CN104569419B - 一种检测人血液glp-1总含量的化学发光免疫分析法试剂盒 - Google Patents

一种检测人血液glp-1总含量的化学发光免疫分析法试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN104569419B
CN104569419B CN201410490637.3A CN201410490637A CN104569419B CN 104569419 B CN104569419 B CN 104569419B CN 201410490637 A CN201410490637 A CN 201410490637A CN 104569419 B CN104569419 B CN 104569419B
Authority
CN
China
Prior art keywords
glp
test kit
peptide
kinds
mentioned
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410490637.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104569419A (zh
Inventor
范列英
刘颖冰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201410490637.3A priority Critical patent/CN104569419B/zh
Publication of CN104569419A publication Critical patent/CN104569419A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104569419B publication Critical patent/CN104569419B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/605—Glucagons

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种检测人血液GLP-1总含量的化学发光免疫分析法试剂盒，包括有生物活性的GLP-1(7-37)、GLP-1 (7-36) NH2肽和无生物活性的GLP-1(9-37)和GLP-1 (9-36) NH2肽、及上述四种肽链BSA融合蛋白；能够识别上述四种GLP-1的单克隆抗体、多克隆抗体和酶标记单克隆或多克隆抗体；包被有抗GLP-1 BSA融合蛋白的抗体、或者能够识别上述四种GLP-1的单克隆抗体、或者多克隆抗体的载体；GLP-1校准品；化学发光底物和洗涤液。本发明还提供了上述试剂盒的制备方法。本发明的试剂盒具有高特异性、高灵敏度、高精确性、简便快速等优点，并且使用成本低，更易推广应用。

Description

一种检测人血液GLP-1总含量的化学发光免疫分析法试剂盒
技术领域：
本发明属于免疫分析及生物医学领域，尤其涉及一种检测试剂盒，特别是一种采用化学发光免疫分析法检测血清或血浆胰高血糖素样肽-1浓度的试剂盒。
背景技术：
2010年的统计资料显示中国现有成人糖尿病患者达9240万(发病率10％)，更令人担忧的是还有巨大数量的成人糖耐量受损者(Impairedglucosetolerance，IGT)。如何更有效地预防糖尿病，特别是2型糖尿病(type2diabetetsmellitus，T2DM)发生、有效地控制病情发展、减少并发症的发生，已经成为全民族共同关注的焦点之一。
胰岛α细胞分泌胰高血糖素、β细胞分泌胰岛素，两者作用互为相反，在维持机体血糖浓度中起至关重要作用。在胰岛α细胞中，胰高血糖素原基因的主要表达产物是胰高血糖素，而在肠粘膜的L细胞中，胰高血糖素原基因表达的产物经前激素转换酶剪切，其中羧基端的段肽链即为胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)。GLP-1有2种生物活性形式，分别为GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2，GLP-1约80％的循环活性来自GLP-1(7-36)。生物活性GLP-1在体内被二肽酶(DPP-IV)、中性肽链内切酶(NEP)降解成无活性的GLP-1(9-37)和GLP-1(9-36)NH2，半衰期极短仅2min。
研究已证实，GLP-1以葡萄糖浓度依赖性方式促进胰岛β细胞分泌胰岛素，并减少胰岛胰高血糖素分泌从而降低血糖。正常人在进餐后，GLP-1开始分泌，进而促进胰岛素分泌，以减少餐后血糖的波动。但对于T2DM患者，其“肠促胰素效应”受损，主要表现为进餐后GLP-1浓度升高幅度较正常人有所减小，但其促进胰岛素分泌以及降血糖的作用并无明显受损。动物实验和临床研究已经证明GLP-1可通过多种机制明显地改善T2DM动物模型或患者的血糖情况，其中促进胰岛β细胞的再生和修复，增加胰岛β细胞数量的作用尤为显著，这为T2DM的治疗提供了一个非常好的前景。同时GLP-1的这种葡萄糖浓度依赖性降糖特性是其临床应用安全性的基础与保障，从而免除了人们对现有糖尿病治疗药物及方案可能造成患者严重低血糖的担心。此外，动物和临床研究显示，一些治疗措施，如胃转流术治疗非肥胖型糖尿病、胃部分切除术治疗肥胖症以及中医药治疗糖尿病等，均能通过调节循环GLP-1水平来达达到治疗目的，同时通过监测治疗前后外周血中GLP-1水平来指导、调整治疗方案。
近年来，多个制药企业，如美国的礼来公司、默克公司、百时美施贵宝公司，瑞士罗氏制药等均在研制GLP-1相关药物，有的在进行临床试验，有的已经完成了临床试验进入市场，表明GLP-1在不久的将来必定成为IGT、T2DM的常用治疗药物之一。
在GLP-1作为新的治疗方法应用于临床之前，必须完成一个重要的基础工作，那就是要建立快速、准确的测定方法判断患者体内是否真正存在GLP-1分泌不足！准确地监测GLP-1含量变化，对于T2DM的分型诊断、个性化治疗以及不同个体用药剂量等均是必不可少的前提，此外检测方法的建立也是进一步研究GLP-1在IGT、T2DM、代谢综合征等GLP-1缺乏相关性疾病的发病机制及早期预防研究的实验基础。目前采用化学发光免疫分析法定量检测患者血液中总GLP-1含量的试剂盒尚未见报道。
发明内容：
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种检测人血液GLP-1总含量的化学发光免疫分析法试剂盒，所述的这种试剂盒解决了现有技术中无法定量检测血液中总GLP-1含量的技术问题。
本发明一种检测人血液GLP-1总含量的化学发光免疫分析法试剂盒，包括有生物活性的GLP-1(7-37)NH2肽、有生物活性的GLP-1(7-36)NH2肽、无生物活性的GLP-1(9-37)NH2肽、无生物活性的GLP-1(9-36)NH2肽；以及上述四种GLP-1肽链与BSA融合的蛋白；以及能够识别上述四种GLP-1的单克隆抗体、或者多克隆抗体、或者酶标记的单克隆抗体、或者酶标记的多克隆抗体；以及包被有抗上述四种GLP-1肽链与BSA融合的蛋白的抗体、或者包被有能够识别上述四种GLP-1的单克隆抗体、或者多克隆抗体的载体；GLP-1校准品；化学发光底物和洗涤液。
进一步的，所述的有生物活性的GLP-1(7-37)NH2肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，有生物活性的GLP-1(7-36)NH2肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，无生物活性的GLP-1(9-37)NH2肽的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，无生物活性的GLP-1(9-36)NH2肽的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。
进一步的，所述的单克隆抗体是由保藏号为CCTCCNO：C2014108的杂交瘤细胞株所分泌的。
进一步的，所述载体为聚苯乙烯微孔板、聚苯乙烯珠、或聚苯乙烯管、或磁性颗粒。
进一步的，所述的化学发光底物为缓冲液，每升缓冲液中含有24gTris、160gNaCl、4gKC1、15mLHCl、lmlProclin300和200ml的3-(2'-螺旋金刚烷)-4-曱氧基-4-(3'-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷，余量为双蒸水。
进一步的，所述的洗涤液为1，2-二氧乙烷类衍生物、或者1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2_二氧乙烷、或者3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3'-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、或者CSPD、或者精制的二磷酸胞苷(CDP-Star)。
进一步的，所述的酶标记的酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
本发明还提供了上述的试剂盒的制备方法，包括一个制备包被有识别四种GLP-1的单克隆抗体、或者包被有识别四种GLP-1的多克隆抗体的载体的步骤，一个用碱性磷酸酶标记识别四种GLP-1的单克隆抗体或者识别四种GLP-1的多克隆抗体的步骤；还包括一个以无生物活性的GLP-1(9-36)NH2肽与BSA融合的蛋白纯品配制校准品步骤，一个配制洗涤液的步骤，一个配制化学发光底物的步骤，以及分装上述各组份并组装为成品的步骤。
进一步的，在一个制备包被有识别四种GLP-1的单克隆抗体、或者包被有识别四种GLP-1的多克隆抗体的载体的步骤，首先用0.05M、pH为7.2的磷酸盐緩冲液配制成所需浓度的包被液，然后将识别四种GLP-1的单克隆抗体、或者识别四种GLP-1的多克隆抗体进行包被，在包被的过程中采用生理盐水洗涤2-5次；最后使用pH值为7.0～7.5的磷酸盐封闭液进行封闭。
进一步的，在一个用碱性磷酸酶标记识别四种GLP-1的单克隆抗体或者识别四种GLP-1的多克隆抗体的步骤中，所述的碱性磷酸酶标记是采用戊二醛法进行标记。
进一步的，所述的碱性磷酸酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
本发明一种采用化学发光免疫分析的方法测定血液或者血浆中GLP-1总含量的方法，包括如下步骤：
1)自冰箱中取出权利要求1所述的试剂盒，室温平衡10～20分钟；
2)取出包被板条，插入板架上；
3)加样，每孔加样100ul；
4)用微量震荡器充分振荡混匀，用封板膜封板30～40℃水浴20～50分钟；
5)用稀释后的洗涤液洗板3～7次，最后在干净的吸水纸上扣干；
6)加酶标记GLP-1多克隆抗体，每孔100ul；
7)重复4)至5)；
8)加化学发光底物工作液100ul；
9)用微量震荡器充分振荡混合均匀，室温避光反应20～50分钟；
10)在加化学发光底物液后的第30-90分钟内测量，在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度，测量时间0.2-1.0秒/孔，以校准品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标绘出标准曲线，以各待测样本RLU值在标准曲线上查出该样本GLP-1的浓度。
本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCCNO：C2014108。
本发明的一种杂交瘤细胞株，其分类命名为：杂交瘤细胞株Clone2D11-2，该细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)中，中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武汉大学(武汉市武昌珞珈山)，保藏日期为2014年7月1日，保藏号为CCTCCNO：C2014108。
本发明的试剂盒可以准确地定量检测出人血液中包括有生物活性GLP-1(7-36肽和7-37肽)和无生物活性GLP-1(9-36肽和9-37肽)在内的总GLP-1含量。它具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。
本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，适用于小型化学发光分析仪，也可以适用于开放式自动化化学发光分析仪，从而适合广大的大、中、小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。
酶标记的GLP-1抗体与载体上包被的GLP-1抗体和被测样品的GLP-1抗原形成“双抗体夹心”结构，因此本发明采用的“双抗体夹心一步法”反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。
本发明的试剂盒应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，因而具有与透射(散射)比浊免疫分析法同等的特异性，而灵敏度大大提高，比现今的透射(散射)比浊免疫分析法分析灵敏度提高约10倍，可为临床诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。
在本发明的研究过程中，首先对所用的原材料进行了筛选实验和质量鉴定，包括标记抗体与包被抗体的活性、载体(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和变异大小、ALP的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等。然后对包被方法进行了研究，用不同的包被緩冲液和保护液进行实验，选择出最适合的包被緩沖液和保护液，通过抗体不同包被浓度实验找到最佳的浓度条件。对于ALP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对不同的酶稀释液进行了长期的考察实验，配制出了能够使酶标记物长期保持活性稳定的稀释液。
本发明与已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明将化学发光技术与抗原抗体免疫分析学技术有效地结合，提供了一种高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速地检测血液中GLP-1总含量的化学发光免疫分析定量测定试剂盒，本发明的试剂盒可应用于开放式的化学发光测量仪，使用成本低，更易推广应用。
附图说明：
图1是GLP-1总含量化学发光免疫学检测标准曲线。
图2是正常体检者血清总GLP-1含量分布。
具体实施方式：
实施例1设计和合成人源性生物活性和无活性GLP-1多肽
按照NCBI官方网站上发布的人生物活性、无活性GLP-1氨基酸序列，进行人工生
按照NCBI官方网站上发布的人生物活性、无活性GLP-1氨基酸序列，进行人工生物合成、纯化。
实施例2GLP-1多肽及其单克隆及多克隆抗体特征
制备生物合成GLP-1的7-37、7-36、9-37、9-36多肽与BSA融合蛋白。采用GLP-1(9-36)NH2融合蛋白，用加强免疫法免疫家兔制备多克隆抗体，并标记辣根过氧化物酶。采用杂交瘤细胞融合技术，制备GLP-1(9-36)NH2单克隆抗体。
表1鉴定兔抗GLP-1(9-36)NH2融合蛋白多克隆抗体与GLP-1的7-37、7-36、9-37、9-36多肽BSA融合蛋白抗原的反应性(反应滴度)，抗血清经三倍系列稀释后与多肽-BSA抗原蛋白反应，并经二抗-HRP信号放大反应后，在96孔ELISA板上显示出不同中的吸光度(OD)和梯度曲线，以证实所制备的兔抗GLP-1(9-36)NH2多克隆抗体能够识别GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)、GLP-1(9-37)、GLP-1(9-36)抗原肽，并有较高的效价。
以GLP-1(9-36)NH2为抗原制备的单克隆抗体，再采用GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)、GLP-1(9-37)抗原肽分别同时筛选。表2显示所筛选到的单克隆抗体(Clone2D11-2)，与各GLP-1抗原肽融合蛋白反应曲线，表明所筛选到的鼠抗GLP-1(9-36)NH2融合蛋白单克隆抗体同样识别其它GLP-1多肽BSA融合蛋白，效价相近。将该杂交瘤细胞株(Clone2D11-2)进行克隆扩大培养后，送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCCNO：C2014108；
在分析GLP-1多克隆抗体与抗原反应特性实验中，通过棋盘法初步筛选确定GLP-1的四个抗原肽融合蛋白均以250nmol/L浓度、100ul/孔包被ELISA板，室温过夜，反应板封闭后，将不同稀释度抗血清100ul/well加入反应孔内，室温1小时后洗涤三次，再加100ul/well以1:2000稀释HRP偶联的羊抗兔IgG，室温1小时后再洗涤四次，加HRP底物溶液(TMB和过氧化氢)并显色10分钟，读取OD492/640nm值。GLP-1单克隆抗体筛选方法同上，酶标记的显色抗体换成HRP偶联的羊抗鼠IgG。
表1.兔抗GLP-1多克隆抗体与GLP-1抗原肽反应特性
表2.GLP-1单克隆抗体(Clone2D11-2)与GLP-1抗原肽反应特性
从表1、2的结果分析看，所制备的GLP-1(9-36)多克隆抗体和筛选到的单克隆抗体均能识别GLP-1的四个抗原肽，说明单克隆、多克隆抗体所识别的抗原表位为GLP-1(9-36)、(9-37)、(7-36)、(7-37)肽链分子中共有的抗原表位。
实施例3GLP-1化学发光免疫定量测定方法建立
一、酶标抗体制备
GLP-1多克隆抗体用戊二醛法与碱性磷酸酶偶联，对PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃以下保存。
酶标抗体稀释液配制称量12.12g的Tris，5gBSA和lmlProclin300，将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水至1L，溶解混匀。
采用方阵法选择酶标抗体的工作浓度大于1:5000。
二、GLP-1校准品的制备
用生物合成GLP-1(9-36)-BSA融合蛋白纯品配制，也可用其它三种制备的GLP-1-BSA融合蛋白配制。分装0、25、50、100、500、1000nmol/L共5瓶。
三、固相包被板载体的制备
(1)包被液：称量2.20g的NaH2P04·2H20，12.90g的Na2HP04·12H20和9.0g的NaCl于1L的洁净容器中，加入1L的双蒸水溶解混匀后，PH为7.2，加入适量GLP-1单克隆抗体(保藏号为CCTCCNO：C2014108的单克隆抗体Clone2D11-2)混匀。此包被液可以包被聚苯乙烯板、珠、管等载体，包被条件是4℃、24h。
(2)洗涤：用生理盐水洗三次。
(3)封闭液：称量0.2g的NaH2P04·2H20，2.9g的Na2HP04·12H20、l0gBSA、和lmlProclin300，将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水至1L，溶解混匀，调整pH值为7.0或者7.5。聚苯乙烯板与聚苯乙烯珠的封闭液pH值约有差异。封闭条件是室温3小时后弃封闭液、拍干，室温除湿干燥24小时。立即进行封袋，贴签后置2-8℃保存。
四、化学发光底物液
称量24gTris、160gNaCl、4gKCl、15mlHC1、200ml3-(2'-螺旋金刚烷)-4-曱氧基-4-(3'-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷和lmlProclin300，将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水至1L，溶解混匀。
五、洗涤液
称量24gTris，160gNaCl，4gKC1和15mlHC1于洁净容器中，加双蒸水至1L，溶解混匀，调整PH至7.4。
六、半成品及成品组成
上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成GLP-1定量测定试剂盒(化学发光法)。
综上，本发明的发明人还对试剂盒的反应模式和反应条件进行了实验研究，最终确定了双抗体夹心一步法反应模式，并就不同的反应时间对实验结果的影响进行了实验，确定最适合的反应时间。通过对化学发光底物液发光持续时间的测定及不同发光时间对测定值的影响实验表明：在加入化学发光底物液后30-90分钟之间进行测量为最佳，其结果也较为准确。
实施例4本发明的试剂盒的操作方法
以实施例3制备的血液GLP-1总含量化学发光免疫分析定量测定试剂盒的具体操作如下:(以反应板为例)
1.自4℃冰箱中取出试剂盒，室温平衡15分钟。
2.取出包被板条，插入板架上。
3.加样，每孔加样100ul，
4.用微量震荡器充分振荡混匀，用封板膜封板37℃水浴30分钟。
5.用稀释后的洗涤液洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。
6.加酶标记GLP-1多克隆抗体，每孔100ul，
7.重复4)至5)
8.加化学发光底物工作液100ul
9.用微量震荡器充分振荡混合均匀，室温(20-27℃)避光反应30分钟。
10.测量必须于加化学发光底物液后的第30-90分钟内测量，在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间0.2-1.0秒/孔。以校准品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标绘出标准曲线，以各待测样本RLU值在标准曲线上查出该样本GLP-1的浓度。
实施例5本发明的试剂盒方法学性能鉴定
按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定。
1.试剂盒分析灵敏度(见表3)
具有定量含义的分析灵敏度通常以生物检测限或功能灵敏度表示。某样品单次检测可能具有的最小响应量刚大于空白检测低限响应量，该样品内含有的分析物浓度或其他量值为生物检测限。
本发明化学发光免疫分析定量测定试剂盒生物检测限表达该试剂盒的分析灵敏度。估算采用以保证99.7％的可能性。
实验设计：
1.1试剂：GLP-1化学发光免疫分析定量测定试剂盒，批号：20130816
1.2样品：浓度分别为0nmol/L、6.25nmol/L、12.5nmol/L、25nmol/L、50nmol/L100nmol/L、250nmol/L、500nmol/L、1000nmol/L
1.3方法：各样品连续检测12次，读取各浓度样品的吸光度值并计算SD。
1.4确定分析灵敏度--生物检测限：由上表得以计算，0nmol/L样品组的RLU有99.7％的可能性可高达335.1。6.25nmol/L样品组有99.7％的可能出现的最小RLU为1159.7，超出0nmol/L样品组可能出现的最高RLU335.1，即6.25nmol/L样品的吸光度有99.7％的可能大于0mg/L样品的吸光度，符合生物检测限的定义。且符合本试剂盒的线性范围(6.25nmol/L—250nmol/L)。
结论：拟定本产品分析灵敏度为6.25nmol/L浓度点。本试剂盒能定量报告血液样品含GLP-1总浓度的最低限值为6.25nmol/L。
表3.分析灵敏度
(2)试剂盒线性范围(见表4、图2)
表4.线性范围
由图2可知，本试剂盒线性范围为6.25nmol/l---1000nmol/l，R＝0.9997
(3)试剂盒精密性实验批内变异
批内变异：取低、中、高三份质控血清样品分别进行10孔平行实验，计算测定值的平均值和标准差。按公式CV＝标准差/平均值x100％计算变异系数，批内变异系数CV分别为3.89％，4.8％，4.13％。批间变异：选择5份不同浓度的血清样品对每份血清进行3次重复测定，计算其批间变异系数(CV％)，批间变异CV在3.1～6.54％之间。
(4)试剂盒准确性实验
将高浓度的校准品原料，用正常人血清稀释成四个不同浓度值，每个浓度做5孔平行实验，分别计算回收率在94-105％范围内。
(5)试剂盒稳定性实验
试剂盒保存温度为2-8℃，经过6个月的测定试剂盒的各项指标均满足要求，考虑到运输和使用过程中对试剂盒的影响，我们进行37℃7天的加速实验，实验结果表明试剂盒的各项指标完全符合要求。
说明“GLP-1化学发光免疫分析定量测定试剂盒”的灵敏度、特异性、精密性、准确性和稳定性是完全合格的。
实施例6GLP-1化学发光免疫测定试剂临床初步应用
一、研究对象
收集健康体检者空腹静脉血108例，明确空腹血糖正常、肝肾功能正常、血脂指标均正常，无糖尿病及其它心血管病史，其中男性52例、年龄25～76岁，女性56例，年龄25～75岁。
收集新诊断的IGT、T2DM患者120例，收集糖耐量试验正常人50例，上述对象至少包括空腹、服糖后1h和2h三个时间点样本，累计血样本510个。所有患者均未接受GLP-1或其类似物药物治疗。
采用普通管或促凝管收集血样本，收集血清-20℃冻存，用于血清总GLP-1检测。
二、血清总GLP-1含量测定
上述所有血清样本按照实施例4所示操作步骤集中进行检验，设0～1490nmol/L标准曲线和空白孔。
三、结果
1.正常人空腹血清总GLP-1含量
按照实施例4方法集中检测，获得健康成人空腹总GLP-1含量50.8±43.8nmol/L，图3显示了108例正常人空腹血清总GLP-1含量的分布情况，从中可以发现糖代谢正常人群中GLP-1的空腹基础值差别较大。
2.IGT、T2DM临床应用分析
所有临床样本检测结果见表5。分析检测的结果，T2DM患者空腹血清GLP-1总含量高于正常组，IGT组相对偏高、但尚未达到统计学差异。三组对象接受糖耐量测试的同时检测血清总GLP-1含量，发现NGT组在餐后1h血清总GLP-1含量显著升高至2h逐渐回落，而IGT组和T2DM组均呈现餐后1h、2h没有明显上升降，提示IGT组和T2DM组存在GLP-1分泌缺陷。
另外，观察每一列研究对象在进行糖耐量测试中血清总GLP-1含量变化，发现50例NGT空腹、餐后1h、2hGLP-1变化趋势一致。52例IGT患者中有5例、68例T2DM中有3例GLP-1变化趋势与NGT一致，在餐后1小时出现GLP-1水平显著升高，2小时候回落，表明并不是所有IGT、T2DM患者都存在餐后GLP-1分泌不足，患者的糖代谢异常可能存在其它原因。
表4.IGT、T2DM患者餐后血清总GLP-1变化分析
*IGT组或T2DM组与NGT组比较(*p<0.05，**p<0.01)；Δ餐后1h、2h与空腹比较(Δp<0.05，ΔΔp<0.01)。空腹状态下，T2DM组GLP-1水平显著高于NGT组(p<0.01)，但与IGT组无显著差异。各组内餐后GLP-1水平比较，NGT组餐后1hGLP-1水平显著上升，2h后回落显
著低于1h水平，但仍高于空腹水平，IGT组heT2DM组餐后1h、2h无明显波动。
结论：采用本发明建立的血清(血浆)GLP-1总含量化学发光免疫检测方法，首先建立正常人空腹血清GLP-1参考范围为50.8±43.8nmol/L，并发现正常个体间GLP-1的空腹基础值差异较大。分析IGT、T2DM患者空腹、餐后不同时段血液中总GLP-1含量，发现120例IGT、T2DM患者中112例患者存在餐后GLP-1分泌缺陷。本发明的重要意义在于所公开的血清(血浆)总GLP-1定量检测方法，能动态定量监测血液中总GLP-1含量变化，对于T2DM的分型诊断、个性化治疗以及其它GLP-1缺乏相关性疾病(代谢综合征、冠心病、老年痴呆等)的发病机制及早期预防研究奠定了实验基础。此外，检测血液中总GLP-1含量，配合生物活性GLP-1检测，可全面了解受试者体内GLP-1分泌、失活的状况，是GLP-1相关基础及临床研究必不可少的工具。

Claims (10)

1.一种检测人血液GLP-1总含量的化学发光免疫分析法试剂盒，其特征在于：包括有生物活性的GLP-1(7-37)NH2肽、有生物活性的GLP-1(7-36)NH2肽、无生物活性的GLP-1(9-37)NH2肽、无生物活性的GLP-1(9-36)NH2肽；以及上述四种GLP-1肽链与BSA融合的蛋白；以及能够识别上述四种GLP-1肽的单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由保藏号为CCTCCNO：C2014108的杂交瘤细胞株所分泌的；以及酶标记的能够识别上述四种GLP-1肽的多克隆抗体；GLP-1校准品；化学发光底物和洗涤液。
2.如权利要求1所述的一种检测人血液GLP-1总含量的化学发光免疫分析法试剂盒，其特征在于：所述的有生物活性的GLP-1(7-37)NH2肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，有生物活性的GLP-1(7-36)NH2肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，无生物活性的GLP-1(9-37)NH2肽的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，无生物活性的GLP-1(9-36)NH2肽的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。
3.如权利要求1所述的一种检测人血液GLP-1总含量的化学发光免疫分析法试剂盒，其特征在于：每升所述的化学发光底物中，含有24gTris、160gNaCl、4gKC1、15mLHCl、lmlProclin300和200ml的3-（2'-螺旋金刚烷）-4-曱氧基-4-（3'-磷酰氧基）苯基-1，2-二氧乙烷，余量为双蒸水。
4.如权利要求1所述的一种检测人血液GLP-1总含量的化学发光免疫分析法试剂盒，其特征在于：每升所述的洗涤液中含有24gTris，160gNaCl，4gKC1和15mlHC1，余量为双蒸水，PH为7.4。
5.如权利要求1所述的一种检测人血液GLP-1总含量的化学发光免疫分析法试剂盒，其特征在于：标记多克隆抗体的酶为碱性磷酸酶。
6.权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括一个制备能够识别上述四种GLP-1肽的单克隆抗体，一个酶标记的能够识别上述四种GLP-1肽的多克隆抗体的步骤；还包括一个以无生物活性的GLP-1(9-36)NH2肽与BSA融合的蛋白纯品配制校准品步骤，一个配制洗涤液的步骤，一个配制化学发光底物的步骤，以及分装上述各组份并组装为成品的步骤。
7.如权利要求6所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：在一个制备能够识别上述四种GLP-1肽的单克隆抗体的步骤中，首先用0.05M、pH为7.2的磷酸盐缓冲液配制成所需浓度的包被液，然后将识别四种GLP-1的单克隆抗体包被，在包被的过程中采用生理盐水洗涤2-5次；最后使用pH值为7.0~7.5的磷酸盐封闭液进行封闭。
8.如权利要求6所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：在一个制备酶标记的能够识别上述四种GLP-1肽的多克隆抗体的步骤中，标记多克隆抗体的酶为碱性磷酸酶，碱性磷酸酶标记是采用戊二醛法进行标记。
9.一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCCNO：C2014108。
10.一种采用化学发光免疫分析的方法测定血液或者血浆中GLP-1总含量的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）自冰箱中取出权利要求1所述的试剂盒，室温平衡10~20分钟；
2）取出包被板条，插入板架上；
3）加样，每孔加样100μl；
4）用微量震荡器充分振荡混匀，用封板膜封板30~40℃水浴20~50分钟；
5）用稀释后的洗涤液洗板3~7次，最后在干净的吸水纸上扣干；
6）加酶标记GLP-1多克隆抗体，每孔100μl；
7）重复4）至5）；
8）加化学发光底物工作液100μl；
9）用微量震荡器充分振荡混合均匀，室温避光反应20~50分钟；
10）在加化学发光底物液后的第30-90分钟内测量，在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度，测量时间0.2-1.0秒/孔，以校准品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标绘出标准曲线，以各待测样本RLU值在标准曲线上查出该样本GLP-1的浓度。
CN201410490637.3A 2014-09-23 2014-09-23 一种检测人血液glp-1总含量的化学发光免疫分析法试剂盒 Active CN104569419B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410490637.3A CN104569419B (zh) 2014-09-23 2014-09-23 一种检测人血液glp-1总含量的化学发光免疫分析法试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410490637.3A CN104569419B (zh) 2014-09-23 2014-09-23 一种检测人血液glp-1总含量的化学发光免疫分析法试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104569419A CN104569419A (zh) 2015-04-29
CN104569419B true CN104569419B (zh) 2016-07-06

Family

ID=53085971

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410490637.3A Active CN104569419B (zh) 2014-09-23 2014-09-23 一种检测人血液glp-1总含量的化学发光免疫分析法试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104569419B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104267194B (zh) * 2014-09-23 2016-01-13 上海市东方医院 人胰高血糖素样肽-1、抗体及其试剂盒
CN106290920A (zh) * 2016-08-30 2017-01-04 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 艾塞那肽检测试剂盒
CN108196062B (zh) * 2017-12-20 2020-11-27 上海美迪西生物医药股份有限公司 一种竞争性的化学发光法测定游离艾塞那肽的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008006095A1 (en) * 2006-07-07 2008-01-10 Hill's Pet Nutrition, Inc. Method of diagnosing a body weight condition or predisposition in an animal
WO2009143014A1 (en) * 2008-05-23 2009-11-26 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Glp-1 receptor agonist bioassays
WO2013027823A1 (ja) * 2011-08-25 2013-02-28 三菱化学メディエンス株式会社 グルカゴン様ペプチド－１の測定方法及びそれに使用するキット
CN103344764B (zh) * 2013-06-19 2014-11-26 天津美德太平洋科技有限公司 胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂及检测方法和试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN104569419A (zh) 2015-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105934671B (zh) 用于评估妊娠糖尿病的方法和试剂
CN109596843B (zh) 一种血清淀粉样蛋白a的测定试剂盒
CN104569419B (zh) 一种检测人血液glp-1总含量的化学发光免疫分析法试剂盒
CN102081100B (zh) 一种肝癌多标志物微阵列试剂盒、其制备方法及其应用
CN106918708A (zh) 一种用于检测胰岛素的竞争法胶乳增强免疫透射比浊试剂盒
CN108570104B (zh) 重组脂联素抗原、抗体及脂联素纳米胶乳增强免疫比浊法试剂盒
CN107075557A (zh) 使用嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3作为诊断生物标志物的方法和组合物
CN107991485A (zh) 用于检测可溶性st2蛋白的试剂盒
CN101004421A (zh) 一种半定量检测oxLDL的试纸
EP2943795B1 (en) Fasting levels of growth hormone as a predictive marker of cardiovascular risk
CN110361547A (zh) 一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂及其检测方法和其在检测下消化道健康的用途
EP2518084B1 (en) Method for measuring human insulin and measurement reagent
CN109180519A (zh) 一种喹乙醇代谢物抗原、抗体及酶联免疫检测试剂盒与检测方法
CN102943066B (zh) 一种人载脂蛋白b100单克隆抗体及其化学发光免疫分析测定试剂盒
CN103344773B (zh) 一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂及检测方法和试剂盒
CN111856038A (zh) Unc45a在pop早期预警、诊断、预后评估中的应用和产品
CN108802367A (zh) 一种万古霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒
CN103344764A (zh) 胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂及检测方法和试剂盒
CN107746430B (zh) 一种gp73 c端抗原的制备及其应用
CN108241064A (zh) 一种测定甲状腺球蛋白抗体含量的试剂盒及其测试方法
CN111856037B (zh) Unc45a与hsp10的比值在pop早期预警、诊断、预后评估中的应用和产品
CN104267194B (zh) 人胰高血糖素样肽-1、抗体及其试剂盒
CN111596069A (zh) Hsp10在pop早期预警、诊断、预后评估中的应用和产品
KR20130045779A (ko) 미성숙 항체, 이를 이용한 연속 검출장치 및 실시간 연속 검출 방법
CN108196056A (zh) 一种测定糖类抗原50含量的试剂盒及其测试方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant