差值的平均值：即0.3与0.1的平 均值0.2作为该样本的差异信号值。取多个阴性对照样本的相应差异信号值中的最大值作为预 设阈值。假如有10个阴性对照样本，其中，差异信号值中的最大值为0.4，则将0.4作为预设 阈值。
需要说明的是，上述检测可以在多个不同浓度下进行检测得到结果，为了在检测结果准 确的基础上进一步提高检测效率，在一种优选的实施例中，选择在最佳样本浓度下进行上述 共孵育预处理。此处的最佳样本浓度指在阴性样本和阳性样本检测时，荧光信号强度差异最 显著时的样本稀释浓度，具体可以通过多个浓度下实验进行确定。
优选地，上述最佳样本浓度通过如下方式确定：采用多个不同浓度的阴性样本和多个不 同浓度的阳性样本分别与荧光标记的SARS-CoV-2的刺突蛋白进行共孵育预处理，得到不同 浓度下的阴性处理样本和阳性处理样本；利用多肽芯片技术对上述阴性处理样本和上述阳性 处理样本进行检测，获得在不同浓度下的检测结果；选择上述不同浓度下的检测结果中，荧 光信号强度在上述阴性处理样本和上述阳性处理样本中的差异最显著的多肽所对应的浓度， 即为上述最佳样本浓度。
进而优选地，在上述最佳样本浓度下计算上述预设阈值；更优选地，将荧光信号强度在 上述阴性处理样本和上述阳性处理样本中的差异最显著的多肽记为最佳多肽，在上述最佳样 本浓度下利用上述最佳多肽计算得到上述预设阈值。优选上述最佳样本浓度为1:5000的稀释 倍数，上述最佳多肽为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:4所示的多肽。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
以新冠病毒为例，被新冠病毒感染过的人一般会产生中和抗体，这些功能性抗体通过与 病毒表面的刺突蛋白(S)结合来阻止病毒再感染健康细胞，具体而言，新型冠状病毒S蛋白 的受体结合区(RBD)可以与人的血管紧张素转换酶(ACE2)结合进一步引起细胞对新冠病 毒的内吞，导致病毒感染，而新冠病毒的中和抗体可以竞争性的与新型冠状病毒S蛋白的受 体结合区结合从而阻断这一过程。
目前现有技术中对新冠病毒中和抗体的检测大都是通过酶联免疫法技术进行新冠病毒中 和抗体的检测，主要技术路线如下：首先将制备好的ACE2蛋白包被在Elisa板上，然后将S 蛋白与样本进行检测前的混合孵育，之后再将孵育后的样本加入酶标板中进行检测，若样本 中存在新冠病毒的中和抗体，则其能竞争性抑制ACE2与S蛋白的结合，从而定性检测是否 为新冠中和抗体阳性样本。该技术依赖于高质量的ACE2蛋白用于酶标板的包被，且存在样 本检测通量有限、性能指标不够良好等问题。
以下实施例按照图1所示流程，使用HealthTell公司的多肽芯片技术，利用V13芯片(含 有超过13万种随机合成多肽的肽段簇)进行检测新冠病毒中和抗体的多肽的筛选。
实施例1第一肽段集的获得
在本实施例中，通过以刺突蛋白(S)的受体结合区域(RBD，即S蛋白的第319位氨基酸至第541位的氨基酸)代表S蛋白，进行第一肽段集的筛选。
其具体筛选步骤如下：
1、使用荧光标记试剂盒-Alexa
555Protein Labeling Kit(A20174)，对S-RBD重组 蛋白(购自南京金斯瑞生物科技有限公司，货号为Z03483，为定制产品，序列如SEQID NO： 6所示)进行荧光标记。
a.配制1M的碳酸钠缓冲溶液：加入1ml的蒸馏水至组分B玻璃瓶中(84mg的碳酸钠)， 混匀使其溶解；
b.稀释蛋白：若蛋白浓度大于2mg/mL，需将蛋白稀释至2mg/mL(例如：1mg蛋白溶于0.5 mL 1×PBS或者0.1M碳酸钠缓冲溶液)；
c.调节pH：加入50μL 1M碳酸钠缓冲溶液(来自步骤a)至0.5mL含蛋白的1×PBS；最终pH值应是7.5–8.3。若蛋白已置于碳酸钠缓冲溶液(pH 8.0–8.3)或者PBS(pH 8.0)则可略过这一步；
d.配置标记反应混合液：加入蛋白溶液(来自步骤c)至装有反应染料的一个玻璃瓶中(组 份A)。盖上瓶盖，温和倒置或经枪头轻微吹打混合均匀。搅拌反应混合液，避免起泡；
e.孵育标记反应：于室温下低速磁力搅拌1小时。注意避免溶液起泡；
2、纯化已标记的S-RBD蛋白
a.准备纯化柱/纯化树脂：组装纯化柱，加入纯化树脂(组份C)至顶端3cm处。加入1×PBS 检查缓冲液是否能够流通。若缓冲液流动受阻，移除树脂，清洁玻璃滤头并重新装填树脂/缓冲液。 加入标记蛋白前需待多余缓冲液排出；
b.配置1×洗脱缓冲剂：于室温用蒸馏水将10X洗脱缓冲液(组份D)稀释10倍。正常情 况下，单次提纯用量不超过10mL；
c,蛋白质提纯：移开漏斗。倒入反应液至提纯柱树脂上；等待反应液融入树脂。用洗脱缓冲 剂或1×PBS洗提蛋白质，收集并保留所有余液；
d.计算DOL(标记程度)并且储存标记蛋白。
3、对已做好荧光标记的新冠S-RBD蛋白做浓度梯度稀释，并利用多肽芯片技术筛选能 与S-RBD相互结合的肽段。
多肽芯片检测方法如下：
1)样本制备
纯化后的荧光标记S-RBD蛋白初始浓度为0.5mg/mL，分为7个浓度梯度1:500、1:1000、 1:5000、1:10000、1:50000、1：500000、1：5000000系列稀释。
2)芯片的水化和组装
将芯片置于芯片水化用具中，加入超纯水没过芯片，在轨道摇床上55±5rpm/min，水化 20min。然后用异丙醇喷洒芯片表面后将芯片放入离心机离心干燥。干燥好的芯片按照实验设 计的位置组装成assay cassette。
3)样本与芯片孵育结合
将稀释好的样本按照90μL/孔加入组装好的芯片上，置于恒温振荡仪上振荡孵育1小时。
4)样本清洗
将assay cassette置于洗板机进行清洗。
5)成像
将assay cassette中的芯片进行拆卸、清洗、干燥后组装进imaging cassette，放入Molecular Device公司的ImageXpress micro 4成像仪进行扫描成像。最终每个检测样本得到一张TIFF 图片文件，即为原始数据。
本实施例中，采用的多肽芯片技术平台捕获靶点蛋白与多肽芯片集合的信号，再将信号 转换获得数据。其中，多肽芯片技术所使用到的仪器设备包括多肽芯片(比如Health Tell V13 芯片，型号为P/N:600001V13 Slides)，荧光成像仪(比如MelecularDevice Image Xpress Micro-4),芯片离心机(比如Labnet C1303T-230V)，洗板机(比如BioTek Instruments， 405TSUVS)，96孔板轨道式振荡器(比如Thermo scientific，88880026)，恒温混匀器(比如 Eppendorf Thermomixer C)。
4.数据预处理
1)提取特征的荧光强度数值，输出1个GPR5数据文件和1个corner images文件。其中， GPR5文件包含了一个样本的所有信息和所有特征的荧光强度信息。
2)从所有样本的GPR5数据文件中提取特征的荧光强度信息，生成原始荧光强度(FG， foreground)数据矩阵。然后对每个样本的数据分别进行对数转换得到LFG(log-transferred foreground)数据矩阵、进行z-score的标准化处理获得NLFG(normalizedand log-transferred foreground)数据矩阵。该步骤还会生成一个样本芯片信息文件，该文件包括了样本阵列位置、 所用芯片编号等信息。
5.质控
通过Health Tell自带的质控方法对样本和系统进行质控，是合格的。
6.筛选能与S-RBD蛋白强结合的多肽序列：取排除背景信号后，在不存在过饱和现象下 的信号强度排序在不同浓度下均靠前的信号肽段。
6.1)先将各信号强度转化成log10值，然后对于每个浓度的S-RBD蛋白样本(每个样本 三次技术重复)，逐个特征计算三次技术重复的log10值的中位数；
6.2)对于每个浓度的中位数样本，将数值转换为降序(降序排序：descending，对于数值 相同的特征，使用method＝min(lowest rank in group))排序；
6.3)对于一个肽段而言，如果某肽段在70％以上的浓度中的rank排序均在前100以内， 将该肽段纳入候选，得到第一候选集；
6.4)从第一候选集的所有候选肽段中，去除无关样本(即在空白对照中排序前5000的肽 段)，得到第二候选集；
6.5)根据第二候选集中的各多肽在多个不同浓度下对应的排序结果计算排序均值，然后 进行排序，挑选出排名靠前的肽段。
7.将筛选出与S-RBD蛋白具有强相互作用的肽段，作为能够检测中和抗体的初筛肽库， 即第一肽段集。部分信息具体信息如表1所示。
表1：
比对hACE2序列结果(数值区间)：表示的是肽段与hACE2的氨基酸序列中能比对上的 氨基酸的区间。
上表中的数字由大到小代表信号强度由强到弱(即数字1代表信号强度最强)，而信号强 度一定程度上代表着结合能力的强弱。但是，浓度是信号强度的一个影响因素，理论上，候 选肽段在不同浓度下若均较强，或均具有一定的信号强度，则代表该肽段与S-RBD的结合能 力较强。
上述操作中，将S-RBD进行不同浓度梯度稀释的原因是，需要根据不同浓度梯度稀释来 确定较佳的检测浓度，以及根据在不同浓度情况下的检测结果是否都具有较强的信号，从而 筛选得出第一肽段集。
实施例2第二肽段集的获得
由于根据中和抗体的定义，只有能够竞争性抑制病毒与受体结合的抗体才叫做中和抗体， 因此筛选出的肽段应能够较好地比对到hACE2的序列上。
筛选出能够与S蛋白很好地结合，同时与已知的S蛋白受体hACE2的序列相匹配的肽段 作为第二肽段集。具体的匹配示例如下：
利用blast软件，将上述第一肽段集中所有候选肽段与S蛋白受体hACE2进行比对，挑选 bit score>14作为能够比对上的肽段，其中bit score＝14为比对阈值，满足bitscore>14即表明 该肽段与S蛋白受体hACE2之间一定的具有相似性。
其中，与hACE2序列比对得到的5条肽段信息如下：
1)FDLFYVEKG(SEQ ID NO：1)
2)HKVDLFYFSD(SEQ ID NO：2)
3)LQLFQLFYQVF(SEQ ID NO：3)
4)PFGDLFYLG(SEQ ID NO：4)
5)GANEVFVLF(SEQ ID NO：5)。
实施例3中和试验验证第二肽段集
本实施例按照如图3所示详细流程进行验证，具体如下：
1.依据荧光标记新冠S-RBD蛋白筛选候选肽段的多肽芯片技术检测结果，将S-RBD蛋 白分别设置1:5000和1:10,000两个稀释比例来做中和实验；
2.分别对新冠病毒中和抗体阳性的人群血清样本和新冠病毒核酸检测及抗体检测阴性 的健康人血清样本进行浓度梯度稀释。
1)具体样本类型：
临床阳性血清样本：新冠病毒中和抗体阳性的人群血清样
临床阳性血清样本：共计2例新冠病毒中和抗体阳性血清样本，分别稀释500，1000，5000， 10000倍，每个浓度下进行3个技术重复。
阴性对照血清样本：共计2例已通过检测新冠病毒核酸检测及抗体检测阴性的健康人血 清样本，分别稀释500，1000，5000，10000倍，每个浓度下进行3个技术重复。
3.检测步骤：
1)样本制备
将步骤2中的血清样本与50μL荧光标记S蛋白进行1:1混合，并进行37℃孵育60分钟 (每30分钟手动混合一下混合物)，之后完成共同孵育的样本取90μl作为上样的样本。
2)多肽芯片组装
根据样本量取出4张芯片并组装芯片卡夹。
3)多肽芯片水化
将芯片卡夹放入水化盒中，加入水化剂1，放置于96孔板轨道式振荡器(55rpm)20分 钟进行水化。之后喷洒水化剂2，放置20分钟直至表面风干。
4)上样
将与S蛋白完成孵育的样本按照90μL/孔加入组装好的芯片上，用封板膜封板，检查确 认每一个孔位密封完好。
每一张芯片上加入阴性对照1孔，阳性对照1孔及待测样本，各90μL/孔。
其中阴性对照为样本稀释液；阳性对照为含有一定浓度的荧光标记的S-RBD蛋白溶液， 具体为利用样本稀释液按1:5000的稀释倍数稀释0.5mg/mL的纯化后的荧光标记的S-RBD蛋 白。
5)孵育
将组装好的芯片放置于96孔板37℃恒温混匀器上孵育60分钟，每6分钟需要将芯片卡 夹震荡15s。
6)洗板
终止震荡，撕膜后将芯片卡夹置于洗板机或进行人工清洗。
7)芯片干燥
将芯片卡夹放入水化盒，加入水化剂1清洗。之后喷洒水化剂2，放入芯片离心机中离心， 干燥芯片。
8)荧光成像
使用机械臂将芯片卡夹首先转移至条形码扫描的位置，待扫描完成后，再将芯片卡夹转 移至成像系统中，进行成像，生成TIFF图像。软件系统会进一步从图像文件中提取特征强度 数据。
9)数据处理
9.1提取特征的荧光强度数值，输出1个GPR5数据文件和1个corner images文件。其中， GPR5文件包含了一个样本的所有信息和所有特征的荧光强度信息。
9.2从所有样本的GPR5数据文件中提取特征的荧光强度信息，生成原始荧光强度(FG， foreground)数据矩阵。然后对每个样本的数据分别进行对数转换得到LFG(log-transferred foreground)数据矩阵、进行z-score的标准化处理获得NLFG(normalizedand log-transferred foreground)数据矩阵。该步骤还会生成一个样本芯片信息文件，该文件包括了样本阵列位置、 所用芯片编号等信息。
结果分析：针对新冠中和抗体阳性样本和阴性样本检测结果中，上述5条候选肽段的信 号值差异，确定出有2条最佳的特异性靶标信号肽段(FDLFYVEKG、PFGDLFYLG)，能够较好的实现对新冠中和抗体的检测；其他3条候选肽段可作为备选肽段或肽库。
新冠中和抗体阳性样本和阴性样本检测结果中上述5条候选肽段的信号值差异如图2、图 3和图4所示，图中纵轴为肽段对应的荧光信号强度为取log10后的值。
本实施例筛选出在中和抗体阳性血清与阴性血清中信号值差异最显著的2条肽段作为检 测肽段(即SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4)，并确定其在1:5000倍的样本稀释下差异最为 明显，因此设置为检测中和抗体的最佳样本稀释浓度。
实施例4样本验证实验
1.样本类型
临床阳性血清样本：新冠中和抗体阳性的血清样本和新冠感染康复后的人群血清样本。
阴性对照血清样本：检测新冠病毒核酸检测及抗体检测阴性的健康人血清样本。
2.样本数量
临床阳性血清样本：共计13例新冠感染康复后的人群血清样本，分别进行1:5000的稀释， 3个技术重复。
阴性对照血清样本：共计11例已通过检测新冠病毒核酸检测及抗体检测阴性的健康人血 清样本，分别进行1:5000的稀释，3个技术重复。
3.样本采集
采集受检者的静脉血1mL，并立即进行血清分离，获得血清样本。
4.多肽芯片检测过程与结果分析
4.1分别将以上血清样本与荧光标记的S-RBD蛋白进行共孵育，之后将完成孵育的样本 根据新冠中和抗体检测的标准流程进行检测；
4.2通过前述筛选出的信号肽所确定的阈值范围(0.5-1)判定以上血清样本是否为新冠中 和抗体阳性样本。
阈值范围的确定：(可有多种方法，比如下列步骤(2)中可以仅用1个肽段、任意一个肽段；以阳性样本的最低值为阳性样本判断的最低阈值下限；下列步骤(3)中的分值还可以进一步乘以一个系数，例如1.1或1.2的经验值)
(1)将用于检测的肽段的荧光强度数据转换为log10模式；
(2)计算阴性样品和只有荧光标记S蛋白所对应的2个确定的信号肽的各自的差值，将 差值的平均值用作评估得分；
(3)将所有阴性样品的最高评估分设置为确定中和抗体存在的阈值(比如可以选择确定 新冠中和抗体阴性的样本，用其确定本检测方法的阈值。为保证低特异性，设置阴性样本信 号评估值作为判定阈值)，如0.678。
5.使用其他商用临床诊断试剂盒(Elisa)方法对以上血清样本进行检测，判断是否为新 冠中和抗体阳性样本，并与此处多肽芯片检测结果进行对比。其中，商用临床诊断试剂盒 (Elisa)信息如下：
产品名称：新冠中和抗体ELISA检测试剂盒(SARS-CoV-2Surrogate VirusNeutralization Test Kit)，生产厂家为金斯瑞生物科技股份有限公司，产品编号为L00847。
上述两种方法的检测结果如下表。
表2：对比结果：
如上表所示，本申请的方法与目前市面上的试剂盒相比，能够更为灵敏的检测出待测样 本中是否存在中和抗体。
从上述实施例的描述可以看出，本申请的方法能够高效准确的实现目标抗体(如中和抗 体)检测肽段的筛选和确认。
以目标抗体为中和抗体为例，本申请所建立的中和抗体的检测方法，特异性强、操作简 单、耗时短、成本低、可大批量检测，能特异性的检测病原体(如新冠病毒)的中和抗体。 具体而言，与酶联免疫法(Elisa)检测病原体(如新冠病毒)中和抗体的方法相比，本申请 的检测方法具有以下主要优点：
1)极高灵敏度，血量用量极少，建立优于酶免法数千倍的新冠中和抗体高灵敏评估体系；
2)通量高，酶免法主要为单次单项检测，以酶免法为主的检测方法，操作通量受限；本 开发方法一次样本测试，可同时实现多项检测，高通量＞1000样本/天，目前新冠中和抗体检 测主要以手动或半自动化；
3)肽段的生物学特性与免疫性质清楚可控，合成便捷可自动化，能够实现高效稳定的新 冠中和抗体评价。
需要说明的是，本申请的上述实施例仅是以新冠病毒为例说明本申请的中和抗体的检测 方法，根据实际应用及研究需要，新冠病毒可以替换为其他感兴趣的病原体，相应地，新冠 病毒的中和抗体，可以替换为其他感染性病原体的中和抗体，例如乙肝病毒、丙肝病毒、HPV 或SARS等。其中，如果替换为乙肝病毒中和抗体，则相应的候选结合物可以为HBsAg；如 果为SARS中和抗体时，相应的候选结合物可以是SARS病毒的S蛋白。此外，上述具体实 施例中的新冠病毒的S蛋白也可以是新冠病毒的其他蛋白成份，例如新冠病毒N蛋白。
本申请实施例中所筛选的多肽，能够竞争性地降低或抑制ACE2蛋白与S蛋白的结合， 从而减弱或抑制新冠病毒对人体的感染作用。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说， 本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、 改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 珠海碳云智能科技有限公司
<120> 多肽、包含其的多肽产品、试剂盒及应用
<130> PN147325SZTY
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(9)
<223> 与S-RBD特异结合且与hACE2匹配的多肽
<400> 1
Phe Asp Leu Phe Tyr Val Glu Lys Gly
1 5
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(10)
<223> 与S-RBD特异结合且与hACE2匹配的多肽
<400> 2
His Lys Val Asp Leu Phe Tyr Phe Ser Asp
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(11)
<223> 与S-RBD特异结合且与hACE2匹配的多肽
<400> 3
Leu Gln Leu Phe Gln Leu Phe Tyr Gln Val Phe
1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(9)
<223> 与S-RBD特异结合且与hACE2匹配的多肽
<400> 4
Pro Phe Gly Asp Leu Phe Tyr Leu Gly
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(9)
<223> 与S-RBD特异结合且与hACE2匹配的多肽
<400> 5
Gly Ala Asn Glu Val Phe Val Leu Phe
1 5
<210> 6
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(201)
<223> S-RBD重组蛋白
<400> 6
Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr
1 5 10 15
Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys
20 25 30
Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe
35 40 45
Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr
50 55 60
Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln
65 70 75 80
Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu
85 90 95
Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu
100 105 110
Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg
115 120 125
Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr
130 135 140
Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr
145 150 155 160
Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr
165 170 175
Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro
180 185 190
Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser
195 200
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(10)
<223> 与S-RBD特异结合的多肽
<400> 7
Tyr Ala Tyr Glu Tyr Val Phe Phe Ser Glu
1 5 10
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(7)
<223> 与S-RBD特异结合的多肽
<400> 8
Pro Phe Phe Phe Phe Glu Gly
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(10)
<223> 与S-RBD特异结合的多肽
<400> 9
Gln Val Val Glu Val Phe Trp Leu Phe Asp
1 5 10
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(8)
<223> 与S-RBD特异结合的多肽
<400> 10
Asn Tyr Val Phe Phe Phe Glu Gly
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(9)
<223> 与S-RBD特异结合的多肽
<400> 11
Arg Leu Glu Phe Leu Phe Leu Phe Glu
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(8)
<223> 与S-RBD特异结合的多肽
<400> 12
Gln Tyr Leu Phe Phe Leu Glu Gly
1 5
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(10)
<223> 与S-RBD特异结合的多肽
<400> 13
Pro Val Phe Leu Val Phe Pro Gln Arg Gly
1 5 10
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(9)
<223> 与S-RBD特异结合的多肽
<400> 14
Gln Ser Leu Phe Leu Glu Val Phe Ser
1 5
Claims (41)
1.一种多肽，其特征在于，所述多肽能够特异性地与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合，且所述多肽与所述刺突蛋白的结合能够被SARS-CoV-2的中和抗体竞争性抑制；
所述多肽能够特异性地与SARS-CoV-2的刺突蛋白的受体结合区域结合；
所述多肽为SEQ ID NO：1所示的多肽。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽为修饰后的肽段。
3.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述修饰为化学基团修饰或氨基酸修饰。
4.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述化学基团修饰为PEG修饰。
5.根据权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述PEG修饰为直链PEG修饰、具有单官能团的PEG修饰或者具有双官能团的PEG修饰。
6.根据权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述PEG修饰的位点选自所述多肽的N端、C端、Lys侧链和Cys侧链中的任意一个或多个。
7.根据权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述PEG修饰为分子量为500~40000的PEG修饰。
8.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸修饰为亲水性氨基酸修饰或半胱氨酸修饰；
所述亲水性氨基酸修饰为在所述多肽的N端和/或C端添加1-4个亲水性氨基酸。
9.根据权利要求8所述的多肽，其特征在于，所述亲水性氨基酸为Glu、Lys、Ser或Gly。
10.根据权利要求9所述的多肽，其特征在于，所述1-4个亲水性氨基酸选自如下任意一种：Glu-Glu、Lys-Lys或Ser-Gly-Ser。
11.根据权利要求8所述的多肽，其特征在于，所述半胱氨酸修饰为在所述多肽的如下任一位置添加半胱氨酸：N端和/或C端。
12.一种多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合为权利要求1所述的多肽，以及SEQ IDNO：2至SEQ ID NO：5序列所示的多肽中的任意一条或多条多肽形成的组合。
13.根据权利要求12所述的多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物为SEQ ID NO：1序列所示的多肽和SEQ ID NO：4序列所示的多肽的组合。
14.根据权利要求12或13所述的多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物为修饰后的肽段。
15.根据权利要求14所述的多肽组合物，其特征在于，所述修饰为化学基团修饰或氨基酸修饰。
16.根据权利要求15所述的多肽组合物，其特征在于，所述化学基团修饰为PEG修饰。
17.根据权利要求16所述的多肽组合物，其特征在于，所述PEG修饰为直链PEG修饰、具有单官能团的PEG修饰或者具有双官能团的PEG修饰。
18.根据权利要求16所述的多肽组合物，其特征在于，所述PEG修饰的位点选自所述多肽组合物的N端、C端、Lys侧链和Cys侧链中的任意一个或多个。
19.根据权利要求16所述的多肽组合物，其特征在于，所述PEG修饰为分子量为500~40000的PEG修饰。
20.根据权利要求15所述的多肽组合物，其特征在于，所述氨基酸修饰为亲水性氨基酸修饰或半胱氨酸修饰；
所述亲水性氨基酸修饰为在所述多肽组合物的N端和/或C端添加1-4个亲水性氨基酸。
21.根据权利要求20所述的多肽组合物，其特征在于，所述亲水性氨基酸为Glu、Lys、Ser或Gly。
22.根据权利要求21所述的多肽组合物，其特征在于，所述1-4个亲水性氨基酸选自如下任意一种：Glu-Glu、Lys-Lys或Ser-Gly-Ser。
23.根据权利要求20所述的多肽组合物，其特征在于，所述半胱氨酸修饰为在所述多肽组合物的如下任一位置添加半胱氨酸：N端和/或C端。
24.一种检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求1至11中任一项所述的多肽、或权利要求12至23中任一项所述的多肽组合物。
25.一种检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测试剂或检测芯片，
在含有所述检测试剂的所述试剂盒中，所述检测试剂包括权利要求1至11中任一项所述的多肽、或权利要求12至23中任一项所述的多肽组合物，或者
在含有所述检测芯片的所述试剂盒中，所述检测芯片上设置有权利要求1至11中任一项所述的多肽、或权利要求12至23中任一项所述的多肽组合物。
26.一种多肽产品，其特征在于，所述多肽产品包括权利要求1至11中任一项所述的多肽、或权利要求12至23中任一项所述的多肽组合物。
27.根据权利要求26所述的多肽产品，其特征在于，所述多肽产品还包括多肽稳定剂。
28.根据权利要求27所述的多肽产品，其特征在于，所述多肽稳定剂包括150~180mMNaCl、100~140mM的聚赖氨酸盐酸盐及水。
29.一种检测SARS-CoV-2的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测试剂或检测芯片，
在含有所述检测试剂的所述试剂盒中，所述检测试剂包括权利要求1至11中任一项所述的多肽、或权利要求12至23中任一项所述的多肽组合物，或者
在含有所述检测芯片的所述试剂盒中，所述检测芯片上设置有权利要求1至11中任一项所述的多肽、或权利要求12至23中任一项所述的多肽组合物。
30.权利要求1至11中任一项所述的多肽、或权利要求12至23中任一项所述的多肽组合物在制备检测SARS-CoV-2或SARS-CoV-2的中和抗体的试剂盒中的应用。
31.一种非诊断目的的检测SARS-CoV-2的中和抗体的方法，其特征在于，所述方法包括：
将待测样本与荧光标记的SARS-CoV-2的刺突蛋白进行共孵育预处理，得到预处理样本；
将所述预处理样本、荧光标记的SARS-CoV-2的刺突蛋白分别与权利要求1至11中任一项所述的任一种多肽、或权利要求12至23中任一项所述的多肽组合物进行孵育；
检测并判断所述预处理样本的所述多肽的荧光信号强度与所述荧光标记的SARS-CoV-2的刺突蛋白的所述多肽的荧光信号强度之间的差值是否满足预设阈值；
输出判断结果。
32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述预设阈值通过以下方法计算得到：
计算权利要求1至11中任一项所述的多肽、或权利要求12至23中任一项所述的多肽组合物，对应特征的荧光信号强度在各阴性处理样本中和在所述荧光标记的SARS-CoV-2的刺突蛋白中的差值，并计算所述差值的平均值，记为差异均值；
选择所有所述阴性处理样本对应的所述差异均值中的最大值作为所述预设阈值；
其中，所述阴性处理样本为阴性样本与所述荧光标记的SARS-CoV-2的刺突蛋白进行共孵育预处理后的样本。
33.根据权利要求-32 所述的方法，其特征在于，所述待测样本和所述阴性样本均为血清样本。
34.根据权利要求32所述的方法，其特征在于，在计算所述差值之前，将所述多肽对应特征的荧光信号强度转换为对数值。
35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，将所述多肽对应特征的荧光信号强度转换为log10值进行计算。
36.根据权利要求32所述的方法，其特征在于，在最佳样本浓度下进行所述共孵育预处理。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述最佳样本浓度通过如下方式确定：
采用多个不同浓度的阴性样本和多个不同浓度的阳性样本分别与荧光标记的SARS-CoV-2的刺突蛋白进行共孵育预处理，得到不同浓度下的阴性处理样本和阳性处理样本；
利用多肽芯片技术对所述阴性处理样本和所述阳性处理样本进行检测，获得在不同浓度下的检测结果；
选择所述不同浓度下的检测结果中，荧光信号强度在所述阴性处理样本和所述阳性处理样本中的差异最显著的多肽所对应的浓度，即为所述最佳样本浓度。
38.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，在所述最佳样本浓度下计算所述预设阈值。
39.根据权利要求38所述的方法，其特征在于，将荧光信号强度在所述阴性处理样本和所述阳性处理样本中的差异最显著的多肽记为最佳多肽，在所述最佳样本浓度下利用所述最佳多肽计算得到所述预设阈值。
40.根据权利要求39所述的方法，其特征在于，所述最佳样本浓度为1:5000的稀释倍数，所述最佳多肽为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:4所示的多肽。
41.根据权利要求31-40中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽设置在多肽芯片上。
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