CN101896816A - 用于检测分析物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于检测生物学样品的分析物的方法，包括下列步骤：a)提供固定化在固相上的可逆结合配偶体1，分析物结合剂通过与该分析物结合剂键合的可逆结合配偶体2与所述固相可逆键合，由此通过可逆结合配偶体1和2之间的结合，使分析物结合剂固定化，b)加入生物学样品，和在生物学样品含有分析物的情况下，分析物与被可逆固定化的分析物结合剂结合，c)分离生物学样品，d)加入解离缓冲液，其解离可逆结合配偶体1和2之间的结合，而任选保持分析物与分析物结合剂的结合，以及e)分别在生物学样品含有分析物的情况下检测解离缓冲液中的分析物，和在生物学样品不包含分析物的情况下，确定分析物的不存在。

Description

用于检测分析物的方法

本发明的主题是用于检测来自生物学样品的分析物的方法，包括下列处理步骤：

a)制备固定化在固相上的可逆结合配偶体1，分析物结合剂通过与该分析物结合剂键合的可逆结合配偶体2与所述可逆键合，由此通过可逆结合配偶体1和2之间的结合，使分析物结合剂固定，

b)加入生物学样品，在生物学样品含有分析物的情况下，分析物与被可逆固定化的分析物结合剂结合。

c)分离生物学样品，

d)加入解离缓冲液，其解离可逆结合配偶体1和2之间的结合，而任选保持分析物与分析物结合剂的结合，以及

e)在生物学样品含有分析物的情况下检测解离缓冲液中的分析物，或在生物学样品不包含分析物的情况下，确定分析物的不存在。

在各种不同技术中，已经开发了快速测试或现场护理(POC)检测方法(1)。但是，其中很少已经达到准备进入市场的程度。

现在，已建立了快速测试方法，例如TRIAGE系统(Biosite，SanDiego，USA)，但是特别是在最常用的方法免疫层析法中，与手动或以自动方式处理的标准免疫分析方法相比，具有较低的分析灵敏性以及降低的精确性的缺点，但是在适合的实施方案(2)-(7)中的任何情况下，也具有可以处理未加工的全血样品的优点。

缺点主要是由于样品基质对方法的依赖性，以及可使用的样品体积的限制。

因此，本发明的目的是开发可以执行的方法、尤其是作为快速测试的方法，它可以处理未作处理的全血样品，并具有可以与标准免疫分析方法相比的分析灵敏性和精确性。

具体来说，本发明的主题是使用本发明的可逆结合系统，用于固定分析物特异性结合剂，例如抗PCT抗体。

因此，本发明的主题是用于检测由生物学样品构成的分析物的方法，包括下列处理步骤：

a)制备固定化在固相上的可逆结合配偶体1，分析物结合剂通过与该分析物结合剂键合的可逆结合配偶体2与所述固相可逆键合，由此通过可逆结合配偶体1和2之间的结合，使分析物结合剂固定化，

b)加入生物学样品，在生物学样品含有分析物的情况下，分析物与被可逆固定化的分析物结合剂结合。

c)分离生物学样品，

d)加入解离缓冲液，其解离可逆结合配偶体1和2之间的结合，而任选保持分析物与分析物结合剂的结合，以及

e)在生物学样品含有分析物的情况下检测解离缓冲液中的分析物，或在生物学样品不包含分析物的情况下，确定分析物的不存在。

对于本技术领域的专业人员来说，显然在步骤b)和c)之间，要维持一定的温育时间。温育时间应该不短于30秒，并且不长于24小时；特别优选在快速测试方法的体系之内，温育时间在5到15分钟之间。步骤d)的解离过程可以优选长达24小时；优选在快速测试方法的体系之内，解离过程长于15秒并短于15分钟，优选在5到15分钟之间。

在按照d)解离过程中和/或之后，分析物与分析物结合剂的结合保持或完全没有。根据本发明，这两种选项都是可以想到的。优选分析物与分析物结合剂之间的结合，在按照d)加入解离缓冲液期间和/或之后保留。优选至少90％的分析物分子保留了结合。如果不保留结合，优选在随后时间再建立一次。最优选在检测时存在分析物与分析物结合剂之间的结合，即在解离过程中结合保留下来或重新建立。

在优选实施方案中，分析物结合剂是抗分析物抗体。

在本发明的方法的优选实施方案中，生物学液体是未处理的全血样品。

根据本发明，固定化的可逆结合配偶体1被直接或通过载体蛋白固定化。示例性的载体蛋白是BSA(牛血清白蛋白)。适合的载体蛋白对于本技术领域的专业人员来说是已知的。

按照本发明，各种不同的结合配偶体是适合的，它们可以形成牢固的键，但是在某些条件下，它们可以断裂这些键，因此表示成“可逆结合系统”。其中本发明特别感兴趣的是结合可以通过相对温和的条件去稳定化的结合系统，即不显著损害蛋白特别是抗体的构象、以及它们与抗原的结合的条件。

已了解这些可逆结合系统的应用，与重组蛋白从复杂的蛋白混合物例如细胞提取液中纯化的可能性相关。就此而言，利用重组DNA技术，将编码目标蛋白的cDNA序列与编码所谓“标签”的序列相连，以便表达延伸出“标签”的蛋白。通过固定化在固相上的针对“标签”的结合配偶体，然后来自蛋白混合物的“标签”蛋白可以被选择性键合，然后通过“标签”键合的特异性去稳定化作用与固相再次分离。因而目标蛋白在溶液中是富集的形式或纯的。常用的“标签”、相应的固定化的结合配偶体以及特异性去稳定化方法的名单可以在例如(8)-(10)中发现。

这样的结合系统可以在本发明的体系内用作结合配偶体。

在本发明的方法的体系中，具体来说，可逆结合配偶体1和2的结合对，可以选自下列结合对之一：

a)带正电荷和负电荷的肽寡聚体，

b)Ca²⁺结合肽/蛋白，以及当肽/蛋白具有键合的Ca²⁺时，肽/蛋白以较高亲和性结合的抗体，

c)寡聚组氨酸(例如6His)和Ni-NTA，

d)生物素和亲和素或链亲和素或中性链亲和素。

某些在本发明的体系中的可逆结合系统，可以在这里简要介绍：

Ca²⁺结合肽/蛋白，以及当肽/蛋白具有键合的Ca²⁺时、以较高亲和性与肽/蛋白结合的抗体的例子，是FLAG/MI系统，其中Ca²⁺结合肽/蛋白是FLAG-肽，抗体是M1抗体。在另一个系统中，Ca²⁺结合肽/蛋白是蛋白C肽，抗体是HPC4抗体。

a)FLAG/M1

因此，一个例子是单克隆抗体M1(也被描述成4E11)与所谓的FLAG肽之间的结合。该肽可以结合Ca²⁺，因此采取了某种构象。只有这种构象被M1有效结合。通过加入Ca²⁺络合剂例如EDTA，将Ca²⁺从肽中除去，肽采取另一种构象，通过这种构象M1抗体极大地降低了它与肽的亲和性；美国专利4,851,341(11)。

b)C/HPC4蛋白

这种结合对的另一个类似的例子是源自于人类蛋白C、并且也可以采取Ca²⁺依赖性形状的肽，以及单克隆抗体HPC4(12)。

c)Ni²⁺-NTA/6His

另一个例子是Ni²⁺-NTA/6His系统，它可以通过添加咪唑特异性地去稳定化(13)。

d)带电荷的肽寡聚体

另一个例子是带正电荷或负电荷的肽寡聚体的结合对，例如寡聚-Lys或寡聚-Asp，它们的彼此结合可以通过增加离子强度去稳定化。作为结合对，描述了与离子交换基质结合的带电荷的肽寡聚体；此外，这种结合也通过增加离子强度去稳定化(14)-(16)。

除了其中结合配偶体之一被整合在重组蛋白中的可逆结合系统之外，其中结合配偶体之一被化学连接到将被固定化的蛋白上的系统，也是已知的。例如，这里可以提到生物素/亲和素系统。生物素可以以例如NHS酯的形式连接到一个蛋白的伯胺基团上(17)。这种结合系统也可以通过加入过量的生物素来去稳定化，但是只有在剧烈条件下才发生，例如升高的温度和延长的温育时间(18)。然而，已经描述了这种系统的一种变体，其使用了所谓的单体亲和素；在“不可逆”结合位点被生物素饱和之后，剩余的“可逆”结合位点适合于结合生物素化的蛋白，它随后可以利用生物素在温和条件下从结合位点解离下来(19)。

上述的用于重组蛋白的肽“标签”，也应该可以与蛋白化学结合，由此使这样衍生的蛋白可然后用于可逆结合。在本发明的体系中，化学结合可以被视为蛋白衍生的优选变体，因为衍生的程度可以控制，并且化学结合相对来说节省时间、经济。

所有上面提到的可逆结合系统的例子都是基于结合配偶体的非共价相互作用。但是，在本发明的体系中，那些其中首先存在共价键并且它然后可以被化学解离的系统，也被当作可逆结合系统。例如，在这里可以提到利用可水解的异双功能交联剂例如SPDP的共价交联(20)；通过加入还原剂，可以将二硫桥水解，因此可以将键解离。

因此，本发明的主题还有根据本发明的快速检测方法，其中分析物结合剂共价键合于可逆结合配偶体2。

因此，本发明的主题是根据本发明的优选实施方案中的方法，其中分析物结合剂是抗降钙素原抗体。

因此，本发明的优选主题是可逆结合系统对于固定分析物特异性结合剂、例如抗PCT抗体的应用。

所述应用按照下面以带电荷的肽寡聚体可逆结合系统(参见上文)为例进行配置，但是也可以类似地转移到其它系统。将寡聚-Asp结合到载体蛋白如牛血清白蛋白(BSA)上，并以稳定的方式将该结合物固定化在固相上，例如高结合性聚苯乙烯微量滴定板。寡聚-Lys结合在抗PCT抗体上。寡聚-Lys-抗PCT抗体与固相的温育，由寡聚-Lys和寡聚-Asp部分之间通过离子相互作用的结合导致了抗体的固定化。

在可选实施方案中，抗PCT抗体也可以利用针对抗PCT抗体的寡聚-Lys衍生的抗体(例如抗小鼠IgG抗体，如果抗PCT抗体是小鼠单克隆抗体的话)，进行间接固定化。

免疫提取的原理通过下面对PCT分析的例子进行解释：

首先，通过可逆结合系统将抗PCT抗体固定化在固相上。加入待检测的全血样品(对于本实施例来说是含有带电荷的肽寡聚体和EDTA的血液)，将PCT从样品中免疫提取。在这种情况下，可以使用相对大体积的样品，使得可以提取相对大量的PCT，这在下面导致了测试的高的分析灵敏度。在短时间温育后，将样品分离(通过清洗或其它适合的分离方法，例如吸掉或适当离心)。在下一步中，加入缓冲液(“解离缓冲液”)，它含有试剂(例如在寡聚-Lys-/寡聚-Asp系统中是带强负电荷的肝素)，适合于较大程度地去稳定化抗体与固相的结合，但不是PCT与抗体之间的结合。因此，获得了含有大量待检测分析物(与特异性抗体复合的)的溶液。任何被检测样品的溶液总是组成相同的，因为样品基质已经事先分离。因此，该步骤的优点在于：

-使用未处理全血的可能性，

-使用较大样品体积、从而可以提取相对大量的分析物并最终在随后的测定过程中可以获得高的分析测定灵敏度的可能性，

-在随后测定过程的步骤中基质的不依赖性，这对于测定过程的精确性和准确性具有有利影响。

带入溶液中的免疫提取的分析物可以通过各种不同方法检测。一个例子是TRACE技术，另一个例子(下面解释的附加方法)是免疫色谱。

对于夹心免疫分析方法来说，TRACE技术使用了两种抗体，它们用不同的荧光标记物标记(例如花色素苷或穴状化合物)。在与溶液中的分析物形成夹心物时，两种标记物在空间上达到接近，根据相应的光激发产生了特异性光发射。

对于举例的PCT分析来说，将与寡聚-Lys结合的抗PCT抗体，在固定化之前首先添加穴状化合物进行标记。

以此方法，进行了免疫提取。在解离缓冲液中，除了解离剂之外，现在还包含了夹心物形成所必需的第二个花色素苷标记的抗PCT抗体。因此，通过加入解离缓冲液，既导致抗原-抗体复合物从固相解离，也导致夹心物的形成，它可以在适合的光激发后检测到。夹心物形成中，也可以相继进行第二抗体的解离和加入。

在上述的变体中，可以在免疫提取之前，通过寡聚-Lys衍生的例如抗小鼠IgG抗体间接地固定分析物特异性抗体。在该实施方案中，然后可以将荧光标记结合到一个或另一个抗体上。

在免疫色谱的例子中，在固定化之前，首先加入生物素将与寡聚-Lys结合的抗PCT抗体进行标记。以此进行了免疫提取。现在，在解离缓冲液中，除了解离剂之外，现还包含夹心物形成所必需的用胶体金标记的第二种抗PCT抗体。夹心物形成中也可以相继进行第二抗体的解离和加入。然后将反应混合物施加到免疫色谱测试条上，该测试条上作为形成的夹心物的捕获物，在测试条的后部区域中，横穿反应溶液的进料方向，将生物素结合剂例如亲和素，喷洒成细线。

在本发明的方法的特别优选的实施方案中，分析物结合剂被标记，并且在加入解离缓冲液之后仍保持被标记物标记，用于分析物的检测。

在免疫色谱的实施方案中，可以设想下面的附加变体：

除了用结合配偶体2衍生之外，免疫提取抗体还是生物素化的。将用于夹心物形成的第二抗体进行标记(例如使用胶体金)。然后在测试条上的捕获物将是生物素结合剂例如亲和素或链亲和素或中性链亲和素。

免疫提取抗体(例如多克隆绵羊抗体)只用结合配偶体2衍生。用于夹心物形成的第二抗体必须源自于另一个动物物种(例如单克隆小鼠抗体)，并且被标记(例如用胶体金)。

然后，测试条上的捕获物将是抗绵羊IgG抗体。也可以设想这两种变体采取下面的形式，其中免疫提取抗体携带标记，其中在第一种变体中第二抗体然后被生物素化(这里，作为可选方案，第二抗体也可以直接喷洒在测试条上)。

在方法的另一个优选实施方案中，解离缓冲液含有检测所必需的另一种标记成分。

在方法的特别优选实施方案中，其它检测所必需的标记成分是用于执行夹心免疫分析方法的第二种分析物结合剂。

被标记的分析物的检测，特别优选通过使用TRACE技术以免疫分析来进行。

在另一个优选实施方案中，标记的分析物的检测通过免疫色谱来进行。

在本发明的特别优选变体中，生物样品是未稀释的，其使用的体积使得固相的包被部分与生物学样品保持完全接触。

加入样品直到检测的时间，特别优选不超过30分钟，因此方法可以被视为快速测试方法。

本发明的主题还有用于执行本发明的方法的装置，包括：

·其中固定化有可逆结合配偶体1的固相，分析物结合剂通过与该分析物结合剂键合的可逆结合配偶体2与所述固相可逆键合，

·其中可逆结合配偶体1和2之间的结合通过加入解离缓冲液进行解离，但是当加入解离缓冲液时，任选保持分析物与分析物结合剂的结合。

同样地，本发明的主题还有用于执行本发明的方法的试剂盒，包括：

·固定化有可逆结合配偶体1的固相，

·含有与可逆结合配偶体2键合的分析物结合剂的复合物，其中通过将可逆结合配偶体1和2结合到固相上，该复合物可以任选能够已经以固定化的形式存在，

·解离缓冲液，其解离可逆结合配偶体1和2之间的结合，但是其中任选保持分析物与分析物结合剂之间的结合。

在特别优选的实施方案中，在试剂盒中发现的分析物结合剂是抗PCT抗体。

作为选择的结合对，最优选试剂盒包含选自下列结合对之一的可逆结合配偶体1和2：

·带正电荷和负电荷的肽寡聚体，

·Ca²⁺结合肽/蛋白，以及当肽/蛋白具有键合的Ca²⁺时，肽/蛋白以较高亲和性结合的抗体，

·寡聚组氨酸(例如6His)和Ni-NTA，

·生物素和亲和素或链亲和素或中性链亲和素。

下面的实施例将对本发明进行更详细的解释，而不是对本发明的主题进行限制。

实施例

从全血免疫提取PCT

作为其它步骤进行的基础，首先检查这里在PCT实施例中检测的分析物是否能够以及如何有效地利用固定化在固相上的分析物特异性抗体，从未处理的EDTA全血中提取出来。在短时间温育(5分钟)以及分离全血样品后，使用第二种化学发光标记的抗PCT抗体检测键合的PCT。为了进行比较，用缓冲液稀释的含有PCT的血清，在同样的固相上温育，但是时间更长(2小时)，在与稀释的样品分离后，按照上述检测结合的PCT。

具体来说，测试如下进行：

为了测定免疫提取，使用了来自BRAHMS PCT灵敏的LIA试剂盒的成分(BRAHMS Aktiengesellschaft，Hennigsdorf，Germany)。按照操作说明书，将发光标记的抗PCT示踪抗体A溶解在示踪剂复溶缓冲液B中。将标准品系列以下列浓度溶解在健康献血者的EDTA全血中：c＝0.007；0.014；0.036；0.171；0.383；1.73；7.99ng/ml。在包被有抗PCT抗体的管中，用移液管移入300μl每种全血标准品，在室温温育5分钟。然后，将管用5x1ml洗涤溶液(8mM Tris，60mM NaCl，0.2％Tween 20，pH 7.5)洗涤。然后用移液管移入200μl发光标记的抗PCT抗体，在室温温育2小时；将管再用5x1ml洗涤溶液洗涤一遍。在照度计(BERTHOLD Company，BAD WILDBAD，GERMANY，LB952T；基本试剂来自BRAHMS AG)中测量与管键合的化学发光物质。

基于BRAHMS PCT灵敏的LIA试剂盒(BRAHMSAktiengesellschaft，Hennigsdorf，Germany)，如下进行了参比方法(测定来自稀释血清的PCT)：将标准品系列以下列浓度溶解在测试试剂盒的空白血清中：c＝0；0.008；0.031；0.042；0.126；0.251；1.21；5.61；28.0ng/ml。在包被有抗PCT抗体的管中，用移液管吸移入50μl每种血清标准品和250μl示踪剂复溶缓冲液B，在室温温育2小时。然后，将管用5x1ml洗涤溶液(8mM Tris，60mM NaCl，0.2％Tween20，pH 7.5)洗涤。然后用移液管吸移入200μl发光标记的抗PCT抗体，在室温温育2小时；将管再用5x1ml洗涤溶液洗涤一遍。在照度计(BERTHOLD Company，BAD WILDBAD，GERMANY，LB952T；基本试剂来自BRAHMS AG)中测量与管键合的化学发光物质。

产生准备与固相可逆结合的抗体

这里，在抗PCT抗体的实施例中，检测了上文描述的几种可逆结合系统对于将抗体与固相可逆结合的适合性。就此而言，将抗体衍生到不同的程度(参见表1)，并用化学发光标记物标记。因此，检测了对应于相应的衍生来说，这些抗体怎样与固相结合，以及它们如何可以再次解离。表1中结果的概述显示，所有被检测的可逆结合系统，除了生物素/亲和素系统之外，都可以特异性和快速地去稳定化，并且——限于6His/Ni-NTA系统——不受血液基质的损伤。

抗体的衍生(结合配偶体1)	固相(结合配偶体2)	解离剂	可以被血液解离(温育10分钟)的非特异性抗体相对于以前键合的量的比例	可以被解离剂解离(温育10分钟)的抗体相对于以前键合的量的比例	可以被解离剂解离(温育30分钟)的抗体相对于以前键合的量的比例
						生物素	亲和素	25mM生物素	0.7％	1.9％	2.5％
M1抗体	FLAG-肽-BSA	10mM EDTA	7.8％	58.7％	74.8％
						6His	Ni-NTA	250mM咪唑	38.6％	89.4％	98.8％
HPC4抗体	蛋白C-肽-BSA	10mM EDTA	3.5％	38.3％	69.2％
						寡聚-Asp	寡聚-Lys BSA	0.01％肝素	5.3％	80.0％	93.2％

表1

此外，观察到了结合和特异性解离的效率受到下列因素的影响：相应的衍生化程度(每个抗体的结合配偶体1的摩尔比率)，固定化在固相上的结合配偶体2的浓度，因而是结合配偶体1与抗体结合而结合配偶体2被固定化、还是结合配偶体2与抗体结合而结合配偶体1被固定化，以及在寡聚-Asp/寡聚-Lys系统的情况下两个寡聚体的长度。因此，在本发明的体系内，这些变体也在术语可逆结合系统的范围内，权利要求书明确地包含了这些变体，但是在这里举例描述的变体可以被当作优选实施方案。作为寡聚-Lys-BSA的替换方案，聚赖氨酸固相也已被证明是适合的。

具体来说，测试如下进行：

结合配偶体1(液相)

1.产生MACN-化学发光标记的抗体

多克隆抗降钙素绵羊抗体如下进行处理：

制备了三种标记物；后者在温育后被不同地缓冲(参见下文)。

对于抗体的化学发光标记来说，将1ml抗体溶液(c＝3.19mg/ml)与40μl pH 7.8的1M磷酸钾，以及2.7μl MACN-吖啶鎓-NHS酯(c＝1mg/ml；InVent Company GmbH，Hennigsdorf，Germany)进行混合(抗体：MACN的摩尔标记比率是10∶1)。然后，在室温温育30分钟。然后，通过NAP-10凝胶过滤柱(Pharmacia，Upsalla，Sweden)将标记性制备物在1.5ml流动溶剂中进行缓冲，由此除去了低分子量组分：

标记物1   PBS         pH 7.4     用于生物素化，      参见2.1.

标记物2  100mM磷酸钠，5mM EDTA   pH 6.9用于SPDP活化，参见2.2.

标记物3  PBS，        10mM EDTA  pH 8.0用于SMCC活化，参见2.3.

蛋白含量通过光度测定法测定；标记的抗体分份储存在-20℃。

2.MACN-化学发光标记的抗体的衍生

2.1.生物素化

MACN抗体用EZ-连接的NHS-发色的生物素(Pierce Company，Rockford，IL，USA，Art.No.21325)以摩尔比例1∶10进行生物素化。

将1mg  MACN抗体与5.41μl 1.233mM生物素溶液(新鲜溶解在DMSO中)混合，在室温温育60分钟。使用100μl 50mM甘氨酸将反应在室温终止10分钟，并在NAP5柱(Pharmacia，Upsalla，Sweden)上纯化。

为了将最后的游离基同没有与抗体键合的生物素分离，进行了凝胶过滤HPLC(柱子：Bio-Sil Sec 400，Biorad Company，Munich，Germany)。将样品上样，使用pH 7.4的PBS以0.8ml/min的流速进行层析。使用流动光度计测量280nm和354nm的波长。生物素的μM数/抗体标记程度的μM数的峰值为0.48。将含有抗体的级份(持留时间为11-12分钟)合并。

蛋白含量通过光度测定法测定；结合物分份储存在-20℃。

2.2分别与抗FLAG标签M1抗体和抗ProtC标签HPC4抗体的结合

对于分别与抗FLAG标签M1抗体(Sigma Company，Deisenhofen，Germany，Art.No.F 3040)和抗ProtC标签HPC 4抗体(RocheCompany，Nutley，NJ，USA，USA，Art No.11814516001)的结合来说，将后者与MACN抗体用SPDP(3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯，Pierce Company，Rockford，IL，USA，Art.No.21857)，以1∶7的摩尔比进行活化(参见“SPDP试剂说明书”，Pierce，Rockford，IL，USA)。

将每2mg抗体与4.67μl、20mmol的SPDP(新鲜溶解在乙醇中)混合，在室温温育30分钟。只有被活化的M1和HPC4抗体用200mmolDTT(二硫苏糖醇，溶解在100mmol磷酸钠，5mmol EDTA，pH 6.9中)调整到终浓度为10mmol DTT，并在室温还原15分钟。

在每种情况下，分别将还原的M1和HPC4抗体在NAP10柱上纯化(流动相溶剂：100mmol磷酸钠，5mmol EDTA，pH 6.9)，蛋白含量通过光度测定法测定。

在每种情况下，将还原的产物与未还原的SPDP活化的MACN抗体，以1∶1的摩尔比例在4℃结合过夜。然后，各用50μl、100mmol半胱氨酸将反应终止10分钟。

蛋白含量通过光度测定法测定；结合物分份储存在-20℃。

2.3.分别与His标签和寡聚-Asp肽的结合

为了分别偶联His标签肽“PRG12”(氨基酸序列RGSHHHHHHGGC(SEQ ID NO.1)，JPT Company GmbH，Berlin，Germany，M＝1359.8)和寡聚-Asp肽“D14C”(氨基酸序列DDDDDDDDDDDDDDC(SEQ ID NO.2)JPT Company GmbH，Berlin，Germany，M＝1731.43)，将MACN抗体用SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯，Pierce Company，Rockford，IL，USA，Art.No.22360)，以1∶50的摩尔比例进行活化(参见“SMCC和Sulfo-SMCC说明书”，Pierce，Rockford，IL，USA)。

将2mg MACN抗体与6.68μl 100mM SMCC(新鲜溶解在DMSO中)混合，在室温温育30分钟。将产物在NAP10柱子(Pharmacia，Upsalla，Sweden)上纯化(流动相溶剂：PBS，10mmol EDTA，pH 8)，蛋白含量通过光度测定法测定。

然后，立即以1∶100的摩尔比例进行与His标签或寡聚-Asp肽(溶解在蒸馏水中)的结合。在室温温育60分钟后，用100μl 100mM半胱氨酸将反应终止10分钟，再一次在NAP25柱(Pharmacia，Upsalla，Sweden)上纯化(流动相溶剂：PBS，pH 7.4)，蛋白含量通过光度测定法测定。

两种结合物都分成等份储存在-20℃。

结合配偶体2(固相)

1.1BSA与FLA-标签/ProtC-标签的结合

为了分别偶联Flag标签肽“PDC12”(氨基酸序列DYKDDDDKGGGC，(SEQ ID NO.3)，JPT Company GmbH，Berlin，Germany，M＝1286.46)和ProtC标签肽PEG15(氨基酸序列EDQVDPRLIDGKGGC，(SEQ ID NO.4)，JPT Company GmbH，Berlin，Germany，M＝1601.7)，将无蛋白酶的牛血清白蛋白(Sigma Company，Deisenhofen，Germany)用SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯，Pierce Company，Rockford，IL，USA，Art.No.22360)，以1∶2的摩尔比例进行活化(参见“SMCC和Sulfo-SMCC说明书”，Pierce，Rockford，IL，USA)。

将2500μl 0.5％BSA(溶解在PBS，10mmol EDTA，pH 8中)与3.78μl 100mM SMCC(新鲜溶解在DMSO中)混合，在室温温育30分钟。将产物在NAP25柱(Pharmacia，Upsalla，Sweden)上纯化(流动相溶剂：PBS，10mmol EDTA，pH 8)，蛋白含量通过光度测定法测定。

然后，立即以1∶100的摩尔比例进行与FLAG标签或ProtC标签肽(溶解在蒸馏水中)的结合。在室温温育60分钟后，结合物各用100μl 100mM半胱氨酸终止10分钟并再一次在NAP25柱(Pharmacia，Upsalla，Sweden)上纯化(流动相溶剂：PBS，pH 7.4)，蛋白含量通过光度测定法测定。

将BSA+FLAG标签和BSA+ProtC标签结合物分成等份储存在-20℃。

1.2BSA与寡聚-Lys肽的结合

为了偶联寡聚-Lys肽“K14C”(氨基酸序列KKKKKKKKKKKKKKC，(SEQ ID NO.5)，JPT Company GmbH，Berlin，Germany，M＝1914.27)，将无蛋白酶的牛血清白蛋白(SigmaCompany，Deisenhofen，Germany)用SMCC以1∶25的摩尔比例进行活化。

将1000μl 0.5％BSA(溶解在PBS，10mmol EDTA，pH 8中)与18.9μl 100mM SMCC(新鲜溶解在DMSO中)在室温温育30分钟。将产物在NAP10柱(Pharmacia，Upsalla，Sweden)上纯化(流动相溶剂：PBS，10mmol EDTA，pH 8)，蛋白含量通过光度测定法测定。

然后，立即以1∶100的摩尔比例进行与寡聚-Lys肽(溶解在蒸馏水中)的结合。在室温温育60分钟后，用100μl 100mM半胱氨酸将反应终止10分钟，再一次在NAP25柱(Pharmacia，Upsalla，Sweden)上纯化(流动相溶剂：PBS，pH 7.4)，蛋白含量通过光度测定法测定。

将BSA+寡聚-Lys结合物分成等份储存在-20℃。

2.分别偶联结合物和亲和素

将辐照过的star管(Greiner Company，Frickenhausen，Germany)按照下面描述，分别使用来自1.1和1.2的结合物、以及亲和素(Pierce，Rockford，IL，USA，Art.No.21121，溶解在蒸馏水中)进行包被：

将成分用10mM Tris，100mM NaCl，pH 7.8稀释到浓度为6.67μg/ml。每个管用移液管移入300μl每种溶液，在22℃温育20小时。将溶液吸出。然后，将每个管用300μl 0.5％牛血清白蛋白，2％KarionFP饱和2小时，并再一次吸出。然后将管在真空干燥器中干燥，储存在4℃。

3.Ni-NTA固相

使用了Ni-NTA微量滴定板(Qiagen Company，Hilden，Germany，Art.No.1006387)。

4.用于检测可逆键合的抗体的分析方法

4.1MACN抗体结合物的结合

将MACN抗体结合物用稀释缓冲液(参见表2)调整到浓度为1.5μg/ml(参见表2)。各用移液管吸取300μl到几个平行批次的相应固相中，在室温温育过夜。将管用5x1ml、Ni-NTA微量滴定板用5x300μl洗涤缓冲液(参见表2)洗涤。

在每个批次中，测定键合的MACN抗体结合物的量：

与管键合的MACN抗体结合物的量在照度计(BERTHOLDCompany，BAD WILDBAD，GERMANY，LB952T；基本试剂来自BRAHMS AG)中测量。与微孔板键合的MACN抗体结合物的量在微孔板照度计(BERTHOLD Company，BAD WILDBAD，GERMANY，MPL2；基本试剂来自BRAHMS AG)中测量。

4.2测量MACN-抗体结合物与全血的非特异性解离

在其它批次的键合的MACN-抗体结合物中，各用移液管吸取300μl全血(参见表2)，温育10分钟。将管用5x1ml、Ni-NTA微量滴定板用5x300μl洗涤缓冲液(参见表2)洗涤。管中留下的MACN抗体结合物的量在照度计(BERTHOLD Company，BAD WILDBAD，GERMANY，LB952T；基本试剂来自BRAHMS AG)中测量。

微量滴定板中留下的MACN抗体结合物的量，在微孔板照度计(BERTHOLD Company，BAD WILDBAD，GERMANY，MPL2；基本试剂来自BRAHMS AG)中测量。

4.3测量MACN抗体结合物与解离缓冲液的特异性解离

在其它批次的键合的MACN抗体结合物中，各用移液管吸取300μl解离缓冲液(参见表2)，温育10或30分钟。将管用5x1ml洗涤缓冲液、Ni-NTA微量滴定板用5x300μl洗涤缓冲液(参见表2)洗涤。

管中留下的MACN抗体结合物的量在照度计(BERTHOLDCompany，BAD WILDBAD，GERMANY，LB952T；基本试剂来自BRAHMS AG)中测量。

微量滴定板中留下的MACN抗体结合物的量，在微孔板照度计(BERTHOLD Company，BAD WILDBAD，GERMANY，MPL2基本试剂来自BRAHMS AG)中测量。

表2

关于寡聚-Asp/寡聚-Lys系统的进一步研究

解离剂

如上所述，通过加入0.01％肝素获得了键的有效解离(参见表1和相关描述)。作为可选的解离剂，也研究了NaCl和KF。使用浓度＞0.8M的NaCl或KF时，获得了与使用0.01％肝素时可比的键解离。也可以设想大量其它导致键解离的缓冲液组成变体(其它低分子量的盐，其它带电荷寡聚物或聚合物，其它pH值)。所有这些变化在本发明的术语中都被定义为解离剂。但是，被认为是特别优选的那些变体，一方面有效地使寡聚-Asp/寡聚-Lys系统的结合去稳定化，但是另一方面又保持抗体与分析物之间的结合尽可能不被破坏。浓度为0.01％的肝素代表了这样一种优选的变体，因为当然，许多免疫分析可以使用肝素血浆作为样品基质，在这种血浆中肝素的浓度典型地在0.01％的范围内。

分析物与固相键合的特异性

如果将生物学样品加到包被有寡聚-Lys-BSA/寡聚-Asp-分析物结合剂的固相上，可能会担心来自样品的目标分析物将不仅与分析物特异性抗体结合，而且可能通过离子相互作用与固相的任选游离赖氨酸部分非特异性结合。如果发生这种情况，将损害随后进行的分析物检测(在解离步骤后)的精确性。通过将各种不同的合成肽——它们与已知天然分析物基本上相同，因而代表了后者——进行化学发光标记，在血浆基质中稀释，并在用寡聚-Lys-0BSA标记并键合了寡聚-Asp-抗PCT抗体的管中温育，对这种分析物的非特异性键合是否能够发生、以及发生的程度，进行了研究。检测到的非特异性键合的肽的比例总是低于提供的肽的7％。因此，与固相结合的非特异性分析物不构成问题。

具体来说，试验如下进行：

1.产生MaCN-化学发光标记的肽

将下列的肽(都来自JPT Company GmbH，Berlin，Germany)用MACN进行标记：

“PPL41”(氨基酸序列PEVPPWTGEVSPAQRDGGALGGGG-RGPWDSSDRSALLKSKL(SEQID NO.6)，源自于NT-proANP)，“PSW44”(氨基酸序列SSEEHLRQTRSETMRNSVKSSFHDPKLKGKPSRER-YVTHNRAHW，(SEQ ID NO.7)，源自于前内皮素)，“PAY33”(氨基酸序列ATQLDGPAGALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY，(SEQ ID NO.8)，源自于和肽素)，“肽45-92”(氨基酸序列ELRMSSSYPTGLADVKAGPAQTLIRPQDMKGASRSPEDSSPDAARIRV(SEQ ID NO.9)，源自于肾上腺髓质素前体)。

为了进行化学发光标记，以1∶1的摩尔比例将肽用MACN-吖啶鎓-NHS酯(InVent Company GmbH，Hennigsdorf，Germany)在室温标记1小时。然后使用pH 7.8的1mM Tris将反应终止10分钟。

为了分离未掺入的MACN，将标记的批样在反相C18柱(μBondapak，Waters WAT027342，No.0202352581)上进行纯化。将样品上样，以1.0ml/min的流速，使用渐增的水/乙腈(+0.1％TFA)梯度进行层析。使用流动光度计，在214nm、280nm和368nm波长处进行测量，并检测峰。

将标记的肽分份储存在-20℃。

1.1.BSA+寡聚-Lys结合物的生产：参见上文。

1.2.抗降钙素绵羊+寡聚-Asp结合物的生产

为了偶联寡聚-Asp肽“D14C”(氨基酸序列为DDDDDDDDDDDDDDC，(SEQ ID NO.2)，(JPT Company GmbH，Berlin，Germany，M＝1731.43)，将多克隆抗降钙素绵羊抗体(“抗PCT抗体1”)以1∶25的比例用SMCC进行活化(参见“SMCC和Sulfo-SMCC说明书”，Pierce)。

将3mg抗体(在4.5ml PBS，10mM EDTA，pH 8中)与5.0μl 100mM SMCC(新鲜溶解在DMSO中)混合，在室温温育30分钟。将产物在两个NAP25柱上纯化(流动相溶剂：PBS，10mmol EDTA，pH 8)，蛋白含量通过光度测定法测定。

然后，立即以1∶100的摩尔比例与寡聚-Asp肽(溶解在蒸馏水中)进行结合。在室温温育60分钟后，用100μl 100mM半胱氨酸将反应终止10分钟，未结合的肽在NAP25柱上进行分离(流动相溶剂：PBS，pH 7.4)，蛋白含量通过光度测定法测定。

将抗降钙素绵羊抗体+寡聚-Asp结合物分成等份，储存在-20℃。

2.结合物与管的结合

2.1.偶联：BSA+寡聚-Lys结合物

将辐照过的star管(Greiner Company，Frickenhausen，Germany)用BSA-寡聚-Lys结合物如下所述进行包被：

将结合物在10mM Tris，100mM NaCl，pH 7.8中稀释，形成6.67μg/ml的浓度。在每个管中用移液管吸移入300μl该溶液，在22℃温育20小时。将溶液吸出。然后，将每个管用300μl 0.5％牛血清白蛋白，2％Karion FP饱和2小时，再一次吸出。然后进行抗降钙素绵羊抗体+寡聚-Asp结合物的结合：

2.2键合：抗降钙素绵羊抗体+寡聚-Asp结合物

将结合物在PBS，0.5％无蛋白酶BSA，pH 7.4中稀释到浓度为667ng/ml。用移液管移取300μl该溶液到每个管中，在22℃温育1小时。将溶液吸出。然后，将每个管再用300μl 0.5％牛血清白蛋白，2％KarionFP饱和2小时，然后吸出。

然后，将管在真空干燥器中干燥，储存在4℃。

3.非特异性键合的测定：

将MACN肽在血浆基质中稀释。各用移液管移取300μl到用寡聚-Lays-BSA和寡聚-Asp-抗PCT抗体包被的管中，在室温温育30分钟。将管用3x1ml PBS，pH 7.40.5％无蛋白酶BSA洗涤。与管键合的量以及使用的MACN的总活性在照度计(BERTHOLD Company，BADWILDBAD，GERMANY，LB9527；基本试剂来自BRAHMS AG)中测量。非特异性结合相对于总活性的百分率是：

PSW44        3.0％

PPL41        3.1％

PAY33        6.5％

肽45-92      2.9％

与PCT实施例的比较：全血与来自全血的PCT免疫提取物的标准免疫层析的比较，利用免疫层析或TRACE技术进行解离和分析物检测

PCT(降钙素原)被选作相应的模型分析物。它是细菌感染的标志物，特别是引起宿主全身性炎症反应的严重感染(败血病)(21)。用于检测PCT的夹心免疫分析方法，使用了针对降钙素或肽的catacalcin部分的抗体(22)，(23)。

免疫层析代表了用于对来自全血的分析物进行免疫检测的快速测试方法，而全血在当今常规应用中最常见，因此这种方法可以被称为“标准免疫层析”。因此在这里选择这种方法作为参比方法，来解释按照本发明的用于相关分析物检测的免疫提取和解离(“免疫转移”)的原理的优点。研究了两种不同的检测方法：一方面是免疫层析，另一方面是TRACE(时间分辨扩增穴状化合物释放)技术。使用所有三种方法，在每种情况下进行了10次来自含有PCT的全血样品的PCT浓度的测定。在图2中，对获得的方法的精确性情况进行了比较。可以清楚地看出，作为本发明的主题的两种方法，产生了与检测方法(即免疫层析或TRACE技术)相关联的免疫转移，特别是与参比方法(标准的直接从全血进行的免疫层析)相比获得了更精确灵敏的测量结果。执行实验的详细情况在下面进行解释。在A下，作为本发明的方法，描述了利用TRACE技术进行共同结合的分析物检测的免疫转移；在B下，作为本发明的方法，描述了利用免疫层析进行结合的分析物检测的免疫转移；在C下，描述了标准的免疫层析作为参比方法。变体A、B和C的精确性情况的比较，显示在图2中。

A.从全血免疫提取PCT和利用TRACE技术进行分析物检测

作为固相，使用了由高结合力聚苯乙烯构成的微量滴定板，它包被有寡聚-Lys-BSA，通过它键合了第一种抗PCT抗体，该抗体事先已经用寡聚-Asp和空穴化合物衍生。然后将含有PCT的全血样品短时温育，PCT从样品免疫提取到固相中。在清洗固相后，加入解离缓冲液，短时间温育。将等份试样转移到另一个低结合性的黑色微量滴定板中，与含有花青苷标记的抗PCT第二抗体的溶液混合。在短时间温育后，形成的夹心物在使用激光激发后利用TRACE技术进行检测。

具体来说，试验如下进行：

A.1.产生用于固相的结合物

A.1.1.产生BSA+寡聚-Lys结合物：参见前述。

A.1.2.产生抗抗降钙素绵羊抗体空穴化合物MonoMP+寡聚-Asp结合物

为了用空穴化合物单磷酸酯(“KmonoMP”，Cezanne Company，Nimes，France)进行标记，将多克隆的抗降钙素绵羊抗体(“抗PCT抗体1”)用SPDP(3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯，PierceCompany，Rockford，IL，USA，Art.No.21857)，以1∶4的摩尔比进行活化(参见“SPDP试剂说明书”，Pierce，Rockford，IL，USA)。

将5mg抗体(溶解在1.5ml 100mM磷酸钠，5mM EDTA，pH 6.9中)与41.6μl 3.2mM SPDP(新鲜溶解在乙醇中)混合，在室温温育30分钟。

将活化的抗体用81.2μl 200mM DTT(二硫苏糖醇，溶解在100mM磷酸钠，5mM EDTA，pH 6.9中)在室温还原15分钟。

将产物在两个NAP10柱上纯化(流动相溶剂：100mM磷酸钠，5mM EDTA，pH 6.9)，蛋白含量通过光度测定法测定。

然后，立即将洗脱物与冷冻干燥的KmonoMP以1∶8的摩尔比例进行结合。在4℃温育20小时后，将产物在三个NAP10柱上再纯化一次(流动相溶剂：PBS，10mM EDTA，pH 8)，蛋白含量通过光度测定法测定。

为了连接寡聚-Asp肽“D14C”(氨基酸序列DDDDDDDDDDDDDDC，(SEQ ID NO.2)，JPT Company GmbH，Berlin，Germany，M＝1731.43)，将产物用SMCC以1∶25的比例活化(参见“SMCC和Sulfo-SMCC说明书”，Pierce，Rockford，IL，USA)：将3mg产物(用4.5ml PBS，10mM EDTA，pH 8洗脱)与5.0μl 100mM SMCC(新鲜溶解在DMSO中)混合，在室温温育30分钟。将产物在两个NAP25柱上进行纯化(流动相溶剂：PBS，10mM EDTA，pH 8)，蛋白含量通过光度测定法测定。

然后，立即以1∶100的摩尔比例使用寡聚-Asp肽(溶解在蒸馏水中)进行结合。在室温温育60分钟后，将反应用100μl 100mM半胱氨酸终止10分钟，未结合的肽在NAP25柱上进行分离(流动相溶剂：PBS，pH 7.4)，蛋白含量通过光度测定法测定。

将抗降钙素绵羊抗体-K monoMP+寡聚-Asp结合物的等份试样储存在-20℃。

A.2.结合物与微量滴定板的偶联

A.2.1.偶联：BSA+寡聚-Lys结合物

将辐射过的微量滴定板(Greiner Company，Frickenhausen，Germany)用BSA-寡聚-Lys结合物如下进行包被：

将结合物用10mM Tris，100mM NaCl，pH 7.8的溶液稀释到浓度为6.67μg/ml。将300μl该溶液用移液管移取到每个孔中，在22℃温育20小时。将溶液吸出。然后，将每个孔用300μl 0.5％牛血清白蛋白，2％Karion FP饱和2小时，再一次吸出。然后，进行抗降钙素绵羊抗体-空穴化合物monoMP+寡聚-Asp结合物的结合。

A.2.2.键合：抗降钙素绵羊抗体空穴化合物MonoMP+寡聚-Asp结合物

将结合物在PBS，0.5％无蛋白酶BSA，pH 7.4中稀释到浓度为667ng/ml。用移液管移取300μl该溶液到每个孔中，在22℃温育1小时。将溶液吸出。然后，每个孔用300μl 0.5％牛血清白蛋白，2％Karion FP饱和2小时，再一次吸出。

然后，将微量滴定板在真空干燥器中干燥，储存在4℃。

A.3.产生用于液相的抗降钙素小鼠抗体-Cy5结合物

在存在45％(2-羟基丙基)-β-环糊精(Aldrich Company，Seelze，Germany，Art.No.33,260-7)的情况下，将单克隆的抗降钙素抗体(“抗PCT抗体2”)用Cy5-NHC(Amersham Company，Art.No.PA15100)以1∶20的摩尔比例进行标记(参见产品手册“Amersham CyDye单反应性NHS酯”)。

将213μl抗体(c＝10mg/ml，在pH 7.4的PBS中)与750μl 60％的环糊精(溶解在pH9的100mM碳酸盐缓冲液中)混合，并与37.3μl7.7mM Cy5-NHS(溶解在DMSO中)混合。在室温温育1小时后，使用50μl 50mM甘氨酸将批次终止10分钟，在NAP10柱上预纯化(流动相溶剂：PBS，pH 7.4)。

为了分离最后的没有与抗体键合的Cy5-NHS基团，进行了凝胶过滤-HPLC(柱：Bio-Sil Sec 125，Biorad Company，Munich，Germany)。将样品上样并使用pH7.4的PBS以1ml/分钟的流速层析。使用流动光检测器在280nm和648nm波长处进行测量。作为抗体标记程度的度量的648nm/280nm吸光度比率的峰值是1.48。将含有抗体的级分(持留时间8-10分钟)合并。

将抗降钙素小鼠抗体-Cy5结合物分份储存在-20℃。

A.4.免疫转移和TRACE分析测定

对于每种样品，在10次测定中进行了下面描述的分析。在用BSA+寡聚-Lys和抗降钙素绵羊抗体空穴化合物MonoMP+D14C结合物包被的微量滴定板的孔中，用移液管吸移入300μl与重组PCT((InVivoGmbh，Hennigsdorf，Germany)一起储存的EDTA全血样品，在室温温育15分钟(样品的PCT浓度从血浆测定，使用LIA-灵敏性BRAHMSPCT分析(BRAHMS AG，Hennigsdorf，Germany)进行测量)。然后，将它用300μl pH 7.4的PBS清洗两次，然后用300μl清洗溶液(8mMTris，60mM NaCl，0.2％Tween 20，pH 7.5)清洗两次。然后，将它与300μl解离缓冲液(PBS，pH 7.4，0.6M KF，0.5％BSA，0.01％肝素)温育10分钟。从解离的免疫复合物中，转移100μl到适合用于TRACE测量的微量滴定板中(Costar Half Area板，96孔，黑色，聚苯乙烯，Sigma/Aldrich Company，Seelze，Germany，Catalyst.No.CLS3694-100EA)，与50μl抗降钙素小鼠抗体-Cy5-NHS结合物(c＝20μg/ml，在pH 7.4的PBS中，0.6M KF，0.5％BSA，0.01％肝素)在室温温育19分钟。TRACE信号的测量(620nm和665nm)使用高效时间分辨荧光微量滴定板读板器RUBYstar(BMG LABTECH CompanyGmbH，Offenburg，Germany)进行。

在这种情况下，在RUBYstar上进行了下列装置设置：

闪光数量         20

积分延迟[μs]    50

积分时间[μs]    400

间隔时间[μs]    10

间隔数量         45

比率乘数         10,000

对于每个样品来说，按照下式从OD_665nm/OD_620nm比率计算了ΔF：

ΔF＝(Ratio_pos-Ratio_neg)/Ratio_neg

在这种情况下，ratio_neg是指PCT阴性样品(即不包含或没有检测到PCT的样品)的比率，ratio_pos是指被测试的样品(即可能含有PCT的样品)的比率。相应的平均值从个体样品的10次测定中产生。这些值被用作标准浓度，据此使用MultiCalc(样条拟合)软件确定所有个体样品的浓度。对于每个10次测定确定了变异系数。

B.从全血免疫提取PCT以及通过免疫层析检测分析物

作为固相，使用了用寡聚-Lys-BSA包被的聚苯乙烯管，其上键合有第一种抗PCT抗体，所述抗体事先已经用寡聚-Asp和生物素衍生。然后将含有PCT的全血样品短时温育，在这种情况下，PCT从样品免疫提取到固相中。在清洗固相后，加入解离缓冲液，它含有用胶体金标记的抗PCT第二抗体，并短时间温育。最后将溶液在测试条上免疫层析，在测试条上喷洒有链亲和素作为测试区带。生物素化的抗PCT第一抗体，以及进而还有与其键合的PCT，以及依次与PCT键合的金标记的抗PCT第二抗体，与链亲和素结合。标记物的检测通过反射计进行。

具体来说，试验如下进行：

B.1.产生用于固相的结合物

B.1.1.产生BSA+寡聚-Lys结合物：参见上文。

B.1.2.产生生物素化的抗降钙素绵羊抗体+寡聚-Asp结合物

将多克隆抗降钙素绵羊抗体(“抗PCT抗体1”)与EZ连接的sulfo-NHS-LC-LC-生物素(Pierce Company，Rockford，IL，USA，Art.No.21338)以1∶10的摩尔比率混合(参见“EZ连接的Sulfo-NHS-LC-LC-生物素说明书”，Pierce，Rockford，IL，USA)：将1.6mg抗体(在pH7.4的PBS)与10μl 10mM EZ连接的sulfo-NHS-LC-LC-生物素(新鲜溶解在蒸馏水中)混合，在室温温育30分钟。

将产物在NAP5柱上纯化(流动相溶剂：PBS，10mM EDTA，pH8.0)，蛋白含量通过光度测定法测定。

为了连接寡聚-Asp肽“D14C”(氨基酸序列DDDDDDDDDDDDDDC，(SEQ ID NO.2))(JPT Company GmbH，Berlin，Germany，M＝1731.43)，将产物用SMCC以1∶50的比率进行活化(参见“SMCC和Sulfo-SMCC说明书”，Pierce，Rockford，IL，USA)。

将1.3mg产物(用1.0ml PBS，10mmol EDTA，pH 8洗脱)与4.33μl 100mM SMCC(新鲜溶解在DMSO中)混合，在室温温育30分钟。将产物在NAP10柱上纯化(流动相溶剂：PBS，10mmol EDTA，pH 8)，蛋白含量通过光度测定法测定。

然后，立即与寡聚-Asp肽(溶解在蒸馏水中)以1∶100的摩尔比率进行结合。在室温温育60分钟后，使用100μl 100mM半胱氨酸将反应终止10分钟，将未结合的肽在NAP25柱上分离(流动相溶剂：PBS，pH 7.4)，蛋白含量通过光度测定法测定。

将生物素化的抗降钙素绵羊抗体+寡聚-Asp结合物等份储存在-20℃。

B.2.结合物与管的偶联

B.2.1.偶联：BSA+寡聚-Lys结合物

将辐照过的star管(Greiner Company，Frickenhausen，Germany)按照下面描述用BSA-寡聚-Lys结合物包被：

将结合物用10mM Tris，100mM NaCl，pH 7.8的溶液稀释到浓度为6.67μg/ml。将300μl该溶液用移液管移取到每个管中，在22℃温育20小时。将溶液吸出。然后，将每个管用300μl 0.5％牛血清白蛋白，2％Karion FP饱和2小时，再一次吸出。然后，进行生物素化的抗降钙素绵羊抗体+寡聚-Asp结合物的结合。

B.2.2.键合：生物素化的抗降钙素绵羊抗体+寡聚-Asp结合物

将结合物在PBS，0.5％无蛋白酶BSA，pH 7.4中稀释到浓度为667ng/ml。将300μl该溶液用移液管移取到每个管中，在22℃温育1小时。吸出溶液。然后，将每个管再一次用300μl 0.5％牛血清白蛋白，2％Karion FP饱和2小时，然后吸出。

然后，将管在真空干燥器中干燥，储存在4℃。

B.3.产生金标记的抗Catacalcin抗体：

本成分从8sens.biognostic Company GmbH，Berlin，Germany购买。按照Hermanson的描述，将单克隆抗catacalcinin抗体与胶体金偶联(8sens.biognostic Company GmbH，Berlin，Germany；按照Frens的文献进行：Frens，G.，Nature Physical Science，1973，241 20-22)(http://www.amazon.de/Bioconjugate-Techniques-Greg-T-Hermanson/dp/0 123423368)。

B.4.产生测试条：

本成分从8sens.biognostic Company GmbH，Berlin，Germany购买。将MDI的硝酸纤维素膜(Advanced Microdevices，Ambala，India)涂有4μg/cm链亲和素(Pierce，Rockford，IL，USA)(测试线)以及2.5μg/cm抗小鼠IgG抗体(Scantibodies，Santee，CA，USA)(对照线)。使用Biodot Company，Irvine，CA，USA的微量分样器来施加捕获分子。然后，将膜在50℃干燥过夜。Millipore Company Billerica，MA，USA的AP22被用作吸入垫。

B.5.免疫转移和免疫层析：

对于每种样品，在10次测定中进行了下面描述的分析。在用BSA+寡聚-Lys和生物素化的抗降钙素绵羊抗体+D14C结合物包被的管中，用移液管吸移入300μl与重组PCT((InVivo Gmbh，Hennigsdorf，Germany)一起储存的EDTA全血样品，在室温温育15分钟(样品的PCT浓度从血浆测定，使用LIA-灵敏的BRAHMS PCT分析(BRAHMSAG，Hennigsdorf，Germany)进行测量)。然后，将它用300μl pH 7.4的PBS清洗两次，然后用300μl清洗溶液(8mM Tris，60mM NaCl，0.2％Tween 20，pH 7.5)清洗两次。然后，将它与150μl解离缓冲液(PBS，pH 7.4，0.5％BSA，0.5％Tween 20，0.01％肝素)温育，其中还包含金标记的抗catacalcin单克隆抗体，同时振荡10分钟。从解离的免疫复合物转移150μl到低结合力微量滴定板的孔中。然后直接使用测试条，通过将测试条插入到孔中来进行免疫层析。30分钟后，使用来自LRE医药Company GmbH，Munich，Germany的反射计测定测试区带的显色。

相应的平均值从个体样品的10次测定中产生。这些值被用作标准浓度，据此使用MultiCalc(样条拟合)软件确定所有个体样品的浓度。对于每个10次测定确定了变异系数。

C.通过标准免疫层析从全血检测PCT

产生的测试条在样品施加区上提供了适合用于保留来自要施加的全血样品的血细胞的膜。处于干燥状态的多孔垫(“样品垫”)，一方面包含了生物素标记的抗PCT第一抗体，另一方面包含了胶体金标记的抗PCT第二抗体，它被附着在该膜与测试条之间。将链亲和素喷洒在测试条上作为测试区带。将测试条插入塑料匣中。将含有PCT的全血样品进行免疫层析。生物素化的抗PCT第一抗体，以及因此因此还有与其键合的PCT，以及又与PCT键合的金标记的抗PCT第二抗体，与链亲和素结合。标记物的检测通过反射计进行。

具体来说，试验如下进行：

C.1.生产用于固相的结合物

C.1.1.生产BSA+寡聚-Lys结合物：参见上文

C.1.2.生产生物素化的抗降钙素绵羊抗体+寡聚-Asp结合物：参见上文

C.2.生产金标记的抗Catacalcin抗体：参见上文

C.3.产生测试条：

本成分从8sens.biognostic Company GmbH，Berlin，Germany购买。将MDI的硝酸纤维素膜(Advanced Microdevices，Ambala，India)涂布4μg/cm链亲和素(Pierce，Rockford，IL，USA)(测试线)以及2.5μg/cm抗小鼠IgG抗体(Scantibodies，Santee，CA，USA)(对照线)。使用Biodot Company，Irvine，CA，USA的微量分样器来施加捕获分子。然后，将膜在50℃干燥过夜。Millipore Company Billerica，MA，USA的AP22被用作吸入垫。为了生产全血测试，使用了8sens.biognosticCompany的全血套装。在样品施加区中，一方面是与胶体金偶联的抗降钙素抗体，另一方面是生物素化+寡聚-Asp-衍生的抗降钙素抗体被固定化在两个分离的垫上。使用8sens.biognostic Company的标准外壳作为匣。

C.4.标准免疫层析

对于每种样品，在10次测定中进行了下面描述的免疫层析。将120μl与重组PCT((InVivo Gmbh，Hennigsdorf，Germany)一起储存的EDTA全血样品，用移液管移取到测试条上(样品的PCT浓度从血浆测定，使用LIA-灵敏的BRAHMS PCT分析(BRAHMS AG，Hennigsdorf，Germany)进行测量)。30分钟后，使用来自LRE Medical Company GmbH，Munich，Germany的反射计测定测试区带的显色。

相应的平均值从个体样品的10次测定中产生。这些值被用作标准浓度，据此使用MultiCalc(样条拟合)软件确定所有个体样品的浓度。对于每个10次测定确定了变异系数。

D.从全血免疫提取MR-proADM以及利用免疫层析测定分析物

作为从全血免疫提取的方法和利用免疫层析进行分析物检测的另一个例子，开发了用于MR-proADM分析物(中区肾上腺髓质素前体)的测试系统。MR-proADM是在血液中循环的稳定的肽，已知来自于肾上腺髓质素前体的蛋白水解加工(Struck，J.等：Peptides，2004 Aug；25(8)：1369-72)。肾上腺髓质素是了解的最多的内源血管舒张剂之一，参与了大量生物学过程的调控，特别是心血管系统的调控(Beltowski，J.等：Pol J Pharmacol.2004 Jan-Feb；56(1)：5-27)。MR-proADM的测量已经被证明可用作成熟的肾上腺髓质素的替代标志，成熟的肾上腺髓质素在各种不同疾病状况的诊断和预后的体系中，不能可靠地测量。这些疾病包括尤其是：COPD(Stolz，D.等：Chest.2008 May 19[印刷文字前面的Epub格式])，肺炎(Christ-Cain，M.等；Crit Care.206；10(3)：R96.)，败血病(Christ-Crain，M.等；Crit Care.2005；9(6)：R816-24.)，心肌梗塞(Khan，S.Q.等：J Am Coll Cardiol.2007 Apr 10；49(14)：1525-32.)，心力衰竭(Gegenhuber，A.等：J Card Fail.2007 Feb；13(1)：42-9.)。

对于MR-proADM来说，本发明的方法在正常范围(Morgenthaler，N.G.等：Clin Chem.2005 Oct；51(10)：1823-9)和与各种临床情况(参见上文)相关的升高的浓度范围内(图3)，都显示出高的精确性。

具体来说，试验如下进行：

D.1.产生用于固相的结合物

D.1.1.产生BSA+寡聚-Lys结合物：参见上文

D.1.2.产生生物素化的抗“SPCD19”绵羊抗体+寡聚-Asp结合物

为了偶联寡聚-Asp肽“D14C”(氨基酸序列DDDDDDDDDDDDDDC，(SEQ ID NO.2)，JPT Company GmbH，Berlin，Germany，M＝1731.43)，将多克隆抗“SPCD19”(氨基酸序列CRPQDMKGAS-RSPEDSSPD，(SEQ ID NO.10)，JPT CompanyGmbH，Berlin，Germany，M＝2063)绵羊抗体，用SMCC以1∶25的比例活化(参见“SMCC和Sulfo-SMCC说明书”，Pierce，Rockford，IL，USA)。

将1.0mg抗体与16.67μl 10mM SMCC(新鲜溶解在DMSO中)和103μl PBS，10mM EDTA，pH 8混合，在室温温育30分钟。将产物在NAP5柱上纯化(流动相溶剂：PBS，10mM EDTA，pH 8)，蛋白含量通过光度测定法测定。

然后，以1∶100的摩尔比例立即与寡聚-Asp肽(溶解在蒸馏水中)进行结合。在室温温育60分钟后，将未结合的肽在NAP10柱上分离(流动相溶剂：PBS，pH 7.4)，蛋白含量通过光度测定法测定。

将产物与EZ连接的sulfo-NHS-LC-LC-生物素(Pierce Company，Rockford，IL，USA，Art.No.21338)以1∶20的摩尔比率混合(参见“EZ连接的Sulfo-NHS-LC-LC-生物素说明书”，Pierce，Rockford，IL，USA)：将900μg抗体(在pH 7.4的PBS)与12μl 10mM EZ连接的sulfo-NHS-LC-LC-生物素(新鲜溶解在蒸馏水中)混合。在室温温育30分钟后，将反应用50μl 1M Tris终止10分钟。将产物在NAP25柱上纯化(流动相溶剂：PBS，pH 7.4)，蛋白含量通过光度测定法测定。

将生物素化的抗“SPCD19”绵羊抗体+寡聚-Asp结合物等份储存在-20℃。

D.2.结合物与管的偶联

D.2.1.偶联：BSA+寡聚-Lys结合物

将辐照过的star管(Greiner Company，Frickenhausen，Germany)按照下面描述用BSA-寡聚-Lys结合物包被：

将结合物用10mM Tris，100mM NaCl，pH 7.8的溶液稀释到浓度为6.67μg/ml。将300μl该溶液用移液管移取到每个管中，在22℃温育20小时。将溶液吸出。然后，将每个管用300μl 0.5％牛血清白蛋白，2％Karion FP饱和2小时，再一次吸出。然后，进行生物素化的抗降钙素绵羊抗体+寡聚-Asp结合物的结合。

D.2.2.键合：生物素化的抗“SPCD19”绵羊抗体+寡聚-Asp结合物

将结合物在PBS，0.5％无蛋白酶BSA，pH 7.4中稀释到浓度为667ng/ml。将300μl该溶液用移液管移取到每个管中，在22℃温育1小时。吸出溶液。然后，将每个管再一次用300μl 0.5％牛血清白蛋白，2％Karion FP饱和2小时，然后吸出。

然后，将管在真空干燥器中干燥，储存在4℃。

D.3.产生金标记的抗“PSV11”抗体：

使用了单克隆抗“PSV11”抗体(PSV11代表MR-proADM的部分序列：氨基酸序列CSSPDAARIRV，(SEQ ID NO.11)，JPT CompanyGmbH，Berlin，Germany，M＝1174)。按照Hermanson的描述，将抗体与胶体金(BBI International Company，EM.GC 60nm)偶联(http://www.amazon.de/Bioconjugate-Techniques-Greg-T-Hermanson/dp/0 123423368).

D.4.产生测试条：

本成分从8sens.biognostic GmbH，Berlin，Germany购买。将MDI的硝酸纤维素膜(Advanced Microdevices，Ambala，India)涂上4μg/cm链亲和素(Pierce，Rockford，IL，USA)(测试线)。使用Biodot Company，Irvine，CA，USA的微量分样器来施加捕获分子。然后，将膜在50℃干燥过夜。Millipore Company Billerica，MA，USA的AP22被用作吸入垫。

D.5.免疫转移和免疫层析：

对于每种样品，在10次测定中进行了下面描述的分析。在用BSA+寡聚-Lys和生物素化的抗“SPCD19”绵羊抗体+“D14C”结合物包被的管中，用移液管吸移入300μl与合成的45-92肾上腺髓质素前体(氨基酸序列ELRMSSSYPTGLADVKAGPAQTLIR-PQDMKGASRSPEDSSPDAARIRV(SEQ ID NO.9)，JPT Company GmbH，Berlin，Germany，M＝5115)一起储存的EDTA全血样品，在室温温育15分钟(样品的proADM浓度从血浆测定，使用proADM LIA BRAHMS分析(BRAHMS AG，Hennigsdorf，Germany)进行测量)。然后，将它用1ml洗涤缓冲液(8mM Tris，60mM NaCl，0.2％Tween 20，pH 7.5)清洗5次。

然后，在振荡10分钟的同时，将它与150μl解离缓冲液(PBS，pH7.4，0.5％BSA，0.1％Tween 20，0.01％肝素，0.08％NaN3)温育，其中还包含金标记的抗“PSV11”单克隆抗体。从解离的免疫复合物转移100μl到低结合力微量滴定板的孔中。然后直接使用测试条，通过将测试条插入到孔中来进行免疫层析。30分钟后，使用来自LRE MedicalCompany GmbH，Munich，Germany的反射计测定测试区带的显色。

相应的平均值从个体样品的10次测定中产生。这些值被用作标准浓度，据此使用MultiCalc(样条拟合)软件确定所有个体样品的浓度。对于每个10次测定确定了变异系数。

附图描述

图1显示了分析物(PCT)可以从全血中免疫提取，特别是早在仅仅温育5分钟后，就具有与参比方法温育2小时后相似的效率。

图2：显示了使用各种不同PCT浓度的全血样品进行的多次测定的变异系数，它们使用下列三种标明的方法进行测定(A：使用TRACE技术的免疫转移，B：使用免疫层析的免疫转移，C：参比的标准免疫层析)。包含免疫转移的两种方法代表了本发明的方法；标准免疫层析是参比方法。

图3：显示了使用各种不同MR-proADM浓度的全血样品进行的多次测定的变异系数，它们使用本发明的使用免疫层析的免疫转移方法来测定。

参考文献

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(10)Stevens，R.C.：用于结构生物学的高通量蛋白生产方法的设计(Design of High-Throughput Methods of Protein Production forStructural Biology)，Structure.2000Sep 15；8(9)：R177-85.

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(20)Pierce：两种可硫解的、异源双功能的胺-和巯基-反应性交联试剂(Two Thiol Cleavable，Heterobifunctional，Amine-andSulfhydryl-Reactive Crosslinking Agents)，www.piercenet.com

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(22)Meisner，M.等：用于快速测量降钙素原的新的半定量固相免疫分析方法的临床经验(Clinical Experiences with a NewSemi-Quantitative Solid Phase Immunoassay for Rapid Measurement ofProcalcitonin)，Clin Chem Lab Med.2000 Oct；38(10)：989-95.

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序列表

<110>B.R.A.H.M.S有限公司

 

<120>用于检测分析物的方法

 

<130>SCT094858-50

 

<150>DE 10 2007 029 766.3

<151>2007-06-22

 

<150>DE 10 2007 037 068.9

<151>2007-08-04

 

<160>11

 

<170>PatentIn version 3.4

 

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<221>source

<223>/note＝″Description of artificial sequence：His-tag peptide PRG12″

 

<400>1

 

Arg Gly Ser His His His His His His Gly Gly Cys

1               5                   10

 

<210>2

<211>15

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<221>source

<223>/note＝″Description of artificial sequence：Oligo-Asp peptide

    D14C″

 

<400>2

Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Cys

1               5                   10                  15

 

<210>3

<211>12

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<221>source

<223>/note＝″Description of artificial sequence：Flag-tag peptide

     PDC12″

 

<400>3

 

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Cys

1               5                   10

 

<210>4

<211>15

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<221>source

<223>/note＝″Description of artificial sequence：ProtC-tag peptide

     PEG15″

 

<400>4

 

Glu Asp Gln Val Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys Gly Gly Cys

1               5                   10                  15

 

<210>5

<211>15

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<221>source

<223>/note＝″Description of artificial sequence：Oligo-Lys peptide

     K14C″

 

<400>5

 

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Cys

1               5                   10                  15

 

<210>6

<211>41

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<221>source

<223>/note＝″Description of artificial sequence：PPL41peptide″

 

<400>6

 

Pro Glu Val Pro Pro Trp Thr Gly Glu Val Ser Pro Ala Gln Arg Asp

1               5                   10                  15

Gly Gly Ala Leu Gly Gly Gly Gly Arg Gly Pro Trp Asp Ser Ser Asp

            20                  25                  30

Arg Ser Ala Leu Leu Lys Ser Lys Leu

        35                  40

 

<210>7

<211>44

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<221>source

<223>/note＝″Description of artificial sequence：PSW44peptide″

 

<400>7

 

Ser Ser Glu Glu His Leu Arg Gln Thr Arg Ser Glu Thr Met Arg Asn

1                5                  10                  15

Ser Val Lys Ser Ser Phe His Asp Pro Lys Leu Lys Gly Lys Pro Ser

            20                  25                  30

Arg Glu Arg Tyr Val Thr His Asn Arg Ala His Trp

        35                  40

 

<210>8

<211>33

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<221>source

<223>/note＝″Description of artificial sequence：PAY33peptide″

 

<400>8

 

Ala Thr Gln Leu Asp Gly Pro Ala Gly Ala Leu Leu Leu Arg Leu Val

1               5                   10                  15

Gln Leu Ala Gly Ala Pro Glu Pro Phe Glu Pro Ala Gln Pro Asp Ala

            20                  25                  30

Tyr

 

<210>9

<211>48

<212>PRT

<213>Artificial

 

<220>

<221>source

<223>/note＝″Description of artificial sequence：peptide 45-92″

 

<400>9

Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys

1               5                   10                  15

Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala

            20                  25                  30

Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val

        35                  40                  45

 

<210>10

<211>19

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<221>source

<223>/note＝″Description of artificial sequence：SPCD19peptide″

 

<400>10

 

Cys Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser

1               5                   10                  15

Ser Pro Asp

 

<210>11

<211>11

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<221>source

<223>/note＝″Description of artificial sequence：PSV11peptide″

 

<400>11

 

Cys Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val

1               5                   10

Claims (18)

1.用于检测来自生物学样品的分析物的方法，包括下列处理步骤：

a)制备固定化在固相上的可逆结合配偶体1，分析物结合剂通过与该分析物结合剂键合的可逆结合配偶体2与固相可逆键合，由此通过可逆结合配偶体1和2之间的结合将分析物结合剂固定化，

b)加入生物学样品，和在生物学样品含有分析物的情况下，分析物与被可逆固定化的分析物结合剂结合，

c)分离生物学样品，

d)加入解离缓冲液，其解离可逆结合配偶体1和2之间的结合，由此任选保持分析物与分析物结合剂的结合，以及

e)分别在生物学样品含有分析物的情况下检测解离缓冲液中的分析物，和在生物学样品不包含分析物的情况下，确定分析物的不存在。

2.权利要求1的方法，其中生物学流体是未处理的全血样品。

3.权利要求1或2的方法，其中固定化的可逆结合配偶体1直接或利用载体蛋白固定化。

4.权利要求1到3任一项的方法，其中分析物结合剂与可逆结合配偶体2共价键合。

5.权利要求1到4任一项的方法，其中分析物结合剂是抗降钙素原抗体。

6.权利要求1到5任一项的方法，其中可逆结合配偶体1和2的结合对选自下列结合对之一：

a)带正电荷和负电荷的肽寡聚体，

b)Ca²⁺结合肽/蛋白，和当肽/蛋白键合有Ca²⁺时，所述肽/蛋白以高亲和性结合的抗体，

c)寡聚组氨酸(例如6His)和Ni-NTA，

d)生物素和亲和素或链亲和素或中性链亲和素。

7.权利要求1到6任一项的方法，其中Ca²⁺结合肽/蛋白是FLAG肽，和抗体是M1抗体，或Ca²⁺结合肽/蛋白是蛋白C肽，和抗体是HPC4抗体。

8.权利要求1到7任一项的方法，其中分析物结合剂是被标记的，并且即使在加入解离缓冲液后，它仍保持被用于检测分析物的标记物标记。

9.权利要求1到8任一项的方法，其中解离缓冲液含有另一种检测所需的被标记的成分。

10.权利要求10的方法，其中另一种检测所需的被标记的成分是用于进行夹心免疫分析的第二种分析物结合剂。

11.权利要求1到10任一项的方法，其中被标记的分析物的检测使用TRACE技术，通过免疫分析来进行。

12.权利要求1到11任一项的方法，其中被标记的分析物的检测利用免疫层析法来进行。

13.权利要求1到12任一项的方法，其中使用的生物样品是未稀释的，并且其体积使得固相的包被部分与生物学样品完全接触。

14.权利要求1到13任一项的方法，其中加入样品直到检测的时间不超过30分钟，并且所述方法能被当作快速测试方法。

15.用于执行权利要求1到14的方法的装置，包含：

a)其中固定化有可逆结合配偶体1的固相，分析物结合剂通过与该分析物结合剂键合的可逆结合配偶体2与所述固相可逆键合，

b)其中可逆结合配偶体1和2之间的结合通过加入解离缓冲液进行解离，但是当加入解离缓冲液时，分析物与分析物结合剂的结合任选得以保持。

16.用于执行权利要求1到14任一项的方法的试剂盒，包含：

a)固定化有可逆结合配偶体1的固相，

b)含有与可逆结合配偶体2键合的分析物结合剂的复合物，其中通过将可逆结合配偶体1和2结合到固相上，该复合物任选能够已经以固定化的形式存在，

c)解离缓冲液，其解离可逆结合配偶体1和2之间的结合，但是其中分析物与分析物结合剂之间的结合任选得以保持。

17.权利要求16的试剂盒，其中分析物结合剂是抗PCT抗体。

18.权利要求16或17的试剂盒，其中可逆结合配偶体1和2的结合对选自下列结合对之一：

a)带正电荷和负电荷的肽寡聚体，

b)Ca²⁺结合肽/蛋白，和当肽/蛋白键合有Ca²⁺时，所述肽/蛋白以高亲和性结合的抗体，

c)寡聚组氨酸(例如6His)和Ni-NTA，

d)生物素和亲和素或链亲和素或中性链亲和素。

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