CN108196062B - 一种竞争性的化学发光法测定游离艾塞那肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种竞争性的化学发光法测定游离艾塞那肽的方法，包括：将抗艾塞那肽的抗体包被在多孔微孔板上形成固相的抗体；在包被后的多孔微孔板的各孔中分别加入不同浓度的艾塞那肽标准品及待测样品，孵育一段时间；在多孔微孔板的各孔中再分别加入生物素标记的艾塞那肽继续孵育一段时间，洗涤；在多孔微孔板的各孔中再分别加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，孵育一段时间，洗涤；在多孔微孔板的各孔中再分别加入能够被辣根过氧化物酶催化的化学发光底物，反应一段时间后检测化学发光信号值；将艾塞那肽标准品的浓度与对应的化学发光信号值拟合出标准曲线，将待测样品的化学发光信号值插入所述标准曲线，计算出待测样品的浓度。

Description

一种竞争性的化学发光法测定游离艾塞那肽的方法
技术领域
本发明属于生物分析、药学分析和免疫检测领域，具体涉及一种竞争性的化学发光法测定游离艾塞那肽的方法。
背景技术
艾塞那肽(Exendin-4)是一种GLP-1类似物，它的发现源于对一种毒蜥蜴的研究，该动物每年进食4次，断食期间，胰腺关闭，停止分泌胰岛素，与该物质有关。后来的研究表明Exendin-4的作用几乎与GLP-1的作用完全一致，Exendin-4也可通过GLP-1受体产生作用，又称为GLP-1受体激动剂，但对受体的亲和力还要强于GLP-1。并且Exendin-4的N端不易被DPP-IV降解，具有更长的血浆半衰期，具有良好的临床应用价值并给2型糖尿病的治疗提供了思路。许多药企纷纷开展研制Exendin-4相关生物治疗性产品用于临床II型糖尿病的治疗，并不断改进相关产品的研发。因此，对于Exendin-4的检测与分析方法的改进与提高，对于不断改进和更新中Exendin的各种形式的检测尤为重要。尤其是一个能通用的，高灵敏的检测方法能为Exendin相关的药学研究及应用中的检测和生物分析提供便利。
Exendin-4是一个由39个氨基酸组成的多肽类物质，一般以人工合成为主。因其在2型糖尿病治疗中具有很强的优势，引起企业及科研院所的竞相开发。因而，针对艾塞那肽的检测方法也引起广大科研工作者的不断探索与更新，目前已经形成了多种多样的基于艾塞那肽的检测方法。如毛细管电泳法【宫菲菲，张玉芬，孙雯，等.毛细管区带电泳法测定艾塞那肽纯度及在稳定性研究中的应用】,高效液相色谱法【吴宏斌，王永智，饶玲，等.高效液相色谱法测定重组艾塞那肽纯度的方法验证研究】，串联质谱法【盖云云，孙渝，李静，等.TSQ Vantage质谱仪测定两种多肽类药物戈舍瑞林和艾塞那肽】及ELISA法。
不同的艾塞那肽检测方法可以应用到不同用途的检测中。像毛细管电泳及高效液相法用于工艺方面的纯度鉴定比较具有实际价值，因为其检测的下限浓度比较高，不太适用于浓度方面的定量检测；液质联用法在小分子化合物检测方面占据优势，但在分子量偏大，尤其是大于2000道尔顿的分子，其不具有基于抗原抗体即ELISA法的检测优势，尤其是对于蛋白、多肽类分子。虽然现在有公司推出TSQ等对蛋白、多肽类检测进行优化升级的仪器系统，但适用性以及普及性还不是很强，且这样的仪器价格非常昂贵，检测灵敏度仍然受限，像针对含39个肽的艾塞那肽来说还是有其局限性，其对血液的样品前处理过程复杂。传统的常见的夹心ELISA法在多肽检测方面仍有其优势，但在检测灵敏度等方面需要进一步升级。
灵敏度问题是许多检测方法关心的一个关键问题，因为灵敏度过低，基质中本来存在的分析物却不被检出，导致想获取的分析物数据信息难以获得；另，对于ELISA法来讲，灵敏度过低，可能样品就不能稀释或必须稀释很小的倍数下被检测，必然耗费样品的体积量偏大，对于宝贵的临床资源来说，也是一种变相浪费。灵敏度高的检测方法，意味着样品可以更多倍数的稀释，更少的样本体积的消耗。高灵敏度的方法对于基于分析物的检测项目适用范围要广于低灵敏度的基于分析物的检测项目。因为即使低灵敏度的方法就可以测的含目标分析物浓度高的样品可以稀释后放在高灵敏度的方法中测，而分析物含量低的样品却不可以放在低灵敏度的方法中去测。这涉及到方法的普适性问题。
发明内容
为了有利于艾塞那肽相关产品在临床前及临床上血液等基质中被有效检测，更灵敏地捕捉其信号，为血药中相关药代动力学分析提供更好的支持手段，本发明在传统的ELISA法检测手段上进行了创新。基于抗原抗体反应的基础上，运用竞争性方式结合化学发光的手段，进行艾塞那肽的检测。
本发明提供一种测定游离艾塞那肽的方法，其包括以下步骤：
(1)将抗艾塞那肽的抗体包被在多孔微孔板上形成固相的抗体；
(2)在包被后的多孔微孔板的各孔中分别加入不同浓度的艾塞那肽标准品及待测样品，孵育一段时间；
(3)在多孔微孔板的各孔中再分别加入生物素标记的艾塞那肽继续孵育一段时间，洗涤；
(4)在多孔微孔板的各孔中再分别加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，孵育一段时间，洗涤；
(5)在多孔微孔板的各孔中再分别加入能够被辣根过氧化物酶催化的化学发光底物，反应一段时间后检测化学发光信号值；
(6)将艾塞那肽标准品的浓度与对应的化学发光信号值拟合出标准曲线，将待测样品的化学发光信号值插入所述标准曲线，计算出待测样品的浓度。
本发明基于抗原抗体反应的原理，与同类方法相比，创新性地基于抗原抗体反应的，及游离抗原与标记抗原，游离融合蛋白与标记蛋白的竞争性原理，结合化学发光信号放大的技术原理，开发了针对艾塞那肽的一种新的更灵敏的竞争性化学发光免疫检测方法。竞争的方法有利于半抗原基于抗原抗体反应的检测，让游离抗原优先进入反应体系的非平衡式的竞争更加有利于低浓度游离艾塞那肽与生物素标记的竞争，促进灵敏度，另化学发光信号比普通的光吸收信号对微小浓度差异的区分更加敏感，有利于促进灵敏度。
较佳地，步骤(1)包括：
使用碳酸盐缓冲液稀释抗艾塞那肽的抗体溶液到1μg/mL，以每孔100μL以下加入到多孔微孔板中，2～8℃孵育12～24小时，优选地，所述抗艾塞那肽的抗体为鼠抗艾塞那肽单抗；使用含0.05％吐温-20的PBS溶液洗板；
加入含3％～5％脱脂牛奶的PBS溶液封闭，再使用含0.05％吐温-20的PBS溶液洗板。
较佳地，步骤(2)中，所述不同浓度的艾塞那肽标准品包括浓度范围9000pg/mL～4.1pg/mL内的梯度稀释的5个以上艾塞那肽标准品，优选地，浓度梯度分别为9000pg/mL，3000pg/mL，1000pg/mL，333.3pg/mL，111.1pg/mL，37.0pg/mL，12.3pg/mL，4.1pg/mL。
较佳地，步骤(2)中，所述艾塞那肽标准品和/或待测样品的基质为缓冲液、细胞培养液、血清中的任意一种。即，待测样品可为待测的细胞培养液中、组织提取液中或血清中的样品。血清中的样品可进行MRD(最小稀释倍数)为100倍的稀释，稀释用PBST稀释。步骤(2)中，孵育时间可为30～45分钟。
较佳地，步骤(3)中，加入1:(45000～55000)倍用PBS稀释的生物素标记的艾塞那肽，37℃孵育1～2小时。本发明可采用非平衡式的竞争法，在加生物素标记的艾塞那肽之前，待测样品和标准品优先孵育30～45分钟，然后加入生物素孵育与样品、标准品一起同步继续孵育1～2小时。
较佳地，步骤(4)中，加入1:(20000～25000)倍用PBS稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，37℃孵育45分钟～1小时。
较佳地，步骤(5)中，所述化学发光底物为SuperSignalTM ELISA FemtoSubstrate。
较佳地，步骤(5)中，反应1～2分钟后，在425nm的波长下读板以检测化学发光信号值。
较佳地，步骤(6)中，以五参数方程拟合标准曲线。
本发明中，待测样品可以含有游离的艾塞那肽和/或重组的艾塞那肽。
本发明具有以下优点：
1)提高灵敏度，拥有更低的定量下限；
2)针对于艾塞那肽这样的短肽半抗原用更加敏感的检测方法；
3)促进检测方法在血液样品检测中的普遍适用性；
4)灵敏度提高，增加样品的稀释倍数，可以节约样本量；
5)不仅适用于测定游离的艾塞那肽也适用于重组的艾塞那肽。
附图说明
图1为本发明一个示例的标准曲线图；
图2为动物个体PK样品检测后的个体趋势比较。
具体实施方式
以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
本发明一实施方式中，实现原理和方式为：将抗艾塞那肽的抗体(例如单抗)包被在多孔微孔ELISA板上形成固相的抗体，在包被封闭后的微孔板上先加入梯度稀释的游离的艾塞那肽标准品及待测样品孵育一段时间后再加入生物素标记的艾塞那肽继续孵育一段时间，孵育完成洗涤后然后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)反应一段时间，洗涤完成后加入一种可被HRP催化的高灵敏的化学发光底物，该底物产生的信号可以在一定波长(例如425nm波长)下被酶标仪检测并以数字形式报告出来。在样品孵育的反应体系里，生物素标记的艾塞那肽与样品及标准品中的游离艾塞那肽形成一种非平衡性的竞争关系，从而最终样品中游离的艾塞那肽的量与最终的化学发光的量形成反向关系。根据标准品中艾塞那肽与化学发光信号的反向关系，用一定的数学模型拟合出标准曲线然后去定量样品中游离的艾塞那肽。
以下，作为示例，具体说明本发明的方法。
首先，将抗艾塞那肽的抗体包被在多孔微孔板上形成固相的抗体。本发明中，优选只使用一种抗体，无需使用二抗包被。
多孔微孔板可为黑色底部非透明的化学发光ELISA板，其孔数可为96、384等。抗艾塞那肽的抗体可为鼠抗艾塞那肽单抗等。可以使用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释鼠抗艾塞那肽单抗溶液到1μg/mL。将稀释后的抗艾塞那肽的抗体加入到多孔微孔板的各孔中。加入量可为每孔100μL以下。加入后，可于2～8℃孵育12～24小时。
然后，可进行洗板、封闭。洗板所用溶液可为PBST，即PBS缓冲液+0.05％吐温-20(Tween-20)。洗涤次数可为3次以上。洗涤溶液的加入量可为300～350uL/孔。洗板后，可加入含3～5％脱脂牛奶的PBS缓冲液进行封闭。其加入量可为200～250uL/孔。加入封闭物后，可于37℃孵育1～2h。封闭完成后，洗涤，例如使用PBST洗涤3次，每次300uL/孔，拍干备用。
然后，在包被封闭后的多孔微孔板的各孔中分别加入不同浓度的艾塞那肽标准品及待测样品，孵育一段时间。
不同浓度的艾塞那肽标准品可为将游离的艾塞那肽梯度稀释而得。游离的艾塞那肽可为化学合成或基因工程重组。稀释液可采用含Tween-20为0.05％的PBST。艾塞那肽标准品的浓度范围可为9000pg/mL～4.1pg/mL。一个示例中，进行3倍稀释，浓度梯度分别为9000pg/mL，3000pg/mL，1000pg/mL，333.3pg/mL，111.1pg/mL，37.0pg/mL，12.3pg/mL，4.1pg/mL。梯度稀释的游离的艾塞那肽，将作为定量检测方法的标准曲线。本发明中，标准品的浓度范围可较宽，实际操作中，特别是血清稀释，易于稀释到标曲范围内，实用性强。
待测样品的基质为缓冲液、细胞培养液、血清等。检测前，可将待测样品稀释，例如使用PBST稀释。本发明灵敏度高，因此可以增加待测样品的稀释倍数，例如稀释至100倍以上。节约样本量。
将配制好的艾塞那肽标准品、以及待测样品分别加入包被封闭后的多孔微孔板的各孔中，进行孵育。配制好的艾塞那肽标准品以及待测样品的加入量可为100uL/孔。待测样品的数量可为一个以上，即，可以一批检测多个待测样品。孵育温度可为37℃。孵育时间可为30～45分钟。
标准品和待测样品孵育后，不洗，直接在上述多孔微孔板的各孔中加入生物素(biotin)标记的艾塞那肽。其加入形式可为用PBS稀释至浓度为0.75～1ng/mL的溶液。混匀后继续37℃孵育1～2小时。本发明中，采用非平衡式的竞争方式，即游离的艾塞那肽和生物素标记的艾塞那肽是竞争关系，他们共同竞争板子上的抗体，但优先让标准品和样品中的游离艾塞那肽优先与板子上包被的抗体先结合一段时间再和生物素标记的艾塞那肽竞争，有利于反应。
孵育完成后，洗涤，例如用PBST洗涤3遍。然后加入Sreptavadin-HRP，进行孵育。Sreptavadin-HRP的加入形式可为用PBS以1：(20000～25000)稀释的溶液。孵育温度可为37℃。孵育时间可为1～2小时。
孵育完成后，洗涤，例如用PBST洗涤4遍。然后加入可被HRP催化的高灵敏的化学发光底物，反应一段时间后检测化学发光信号值。一个示例中，所述化学发光底物为SuperSignalTM ELISA Femto Substrate(Thermo，Cat#:37074)。该化学发光底物有A液和B液两种组分，1:1混合后加入100-150ul每孔即可。其中A液是HRP适应的缓冲液，B液里面含有普通的化学发光底物但又有一种化学发光增强剂，可以增强化学发光信号，有利于提高方法的分辨率。反应时间可为1～2分钟。检测化学发光信号值的方法可为利用可测425nm波长的酶标仪在425nm波长下读板。可测425nm波长的酶标仪例如可采用Molecular Device全波长酶标仪或其它可测425nm波长的酶标仪。
根据标准品的浓度及其对应的化学发光信号值制作标准曲线。一个示例中，以五参数方程将标准曲线进行拟合。五参数方程是指y＝(A-D)/((1+(x/C)^B)^G)+D，y是化学发光信号，x是艾塞那肽浓度，A是下端渐近线估值，D为下端渐近线估计值，B是斜率，C是IC50值，G为不对称因子。采用五参数方程，与一般的四参数方程相比多了一个不对称因子，更有利于信号低的浓度点的拟合，对于此方法不仅基于竞争法及化学发光法增加灵敏度，而且这样的拟合方式有利于拓宽检测上限的范围，有利于在实际操作中样品更容易有把握地稀释到定量范围中。
然后将待测样品的化学发光信号值插入该五参数方程计算出对应样品的浓度测量结果。
本发明可以提高灵敏度，拥有更低的定量下限，例如其定量下限可为4.1pg/mL。而且，本发明中，标准曲线每次都能稳健拟合，不同批之间差异都在精密度和准确度要求的范围内，均不会超过20％的偏差。本发明中，回收率可在80％～120％范围内。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
主要材料和设备：
Molecular Device全波长酶标仪；
黑色底部非透明的化学发光ELISA板(Nunc，Cat#437111)。
生物和化学试剂：
PH9.6的碳酸盐缓冲液
PH7.4的磷酸盐缓冲液
Mouse mAb to Exendin(Abcam，Cat#：ab23407)
Streptavidin-HRP(21130，Thermo)
生物素偶联的艾塞那肽(Biotin-Exendin 4，0.1mg/mL)
游离的艾塞那肽(Exendin-4)
SuperSignalTM ELISA Femto Substrate(Thermo，Cat#:37074)。
方法步骤：
1)使用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释鼠抗艾塞那肽单抗(Exendin-4 1mg/mL)溶液到1μg/mL，100μL每孔加入到96孔微孔板中，2-8℃孵育过夜；
2)甩掉板中液体，使用PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗涤3次，300uL/孔，震荡30sec。拍干，加入含5％脱脂牛奶的PBS缓冲液，200uL/孔，37℃，孵育2h；
3)封闭完成后，使用PBST洗涤3次，每次300uL/孔，拍干备用；
4)使用含Tween为0.05％的PBST作为稀释液，将游离的艾塞那肽稀释在PBST中，其浓度梯度分别为9000pg/mL，3000pg/mL，1000pg/mL，333.3pg/mL，111.1pg/mL，37.0pg/mL，12.3pg/mL，4.1pg/mL，该系列梯度稀释的游离的艾塞那肽，将作为定量检测方法的标准曲线，其范围为9000pg/mL-4.1pg/mL；将配制好的游离的艾塞那肽及待测样品加入96孔微孔板37℃孵育，100uL/孔；
5)用PBS稀释biotin偶联的艾塞那肽到1:50000倍，在游离的艾塞那肽孵育0.5小时后，立即将这稀释的biotin偶联的艾塞那肽加入所有板孔中，混匀后继续37℃孵育1.5小时；
6)孵育完成后，用PBST洗涤3遍，加入1:20000倍用PBS稀释的Sreptavadin-HRP，37℃孵育1小时；
7)孵育完成后，用PBST洗涤4遍，加入混合好的SuperSignalTM ELISA FemtoSubstrate化学发光底物，室温显色1-2分钟后，在425nm的波长下读板；
8)以五参数方程将标曲进行拟合，然后将样品的化学发光信号值插入该五参数方程计算出对应样品的浓度测量结果；
9)酶标仪参数设定
Figure BDA0001516248160000071
。
实施例2
标准曲线：由于本发明的方法运用了竞争性的反应方式，所以浓度与信号值呈反向关系，标曲的性状也呈现反S型，典型的曲线见图1。验证不同分析批次的标准曲线，并进行了比较(见表1)，标准曲线每次都能稳健拟合，不同批之间差异都在精密度和准确度要求的范围内，均不会超过20％的偏差；
表1不同分析批次的标准曲线
Figure BDA0001516248160000081
。
实施例3
回收率比较：将游离的艾塞那肽分别加入到PBS、细胞培养液，浓度为8000，4000，300，100，10，5pg/mL，参照实施例1的方法测量其回收率，回收率均在80％～120％范围内(见表2)；
表2艾塞那肽在PBS、细胞培养液中的回收率
Figure BDA0001516248160000082
。
实施例4
回收率比较：将游离的艾塞那肽分别加入到人血清中，浓度为80000，40000，3000，1000，100，50pg/mL，然后用PBST，按照MRD(最小稀释倍数)稀释10倍后，参照实施例1的方法测量其回收率，回收率均在80％～120％范围内(见表3)；
表3艾塞那肽在人血清中的回收率
Figure BDA0001516248160000083
。
实施例5
在实际药代研究中的运用效果：在灵长类动物身上皮下给予艾塞那肽注射液(0.005mg/kg)后检测血清里的艾塞那肽在不同时间点的浓度，个体间浓度差异小及趋势一致(参见图2)，说明本发明的方法适用，其结果如表4所示：
表4艾塞那肽在不同时间点的浓度以及个体间浓度差异
Figure BDA0001516248160000091
。
本发明有效地考虑了短肽类物质在肽短，表位少等特征，综合利用了标记抗原与游离抗原竞争抗体的反应特征，并通过摸索在艾塞那肽检测领域创造性地使用了非平衡竞争的模式，有效结合化学发光增强信号的模式，进一步拓展了艾塞那肽的检测下限，而且该方法经过验证可以适用于缓冲液(Buffer)，细胞培养液，血清等多种基质类型，为艾塞那肽应用领域的检测提供了新的更为灵敏有效的方法。

Claims (9)

1.一种测定游离艾塞那肽的方法，其特征在于，所述方法中生物素标记的艾塞那肽与待测样品及标准品中的游离艾塞那肽形成非平衡性的竞争关系，其中待测样品及标准品中的游离艾塞那肽优先进入反应体系的非平衡竞争；所述方法包括以下步骤：
（1）将抗艾塞那肽的抗体包被在多孔微孔板上形成固相的抗体；
（2）在包被后的多孔微孔板的各孔中分别加入不同浓度的艾塞那肽标准品及待测样品，孵育30～45分钟；
（3）在多孔微孔板的各孔中再分别加入生物素标记的艾塞那肽继续孵育一段时间，洗涤；
（4）在多孔微孔板的各孔中再分别加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，孵育一段时间，洗涤；
（5）在多孔微孔板的各孔中再分别加入能够被辣根过氧化物酶催化的化学发光底物，反应一段时间后检测化学发光信号值；所述化学发光底物为SuperSignalTM ELISA FemtoSubstrate；
（6）将艾塞那肽标准品的浓度与对应的化学发光信号值以五参数方程拟合出标准曲线，将待测样品的化学发光信号值插入所述标准曲线，计算出待测样品的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）包括：
使用碳酸盐缓冲液稀释抗艾塞那肽的抗体溶液到1µg/mL，以每孔100µL以下加入到多孔微孔板中，2～8℃孵育12～24小时；
使用含0.05% 吐温-20的PBS溶液洗板；
加入含3%～5%脱脂牛奶的PBS缓冲液封闭，再使用含0.05%吐温-20的PBS溶液洗板。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗艾塞那肽的抗体为鼠抗艾塞那肽单抗。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述不同浓度的艾塞那肽标准品包括浓度范围9000 pg/mL～4.1 pg/mL内的梯度稀释的5个以上艾塞那肽标准品。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述艾塞那肽标准品的浓度梯度分别为9000 pg/mL，3000 pg/mL，1000 pg/mL，333.3 pg/mL，111.1 pg/mL，37.0 pg/mL，12.3 pg/mL，4.1 pg/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述艾塞那肽标准品和/或待测样品的基质为缓冲液、细胞培养液、血清中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，加入1:（45000～55000）倍用PBS稀释的生物素标记的艾塞那肽，37℃孵育1～2小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，加入1: （20000～25000）倍用PBS稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，37℃孵育45分钟～1小时。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，反应1～2分钟后，在425nm的波长下读板以检测化学发光信号值。
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