JP2011164105A - タンパク質の微細構造分析方法及びタンパク質の微細構造分析用構造体 - Google Patents

タンパク質の微細構造分析方法及びタンパク質の微細構造分析用構造体 Download PDF

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Abstract

【課題】タンパク質の微細構造分析方法及びタンパク質の微細構造分析用構造体を提供すること。
【解決手段】本発明のタンパク質の微細構造分析方法は、標的物質の微細構造に関係なく標的物質の捕獲が可能な捕獲物質を基板に固定する段階と、標的物質と捕獲物質とを結合させて第１複合体を形成する段階と、第１複合体を複数種類のプローブ分子のうちの１種のプローブ分子とそれぞれ結合させて複数個の第２複合体を形成する段階と、複数個の第２複合体に発色反応を行って第１複合体とプローブ分子との結合親和度を測定する段階と、測定した結合親和度と既存の結合親和度データとを比較して標的物質を決定する段階と、を含む。したがって、高価装備や熟練技術なしに比較的に簡単な装備や試薬を有して簡単に標的タンパク質の微細構造を分析することができる。
【選択図】図５

Description

本発明は、タンパク質の構造分析方法に関し、特に、タンパク質の微細構造変化の分析方法に関する。
疾病の原因となるインフルエンザウイルス(ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ)のうちに特に問題とされているＡタイプ(ｔｙｐｅ)の場合は、ウイルス表面のタンパク質(ｐｒｏｔｅｉｎ)によりウイルス種類が決定される。主に、ＨＡ(ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ)とＮＡ(ｎｅｕｒｏａｍｉｄａｓｅ)の種類によってウイルスのサブタイプ(ｓｕｂ−ｔｙｐｅ)が決定されることになるが、現在までは、１５〜１６種のＨＡと９種のＮＡが知られている。
インフルエンザＡウイルスは、一般的に上記２種のタンパク質の略字を用いて表記される(例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１など)。理論的には約２００種類のインフルエンザウイルスが存在されているものの、現在まで人間に致命的な結果をもたらしたり、全世界的に問題となったりしたサブタイプは１９１８年２〜５千万人(一部のレポートでは約７千万人以上)が死亡したと知られたＨ１Ｎ１を含んで、約３〜４種類ともいわれている。そして、人間には直接的に感染しないと知られていたＨ５Ｎ１の場合は、Ｈ１Ｎ１と比較して人間に対する被害は少ないものの、変種出現によって家擒(鶏や鴨)産業に致命的な結果をもたらすとともに、東南アジアでは人命損失をもたらしている。
このようなウイルスの感染に迅速に対応するためには、問題ウイルスの種類を早期に判別することが重要である。実際に、人類はいつもウイルス感染に露出されていて、周期的にインフルエンザウイルス(普通１年に１〜２回流行する風邪(ｆｌｕ)を季節性インフルエンザ(ｓｅａｓｏｎａｌ ｆｌｕ)という)が流行される。したがって、感染力が非常に高く、人間に致命的なウイルスの場合は、正確な診断ができなければ新種インフルエンザウイルスの感染を初期に遮断して適切な診療を行うことができない。
しかし、インフルエンザＡウイルス感染の場合は、種類に関係なく症状が非常に類似していて実際の臨床診断だけでは季節性インフルエンザであるか、それともパンデミック(ｐａｎｄｅｍｉｃ)または流行性(ｅｐｉｄｅｍｉｃ)インフルエンザであるかが判別できない。
現在までインフルエンザＡウイルスの正確な判別のために用いられた方法は、ＲＴ−ＰＣＲ(Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ)を利用する遺伝子鑑別方式と免疫学的方法(主に、ＥＬＩＳＡやウエスタンブロット)を利用することが最も一般的であった。しかし、ＲＴ−ＰＣＲを利用する場合は、まずウイルスの遺伝的情報がすべて知られていなければならず、非常に高価な試薬や酵素などが必要であると共に、増幅の後に再分析を行わなければならないなど、時間と資源を多く消耗するという短所があった。
ＥＬＩＳＡ(Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ)とＷＢ(Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ)の場合は、比較的に簡単にタンパク質の種類が把握できるという長所はあるが、適切な抗体(ａｎｔｉｂｏｄｙ)が確保されていなければならなく、どのような種類の抗体を使用するかによって非特異的結合(ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ)による目標タンパク質(ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ)の種類を正確に判別できない場合もある。
インフルエンザウイルスを測定する際には、人の血液や分泌物または咽喉部分の試料を採取することになる。しかしながら、測定者は、実際にこの人がインフルエンザＡウイルスに感染されているか、それとも他のウイルスに感染されているかがわからなく、さらにどのくらいウイルスに感染されているかもわからない。したがって、一般的なＥＬＩＳＡ分析では、測定者が使用する抗体により検出できるウイルスまたはウイルス性タンパク質の存在有無だけを判別することができる。
一般に、抗原−抗体反応(ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ、Ａｂ−Ａｇ)を判別するために用いる発色または蛍光標識物質(ｌａｂｅｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ)の場合、結合可否については確認することができるが、実際タンパク質の微細構造変化(例えば、１〜２個のアミノ酸変化)を感知することはほとんど不可能である。実際、このような変化は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのような高価な分析装備を使用しても分析することが困難な場合が多い。しかし、インフルエンザＡウイルスの場合は、免疫反応(ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ)を誘導するエピトープ(ｅｐｉｔｏｐｅ)において１〜２個のアミノ酸変化が感染特性を決定する場合が大部分である。したがって、タンパク質の微細な構造変化を測定する必要性がある。
図１は一般的なタンパク質分析方法を説明する構造図である。
図１に示すように、従来のＥＬＩＳＡまたはＷＢなどのタンパク質の分析方法は、まず基板１０５に第１番目の１次抗体１１０を固定する。
その次に、固定された１次抗体１１０に抗原１２０を結合する。
次に、第２番目の１次抗体１１０をさらに抗原１２０に結合する。このように１次抗体を抗原に２回も結合する理由は、非特異的結合の可能性を減少させて反応感度を高めるためである。
その後、第２番目の１次抗体１１０に２次抗体１３０を結合し、２次抗体１３０に標識物質としてＨＲＰ１４０を結合する。２次抗体１３０の端部に結合されているＨＲＰ１４０は、これを化学的に処理して発生する光によって抗原１２０を検出することができる。
最後に、基質(ｓｕｂｓｔｒａｔｅ)を用いて発色反応を起こし、その反応を確認することで、抗原１２０の存在有無を確認することができる。
要約すれば、一般的なＥＬＩＳＡ方法で測定した場合、１次抗体(ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ)及び２次抗体(ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ)が抗原(ａｎｔｉｇｅｎ)に結合されると、抗体を生産する動物のＩｇＧ−ＨＲＰと基質を用いて発色反応を起こすことができる。しかし、この場合、微細なアミノ酸の差異を確認することができないという問題点がある。
図２は図１の方法によるタンパク質分析結果を説明するグラフである。
図２に示すように、一般的なＥＬＩＳＡ方法でタンパク質(例えば、ウイルスまたはウイルス性タンパク質)の分析を行う場合(抗体は試料１に相当する抗原に対してウサギ(ｒａｂｂｉｔ)を用いて生産したものである)、理論的には、試料１に対する信号のみが存在するが、試料２ないし試料４も強度(ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ)の差異はあるものの、信号確保が可能であることを確認することができる。よって、測定者がタンパク質の濃度や種類を知らない場合は、偽陽性(ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆａｌｓｅ)のエラーが発生することがある。実際に、Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１のウイルスは、分析キット(ｋｉｔ)のこのようなエラーに因り季節インフルエンザとの区別ができない。
大韓民国特許公開第１０−２００７−００６２４６７号
本発明が解決しようとする技術的課題は、抗体を用いて１次に特定タンパク質を選別(ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ)し、特定タンパク質と多様な種類の低分子物質との結合親和度を利用してタンパク質の微細な構造を分析する方法を提供することにある。
上記技術的課題を解決するために、本発明の実施例によるタンパク質の微細構造分析方法によれば、
標的物質の微細構造に関係なく、上記標的物質の捕獲が可能な捕獲物質を基板に固定する段階と、上記標的物質と上記捕獲物質とを結合させて第１複合体を形成する段階と、上記第１複合体を複数種類のプローブ分子のうちの１種のプローブ分子とそれぞれ結合させて複数個の第２複合体を形成する段階と、上記複数個の第２複合体に発色反応を行って上記第１複合体と上記プローブ分子との結合親和度を測定する段階と、測定された上記結合親和度と既存の結合親和度データとを比較して上記標的物質を決定する段階と、を含む。
実施例において、上記プローブ分子は、アミノ酸二量体(ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｉｍｅｒ)を含むことができる。
この実施例において、上記アミノ酸二量体は、ＴＲＰ−ＴＲＰ、ＳＥＲ−ＨＩＳ、ＧＬＵ−ＩＬＥ、ＳＥＲ−ＰＲＯ、ＡＳＮ−ＧＬＵ、ＧＬＹ−ＴＲＰ、ＭＥＴ−ＡＬＡ、ＭＥＹ−ＬＹＳ、ＰＨＥ−ＧＬＹ、ＩＬＥ−ＬＥＵよりなる群から選択することができる。
この実施例において、上記プローブ分子は、下記の構造式１として構成することができる。
＜構造式１＞
ＮＨ２−(ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ １：第１アミノ酸)−(ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ２：第１アミノ酸」)−ＰＥＧ(ポリエチレングリコール)−Ｂｉｏｔｉｎ（ビオチン）
実施例において、上記発色反応を行う段階は、上記第２複合体の上記プローブ分子に標識物質を結合する段階と、結合された上記標識物質と基質とを反応させて発色反応を起こす段階と、を含むことができる。
この実施例において、上記標識物質は、ＨＲＰ(ＨｏｒｓｅＲａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ホースラディッシュペルオキシダーゼ)とすることができる。
この実施例において、上記基質は、ＴＭＢ(ＴｅｔｒａＭｅｔｈｙｌ Ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ：テトラメチルベンジン)とすることができる。
本発明の実施例によるタンパク質の微細構造分析用構造体は、標的物質と、上記標的物質の微細構造に関係なく上記標的物質と結合して第１複合体を形成する捕獲物質と、上記第１複合体の上記標的物質に１種ずつ結合して複数個の第２複合体を形成する複数種類のプローブ分子と、を含む。
実施例において、上記プローブ分子は、アミノ酸二量体(ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｉｍｅｒ)を含むことができる。
この実施例において、上記アミノ酸二量体は、ＴＲＰ−ＴＲＰ、ＳＥＲ−ＨＩＳ、ＧＬＵ−ＩＬＥ、ＳＥＲ−ＰＲＯ、ＡＳＮ−ＧＬＵ、ＧＬＹ−ＴＲＰ、ＭＥＴ−ＡＬＡ、ＭＥＹ−ＬＹＳ、ＰＨＥ−ＧＬＹ、ＩＬＥ−ＬＥＵよりなる群から選択することができる。
実施例において、上記第２複合体の上記プローブ分子に結合して上記第１複合体と上記プローブ分子との結合親和度を測定するための発色反応を行う標識物質をさらに含むことができる。
この実施例において、上記標識物質は、基質を酸化させて発色反応を行うことができる。
この実施例において、上記基質は、ＴＭＢ(Ｔｅｔｒａ Ｍｅｔｈｙｌ Ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ)とすることができる。
本発明の実施例によるインフルエンザＡウイルス診断用バイオセンサは、本発明の実施例によるタンパク質の微細構造分析用構造体を用いてアレイタイプに製造することができる。
本発明の実施例によるタンパク質の微細構造分析方法によれば、
単純な結合可否だけを把握する既存の免疫学的な方法としては判別することができず、または困難であったインフルエンザＡウイルス(ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ)のサブタイプ(ｓｕｂ−ｔｙｐｅ)の新種ウイルスを確認することができる。
また、その他の遺伝的浮動(ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｒｉｆｔ)または遺伝的移動(ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｈｉｆｔ)によるタンパク質の微細な構造変化でサブタイプの判別が困難である場合、多様な種類の低分子と特定タンパク質との結合によって得られる情報を、１次選別用として用いられる抗体の種類と総合してデータベース(ＤＢ)を構成することによって、高価装備や熟練技術がなくても比較的に簡単な装備や試薬を用いて簡単に特定タンパク質(主に、分析しようとする対象タンパク質)の微細構造変化までを確認することができ、これによってウイルスのサブタイプを分析することができる。
したがって、インフルエンザＡウイルスのように、遺伝的変化でタンパク質構造に微細な変化が発生する病原性ウイルスまたは微生物の病原性及び感染性可否を判別することができ、インフルエンザウイルスだけでなく癌やその他の疾病の原因となる生体タンパク質の構造変化も検知できるとともに、さらに判別用分析システムを開発することができる。
生体物質(例えば、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチドなど)の生産にかかわる産業においては、高価装備なしに、シーケンス(ｓｅｑｕｅｎｃｅ)の異常有無を判断することができる。また、現在使用している簡易分析方法(ＱＡ／ＱＣ)よりも使用が便利であって、低コストながらもより精密な分析資料を提供することができる。
また、軍、警察、消防などのように、化学物質の危険に露出されながら精密な分析装備を使用することができない特殊環境においても正確な生化学的危険要素を提供することができる。
一般的なタンパク質分析方法を説明する構造図である。 図１の方法によるタンパク質分析結果を説明するグラフである。 本発明の実施例によるタンパク質の微細構造分析用構造体を概略的に説明する構造図である。 本発明の実施例によるタンパク質の微細構造分析用構造体を概略的に説明する構造図である。 図３Ａ及び図３Ｂの構造体のタンパク質の微細構造分析結果を概略的に説明するグラフである。 図３Ａ及び図３Ｂの構造体のタンパク質の微細構造分析結果を概略的に説明するグラフである。 本発明の実施例によるタンパク質の微細構造分析方法を説明するフローチャートである。 図５のタンパク質の微細構造分析方法によるタンパク質の微細構造分析結果を説明するグラフである。
以下、添付した図面を参照して、本発明の好適な実施形態を詳細に説明する。しかしながら、本発明は、ここで説明する実施形態に限定されるわけではなく、他の形態で具体化することができる。したがって、ここに開示される実施形態は発明の開示を完全なものとすると共に、当業者に本発明の思想を十分に伝えるために提供されるものである。
明細書において、ある部分が他の構成要素を「含む」とした場合、それに特に反対する記載がない限り、他の構成要素を除くのではなく他の構成要素をさらに含むことを意味する。また、明細書に記載された「…部」などの用語は、少なくとも１つの機能や動作を処理する単位を意味する。
図３Ａ及び図３Ｂは本発明の実施例によるタンパク質の微細構造分析用構造体を説明する構造図であり、図４Ａ及び図４Ｂは図３Ａ及び図３Ｂの構造体のタンパク質の微細構造分析結果を概略的に説明するグラフであり、図５は本発明の実施例によるタンパク質の微細構造分析方法を説明するフローチャートである。
図３Ａ、図３Ｂ、及び図５に示すように、本発明の実施例によるタンパク質の微細構造分析方法は、まず、標的物質２２０ａ、２２０ｂの微細構造変化と関係なく、標的物質２２０ａ、２２０ｂの１次選別(ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ)が可能な捕獲物質２１０を基板２０５に固定する(Ｓ５１０)。基板２０５はシリコンウエハまたはガラスプレートとすることができる。
ここで、標的物質２２０ａ、２２０ｂは、分析しようとするタンパク質、抗原、ウイルス(ｖｉｒｕｓ)、またはウイルス性タンパク質(ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ)とすることができる。詳しくは、インフルエンザＡウイルスとすることができる。
捕獲物質２１０は、標的物質２２０ａ、２２０ｂを１次的に選別することから１次捕獲物質であるという。
捕獲物質２１０は、標的物質２２０ａ、２２０ｂの微細構造に関係なく、標的物質２２０ａ、２２０ｂを選別することができる物質であって、詳しくは、分析しようとする抗原、すなわち、インフルエンザＡウイルスのサブタイプとは関係なく、インフルエンザＡウイルスと結合することができる抗体または受容体(ｒｅｃｅｐｔｏｒ)とすることができる。
その後、標的物質２２０ａ、２２０ｂと捕獲物質２１０とを結合させて第１複合体を形成する(Ｓ５２０)。標的物質２２０ａ、２２０ｂは抗原とすることができ、捕獲物質２１０は抗原と結合する抗体とすることができるので、標的物質２２０ａ、２２０ｂと捕獲物質２１０との間の反応を抗原−抗体反応であるという。
このように、分析しようとする抗原と結合することができる抗体を基板２０５に固定することで、微細構造の変化(差異)と関係なく、１次的に分析を要する抗原を選別することができる。
次に、抗原−抗体反応による第１複合体、すなわち、抗原−抗体複合体(ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｘ)をアレイ形態に具備する、互いに異なる複数種類のプローブ分子(ｐｒｏｂｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ)２３１〜２３４のうち一種のプローブ分子とそれぞれ結合して複数個の第２複合体を形成する(Ｓ５３０)。
それぞれのプローブ分子２３１〜２３４は、抗原−抗体複合体と別に反応させる。プローブ分子２３１〜２３４は、抗原−抗体複合体の抗原と個別的に反応するために複数個のセル(ｃｅｌｌ)を含むアレイタイプ(ａｒｒａｙ ｔｙｐｅ)に備えることができる。一つのセルは一種のプローブ分子を含む。また、それぞれのプローブ分子２３１〜２３４は、抗原−抗体複合体の抗原と反応するのに十分な濃度に備えることができる。
図３Ａ及び図３Ｂには、４種のプローブ分子を使用するものと示されているが、開示のプローブ分子の種類及び個数は理解のために例示したものである。１０種または２０種のプローブ分子を用いてもよく、プローブ分子の種類及び個数は標的物質２２０ａ、２２０ｂを分析するために十分な数であればよく、特にそれに限定されない。
本発明に使用されるプローブ分子２３１〜２３４は、ペプチド結合で連結されたアミノ酸二量体(ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｉｍｅｒ)を含む構造とすることができる。
詳しくは、プローブ分子２３１〜２３４は捕獲部位(ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ｐａｒｔ、−ＮＨ２−ＡＡ)、リンカー部位(ｌｉｎｋｅｒ ｐａｒｔ、ＰＥＧ)、固定化部位(ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐａｒｔ、ビオチン)を含むことができる。次に、プローブ分子２３１〜２３４の構造を構造式として示す。
‘ＮＨ２−第１アミノ酸(ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ １)−第２アミノ酸(ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ２)−ＰＥＧ(Ｐｏｌｙ Ｅｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ)−ビオチン(Ｂｉｏｔｉｎ)’
上記の構造式において、リンカー部位及び固定化部位は他の物質を用いることができる。例えば、リンカー部位は長さが相異するアルキル構造の物質、すなわち、ＤＮＡなどのように一般のリンカーに使用する物質を含むことができ、固定化部位はビオチンの外にも、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ−、−ＯＨなどの特定作用基を用いることができる。
プローブ分子２３１〜２３４に含まれるアミノ酸二量体は、ＴＲＰ−ＴＲＰ、ＳＥＲ−ＨＩＳ、ＧＬＵ−ＩＬＥ、ＳＥＲ−ＰＲＯ、ＡＳＮ−ＧＬＵ、ＧＬＹ−ＴＲＰ、ＭＥＴ−ＡＬＡ、ＭＥＹ−ＬＹＳ、ＰＨＥ−ＧＬＹ、ＩＬＥ−ＬＥＵよりなる群から選択することができる。このようなアミノ酸二量体は、組合可能な数百個のアミノ酸二量体のうち、分析しようとするタンパク質の微細構造変化に従って選択することができ、分析しようとするタンパク質がインフルエンザＡウイルスの場合にはサブタイプによって適切に選択することができる。
本発明の実施例では、プローブ分子がアミノ酸二量体を含む場合を例として説明したが、それに限定されない。プローブ分子は低分子物質であって、好ましくはペプチド結合を有することができる。ペプチド結合を有する物質は、２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個、最も好ましくは２個のアミノ酸からなる小さなペプチド(ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅ)を含むことができる。
その後、複数個の第２複合体に発色反応を行って、第１複合体(抗原−抗体複合体)とプローブ分子２３１〜２３４との結合親和度(ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ)を測定する(Ｓ５４０)。
発色反応は、第２複合体のプローブ分子２３１〜２３４に標識物質(図示せず)を結合させ、第２複合体のプローブ分子２３１〜２３４に結合された標識物質を基質(ｓｕｂｓｔｒａｔｅ)と反応させて行う。本発明に用いるＴＭＢなどの基質は標識物質(例えば、ＨＲＰ)によって酸化されるが、酸化したＴＭＢは励起状態(ｅｘｃｉｔｅｄ ｓｔａｔｅ)になってから基底状態(ｇｒｏｕｎｄ ｓｔａｔｅ)となり、その際のエネルギーを光として放出する。第１複合体、すなわち、抗原−抗体複合体とそれぞれのプローブ分子とが結合した程度によって放出されるエネルギーによる色相変化程度に差異がある。これにより、抗原−抗体複合体とプローブ分子との結合親和度を測定することができ、これに対するプロファイル(ｐｒｏｆｉｌｅ)を作成することができる。
次に、測定された結合親和度と、抗原(またはタンパク質)に対する既存の結合親和度データとを比較して標的物質の微細構造を確定する(Ｓ５５０)。
図４Ａ及び図４Ｂの反応パターンによるグラフに示したように、図３Ａに用いられた 、例えば、Ａタイプのインフルエンザウイルスは、第１プローブ分子２３１の１個と、第２プローブ分子２３２の３個と、第４プローブ分子２３４の２個とがそれぞれ結合していることがわかる。Ａタイプのインフルエンザウイルスは、第３プローブ分子２３３と結合してない。
一方、図３Ｂに用いられた、例えば、Ｂタイプのインフルエンザウイルスは、第１プローブ分子２３１ないし第４プローブ分子２３４の１個とそれぞれ結合していることがわかる。
このように、インフルエンザウイルス(詳細には、インフルエンザＡウイルス)のサブタイプによってそれぞれのプローブ分子と結合する程度(結合親和度)が異なるので、反応パターンが異なるように示されることがわかる。この反応パターンを用いてインフルエンザウイルスのサブタイプを知ることができる。
要約すれば、１種の抗体に共通的に結合することができるサブタイプが他の原のサブタイプを、種類が異なるプローブ分子(例えば、アミノ酸)と上記抗原との結合親和度を用いて区別することができる。
本発明の実施例によるタンパク質の微細構造分析方法では、タンパク質の微細構造の変化を分析するためにあらかじめ分析しようとするタンパク質に対する結合親和度をデータベース化して保存しておく。タンパク質の多くの結合可能部分(例えば、エピトープまたは結合サイト(ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ)がプローブ分子に対して有する多様な結合親和度を分析し、保存された結合親和度に対するデータと未知のタンパク質に対する測定された結合親和度の信号パターンを比較して未知のタンパク質がどのようなタンパク質であるかを分析することができる。
(１)材料(Ｍａｔｅｒｉａｌｓ)
分析しようとするタンパク質の抗原と１次的に結合してタンパク質を選別する捕獲(ｃａｐｔｕｒｉｎｇ)用の抗体としては、インフルエンザＡウイルスを測定する際に使用するＰｒｏＳｃｉ３４２７を用いた。
標的物質(Ｔａｒｇｅｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ)であるインフルエンザＡウイルスのサブタイプ(ｓｕｂ−ｔｙｐｅ)のエピトープは、すべて韓国会社の(株)ＰＥＰＴＲＯＮで合成した。抗体と組み換えタンパク質(ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ)はＰｒｏＳＣＩから購買し、その他のペプチドはすべて合成した。
使用する試料は、それぞれ１ｓｔ：Ｏｒｉｇｉｎ→Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／３／９７(Ｈ５Ｎ１)、２ｎｄ：Ｏｒｉｇｉｎ→Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４(Ｈ５Ｎ１)、３ｒｄ：Ｏｒｉｇｉｎ→Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／１５／３０(Ｈ１Ｎ１)、４ｔｈ：Ｏｒｉｇｉｎ→Ａ／Ｐｕｅｒｄｏｒｉｃｏ／８／３４(Ｈ１Ｎ１)である。
そして、陰性標準(ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ)としては、ＢＳＡ(Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ)を用い、陽性(Ｐｏｓｉｔｉｖｅ)としては、組み換えタンパク質が用いられた。試料として使用した各抗原のアミノ酸配列を次の表１に示す。
Figure 2011164105
 (Ｇｌｙｃｉｎｅ(Ｇｌｙ、Ｇ)、Ａｌａｎｉｎｅ(Ａｌａ、Ａ)、Ｖａｌｉｎｅ(Ｖａｌ、Ｖ)、Ｌｅｕｃｉｎｅ(Ｌｅｕ、Ｌ)、Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ(Ｉｌｅ、Ｉ)、Ｐｒｏｌｉｎｅ(Ｐｒｏ、Ｐ)、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ(Ｐｈｅ、Ｆ)、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ(Ｔｙｒ、Ｙ)、Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ(Ｔｒｐ、Ｗ)、Ｃｙｓｔｅｉｎｅ(Ｃｙｓ、Ｃ)、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ(Ｍｅｔ、Ｍ)、Ｓｅｒｉｎｅ(Ｓｅｒ、Ｓ)、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ(Ｔｈｒ、Ｔ)、Ｌｙｓｉｎｅ(Ｌｙｓ、Ｋ)、Ａｒｇｉｎｉｎｅ(Ａｒｇ、Ｒ)、Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ(Ｈｉｓ、Ｈ)、Ａｓｐａｒｔａｔｅ(Ａｓｐ、Ｄ)、Ｇｌｕｔａｍａｔｅ(Ｇｌｕ、Ｅ)、Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ(Ａｓｎ、Ｎ)、Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ(Ｇｌｎ、Ｑ))
(２)方法(Ｍｅｔｈｏｄ)
下記の表２には、本発明に用いるバッファ(Ｂｕｆｆｅｒ)が説明されている。表２に示されたバッファの製造方法は、すべてＰｒｏＳｃｉ社のマニュアルに従った。
Figure 2011164105
 表２
必要とされる物質：
９６−ウェル ELISA プレート
ELISA プレート リーダー
抗体 検出 キット

カーボネートバッファ
・ １５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３
・ ３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３
・ ３ｍＭ ＮａＮ３

ブロッキング／希釈バッファ
・１×ＰＢＳ，ｐＨ７．２
・０．１％ ＢＳＡ
・０．０２％ チオメルサール

洗浄バッファ
・１×ＰＢＳ，ｐＨ７．２
・０．０５％ トウィーン２０
・０．０２％ チオメルサール
１)１次抗体固定化
(1)インフルエンザＡウイルスの１次選別のための抗体原液をカーボネートバッファ(Ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ９．４)に濃度が１．０μｇ／ｍＬになるように溶かす。
(2)１分以上シェーキング(ｓｈａｋｉｎｇ)した後、９６ウェルマイクロプレート(９６ ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ、Ｎｕｎｃ社製のｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ)に１００．０μＬずつ分注する。
(3)２４時間、温度２３℃、湿度８０％の恒湿器(ｈｕｍｉｄｉｔｙ ｃｈａｍｂｅｒ)に静置培養する。
(4)培養後ＰＢＳ０．０２％のチオメルサール(ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ)またはＤＩ ｗａｔｅｒ(ｐｈ７．４)で２回洗浄(ｗａｓｈｉｎｇ)する。
(5)洗浄後、ＰＢＳブロッキングバッファ(ＰＢＳ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ)を２００μＬずつ分注した後、２時間軽くシェーキング(ｓｈａｋｉｎｇ)して培養する。
(6)培養後、さらにＰＢＳ０．０２％のチオメルサールを用いて２回以上洗浄する。
２)標的物質注入
洗浄した後に用意した標的物質溶液(ｔａｒｇｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、本実験ではウイルス性タンパク質のペプチド溶液)を１００μＬずつ分注する。
以下のように、標的物質溶液の準備を行う。
(1)まず、合成されている場合は、２００μｇ／ｍＬになるように、ＰＢＳバッファに希釈(ｄｉｌｕｔｉｏｎ)する。実際には、１．０ｍｇ／５ｍＬを準備した(Ｓｔｏｃｋ１)。
(2)Ｓｔｏｃｋ１を２０倍の希釈バッファ(ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ)に希釈する。
(3)次に、１５０μＬを３０００μＬの希釈バッファに溶かす。
(4)このように用意された標的物質溶液１００μＬを分注する。
分注する際には、２回の実験のために同じプレート(ｐｌａｔｅ)を２個準備する。２回実験を行う理由は実験誤差を少なくするためである。
分注方法としては下記の表３の記載に従う。表３の各セルはマイクロプレート(ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅ)を示す。
Figure 2011164105
１時間軽くシェーキングしながら培養した後に、ＰＢＳウォッシングバッファ(ＰＢＳ ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ)を用いて５回洗浄し、ＰＢＳ０．０２％のチオメルサールを用いて３回洗浄する。
３)アミノ酸二量体(ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｉｍｅｒ)注入
(1)培養後に、アミノ酸二量体溶液(ｄｉｍｅｒ＋ビオチンｂｉｏｔｉｎ)１５０μＭの溶液を１００μＬずつ分注する。分注した二量体(ｄｉｍｅｒ)の種類は次のようである。
(１)ＴＲＰ−ＴＲＰ、(２)ＳＥＲ−ＨＩＳ、(３)ＧＬＵ−ＩＬＥ、(４)ＳＥＲ−ＰＲＯ、(５)ＡＳＮ−ＧＬＵ、(６)ＧＬＹ−ＴＲＰ、(７)ＭＥＴ−ＡＬＡ、(８)ＭＥＹ−ＬＹＳ、(９)ＰＨＥ−ＧＬＹ、(１０)ＩＬＥ−ＬＥＵ
２番のカラム(ｃｏｌｕｍｎ)に１番の二量体溶液、３番のコラムに２番の二量体溶液の順に、１０種の二量体溶液をすべて注入する。
(2)その後、二量体溶液を、ＰＢＳバッファを用いて希釈する。
(3)再び１時間軽くシェーキングして培養(７０〜８０ｒｐｍ)する。
(4)培養が終了したら、再びＰＢＳ０．０２％のチオメルサールを用いて３回洗浄する。
４)ＨＲＰ(ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ)注入
(1)洗浄が終了したら、ＰＢＳバッファを用いて１：５０００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ(ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ)溶液を１００ｕｌずつ分注する。
(2)分注後、さらにウォッシングバッファ(Ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ)で５回洗浄し、その後ＰＢＳ０．０２％のチオメルサールで３回洗浄する。
本実験に用いるＰＢＳ０．０２％のチオメルサールは、防腐剤として使用されるため、一般のＰＢＳに比較して他の雑菌が培養することを防止することができる。
５)ＴＭＢ(ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ)注入
ＴＭＢ溶液(ＴＭＢ ｓｏｌｕｔｉｏｎ)を注入し、１５分ぐらい反応させた後、マイクロプレートリーダ器(Ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ)を用いて分析する。
すなわち、本発明の実施例によるタンパク質の微細構造分析方法は、１次抗体を用いて抗原を選別した後、それに多様な種類のプローブ分子(例えば、アミノ酸二量体などの低分子物質)を１つのセルに一種類ずつ含むアレイを形成した後、それぞれのプローブ分子の結合親和度の差異を確認し、これを用いて微細な差異を確認することによって、確認が困難なタンパク質の微細構造の変化を確認することができる。
図６は、図５のタンパク質の微細構造分析方法によるタンパク質の微細構造分析結果を説明するグラフである。
図６は、このような本発明の実施例によるタンパク質の微細構造分析方法を用いて４種のウイルス性タンパク質のエピトープを分析した結果である。Ｘ軸の番号はアミノ酸二量体の種類を示す。各番号別のアミノ酸二量体の種類は次のようである。
（１）ＴＲＰ−ＴＲＰ、(２)ＳＥＲ−ＨＩＳ、(３)ＧＬＵ−ＩＬＥ、(４)ＳＥＲ−ＰＲＯ、(５)ＡＳＮ−ＧＬＵ、(６)ＧＬＹ−ＴＲＰ、(７)ＭＥＴ−ＡＬＡ、(８)ＭＥＹ−ＬＹＳ、(９)ＰＨＥ−ＧＬＹ、(１０)ＩＬＥ−ＬＥＵ
図６に示すように、第１試料はアミノ酸二量体の結合親和度が、１番が最も高く、５番、２番、４番、３番の順に低くなっていることがわかる。第２試料はアミノ酸二量体の結合親和度が、１番が最も高く、２番、４番、５番、３番の順に低くなっていることがわかる。第３試料はアミノ酸二量体の結合親和度が、１番が最も高く、２番、４番、６番、３番の順に低くなっていることがわかる。第４試料はアミノ酸二量体の結合親和度が、１番と４番とが類似し、２番がその次に高く、３番と６番が次に高いことがわかる。
このように、試料種類ごとに結合親和度の信号パターンが異なることがわかる。したがって、データベースに保存された結合親和度に対するデータと未知のタンパク質に対する測定した結合親和度信号パターンとを比較して未知のタンパク質がどのようなタンパク質であるかを知ることができる。
以上説明した本発明の実施例は、装置及び方法によってのみ実現されるのではなく、また、このような実現は上記説明した実施例の記載から本発明が属する技術分野の当業者であれば容易に実現することができる。
以上、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施形態について詳細に説明したが、本発明はかかる例に限定されない。本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇内において、各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、これらについても、当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。
２０５ 基板
２１０ 捕獲物質
２２０ａ、２２０ｂ 標的物質
２３１ 第１プローブ分子
２３２ 第２プローブ分子
２３３ 第３プローブ分子
２３４ 第４プローブ分子

Claims (14)

  1. タンパク質の微細構造分析方法であって、
    標的物質の微細構造に関係なく前記標的物質の捕獲が可能な捕獲物質を基板に固定する段階と、
    前記標的物質と前記捕獲物質とを結合させて第１複合体を形成する段階と、
    前記第１複合体を複数種類のプローブ分子のうちの１種のプローブ分子とそれぞれ結合させて複数個の第２複合体を形成する段階と、
    前記複数個の第２複合体に発色反応を行って前記第１複合体と前記プローブ分子との結合親和度を測定する段階と、及び
    測定した前記結合親和度と既存の結合親和度データとを比較して前記標的物質を決定する段階とを含んでなる、タンパク質の微細構造分析方法。
  2. 前記プローブ分子が、アミノ酸二量体を含んでなる、請求項１に記載のタンパク質の微細構造分析方法。
  3. 前記アミノ酸二量体が、ＴＲＰ−ＴＲＰ、ＳＥＲ−ＨＩＳ、ＧＬＵ−ＩＬＥ、ＳＥＲ−ＰＲＯ、ＡＳＮ−ＧＬＵ、ＧＬＹ−ＴＲＰ、ＭＥＴ−ＡＬＡ、ＭＥＹ−ＬＹＳ、ＰＨＥ−ＧＬＹ、ＩＬＥ−ＬＥＵよりなる群から選択されてなる、請求項２に記載のタンパク質の微細構造分析方法。
  4. 前記プローブ分子が、下記の構造式１で構成されてなる、請求項３に記載のタンパク質の微細構造分析方法。
    ＮＨ２−(ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ １：第１アミノ酸)−(ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ２：第２アミノ酸」)−ＰＥＧ(ポリエチレングリコール)−Ｂｉｏｔｉｎ(ビオチン)
    ＜構造式１＞
  5. 前記発色反応を行う段階が、
    前記第２複合体の前記プローブ分子に標識物質を結合する段階と、及び
    結合した前記標識物質と基質とを反応させて発色反応を起こす段階とを含んでなる、請求項１に記載のタンパク質の微細構造分析方法。
  6. 前記標識物質が、ＨＲＰ(ＨｏｒｓｅＲａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ホースラディッシュペルオキシダーゼ)である、請求項５に記載のタンパク質の微細構造分析方法。
  7. 前記基質が、ＴＭＢ(ＴｅｔｒａＭｅｔｈｙｌ Ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ：テトラメチルベンジン)である、請求項５に記載のタンパク質の微細構造分析方法。
  8. 標的物質と、
    前記標的物質の微細構造に関係なく前記標的物質と結合して第１複合体を形成する捕獲物質と、及び
    前記第１複合体の前記標的物質に１種ずつ結合して複数個の第２複合体を形成する複数種類のプローブ分子とを含んでなる、タンパク質の微細構造分析用構造体。
  9. 前記プローブ分子が、アミノ酸二量体を包含してなる、請求項８に記載のタンパク質の微細構造分析用構造体。
  10. 前記アミノ酸二量体が、ＴＲＰ−ＴＲＰ、ＳＥＲ−ＨＩＳ、ＧＬＵ−ＩＬＥ、ＳＥＲ−ＰＲＯ、ＡＳＮ−ＧＬＵ、ＧＬＹ−ＴＲＰ、ＭＥＴ−ＡＬＡ、ＭＥＹ−ＬＹＳ、ＰＨＥ−ＧＬＹ、ＩＬＥ−ＬＥＵよりなる群から選択される、請求項９に記載のタンパク質の微細構造分析用構造体。
  11. 前記第２複合体の前記プローブ分子に結合して前記第１複合体と前記プローブ分子との結合親和度を測定するための発色反応を行う標識物質をさらに含んでなる、請求項８に記載のタンパク質の微細構造分析用構造体。
  12. 前記標識物質が、基質を酸化させて発色反応を行うものである、請求項１１に記載のタンパク質の微細構造分析用構造体。
  13. 前記基質が、ＴＭＢ(ＴｅｔｒａＭｅｔｈｙｌ Ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ：テトラメチルベンジン)である、請求項１２に記載のタンパク質の微細構造分析用構造体。
  14. 請求項８に記載のタンパク質の微細構造分析用構造体を用いて製造される、アレイタイプのインフルエンザＡウイルス診断用バイオセンサ。
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