CN103344764B - 胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂及检测方法和试剂盒 - Google Patents
胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂及检测方法和试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103344764B CN103344764B CN201310242495.4A CN201310242495A CN103344764B CN 103344764 B CN103344764 B CN 103344764B CN 201310242495 A CN201310242495 A CN 201310242495A CN 103344764 B CN103344764 B CN 103344764B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glp
- microliters
- peptide
- glucagon
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Abstract
本发明涉及一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，每15μl待测标本中加入的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂的组份及份数如下：⑴膜反应液 35~45μl；⑵GLP-1受体15~25μl；⑶GLP-1标准品10~20μl；⑷磷酸西他列汀 5~15μl；⑸三磷酸腺苷1~10μl；⑹三磷酸鸟苷1~10μl；⑺3-异丁基 1-甲基黄嘌呤5~15μl；⑻牛血清白蛋白1~10μl；⑼生物素标记的鼠抗人cAMP单克隆抗体 50~150μl；⑽包被有羊抗人cAMP多克隆抗体的微孔板；⑾亲和素标记的辣根过氧化物酶50~150μl；⑿ PBS洗液300~400μl；⒀显色底物50~150μl；⒁终止液 50~150μl。本发明检测试剂组成成份中的GLP-1受体由基因重组产生，便于纯化并能降低检测试剂的批间差异；同时，以GLP-1受体作为捕获GLP-1的探针，不仅提高了检测的灵敏性，同时也可直接测定其生物活性，灵敏度高、实用性强。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验领域的一种检测试剂，尤其是一种胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）生物学活性检测试剂及及检测方法和试剂盒。
背景技术
糖尿病是在多基因遗传基础上，加上环境因素、自身免疫的作用，通过未完全阐明的机制，引起胰岛素的分泌障碍和胰岛素生物学效应不足，导致以高血糖症为基本生化特点的糖、脂肪、蛋白质、水电解质代谢紊乱的一组临床综合征。典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等“三多一少”症状，其慢性并发症主要是特异和非特异的微血管病变、末梢神经病变。目前，糖尿病已成为继肿瘤及心脑血管疾病后第3 位主要的非传染性疾病，WHO预测到2030 年全世界糖尿病患者将超过3. 6亿。糖尿病治疗主要围绕如何控制血糖升高，而现有纠正高血糖治疗措施并不能纠正糖尿病原发病理生理改变即β细胞功能缺陷。近年研究发现，2 型糖尿病患者肠促胰岛素激素对胰岛素的刺激作用明显降低，其原因可能是肠促胰岛素激素的浓度低或作用抵抗。因此，GLP-1将成为2 型糖尿病治疗重要环节。
GLP-1是由末端空肠、回肠和结肠的Langerhans 细胞（L细胞）分泌的一种由30个氨基酸组成的短肽激素，是胰高血糖素原基因转录翻译后的产物。肠腔内营养物质如糖、脂肪等可直接刺激肠腔分泌GLP-1。GLP-1基因表达具有组织特异性，主要表达在胰腺胰岛细胞、小肠的L细胞以及下丘脑。人体内有活性的GLP-1有两种形式，分别为GLP-1（7-36）NH2和GLP-l（7-37）NH2，其中血循环中80％以上为GLP-l（7-36）NH2。在人体内GLP-1能被二肽酰基肽酶特异性识别，导致GLP-1在血浆中的半衰期短于2min，这一降解过程主要是在肝脏完成，最后通过肾脏排泄；同时，在正常生理状态下肾外组织协助肾脏清除GLP-l。GLP-1通过与GLP-1受体结合后发挥葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌作用，即高血糖时才能发挥作用，这种生理特性使GLP-1具有不会造成低血糖的优势。GLP-1能够促进胰岛素的分泌，刺激胰岛β 细胞增殖分化、抑制β细胞凋亡，从而起到保护胰岛β细胞的作用。此外，GLP-1还对心血管具有保护作用，并且能够营养神经细胞。
由于GLP-1在控制和调控血糖中的重要地位，且其降糖作用依赖于血糖浓度，通过这样途径控制血糖不存在导致低血糖的风险，为此，药学领域的专家已经开发GLP-1的类似物，如：艾塞那肽，利拉鲁肽等，而检测患者血浆中GLP-1水平，可指导临床正确使用GLP-1类似物。
然而，国内外检测GLP-1主要是通过酶联免疫吸附试验和化学发光免疫测定技术。目前国内尚不能生产临床实用商品化试剂，进口试剂盒不但价格昂贵、检测成本高，而且操作繁琐。同时，基于免疫学原理建立的测定方法，只能测定GLP-1免疫活性（蛋白含量），而不能测定其生物活性，但GLP-1在体内以生物活性发挥生理和病理作用。而且，目前GLP-1检测试剂盒灵敏度低，只能用于科研而不适用于临床检验的缺陷。
通过检索，发现与本发明专利申请相关的如下专利公开文献：
1、人胰高血糖素样肽-1调节剂及其在治疗糖尿病和相关病症中的用途（CN101400699），本发明提供新的人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)-受体调节剂，其具有类似于或优于天然GLP-1肽的生物活性，因而可用于治疗或预防与GLP活性相关的疾病或病症。此外，本发明提供新的化学修饰的化合物，其不但在II 型糖尿病中刺激胰岛素的分泌，而且还产生其它有益的促胰岛素响应。这些合成的肽GLP-1受体调节剂对溶蛋白性裂解表现出提高的稳定性，这使其成为理想的用于口服或肠胃外给药的治疗候选物。本发明的化合物在糖尿病的功效模型中显示出期望的药物动力学性质和期望的效能。
2、胰高血糖素样肽-1衍生物及其制药用途（CN101868476A），本发明的GLP-1衍生物包含修饰的GLP-1(7-37)序列，其具有总共2-12个氨基酸修饰，包括Glu22和Arg26，在18、20、23、30、31、34、36、37或39位被白蛋白结合残基衍生化或PEG化。这些化合物可用于治疗或预防2型糖尿病和相关疾病。所述化合物是有效的、稳定的，具有长半衰期、结合白蛋白的高亲和力和/或结合GLP-1受体(GLP-1R)的胞外结构域的高亲和力，所有这些都与获得长效的、稳定的且有活性的并有可能每周给予1次的GLP-1衍生物的总体目标潜在相关。
3、胰高血糖素样肽-1突变体多肽及其制备方法、药物组合物和其应用（CN102363633A），本发明公开了一种胰高血糖素样肽-1突变体多肽及其制备方法、药物组合物和其应用，所述突变多肽由胰高血糖素样肽-1突变体N末端添加含有Cys的延长多肽而成，并且所述突变多肽自身折叠成二硫键，所述胰高血糖素样肽-1突变多肽用于制备治疗糖尿病、治疗和/或预防肥胖症的药物组合物。针对临床上GLP-1类似物在体内存留时间较短，需要每天注射给药的缺限，提供一种半衰期较长的GLP-1突变体多肽，该GLP-1突变体多肽半衰期较长，不需要每天给患者注射，能够有效地提高患者的依从态度。
通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献有本质的不同。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种灵敏度高、实用性强、不仅能够辅助诊断血糖升高的原因，而且能够更好地指导临床GLP-1类似物药物的直接检测胰高血糖素样肽-1（GLP-1）生物学活性检测试剂及检测方法和试剂盒，该检测试剂主要用于检测2型糖尿病患者血清（或血浆）中胰高血糖素样肽-1的生物学活性。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，每15μl待测标本中加入的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂的组份及份数如下：
而且，所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，每15μl待测标本中加入的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂的组份及份数如下：
而且，所述的GLP-1受体的制备步骤如下：
⑴真核细胞GLP-1受体表达
①根据人GLP-1受体的序列设计引物，5′端引入BglII 酶切位点和Kozok序列，3′端引入XhoI酶切位点和终止密码；上游引物序列见序列SEQ NO.1，下游引物序列见序列SEQ NO.2；
②用PCR方法扩增DNA片段，模板来自胎儿正常胰岛组织的cDNA文库，反应条件为：
94℃，30 s；
60℃，20 s；
72℃，90 s；
25个循环后，72℃延伸7min；
③反应结束后，凝胶电泳提取PCR片段，分别用BglII和XhoI消化PCR产物并用QIAGEN Plasmid Mini Kits纯化DNA片段；使用NheI 和XhoI消化质粒pcDNA3.1(+) (5.4kb)；
④按照DNA的重量比为1:5-10的比例将PCR片段和质粒片段在DNA连接酶的作用下连接起来，将新构建的质粒转入E.coli DH5α细菌中；
⑤通过氨苄青霉素筛选步骤④中转入E.coli DH5α的细菌，挑取单菌落，PCR鉴定后，提取纯化重组质粒；
⑥使用电穿孔将重组质料转染CHO细胞株，用G418筛选细胞株，扩增并提取蛋白质，确定该细胞株表达GLP-1受体，将该细胞株液氮冻存备用；
⑵ 提取表达GLP-1受体细胞膜的过程
① 向步骤⑴中细胞株中加入harvesting 缓冲液，在温箱中孵育后，离心，弃去上清液得沉淀；
② 将沉淀重新悬浮，再将其在冰上孵育后破碎细胞，得细胞液；
③ 将步骤②中细胞液离心，沉淀即为GLP-1受体。
而且，所述的膜反应液的组成成份及重量份数g/L为：
余量为双蒸水；
pH=7.4。
而且，所述的膜反应液的组成成份及重量份数g/L为：
余量为双蒸水；
pH=7.4。
一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂盒，包括如上所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂。
一种利用胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂的检测方法，在检测过程中使用如上所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂。
而且，步骤如下：
⑴加入GLP-1受体、膜反应液、待测标本、磷酸西他列汀、三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、3-异丁基 1-甲基黄嘌呤、牛血清白蛋白及GLP-1标准品后，于30℃振荡下，孵育5-10min；同时设定自身对照；利用GLP-1系列标准品绘制标准曲线；
⑵将上述反应体系110微升加入包被羊抗人cAMP多克隆抗体的微孔板中，于室温下反应30分钟；
⑶弃去上述液体，加入洗液350微升/孔洗板3-5次后，加入生物素标记的鼠抗人cAMP单克隆抗体100微升，充分混匀后于37℃孵育1小时；
⑷弃去上述液体，加入洗液350微升/孔洗板3-5次后，加入亲和素标记的辣根过氧化物酶100微升，于37℃孵育30分钟；
⑸弃去上述液体，加入PBS洗液350微升/孔洗板3-5次后，加入显示底物100微升，15分钟后加入终止液100微升终止反应；
⑹以标准品测定的OD值为纵坐标，GLP-1浓度为横坐标绘制标准曲线，通过标准曲线获得未知样品浓度，对胰高血糖素样肽-1生物学活性进行检测。
本发明的有益效果和优点是：
1、本发明检测试剂组成成份中的GLP-1受体由基因重组产生，便于纯化并能降低检测试剂的批间差异；同时，以GLP-1受体作为捕获GLP-1的探针，不仅提高了检测的灵敏性，同时也可直接测定其生物活性，灵敏度高、实用性强。
2、本发明胰高血糖素样肽-1（GLP-1）生物学活性检测方法不仅可以提高GLP-1检测的灵敏度，能够监测患者血清（或血浆）中GLP-1活性变化，而且方法简单、快速，并适合用于临床GLP-1的体外检测，辅助临床对血糖升高原因进行鉴别，并且对指导临床应用GLP-1类似物药物也具有重要的意义。
3、本发明检测GLP-1生物活性时将激活受体后产生的cAMP直接捕获，可直接观察GLP-1的生物学活性而不用转换为cAMP，此外直接捕获产生的cAMP能够提高检测的特异性，降低非特异反应。
4、本发明将诱生cAMP的过程和cAMP测定过程融合，随着cAMP产生，随即被酶标反应板表面的抗cAMP捕获，防止cAMP损失，影响检测效果。此外，如此处理可减少整个测定时间。
附图说明
图1为本发明的胰高血糖素样肽-1生物活性检测试剂测定原理图；
其中，1为表达GLP-1R细胞系；2为GLP-1；3为cAMP（诱生产物）；4为包被有包被有羊抗人cAMP多克隆抗体的微孔板；5为生物素标记的鼠抗人cAMP单克隆抗体；6为亲和素标记的辣根过氧化物酶；
图2为本发明转染CHO的细胞系表达GLP-1受体图；
右侧为阳性对照；中间是CHO细胞系；左侧为转染pcDNA3.1/GLP-1R的CHO细胞系。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明建立一种基于受体-配体结合测定GLP-1生物活性，并且将受体激活后分泌的cAMP直接捕获进行检测的方法和相应检测试剂。本发明克隆GLP-1受体的目的基因，通过基因重组技术建立表达GLP-1受体的细胞系，从而获得纯化的GLP-1受体，待测血清（或血浆）中的GLP-1与细胞膜上的GLP-1受体结合，受体被激活产生第二信使cAMP，包被有羊抗人cAMP多克隆抗体的微孔板直接将产生的cAMP捕获，而后加入生物素标记的鼠抗人cAMP单克隆抗体及亲和素标记的辣根过氧化物酶，通过加入底物后颜色的变化及相应的OD值反映待检血清（或血浆）中GLP-1的生物学活性。同时设定自身对照，以排除血清（或血浆）中所含的cAMP量。
本发明采用生物活性测定方法：采用分子生物学技术构建表达GLP-1受体的细胞株（系）并作为指示细胞；GLP-1与GLP-1受体（GLP-1R）结合激活指示细胞，导致细胞合成环单磷酸腺苷（cyclic adenosinemonophosphate，cAMP），产物cAMP的浓度与体系中GLP-1生物活性呈正比。使用不同浓度GLP-1标准品分别与表达有GLP-1R的指示细胞共同温育，通过测定诱生后cAMP含量制作标准曲线或获得数学函数；待测标本与同样方式和细胞温浴，通过标准曲线或数学函数获得GLP-1含量。
本发明将cAMP诱生和cAMP检测过程合并方式，即将细胞与GLP-1一并加入包被有羊抗人cAMP多克隆抗体的微孔板内，GLP-1与GLP-1R结合，指示细胞一旦产生cAMP会马上被捕获抗体所捕获。此时，体系中cAMP浓度采用双抗体夹心模式测定，即向上述体系中再加入生物素标记鼠抗人cAMP抗体；最后通过生物素-亲和素系统显色，测定各测试孔的吸光度值。
本发明的胰高血糖素样肽-1生物活性检测试剂测定原理图见图1。
下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一、溶液配制
⑴ 膜反应液的配制
充分溶解后，用HCl或NaOH调pH 至7.4，加ddH2O定容至1L；
⑵ 牛血清白蛋白溶液
BSA （牛血清白蛋白） 2.4 g；
ddH2O（双蒸水） 50 mL；
充分溶解后加ddH2O定容至100 mL；
⑶ HBS液的配制 pH 7.4
NaCl （氯化钠） 4.5g；
HEPES (4-羟乙基哌嗪乙磺酸) 1.192
ddH2O（双蒸水） 300 ml；
充分溶解后，用HCl或NaOH调节pH至7.4，加ddH2O定容至500 ml；
⑷ harvesting 缓冲液 pH 7.4
充分溶解后，用HCl或NaOH调节pH至7.4，加ddH2O定容至500 ml；
⑸ solubilization 缓冲液 pH 7.4
HEPES （4-羟乙基哌嗪乙磺酸） 1.192 g；
EDTA （乙二胺四乙酸） 1.871g；
ddH2O （双蒸水） 300ml；
充分溶解后，用HCl或NaOH调节pH至7.4，加ddH2O定容至500 ml；
充分溶解后，用HCl或NaOH调节pH至7.4，加ddH2O定容至500 ml。
充分溶解后，用HCl或NaOH调节pH至7.4，加ddH2O定容至1升。
充分溶解后，用HCl或NaOH调节pH至7.4，加ddH2O定容至1升。
⑼磷酸盐缓冲盐水溶液 （PBS洗液） 1M pH 7.4
充分溶解后，用HCl或NaOH调节pH至7.4，加ddH2O定容至100毫升。
二、一种胰高血糖素样肽-1的生物学活性检测试剂，其主要组份如下：
⑴ GLP-1标准品 （购自Sigma公司 货号：a9501）；
⑵ 生物素标记的鼠抗人cAMP单克隆抗体；
⑶ 包被有羊抗人cAMP多克隆抗体的微孔板；
⑷ 亲和素标记的辣根过氧化物酶（购自Sigma公司 货号：A3151）；
⑸ 基因重组GLP-1受体；
⑹ 磷酸西他列汀 （购自北京汇康博源医药科技 货号：654671-77-9）；
⑺ 三磷酸腺苷（ATP）（购自上海兆维科技发展有限公司 货号：987-65-5 ）；
⑻ 三磷酸鸟苷（GTP）（购自上海兆维科技发展有限公司 货号：56001-37-7）；
⑼ 3-异丁基 1-甲基黄嘌呤(IBMX) （购自百灵威科技有限公司货号：28822-58-4）
⑽ 膜反应液；
⑾ 洗液（pH 7.4，1M PBS洗液）；
⑿ 显色底物（3,3',5,5'-四甲基联苯胺（简称TMB)）。
⒀牛血清白蛋白 5μl；
⒁终止液1M的硫酸溶液。
上述鼠抗人cAMP单克隆抗体选自R&D公司的Monoclonal Mouse IgG1，货号：MAB2146；羊抗人cAMP多克隆抗体选自abcame公司的Goat polyclonal to cAMP，货号：ab130106。
基因重组GLP-1受体的制备步骤如下：
1、真核细胞GLP-1受体表达
⑴根据人GLP-1受体的序列设计引物，5′端引入BglII 酶切位点和Kozok序列，3′端引入XhoI酶切位点和终止密码；引物序列见表1；
⑵用PCR方法扩增DNA片段，模板来自胎儿正常胰岛组织的cDNA文库，反应条件为：
94℃，30 s；
60℃，20 s；
72℃，90 s；
25个循环后，72℃延伸7min；
⑶反应结束后，凝胶电泳提取PCR片段（1.4Kb），分别用BgIII和XhoI消化PCR产物并用QIAGEN Plasmid Mini Kits纯化DNA片段；使用NheI 和XhoI消化质粒pcDNA3.1(+) (5.4kb)；
⑷按照重量比为1:8的比例将PCR片段和质粒片段在DNA连接酶的作用下连接起来，将新构建的质粒转入E.coli DH5α细菌中；
⑸通过氨苄青霉素筛选步骤⑷中转入E.coli DH5α的细菌，挑取单菌落，PCR鉴定后，提取纯化重组质粒；
⑹使用电穿孔将重组质料转染CHO细胞株，用1mg/ml G418筛选细胞株，3周后挑选单个活细胞，扩增并提取蛋白质，用Western Blotting的方法确定该细胞株表达GLP-1受体，结果见图2，液氮冻存备用。
表1 GLP-1受体引物序列
| 引物（5’-3’） | 核苷酸序列 |
| 5’端引物序列 | GA AGATCT GCC ACC ATG GCC GGC GCC CCC GGC |
| 3’端引物序列 | TA CTC GAG TCA GCT GCA GGA GGC CT |
2、提取表达GLP-1受体细胞膜的过程
⑴ 用预保温（保温温度为37℃）的20ml HBS液（HBS: 154mM NaCl，10mM HEPES，pH 7.4）洗涤瓶中的单层融合细胞；
⑵ 向洗涤细胞中加入8ml harvesting 缓冲液(154mM NaCl，10mM HEPES，5mM EDTA，pH 7.4)，在37℃温箱中孵育10min后，在4℃条件下500g/转离心5min，弃去上清液；
⑶ 将离心后的沉淀颗粒重新悬浮于10mL 的 solubilization 缓冲液 (10mM HEPES，10mM EDTA，pH 7.4)，将其在冰上孵育15min后用超声破碎仪处理细胞；
⑷ 经处理后的细胞液在4℃环境下以40,000g离心15min；再将下层颗粒重新悬浮于冰冻 resuspension 缓冲液 (10mM HEPES，0.1mMEDTA, pH 7.4)，向其中加入2mg/mL 牛血清白蛋白，分装后保存于-80℃冰箱待用。
3、制备生物素标记的鼠抗人cAMP单克隆抗体溶液
将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素与鼠抗人cAMP单克隆抗体的摩尔比为20:1的比例将二者混合反应，将反应后的液体用0.1M PBS进行透析，得所述生物素标记的鼠抗人cAMP单克隆抗体溶液；
4、用羊抗人cAMP多克隆抗体包被微孔板
⑴包被：用PB溶液将cAMP抗体稀释为1微克/毫升，向微孔板中每孔加入150微升，放入湿盒中室温过夜；
⑵封闭：弃去包被液，向微孔中加入5%牛血清白蛋白（BSA）于37℃封闭2小时，弃去封闭液后风干待用。
三、本发明专利申请胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂的检测方法
⑴ 按照下表配制GLP-1系列标准品，配制方法如表2所示。
表2 GLP-1的标准品的配制
⑵ 分别设置样本孔及GLP-1标准品孔，标准品孔中加入不同浓度的GLP-1 15微升，样本孔中加入待检血标本15微升后，按照表3加入试剂。
表3 操作流程中各物质的添加量表
⑶ 由于血标本中可能存在cAMP，所以需设置自身对照，及将一份血标本中加经煮沸的细胞膜，使膜受体失活，以作为cAMP自身对照；此外还需设置阴性对照，即只加入基因重组GLP-1受体而不加入GLP-1。
⑷ 将上述反应体系110微升加入包被羊抗人cAMP多克隆抗体的微孔板中，于室温下反应30分钟。
⑸弃去上述液体，洗板3-5次后，加入生物素标记的鼠抗人cAMP单克隆抗体100微升，充分混匀后于37℃孵育1小时。
⑹ 弃去上述液体，洗板3-5次后，加入亲和素标记的辣根过氧化物酶100微升，于37℃孵育30分钟。
⑺ 弃去上述液体，加入PBS洗液350微升/孔洗板3-5次后，加入100μl显示底物（3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB)），15分钟后加入100μl终止液（1M的硫酸溶液）终止反应。
⑻以标准品测定的OD值为纵坐标，GLP-1浓度为横坐标绘制标准曲线（或建立数学模型），未知样品浓度通过标准曲线（或数学模型）获得，即可对血清中的胰高血糖素样肽-1（GLP-1）人生物学活性进行检测。
Claims (6)
1.一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其特征在于：每15μl待测标本中加入的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂的组份及份数如下：
所述的GLP-1受体的制备步骤如下：
⑴真核细胞GLP-1受体表达
①根据人GLP-1受体的序列设计引物，5′端引入BglII酶切位点和Kozok序列，3′端引入XhoI酶切位点和终止密码；上游引物序列见序列SEQ NO.1，下游引物序列见序列SEQNO.2；
②用PCR方法扩增DNA片段，模板来自胎儿正常胰岛组织的cDNA文库，反应条件为：
94℃，30s；
60℃，20s；
72℃，90s；
25个循环后，72℃延伸7min；
③反应结束后，凝胶电泳提取PCR片段，分别用BglII和XhoI消化PCR产物并用QIAGENPlasmid Mini Kits纯化DNA片段；使用NheI和XhoI消化质粒pcDNA3.1(+)；
④按照DNA的重量比为1:5-10的比例将PCR片段和质粒片段在DNA连接酶的作用下连接起来，将新构建的质粒转入E.coli DH5α细菌中；
⑤通过氨苄青霉素筛选步骤④中转入E.coli DH5α的细菌，挑取单菌落，PCR鉴定后，提取纯化重组质粒；
⑥使用电穿孔将重组质料转染CHO细胞株，用G418筛选细胞株，扩增并提取蛋白质，确定该细胞株表达GLP-1受体，将该细胞株液氮冻存备用；
⑵提取表达GLP-1受体细胞膜的过程
①向步骤⑴中细胞株中加入harvesting缓冲液，在温箱中孵育后，离心，弃去上清液得沉淀；
②将沉淀重新悬浮，再将其在冰上孵育后破碎细胞，得细胞液；
③将步骤②中细胞液离心，沉淀即为GLP-1受体；
充分溶解后，用HCl或NaOH调节pH至7.4，加ddH2O定容至500ml；
所述的膜反应液的组成成份及重量份数g/L为：
pH＝7.4。
2.根据权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其特征在于：每15μl待测标本中加入的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂的组份及份数如下：
3.根据权利要求1或2所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其特征在于：所述的膜反应液的组成成份及重量份数g/L为：
4.一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1至3任一项所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂。
5.一种利用胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂的检测方法，其特征在于：在检测过程中使用如权利要求1至3任一项所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂。
6.根据权利要求5所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂的检测方法，其特征在于：步骤如下：
⑴加入GLP-1受体、膜反应液、待测标本、磷酸西他列汀、三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、3-异丁基1-甲基黄嘌呤、牛血清白蛋白及GLP-1标准品后，于30℃振荡下，孵育5-10min；同时设定自身对照；利用GLP-1系列标准品绘制标准曲线；
⑵将上述反应体系110微升加入包被羊抗人cAMP多克隆抗体的微孔板中，于室温下反应30分钟；
⑶弃去上述液体，加入洗液350微升/孔洗板3-5次后，加入生物素标记的鼠抗人cAMP单克隆抗体100微升，充分混匀后于37℃孵育1小时；
⑷弃去上述液体，加入洗液350微升/孔洗板3-5次后，加入亲和素标记的辣根过氧化物酶100微升，于37℃孵育30分钟；
⑸弃去上述液体，加入PBS洗液350微升/孔洗板3-5次后，加入显示底物100微升，15分钟后加入终止液100微升终止反应；
⑹以标准品测定的OD值为纵坐标，GLP-1浓度为横坐标绘制标准曲线，通过标准曲线获得未知样品浓度，对胰高血糖素样肽-1生物学活性进行检测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310242495.4A CN103344764B (zh) | 2013-06-19 | 2013-06-19 | 胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂及检测方法和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310242495.4A CN103344764B (zh) | 2013-06-19 | 2013-06-19 | 胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂及检测方法和试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103344764A CN103344764A (zh) | 2013-10-09 |
| CN103344764B true CN103344764B (zh) | 2014-11-26 |
Family
ID=49279578
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310242495.4A Active CN103344764B (zh) | 2013-06-19 | 2013-06-19 | 胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂及检测方法和试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103344764B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103884846B (zh) * | 2014-03-06 | 2016-06-08 | 杭州九源基因工程有限公司 | 一种利拉鲁肽生物学活性的检测方法 |
| CN104569419B (zh) * | 2014-09-23 | 2016-07-06 | 范列英 | 一种检测人血液glp-1总含量的化学发光免疫分析法试剂盒 |
| CN110452952B (zh) * | 2018-05-08 | 2024-01-16 | 宜昌东阳光长江药业股份有限公司 | 一种glp-1类似物生物活性的检测方法 |
| CN109655626A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-04-19 | 广州市进德生物科技有限公司 | 一种完全均相测定胰高血糖素的检测试剂盒及其方法 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1242707A (zh) * | 1996-11-05 | 2000-01-26 | 伊莱利利公司 | 外周给予的glp－1类似物和衍生物在控制肥胖中的用途 |
| JP2002522099A (ja) * | 1998-08-13 | 2002-07-23 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー | 哺乳類細胞ベースレポーター検定のアガロース・フォーマット |
| CN1844925A (zh) * | 2006-04-24 | 2006-10-11 | 东莞市博康健医药科技有限公司 | 一种重组促胰岛素分泌素生物学活性测定方法及其应用 |
| CN101400699A (zh) * | 2006-01-11 | 2009-04-01 | 布里斯托尔-迈尔斯·斯奎布公司 | 人胰高血糖素样肽-1调节剂及其在治疗糖尿病和相关病症中的用途 |
| CN101868476A (zh) * | 2007-09-05 | 2010-10-20 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 胰高血糖素样肽-1衍生物及其制药用途 |
| US20110097751A1 (en) * | 2008-05-23 | 2011-04-28 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Glp-1 receptor agonist bioassays |
| CN102363633A (zh) * | 2011-11-16 | 2012-02-29 | 天津拓飞生物科技有限公司 | 胰高血糖素样肽-1突变体多肽及其制备方法、药物组合物和其应用 |
| CN102649947A (zh) * | 2012-04-20 | 2012-08-29 | 无锡和邦生物科技有限公司 | 一种用于测定glp-1及其功能类似物生物活性的细胞株及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102004043153B4 (de) * | 2004-09-03 | 2013-11-21 | Philipps-Universität Marburg | Erfindung betreffend GLP-1 und Exendin |
-
2013
- 2013-06-19 CN CN201310242495.4A patent/CN103344764B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1242707A (zh) * | 1996-11-05 | 2000-01-26 | 伊莱利利公司 | 外周给予的glp－1类似物和衍生物在控制肥胖中的用途 |
| JP2002522099A (ja) * | 1998-08-13 | 2002-07-23 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー | 哺乳類細胞ベースレポーター検定のアガロース・フォーマット |
| CN101400699A (zh) * | 2006-01-11 | 2009-04-01 | 布里斯托尔-迈尔斯·斯奎布公司 | 人胰高血糖素样肽-1调节剂及其在治疗糖尿病和相关病症中的用途 |
| CN1844925A (zh) * | 2006-04-24 | 2006-10-11 | 东莞市博康健医药科技有限公司 | 一种重组促胰岛素分泌素生物学活性测定方法及其应用 |
| CN101868476A (zh) * | 2007-09-05 | 2010-10-20 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 胰高血糖素样肽-1衍生物及其制药用途 |
| US20110097751A1 (en) * | 2008-05-23 | 2011-04-28 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Glp-1 receptor agonist bioassays |
| CN102363633A (zh) * | 2011-11-16 | 2012-02-29 | 天津拓飞生物科技有限公司 | 胰高血糖素样肽-1突变体多肽及其制备方法、药物组合物和其应用 |
| CN102649947A (zh) * | 2012-04-20 | 2012-08-29 | 无锡和邦生物科技有限公司 | 一种用于测定glp-1及其功能类似物生物活性的细胞株及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 郭晓蓉.重组人白细胞介素1α对人成纤维样滑膜细胞功能和前列腺素E2受体-G蛋白－环磷腺苷信号转导通路的影响及芍药苷的作用.《中国优秀硕士学位论文全文数据库》.2010, * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103344764A (zh) | 2013-10-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Weston et al. | Modulation of glucagon receptor pharmacology by receptor activity-modifying protein-2 (RAMP2) | |
| Vink et al. | Natriuretic peptide drug leads from snake venom | |
| Ludvigsen et al. | Expression and distribution of somatostatin receptor subtypes in the pancreatic islets of mice and rats | |
| Ginsberg | The insulin receptor: properties and regulation | |
| CN103344764B (zh) | 胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂及检测方法和试剂盒 | |
| JP3394040B2 (ja) | ナトリウム排泄増加性蛋白質受容体ｂの組成物および合成法および使用法 | |
| CN103408669B (zh) | Glp-1类似物融合蛋白，及其制备方法和用途 | |
| Min et al. | Agonistic β-Klotho antibody mimics fibroblast growth factor 21 (FGF21) functions | |
| CN101367873B (zh) | 一种改构的胰高血糖素样肽-1的类似物和修饰物及其应用 | |
| CN106117370B (zh) | 高糖基化Exendin‑4及其类似物的融合蛋白、其制备方法和用途 | |
| Liu et al. | Human G protein-coupled receptor studies in Saccharomyces cerevisiae | |
| CN109836504A (zh) | 一种治疗代谢疾病的多结构域活性蛋白 | |
| Cosowsky et al. | The Groove between the α-and β-Subunits of Hormones with Lutropin (LH) Activity Appears to Contact the LH Receptor, and Its Conformation Is Changed during Hormone Binding (∗) | |
| CN109836503A (zh) | 一种治疗代谢疾病的多重活性蛋白 | |
| Allu et al. | Naturally occurring variants of the dysglycemic peptide pancreastatin: differential potencies for multiple cellular functions and structure-function correlation | |
| Pustovit et al. | A novel antagonist peptide reveals a physiological role of insulin-like peptide 5 in control of colorectal function | |
| CN103344773B (zh) | 一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂及检测方法和试剂盒 | |
| CN102516393B (zh) | 胰岛素模拟肽融合蛋白和突变体及其应用 | |
| Wittelsberger et al. | The mid-region of parathyroid hormone (1− 34) serves as a functional docking domain in receptor activation | |
| CN106608915A (zh) | Glp-1(7-37)多肽类似物 | |
| CN103884846B (zh) | 一种利拉鲁肽生物学活性的检测方法 | |
| Sakurai et al. | Advances in insulin therapy from discovery to β‐cell replacement | |
| CN104569419B (zh) | 一种检测人血液glp-1总含量的化学发光免疫分析法试剂盒 | |
| CN103261415A (zh) | 检测生理活性物质的生物测定法 | |
| CN106573968A (zh) | 糖蛋白激素受体突变 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 300384 Tianjin Haitai Nankai District Huayuan Industrial Development Zone Six Road No. 6 Haitai green industry base building C Room 101 Patentee after: Virtue Pacific (Tianjin) biological Polytron Technologies Inc Address before: 300384 Tianjin Haitai Nankai District Huayuan Industrial Development Zone Six Road No. 6 C Haitai green industry base 101 Patentee before: Tianjin MD Pacific Technology Co., Ltd. |