JP2011164105A - タンパク質の微細構造分析方法及びタンパク質の微細構造分析用構造体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明のタンパク質の微細構造分析方法は、標的物質の微細構造に関係なく標的物質の捕獲が可能な捕獲物質を基板に固定する段階と、標的物質と捕獲物質とを結合させて第1複合体を形成する段階と、第1複合体を複数種類のプローブ分子のうちの1種のプローブ分子とそれぞれ結合させて複数個の第2複合体を形成する段階と、複数個の第2複合体に発色反応を行って第1複合体とプローブ分子との結合親和度を測定する段階と、測定した結合親和度と既存の結合親和度データとを比較して標的物質を決定する段階と、を含む。したがって、高価装備や熟練技術なしに比較的に簡単な装備や試薬を有して簡単に標的タンパク質の微細構造を分析することができる。
【選択図】図5
Description
図1に示すように、従来のELISAまたはWBなどのタンパク質の分析方法は、まず基板105に第1番目の1次抗体110を固定する。
その次に、固定された1次抗体110に抗原120を結合する。
図2に示すように、一般的なELISA方法でタンパク質(例えば、ウイルスまたはウイルス性タンパク質)の分析を行う場合(抗体は試料1に相当する抗原に対してウサギ(rabbit)を用いて生産したものである)、理論的には、試料1に対する信号のみが存在するが、試料2ないし試料4も強度(intensity)の差異はあるものの、信号確保が可能であることを確認することができる。よって、測定者がタンパク質の濃度や種類を知らない場合は、偽陽性(positive false)のエラーが発生することがある。実際に、H1N1及びH5N1のウイルスは、分析キット(kit)のこのようなエラーに因り季節インフルエンザとの区別ができない。
<構造式1>
NH2−(amino acid 1:第1アミノ酸)−(amino acid 2:第1アミノ酸」)−PEG(ポリエチレングリコール)−Biotin(ビオチン)
単純な結合可否だけを把握する既存の免疫学的な方法としては判別することができず、または困難であったインフルエンザAウイルス(influenza A virus)のサブタイプ(sub−type)の新種ウイルスを確認することができる。
分析しようとするタンパク質の抗原と1次的に結合してタンパク質を選別する捕獲(capturing)用の抗体としては、インフルエンザAウイルスを測定する際に使用するProSci3427を用いた。
下記の表2には、本発明に用いるバッファ(Buffer)が説明されている。表2に示されたバッファの製造方法は、すべてProSci社のマニュアルに従った。
必要とされる物質:
96−ウェル ELISA プレート
ELISA プレート リーダー
抗体 検出 キット
カーボネートバッファ
・ 15mM Na2CO3
・ 35mM NaHCO3
・ 3mM NaN3
ブロッキング/希釈バッファ
・1×PBS,pH7.2
・0.1% BSA
・0.02% チオメルサール
洗浄バッファ
・1×PBS,pH7.2
・0.05% トウィーン20
・0.02% チオメルサール
(1)インフルエンザAウイルスの1次選別のための抗体原液をカーボネートバッファ(Carbonate buffer、pH9.4)に濃度が1.0μg/mLになるように溶かす。
(2)1分以上シェーキング(shaking)した後、96ウェルマイクロプレート(96 well microplate、Nunc社製のhigh affinity)に100.0μLずつ分注する。
(3)24時間、温度23℃、湿度80%の恒湿器(humidity chamber)に静置培養する。
(4)培養後PBS0.02%のチオメルサール(thiomersal)またはDI water(ph7.4)で2回洗浄(washing)する。
(5)洗浄後、PBSブロッキングバッファ(PBS blocking buffer)を200μLずつ分注した後、2時間軽くシェーキング(shaking)して培養する。
(6)培養後、さらにPBS0.02%のチオメルサールを用いて2回以上洗浄する。
洗浄した後に用意した標的物質溶液(target solution、本実験ではウイルス性タンパク質のペプチド溶液)を100μLずつ分注する。
以下のように、標的物質溶液の準備を行う。
(1)まず、合成されている場合は、200μg/mLになるように、PBSバッファに希釈(dilution)する。実際には、1.0mg/5mLを準備した(Stock1)。
(2)Stock1を20倍の希釈バッファ(dilution buffer)に希釈する。
(3)次に、150μLを3000μLの希釈バッファに溶かす。
(4)このように用意された標的物質溶液100μLを分注する。
(1)培養後に、アミノ酸二量体溶液(dimer+ビオチンbiotin)150μMの溶液を100μLずつ分注する。分注した二量体(dimer)の種類は次のようである。
(1)TRP−TRP、(2)SER−HIS、(3)GLU−ILE、(4)SER−PRO、(5)ASN−GLU、(6)GLY−TRP、(7)MET−ALA、(8)MEY−LYS、(9)PHE−GLY、(10)ILE−LEU
2番のカラム(column)に1番の二量体溶液、3番のコラムに2番の二量体溶液の順に、10種の二量体溶液をすべて注入する。
(2)その後、二量体溶液を、PBSバッファを用いて希釈する。
(3)再び1時間軽くシェーキングして培養(70〜80rpm)する。
(4)培養が終了したら、再びPBS0.02%のチオメルサールを用いて3回洗浄する。
(1)洗浄が終了したら、PBSバッファを用いて1:5000に希釈したストレプトアビジン−HRP(streptavidin−HRP)溶液を100ulずつ分注する。
(2)分注後、さらにウォッシングバッファ(Washing buffer)で5回洗浄し、その後PBS0.02%のチオメルサールで3回洗浄する。
本実験に用いるPBS0.02%のチオメルサールは、防腐剤として使用されるため、一般のPBSに比較して他の雑菌が培養することを防止することができる。
TMB溶液(TMB solution)を注入し、15分ぐらい反応させた後、マイクロプレートリーダ器(Micro plate reader)を用いて分析する。
210 捕獲物質
220a、220b 標的物質
231 第1プローブ分子
232 第2プローブ分子
233 第3プローブ分子
234 第4プローブ分子
Claims (14)
- タンパク質の微細構造分析方法であって、
標的物質の微細構造に関係なく前記標的物質の捕獲が可能な捕獲物質を基板に固定する段階と、
前記標的物質と前記捕獲物質とを結合させて第1複合体を形成する段階と、
前記第1複合体を複数種類のプローブ分子のうちの1種のプローブ分子とそれぞれ結合させて複数個の第2複合体を形成する段階と、
前記複数個の第2複合体に発色反応を行って前記第1複合体と前記プローブ分子との結合親和度を測定する段階と、及び
測定した前記結合親和度と既存の結合親和度データとを比較して前記標的物質を決定する段階とを含んでなる、タンパク質の微細構造分析方法。 - 前記プローブ分子が、アミノ酸二量体を含んでなる、請求項1に記載のタンパク質の微細構造分析方法。
- 前記アミノ酸二量体が、TRP−TRP、SER−HIS、GLU−ILE、SER−PRO、ASN−GLU、GLY−TRP、MET−ALA、MEY−LYS、PHE−GLY、ILE−LEUよりなる群から選択されてなる、請求項2に記載のタンパク質の微細構造分析方法。
- 前記プローブ分子が、下記の構造式1で構成されてなる、請求項3に記載のタンパク質の微細構造分析方法。
NH2−(amino acid 1:第1アミノ酸)−(amino acid 2:第2アミノ酸」)−PEG(ポリエチレングリコール)−Biotin(ビオチン)
<構造式1> - 前記発色反応を行う段階が、
前記第2複合体の前記プローブ分子に標識物質を結合する段階と、及び
結合した前記標識物質と基質とを反応させて発色反応を起こす段階とを含んでなる、請求項1に記載のタンパク質の微細構造分析方法。 - 前記標識物質が、HRP(HorseRadish Peroxidase:ホースラディッシュペルオキシダーゼ)である、請求項5に記載のタンパク質の微細構造分析方法。
- 前記基質が、TMB(TetraMethyl Benzidine:テトラメチルベンジン)である、請求項5に記載のタンパク質の微細構造分析方法。
- 標的物質と、
前記標的物質の微細構造に関係なく前記標的物質と結合して第1複合体を形成する捕獲物質と、及び
前記第1複合体の前記標的物質に1種ずつ結合して複数個の第2複合体を形成する複数種類のプローブ分子とを含んでなる、タンパク質の微細構造分析用構造体。 - 前記プローブ分子が、アミノ酸二量体を包含してなる、請求項8に記載のタンパク質の微細構造分析用構造体。
- 前記アミノ酸二量体が、TRP−TRP、SER−HIS、GLU−ILE、SER−PRO、ASN−GLU、GLY−TRP、MET−ALA、MEY−LYS、PHE−GLY、ILE−LEUよりなる群から選択される、請求項9に記載のタンパク質の微細構造分析用構造体。
- 前記第2複合体の前記プローブ分子に結合して前記第1複合体と前記プローブ分子との結合親和度を測定するための発色反応を行う標識物質をさらに含んでなる、請求項8に記載のタンパク質の微細構造分析用構造体。
- 前記標識物質が、基質を酸化させて発色反応を行うものである、請求項11に記載のタンパク質の微細構造分析用構造体。
- 前記基質が、TMB(TetraMethyl Benzidine:テトラメチルベンジン)である、請求項12に記載のタンパク質の微細構造分析用構造体。
- 請求項8に記載のタンパク質の微細構造分析用構造体を用いて製造される、アレイタイプのインフルエンザAウイルス診断用バイオセンサ。
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