CN106573968A - 糖蛋白激素受体突变 - Google Patents

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Abstract

一种突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段，其包含一或多个突变，其中突变体TSHR与等价的野生型TSHR或片段相比具有增加的热稳定性。所述一或多个突变优选在TSHR的胞外亮氨酸富集的重复结构域(LRD)内，或者在TSHR的残基22‑260(TSHR260)内，或者可以在跨膜结构域(TMD)中。本发明的突变体TSHR或其片段优选由或者基本由TSHR受体的亚结构域TSHR260组成。在指定温度通过其半衰期确定，本发明的突变体TSHR或其片段与等价野生型TSHR或片段相比具有较高的热稳定性而且可以被纯化同时保留活性。本发明的突变体TSHR或其片段也可以去糖基化同时保留活性。本发明还提供了应用本发明的突变体TSHR或其片段的方法、试剂盒和用途。

Description

糖蛋白激素受体突变
发明领域
本发明一般性涉及糖蛋白激素受体，特别但不唯一地涉及促甲状腺激素(TSH)受体(TSHR)。本发明涉及突变、特别是单一点突变，其改良这种受体、特别是TSHR制备物的热稳定性。进一步地，本发明涉及组合在一起的单一点突变以进一步改良这种制备物的稳定性。本发明还涉及使用热稳定的糖蛋白激素受体、包括TSHR的制备物检测自身抗体如TSHR自身抗体(TRAb)存在的方法，以诊断、监测和预测与自身免疫性、特别是TSHR自身免疫性相关的疾病。
发明背景
TSH受体
TSHR是G蛋白偶联受体(GPCR)家族的成员，由三个结构域组成：胞外亮氨酸富集的重复结构域(LRD)、铰链区和具有胞内C末端的跨膜结构域(TMD)(Miguel R et al(2004)Thyroid 14:991-1011)。TSHR260是TSHR的亚结构域，由残基22-260组成及涵盖大多数LRD(Sanders J et al(2007)Thyroid 17:395-410)。TSHR260与全长TSHR示出相似的TRAb结合(Rees Smith B et al(2009)Hormone and Metabolic Research 41:448-455和WO 2010/073012)。
在甲状腺中，TSHR存在于甲状腺滤泡上皮细胞的基底膜上。TSH与TSHR的结合开始激活TSHR信号级联，其包括G蛋白与TSHR的结合，随后刺激环AMP途径及合成甲状腺激素(甲状腺素；T4和三碘甲状腺原氨酸；T3)(Sanders J et al(1997)Ballière's ClinicalEndocrinology and Metabolism.Ed TF Davies 11:451-479；pub Ballière Tindall,London and Latif R et al(2009)Endocrinology和Metabolism Clinics of NorthAmerica 38:319-341)。
自身免疫性甲状腺疾病
自身免疫性甲状腺疾病是最常见的自身免疫疾病之一，发病率为600-1000/100,000(Jacobson DL et al(1997)Clinical Immunology and Immunopathology 84:223-243和Cooper GS et al(2009)Journal of Autoimmunity 33:197-207)。被自身免疫系统靶向的主要甲状腺自身抗原是甲状腺过氧化物酶(TPO)、甲状腺球蛋白(Tg)和TSHR。TPO自身抗体(TPOAb)和甲状腺球蛋白自身抗体(TgAb)在不同形式AITD、包括桥本氏甲状腺炎、Graves'病和产后甲状腺炎(PPT)中是甲状腺自身免疫性的血清学标记(Rees Smith B etal(2007)Thyroid 17:923-938)。TRAb是TSHR自身免疫性、特别是Graves'病的标记。此外，TRAb是Graves'病的病理学原因。有两种主要类型的TRAb：刺激类型和阻断类型(ReesSmith B et al(2007)supra和Rees Smith B et al(2009)supra)。
甲状腺刺激性自身抗体结合TSHR并模拟TSH的作用，从而刺激甲状腺产生高水平T4和T3；这些自身抗体也被描述为具有刺激活性或者TSH激动剂活性的TRAb(Rees Smith Bet al(2007)supra)。甲状腺功能的反馈控制机制在存在甲状腺刺激性自身抗体条件下不再有效，患者呈现出甲状腺功能亢进的临床症状，特征在于血清中存在过量的甲状腺激素及其代谢结果。这种状况称作Graves'病。具有刺激活性的TRAb也可以与TSHR在眶后组织中相互作用，促成Graves'病的眼部症状的发展(Seethalakshimi,I and BahnR(2012)BestPract Res Clin Endocrinol Metab 26:281-289，Rees Smith B,Sanders J andFurmaniak J(2008)Biomarkers Med 2:567-576)。作为有力的甲状腺刺激物的人单克隆自身抗体(hMAb TSHR1；也称作M22)已经在EP 1565493B1中详细描述。M22Fab结合TSHR260的复合物的结构已经通过在分辨率的X射线晶体学解决，如在WO 2008/025991A1中描述。对TSHR260-M22复合物的结构的分析提供了关于参与彼此相互作用的受体和刺激性自身抗体残基的详细信息。
具有强力甲状腺刺激活性的进一步的人单克隆自身抗体(K1-18)在WO 2010/073012中描述。
在AITD患者中阻断类型TRAb比刺激性自身抗体发生频率更低。阻断类型自身抗体结合TSHR，阻止TSH结合受体，但是不具有刺激TSHR活性的能力。因此，甲状腺激素(T4和T3)的形成和分泌被显著降低，具有这种类型TRAb的患者具有甲状腺功能低下的临床症状(甲状腺功能低下症)。阻断类型自身抗体已知是具有阻断活性或者TSH拮抗剂活性的TRAb(Rees Smith B et al(1988)Endocrine Reviews 9:106-121，及Rees Smith B et al(2007)supra)。具有TSH拮抗剂活性的人TSHR自身抗体(5C9)在WO 2008/099185A1中详细描述，进一步的具有强力TSHR阻断活性的人单克隆自身抗体(K1-70)在WO 2010/073012中描述。与TSHR260的复合物中K1-70Fab的结构已经通过X射线晶体学解答，如Sanders P et al(2011)Journal of Molecular Endocrinology 46:81-99所述。TSHR260-K1-70结构示出TSHR与TSHR阻断性自身抗体之间在分子水平的结合排列。对比TSHR260-M22与TSHR260-K1-70结构提供了关于刺激性和阻断性自身抗体与TSHR相互作用中的相似性和差别的独特深入了解(Miguel R et al(2012)Journalof Molecular Endocrinology 49:137-151)。作为与M22而非K1-70形成强力相互作用的关键氨基酸残基而呈现的TSHR-R255与R255在患者血清中对于各种人和动物TSHR抗体和刺激抗体的刺激活性的重要性的报道一致(Sanders J et al(2006)Thyroid 16:1195-1206和WO 2006/016121)。
检测TSHR抗体的方法
在本领域已经充分论证具有刺激或阻断活性的患者TRAb结合TSHRLRD上彼此重叠及与TSH结合位点重叠的区域。然而，在与不同血清中存在的自身抗体接触的TSHR残基中有微小不同(Rees Smith B et al(2007)supra)。也论证了人单克隆自身抗体M22和K1-70在AITD患者中是代表性的TRAb(Sanders J et al(2007)supra，Rees Smith B et al(2009)supra，Evans M et al(2010)Clinical Endocrinology 73:404-412，Miguel etal(2012)supra)。TSHR与TSH和TRAb相互作用的原理已经用于不同的测定中以检测患者TSHR自身抗体。
TRAb的测量在Graves'病及其它甲状腺疾病的诊断和管理中是重要的。目前有四种类型的测定用于测量TRAb：
a)竞争性结合测定，其测量患者血清TRAb抑制TSH或人单克隆TRAb与TSH受体制备物结合的能力；
b)生物测定，其测量TRAb刺激在培养中表达TSH受体的细胞的能力；
c)用TRAb对标记的TSH受体制备物进行免疫沉淀；及
d)桥型测定，其中二价TRAb用一个臂结合包被在ELISA平板孔上的TSHR及用另一臂结合液相TSHR260-碱性磷酸酶融合蛋白(TSHR260-AP)以形成桥。
使用这些测定测量TSH受体自身抗体在如下参考文献中描述：
Sanders J et al(1997)，如前。
Sanders J et al(1999)Journal of Clinical Endocrinology和Metabolism84:3797-3802.
Rees Smith B et al(2004)Thyroid 14:830-835
Rees Smith B et al(2009)，如前。
改良TSHR稳定性的策略
本发明人意识到蛋白质如TSHR和TSHR260具有不佳的稳定性及在纯化期间变性。因此，更具热稳定性的蛋白质如更具热稳定性的TSHR260和全长TSHR具有许多用途，包括：
a)使得可以产生高度纯化的TSHR260和全长TSHR；
b)设计改良的测定法以检测TRAb；
c)使得包含稳定化抗体的高度纯化的TSHR260可以结晶；
d)设计药物，由此无配体TSHR260的结晶体渗透入片段文库中，随后进行X射线晶体学检测以鉴别新的药物支架；
e)设计策略以在TSHR260之外获得具有提高的热稳定性的全长TSHR的区域。
天然蛋白质在其天然环境中足够稳定以发挥功能，但是通常在为工业应用需要的条件范围下不是最佳热稳定性的。蛋白质工程方法、特别是诱变法已经用于改良可溶蛋白质和膜蛋白质的热稳定性。先前的通过诱变改良蛋白质热稳定性的策略涉及如下两种方法之一：(i)检测少量的推理设计的突变，或者(ii)检测大量随机或系统产生的突变(Dodevski I和Plückthun A(2011)Journal of Molecular Biology 408:519-655；Serrano-Vega MJ et al(2008)Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe USA 105:877-882)对于蛋白质的热稳定性作用。
本发明描述了特别导入TSHR中、特别是TSHR260中的突变，通过本发明人的工作鉴别最可能改良热稳定性的突变(表1)：
·在β-折叠中，氨基酸残基的位置和环境在β-折叠的形成和稳定性中起重要作用，极性和非极性残基的周期性对于确定二级结构是重要的(Xiong H et al(1995)Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 92:6349-6353)。优选的β-链的残基周期性是0+0-0+0-，其中“0”是非极性残基如Ile或Thr，“+”是正电残基，优选Arg，“-”是负电残基，优选Asp。
·亮氨酸富集结构域(LRD)具有常规的亮氨酸富集重复(LRR)基序的共有序列LxxLxLxxNxLxxLpxxoFxxLxx，其中“L”是Leu、Ile、Val或Phe，“N”是Asn、Thr、Ser或Cys，“o”是非极性残基，“x”是非保守残基(Matsushima N et al(2010)BMC Microbiology 10:235-245)。可以突变残基以符合这个基序。
·趋于使蛋白质稳定或去稳定的氨基酸已经通过对比在中温和耐热生物体中同源蛋白质的序列或者其蛋白质组的氨基酸组成而计算性鉴别，或者通过测量突变体的热力学性质而实验性鉴别。不同残基根据其在蛋白质表面或者核心(Yokota K et al(2006)Science and Technology of Advanced Materials 7:255-262)或者根据其在二级结构元件中的位置(Xiong H,et al(1995)supra；Vogt G et al(1997)Journal of MolecularBiology 269:631-643；Minor DL和Kim PS(1994)Nature 367:660-663和Minor DL和Kim PS(1994)Nature 371:264)而具有不同的稳定作用。稳定残基包括在表面上的Glu、Lys、Arg和Tyr残基及在核心的Ala；而Gln、Met、Cys和Ser及Asn趋于去稳定(Cambillau C andClaverie J-M(2000)Journal of Biological Chemistry 275:32383-32386；Kim CA和Berg JM(1993)Nature 362:267-270；Kumar S et al(2000)Journal of BiomolecularStructure&Dynamics 17Suppl 1:79-85；Minor D and Kim PS 1994a+b supra；Montanucci L et al(2008)Bioinformatics 24:i190–i195；Pack SP和Yoo YJ(2004)Journal of Biotechnology 111:269-277；Smith CK et al(1994)Biochemistry 33:5510-5517；Szilágy A和Závodsky P(2000)Structure 8:493-504；Vogt G et al(1997)supra；Yokota K et al(2006)supra)。
·耐热生物体与中温生物体相比趋于具有更多的带电荷残基和较少的极性无电荷残基(Cambillau C和Claverie J-M(2000)supra)。离子对的数目和排列在改良蛋白质的热稳定性中起重大作用(Vetriani CDL et al(1998)Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of USA 95:12300-12305；Kumar S et al(2000)supra；Montanucciet al(2008)supra；Szilágy A and Závodsky P(2000)supra)。这或许解释了耐热蛋白质中Glu和Lys的高频率。
·不同生物体中蛋白质同系物共有序列残基的突变可用于鉴别可能的热稳定性突变。这已经用于产生大范围蛋白质包括免疫球蛋白结构域、GroEL小伴侣蛋白(minichaperones)、p53和植酸酶的更具热稳定性的突变体，表观熔点(Tm)从5℃增加至36℃(参见Lehmann M and Wyss M(2001)Current Opinion in Biotechnology 12:371-375的回顾)。
·具有适当主链扭角的残基可以突变为Pro以改良蛋白质的刚性及其稳定性，或者突变为Gly以降低左手螺旋构型中残基的紧张的(strained)扭角(Vielle C and ZiekusGJ(2001)Microbiology和Molecular Biology Reviews65:1-43)。
·计算建模可用于预测突变对于蛋白质的热稳定性的作用，但是获得的结果是可变的。
本发明中描述的改良特别是TSHR及其片段如TSHR260的热稳定性的新策略使用多肽TSHR260(氨基酸残基M22-L260)的推理扫描诱变，其中通过组合推理方法(上述)结合热稳定性测定确定每个残基被突变为另一氨基酸。上述新的策略包括四个步骤：(i)通过PCR定向诱变获得突变体，(ii)通过瞬时转染CHO-K1细胞表达突变体TSHR260，(iii)评估蛋白质表达和热稳定性，(iv)分析在(iii)中鉴别的最稳定的突变体的热稳定性曲线。
组合最具热稳定性的单一突变产生双重、三重、四重、五重和六重TSHR260突变体，这样进一步增加了TSHR260的热稳定性。
发现增加TSHR260的热稳定性的单一和组合突变也增加全长TSHR的热稳定性。
相似地，在TSHR的跨膜结构域(TMD)中鉴别热稳定性突变。将来自最稳定的六重TSHR260突变体的6个突变组合热稳定TMD突变表达为全长TSHR。使用热稳定性曲线分析检测这些全长TSHR突变体的热稳定性，组合在TMD中的最具热稳定性的突变以进一步增加全长TSHR的热稳定性。
具有改良的热稳定性的全长TSHR突变体及其片段可用于检测患者血清中TSHR自身抗体的测定中及可以活性形式纯化。
相关的先前专利申请
在EP 1565493B1中描述的发明提供了关于具有强力刺激活性的人单克隆自身抗体(M22或hMAb TSHR1)的性质及其与TSHR相互作用的详细描述。M22Fab与TSHR LRD之间的相互作用已经在分子水平通过对如WO 2008/025991A1所述两个分子之间的复合物进行X射线衍射分析(分辨率)而揭示。
WO 2006/016121A1揭示了包括至少一个点突变的突变的TSHR制备物，其可用于差示筛选和鉴别患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体及待筛选患者体液样品中的TSH。
具有TSHR阻断活性的小鼠MAb(9D33)的产生和鉴定在WO2004/050708A2中描述。9D33以高亲和性(2×1010L/mol)结合TSHR且是具有刺激或阻断活性的TSH、hMAb TSHR1(M22)和患者血清TRAb的有效拮抗剂。
WO 2008/099185A1揭示了TSHR的人MAb(5C9)的分离和鉴定，其是TSH和患者血清中刺激性TRAb的有效拮抗剂。意外地发现5C9抑制TSHR固有活性，即在检测系统中在不存在促甲状腺激素或M22的条件下通过TSHR的环AMP的产生。此外，已经发现5C9抑制与TSHR激活突变相关的TSHR基础活性(即不存在TSH的活性)的增加。
WO 2010/073012揭示了进一步的来自患者周围血淋巴细胞的具有强力刺激活性的人单克隆自身抗体(K1-18)和是强力TSHR拮抗剂的人单克隆自身抗体(K1-70)的分离和鉴定。K1-18和K1-70具有分别在患者血清中发现的具有刺激性和阻断活性的TRAb的特性。本发明提供了首次证明具有相反活性(刺激活性和阻断活性)的TRAb可以在同一患者血清中同时存在。进一步地，在WO 2010/073012中描述的发明描述了基于桥连原理测量TRAb的一种新测定法，其中二价抗体的一个臂结合包被在ELISA平板孔上的TSHR，另一个臂结合液相TSHR260-碱性磷酸酶，由此形成桥。
发明概述
本发明一般性涉及但不唯一地涉及TSHR，及特别但不唯一地涉及在残基22-260之间的TSHR序列(TSHR260)(图3和4；SEQ ID No:3和4)。本发明另一方面特别涉及TSHR260中的氨基酸突变，特别涉及使用新的推理扫描诱变方法设计氨基酸突变，其中通过组合推理方法确定每个残基均被突变为另一氨基酸。此外，本发明涉及产生和检测众多突变体的高通量方法。本发明的一方面涉及产生特别是但不唯一是含有单一氨基酸突变的TSHR260，特征在于其相对于野生型TSHR260(TSHR260-WT)具有更高的热稳定性。
本发明另一方面涉及设计、产生和检测两个单一氨基酸突变的组合以产生含有双突变的TSHR260。本发明一方面特别但不唯一地涉及含有双突变的TSHR260，特征在于相对于含有单一突变的TSHR260和TSHR260-WT的更高的热稳定性。
本发明另一方面涉及设计、产生和检测特别是但不唯一是含有单一氨基酸突变的三重、四重、五重和六重组合的TSHR260。本发明的这些方面涉及产生特别是但不唯一是突变的TSHR260，特征在于相对于含有较少数目突变的TSHR260及TSHR260-WT的增加的热稳定性。
本发明一方面描述了鉴别未发现的TSHR序列中稳定化突变的一种成功方法，通过推理方法或者计算建模仅选择少数残基进行。
本发明一方面涉及TSHR260的重要生物学活性。所述生物学活性涉及结合TSHR自身抗体、特别是TSHR刺激性人单克隆自身抗体M22的能力。本发明描述了特异的和新的单一、双重、三重、四重、五重和六重突变，通过TSHR260结合M22的能力测量到所述突变增加TSHR260的热稳定性。本发明的这些方面涉及新的突变的TSHR260制备物，其具有增加的热稳定性及保留结合M22及其它TSHR自身抗体的能力。
在本发明的另一方面，令人惊奇地发现增加TSHR260的热稳定性的新的单一和组合突变也增加全长TSHR的热稳定性(图1和2；SEQ ID No:1和2)。全长TSHR中的突变增加TSHR的热稳定性，但是不影响其生物学活性(即刺激TSHR的配体能力)或者其结合TRAb的能力。
本发明再一方面涉及设计和开发检测TSHR自身抗体的改良的方法。在本发明一方面中，特别但不唯一地将在水溶液中稳定的TSHR260制备物以测定试剂盒形式用于结合体液中存在的TSHR自身抗体。在本发明另一方面中，含有稳定化突变的全长TSHR的稳定制备物以测定试剂盒形式用于结合体液中存在的TSHR自身抗体。再一方面，稳定的全长TSHR提供了改良方式以检测应答结合TSH或者TSHR刺激性抗体的TSHR生物活性。这种生物活性可以是但不限于在表达稳定TSHR的细胞系中刺激环AMP产生。
TSHR的稳定制备物的进一步应用可涉及中和AITD患者体液中存在的TSHR自身抗体的新机会。这些应用可以是但不限于将体液与例如稳定的TSHR260制备物或者例如与稳定的全长TSHR制备物在体外或体内接触。此外，比TSHR260含有更少氨基酸的TSHR制备物可以通过相同的突变稳定，如同含有在TSHR260和全长TSHR中间的序列的TSHR制备物。尽管通常优选人TSHR制备物，但是其它物种的TSHR制备物也可以通过相同方式稳定。本发明进一步的方面开启了改良其它相似蛋白质、特别是其它糖蛋白激素受体(FSHR和LHR(图11；分别为SEQ ID No:57和58))的稳定性的新机会。
发明描述
根据本发明的一方面，提供了包含一或多个突变的突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段，其中突变体TSHR与等价的野生型TSHR或片段相比具有增加的热稳定性。所述突变优选是点突变。在下文中，当使用单词“突变体”时是指全长TSHR及其任何片段，如片段TSHR260(图3和4；SEQ ID No:3和4)。热稳定性在下文进一步论述和定义。
适当地，TSHR片段是抗原性片段，特别是保留结合TSHR自身抗体、特别是TSHR刺激性人单克隆自身抗体M22能力的片段。合适的片段包括TSHR260，以及长度更短的序列及在TSHR260和全长TSHR之间的那些序列。TSHR418(残基22-418)是这种片段的另一实例。
在本发明一方面中，通过与全长TSHR相比在突变体中存在的氨基酸数目测量，突变体TSHR或其片段是全长TSHR或者包含全长TSHR长度的至少70或更多、至少80％或更多、或者至少90％或更多。
优选地，所述一或多个突变在TSHR或其片段的胞外亮氨酸富集重复结构域(LRD)内。更优选地，所述一或多个突变在TSHR或其片段的残基22-260(TSHR260)内。
在一个优选的方面，本发明的突变体TSHR或其片段来自哺乳动物物种，特别是来自或者衍生自人TSHR(SEQ ID No:1和2)。然而，可以使用任何其它合适物种，其它的这种物种包括猴、猪、牛、猫、狗、小鼠、大鼠、绵羊或者马TSHR(分别为SEQ ID No:47-56)。
优选地，本发明的突变体TSHR或其片段结合TSHR自身抗体，特别是TSHR自身抗体M22、K1-70或K1-18。
一方面，本发明提供了突变体TSHR或其片段，其中通过在42℃的半衰期确定的突变体的热稳定性(在此进一步定义)是等价野生型TSHR或片段的半衰期的1.5倍高或更高。优选地，通过在42℃的半衰期确定的突变体的热稳定性是等价野生型TSHR或片段的半衰期的1.7倍高、或2倍高、或3倍高、或3.5倍高、或5倍高或更高。上图应用特别是但不唯一是仅包含一个单点突变的突变体。
与等价野生型TSHR或其片段的半衰期相比，突变体TSHR或其片段(如TSHR260)的半衰期在结合测定中适当测量，其确定了在检测温度保留了使抗体或自身抗体结合TSHR的能力的突变体TSHR或其片段(或者等价野生型蛋白)的量。
本发明的突变体TSHR或其片段可包含任何数目的单一点突变，但是优选使用1-6个单一点突变。在本发明优选的方面中，所述突变体含有选自如下任一突变的1、2、3、4、5或6个点突变：P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R和R255Y(图5和6；分别为SEQ ID No:11-25、27-43、45和46)。然而，应理解如果需要可以选择多个上述不同的点突变，本发明的一方面是提供了一种结合测定，其可以确定任何特定点突变或者点突变组合的热稳定性。在本发明一方面中，突变体仅含有一个单一点突变。
另一方面，本发明的突变体TSHR或其片段含有双重点突变(即仅两个单一点突变)。优选地，通过在42℃的半衰期确定的这种双重点突变体的热稳定性是等价野生型TSHR或片段的半衰期的3.5倍、或者5倍、或者7倍、或者9倍或更高。或者，通过在50℃的半衰期确定的这种双重点突变体的热稳定性是等价野生型TSHR或片段的半衰期的3倍、或者5倍、或者6倍、或者8倍或者10倍或者更高。
再一方面，本发明的突变体TSHR或其片段含有三重点突变(即仅三个单一点突变)。优选地，通过在50℃的半衰期确定的这种三重点突变的热稳定性是包含单一点突变I253R的TSHR260突变体(SEQ ID No:45)的半衰期的9倍、或者12倍、或者15倍或更高。包含单一点突变I253R的TSHR260突变体可以与野生型TSHR260(TSHR260-WT)对比，以使得可以在更加热稳定的突变(通常包含多个单一点突变的三个)与野生型TSHR260(为此在更高温度的有意义的半衰期测量是困难的)之间进行对比。TSHR260-I253R改良了热稳定性，在42℃是TSHR260-WT的3.0±0.4倍，及使在42℃的TSHR260半衰期增加了53±6分钟(见例如在表3和7中的数据)。也改良了在50℃的热稳定性，是TSHR260-WT的2.85±0.13倍。
再一方面，本发明的突变体TSHR或其片段含有四重点突变(即仅四个单一点突变)。优选地，通过在50℃的半衰期确定的这种四重点突变体的热稳定性是包含单一点突变I253R的TSHR260突变体的半衰期的20倍、或者30倍、或者50倍或更高。或者，通过在55℃的半衰期确定的这种四重点突变体的热稳定性是包含单一点突变I253R的TSHR260突变体的半衰期的12倍、或者20倍、或者30倍或更高。
再一方面，本发明的突变体TSHR或其片段含有五重点突变(即仅五个单一点突变)。优选地，通过在55℃的半衰期确定的这种五重点突变体的热稳定性是含有单一点突变I253R的TSHR260突变体的半衰期的40倍、或者70倍、或者100倍或更高。
再一方面，本发明的突变体TSHR或其片段含有六重点突变。优选地，通过在55℃的半衰期确定的这种六重点突变体的热稳定性是包含单一点突变I253R的TSHR260突变体的半衰期的500倍、或者750倍、或者900倍或更高。或者，通过在60℃的半衰期确定的这种六重突变体的热稳定性是包含四重点突变I253R+D143P+R112P+D151E(在此称作JMG45(分别为SEQ ID No:45、36、34和37，预测在60℃的热稳定性为TSHR260-WT的174倍))的TSHR260突变体的半衰期的3倍或更高，或者在55℃是包含四重点突变I253R+D143P+R112P+D151E的TSHR260突变体的半衰期的1.2倍或更高。在本发明的任何方面中，如果需要，可以使用全长TSHR突变体。特别优选人、小鼠或猪全长TSHR突变体，其已经示出具有良好的热稳定性。再一方面，本发明的突变体TSHR是全长TSHR突变体，其中通过在50℃的半衰期确定的突变体的热稳定性是等价野生型全长TSHR的半衰期的3倍、或者5倍或更高。
在一个优选的方面，全长TSHR突变体在TSHR的残基22-260(TSHR260)内包含三或更多个点突变。
在本发明一个特别优选的方面，突变体TSHR或其片段由或者基本由TSHR受体的亚结构域TSHR260组成。在本文中“基本由…组成”是指适当地与TSHR260具有至少80％序列相同性，优选90％序列相同性，更优选95％序列相同性。
一方面，本发明的突变体TSHR或其片段优选含有选自如下任何的单一点突变：P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R和R255Y。本领域技术人员应理解“P28E”是指在TSHR的序列位置28的氨基酸脯氨酸(P)突变为谷氨酸(E)等等。
另一方面，本发明的突变体TSHR或其片段含有两个点突变，一个是I253R(SEQ IDNo:45)，另一个是：P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、或R255Y。
另一方面，本发明的突变体TSHR或其片段含有三个点突变，一个是I253R(SEQ IDNo:45)，第二个是D143P(SEQ ID No:36)并且第三个是P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D151E、S166T、P168Y、V169R和N170W之一。
另一方面，本发明的突变体TSHR或其片段含有四个点突变，一个是I253R，第二个是D143P，第三个是R112P(SEQ ID No:34)并且第四个是L59F、H63C、D151E、S166T、V169R和N170W之一。
另一方面，本发明的突变体TSHR或其片段含有五个点突变，一个是I253R，第二个是D143P，第三个是R112P，第四个是D151E(SEQ ID No:37)或者H63C(SEQ ID No:32)并且第五个是L59F、(H63C或D151E)、S166T和V169R之一(分别为SEQ ID No:30、32、37、38和41)。
另一方面，本发明的突变体TSHR或其片段含有六个突变，一个是I253R，第二个是D143P，第三个是R112P，第四个是D151E，第五个是H63C并且第六个是S166T或者V169R。
另一方面，本发明的突变体TSHR或其片段可含有选自如下任何的1、2、3、4、5或6个点突变：P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R和R255Y。
在一个优选的方面，突变体TSHR或其片段由TSHR260组成，等价野生型由野生型TSHR260组成。
本发明的突变体的一个特别优选的特征是当与单克隆TSHR抗体或自身抗体与等价野生型TSHR或片段的结合相比时，相同单克隆TSHR抗体、特别是自身抗体与突变体的结合不受影响或者基本不受影响。
本发明还提供了本发明的突变体TSHR或其片段用于医学中。本发明的突变体具有潜在的众多医学和治疗用途。例如，本发明提供了本发明的突变体TSHR或其片段用于检测TSHR单克隆自身抗体和患者TRAb。本发明还提供了本发明的突变体TSHR或其片段以治疗有效量用于吸收循环中的患者TRAb。
本发明还提供了本发明的突变体TSHR或其片段用于小分子片段筛选以鉴别小分子药物的新支架的用途。
本发明还提供了治疗对象中与TSH受体的免疫反应相关的自身免疫疾病的体外方法，该方法包括将对象的血液样品经过结合了本发明突变体TSHR或其片段的固相柱，及将所述血液中的循环TRAb吸收在所述突变体TSHR或其片段上。
本发明还提供了本发明的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体包含可检测标记。所述标记可以例如是选自酶标记、同位素标记、化学发光标记、荧光标记和染料。这种标记可以任何合适方式加入，例如通过使用合适构建体的基因融合(如下文进一步描述)或者通过化学标记方法加入。本领域技术人员熟知需要的相关技术及合适标记的特性。
在一个优选的方面，所述标记包含碱性磷酸酶(AP)标记或者生物素标记。最优选地，应用碱性磷酸酶标记。
在一个优选的方面，标记的突变体由或者基本由TSHR受体的亚结构域TSHR260组成。某些优选的突变体是由TSHR受体的亚结构域TSHR260和碱性磷酸酶(AP)标记组成的那些，在本文表示为TSHR260-AP-X，其中“X”表示在突变体中的一或多个氨基酸突变。
标记的突变体或其片段可包含本文描述的任一或多个氨基酸点突变。突变可以在进行标记之前或之后导入野生型TSHR或其片段中，这些为本领域技术人员所了解。
本发明还提供了突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段，其在跨膜结构域(TMD)内包含一或多个突变，其中突变体TSHR相对于等价野生型TSHR或片段具有增加的热稳定性。
优选地，通过与全长TSHR相比在突变体中存在的氨基酸数目进行测量，突变体TSHR或其片段是全长TSHR或者包含全长TSHR长度的至少70％或更多、或者至少80％或更多、或者至少90％或更多。
在一个优选的方面，具有一或多个TMD突变的突变体TSHR或片段进一步包含一或多个不在跨膜结构域中的进一步的突变，所述一或多个进一步的突变是如本发明所述突变。根据本发明的方面，所述一或多个进一步的突变可例如在TSHR260亚结构域中。优选地，所述进一步的突变包含至少两个或更多个不在跨膜结构域中的进一步的突变，优选这种突变在TSHR260亚结构域中。
一方面，所述进一步的突变包含六重点突变H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(TSHR-JMG55)(分别为SEQ ID No:32、34、36、37、41和45)。
优选地，本发明提供了突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段，其中在跨膜结构域(TMD)内的一或多个突变相对于仅包含所述不在跨膜结构域中的进一步突变的等价突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段提供了增加的热稳定性。在本文中“等价”突变体促甲状腺激素受体(TSHR)因此等于讨论的突变体，及因此除了在跨膜结构域中缺少任何进一步的突变之外，包含相同的突变。进行必要修正后(mutatis mutandis)，在本说明书中在相似的语境中使用的术语“等价”具有相同的含义。
一方面，本发明提供了在跨膜结构域(TMD)内包含一或多个突变的突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段，其中通过在33℃的半衰期确定的突变体的热稳定性是仅包含所述不在跨膜结构域中的进一步突变的等价TSHR或片段的半衰期的1.2倍或更高、或者1.3倍或更高。
另一方面，本发明提供了在跨膜结构域(TMD)内包含一或多个突变的突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段，其中通过在33℃的半衰期确定的突变体的热稳定性是包含六重突变H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R的TSHR突变体(TSHR-JMG55)的半衰期的1.2倍或更高、或者1.3倍或更高。
优选地，在上述方面中，通过在33℃的半衰期确定的突变体的热稳定性2倍高或更高，或者3倍高或更高，或者5倍高或更高。
热稳定性在下文一般性定义，但是可例如通过分别为图14b、c和d中示出的稳定性测定A、B或C测量。
优选地，本发明的突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段在跨膜结构域(TMD)中含有两个点突变，其中通过如图14d所示稳定性测定C测量的在33℃的半衰期确定的突变体的热稳定性是在跨膜结构域(TMD)中仅包含选自T477I(SEQ ID No:97)、V595I(SEQ IDNo:100)或I648L(SEQ ID No:103)的单一点突变的等价TSHR或片段的半衰期的1.1倍或更高。
在另一优选的方面，本发明的突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段在跨膜结构域(TMD)中含有两个点突变，其中通过图14b和14c分别示出的稳定性测定A或稳定性测定B测量的在55℃的半衰期确定的突变体的热稳定性是在跨膜结构域(TMD)中仅包含选自T477I、V595I或I648L的单一点突变的等价TSHR或片段的半衰期的1.5倍或更高。
优选地，本发明的突变体刺激激素受体(TSHR)或其片段是在TMD中所述两个点突变的至少一个突变选自T477I、V595I和I648L。
优选地，本发明的在跨膜结构域(TMD)内具有突变的突变体TSHR或其片段含有选自如下任何突变的单一点突变：E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、T477I、Q489H、K565L、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671A、Y678L、Y678A(分别为SEQ ID No:89-108)。也可以组合这些突变中的两或更多个突变。
优选地，本发明的在跨膜结构域(TMD)内具有突变的突变体TSHR或其片段含有两个点突变，一个是T477I或V595I或I648L，另一个是选自如下突变的一个不同的突变：E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、T477I、Q489H、K565L、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671A、Y678L、Y678A。
另一方面，本发明还提供了一种纯化包含一或多个突变的突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段的方法，其中突变体TSHR相对于等价野生型TSHR或片段具有增加的热稳定性，所述方法包括：
i)通过柱层析纯化包含所述突变体或其片段的组合物；
ii)收集所述纯化的突变体或其片段。
所述组合物可以是含有待纯化的突变体蛋白质的任何合适的组合物或配制物。例如，其可包含水溶液。其可以包含培养上清，例如衍生自用于产生突变体蛋白质的细胞培养物的上清。
待纯化的突变体TSHR或其片段可以是例如如本文所述本发明的任一突变体TSHR或其片段蛋白。优选地，所述突变体由或者基本由TSHR受体的亚结构域TSHR260组成，及优选也可以包含如下组突变之一：
1)I253R(图5和6；SEQ ID No:27和45)
2)D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:18、27、36和45)
3)R112P+D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、27、34、36和45)
4)R112P+D143P+D151E+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、19、27、34、36、37和45)
5)R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、19、23、27、34、36、37、41和45)
6)H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41和45)
7)H63C+R112P+D143P+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、23、27、32、34、36、41和45)
8)H63C+R112P+D143P+S166T+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、20、27、32、34、36、38和45)。
优选地，柱层析包括离子交换层析如阳离子交换或者阴离子交换层析。可以使用标准的层析设备和流程，这些为本领域技术人员已知。令人惊奇地，我们发现本发明的及本文描述的突变体蛋白质与其野生型等价物不同，事实上由于其增加的热稳定性而可以在上述方式中纯化。这是本发明的一方面。
优选地，本发明的纯化方法在步骤i)之前或之后进一步包括通过亲和性层析纯化包含突变体或其片段的组合物。可以使用任何合适的亲和性层析，但是在优选的方面，所述亲和性层析包括抗体亲和性层析和/或金属离子亲和性层析。可以使用一或者这两种方法。
在一个特别优选的方面，上述本发明的纯化方法包括：
i)通过阳离子交换或者阴离子交换柱层析纯化包含突变体或其片段的组合物；
ii)通过抗体亲和性层析进一步纯化突变体或其片段；
iii)任选地通过金属离子亲和性层析进一步纯化突变体或其片段；
iv)收集纯化的突变体或其片段。
优选地，步骤(ii)中的抗体是结合TSHR胞外结构域内的构象表位的抗体，优选单克隆抗体。可以使用任何合适的抗体。14C4是一个优选的小鼠单克隆抗体。
在一个优选的方面，上述步骤(iii)包括使用镍亲和性层析，但是也可以使用其它合适的金属离子亲和性层析柱。
在另一优选的方面，本发明的纯化方法，其中亲和性层析是抗体亲和性层析，也包括用pH 4.5+/-0.2的洗脱缓冲液洗脱，任选之前用pH 5.0+/-0.2的洗脱缓冲液洗脱。
优选地，在本发明的纯化方法中，突变体由或者基本由TSHR受体的亚结构域TSHR260组成。优选地，突变体包含如下突变组：
H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R
根据本发明的再一方面，突变体TSHR或其片段的纯化不需要与所述突变体或其片段结合或者复合的抗体。本发明提供了稳定性增加的突变体，由此通过纯化可以产生功能性活性蛋白质，而不需要在用与其结合或复合的抗体纯化期间稳定所述突变体或其片段。
在本发明一方面中，特别但不唯一地，将在水溶液中是稳定的TSHR260制备物、特别是TSHR260-JMG55制备物纯化以获得在TSHR260结合ELISA中具有高活性的制备物(图12a示出)。
本发明的具有增加的热稳定性的突变体TSHR蛋白使得可以例如通过本文描述的纯化方法纯化。迄今为止这种活性蛋白质的纯化尚未实现。因此，本发明提供了先前不可获得的纯度和活性水平的TSHR蛋白，包括TSHR260蛋白。这些是新产物。如本文使用，“纯化的”突变体TSHR或其片段是指已经进行至少一个纯化步骤的突变体TSHR或其片段。所述纯化步骤可以是纯化蛋白质的任何合适的纯化步骤，这些对于本领域技术人员是清楚的。例如，可以使用本文描述和请求保护的纯化步骤，但是不除外其它合适的纯化步骤及如果需要可以使用这些纯化步骤。
根据本发明的另一方面，提供了通过本文描述的本发明的纯化方法获得的本文所述的本发明的纯化的突变体TSHR或其片段。所述突变体TSHR或其片段也可以通过本发明的纯化方法获得。也可以使用其它纯化方法产生本发明的纯化的突变体。
在一相关方面，本发明还提供了本文所述的本发明的纯化的突变体TSHR或其片段，特征在于在TSHR活性测定中所述纯化的突变体的活性高于在相同TSHR活性测定中测量的来自培养上清的未纯化的突变体的活性。所述上清优选来自用于表达和分泌突变体蛋白的合适的细胞培养物(如本文所述)。TSHR活性测定可以是任何合适的测定，其能给出被检测的突变体的活性测量值，条件是对于未纯化和纯化的样品使用条件相同的完全一样的测定(即相同的测定)。在此提供了许多合适测定的实例，且这些为本领域技术人员已知。特别合适的测定是在图12a、12d和13c中示出的那些。
TSHR活性测定中的活性可以以任何合适方式表示，例如以活性量/样品体积表示，例如单位/ml。适当地，所述活性是以活性单位/蛋白质数量测量的突变体的比活性，例如单位/mg。
在一个优选的方面，本发明提供了根据本发明的纯化的突变体TSHR或其片段，特征在于在TSHR活性测定中所述纯化的突变体的活性与在相同TSHR活性测定中测量的来自培养上清的未纯化的突变体的活性相比高500倍或更高。事实上，所述活性与在相同TSHR活性测定中测量的来自培养上清的未纯化的突变体的活性相比是1000倍或更高，或者5000倍或更高。优选地，活性以单位/mg蛋白质形式的比活性表示或测量。
优选地，未纯化的突变体的活性是从直接从培养物中收获的未经任何上清稀释或浓缩的培养上清中测量的，但是应理解如果需要可以这样做，当以单位/mg蛋白质的比活性表示时不影响测量的活性。
优选地，TSHR活性测定测量所述突变体结合TSHR抗体或自身抗体的能力。可以使用任何合适的抗体或自身抗体，合适的TSHR自身抗体包括M22、K1-70或K1-18(如本文所述)。
优选地，TSHR活性测定包括待检测的突变体直接或间接结合ELISA平板。优选地，待检测的突变体间接结合或包被在ELISA平板上。例如，这可以使用结合TSHR但是不干扰TSHR自身正常结合的抗体而实现。优选地，抗体是单克隆抗体，其结合TSHR胞外结构域内的构象表位。可以使用任何合适的抗体。14C4是一种优选的小鼠单克隆抗体，但是应理解可以使用其它抗体。
在一个优选的方面，TSHR活性测定包括如图12a或图13c所示的测定。如果其活性待检测的突变体能直接结合ELISA平板，则可以使用在图12d中示出的测定类型。优选地，本发明的纯化的突变体TSHR或其片段由或者基本由TSHR受体的亚结构域TSHR260组成，及包含如下突变组之一：
1)I253R(图5和6；SEQ ID No:27和45)
2)D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:18、27、36和45)
3)R112P+D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、27、34、36和45)
4)R112P+D143P+D151E+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、19、27、34、36、37和45)
5)R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、19、23、27、34、36、37、41和45)
6)H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ IDNo:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41和45)
7)H63C+R112P+D143P+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、23、27、32、34、36、41和45)
8)H63C+R112P+D143P+S166T+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、20、27、32、34、36、38和45)。
在一特别优选的方面，本发明提供了如本文所述根据本发明的纯化的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体包含如下突变：H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41和45)。
根据本发明的纯化的突变体TSHR或其片段也可以包含如本文所述的可检测标记。
本发明还提供了如本文所述根据本发明的突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段，其中突变体或其片段是去糖基化的且保留活性，例如在TSHR活性测定中测量。这种测定的例子在本文中描述，且也涉及纯化的突变体的活性。可以使用任何合适的TSHR活性测定。例如，图12a或13c示出的测定可用于测量活性。所述活性优选是未去糖基化的突变体或其片段的活性的至少70％或更多、至少80％或更多、或者至少90％或更多。在一些情况中，所述活性几乎不减少，或者可以与未去糖基化的突变体或其片段的活性相同或者基本相同。
原则上，去糖基化可用于如本文所述和请求保护的任一突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段，但是我们优选所述突变体包含至少一个双重点突变。要求一定水平的稳定性，及本文描述的性质的检测能确定突变体蛋白在每种情况中在去糖基化之后的活性。我们期望具有至少一个双重点突变或者在一些情况中具有至少三重点突变的突变体能被去糖基化，同时保留足够活性。正如所理解的，去糖基化从蛋白质中除去糖残基，使得更易于结晶。可以使用任何合适的去糖基化方法，一种合适的技术在下文详细描述。
根据本发明的去糖基化的突变体优选由或者基本由TSHR受体的亚结构域TSHR260组成，及包含如下突变组之一：
1)I253R(图5和6；SEQ ID No:27和45)
2)D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:18、27、36和45)
3)R112P+D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、27、34、36和45)
4)R112P+D143P+D151E+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、19、27、34、36、37和45)
5)R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、19、23、27、34、36、37、41和45)
6)H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41和45)
7)H63C+R112P+D143P+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、23、27、32、34、36、41和45)
8)H63C+R112P+D143P+S166T+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、20、27、32、34、36、38和45)。
尽管如上述，去糖基化原则上可用于本文描述和请求保护的任一突变体。
本发明还提供了一种方法、包括诊断方法，用于检测TSHR的分析物自身抗体，所述方法包括将分析物自身抗体的样品与如本文所述本发明的突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段接触。特别优选使用TSHR260突变体，尤其是用碱性磷酸酶标记的那些突变体。特别优选包含点突变H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R的TSHR260(JMG55)。
所述分析物抗体可来自任何合适来源。优选地，分析物自身抗体的样品已经分离自确信含有这种分析物自身抗体的对象。样品可以来自任何物种，包括人，例如人患者血清。适当地，所述样品包括人或动物患者血清。
本发明还提供了一种检测TSHR的分析物自身抗体的方法，包括诊断方法，所述方法包括：
a)提供来自对象的样品，例如体液样品；
b)提供一或多个第一来源的TSHR或其片段；
c)提供一或多个第二来源的TSHR，其中第二来源是根据本发明的突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段；
d)将所述第一和第二来源的TSHR同时或者相继与所述样品例如体液样品接触，从而所述抗体与TSHR形成包含[第一来源的TSHR]-[TSHR抗体]-[第二来源的TSHR]的一或多个复合物；
e)在步骤(d)之前或者同时或者之后，提供固定工具，从而在步骤(d)中形成的复合物中存在的所述第一来源的TSHR在步骤(d)之前或者同时或者之后被固定在固体支持物上；
f)在步骤(d)之前或同时或者之后，提供直接或间接可检测的标记工具，从而在步骤(d)之前或同时或之后，给在步骤(d)形成的复合物中存在的所述第二来源的TSHR提供这种直接或间接标记工具；及
g)根据(e)检测在(d)中形成的复合物的存在，以提供在所述体液样品中存在TSHR抗体的指示。
第一来源TSHR可以是任何合适形式的TSHR(野生型或突变的)，包括全长TSHR或片段，包括TSHR260，但是优选(b)中提供的第一来源TSHR是全长TSHR，包括TSH受体的一或多个表位或者包含TSH受体的一或多个表位的多肽。如果需要，(b)中提供的第一来源TSHR是如本文描述的根据本发明的突变体TSHR或其片段。因此，如果需要，本发明方法中的第一和第二来源TSHR可以是如本文描述和请求保护的根据本发明的突变体TSHR或其片段。
在一个优选的方面，突变体TSHR或其片段由或者基本由TSHR受体的亚结构域TSHR26组成，但是原则上可以是如本文揭示的任何突变体TSHR或其片段。
所述标记工具可包括任何合适的标记第二来源TSHR的工具，合适的工具及其使用方法和用途为本领域技术人员已知。所述标记可例如选自酶标记、同位素标记、化学发光标记、荧光标记和染料。这种标记可以任何合适方式加入，例如使用合适的构建体(如下文进一步描述)通过基因融合或者通过化学标记进行。本领域技术人员熟知所需的相关技术及合适标记的特性。
在一个优选的方面，所述标记包含碱性磷酸酶(AP)标记或者生物素标记。最优选应用碱性磷酸酶标记。
在一个优选的方面，标记的突变体由或者基本由TSHR受体的亚结构域TSHR260组成。某些优选的突变体是由TSHR受体的亚结构域TSHR260和碱性磷酸酶(AP)标记组成的那些，在本文标示为TSHR260-AP-X，其中“X”表示在突变体中的一或多个氨基酸突变。
优选地，所述标记工具包括碱性磷酸酶(AP)标记。
优选地，突变体直接用所述标记工具标记，例如使用碱性磷酸酶(AP)标记或生物素对TSHR260直接化学标记。
在一个优选的方面，将所述第一来源TSHR固定在固体支持物上的固定工具包括单克隆抗体、重组抗体、合成抗体或者其片段。一个实例是抗体4E31(如本文描述)，但是可以使用任何合适抗体。
固体支持物可以是任何合适的支持物，但是优选是平板如ELISA平板，或者ELISA平板孔。
本发明还提供了检测TSHR的分析物自身抗体的试剂盒，所述试剂盒包含：
a)一或多个第一来源TSHR或其片段；
b)一或多个第二来源TSHR，其中第二来源是如本文所述根据本发明的突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段；
c)将所述第一和第二来源TSHR同时或者相继与确信含有TSHR分析物自身抗体的样品接触的工具，从而所述抗体与TSHR形成包含[第一来源的TSHR]-[TSHR抗体]-[第二来源的TSHR]的一或多种复合物；
d)在步骤(c)之前或者同时或者之后，将在步骤(c)形成的复合物中存在的所述第一来源TSHR固定在固体支持物上的固定工具；
e)在所述复合物形成之前或者同时或者之后，直接或者间接标记在(c)形成的复合物中存在的所述第二来源TSHR的可检测标记工具；及
f)检测在(c)形成的复合物存在的工具，以提供所述样品中存在TSHR抗体的指示。
所述试剂盒可例如包含关于相应方法的任一或多个上述特征。
特别地，如果需要，在步骤(a)中提供的第一来源TSHR是如本文所述的根据本发明的突变体TSHR或其片段。本发明试剂盒中的第一和第二来源TSHR因此如果需要则可以是如本文描述和请求保护的根据本发明的突变体TSHR或其片段。本发明还提供了如本文所述的根据本发明的突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段与其直接或间接结合的固体支持物。
优选地，本发明的固体支持物结合由或者基本由TSHR受体的亚结构域TSHR260组成的突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段。
在一个优选的方面，本发明的固体支持物结合包含如下突变组之一的突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段：
1)I253R(图5和6；SEQ ID No:27和45)
2)D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:18、27、36和45)
3)R112P+D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、27、34、36和45)
4)R112P+D143P+D151E+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、19、27、34、36、37和45)
5)R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、19、23、27、34、36、37、41和45)
6)H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41和45)
7)H63C+R112P+D143P+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、23、27、32、34、36、41和45)
8)H63C+R112P+D143P+S166T+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、20、27、32、34、36、38和45)。
本发明因此提供了直接包被在ELISA平板孔上的稳定的纯化的TSHR260突变体、特别是TSHR260-JMG55在检测TSHR单克隆自身抗体和患者血清TRAb中的应用。如果需要，这种突变体可包含可检测的标记如碱性磷酸酶(AP)标记。
适当地，所述突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段直接结合所述固体支持物。
在一个优选的方面，所述支持物是包含一或多个孔的ELISA平板。
本发明还提供了包含本发明的固体支持物的试剂盒。
本发明还提供了本发明的固体支持物或者包含所述固体支持物的本发明的试剂盒在检测TSHR单克隆自身抗体或者患者TRAb中的应用。
附图描述
通过参考仅举例的附图1-30描述本发明的TSHR分子和方法，其中：
图1示出人(野生型)TSHR的DNA序列(SEQ ID No:1)。
图2示出人(野生型)TSHR的氨基酸序列(SEQ ID No:2)。
图3示出人(野生型)TSHR260片段的DNA序列(SEQ ID No:3)。
图4示出人(野生型)TSHR260片段的氨基酸序列(SEQ ID No:4)。
图5示出热稳定的TSHR单一突变的DNA序列(SEQ ID No:11-28)。
图6示出热稳定的TSHR单一突变的氨基酸序列(SEQ ID No:29-46)。
图7示出在(a)42℃、(b)50℃、(c)50℃、(d)55℃和(e)60℃加热的TSHR260突变体的TSHR260热稳定性测定结果的五个代表性实例。
图8示出通过在50℃在14C4Fab2平板上加热的全长TSHR突变体的热稳定性。
图9示例了动画形式的TSHR260结构域并示出在条状构象中最具热稳定性的突变的天然残基的位置。
图10示出来自人、黑长尾猴、猕猴、猪、牛、猫、狗、小鼠、大鼠、绵羊、马的TSHR氨基酸序列(分别为SEQ ID No:2、47-56)的比对。
图11示出人TSHR氨基酸序列与人FSHR和人LHR(分别为SEQ IDNo:2、57和58)的比对。
图12示出涉及TSHR260的测定图示：(a)TSHR260-结合测定；(b)TSHR260热稳定性测定；(c)M22-POD结合TSHR260的抑制及(d)TSHR260-JMG55包被的ELISA平板孔测定。
图13示出涉及TSHR260-AP的测定图示：(a)TSHR260-AP桥连ELISA；(b)TSHR260-AP热稳定性测定及(c)TSHR260-AP桥连抑制性ELISA。
图14示出涉及TSHR的测定图示：(a)TSHR结合测定；(b)TSHR稳定性测定A；(c)TSHR稳定性测定B；(d)TSHR稳定性测定C及(e)M22-POD结合TSHR的抑制。
图15示出TSHR260-AP的DNA序列(SEQ ID No:59)。
图16示出TSHR260-AP的氨基酸序列(SEQ ID No:60)。
图17示出猪(野生型)TSHR的DNA序列(SEQ ID No:61)。
图18示出猪(野生型)TSHR的氨基酸序列(SEQ ID No:62)。
图19示出小鼠(野生型)TSHR的DNA序列(SEQ ID No:63)。
图20示出小鼠(野生型)TSHR的氨基酸序列(SEQ ID No:64)。
图21示出猪(突变的)TSHR的DNA序列(SEQ ID No:65)。
图22示出猪(突变的)TSHR的氨基酸序列(SEQ ID No:66)。
图23示出小鼠(突变的)TSHR的DNA序列(SEQ ID No:67)。
图24示出小鼠(突变的)TSHR的氨基酸序列(SEQ ID No:68)。
图25示出通过图13(c)示例的桥连抑制ELISA测定测量的如下的活性：在Streamline DEAE或者层流HST基质上纯化的(a)TSHR260(野生型)、(b)TSHR260(野生型)复合14C4IgG、(c)TSHR260(野生型)复合25E1IgG、(d)TSHR260(野生型)复合2H11IgG、(e)TSHR260(野生型)复合23H4IgG、(f)TSHR260(野生型)复合36F11IgG、(g)TSHR260(野生型)复合9B7IgG及(h)TSHR260-JMG55的加样和洗脱集合。
图26示出在层流HST纯化的TSHR260-JMG55的14C4亲和性层析之后洗脱级分中TSHR260-JMG55活性的分布。
图27示出纯化的TSHR260-JMG55-5.0(低比活性)和纯化的TSHR260-JMG55-4.5(高比活性)在3轮柱纯化(层流HST，14C4-亲和性和镍亲和性层析)之后的染色的12％非还原的SDS-PAGE凝胶。泳道1：分子量标记；泳道2：TSHR260(野生型)培养上清对照；泳道3：昆虫细胞培养基对照；泳道4：纯化的TSHR260-JMG55-5.0(2.4μg)和泳道5：纯化的TSHR260-JMG55-4.5(3.0μg)。
图28示出使用不同浓度的内切糖苷酶F3对纯化的TSHR260-JMG55-4.5的去糖基化(染色的12％非还原的SDS-PAGE凝胶)。(A)泳道1：分子量标记；泳道2：昆虫细胞培养基阴性对照；泳道3：镍亲和性纯化的TSHR260-JMG55-4.5(未处理的)；泳道4-6：在分别保温24h、72h和120h后的40mU内切糖苷酶F3/mg的TSHR260-JMG55-4.5；泳道7-9：在分别保温24h、72h和120h之后的0mU内切糖苷酶F3/mg的TSHR260-JMG55-4.5。(B)泳道1：分子量标记；泳道2：昆虫细胞培养基阴性对照；泳道3：镍亲和性纯化的TSHR260-JMG55-4.5(未处理的)；泳道4-6：在分别保温24h、72h和120h之后的60mU内切糖苷酶F3/mg的TSHR260-JMG55-4.5；泳道7-9：在分别保温24h、72h和120h之后的80mU内切糖苷酶F3/mg的TSHR260-JMG55-4.5。
图29示出在TSHR-JMG55的TMD中产生的热稳定性单一氨基酸突变的DNA序列(SEQID No:69-88)。
图30示出在TSHR-JMG55的TMD中产生的热稳定性单一氨基酸突变的氨基酸序列(SEQ ID No:89-108)。
方法
TSHR260突变的计算建模
使用Calculate Mutation Energy Stability方案由Discovery studios v3.5(Accelrys Software Inc,Accelrys Ltd,Cambridge,CB4 0WN,UK)进行计算建模。TSHR260-M22Fab复合物(PDB code:3G04；得自RCSB Protein Databank www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝3go4)的晶体结构用作所有突变的起始模型以保证选择不破坏M22与TSHR260结合的突变。TSHR260结构中的每个残基均被突变为其它19个可能的氨基酸的每一个并收集和比较突变能量数据。
所述计算建模数据联合其它预测的稳定突变一起使用以评估在每个位置最可能稳定的靶残基。这些其它的预测基于许多因素：
1.预测对于Pro或Gly氨基酸有利构象的残基的扭角，
2.来自其它生物体和其它糖蛋白的TSHR的共有序列，
3.LRR和/或β-折叠中残基的位置，
4.蛋白质表面或核心中残基的位置。
引物设计
使用PrimerX网站(www.bioinformatics.org/primerx/index.htm)设计引物以将点突变导入TSHR260中。使用基于蛋白质的引物设计选项，使用QuikChange SDM方案及选择引物对，由此其突出端在2-10个残基之间。引物的解链温度在73℃-84℃之间(理想地高于76℃)，长度为27-49个残基对，GC含量为33％-70％(理想地高于40％)。引物在96孔形式中的Sigma Genosys,Haverhill,CB9 8QP,UK的10μM水溶液中。
诱变、质粒DNA制备和纯化
使用全长人TSHR作为模板，预先扩增TSHR260-6His模板构建体(编码人TSHR的1-260位氨基酸；见图3(SEQ ID No:3)和4(SEQ ID No:4)分别为野生型TSHR 260的核苷酸序列和氨基酸序列(Oda Y et al(1998)Journal of Molecular Endocrinology 20:233-244)，在C末端加入6-组氨酸标记。使用两个引物5'-cactgcaggatccaaatgaggccggcggacttg-3'(SEQ ID No:5)和5'-cagtcctctagattatcagtgatggtggtggtgatggttaagagtccaggtgttcttgctat-3'(SEQ ID No:6)从全长TSHR扩增TSHR的残基1-260，这样在人TSHR氨基酸1-260的N末端加入BamHI限制位点及在C末端加入一个氨基酸接头(Asn)、一个6组氨酸标记、一个终止密码子及一个XbaI限制位点。使用BamHI和XbaI限制位点将所述PCR产物克隆进pcDNA3.1+中。
根据QuikChange II方法(Agilent Technologies UK Ltd,Stockport,SK8 3GR)，使用聚合酶链反应(PCR)通过定向诱变产生TSHR260序列中的突变(图5；SEQ ID No:11-28，图6；SEQ ID No:29-46)。在96孔平板中使用KOD热(hot)起始聚合酶试剂盒(Novagen fromVWR International,Lutterworth,LE17 4XN,UK)进行诱变。使用TSHR260-6His作为模板或者载体pcDNA3.1+中的合适的TSHR260突变体，建立50μL PCR反应以便在每个反应中的终浓度为：1×KOD缓冲液，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO4，0.02U/μL KOD热起始聚合酶，9％v/v DMSO(Sigma Aldrich,Poole,BH12 4QH)，0.2ng/μL模板DNA，0.3μM正向引物及0.3μM反向引物。运行如下PCR程序：2分钟在94℃变性；18次在94℃变性15秒、在68℃退火1分钟及在68℃延伸8分钟的循环；随后是在68℃延伸7分钟的最终步骤。模板通过与2μL DpnI(FisherScientific,Loughborough,LE11 5RG)在37℃保温至少3小时而被消化。
将1μL的PCR反应物加入在1.5mL微管或者96孔细胞培养簇圆底平板(Nunc A/S,Roskilde,Denmark)中的30μL XL1blue感受态细胞中，在冰上保温30分钟。将细胞在42℃热休克90秒，转移至冰上并加入200μL Luria Broth(LB)培养基。将细胞在37℃保温1小时，之后涂抹在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB琼脂平板上。当同时进行超过30个转化时，使用将含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB琼脂注入具有48格的Q-tray平板(MolecularDimensions,Newmarket,CB8 7SQ,UK)。将平板在37℃保温过夜以使得集落生长。
挑选每个转化的两个集落并在15mL Falcon管或者24孔深孔模块(Promega UKLtd,Southampton,SO16 7NS,UK)中具有100μg/mL氨苄青霉素的7mL LB培养基中在37℃生长过夜。使用Qiagen PlasmidPlus 96Miniprep Kit(Qiagen Ltd,Manchester,M15 6SH,UK)或者Wizard PlusMiniprep DNA纯化系统(Promega)从过夜培养物的细胞团块中提取质粒DNA，突变的TSHR260cDNA通过Source Bioscience(Cambridge,CB4 0WU,UK)测序以证实存在希望的突变。在将甘油(14％终浓度)加入等份过夜培养物中后，将含有突变体TSHR260-6His的大肠杆菌菌株原种在-70℃维持。
使用PCR在全长人TSHR序列中导入特定氨基酸突变
使用BamHI和XhoI限制位点根据标准克隆方法，将TSHR全长核苷酸序列(Oda Y etal(1998)如前)克隆进pcDNA5.1/FRT载体(Invitrogen)中。使用如上文针对TSHR260突变描述的QuikChange II方法通过定向诱变在全长序列中产生突变，不同的是在0.2mL PCR管中而不是在96孔平板中进行诱变。如上文针对TSHR260PCR产物所述对PCR反应进行转化、扩展及通过测序证实突变。见图1(SEQ ID No:1)和2(SEQ ID No:2)分别示出全长野生型TSHR的核苷酸序列和氨基酸序列。
使用Freestyle Max试剂在CHO-K1细胞中瞬时转染TSHR260突变体
在转染前一天，将1.5×105CHO-K1细胞/孔铺板于24孔细胞培养平板(Nunc)中。对于待转染的每个孔，将在pcDNA3.1+中的5μL TSHR260-6His突变体(0.2μg/μL)与20μLOptipro SFM(Life Technologies,Paisley,PA4 9RF,UK)混合。将在22.5μL Optipro SFM中稀释的2.5μL Freestyle Max试剂(Life Technologies)加入每个DNA/Optipro SFM混合物中，在室温保温10-20分钟。将40μL DNA/Freestyle Max混合物加入在24孔平板中的CHO-K1中，在37℃保温40-48小时。之后收获分泌进培养基中的表达的TSHR蛋白，通过在13000rpm离心2分钟除去细胞碎片并将上清在-70℃贮存。
通过用在pcDNA3.1+中的TSHR260-6His转染在80cm2培养瓶中含有的90％铺满的CHO-K1细胞产生TSHR260-WT标准物。将20μL在pcDNA3.1+中的TSHR260-6His(1μg/μL)加入480μL Optipro SFM(Life Technologies)中。将在450μL Optipro SFM中稀释的50μLFreestyle Max试剂(Life Technologies)加入DNA/Optipro SFM混合物中，在室温保温10-20分钟。将1mL DNA/Freestyle Max混合物加入80cm2培养瓶中的CHO-K1细胞中，在37℃保温40-48小时。之后收获分泌进培养基中的表达的TSHR260-6His蛋白，通过在3000rpm离心30分钟除去细胞碎片，并将上清在-70℃贮存。将此规定为100U/mL。进一步地，将TSHR260-WT标准物样品稀释至与第一TSHR260-WT标准物相同的浓度，如在TSHR260结合测定中(见下文)检测。
使用Flp-In系统在CHO细胞中转染全长TSHR构建体
使用Flp-In-CHO细胞的汇合瓶(Invitrogen,Paisley,PA4 9RF,UK；O'Gorman,S.,Fox,D.T.,and Wahl,G.M.(1991)Science 251:1351-1355)种植24孔平板孔，密度为在DMEM(Invitrogen)、10％胎牛血清(FCS)(Invitrogen)、1×L-谷氨酰胺(Invitrogen)和1×非必需氨基酸(NEAA)(Invitrogen)及无抗生素中1×105–1.5×105细胞/孔。将细胞在37℃、5％CO2和>95％湿度条件下保温过夜。
将pcDNA5.1/FRT TSHR DNA(如上述)和pOG44DNA(Invitrogen)稀释以提供分别为在无菌水中0.01μg/mL和0.1μg/mL的溶液。将pOG44DNA和TSHR DNA以3种不同浓度混合：(1)9μL pOG44，10μL TSHR DNA和31μL optimem I(Invitrogen)；(2)8μL pOG44，20μL TSHRDNA和22μLoptimem I；(3)9.5μL pOG44，5μL TSHR DNA和35.5μL Optimem I，并在室温下保温5分钟。将50μL在optimem I中1:25稀释的lipofectamine(Invitrogen)加入每个管(上述1-3)，在室温保温20分钟。然后将每个保温混合物加入具有95％铺满的Flp-In-CHO细胞的1个孔中(在24孔平板中)，在上述条件下保温过夜。然后除去培养基并更换为DMEM、10％FCS、1×L-谷氨酰胺、1×NEAA和1×青霉素(100u/mL)/链霉素(100μg/mL)(Invitrogen)，继续保温过夜。然后使用1×胰蛋白酶/EDTA溶液(Invitrogen)将细胞从孔中分离并分入4个新孔中，加入600μg/mL潮霉素(Invitrogen)在如上的培养基中生长。
用pOG44质粒DNA和pcDNA5.1/FRT TSHR转染的细胞能将TSHR插入Flp-In-CHO细胞基因组中并赋予细胞潮霉素抗性，由此细胞能在潮霉素选择培养基中生长。设计Invitrogen的Flp-In系统，由此本发明构建体中的TSHR通过pOG44被插入Flp-In-CHO细胞中FRT位点。Flp-In-CHO细胞含有一个Flp-In位点/细胞，因此在每个实验中TSHR DNA被插入基因组中相同位置，以1个拷贝/细胞存在。这个系统具有不需要筛选具有最佳表达水平的细胞集落(随后进行细胞克隆以发现稳定细胞系)的优势。因此，在潮霉素选择培养基中生长的表达突变的TSHR的细胞可以迅速扩展并用于不同测定中。
用于TSHR260结合测定中的抗体
14C4
在TSHR260结合测定中使用的14C4TSHR小鼠单克隆抗体通过cDNA免疫制备。简而言之，为6-8周龄的NMRI(远系杂交)小鼠肌肉注射100μL的10μM心脏毒素，5天后肌肉免疫100μg全长TSHR cDNA(pRC/CMVhTSHR；Oda et al(1998)如前)。间隔3周重复进行TSHR DNA免疫，共进行5次注射(Hasan et al(1999)J.Immunol.Methods 229:1-22)。通过125I标记的TSH结合TSHR的抑制情况检测小鼠血液中TSHR抗体的存在情况(由RSR Ltd,Cardiff,UK制定的测定法)。使用在血清中具有最高TSHR抗体滴度的小鼠的脾细胞产生单克隆抗体。将分离的脾细胞以1:2比率与小鼠骨髓瘤细胞系(X63_Ag8.653；ECACC Porton Down,UK)混合并使用10％DMSO和50％PEG(Sigma Aldrich,Poole,UK)根据先前描述的方法融合(de StGroth,S.F.,&Scheidegger,D.(1980).Journal of immunological methods35,1-21.)。将细胞在DMEM(补加含有HAT的20％胎牛血清以选择杂交体)中培养并铺板于48孔平板中。为获得14C4，通过对125I-TSH标记的TSHR复合物进行免疫沉淀筛选细胞培养物上清中TSHR抗体。在这些测定中，全长TSHR用125I-TSH标记以形成125I-TSH-TSHR复合物。125I-TSH-TSHR复合物由能结合TSHR的抗体及TSH同时结合。然后可以使用标准PEG沉淀技术沉淀复合物并测量沉淀物中的放射性。将来自阳性孔的细胞通过限制稀释再克隆两次以获得表达需要的单克隆抗体的克隆。14C4 IgG结合TSHR凸面上的构象表位，使得TSH或者患者TRAb同时结合TSHR的凸面。14C4可得自RSR Ltd,Cardiff,UK(www.rsrltd.com)。
M22蛋白质数据库(PDB)收录号3G04
(www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝3go4)
M22(hMAb TSHR1)是人甲状腺刺激性单克隆自身抗体，其得自Graves’病患者的周围血淋巴细胞(Sanders et al(2003)Lancet 362:126-128)。简而言之，从具有甲状腺功能亢进和高水平TSHR自身抗体(由于Graves’病所致)的19岁男性患者的20mL周围血中分离淋巴细胞。使用标准技术将淋巴细胞用Epstein Barr病毒感染并与小鼠/人杂交细胞系(K6H6/B5；ECACC,Porton Down,UK)融合(Hayakawa N et al(2002)Autoimmunity 35:343-55)。将细胞铺板于48孔平板上，通过125I-TSH结合TSHR包被试管的抑制情况筛选上清(根据RSR Ltd,Cardiff,UK的测定法)。然后将阳性孔细胞通过限制稀释再克隆直至分离出产生高浓度TSHR自身抗体M22的单一集落。M22(hMAb TSHR1)在本领域是熟知的，如WHO 2ndInternational Standard for Thyroid Stimulating Antibody NIBSC code:08/204(Burns C et al(2010)WHO International Collaborative Study of the proposed2ndInternational Standard for Thyroid Stimulating Antibody,Expert Committee onBiological Standardization,Geneva 18to 22October 2010,WHO/BS/10.214,Availableat:www.who.int/biologicals/_committee/_2142_Thyroid__y.pdf)所述。M22(hMAbTSHR1)可购自RSR Ltd,Cardiff,UK(如前)。
热稳定性
在本发明中，热稳定性通常是指突变体TSHR或其片段(如TSHR260突变体)在暴露于指定温度指定时间之后保留其正常生物学活性的能力。适当地，这可以通过在温度暴露之后保留的活性突变体蛋白质的百分比而确定。活性突变体蛋白的量的一种合适测量是在结合测定中保留将抗体或自身抗体结合TSHR的能力的突变体蛋白质的百分比。在暴露于指定温度之后剩余的活性突变体蛋白质的量因此可以根据被测量为时间的函数及在该温度获得的热稳定性曲线，例如图7示出。因此可推算突变体蛋白质的半衰期-即活性蛋白质的量降至其初始值50％(即50％失活或变性)所用的时间。突变体蛋白质的半衰期提供了蛋白质的热稳定性的一种便利的定量测量，且可以将该半衰期与等价的非突变的TSHR或其片段(即野生型TSHR或其片段如野生型TSHR260)的半衰期进行对比，以评估是否存在热稳定性的增加或降低。
合适的结合测定可例如包含待检测的突变体TSHR或其片段与其结合的平板和标记的TSHR抗体或自身抗体，及这种测定法组成了本发明的一部分。待检测的突变体与平板适当地结合，由此不干扰该抗体与突变体蛋白质的结合。可以使用任何合适的抗体使突变体例如与平板结合，一种这样的抗体是如上述14C4。结合的标记的抗体的量可用于表示活性突变体蛋白质的量，这将为本领域技术人员了解。优选地，应用标记的TSHR单克隆自身抗体如M22(如上述)结合被测定的突变体蛋白质。这种测定的原理例如在图12a和12b、图13a和13b及图14a、b、c和d中示出。在如上图示出的测定的具体细节变化时，在每种情况中突变体蛋白质的热稳定性可以通过测量保留抗体或自身抗体(如M22)结合TSHR能力的蛋白质的量以对比突变体蛋白质与野生型而获得。
在本发明中，术语“热稳定性”和“热稳定的”(及所有相关术语如“增加的热稳定性”)在数量含义方面应理解是指，与等价野生型TSHR或其片段的半衰期相比，在结合测定中在相同条件下测量的突变体TSHR或其片段(如TSHR260)的半衰期，所述测定确定了在测试温度下保留结合TSHR抗体或自身抗体能力的突变体TSHR或其片段(或等价野生型蛋白质)的量。优选地，用于检测突变体的这种结合能力的自身抗体是M22、K1-70或K1-18。
可以使用可以确定如上述突变体TSHR或其片段的半衰期的任何合适的结合测定。对于本发明，我们应用这种类型的特异结合测定，这些在下文充分描述。这些结合测定原则上可以用于确定任何突变体TSHR或片段(无论是全长、TSHR260或者长度比TSHR260更短或更长的序列)的热稳定性。
对于TSHR的片段如TSHR260突变体，我们使用下文描述的热稳定性方案和TSHR260结合测定法确定热稳定性。虽然本发明主要关于TSHR260突变体已经进行了描述，但是应理解所述热稳定性方案和结合测定可以相同方式用于不同序列长度的其它TSHR片段。
关于全长TSHR和全长突变体，我们使用相似的但是经修改的结合测定，如下文“包 被在14C4-Fab 2 ELISA平板上的全长TSHR和突变体的热稳定性”和“全长TSHR突变体的热稳 定性”所述。在这个测定中，主要差别是在加热至检测温度之前使全长样品结合平板。
TSHR260结合测定
将Maxisorp 96-孔ELISA平板(Nunc)孔用150μL等份的在包被缓冲液(15mMNa2CO3，35mM NaHCO3，1.5mM NaN3，0.01g/L Phenol Red，pH9.2)中的1μg/mL 14C4Fab2(Jeffreys J et al(2002)Thyroid 12:1051-1061和Sanders J et al(2007)supra)包被，在室温保温3小时，然后在4℃过夜。将孔用洗涤缓冲液(50mM NaCl；20mM Tris pH 7.8；1％v/v Triton X-100)洗涤3次并将150μL检测样品(收获自瞬时转染的CHO-K1细胞的TSHR260-6His)用于每孔中，在室温保温1小时以使得TSHR260结合14C4-Fab2。然后洗涤孔并与75μL测定缓冲液(50mM NaCl，20mM Tris pH7.8，1％v/v Triton X-100，1g/L BSA，50mg/L正常小鼠IgG)和75μL健康血液提供者血清集合(NPS)在ELISA平板振荡器上以500次振荡/分钟频率在室温保温1小时。之后倒空孔中的内容物，洗涤孔并在每孔中加入100μL的M22Fab-过氧化物酶缀合物(M22-POD,RSR Ltd,Cardiff,CF238HE,UK)。在室温不振荡保温25分钟后，再次洗涤平板孔，随后加入100μL四甲基联苯胺，在室温不振荡进一步保温25分钟。通过加入50μL的0.5MH2SO4终止反应，在ELISA平板读数器上在450nm读取每个孔的吸光度(图12a)。
结合和稳定性筛选
将从瞬时转染的CHO-K1细胞收获的TSHR260-6His样品在CHO-K1培养基((-)DMEM，10％FBS，2×谷胱甘肽，1×Pen/Strep，1×NEAA)中1/4稀释。对于每个样品，将100μL等份在42℃加热30分钟，同时另一个相同样品保持在冰上。然后将样品在TAT缓冲液(50mM NaCl，10mM Tris pH7.8，1％v/v Triton X-100，1g/L BSA，0.2g/L叠氮化钠)中1/5稀释，将150μL等份一式两份用于TSHR260结合测定(图12a)，如上所述进行。检测的TSHR蛋白的量(见上述TSHR260结合测定)表示为：i)与TSHR260-WT标准物的百分比及ii)在加热后剩余的活性TSHR蛋白的分数(fraction)。将其与在加热后剩余的TSHR260-WT标准物的分数对比，作为与TSHR260-WT标准物稳定性的百分比提供突变体稳定性。在检测的活性TSHR蛋白的量太高或太低而难以精确确定时，在不同稀释度的TSHR260突变体重复进行结合测定。
TSHR260突变体的热稳定性
将如上述在CHO-K1细胞中瞬时表达及从上清中收获的TSHR260突变体在CHO-K1培养基中稀释为25％TSHR260-WT标准物(见上述)。将100μL等份在37℃加热0-30天或者在42℃、50℃、55℃或60℃加热0-3小时。然后将样品在TAT缓冲液(87.5μL样品+350μL TAT缓冲液)中1/5稀释，将150μL等份一式两份应用于上述TSHR260结合测定(图12b)。将测定数据根据时间绘图并拟合为指数曲线，计算突变体的半衰期(t1/2)并与TSHR260-WT、TSHR260-I253R或TSHR260-JMG45对比(在表5中定义)。
确定表达的TSHR总量(活性加上无活性)的斑点印迹测定
TSHR260突变体的表达水平通过斑点印迹测定使用Bio-Dot MicrofiltrationApparatus(Bio-Rad Laboratories Ltd,Hemel Hempstead,HP2 7DX,UK)确定。将从如上述转染的细胞培养物收获的50μL等份的TSHR260-6His制备物应用于Bio-Dot装置中并使其通过重力流动进入硝酸纤维素膜。样品与50μL磷酸盐缓冲盐水(PBS，8g/L NaCl，1.15g/L磷酸氢二钠，0.2g/L磷酸二氢钾，0.2g/L氯化钾，pH7.4)一起通过重力流动。然后，将在膜上的样品用400μL洗涤缓冲液(在PBS中0.5％(v/v)Tween)洗涤，用真空将洗涤缓冲液从膜中吸除。然后将膜从Bio-Dot装置移出，通过与在PBS中的0.1mg/L聚醋酸乙烯酯轻微振荡保温1分钟而封闭。将膜用洗涤缓冲液(3次3分钟，室温，振荡)洗涤并与在抗体缓冲液(180g/L D-葡萄糖，10％(v/v)胎牛血清，10％(v/v)～87％甘油，于PBS中0.5％(v/v)Tween)中稀释的一级抗体TSHR单克隆抗体18C5-IgG(0.01mg/mL)或8E2-IgG(0.02mg/mL)(Jeffreys J et al(2002)如前)在室温振荡保温1小时。将膜用洗涤缓冲液(3次3分钟，室温，振荡)再次洗涤，之后将其与在PBS中的二抗山羊抗小鼠HRP(0.04μg/mL，Sigma)在室温振荡保温1小时。在将膜用洗涤缓冲液(3次3分钟，室温，振荡)再次洗涤之后，将膜与化学发光底物Super SignalWest Pico Stable Peroxide(ThermoScientific)和Super Signal West Pico LuminalEnhancer(ThermoScientific)一起保温。
18C5-IgG和8E2-IgG结合TSHR260的线性表位，因此其结合不受TSHR蛋白质解折叠的影响。18C5-IgG识别由TSHR残基246-260形成的线性表位，而8E2-IgG结合在TSHR260的N末端上残基36-42形成的线性表位。使用两种抗体组合使得可以检测印迹上的TSHR260，而无论在诱变后TSHR蛋白质折叠中的潜在改变如何(即检测活性加上非活性TSHR)。
包被在14C4-Fab2ELISA平板上的全长TSHR和突变体的热稳定性
为了检测全长野生型TSHR和突变的TSHR(JMG37，JMG45和JMG52)“在平板上”稳定性，如下所述包被96孔Maxisorp ELISA平板(Nunc)。将14C4Fab2在包被缓冲液中稀释为1μg/mL并将150μL等份于96孔ELISA平板的每个孔中。将其在室温保温3小时，随后在4℃保温过夜。将ELISA平板孔用洗涤缓冲液洗涤3次以除去任何未结合的抗体。取在-80℃保存的野生型和突变的TSHR样品，使其在室温解冻并置于冰上(0℃)。然后将TSHR样品在TAT缓冲液中稀释。将150μL每种稀释液移液进四个ELISA平板孔中，在4℃保温过夜。将平板用洗涤缓冲液洗涤3次以除去与14C4Fab2未结合的任何TSHR。将TAT缓冲液加入每个孔中(150μL)，然后使用胶板盖密封孔。将每个平板置于保温仪中，设定为42℃或50℃。在5、10、15、20、30、45、60、90、120和180分钟后从每个平板中取出96孔平板的一条(8个孔)，插入备用ELISA平板架，然后在冰上保持。在180分钟后，从ELISA孔中抽吸受体稀释缓冲液。
然后在每个孔中加入测定缓冲液(75μL)，随后加入健康血液供体血清混合液(75μL)，在室温(20-25℃)在ELISA平板振荡器上以500次振荡/分钟的频率保温1小时。倒出孔内容物，将孔用洗涤缓冲液洗涤一次，在每个孔中加入100μL的M22-POD(RSR Ltd)。在室温不振荡保温25分钟之后，将平板孔用洗涤缓冲液洗涤两次，然后用水洗涤一次。然后在每个孔中加入100μL四甲基联苯胺并保温25分钟。使用50μl 0.5M H2SO4终止反应并在ELISA平板读数器上在450nm读取每个孔的吸光度(稳定性测定A，图14b)。
结合TSHR260和全长TSHR突变体的M22-POD、K1-18-POD和K1-70-POD
将Maxisorp ELISA平板(Nunc)孔用150μL等份的在包被缓冲液中的1μg/mL14C4Fab2包被，在室温保温3小时，然后在4℃过夜。将TSHR260突变体在CHO-K1培养基中稀释，然后在TAT缓冲液中1/5稀释。或者，将全长TSHR突变体在TAT缓冲液中稀释。洗涤孔并将150μL TSHR260或全长TSHR检测样品应用于每个孔，在室温保温1小时以使得TSHR260或全长TSHR结合14C4-Fab2。然后洗涤孔，与75μL测定缓冲液和75μL健康血液供体血清在室温在ELISA平板振荡器上以500次振荡/分钟的频率保温1小时。之后，倒空孔的内容物，洗涤孔并与100μL的M22-POD(RSR Ltd)、K1-18过氧化物酶缀合物(K1-18-POD；RSR Ltd)或者K1-70过氧化物酶缀合物(K1-70-POD；RSR Ltd)在10μg/mL-1ng/mL浓度范围保温。在室温不振荡保温25分钟后，再次洗涤平板孔，随后加入100μL四甲基联苯胺，在室温不振荡进一步保温25分钟。通过加入50μL的0.5M H2SO4终止反应，在ELISA平板读数器上在450nm读取每个孔的吸光度。对于非特异性结合，将CHO-K1培养基在TAT缓冲液中稀释并用作TSHR260突变体或全长TSHR突变体的阴性对照物并以相同方式处理，包括与不同浓度的M22-POD、K1-18POD或K1-170POD保温。使用GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA,USA)绘制M22-POD、K1-18-POD和K1-70-POD的结合曲线，通过从与匹配浓度的M22-POD、K1-18POD或K1-70POD保温的TSHR260或TSHR样品的OD450中减去阴性CHO-K1对照物的OD450而校正非特异性结合。非线性回归(单址特异性结合饱和曲线)用于计算平衡结合常数(Kd)，这是一半的受体(全长TSHR或TSHR260突变体)结合配体时的配体(M22-POD，K1-18-POD或K1-70-POD)浓度。Kd等于1/Ka，其中Ka是亲和性常数(图12a和图14a)。
在TSHR260结合测定中M22IgG、K1-18IgG、K1-70IgG和TRAb阳性患者血清抑制M22-POD结合TSHR260突变体
将ELISA平板(Nunc)孔用150μL等份的在包被缓冲液的1μg/mL 14C4Fab2包被，在室温保温3小时，然后在4℃过夜。将TSHR260-WT、TSHR-JMG37、TSHR-JMG45、TSHR-JMG52和TSHR-JMG55在培养基中稀释，随后在TAT缓冲液中1/5稀释。洗涤孔并在每个孔中加入150μL全长TSHR检测样品，在室温保温1小时以使得TSHR260结合14C4-Fab2。然后洗涤孔，与75μL测定缓冲液和75μL的TRAb阳性患者血清或者在NPS中稀释的M22IgG、K1-18IgG或K1-70IgG(1000ng/mL至0.1ng/mL)在室温在ELISA平板振荡器上以500次/分钟的频率保温1小时。之后倒空孔的内容物，洗涤孔并在每个孔中加入100μL的89.5ng/mL M22-POD(RSR Ltd)。在室温不振荡保温25分钟后，再次洗涤孔，随后加入100μL四甲基联苯胺，在室温不振荡进一步保温25分钟。通过加入50μL的0.5M H2SO4终止反应，在ELISA平板读数器上在450nm读取每个孔的吸光度(图12c)。
M22IgG、K1-18IgG、K1-70IgG和TRAb阳性患者血清抑制M22-POD结合全长TSHR突变体
将ELISA平板(Nunc)孔用150μL等份的在包被缓冲液中的1μg/mL的14C4Fab2包被，在室温保温3小时，然后在4℃过夜。将全长TSHR-WT、TSHR-JMG37、TSHR-JMG45和TSHR-JMG52在TAT缓冲液中稀释。洗涤孔，在每个孔中加入150μL全长TSHR检测样品，在4℃保温过夜以使得全长TSHR突变体结合14C4-Fab2。然后洗涤孔并与75μL测定缓冲液和75μL的TRAb阳性患者血清或者在NPS中稀释的M22IgG、K1-18IgG或K1-70IgG(1000ng/mL-0.1ng/mL)在室温在ELISA平板振荡器上以500次/分钟频率振荡保温1小时。之后，倒空孔的内容物，洗涤孔并在每个孔中加入100μL的89.5ng/mL M22-POD(RSR Ltd)。在室温无振荡保温25分钟后，再次洗涤平板孔，随后加入100μL四甲基联苯胺，在室温进一步无振荡保温25分钟。通过加入50μL的0.5M H2SO4终止反应，在ELISA平板读数器上在450nm读取每个孔的吸光度(图14e)。
TSHR刺激分析
如WO2006/016121A所述使用Flp-In系统将突变的TSHR构建体转染进中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中。
如WO2004/050708A2所述检测TSH、单克隆TRAb(M22和K1-18)及患者血清刺激用人TSHR转染的CHO细胞中环AMP产生的能力。将表达TSHR突变体的CHO细胞种植于96孔平板中，2-3×105个细胞/孔，生长48小时直至100％铺满。加入检测样品(TSH，M22-Fab，K1-18IgG或者患者血清)(100μL，在环AMP测定缓冲液中稀释，即无NaCl的含有1g/L葡萄糖、20mMHEPES、222mM蔗糖、15g/L牛血清白蛋白和0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的Hank's缓冲盐水溶液，pH7.4)并在37℃保温1小时。在除去检测溶液之后，将细胞通过与200μL裂解缓冲液(0.37％HCl，1％(v/v)Triton X-100)在室温振荡保温30分钟而裂解，裂解物中环AMP浓度使用来自Enzo Life Sciences的Direct cyclic AMP Elisa试剂盒测定。结果以在细胞裂解物(200μL)中的环AMP的pmol/mL表示。将这些实验与使用表达野生型TSHR的CHO细胞进行的相似实验对比。每个测定均进行至少两次。GraphPad Prism用于使用非线性回归拟合TSH、M22和K1-18数据的剂量应答曲线。这样可以计算每个激动剂(TSH或单克隆TRAb)的EC50，即在最大和基线环AMP浓度之间提供一半应答的激动剂浓度。
比对人TSHR蛋白质序列与其它生物体的TSHR蛋白质序列与人FSHR和人LHR序列
来自黑长尾猴、猕猴、猪、牛、猫、狗、小鼠、大鼠、绵羊和马的TSHR蛋白质序列(图10；SEQ ID No:47-56)及人FSHR(图11；SEQ ID No:57)和人LHR(图11；SEQ ID No:58)的蛋白质序列得自Uniprot数据库，使用DNAStar MegAlign(v.9.1,DNAStar,Madison,WI,USA)与人TSHR蛋白质序列(图2；SEQ ID No:2)进行比对。
TSHR260-碱性磷酸酶(TSHR260-AP)构建体的产生
下文描述了根据本发明的标记的突变体(包含碱性磷酸酶标记的TSHR260)的一个实例，但是应理解如果需要可以使用不同标记和不同长度的突变体TSHR(包括全长TSHR)。其它标记可例如选自酶标记、同位素标记、化学发光标记、荧光标记和染料，这些标记为本领域已知。这种标记可以任何合适方式加入，例如通过使用合适构建体(如下文进一步描述)的基因融合进行或者通过化学标记进行。本领域技术人员熟知任何特定标记所需的相关技术。可以使用生物素标记，包括任何合适的生物素酰化方法。
用于产生TSHR260-碱性磷酸酶(AP)构建体的方法在WO2010/073012A2中描述，对这个参考可以进一步描述。
使用全长人TSHR作为模板扩增TSHR260构建体(编码人TSHR的氨基酸1-260；氨基酸1-21为前导序列)(图3和4；SEQ ID No:3和4分别为野生型TSHR260的核苷酸和氨基酸序列)(Oda Y,et al 1998.Journal of Molecular Endocrinology 20:233-244)并使用克隆载体pSEAP2-basic(Clontech)作为模板连接分泌的碱性磷酸酶的编码序列(除外17个氨基酸的碱性磷酸酶前导序列)。进行两个PCR反应，第一个使用经特定引物(引物1-cactgcgaattcaaaatgag gccggcggac ttgctg(SEQ ID No:7)；引物2-gttctcctcc tcaactgggatgatgttaag agtccaggtg tttcttgc(SEQ ID No:8)(Sigma Genosys)扩增的全长TSHR，这样在N末端加入一个EcoRI限制位点及在C末端加入一个氨基酸接头(天冬酰胺)和分泌的碱性磷酸酶的前8个氨基酸(除外17个氨基酸前导序列)。第二个PCR使用经引物(引物3-gcaagaaaca cctggactct taacatcatc ccagttgagg aggagaac(SEQ ID No:9)；引物4-taatacgact cactataggg(SEQ ID No:10))扩增的克隆载体pSEAP2-basic进行，这样在分泌的碱性磷酸酶的N末端加入TSHR的氨基酸254-260和一个氨基酸接头(天冬酰胺)及在分泌的碱性磷酸酶基因的C末端加入一个6组氨酸标签、一个终止密码子和一个XhoI限制位点。PCR反应进行30次循环，每次是在94℃进行1分钟，在40℃进行1分钟及在72℃进行1分钟，最后在72℃进行7分钟。然后将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上运行，使用Geneclean II试剂盒(Anachem Ltd,Luton)根据厂商指导提取DNA。然后将纯化的PCR产物1和2用于设置第三个PCR以构建完整的TSHR260-碱性磷酸酶基因。第三个PCR反应包含200ng的PCR 1产物和200ng的PCR 2产物，PCR 3进行7次循环，每次包括在94℃进行1.5分钟、在65℃进行1.5分钟及在72℃进行1.5分钟。然后将温度再次提高至94℃进行2分钟并加入引物1和引物4，随后进行30次循环，每次包括在94℃进行1分钟、在52℃进行1分钟及在72℃进行2分钟。使用EcoRI和XhoI限制位点将PCR 3产物克隆进pFastBac1中并通过Sanger-Coulson方法(Sanger F et al 1997.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUSA74:5463-5467)进行测序以证实所述突变的存在。如WO2008/025991A1所述，使用Bac toBac杆状病毒表达系统(Invitrogen,UK)产生重组DNA并转染进Sf-9细胞中以获得并扩增重组杆状病毒原种。如WO2008/025991A1所述在昆虫细胞中表达TSHR260-AP。
产生含有稳定化氨基酸突变的TSHR260-AP构建体
用于在TSHR260-AP构建体(图15和16；SEQ ID No:59和60)的TSHR序列中导入特定突变的方法与上文关于TSHR260突变描述的方法相同。将TSHR突变(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、19、20、23、27、32、34、36、37、38、41和45)相继导入TSHR260-AP构建体中，获得8个单独的构建体(TSHR260-AP-I253R、TSHR260-AP-JMG22、TSHR260-AP-JMG37、TSHR260-AP-JMG45、TSHR260-AP-JMG52、TSHR260-AP-JMG55、TSHR-AP-JMG57和TSHR260-AP-JMG58)，如下文描述。氨基酸残基编号参考在天然野生型TSHR序列中发现的氨基酸的位置：
TSHR260-AP-I253R＝TSHR260-AP+I253R(图5和6；SEQ ID No:27和45)
TSHR260-AP-JMG22＝TSHR260-AP+D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:18、27、36和45)
TSHR260-AP-JMG37＝TSHR260-AP+R112P+D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、27、34、36和45)
TSHR260-AP-JMG45＝TSHR260-AP+R112P+D143P+D151E+I253R(图5和6；SEQ IDNo:16、18、19、27、34、36、37和45)
TSHR260-AP-JMG52＝TSHR260-AP+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQID No:16、18、19、23、27、34、36、37、41和45)
TSHR260-AP-JMG55＝TSHR260-AP+H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41和45)
TSHR260-AP-JMG57＝TSHR260-AP+H63C+R112P+D143P+V169R+I253R(图5和6；SEQID No:14、16、18、23、27、32、34、36、41和45)
TSHR260-AP-JMG58＝TSHR260-AP+H63C+R112P+D143P+S166T+I253R(图5和6；SEQID No:14、16、18、20、27、32、34、36、38和45)。
用于TSHR260-AP桥连ELISA中的抗体
4E31
4E31抗体是TSHR C末端(C-TSHR)的残基603-764的小鼠单克隆抗体，其可用于将全长TSHR固定在ELISA平板孔(EP 1021721B1,Bolton et al.,(1999)如前)。对于小鼠的免疫，使用标准方案将C-TSHR在大肠杆菌中作为与谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白而表达(Oda Y et al.,(1998)如前)。将编码最后162个氨基酸的cDNA的3’末端(1809-2295bp)符合读框地在pGEX2T载体(Pharmacia Biotech,St.Albans ALI 3AW UK)中与GST融合蛋白克隆。将用pGEX-2T/C-TSHR质粒转化的大肠杆菌(菌株UT580)的过夜培养物在2×YTG培养基(16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L NaCl，20g/L葡萄糖，pH 7.0)中1/5稀释，在30℃保温3小时。之后，加入异丙基-3-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)至终浓度为1mM，以诱导C-TSHR/GST融合蛋白表达，随后进一步保温3小时。将细菌团块重悬浮于含有1％(v/v)TritonX-100的PBS中(8g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.44g/L Na2HPO4，0.24g/L KH2PO4，pH 7.4)，在冰上超声处理3次1分钟。沉淀包涵体，在4M尿素中洗涤，溶解于8M尿素中，及在9％聚丙烯酰胺凝胶(SDS-聚丙烯酰胺电泳，SDS-PAGE)上在还原条件下分离。将C-TSHR/GST融合蛋白(MW44kDa)在0.1M NaHCO3和0.1％SDS pH 7.8中从聚丙烯酰胺凝胶切片中电洗脱，用50mMTris-HCl pH 8.0透析并等份在-70℃贮存。
4E31抗体通过用电洗脱的C-TSHR/GST融合蛋白免疫而制备。简而言之，将BALB C小鼠用注射50μg C-TSHR/GST/小鼠进行免疫直至TSHR抗体的滴度高。使用免疫沉淀测定基于在体外转录/翻译系统中产生的35S-标记的TSHR检测小鼠血液样品(Prentice et al.,(1997)Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism,84:1288-1292)。使用标准技术将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系(X63_Ag8.653；ECACC Porton Down,UK)融合及克隆产生分泌单克隆抗体的稳定杂交瘤(Oda et al.,(1998)如前)。4E31可购自RSR Ltd,Cardiff,UK(如前)。
K1-70
K1-70是阻断型TSHR人单克隆自身抗体，得自患有甲状腺功能低下的患者周围血淋巴细胞(Evans et al,(2010)Clinical Endocrinology 73:404-412；EP2367850)。简而言之，从患有甲状腺功能低下及具有高水平TSHR抗体的54岁患者的20mL周围血中分离淋巴细胞。使用标准技术将淋巴细胞用Epstein Barr病毒感染并与小鼠/人杂交细胞系(K6H6/B5；ECACC,Porton Down,UK)融合(Hayakawa N et al.,(2002)如前)。将细胞铺板于48孔平板，使用基于抑制125I-TSH结合TSHR包被的管(得自RSR Ltd,Cardiff,UK的测定试剂盒)的测定筛选上清。然后将阳性孔通过限制稀释再克隆直至分离出产生高浓度TSHR自身抗体K1-70的单一菌落。K1-70可购自RSR Ltd,Cardiff,UK(如前)。
M22
如上文“用于TSHR260结合测定中的抗体”章节详细描述。
基于TSHR260-AP的桥连ELISA
基于前述方法使用桥连ELISA(图13a，Rees Smith,B et al(2009)如前,WO2010/073012A2)。这种ELISA基于二价TSHR抗体在液相中用一个抗原结合位点结合包被在ELISA平板孔上的TSHR及用另一抗原结合位点结合TSHR260-AP的能力，即形成桥。将在CHO细胞中表达的全长洗涤剂溶解的受体形式的TSHR通过如先前所述的C末端抗体4E31包被在ELISA平板孔上(Bolton,J et al(1999)如前)。在测定中，将75μL起始缓冲液(50mM NaCl；20mMTris pH 7.8；1g/L BSA；50mg/L正常小鼠IgG；1％Triton X-100pH 7.8)和75μL检测样品(在健康血液供体血清中稀释的或者在测定缓冲液[50mM NaCl，20mM Tris pH 7.8，1％Triton X-100，1g/L BSA]中稀释的患者血清或单克隆抗体)加入用全长的经洗涤剂溶解的TSHR包被的ELISA平板孔中，在室温振荡(500rpm)保温2小时。然后除去孔的内容物，将孔用洗涤缓冲液(50mM NaCl，20mM Tris pH 7.8，1％Triton X-100)洗涤3次，随后加入100μL的TSHR260-AP(在含有0.2g/L MgCl2-6H2O和2g/L BSA的洗涤缓冲液中稀释)。在室温振荡(500rpm)保温1小时后，倒空孔，洗涤(3次)，加入100μL的对硝基苯基磷酸盐(pNpp)底物(Europa Bioproducts Ltd,Ely,Cambridge UK)，将平板在黑暗中保温45分钟。之后加入100μL终止溶液(1M NaOH)，在ELISA平板读数器中在405nm读取吸光度。结果以在每个样品中使用用人单克隆TSHR自身抗体K1-70制备的标准曲线计算的OD405nm吸光度数值和TRAb浓度表示。
TSHR260-AP突变体的热稳定性
将如上述在昆虫细胞中表达并从上清中收获的TSHR260-AP突变体(见“产生含有稳定性氨基酸突变的TSHR260-AP构建体”章节中SEQ ID No)在含有0.2g/L MgCl2-6H2O和2g/L BSA的洗涤缓冲液中稀释，提供在TSHR260-AP桥连ELISA中合适的吸光度(图13b)。将150μL等份在50℃、60℃或65℃加热0-3小时。将100μL样品一式两份用于上述TSHR260-AP桥连ELISA中(图13b)。测定数据根据时间绘图并拟合为指数曲线，计算突变体的半衰期(t1/2)并与TSHR260-AP WT(图15和16；SEQ ID No:59和60)、TSHR260-AP-JMG22或TSHR260-AP-JMG45对比(在上文“产生含有稳定性氨基酸突变的TSHR260-AP构建体”中定义)。
TSHR26桥连抑制性ELISA
可以对上述TSHR260桥连ELISA进行修改以形成检测未复合的TSHR260和TSHR260-Mab复合物的抑制性ELISA(图13c)。在这个测定中，将75μL起始缓冲液(如针对TRAb ELISA所述；Bolton J,et al(1999)如前)和75μL的1μg/mL M22IgG或1μg/mL K1-70IgG加入用全长洗涤剂溶解的TSHR包被的ELISA平板孔中，在室温振荡(500rpm)保温30分钟。然后除去孔的内容物，用洗涤缓冲液(50mM NaCl，20mM Tris pH 7.8，1％Triton X-100)洗涤孔，随后在每个孔中加入100μL检测样品(即未标记的TSHR260或TSHR260-Mab复合物)。在室温振荡(500rpm)保温1小时后，除去孔的内容物，用洗涤缓冲液洗涤孔，加入100μL的TSHR260-AP(在含有0.2g/L MgCl2-6H2O和2g/L BSA的洗涤缓冲液中稀释)。在室温振荡(500rpm)保温30分钟后，倒空孔，洗涤(3次)并加入100μL的对硝基苯基磷酸盐(pNpp)底物(EuropaBioproducts Ltd,Ely,Cambridge UK)，将平板保温45分钟。之后，加入50μL终止溶液(1MNaOH)，在ELISA平板读数器中在405nm读取吸光度。含有未标记的TSHR260的检测样品对标记的TSHR260(即TSHR260-AP)结合的抑制表示为：100×(1-检测样品在405nm的吸光度与单独缓冲液在405nm的吸光度的比率)。
为了便于对比在阴离子或阳离子交换层析纯化后在不同体积的最初起始材料和洗脱的TSHR260集合中的TSHR260活性，将每个检测样品的活性以相对于未稀释的洗脱材料的稀释倍数表示。
产生人TSHR的凸面的单克隆抗体
用于TSHR260部分纯化中的TSHR凸面的2H11、25E1、23H4、9B7和36F11TSHR小鼠单克隆抗体通过cDNA免疫制备。简而言之，在用100μg全长TSHR cDNA(pRC/CMVhTSHR；Oda etal(1998)如前)肌肉注射免疫之前5天，为6-8周龄OF1(远系繁殖)小鼠肌肉注射100μl的10μM心脏毒素。间隔三周重复进行TSHR DNA免疫，共注射5次(Hasan et al(1999)J.Immunol.Methods 229:1-22)。通过生物素标记的14C4IgG结合TSHR的抑制检测小鼠血液样品中TSHR凸面的抗体的存在(由RSR Ltd,Cardiff,UK制定的测定法)。使用血清中具有最高TSHR抗体滴度的小鼠脾细胞产生单克隆抗体。使用标准方法将分离的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系(Sp2/O-Ag14)融合(de St Groth,S.F.,&Scheidegger,D.(1980).Journal ofImmunological Methods35,1-21)。将细胞在DMEM(补加15％胎牛血清，含有选择杂交体的HAT)中培养并铺板于96孔平板中。为获得TSHR凸面的抗体，将细胞培养上清通过生物素标记的14C4IgG结合包被在ELISA平板孔上的TSHR的抑制进行筛选。在这些测定中，使用4E31(TSHR C末端的抗体)使全长TSHR结合ELISA平板孔，培养上清中的TSHR抗体结合固定的TSHR，含有TSHR凸面(即与14C4结合位点重叠)抗体的孔抑制生物素标记的14C4与TSHR的结合。将来自阳性孔的细胞通过限制稀释再克隆两次以获得表达需要的单克隆抗体的克隆。
制备TSHR260和TSHR260-JMG55
将High-FiveTM昆虫细胞(来自Invitrogen的BTI-TN-5B1-4)维持在Insect Xpress培养基(Lonza)中。以大约1.00×106个细胞/mL的细胞密度种植2L或0.2L摇瓶，在27℃以110rpm保温过夜(之后温度降低至23℃)。使用Bac to Bac系统(Invitrogen)用杆状病毒原种以感染复数(MOI)为0.012pfu/mL感染细胞。在感染后120小时通过在4℃在500g离心10分钟收获含有TSHR260(图4；SEQ ID No:4)或TSHR260-JMG55的培养上清。每200mL上清加入一片完全蛋白质抑制剂(Roche Diagnostics,Lewes,UK)，之后在-70℃贮存直至纯化。
在存在不同单克隆抗体条件下制备TSHR260
如上文针对TSHR260所述培养并感染High-FiveTM昆虫细胞，不同之处是在大约96小时后在培养基中加入2mg/L的TSHR单克隆抗体(14C4，2H11，25E1，36F11，9B7或者23H4IgG)。在感染后120小时通过在4℃在500g离心10分钟收获含有TSHR260-TSHR Mab复合物的培养上清。每200mL上清中加入一片完全蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics,Lewes,UK)，之后在-70℃贮存直至根据各个复合物的PI通过阴离子或阳离子交换层析进行纯化。
纯化TSHR260
将含有TSHR260的培养上清(100mL)用HPLC级别的水1:1稀释，使用2M Tris调节为pH 9.0并加样于15mL的Streamline DEAE基质上，通过阴离子交换层析纯化。将柱用10mMTris-HCl(pH 9.0)、50mM NaCl洗涤，随后用500mM NaCl和10mM Tris-HCl(pH 9.0)洗脱。洗脱的材料用50mM NaCl、10mM Tris-HCl pH 8.0透析。洗脱级分中TSHR260的存在通过Western印迹分析证实，使用小鼠单克隆抗体(10μg/mL)与氨基酸246-260内TSHR表位(TSHRMAb 18C5,Jeffreys J et al(2002)如前)反应，并在TSHR260桥连抑制性ELISA中测量活性(图13c)。
在存在14C4、2H11、25E1、23H4、36F11或9B7TSHR单克隆抗体条件下纯化TSHR260
将含有TSHR260-14C4-IgG复合物(200mL)的培养上清用HPLC级别的水1:1稀释，使用2M Tris调节为pH 9.0并加样于15mLStreamline DEAE基质上，如上针对未复合的TSHR260所述通过阴离子交换层析纯化。
用500mM NaH2PO4将含有TSHR260-2H11-IgG、TSHR260-25E1-IgG、TSHR260-23H4-IgG、TSHR260-36F11-IgG或TSHR260-9B7-IgG复合物(600mL)的培养上清调节为pH 6.3，加样于10mL Streamline Direct HST基质上通过阳离子交换层析进行纯化。用50mM NaH2PO4(pH 6.0)、50mM NaCl及随后用50mM NaH2PO4(pH 7.0)、50mM NaCl洗涤柱，然后在50mMNaH2PO4(pH 8.0)、50mM NaCl中洗脱。洗脱级分中TSHR260的存在通过Western印迹分析证实，使用小鼠单克隆抗体18C5(10μg/mL)与氨基酸246-260内TSHR表位(TSHR-MAb 18C5,Jeffreys J et al(2002)如前)反应，在TSHR260桥连抑制性ELISA中测量活性(图13c)。
纯化TSHR260-JMG55
与下文描述相等的纯化方法可用于本发明的其它突变体。使用如下方法通过三次柱层析循环纯化TSHR260-JMG55：a)在Streamline Direct HST基质上阳离子交换层析；b)在与琼脂糖结合的14C4上单克隆抗体亲和性层析；及c)镍亲和性层析。将含有TSHR260-JMG55的培养上清(12L)用500mM磷酸钠(NaH2PO4)调节为pH 6.0。加入Tween 80至终浓度为0.015％v/v，将培养上清加样于在Streamline 25膨胀床(expanded bed)层析系统(GEHealthcare)中的75mL的Streamline Direct HST基质。在单独的实验中以相同方式处理进一步的两个12L批次。
将柱用含有0.015％v/v Tween 80的50mM NaH2PO4(pH 6.0)、50mM NaCl及随后用含有0.015％v/v Tween 80的100mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH 7.0)洗涤，然后用含有0.015％v/v Tween 80的100mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH 8.0)洗脱。洗脱级分中TSHR260-JMG55的存在通过Western印迹分析证实，使用小鼠单克隆抗体8E2(10μg/mL)与氨基酸36-42内的TSHR表位(TSHR-MAb 8E2,Jeffreys J et al(2002)如前)反应，在TSHR260结合测定中测量活性(图12a)。将样品也在TSHR260桥连抑制性ELISA中分析以与TSHR260和TSHR260-IgG复合物的层流纯化结果进行对比(图13c)。
将TSHR260-JMG55通过亲和性层析进一步纯化，使用偶联了CNBr激活的琼脂糖4B(Sigma)的结合TSHR胞外结构域的氨基酸22-261内的构象表位的小鼠单克隆抗体14C4(Jeffreys J et al(2002)如前)。特别地，将从三次层流柱洗脱集合的TSHR260-JMG55加样于7mL 14C4亲和性柱，用含有0.015％v/v Tween 80的100mM NaCl、50mM Tris-HCL(pH8.0)洗涤。将14C4亲和性柱用洗脱缓冲液(100mM NaCl，100mM柠檬酸盐，0.015％v/v Tween80)在pH 5.0及随后用洗脱缓冲液在pH 4.5相继洗脱。将洗脱级分收集在等体积的中和缓冲液(0.5mM Tris-HCl，pH 8.0，0.015％v/v Tween 80)中，随后在含有0.015％v/v Tween80的100mM NaCl、50mM Tris-HCl，pH 8.0中透析。集合在pH 5.0洗脱的级分(TSHR260-JMG55-5.0)和在pH 4.5洗脱的级分(TSHR260-JMG55-4.5)并单独透析。洗脱级分中TSHR260-JMG55的存在使用小鼠单克隆抗体8E2(10μg/mL)通过Western印迹分析证实，活性使用TSHR260结合测定测量(图12a)。
将透析的TSHR260-JMG55-4.5使用镍亲和性层析进一步纯化。将TSHR260-JMG55调节为终浓度为10mM咪唑pH 8.0，加样于NiNTA-HiTrap1mL固定的金属亲和性层析柱(IMAC)HP柱(GE Healthcare)，使用10平台(GE Healthcare)，用在洗涤缓冲液(100mM NaCl，50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.015％v/v Tween 80)中的10mM咪唑(pH 8.0)洗涤并用在洗涤缓冲液中150mM咪唑(pH 8.0)洗脱。集合洗脱的TSHR260-JMG55-4.5并在含有0.015％v/vTween 80的100mM NaCl、50mM Tris-HCL(pH 8.0)中透析并在-70℃贮存。洗脱级分中的TSHR260-JMG55存在使用小鼠单克隆抗体8E2(10μg/mL)通过Western印迹分析证实，活性在TSHR260结合测定中分析(图12a)。纯化的TSHR260-JMG55-4.5的浓度从在280nm的吸光度中基于1个吸光度单位等于1.43mg/mL的TSHR260-JMG55计算(这个消光系数使用DNASTARProtean V.9.1.0获得)。对在SimplyBlue SafeStain(Invitrogen)染色的12％非还原SDS-PAGE凝胶上运行的材料使用Image Lab软件(Bio-Rad)通过光密度分析证实浓度。
透析的TSHR260-JMG55-5.0也使用IMAC镍亲和性层析进一步纯化。将TSHR260-JMG55-5.0加样于NiNTA HiTrap柱(GE Healthcare)，使用10平台(GE Healthcare)，用洗涤缓冲液洗涤，然后用在洗涤缓冲液中的150mM咪唑(pH 8.0)洗脱。然后将洗脱的TSHR260JMG55-5.0在100mM NaCl、50mM Tris-HCL(pH 8.0)和0.015％v/v Tween 80中透析。洗脱级分中TSHR260-JMG55的存在使用小鼠单克隆抗体8E2(10μg/mL)通过Western印迹分析证实，活性在TSHR260结合测定中分析(图12a)。从在280nm的吸光度中基于1个吸光度单位等于1.43mg/mL的TSHR260-JMG55计算纯化的TSHR260-JMG55-5.0的浓度(这个消光系数使用DNASTAR Protean V.9.1.0获得)。浓度通过使用Image Lab软件(Bio-Rad)对在SimplyBlue SafeStain(Invitrogen)染色的12％非还原的SDS-PAGE凝胶上运行的材料进行光密度分析而证实。
TSHR260-JMG55-4.5包被的ELISA平板孔测定
将Maxisorp 96孔ELISA平板(Nunc)孔用在包被缓冲液(15mM Na2CO3，35mMNaHCO3，1.5mM NaN3，0.01g/L Phenol Red，pH9.2，含有5μg/mL BSA)中150μL等份的4μg/mL或0.4μg/mL纯化的JMG55-TSHR260-4.5的包被，在4℃保温过夜。将孔用洗涤缓冲液(50mMNaCl；20mM Tris pH 7.8；1％v/v Triton X-100)洗涤3次，然后与250μL包被后缓冲液(154mM NaCl，58mM蔗糖，3g/L BSA，0.2g/L叠氮化钠)保温1小时。将孔用洗涤缓冲液洗涤3次，与75μL测定缓冲液(50mM NaCl，20mM Tris pH7.8，1％v/vTriton X-100，1g/L BSA)和75μL健康血液供体血清集合(NPS)在室温以500次振荡/分钟在ELISA平板振荡器上振荡保温1小时。之后，倒空孔的内容物，洗涤孔并在每个孔中加入100μL的M22Fab过氧化物酶缀合物(M22-POD,RSR Ltd,Cardiff,CF23 8HE,UK)、K1-70IgG过氧化物酶缀合物(K1-70-POD)或者K1-18IgG过氧化物酶缀合物(K1-18-POD)，浓度范围是0.25-7.5μg/mL。在室温不振荡保温25分钟后，再次洗涤平板孔，随后加入100μL四甲基联苯胺，在室温不振荡进一步保温25分钟。通过加入50μL的0.5M H2SO4终止反应，在ELISA平板读数器上在450nm读取每个孔的吸光度(图12d)。
TSHR260-JMG55-4.5的去糖基化
如下文描述的去糖基化可以用于本发明的其它突变体。使用内切糖苷酶F3(EndoF3,Sigma)和5μg的TSHR260-JMG55-4.5在50mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)中以0mU/mg、40mU/mg、60mU/mg和80mU/mg(EndoF3:TSHR260-JMG55-4.5比率)在20℃反应24小时、72小时和120小时进行去糖基化。该反应在12％非还原SDS-PAGE上通过SimplyBlue SafeStain(Invitrogen)染色及使用TSHR小鼠单克隆抗体8E2的western印迹进行分析。TSHR260-JMG55-4.5分子量中的任何改变使用Mark12分子量标记(Invitrogen)确定。在去糖基化后TSHR260-JMG55-4.5的活性通过TSHR260结合测定(图12a)确定。
使用PCR在全长小鼠和猪TSHR序列中导入特定氨基酸突变
猪TSHR全长核苷酸序列(图17；SEQ ID No:61)克隆自猪甲状腺cDNA文库(EP1021721B1)。简而言之，使用酸性酚胍方法从2.5g猪甲状腺组织制备总RNA(PChomczynski,N Sacchi；Single step method of RNA isolation by guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extraction；Analytical Biochemistry 1987；162:156-159)。使用Dynal bead mRNA纯化试剂盒(Dynal Biotec Ltd；Wirral,CH62 3QL,UK)制备mRNA。使用ZapExpress cDNA Gigapack克隆试剂盒III(Stratagene Ltd.,CambridgeCB4 4DF UK)将这个mRNA用于产生cDNA文库。产生已知TSHR序列(小鼠，大鼠，人，狗和牛)的四个简并寡核苷酸及使用PCR扩增猪TSHR的两个片段。对这些序列进行测序以证实其与TSHR cDNA的同源性并用于筛选cDNA文库中全长猪TSHR克隆。获得三个全长克隆并完整测序。使用标准克隆方法将猪TSHR cDNA的编码序列克隆进pcDNA5.1/FRT载体(Invitrogen)的BamHI和NotI限制位点。氨基酸序列见图18(SEQ ID No:62)。
使用在5’末端的BamHI限制位点和在3’末端的NotI限制位点合成小鼠TSHR全长核苷酸序列(图19；SEQ ID No:63)(Geneart,Life Technologies,Paisley,UK)并使用标准克隆方法克隆进pcDNA5.1/FRT载体(Invitrogen)中。氨基酸序列见图20(SEQ ID No:64)。
如上文针对人TSHR260所述使用PCR及QuikChange II方法学通过定向诱变在全长小鼠和猪TSHR序列中产生突变。图21和22(SEQ ID No:65和66)分别是突变的猪TSHR的核苷酸和氨基酸序列，图23和24(SEQ ID No:67和68)分别是突变的小鼠TSHR的核苷酸和氨基酸序列。见表54关于在猪和小鼠TSHR中JMG55等价氨基酸突变。
如上文在“使用Flp-In系统将全长TSHR构建体转染进CHO细胞中”章节所述将全长TSHR构建体稳定转染进Flp-In CHO细胞中。
全长小鼠和猪TSHR(野生型和突变体)的热稳定性
在稳定性测定B(图14c)中检测全长小鼠和猪TSHR野生型和突变体的热稳定性，涉及在55℃加热的结合4E31包被的平板的TSHR，如下文在“全长TSHR突变体的热稳定性”中所述(图14c)。
分析小鼠和猪野生型和突变的TSHR应答TSH和M22的刺激
使用Flp-In系统将野生型和突变的TSHR构建体转染进中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的方法在WO2006/016121A中描述。
如在上文针对人TSHR的“TSHR刺激分析”章节中所述检测TSH和甲状腺刺激性单克隆抗体M22在表达野生型和突变的小鼠和猪TSHR的CHO细胞中刺激环AMP的产生的能力。
制备洗涤剂溶解的全长野生型和突变的TSHR
将表达全长野生型或突变的TSHR(人，猪或小鼠)的CHO细胞生长至铺满，从175cm2细胞培养瓶中取出并将细胞团块用含有1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的50mM NaCl、10mM Tris-HCl，pH7.5洗涤，然后在相同缓冲液中均质。在4℃在12000g离心30分钟后，将细胞膜溶解于相同缓冲液(对于大约4×108个细胞4mL缓冲液)用于均质，不同之处是加入1％Triton X-100。将溶解的受体制备物在90000g在4℃离心2小时并将上清贮存在-70℃。
分析TSH与全长野生型和突变的TSHR的结合
将Maxisorp测定管(Nunc)用200μL等份的在包被缓冲液(15mM Na2CO3，35mMNaHCO3，1.5mM NaN3，0.01g/L Phenol Red，pH 9.2)中的10μg/mL 4E31-Fab2包被，在37℃保温90分钟，然后在4℃过夜。将孔用测定缓冲液(50mM NaCl；20mM Tris-HCl pH 7.8，1％Triton-X-100)洗涤3次。全长TSHR制备物在测定缓冲液中稀释，将200μL等份在4E31包被的管中在4℃保温过夜。将孔用测定缓冲液洗涤3次。将在测定缓冲液中50μL未标记的TSH、50μL的125I标记的TSH(30,000cpm在测定缓冲液中)和50μL起始缓冲液(50mM NaCl；20mM Tris-HCl pH 7.8，1％Triton-X-100，1g/LBSA，50mg/L正常小鼠IgG)应用于所述包被的管并在室温轻轻振荡保温2小时，用1mL测定缓冲液洗涤两次并在γ计数仪中计数。绘制结合的对于结合/游离的TSH浓度图(G Scatchard(1949)Annals of the New York Academy ofSciences 51:660-672)以推导结合常数。
在TSHR-JMG55的TMD中的热稳定性突变
关于在TSHR的LRD中鉴别的热稳定性突变，检验TSHR-JMG55的TMD的序列以确定在TSHR的这个结构域中是否可以鉴别进一步的热稳定性突变。三个原则用于预测在TSHR的TMD中可能的热稳定性突变：i)在其它生物体中TSHR同系物的共有序列用于鉴别可能的热稳定性突变；ii)检验导致TSHR较低的基础cAMP信号活性的突变(从SSFA数据库获得(www.ssfa-gphr.de)；Kreuchwig A et al(2013)Mol Endocrinol.8:1357-63)，因为这些突变可以稳定TSHR的无活性构象，无活性构象比活性构象对于GPCR是更具热稳定性的；及iii)将在其它GPCR中即β1-肾上腺素受体(β1AR,Serrano-Vega et al(2008)PNAS105:877-82；Miller JL和Tate CG(2011)J.Mol.Bio.413:628-38)、A2A腺苷受体(A2AR；DoréAS et al(2011)Structure 19:1283-93)、NTS1神经降压素受体(NTS1R；Egloff P et al(2014)PNAS111:E655-62；Shibata Y et al(2009)J.Mol.Bio.390:262-277)和促肾上腺皮质激素释放因子受体-1(CRF1R；Hollenstein K et al(2013)Nature 499:438-443)中已经鉴别是热稳定性的突变转移至TSHR。鉴别了共56个可能的热稳定性突变：10个TSHR共有突变，19个TSHR失活突变，26个GRCP热稳定性突变及1个突变Y601A，其既是在TSHR中失活突变也是在β1-肾上腺素受体中热稳定性突变(表59)。
根据标准克隆方法使用BamHI和XhoI限制位点将TSHR-JMG55全长核苷酸序列克隆进pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen)中。使用上文针对TSHR260突变描述的PCR及QuikChangeII方法学在全长TSHR-JMG55序列中通过定向诱变产生突变。转化、扩展PCR反应，突变通过如上述针对TSHR260PCR产物所述测序证实。通过将50mL培养物在具有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中生长获得较大数量的质粒DNA。使用Qiagen Plasmid PlusMidi试剂盒(Qiagen Ltd,Manchester,M15 6SH,UK)从过夜培养的细胞团块提取质粒DNA。
使用Freestyle Max试剂在CHO-K1细胞中瞬时转染全长TSHR突变体
在转染前一天，将2.2×105CHO-K1细胞/孔铺板于90mm细胞培养皿(Nunc)中。对于待转染的每个90mm培养皿，将30μg在pcDNA3.1(+)中的TSHR-JMG55突变体与600μL OptiproSFM(Life Technologies,Paisley,PA4 9RF,UK)混合。将在540μL Optipro SFM中稀释的60μL Freestyle Max试剂(Life Technologies)加入每个DNA/Optipro SFM混合物中，在室温保温10-20分钟。将1200μL DNA/Freestyle Max混合物加入90mm培养皿中的CHO-K1细胞中，在37℃保温40-48小时。通过用4mL PBS漂洗细胞单层，然后刮擦去除细胞而在1mL PBS中收获细胞，从而收获表达TSHR-TMD突变体的CHO-K1细胞。将细胞在1.5mL小瓶中在13 000rpm离心1分钟，弃去上清并将细胞团块在-70℃贮存。当需要时，将每个细胞团块通过悬浮于1mL溶解缓冲液(50mM NaCl，10mM Tris pH 7.8，1％v/v Triton X-100，完全蛋白酶抑制剂(Roche))中溶解，在冰上保温至少30分钟。然后将该材料立即使用或者在-70℃贮存。
通过用在pcDNA3.1+中的TSHR-JMG55转染含有90％铺满的CHO-K1细胞的80cm2培养瓶产生TSHR-JMG55标准物。对于每个80cm2培养瓶，将40μg在pcDNA3.1中的TSHR-JMG55与800μL Optipro SFM(Life Technologies)混合，然后将在720μL Optipro SFM中稀释的80μL Freestyle Max试剂(Life Technologies)加入DNA/Optipro SFM混合物中，在室温保温10-20分钟。将1.6mL DNA/Freestyle Max混合物加入每个80cm2培养瓶的CHO-K1细胞中，在37℃保温40-48小时。从每个80cm2培养瓶中通过用10mL PBS漂洗细胞单层，然后使用刮擦去除细胞而在2mL PBS中收获细胞，从而收获表达TSHR-JMG55标准物的CHO-K1细胞。集合来自所有培养瓶的细胞，在1.5mL小瓶中等份为1mL等份。将细胞在13 000rpm离心1分钟，弃去上清并将细胞团块贮存在-70℃。当需要时，将每个细胞团块通过悬浮在500μL溶解缓冲液(50mM NaCl，10mM Tris pH 7.8，1％v/vTriton X-100，完全蛋白酶抑制剂(Roche))中溶解，在冰上保温至少30分钟。然后将该材料立即使用或者在-70℃贮存。稀释TSHR-JMG55标准物，由此其在用14C4包被的ELISA平板孔中进行的TSHR结合测定(在下文“TSHR结合测定”中描述，图14a)中与在用14C4包被的ELISA平板孔中进行的TSHR260结合测定(图12a)中提供的TSHR260-WT标准物提供相同活性，如在“使用Freestyle Max试剂在CHO-K1细胞中瞬时转染TSHR260突变体”章节中定义。将此定义为具有100U/mL的14C4活性。相似地，将在4E31包被的ELISA平板孔的TSHR结合测定中测定的相同样品(图14a)用于定义100U/mL的4E31活性。进一步将TSHR-JMG55标准物稀释为与第一个TSHR-JMG55标准物相同浓度，如在分别用14C4-和4E31-包被的ELISA平板孔进行的TSHR结合测定中所检测的。
用于TSHR结合测定中的抗体
4E31
如在上文“用于TSHR260-AP桥连ELISA中的抗体”章节中详细说明。
14C4
如在上文“用于TSHR260结合测定中的抗体”章节中详细说明。
M22
如在上文“用于TSHR260结合测定中的抗体”章节中详细说明。
TSHR结合测定
将Maxisorp 96-孔ELISA平板(Nunc)孔用150μL等份的在包被缓冲液(15mMNa2CO3，35mM NaHCO3，1.5mM NaN3，0.01g/L Phenol Red，pH9.2)中1μg/mL的14C4-Fab2(Jeffreys J et al(2002)如前和Sanders J et al(2007)如前)或者1μg/mL的4E31-Fab2(EP 1021721B1,Bolton et al(1999)如前)包被，在室温保温3小时，然后在4℃过夜。将孔用洗涤缓冲液(50mM NaCl；20mM Tris pH 7.8；1％v/v Triton X-100)洗涤3次，将在TAT缓冲液(50mM NaCl，10mM Tris pH7.8，1％v/v Triton X-100，1g/L BSA，0.2g/L叠氮化钠)中稀释的150μL检测样品(从瞬时转染的CHO-K1细胞收获的TSHR)应用于每个孔，在室温保温1小时或者在4℃保温过夜，使得TSHR结合14C4-Fab2或者4E31-Fab2包被的平板。
然后洗涤孔，并与75μL测定缓冲液(50mM NaCl，20mM Tris pH7.8，1％v/v TritonX-100，1g/L BSA，50mg/L正常小鼠IgG)和75μL健康血液供体血清集合(NPS)在室温在ELISA平板振荡器上以500次振荡/分钟保温1小时。之后倒空孔的内容物，洗涤孔并在每个孔中加入100μL的M22Fab-过氧化物酶缀合物(M22-POD,RSR Ltd,Cardiff,CF23 8HE,UK)。在室温不振荡保温25分钟后，再次洗涤平板孔，随后加入100μL四甲基联苯胺，在室温不振荡进一步保温25分钟。反应通过加入50μL的0.5M H2SO4终止，在ELISA平板读数器上在450nm读取每个孔的吸光度(图14a)。
对于每种突变体，测量其在结合14C4包被的平板和4E31包被的平板的测定中的活性并与稀释为在TSHR260结合测定(100U/mL)中与结合14C4包被的平板的TSHR260-WT标准物具有相同的结合14C4包被的平板的活性的TSHR-JMG55标准物对比，如在“使用FreestyleMax试剂在CHO-K1细胞中瞬时转染TSHR260突变体”和“使用Freestyle Max试剂在CHO-K1细胞中瞬时转染全长TSHR突变体”章节中定义。
全长TSHR突变体的热稳定性
以三种不同方式测量TSHR突变体的热稳定性：A)加热结合14C4包被的ELISA平板孔的TSHR突变体(图14b)；B)加热结合4E31包被的ELISA平板孔的TSHR突变体(图14c)；及C)加热在溶液中的TSHR突变体，然后使其结合4E31包被的ELISA平板孔用于测定(图14d)。
热稳定性测定A和B：将Maxisorp 96孔ELISA平板(Nunc)孔用150μL等份的在包被缓冲液中的1μg/mL 14C4-Fab2(热稳定性测定A)或者1μg/mL4E31-Fab2(热稳定性测定B)包被，在室温保温3小时，然后在4℃过夜。将孔用洗涤缓冲液洗涤3次并将在TAT缓冲液中稀释的150μL检测样品(从瞬时转染的CHO-K1细胞收获的TSHR)应用于每个孔中，在4℃保温过夜，使得TSHR结合14C4或4E31包被的ELISA平板孔。将平板用洗涤缓冲液洗涤3次以除去未结合14C4-Fab2或4E31-Fab2的任何TSHR。将TAT缓冲液加入每个孔中(150μL)，然后使用粘接板盖密封孔。然后将每个平板置于设定为45℃或55℃的水浴中。在直至180分钟后从每个平板取出96孔平板的一条(8个孔)，插入备用的ELISA平板架中，然后保持在冰上。在完成180分钟时程后，从ELISA平板孔中抽吸受体稀释缓冲液并继续上述TSHR结合测定(图14a)。将测定数据根据时间绘图并拟合为指数曲线，计算突变体的半衰期(t1/2)并与TSHR-JMG55或另一TSHR突变体对比。
热稳定性测定C：将Maxisorp 96孔ELISA平板(Nunc)孔用150μL等份的在包被缓冲液中的1μg/mL 4E31-Fab2包被，在室温保温3小时，然后在4℃过夜。将在CHO-K1细胞中瞬时表达的TSHR突变体在溶解缓冲液中稀释。将100μL等份在33℃或40℃加热0-2小时。然后将样品在TAT缓冲液(83.3μL样品+250μL TAT缓冲液)中1/4稀释并将150μL等份一式两份用于已经用洗涤缓冲液洗涤3次的4E31包被的ELISA平板孔，如上文所述进行TSHR结合测定(图14a)。测定数据根据时间绘图并拟合为两相指数衰变等式。计算在加热10、30和120分钟后剩余的活性TSHR突变体的百分比并与TSHR-JMG55或另一TSHR突变体对比以提供在10、30和120分钟的存活率。
结果
单一突变
在我们的实验中，制备并表达了239个TSHR260的单一突变体。特别地，将Met22至Leu260的每个残基均突变为估计是在每个位置最具热稳定性的氨基酸(表1)。在TSHR260结合测定中筛选这些突变体的结合和稳定性(图12a、b，表2)。确定在筛选中鉴别的64个最佳候选物在42℃的半衰期并与野生型TSHR260(TSHR260-WT，平均t1/2＝30.7±1.1分钟)对比，提供突变体与TSHR260-WT(Δt1/2)之间半衰期的差异及突变体半衰期与TSHR260-WT半衰期之间的稳定性比率(表3)。这些热稳定性曲线鉴别了17个突变(P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R和R255Y)(图5和6；SEQ ID No:11-25、27-43、45和46)，其使TSHR260-WT的热稳定性显著改良至少60％，在42℃所述蛋白质的半衰期增加17分钟(表3)。最佳的单一突变体I253R(SEQ IDNo:45)在42℃使TSHR260-WT的热稳定性改良3.0±0.4倍，即在42℃的TSHR260半衰期增加53±6分钟(图7a)。在50℃的热稳定性比TSHR260-WT也改良2.85±0.13倍。
令人惊奇地，具有最佳热稳定性作用的17个突变遍及分布在TSHR260结构中(图9)，但是大多数分布在LRD的凸面或者凸面与凹面之间的边缘。在LRD的凸面上有7个突变(P142I、D143P、S166T、I167F、P168Y、V169R和N170W)，在边缘有6个突变(T62V、H63C、L64Y、R112P、T179C、R255Y)，仅3个在凹面(L59F、D151E和I253R)，P28E在晶体结构中不可见。Leu59和Ile253在凹面侧，但是与晶体结构中的M22-Fab不相互作用(PDB code3G04；Sanders J et al(2007)如前)。在这些热稳定性突变体中，Asp151是与形成在晶体结构中所示的盐桥的M22-Fab直接相互作用的唯一残基。因此，将Asp151突变为另一阴性氨基酸Glu以维持盐桥相互作用。
斑点印迹结果(以确定表达的TSHR的总量，即活性加上非活性TSHR)
在TSHR260结合测定中检测的TSHR260量根据不同突变体而变化(0％-1000％的TSHR260-WT)，因此使用斑点印迹测定测量表达的每个突变体的总量。斑点印迹测定的结果在表4中示出。通过斑点印迹测定测量的表达水平相对于TSHR260-WT加以定义并与也相对于TSHR260-WT定义的TSHR260结合测定的结果对比。计算TSHR260结合测定结果与斑点印迹结果之间的比率(TSHR260结合测定结果÷斑点印迹结果)以确定在斑点印迹测定中检测的TSHR260总量与在TSHR260结合测定中检测的活性TSHR260的量之间何时存在较大差异。
双重突变体
如表5所示，TSHR260的双重突变体通过在最佳稳定性突变加入突变P142I(SEQ IDNo:35)和I253R(SEQ ID No:45)而产生；突变体JMG1–JMG15和JMG31是具有P142I的双重突变体。突变体JMG15–JMG29是具有I253R的双重突变体。尽管P142I具有较大的热稳定性影响，使TSHR260的热稳定性改良5倍，但是其在极低水平表达。这种低表达水平在包含P142I的双重突变体的情况中也观测到。因此，仅对I253R突变体继续进一步的诱变和热稳定性测定。
与P142I相似，单一突变体T62V、L64Y、P142I、I167F、P168Y、N170W和T179C也具有低表达水平(表4)，这在含有这些突变的双重和三重突变体中也观测到。实际上，这些突变不用于进一步的突变体组合。
双重突变的稳定性在42℃(表6)和50℃(表7)测量。检测的所有双重突变相对于TSHR260-WT和单一突变体TSHR260-I253R均改良热稳定性。最具热稳定性的双重突变体是JMG22(I253R+D143P)(分别为SEQ ID No:45和36)，其热稳定性改良为在42℃是TSHR260-WT的9.3±0.5倍，在50℃是15.1±0.7倍，半衰期分别为261±45分钟和23.8±0.7分钟(图7a，b)。
三重突变体
突变体JMG30–JMG42是TSHR260的三重突变体，在最稳定的双重突变中加入突变D143P(SEQ ID No:36)(表5)。两个三重突变体I167F+D143P+I253R和T179C+D143P+I253R由于其各自的双重突变体JMG25(I167F+I253R)和JMG29(T179C+I253R)示出差表达水平而未产生。
建立三重突变体在50℃的热稳定性曲线并与I253R在50℃的热稳定性对比(表8)。最具热稳定性的三重突变体是JMG37(I253R+D143P+R112P)(分别为SEQ ID No:45、36和34)，其在50℃的半衰期为69±3分钟，是TSHR260-I253R的热稳定性的16.6±0.5倍(图7b，c)。
四重突变体
突变体JMG43–JMG48是TSHR260的四重突变体，在最具热稳定性的三重突变体中加入突变R112P(SEQ ID No:34)(表5)。确定四重突变体在50℃和55℃的热稳定性曲线并与I253R在这些温度的热稳定性对比(表8和表9)。最具热稳定性的四重突变体是JMG45(I253R+D143P+R112P+D151E)(分别为SEQ ID No:45、36、34和37)，其在50℃的半衰期是226±31分钟，是TSHR260-I253R热稳定性的58±6倍(图7c)。在55℃，其半衰期为27±3分钟，是TSHR260-I253R热稳定性的54±7倍(图7d)。在60℃，其半衰期是2.40±0.16分钟。
五重突变体
突变体JMG49–JMG52是TSHR260的五重突变体，其中将D151E(SEQ ID No:37)加入四重突变体中(表5)。最具热稳定性的五重突变体是JMG52(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R)(分别为SEQ ID No:45、36、34、37和41)(表9和表10)。其在55℃的半衰期是66±12分钟，是TSHR260-I253R热稳定性的125.1±0.6倍(图7d)。在60℃其半衰期是7.1±0.6分钟，是TSHR260-JMG45热稳定性的3.0±0.2倍(图7e)。
六重突变体
六重突变是通过将S166T(SEQ ID No:38)或V169R(SEQ ID No:41)突变加入五重突变体JMG50中获得JMG54(I253R+D143P+R112P+D151E+H63C+S166T)(分别为SEQ ID No:45、36、34、37、32和38)和JMG55(I253R+D143P+R112P+D151E+H63C+V169R)(SEQ ID No:45、36、34、37、32和41)而产生(表5和表10)。它们在55℃太热稳定以至于不能精确测量，因此在60℃测量热稳定性(图7e)。JMG54在60℃的半衰期为9.6±1.5分钟，是TSHR260-JMG45热稳定性的4.0±0.4倍。JMG55在60℃的半衰期是13±3分钟，是TSHR260-JMG45热稳定性的5.2±0.9倍。JMG55的热稳定性是TSHR260-JMG45的5.2倍，TSHR260-JMG45是TSHR260-I253R热稳定性的56倍，TSHR260-I253R是TSHR260-WT热稳定性的3.1倍。其它热稳定性比率的对比提示组成成分的稳定性比率可以相乘以获得总体的热稳定性比率(表12)。因此，JMG55的热稳定性是TSHR260-WT的大约900倍。
在37℃的热稳定性
在37℃测量最稳定的单一、双重、三重、四重、五重和六重TSHR260突变体(I253R，JMG22(I253R+D143P)，JMG37(I253R+D143P+R112P)，JMG45(I253R+D143P+R112P+D151E)，JMG52(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R)和JMG55(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R+H63C))相对于TSHR260-WT的热稳定性。从在37℃的热稳定性曲线计算突变体的半衰期，示于表11。表11还示出每个突变体与TSHR260-WT相对比的稳定性比率。这些结果与在其它温度观测的稳定性比率一致(表12)。
对比最具热稳定性的突变体在一定温度范围的热稳定性
在不同温度即在42℃和50℃，突变体与TSHR260-WT相比的稳定性比率无明显变化。高于50℃，TSHR260-WT是不稳定的以至于其不能用作参考制备物。因此，选择更合适的突变体代替。然后将使用这种更稳定的突变体作为参考而获得的稳定性比率乘以所述稳定的参考突变体与TSHR260-WT相比的稳定性比率(表12)。例如，在55℃JMG37的热稳定性是I253R的12.0±0.9倍，I253R的热稳定性是TSHR260-WT的3.1倍。因此计算在55℃JMG37的热稳定性是TSHR260-WT的12.0×3.1＝37±3倍，这非常符合在37℃相对于TSHR260-WT测量的热稳定性比率(34±5倍)。
在14C4平板上包被的全长TSHR和突变体的热稳定性
结合用14C4-Fab2包被的ELISA平板的全长TSHR-WT(SEQ ID No:2)、TSHR-JMG37(SEQ ID No:45，36，34)、TSHR-JMG45(SEQ ID No:45，36，34，37)、TSHR-JMG52(SEQ ID No:45，36，34，37，41)和TSHR-JMG55(SEQ ID No:45，36，34，37，32，41)的热稳定性通过在42℃或50℃加热平板而确定。出乎意料地，全长TSHR突变体TSHR-JMG37、TSHR-JMG45、TSHR-JMG52和TSHR-JMG55比TSHR-WT热稳定性显著更高(表13，表14)。在50℃，TSHR-WT的半衰期为33分钟，TSHR-JMG37的半衰期为110分钟，是TSHR-WT热稳定性的3.4倍；TSHR-JMG45的半衰期是173分钟，是TSHR-WT热稳定性的5.3倍；TSHR-JMG52的半衰期是175分钟，是TSHR-WT热稳定性的5.4倍；TSHR-JMG55的半衰期是226分钟，是TSHR-WT热稳定性的6.9倍(图8)。
结合TSHR260和全长TSHR突变体的M22-POD,K1-18-POD和K1-70-POD
通过改变结合TSHR260突变体或全长TSHR突变体包被的ELISA平板的TRAb-过氧化物酶缀合物(即M22-POD、K1-18POD或K1-70POD)的浓度及通过与底物四甲基联苯胺保温检测TRAb-过氧化物酶缀合物的结合从而检测结合TSHR260突变体和全长TSHR的M22-POD、K1-18POD和K1-70 POD。结合常数(Kd)是半数受体(TSHR或TSHR260突变体)结合配体(TRAb-过氧化物酶)时的配体的浓度，适当时相对于TSHR260-WT或全长TSHR-WT的结合常数加以确定。检测的突变不影响全长TSHR或TSHR260与任何M22-POD、K1-18-POD或K1-70-POD的结合(表15-表21)。
K1-18 IgG和K1-70 IgG抑制M22-POD结合TSHR260突变体和全长TSHR突变体
将受体(TSHR260突变体和全长TSHR突变体)和与M22结合相同位点的不同浓度的K1-18IgG和K1-70IgG保温，在与M22-POD保温之前，测量M22-POD结合的抑制情况并示出受体-抗体相互作用是否受热稳定性突变影响。K1-18IgG和K1-70IgG抑制M22-POD与TSHR260突变体和全长TSHR突变体的结合，程度分别与TSHR260-WT和全长TSHR-WT相似。这些结果示出所述突变不影响单克隆TSHR抗体与TSHR260或全长TSHR的结合(表22-表25)。
通过TRAb阳性患者血清抑制M22-POD结合TSHR260和全长TSHR突变体
为确定热稳定的TSHR260和全长TSHR的突变体是否适用于检测患者血清中TRAb的测定中，测量患者血清抑制M22-POD结合TSHR260-WT、TSHR260-JMG52、TSHR260-JMG55全长TSHR-WT、TSHR-JMG45和TSHR-JMG52的能力(图12c，图14e)。患者血清抑制M22-POD结合TSHR260-JMG52和TSHR260-JMG55的能力与TSHR260-WT相似(表27，表29)。此外，患者血清抑制M22-POD结合全长TSHR-JMG45和全长TSHR-JMG52的能力与全长TSHR-WT相似(表28，表29)。因此，热稳定的TSHR260或全长TSHR突变体适用于检测患者血清中TRAb的测定中。
TSHR刺激分析
TSH、M22Fab和K1-18IgG对全长TSHR和全长TSHR突变体(在FlpIn CHO细胞中表达)的刺激通过测量使用不同浓度的TSH、M22-Fab或K1-18IgG产生的环AMP的量确定。在每个测定中，将TSHR突变体的刺激与在相同测定中检测的TSHR-WT刺激对比。计算每个突变体的EC50即产生50％最大刺激应答的激动剂(TSH、M22-Fab或K1-18IgG)的浓度并与TSHR-WT对比(表30-表39)。令人惊奇地，所述突变对于应答TSH、M22或K1-18刺激的环AMP产生无明显影响，但是相对于TSHR-WT，M22对于四重突变体TSHR-JMG45(I253R+D143P+R112P+D151E)、五重突变体TSHR-JMG52(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R)和六重突变体TSHR-JMG55(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R+H63C)的EC50略有增加(表38)。
TRAb阳性患者血清对于全长TSHR-WT、TSHR-JMG45和TSHR-JMG52的刺激也进行测量并与健康血液供体血清的作用对比。患者血清对突变的全长TSHR的刺激与对TSHR-WT的刺激非常相似(表40和表41)。
热稳定性人TSHR突变在其它物种TSHR及其它糖蛋白激素受体中的可转移性
在目前从不同的哺乳动物物种可获得的TSHR序列之间存在高度序列同源性(86-97.5％序列相同性)。这提示在人TSHR(hTSHR)中鉴别的大多数热稳定性突变在这些同源物中也是热稳定性的。表42示出在人TSHR中为改良热稳定性而突变的大多数氨基酸在跨物种中是保守的。Pro28、Leu59、Thr62、Leu64、Arg112、Pro142、Asp143、Asp151、Ser166、Pro168、Asn170、Thr179和Ile253在所有物种中是保守的(表42)。在热稳定性突变H63C的情况中，位置63在狗TSHR中是Gln，而在猕猴和黑长尾猴中是Arg而不是His。由于这些残基与His和Cys非常不同，因此难以预测突变为Cys是否仍然是热稳定性的。关于热稳定性突变I167F，在小鼠、大鼠和绵羊中，位置167是Val而不是Ile。由于Ile和Val是相似的脂肪族氨基酸，因此很可能突变为Phe仍然是热稳定性的。在热稳定性突变V169R的情况中，位置169在猪、牛、猫、狗、绵羊和马TSHR序列中是Ala，这与在人中存在的脂肪族Val相似，因此预期突变为Agr在这些TSHR中也是热稳定性的。相反，在小鼠和大鼠中，残基169是Glu，这是如Arg的带电荷的残基,因此突变为Arg也许不具有如在人TSHR中的惊人的稳定作用。关于热稳定性突变R255Y，小鼠和大鼠在位置255具有Lys而不是在其它TSHR序列中存在的Arg，其均是带正电荷的氨基酸。因此，在位置255突变为Tyr仍然可是热稳定性的。
在hTSHR(SEQ ID No:2)与其它糖蛋白hFSHR(SEQ ID No:57)(50％序列相同性)和hLHR(SEQ ID No:58)(53.3％序列相同性)之间存在较低的序列相同性。然而，序列比对(图11)表明hTSHR中许多热稳定性突变的残基相应于在hFSHR和hLHR中相同或相似的残基。因此，许多热稳定突变很可能是可转移的(表43)。在FSHR中，预期T56V、L58Y、N106P、P136I、D137P、Q145E、I160F、N163W、S172C和R247Y是热稳定性的。在LHR中，预测相应的突变P33E、L56F、V61Y、K109P、P139I、D140P、I164F、P165Y、N167W、S176C和I249R是热稳定性的。
进一步热稳定TSHR260-突变体
产生两个更具热稳定性的五重TSHR260突变体并检测其热稳定性：TSHR260-JMG57(I253R+D143P+R112P+V169R+H63C)(分别为SEQ ID No:45、36、34、41和32)和TSHR260-JMG58(I253R+D143P+R112P+S166T+H63C)(分别为SEQ ID No:45、36、34、38和32)的半衰期在55℃分别为40±2分钟和31.4±0.4分钟，是四重突变体TSHR260-JMG45的1.64±0.07和1.28±0.05倍。TSHR260-JMG57和TSHR260-JMG58在M22-POD结合测定抑制中还保持检测患者血清的能力(图12c，表44)。
在桥连ELISA中M22 IgG、K1-70 IgG和K1-18 IgG与碱性磷酸酶标记的TSHR260突变体的结合
所述测定(图13a)依赖于人单克隆刺激型TSHR自身抗体(M22IgG和K1-18IgG)及人单克隆阻断型TSHR自身抗体(K1-70IgG)在固定的全长野生型TSHR和碱性磷酸酶标记的TSHR260突变体(TSHR260-AP-I253R、TSHR260-AP-JMG22、TSHR260-AP-JMG37、TSHR260-AP-JMG45、TSHR260-AP-JMG52、TSHR260-AP-JMG55、TSHR260-AP-JMG57和TSHR260-AP-JMG58)之间形成桥的二价性质(见关于SEQ ID No的“产生含有稳定氨基酸突变的TSHR260-AP构建体”章节中的描述)。当在健康血液供体血清集合中稀释时，M22IgG、K1-70IgG和K1-18IgG均以相似的剂量依赖性方式结合TSHR260-AP突变体及野生型TSHR260-AP(表45 a-c；e-g)。此外，当在测定缓冲液中稀释时，M22IgG、K1-70IgG和K1-18 IgG均以相似的剂量依赖性方式结合TSHR260-AP突变体及野生型TSHR260-AP(表46a-c；e-g)。检测在健康血液供体血清或者测定缓冲液中稀释的阴性对照人单克隆GAD自身抗体(5B3IgG)的结合(表45d和表46d)。在5B3 IgG(阴性对照抗体)与野生型TSHR260-AP或TSHR260-AP突变体之间观测到无结合(在健康血液供体血清中稀释的吸光度为0.0016-0.033，在测定缓冲液中稀释的为0.001-0.034)。这些实验证实具有刺激或阻断活性的人单克隆TSHR自身抗体结合碱性磷酸酶标记的TSHR260突变体的能力。
在桥连ELISA中TRAb阳性和TRAb阴性血清与碱性磷酸酶标记的TSHR260突变体的结合
检测12个TRAb阳性患者血清(G1-G12)和11个TRAb阴性患者血清(N1-N11)与固定的全长TSHR和碱性磷酸酶标记的TSHR260(TSHR260-AP)突变体(TSHR260-AP-I253R，TSHR260-AP-JMG22，TSHR260-AP-JMG37，TSHR260-AP-JMG45，TSHR260-AP-JMG52，TSHR260-AP-JMG55，TSHR260-AP-JMG57和TSHR260-AP-JMG58)之间二价结合并形成桥的能力(图13a)。TRAb阳性和TRAb阴性血清对于野生型和突变体TSHR260-AP的结合是相似的(表47a)。使用K1-70IgG标准曲线计算每个患者血清的TRAb浓度示出计算的突变体TSHR260-AP构建体的TRAb浓度与野生型TSHR260-AP测定的平均值充分对比(表47b)。对用每个TSHR260-AP突变体获得的结果与用野生型TSHR260-AP确定的平均TRAb浓度对比进行Pearson相关性测定，给出良好的r-值(表47c)，表明患者血清TRAb以相似方式结合野生型TSHR260-AP及TSHR260-AP突变体。
TSHR260-AP突变体的热稳定性
使用一式两份测量方式，针对每个TSHR260-AP构建体在每个温度，通过将指数曲线拟合时程数据(0-3小时)计算TSHR260-AP突变体半衰期(t1/2)(图13b)。每个构建体在每个检测温度的半衰期在表48中示出。将每个TSHR260-AP突变体的半衰期与TSHR260-AP-JMG45(65℃)、TSHR260-AP-JMG22(60℃)或TSHR260-AP-WT(50℃)的半衰期对比。由此可以计算预测的稳定性比率以示出每个TSHR260-AP突变体与TSHR260-AP-WT相比的整体稳定性。TSHR260-AP-JMG22、TSHR260-AP-JMG45和TSHR260-AP-JMG55的半衰期比TSHR260-AP-WT分别高大约11倍、66倍和165倍。尽管TSHR260-AP-WT和TSHR260-AP突变体的稳定性增加与无碱性磷酸酶融合蛋白的TSHR260相比降低，但是TSHR260-AP构建体的热稳定性高于无碱性磷酸酶的等价构建体。TSHR260-AP-WT在50℃的半衰期是野生型TSHR260(无碱性磷酸酶)的半衰期的2.9倍。相似地，在60℃，TSHR260-AP-JMG45和TSHR260-AP-JMG55的半衰期分别是无碱性磷酸酶的等价TSHR260构建体的半衰期的3.2倍和1.5倍。
纯化野生型TSHR260
在使用阴离子交换层析纯化之后，洗脱的野生型TSHR260集合在TSHR260桥连抑制ELISA中比加样于阴离子交换柱的初始材料低大约80倍的活性(图25a)。这些结果证实野生型TSHR260在纯化期间是固有地不稳定的，在仅一次阴离子交换层析纯化之后就丧失80倍的活性。
纯化与TSHR单克隆抗体(14C4、2H11、25E1、23H4、36F11或9B7)复合的野生型TSHR260
先前我们已经示出当TSHR260(野生型)与人单克隆甲状腺刺激性自身抗体M22复合时可以被稳定、纯化和晶体化(WO 2008/025991A1)。然而，M22以高亲和性(5×1010L/mol)结合TSHR260片段，不易于解离且抑制患者血清自身抗体与TSHR260片段的结合(EP1565493B1,Nakatake et al.(2006)Thyroid,16:1077-1084)。因此，TSHR260-M22复合物的形成和纯化不能用作非复合的TSHR260的纯化方法用于检测患者自身抗体与TSHR的结合或其它目的的测定系统中。
通过离子交换层析纯化与14C4IgG、25E1IgG、2H11IgG、36F11IgG或9B7IgG(TSHR凸面的TSHR单克隆抗体，其不与M22竞争结合TSHR)复合的野生型TSHR260，在TSHR260-AP桥连抑制性ELISA中分析之后示出在洗脱的材料相对于加样材料的相似活性(活性降低小于2倍)(分别见图13c，图25b、c、d、f和g)。然而，23H4IgG(TSHR凸面的进一步的单克隆抗体)在稳定野生型TSHR260方面较低效，通过在TSHR260桥连抑制性ELISA中测量，在阳离子交换层析之后洗脱的材料比加样于该层析柱的初始材料的活性低大约15倍(图25e)。这些实验示出与不同的TSHR小鼠单克隆抗体(14C4、2H11、25E1或23H4、36F11IgG或9B7IgG；其结合远离患者血清自身抗体结合位点的TSHR的凸面)复合的野生型TSHR260的纯化在一个离子交换层析周期期间能稳定野生型TSHR260。
纯化TSHR260-JMG55
通过对含有TSHR260-JMG55的36L昆虫细胞培养上清进行阳离子交换层析的初始纯化示出：经在TSHR260结合测定中测量TSHR260-JMG55的比活性增加529倍，从30U/mg增加至15,872U/mg(图12a，表49)。TSHR260-JMG55的单位相对于TSHR260标准物定义，如在“使用Freestyle Max试剂在CHO-K1细胞中瞬时转染TSHR260突变体”章节中描述。
在TSHR260桥连抑制ELISA(图13c)中对初始加样材料和从层流柱洗脱的材料集合进行分析示出洗脱的材料相对于加样材料相似的活性(总活性降低大约3-4倍)(图25h)。
使用TSHR MAb 14C4亲和性柱进一步纯化TSHR260-JMG55，获得两种不同形式TSHR260-JMG55的纯化(图26)。在pH 5.0用14C4亲和性柱洗脱提供纯化的TSHR260-JMG55-5.0，其具有12,041U/mg的低比活性，而在pH 4.5洗脱时提供纯化的TSHR260-JMG55-4.5，其具有11,443,46U/mg的高比活性(表49)。对高活性TSHR260-JMG55-4.5使用镍亲和性层析进一步纯化使纯化的蛋白质的比活性增加至6,414,000U/mg，相比于初始培养上清的整体纯化水平为213,708(表49和表50a)。相反，使用镍亲和性层析对低活性TSHR260-JMG55-5.0的最终纯化提供纯化的蛋白质比活性为20,361U/mg，相比于初始培养上清的整体纯化水平为679(表49和表50b)。
将两种形式的纯化的TSHR260-JMG55在12％非还原SDS PAGE上作为大约34kDa的单一条带运行(图27)。在最终纯化之后，获得0.665mg高比活性的TSHR260-JMG55-4.5(6,414,000U/mg)和0.927mg低比活性的TSHR260-JMG55-5.0(20,361U/mg)。
K1-18-POD、K1-70-POD和M22-POD以剂量依赖性方式结合纯化的JMG55-TSHR260-4.5包被的ELISA平板孔(表51)。
TSHR260-JMG55-4.5的去糖基化
将纯化的TSHR260-JMG55-4.5在没有Endo F3的去糖基化缓冲液中在20℃保温1、3和5天，示出分子量无降低(图28A)。相反，在具有40mU/mg、60mU/mg或80mU/mg的Endo F3的TSHR260-JMG55-4.5的去糖基化中，分别在120小时、72小时和24小时分子量最大降低大约2kDa(图28A和28B)。在20℃保温120小时后，去糖基化TSHR260-JMG55-4.5的活性分析在TSHR260结合测定(图12a)中确定并与在-70℃贮存的未处理的纯化的TSHR260-JMG55-4.5材料的活性对比(表52)。将TSHR260-JMG55-4.5在没有酶(0mU/mg)或者与40mU/mg、60mU/mg或80mU/mg的酶保温分别提供未处理的纯化的TSHR260-JMG55-4.5材料的活性的111％、100％、104％和104％。
纯化的TSHR260-JMG55-4.5蛋白在三次柱层析(层流HST，14C4亲和性层析和镍亲和性次层析)并通过用Endo F3去糖基化除去大约2kDa糖基之后保留其活性且是稳定的。
与野生型TSHR260相反，TSHR260-JMG55突变的TSHR可以通过不加入TSHR单克隆抗体以形成稳定的复合物的三次柱层析(层流HST，14C4亲和性层析及随后镍亲和性层析)成功纯化。从培养上清中纯化了两种不同形式的活性TSHR260-JMG55，高比活性形式(TSHR260-JMG55-4.5)，其比活性为6,414,000U/mg，及低比活性形式，其比活性为20,361U/mg(低315倍)。在TSHR260结合测定中观测到去糖基化的纯化的TSHR260-JMG55-4.5是活性的，进一步证实突变的TSHR片段的增加的稳定性。
热稳定的人TSHR突变至小鼠和猪TSHR的可转移性
将最具热稳定性的人TSHR突变体JMG55(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R+H63C)的等价突变转移至小鼠TSHR(I253R+D143P+R112P+D151E+E169R+H63C)(图23：SEQ ID No:67为核苷酸序列，图24：SEQ ID No:68为氨基酸序列)和猪TSHR(I253R+D143P+R112P+D151E+A169R+H63C)(图21：SEQ ID No:65为核苷酸序列，图22：SEQ ID No:66为氨基酸序列)(表54)。6个突变的残基中的5个在人、小鼠和猪TSHR中是相同的。只有残基169在物种之间不同：在人TSHR中其是缬氨酸，在小鼠TSHR中其是谷氨酸及在猪TSHR中其是丙氨酸。将小鼠和猪TSHR的残基169突变为如在人TSHR-JMG55中的精氨酸。将全长突变体小鼠TSHR和猪TSHR与各自的全长野生型TSHR对比热稳定性、与125I-TSH的结合亲和性及当转染进CHO细胞中时的刺激应答。
全长野生型和突变的小鼠、猪和人TSHR的热稳定性
在稳定性测定B中在45℃测量全长野生型和突变的小鼠、猪和人TSHR的热稳定性(图14c)。稳定性测定B包括将TSHR突变体与4E31包被的平板结合过夜，然后在水浴中在45℃加热该平板直至3小时。在加热后保留的活性TSHR的百分比在TSHR结合测定中测量(图14a，表55)。
突变使小鼠TSHR热稳定性增加6.3倍(半衰期从2.15分钟至13.6分钟)。猪TSHR的热稳定性也相似增加(半衰期从3.6分钟至12.1分钟，热稳定性改良3.34倍)。突变的人TSHR(TSHR-JMG55，半衰期184分钟)的热稳定性是野生型人TSHR(半衰期4.8分钟)的39倍。这示出在人TSHR中发现的热稳定性突变可转移至其它物种的TSHR并改良其热稳定性，然而热稳定性的改良不如在人TSHR-JMG55中观测到的热稳定性改良的明显。
在CHO细胞中表达的小鼠和猪野生型和突变的TSHR的刺激
由TSH和M22Fab对全长野生型小鼠和猪TSHR和全长小鼠和猪TSHR-JMG55等价突变体(表54)(在Flp-In CHO细胞中表达)的刺激通过测量用不同浓度的两种TSHR激动剂(TSH或M22-Fab)产生的环AMP的量而评定。在每个测定中，对比TSHR突变体的刺激与TSHR-WT的刺激(在相同测定中测量)。计算每个突变体的EC50，即产生50％最大刺激应答的激动剂的浓度，并与TSHR-WT对比(表56和表57)。与全长人TSHR-WT和全长人TSHR-JMG55突变相似，与等价小鼠或猪TSHR-WT相比，JMG55等价突变对于应答TSH或M22刺激的环AMP产生无明显作用。
125I-TSH与溶解的全长人、小鼠和猪TSHR(野生型和突变的)的结合亲和性
125I-TSH结合人、小鼠和猪野生型TSHR(在CHO细胞中表达及洗涤剂溶解的)给出相似的亲和性常数，分别为1.80×109L/mol、1.58×109L/mol和1.99×109L/mol(表58)。125I-TSH结合洗涤剂溶解的全长突变的人(JMG55)、小鼠和猪TSHR(JMG55等价物；表54)也示出与野生型TSHR相似的亲和性常数(分别为0.98×109L/mol、0.87×109L/mol和1.25×109L/mol)。这表明在不同的TSHR种类中，TSH与全长TSHR的结合不受JMG55等价TSHR突变的影响。
单一突变对于TSHR-JMG55的跨膜结构域(TMD)的热稳定性作用
在TSHR的跨膜结构域中鉴别总共56个可能的热稳定性突变：10个TSHR共有突变，19个TSHR失活突变，26个GPCR热稳定性突变及既是在TSHR中失活的也是在β1-肾上腺素受体中是热稳定性的1个突变(Y601A)(表59)。将这些单一突变加入已经在LRD含有6个热稳定性突变(I253R、D143P、R112P、D151E、H63C和V169R)(SEQ ID No:45、36、34、37、32和41)的全长TSHR-JMG55中。
所述突变体当结合14C4包被的平板或者4E31平板时在测定中示出不同的活性水平(图14a)。这提示一些突变影响TSHR与这些抗体的结合。为此，检测突变体在这两种形式测定中的活性及将样品适当稀释以在每个测定中提供相似的OD450读数(在2.0-2.5OD450之间)。D460A和S505A不具有足够高的活性以确定其热稳定性。由于在14C4热稳定性测定(A)中的低活性，因此C600R的热稳定性只可以在4E31热稳定性测定(B和C)中确定。
以三种不同方式测量结合用14C4-Fab2或4E31-Fab2包被的ELISA平板的全长TSHR-JMG55和突变体的热稳定性。稳定性测定A包括通过在4℃保温过夜使TSHR突变体结合14C4包被的ELISA平板孔，然后将孔在水浴中在55℃加热直至2小时(图14b)。相似地，稳定性测定B包括通过在4℃保温过夜使TSHR突变体结合4E31包被的ELISA平板孔，然后将孔在水浴中在55℃加热直至2小时(图14c)。相反，稳定性测定C包括在33℃加热在溶液中的TSHR突变体直至2小时，随后结合4E31包被的ELISA平板孔(图14d)。在所有情况中，在TSHR结合测定中测量在加热后保留的活性TSHR的百分比(图14a)。
TSHR260野生型和TSHR260突变体是TSHR的小球状结构域。在这个相对简单的情况中，通过加热失活蛋白质随着时间精确地拟合单相指数衰减曲线，从中计算半衰期(t1/2)。然而，全长TSHR是多结构域蛋白质，因此在蛋白质的折叠与解折叠状态之间存在过渡状态。因此，在稳定性测定C中，其中蛋白质在溶液中加热(图14d)，TSHR解折叠更好地作为双相衰减的模型，即蛋白质的衰减是两个衰减过程的总和，一个快速衰减，一个慢速衰减，产生描述解折叠过程的两个参数“半衰期(慢)”和“半衰期(快)”及第三个参数“PercentFast”，衰减过程的百分比由快速衰减过程描述。直接对比这三个参数更复杂，因此进行在加热10、30和120分钟后保留的活性TSHR的百分比对比。或者，表观半衰期通过确定TSHR丧失其50％活性的时间点而估算。在稳定性测定A和B的情况中(图14a和图14b)，TSHR结构域之一由抗体14C4或4E31束缚于平板。这导致加热失活过程更接近单相指数衰减，因此可以确定并对比在这些测定中TSHR突变体的半衰期。对于所有测定，TSHR-JMG55的热稳定性均在相同实验中测量并用于确定每个TSHR突变体的半衰期比率。
令人惊奇地，检测的大多数突变在至少一个稳定性测定中是热稳定性的(半衰期比率≥1.3)。检测的54个突变中仅两个突变C599S和I622A在所有三个热稳定性测定中是中性或者不稳定的(表60)。20个最具热稳定性的TSHR-JMG55突变是：E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、T477I、Q489H、K565L、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671A、Y678L和Y678A(图29、30，SEQ ID No：69-88(DNA)及89-108(蛋白质))。这些突变使TSHR-JMG55的稳定性在稳定性测定A中增加直至4.5倍，在稳定性测定B中增加直至1.6倍，及在稳定性测定C中增加直至15倍。
TSHR-JMG55的TMD中双重突变的热稳定性
选择三个单一TSHR-JMG55TMD突变体T477I、V595I和I648L(图30；分别为SEQ IDNo:97、100和103)进一步诱变，因为其在所有三个热稳定性测定中均显著增加热稳定性。将这三个突变互相组合及与其它最具热稳定性的单一突变(n＝17)组合，形成TSHR-JMG55的双重突变体(表61及图29和30；分别为SEQ ID No:69-88和SEQ ID No:89-108)。突变体JMG59至JMG73是与T477I组合，突变体JMG74至JMG92是与V595I组合，及JMG93至JMG111是与I648L组合。JMG66与JMG82是相同的(JMG55+T477I+V595I)，JMG68与JMG101是相同的(JMG55+T477I+I648L)，JMG87与JMG104是相同的(JMG55+V595I+I648L)。未产生构建体JMG85(JMG55+V595I+C600R)，因为突变V595I和C600R太接近及很可能彼此干扰。
将所有这些双重突变体JMG59至JMG111在热稳定性测定C中测定(图14d)，并与单一突变体T477I、V595I或I648L在相同测定中的热稳定性对比(表62)。15个T477I双重突变体(JMG59至JMG73)中的5个突变体相对于T477I是热稳定性的(定义为半衰期比率≥1.1)。18个V595I双重突变体(JMG74至JMG92)中的12个突变体相对于V595I是热稳定性的，19个I648L双重突变体(JMG93至JMG111)中的12个突变体相对于I648L是热稳定性的(JMG111在热稳定性测定中活性不足以进行检测)。JMG87[JMG55(SEQ ID No:45、36、34、37、32、41)+V595I(SEQ ID No:100)+I648L(SEQ ID No:103)]、JMG90[JMG55(SEQ ID No:45、36、34、37、32、41)+V595I(SEQ ID No:100)+S671A(SEQ ID No:106)]和JMG91[JMG55(SEQ ID No:45、36、34、37、32、41)+V595I(SEQ ID No:100)+Y678L(SEQ ID No:107)]在热稳定性测定C中是最具热稳定性的V595I突变体。
由于V595I双重突变体(JMG74至JMG92)的热稳定性最高且在14C4和4E31测定中不具有如针对T477I双重突变体观测到的那些巨大活性差异，因此在稳定性测定A和B中进一步分析JMG74至JMG92突变体(图14b、c；表63)。所有这些突变体在至少一个这些热稳定性测定中相对于V595I是热稳定性的。在稳定性测定A中，在55℃的半衰期从TSHR-JMG55-V595I的27分钟增加至JMG82(JMG55+V595I+T477I)[JMG55(SEQ ID No:45、36、34、37、32、41)+V595I(SEQ ID No:100)+T477I(SEQ ID No:97)]的59分钟。在稳定性测定B中具有最高热稳定性的突变体是JMG84(JMG55+V595I+K565L)[JMG55(SEQ ID No:45、36、34、37、32、41)+V595I(SEQ ID No:100)+K565L(SEQ ID No:99)]，在55℃的半衰期是38分钟，是TSHR-JMG55-V595I的18分钟半衰期的2.4倍。然而，选择JMG91(JMG55+V595I+Y678L)和JMG84(JMG55+I+L)，因为该突变体在所有三个热稳定性测定中均是全方位最佳热稳定性的。在稳定性测定A中，JMG91在55℃的半衰期是48分钟，较TSHR-JMG55-V595I改良1.8倍，在稳定性测定B中，其在55℃的半衰期是30分钟，较TSHR-JMG55-V595I改良1.7倍，在稳定性测定C中，其在33℃的半衰期是108分钟，较TSHR-JMG55-V595I改良2.1倍。这等价于在33℃保温10、30和120分钟之后存活率分别为80％、64％和49％，稳定性分别提高1.3、1.1和1.3倍。在稳定性测定A中，JMG84在55℃的半衰期为44分钟，较TSHR-JMG55-V595I改良1.6倍，在稳定性测定B中，其在55℃半衰期为38分钟，较TSHR-JMG55-V595I改良2.4倍，在稳定性测定C中，其在33℃的半衰期为102分钟，较TSHR-JMG55-V595I改良1.6倍。这等于在保温10、30和120分钟之后存活率分别为72％、60％和48％，稳定性提高分别为1.1、1.1和1.4倍
TSHR-JMG55的TMD中三重突变的热稳定性
将TSHR-JMG91和TSHR-JMG84组合在双重TSHR突变体热稳定性测定中是热稳定的15个单一突变(表61)。由于这些突变体的增加的热稳定性，在稳定性测定C中，将溶解的TSHR突变体在40℃加热而不是先前所用的33℃。虽然一些三重突变体在稳定性测定A和B中相对于双重突变体TSHR-JMG91(JMG55+V595I+Y678L)或TSHR-JMG84(JMG55+V595I+K565L)是热稳定性的，但是仅有以TSHR-JMG84为基础的全长TSHR-JMG55的三重TMD突变体(JMG127至JMG142)在40℃在热稳定性测定C中是热稳定性的(表64)。整体最具热稳定性的TSHR-JMG55的三重突变体是TSHR-JMG131(JMG55+V595I+K565L+N455A)[JMG55(SEQ ID No:45,36,34,37,32,41)+V595I(SEQ ID No:100)+K565L(SEQ ID No:99)+N455A(SEQ ID No:93)]。在稳定性测定A中，TSHR-JMG131在55℃的半衰期是60分钟，较TSHR-JMG84的38±4分钟半衰期改良1.5倍。在稳定性测定B中，在55℃，TSHR-JMG131半衰期是32分钟，较TSHR-JMG84的23±7分钟半衰期改良1.1倍。在40℃稳定性测定C中，TSHR-JMG131半衰期是47分钟，是在40℃半衰期为14±3分钟的TSHR-JMG84的热稳定性增加3.5倍。
结合TSHR TMD突变体的M22-POD、K1-70-POD和K1-18-POD
结合全长TSHR突变体TSHR-JMG55、TSHR-JMG55-V595I、TSHR-JMG84(JMG55+V595I+K565L)和TSHR-JMG91(JMG55+V595I+Y678L)的M22-POD,K1-18-POD和K1-70-POD通过改变结合TSHR突变体包被的ELISA平板的TRAb-过氧化物酶缀合物(即M22-POD、K1-18POD或K1-70POD)的浓度及通过与底物四甲基联苯胺保温检测TRAb-过氧化物酶缀合物的结合而进行检测(图14a)。确定结合常数(Kd)，即在一半的受体结合配体时的配体(TRAb-过氧化物酶)浓度(表65)。相对于TSHR-JMG55，检测的突变不影响TSHR突变体与任何M22-POD、K1-18-POD或K1-70-POD的结合(表65-表67)。
M22IgG、K1-18IgG、K1-70IgG或TRAb阳性患者血清对于M22-POD结合全长TSHR-JMG55突变体的抑制
M22-POD结合全长TSHR-JMG55突变体TSHR-JMG55、TSHR-JMG55-V595I、TSHR-JMG84(JMG55+V595I+K565L)和TSHR-JMG91(JMG55+V595I+Y678L)的抑制通过在与M22-POD保温之前将TSHR突变体与M22IgG、K1-18IgG、K1-70IgG或者TRAb阳性患者血清保温而确定(图14e)。M22IgG、K1-18IgG、K1-70IgG和TRAb阳性患者血清抑制M22-POD与全长TSHR突变体的结合，程度与TSHR-JMG55相似。这些结果示出所述突变对于单克隆TSHR抗体与全长TSHR的结合无影响(表68-表70)。相似地，与TSHR-JMG55相似，TRAb阳性患者血清示出抑制M22-POD结合TSHR-JMG55突变体(表71)。因此，这些全长TSHR突变体适用于检测患者血清中TRAb的测定中。
TMD区域中热稳定性人TSHR突变至其它物种TSHR及其它糖蛋白激素受体中的可转移性
表72示出在人TSHR中位于TMD的已被突变以改良热稳定性的大多数氨基酸在人、小鼠和猪TSHR中是保守的。Glu409、Asp410、His443、Leu452、Asn455、Met463、Tyr466、Leu467、Thr477、Gln489、Lys565、Cys600、Tyr601、Lys660、Tyr667、Ser671和Tyr678在所有物种中均是保守的。残基595在人和小鼠中是Val，但是在猪中是Thr。在猪TSHR中Thr595突变为Ile可能是热稳定性的。残基648在人中是Ile，但是在小鼠和猪中是Leu。因此，小鼠和猪TSHR已经具有在hTSHR中I648L热稳定性突变的靶残基。突变为另一脂肪族残基Val可能改变热稳定性。
人TSHR(SEQ ID No:2)、FSHR(SEQ ID No:57)和LHR(SEQ ID No:58)的序列比对(图11)表明在hTSHR中许多热稳定性突变的残基相应于hFSHR和hLHR中相同或相似的残基。因此，位于TSHR的TMD中的大多数热稳定性突变当转移至FSHR和LHR的等价残基时很可能是热稳定性的(表73)。仅有差异是：His443，其在FSHR中是Gln391，在LHR中是Arg388；Met463，其在FSHR中是Ile411；Ile648，其在FSHR中是Ser596，在LHR中是Ala593；及Tyr667，其在FSHR中是His615，在LHR中是Tyr612。一些这样的等价突变仍可能是热稳定性的。
概述与结论
本发明提供了基于推理扫描诱变改良糖蛋白激素受体蛋白如TSHR的热稳定性的新方法。在本发明中，推理设计一些稳定化突变的方法已经与扫描诱变方法组合，使蛋白质中的每个残基突变为丙氨酸以鉴别TSHR序列中的热稳定性位置。在推理扫描诱变方法中，对于TSHR蛋白质中的每个位置已经产生最可能的稳定化突变(通过本发明人组合计算和推理方法推测)并检测其热稳定性性质。在本发明中，高通量方法使得可以产生并筛选许多突变体以鉴别最具热稳定性的突变。这使得可以鉴别TSHR序列中与其它可能突变相比更具热稳定性的突变。本发明中描述的方法也可以用于改良其它蛋白质的热稳定性。本发明的方法特别可以鉴别TSHR260的17个显著热稳定性突变(P28E,L59F,T62V,H63C,L64Y,R112P,P142I,D143P,D151E,S166T,I167F,P168Y,V169R,N170W,T179C,I253R和R255Y)(图5和6；SEQ ID No:11-25,27-43,45和46)，其已经成功组合产生更加热稳定的TSHR260突变体，使TSHR260的热稳定性改良直至900倍。这些突变体仍以与TSHR260-WT相似方式结合TSHR刺激性人自身抗体M22。最稳定的单一(TSHR260-I253R)(SEQ ID No:45)、双重(TSHR260-JMG22:I253R(SEQ ID No:45)+D143P(SEQ ID No:36))、三重(TSHR260-JMG37:I253R(SEQ ID No:45)+D143P(SEQ ID No:36)+R112P(SEQ ID No:34))、四重(TSHR260-JMG45:I253R(SEQ IDNo:45)+D143P(SEQ ID No:36)+R112P(SEQ ID No:34)+D151E(SEQ ID No:37))、五重(TSHR260-JMG52:I253R(SEQ ID No:45)+D143P(SEQ ID No:36)+R112P(SEQ ID No:34)+D151E(SEQ ID No:37)+V169R(SEQ ID No:41))和六重(TSHR260-JMG55:I253R(SEQ ID No:45)+D143P(SEQ ID No:36)+R112P(SEQ ID No:34)+D151E(SEQ ID No:37)+V169R(SEQ IDNo:41)+H63C(SEQ ID No:32))TSHR260突变体的热稳定性使TSHR260的热稳定性改良分别为大约3.1、13、42、174、450、700和900倍。此外，在全长TSHR的情况中，三重(TSHR-JMG37:I253R+D143P+R112P)、四重(TSHR-JMG45:I253R+D143P+R112P+D151E)、五重(TSHR-JMG52I253R+D143P+R112P+D151E+V169R)和六重(TSHR260-JMG55:I253R+D143P+R112P+D151E+V169R+H63C)TSHR突变体相对于全长野生型TSHR改良热稳定性。
所述突变不影响单克隆TSHR抗体(M22、K1-18和K1-70)结合TSHR260或全长TSHR。此外，TRAb阳性患者血清抑制M22-POD与TSHR260突变体和全长TSHR突变体的结合，程度分别与野生型TSHR260和全长TSHR相同。再者，M22-Fab、K1-18IgG和TSH以与在野生型TSHR中可见的相似方式刺激在Flp-In CHO细胞中表达的全长TSHR突变体中环AMP的产生。
增加TSHR制备物、特别是TSHR260的热稳定性使得可以纯化突变体至均质，特别是最具热稳定性的TSHR260突变体TSHR260-JMG55(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R+H63C；分别为SEQ ID No:45、36、34、37、41和32)，同时保留其活性而不需要抗体与其结合以保持TSHR260的折叠状态。这是首次不用抗体与其结合而纯化构象活性TSHR260。在使用内切糖苷酶F3对纯化的材料进行去糖基化之后，TSHR260-JMG55仍是活性的。纯化的和去糖基化的TSHR260-JMG55材料均可用于改良测定中以检测患者血清中的TSHR自身抗体。
这些热稳定性突变也可以例如转移至融合蛋白TSHR260-AP，其由可检测标记碱性磷酸酶连接TSHR260组成，用于测定中。热稳定性TSHR260-AP突变体TSHR260-AP-JMG22(I253R+D143P；SEQ ID No:45和36)、TSHR260-AP-JMG45(I253R+D143P+R112P+D151E；SEQID No:45,36,34和37)和TSHR260-AP-JMG55(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R+H63C；SEQID No:45,36,34,37,41和42)使TSHR260-AP的热稳定性分别改良大约11、66或165倍。这些TSHR260-AP突变体仍能以与野生型TSHR260-AP相同程度结合TRAb抗体(M22、K1-18、K1-70和TRAb阳性患者血清)。这些构建体可用于TSHR260-AP桥连ELISA中以检测患者血清中的TSHR自身抗体。也可以使用其它可检测标记，预期针对TSHR260和全长TSHR鉴别的热稳定性突变也增加这些标记的构建体的热稳定性，因此使其用于广泛的应用中。
本发明中揭示的许多热稳定性突变是令人惊奇的，不能通过计算机建模或者单独检验结构而预测。
作为本发明一部分而描述的实验强调了使用建模软件的有限作用。经计算预测的突变体的热稳定性主要用于两种情况。首先，当存在一个以上的推理诱变选项时，使用Discovery Studios预测哪个突变在特定位置可能是最具热稳定性的。其次，当对于单一残基不存在明确的推理突变时，使用Discovery Studios软件预测最具热稳定性的，或者如果所有突变均是不稳定的，预测不稳定最低的突变。该软件已经用于鉴别另外尚未检测的许多热稳定突变(例如H63C、S84F、P142I、D143P、P168Y、N170W和R255Y)。然而，对于一些残基，预测诱变为任何其它氨基酸均是不稳定的。在这些情况中，选择在一些不稳定突变中预测不稳定最低的突变。令人惊奇地，发现其中一些是最稳定的突变(例如T62V，L64Y，P142I和I167F)。预测还有许多突变情况是稳定的，而实际上其是不稳定的，例证了计算建模的限制性且需要实验性研究，现在使用本发明揭示的方法是可行的。
本发明的一个最成功的策略是在结构中除去及导入脯氨酸残基。总计5/23(22％)突变为或者来自脯氨酸的突变(即P28E、R112P、P142I、D143P和P168Y)显著稳定TSHR260，然而其对于极低水平表达或者不表达的8/23突变体(35％)结构也可以是极具破坏性的。脯氨酸由于其5元环而具有极其的刚性结构，主链二面角约束为-63°±15°，在脯氨酸残基之前的残基的扭角也如此约束。这种降低的蛋白质主链的柔性给出最低的构象熵以便在几何结构适宜的情况下用脯氨酸置换氨基酸产生更具热稳定性的TSHR。然而，在几何结构不适宜的情况中，脯氨酸残基通过限制扭角可以在结构中导入张力。将这种脯氨酸残基用另一个更柔性的氨基酸取代释放产生更具热稳定性的残基的张力。
本发明的另一个成功策略是使表面残基突变为带电荷的残基。P28E、D151E、V169R和I253R均参与在蛋白质表面导入或改变为带电荷的残基。特别地，V169R和I253R参与脂肪族表面残基突变为hFSHR中类似残基，在这两种情况中均是Arg。
在TSHR的跨膜结构域(TMD)中鉴别全长TSHR进一步的稳定性突变。在TSHR的TMD区域中鉴别的20个最具热稳定性突变是：E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、T477I、Q489H、K565L、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671A、Y678L和Y678A(图29和30；SEQ ID No:69-88(DNA序列)和SEQ ID No:89-108(蛋白质序列))。这些突变使TSHR-JMG55的稳定性在稳定性测定A中增加直至4.5倍，在稳定性测定B中增加直至1.6倍及在稳定性测定C中增加直至15倍。将其组合形成双重突变体(例如TSHR-JMG91(JGM55(SEQ ID No:45、36、34、37、32和41)+V595I(SEQ ID No:100)+Y678L(SEQ ID No:107))和TSHR-JGM84(JGM55(SEQ ID No:45、36、34、37、32和41)+V595I(SEQ ID No:100)+K565L(SEQID No:99))和三重突变体(例如TSHR-JMG131(JMG55(SEQ ID No:45、36、34、37、32和41)+V595I(SEQ ID No:100)+K565L(SEQ ID No:99)+N455A(SEQ ID No:93))，突变位于TMD中，进一步增加全长TSHR的热稳定性。
本发明的直接和关键成果是首次产生热稳定的TSHR制备物。这开启了应用突变对全长TSHR及由较短序列组成的其它TSHR制备物的稳定性的作用的新机会。这种TSHR制备物将可用于产生改良的、人工的和自动的可以在较高温度运行的测定系统(以检测患者TRAb)。进一步地，可以纯化热稳定的TSHR制备物及获得这种纯制备物对于研究TSHR的结构及开发新治疗方法具有重要意义。
表
表1在TSHR260中的单一氨基酸突变
进行特定突变的原因如下：扭角-通过检验TSHR260晶体结构主链的扭角确定具有恰当主链结构的残基突变为Pro或Gly；共有序列-突变为在不同物种或者三种糖蛋白激素受体中任一TSHR的共有序列。还有一个天然发生的TSHR变体P27T，其被报道为导致甲状腺功能低下；β-折叠-是指β-链残基的诱变以便改变极性，非极性周期性被保留，核心残基突变为Ile，表面残基突变为Thr、Asp或Arg。LRR-突变为符合一般的富集亮氨酸的重复基序的共有序列LxxLxLxxNxLxxLpxxoFxxLxx，其中L是Leu、Ile、Val或Phe，N是Asn、Thr、Ser或Cys，o是非极性残基，x是非保守残基(Matsushima,Miyashita,Mikami,&Kuroki,2010)；表面-表面残基突变为Glu(如果已经是Glu则突变为Asp)，带电荷的残基的性质通过将Arg突变为Lys及将Lys突变为Arg而保留；核心-核心残基的突变，Ile和Ala突变为Val，Gly突变为Gln，其它残基突变为Ala。DS-通过Discovery Studios软件分子建模预测是稳定的突变。
表2：在基于M22-过氧化物酶与TSHR260结合的测定(TSHR260结合测定)中评估单一突变对TSHR260稳定性的影响
对于在CHO-K1细胞中表达的每个TSHR260突变，在TSHR260测定中的M22结合(图12a)以与TSHR260-WT的百分比表示，通过在42℃加热30分钟后保留的活性蛋白质的比例确定的稳定性(图12b)以与TSHR260-WT稳定性的百分比(％WT)表示。增加稳定性的突变的稳定性筛选结果以粗体字表示。在热稳定性测定中检测这些突变以确定该突变体的半衰期(图12b)。
M22是TSHR的人单克隆自身抗体。
表3：在TSHR260结合测定中确定的在42℃的TSHR260突变体的半衰期
通过在2小时时期内每隔一段时间在42℃测定中加热等份确定每个突变体的半衰期(图12b)。活性TSHR蛋白质的量通过TSHR260结合测定确定并根据时间绘图。在每个实验中，测量TSHR260-WT的热稳定性(半衰期，t1/2)并用于确定与相同实验中TSHR260-WT的半衰期对比半衰期(Δt1/2)的差异和半衰期比率。粗体字是最具热稳定性的突变体，用于产生双重突变体。n是在单独实验中测量每个样品的半衰期的次数。结果以重复至少两次实验的平均值±平均标准误差(SEM)表示。a仅进行一次的实验(一式两份测定)不具有与其相关的SEM。
表4：通过斑点印迹测定测量分析TSHR260突变体相对于TSHR260-WT的表达水平(TSHR突变体的总量，即活性加上非活性)，及其在TSHR260结合测定中相对于TSHR260-WT的活性
nd＝未确定
斑点印迹和TSHR260结合测定(图12a)的结果分别相对于TSHR260-WT(％WT)表示。突变体通过如下在TSHR260结合测定与斑点印迹(总TSHR突变体蛋白)之间的比率分类：(a)在TSHR260结合数据与斑点印迹表达数据之间很少或者无差异；(b)TSHR260结合显著高于斑点印迹表达(TSHR260结合/斑点印迹>2.5)；或者(c)斑点印迹表达显著高于TSHR260结合(TSHR260结合/斑点印迹<0.4)。在TSHR260结合测定结果和斑点印迹结果均低时(低于20％WT)，未进行这些分类。稳定性比率基于突变体的半衰期，但是在未测量的情况中列出了(*)在42℃加热突变体30分钟的稳定性筛选数据(TSHR260-WT的百分比(％WT))。
表5：组合单一TSHR260突变以产生双重、三重、四重、五重和六重TSHR260突变体
全长TSHR中相应突变定义为TSHR-JMGx，其中x是在TSHR260中各自的突变数。
表6：在42℃测量的TSHR260双重突变体的热稳定性
JMG1、JMG3、JMG5、JMG6、JMG8、JMG10、JMG11、JMG12、JMG13、JMG14、JMG18、JMG25、JMG29和JMG31示出在TSHR260结合测定中太低的结合，以至于不能确定热稳定性。JMG21的热稳定性在42℃未测量。JMG30是仅在42℃研究的三重突变体。
每个突变体的半衰期通过在3小时内每隔一段时间在42℃测定中加热等份而确定(图12b)。通过TSHR260结合测定确定活性TSHR蛋白的量并根据时间绘图。在每个实验中，测量TSHR260-WT和TSHR260-I253R的热稳定性并用于确定与在相同实验中TSHR260-WT和TSHR260-I253R的半衰期相比半衰期的差异(Δt1/2)和半衰期比率。在TSHR260结合测定中具有良好结合水平的最具热稳定性的突变体以粗体字示出。n是在单独实验中每个样品测量的半衰期次数。结果以重复至少两次实验的平均值±SEM表示。a仅进行一次的实验(一式两份测定)不具有与其相关的SEM。
表7：在50℃测量的TSHR260双重突变体的热稳定性
JMG1、JMG3、JMG5、JMG6、JMG7、JMG8、JMG10、JMG11、JMG12、JMG13、JMG14、JMG15、JMG18、JMG25、JMG29和JMG31在TSHR260结合测定中示出太低的结合水平，由此不能确定热稳定性。JMG21的热稳定性在相同实验中仅根据TSHR260-I253R而不根据TSHR260-WT确定。
每个突变体的半衰期通过在2小时内每隔一段时间在50℃测定中加热等份而确定(图12b)。通过TSHR260结合测定确定活性TSHR蛋白的量并根据时间绘图。在每个实验中，测量TSHR260-WT和TSHR260-I253R的热稳定性并用于确定与在相同实验中与TSHR260-WT和TSHR260-I253R半衰期相比的半衰期的差异(Δt1/2)和半衰期比率。在TSHR260结合测定中具有良好结合水平的最具热稳定性突变体以粗体字示出。n是在单独实验中每个样品测量的半衰期次数。结果以重复至少两次实验的平均值±SEM表示。a仅进行一次的实验(一式两份测定)不具有与其相关的SEM。
表8：在50℃测量的三重和四重TSHR260突变体的热稳定性
基础突变体是指三重和四重突变体分别基于的双重突变体JMG22(I253R+D143P；表5)或者三重突变体JMG37(I253R+D143P+R112P；表5)。JMG34、JMG36、JMG40、JMG42和JMG48在TSHR260结合测定中示出太低的结合(<16％的TSHR260-WT)，由此不能确定其热稳定性。
每个突变体的半衰期通过在3小时内每隔一段时间在50℃测定中加热等份而确定(图12b)。通过TSHR260结合测定确定活性TSHR蛋白质的量并根据时间绘图。在每个实验中，测量TSHR260-I253R的热稳定性并用于确定与在相同实验中TSHR260-I253R的半衰期相比的半衰期的差异(Δt1/2)和半衰期比率。最具热稳定性突变体以粗体字示出。n是在单独实验中每个样品测量的半衰期次数。结果以重复至少两次实验的平均值±SEM表示。a仅进行一次的实验(一式两份测定)不具有与其相关的SEM。
表9：在55℃测量的四重、五重和六重TSHR260突变体的热稳定性
基础突变体是指所得四重、五重和六重突变体分别基于的三重突变体突变体JMG37(I253R+D143P+R112P；表5)、四重突变体(I253R+D143P+R112P+D151E；表5)或者五重突变体JMG50(I253R+D143P+R112P+D151E+H62C；表5)。JMG48在TSHR260结合测定中无可检测的结合，由此不能确定其热稳定性。六重突变体JMG54和JMG55太稳定以至于在55℃不能精确确定半衰期。
每个突变体的半衰期通过在2小时内每隔一段时间在55℃测定中加热等份而确定(图12b)。通过TSHR260结合测定确定活性TSHR蛋白质的量并根据时间绘图。在每个实验中，测量TSHR260-I253R和TSHR260-JMG37的热稳定性并用于确定与在相同实验中TSHR260-I253R的半衰期相比的半衰期的差异(Δt1/2)和半衰期稳定性比率。最具热稳定性突变体以粗体字示出。n是在单独实验中每个样品测量的半衰期次数。结果以重复至少两次实验的平均值±SEM表示。a仅进行一次的实验(一式两份测定)不具有与其相关的SEM。
表10：在60℃测量的五重和六重TSHR260突变体的热稳定性
基础突变体是指所得四重、五重和六重突变体分别基于的三重突变体JMG37(I253R+D143P+R112P；表5)、四重突变体JMG45(I253R+D143P+R112P+D151E；表5)或者五重突变体JMG50(I253R+D143P+R112P+D151E+H62C；表5)。
每个突变体的半衰期通过在2小时内每隔一段时间在60℃测定中加热等份而确定(图12b)。通过TSHR260结合测定确定活性TSHR蛋白质的量并根据时间绘图。在每个实验中，测量TSHR260-JMG45的热稳定性并用于确定与在相同实验中TSHR260-MG45的半衰期相比的半衰期的差异(Δt1/2)和半衰期稳定性比率。最具热稳定性突变体以粗体字示出。n是在单独实验中每个样品测量的半衰期次数。结果以重复至少两次实验的平均值±SEM表示。
表11：在37℃测量的TSHR260-WT、TSHR260-I253R、JMG22、JMF37、JMG45、JMG52、JMG54和JMG55的热稳定性曲线
每个突变体的半衰期通过在37天内每隔一段时间在37℃测定中加热等份而确定(图12b)。通过TSHR260结合测定确定活性TSHR蛋白质的量并根据时间绘图。示出了与在相同实验中测量的TSHR260-WT的半衰期相比的半衰期的差异(Δt1/2)和半衰期稳定性比率。n是在单独实验中每个样品测量的半衰期次数。结果以重复至少两次实验的平均值±SEM表示。a仅进行一次的实验(一式两份测定)不具有与其相关的SEM。
表13：在14C4平板上在42℃全长TSHR突变体的热稳定性
结果以在450nm的吸光度及与未加热的样品在450nm的吸光度的百分比表示。平均值±SD是在一个实验中一式四份测量的。
表14：在14C4平板上在50℃全长TSHR突变体的热稳定性
结果以在450nm的吸光度及与未加热的样品在450nm的吸光度的百分比表示。平均值±SD是在一个实验中一式四份测量的。表中列出了每个突变体相对于全长TSHR-WT的在50℃的半衰期和稳定性比率。
表18：M22-POD结合全长TSHR突变体
结果是以在450nm的吸光度减去非特异性结合和每个突变体的最大OD450读数的百分比(％Max)在一个实验中一式两份测量的平均值±SD表示。Kd通过使用GraphPadPrism将饱和结合曲线拟合至数据而确定。
表19：K1-18-POD结合全长TSHR突变体
结果是以在450nm的吸光度减去非特异性结合和每个突变体的最大OD450读数的百分比(％Max)在一个实验中一式两份测量的平均值±SD表示。Kd通过使用GraphPadPrism将饱和结合曲线拟合至数据而确定。
表20：K1-70-POD结合全长TSHR突变体
结果是以在450nm的吸光度减去非特异性结合和每个突变体的最大OD450读数的百分比(％Max)在一个实验中一式两份测量的平均值±SD表示。Kd通过使用GraphPadPrism将饱和结合曲线拟合至数据而确定。
表21：突变(相对于TSHR60-WT或全长TSHR-WT)对于M22-POD、K1-18POD和K1-70POD结合的作用概述
n.d.＝未确定
表24：K1-18IgG对M22-POD结合全长TSHR突变体的抑制
结果以在一个实验中一式两份测量的在450nm的吸光度和M22-POD结合抑制百分比±SD表示。
表25：K1-70IgG对M22-POD结合全长TSHR突变体的抑制
结果以在一个实验中一式两份测量的在450nm的吸光度和M22-POD结合抑制百分比±SD表示。
表26：突变(相对于TSHR60-WT或全长TSHR-WT)对于K1-18IgG和K1-70IgG抑制M22-POD结合TSHR260或全长TSHR-WT的作用概述
表27：患者血清对M22-POD结合TSHR260突变体的抑制
结果以在一个实验中一式两份测量的在450nm的吸光度±SD和M22-POD结合抑制百分比表示。
表28：患者血清对M22-POD结合全长TSHR突变体的抑制
结果以在一个实验中一式两份测量的在450nm的吸光度±SD和M22-POD结合抑制百分比表示。
表29：突变(相对于TSHR60-WT或全长TSHR-WT)对于正常血清和TRAb阳性患者血清抑制M22-POD结合TSHR260或全长TSHR-WT的作用概述
表30：不同浓度的TSHR(M22)和TSH的人单克隆抗体对于刺激在表达野生型TSHR和TSHR-JMG37(I253R+D143P+D151E)的CHO细胞中环AMP产生的作用
实验1
实验2
示出的结果是一式三份确定的平均值±SD。*表示一式两份确定。样品在环AMP缓冲液中稀释。
实验1：对于TSHR-WT:EC50(M22)＝1.62ng/mL，EC50(TSH)＝1.02ng/mL。对于TSHR-JMG37:EC50(M22)＝0.94ng/mL，EC50(TSH)＝0.39ng/mL。
实验2：对于TSHR-WT:EC50(M22)＝2.13ng/mL，EC50(TSH)＝0.77ng/mL。对于TSHR-JMG37:EC50(M22)＝3.10ng/mL，EC50(TSH)＝0.86ng/mL。
表31：不同浓度的TSHR(M22)和TSH的人单克隆抗体对于刺激在表达野生型TSHR和TSHR-JMG45(I253R+D143P+R112P+D151E)的CHO细胞中环AMP产生的作用
实验1
实验2
示出的结果是一式三份确定的平均值±SD。*表示一式两份确定。样品在环AMP缓冲液中稀释。
实验1：对于TSHR-WT:EC50(M22)＝1.52ng/mL，EC50(TSH)＝0.82ng/mL。对于TSHR-JMG45:EC50(M22)＝5.37ng/mL，EC50(TSH)＝0.84ng/mL。
实验2：对于TSHR-WT:EC50(M22)＝1.97ng/mL，EC50(TSH)＝0.64ng/mL。对于TSHR-JMG45:EC50(M22)＝4.03ng/mL，EC50(TSH)＝0.63ng/mL。
表32：不同浓度的TSHR(M22)和TSH的人单克隆抗体对于刺激在表达野生型TSHR和TSHR-JMG52(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R)的CHO细胞中环AMP产生的作用
实验1
实验2
示出的结果是一式三份确定的平均值±SD。*表示一式两份确定。样品在环AMP缓冲液中稀释。
实验1:对于TSHR-WT:EC50(M22)＝1.92ng/mL，EC50(TSH)＝0.42ng/mL。对于TSHR-JMG52:EC50(M22)＝3.72ng/mL,EC50(TSH)＝0.43ng/mL.
实验2:对于TSHR-WT:EC50(M22)＝1.40ng/mL，EC50(TSH)＝0.67ng/mL。对于TSHR-JMG52:EC50(M22)＝3.27ng/mL，EC50(TSH)＝0.99ng/mL。
表33：不同浓度的TSHR(M22)和TSH的人单克隆抗体对于刺激在表达野生型TSHR和TSHR-JMG55(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R+H63C)的CHO细胞中环AMP产生的作用
实验1
实验2
示出的结果是一式三份确定的平均值±SD。*表示一式两份确定。样品在环AMP缓冲液中稀释。
实验1：对于TSHR-WT:EC50(M22)＝1.53ng/mL，EC50(TSH)＝1.11ng/mL。对于TSHR-JMG52:EC50(M22)＝2.87ng/mL,EC50(TSH)＝0.934ng/mL。
实验2：对于TSHR-WT:EC50(M22)＝1.30ng/mL，EC50(TSH)＝0.445ng/mL。对于TSHR-JMG52:EC50(M22)＝3.90ng/mL，EC50(TSH)＝0.609ng/mL。
表34：不同浓度的TSHR(K1-18)和TSH的人单克隆抗体对于刺激在表达野生型TSHR和TSHR-JMG37(I253R+D143P+D151E)的CHO细胞中环AMP产生的作用
实验1
实验2
示出的结果是一式三份确定的平均值±SD。样品在环AMP缓冲液中稀释。
实验1：对于TSHR-WT:EC50(K1-18)＝13.3ng/mL，EC50(TSH)＝0.64ng/mL。对于TSHR-JMG37:EC50(K1-18)＝11.3ng/mL，EC50(TSH)＝0.53ng/mL。
实验2：对于TSHR-WT:EC50(K1-18)＝12.8ng/mL，EC50(TSH)＝0.71ng/mL。对于TSHR-JMG37:EC50(K1-18)＝11.1ng/mL，EC50(TSH)＝0.58ng/mL。
表35：不同浓度的TSHR(K1-18)和TSH的人单克隆抗体对于刺激在表达野生型TSHR和TSHR-JMG45(I253R+D143P+R112P+D151E)的CHO细胞中环AMP产生的作用
实验1
实验2
示出的结果是一式三份确定的平均值±SD。*表示一式两份确定。样品在环AMP缓冲液中稀释。
实验1：对于TSHR-WT:EC50(K1-18)＝12.9ng/mL，EC50(TSH)＝0.57ng/mL。对于TSHR-JMG45:EC50(K1-18)＝22.5ng/mL，EC50(TSH)＝0.63ng/mL。
实验2：对于TSHR-WT:EC50(K1-18)＝17.8ng/mL，EC50(TSH)＝0.82ng/mL。对于TSHR-JMG45:EC50(K1-18)＝16.0ng/mL，EC50(TSH)＝0.77ng/mL。
表36：不同浓度的TSHR(K1-18)和TSH的人单克隆抗体对于刺激在表达野生型TSHR和TSHR-JMG52(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R)的CHO细胞中环AMP产生的作用
实验1
实验2
示出的结果是一式三份确定的平均值±SD。*表示一式两份确定。样品在环AMP缓冲液中稀释。
实验1：对于TSHR-WT:EC50(K1-18)＝17.9ng/mL，EC50(TSH)＝0.69ng/mL。对于TSHR-JMG52:EC50(K1-18)＝14.9ng/mL，EC50(TSH)＝0.51ng/mL。
实验2：对于TSHR-WT:EC50(K1-18)＝14.3ng/mL，EC50(TSH)＝1.00ng/mL。对于TSHR-JMG52:EC50(K1-18)＝19.7ng/mL，EC50(TSH)＝0.99ng/mL。
表37：不同浓度的TSHR(K1-18)和TSH的人单克隆抗体对于刺激在表达野生型TSHR和TSHR-JMG55(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R+H63C)的CHO细胞中环AMP产生的作用
实验1
实验2
示出的结果是一式三份确定的平均值±SD。*表示一式两份确定。样品在环AMP缓冲液中稀释。
实验1：对于TSHR-WT:EC50(K1-18)＝11.1ng/mL，EC50(TSH)＝0.50ng/mL。对于TSHR-JMG55:EC50(K1-18)＝14.3ng/mL，EC50(TSH)＝0.48ng/mL。
实验2：对于TSHR-WT:EC50(K1-18)＝12.0ng/mL，EC50(TSH)＝0.62ng/mL。对于TSHR-JMG55:EC50(K1-18)＝28.2ng/mL，EC50(TSH)＝0.81ng/mL。
表38：突变(相对于TSHR-WT)对于TSH、M22-Fab和K1-18IgG刺激表达突变的全长TSHR的CHO细胞的作用概述
表39a：突变(相对于TSHR-WT)对于M22-Fab和TSH刺激表达突变的全长TSHR的CHO细胞的EC50的作用概述
EC50是给出半数最大信号应答所需的配体的浓度。LogEC50以来自2-10个独立实验的平均值±SD示出。
表39b：突变(相对于TSHR-WT)对于K1-18IgG和TSH刺激表达突变的全长TSHR的CHO细胞的EC50的作用概述
EC50是给出半数最大信号应答所需的配体的浓度。LogEC50以来自2-10个独立实验的平均值±SD示出。
表40：表达野生型TSHR和TSHR-JMG45(I253R+D143P+R112P+D151E)的CHO细胞中的环AMP水平。正常血清和患者血清刺激环AMP产生的作用
结果以NPS刺激与基础刺激的比率表示，是一式三份确定的平均值±SD。
表41：表达野生型TSHR和TSHR-JMG52(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R)的CHO细胞中的环AMP水平。正常血清和患者血清对刺激环AMP产生的作用
结果以NPS与基础刺激的比率表示，是一式三份确定的平均值±SD。
表42：与其它哺乳动物TSHR序列中等价TSHR氨基酸残基相比人TSHR的热稳定性氨基酸残基分析
大多数热稳定性突变的残基在不同物种TSHR中非常保守。与人TSHR不同的残基在表中突出示出。同系物之间大多数序列改变是改变为具有相似性质例如碱性、酸性、脂肪族或者芳香族的氨基酸。因此，在人TSHR260和人全长TSHR中观测到的热稳定性突变在其它哺乳动物物种中也可能是热稳定性的，如表42示出。*表示包含最具热稳定性的TSHR260突变体JMG55的6个最具热稳定性的突变。
表43：与人FSHR和人LHR中等价氨基酸残基相比人TSHR的热稳定性残基分析
hFSHR(SEQ ID No:57)和hLHR(SEQ ID No:58)中与hTSHR(SEQ ID No:2)中相同的残基以粗体字表示。除了这些残基之外，在受体之间的许多残基差异限于具有相似性质如碱性、酸性、脂肪族或芳香族的氨基酸。这些残基在表中突出表示，表示在从hTSHR中转移类似的热稳定性突变的情况中在hFSHR和/或hLHR中很可能是热稳定性的残基。*表示包含最热稳定的TSHR260突变体JMG55的6个最具热稳定性的突变。
表44：患者血清抑制M22-POD结合TSHR260突变体
结果以在450nm的吸光度(平均值±SD；n＝2)和M22-POD结合抑制百分比示出。
表49：两种不同形式TSHR260-JMG55的纯化和比活性概述
TSHR260活性是在TSHR260结合测定中样品的活性(图12a)。比活性是在TSHR260结合测定中样品的活性(U/mL)除以样品的蛋白质浓度(mg/mL)，给出1毫克蛋白质的活性。纯化水平是在每个步骤的纯化的材料的比活性除以起始材料(层流加样)的比活性。
表50a：纯化的TSHR260-JMG55-4.5的活性(高比活性)：在pH4.5从镍亲和性柱洗脱
表50b：纯化的TSHR260-JMG55-5.0的活性(低比活性)：在pH 5.0从镍亲和性柱洗脱
表51：TSHR单克隆自身抗体(K1-70、K1-18和M22)与纯化的TSHR260-JMG55-4.5包被的ELISA平板孔的结合
表52：在用内切糖苷酶F3去糖基化之后在TSHR260结合测定中分析TSHR260-JMG55-4.5活性
TSHR260活性是与TSHR260标准相比在TSHR260结合测定中样品的活性，如在“TSHR260结合测定”和“使用Freestyle Max试剂在CHO-K1细胞中瞬时转染TSHR260突变体”(图12a)章节中定义。
表53：在镍亲和性纯化后TSHR260-JMG55-4.5的去糖基化
表54：小鼠和猪TSHR中hTSHR-JMG55突变的等价残基
hTSHR-JMG55的大多数热稳定性突变的残基在小鼠和猪TSHR中非常保守。只有在位置169的残基在物种中是不同的。残基169在人中是缬氨酸，在小鼠中是谷氨酸，在猪中是丙氨酸。
表55：全长野生型和突变的小鼠、猪和人TSHR在45℃的热稳定性
在稳定性测定B中通过TSHR制备物与4E31包被的平板结合并在45℃水浴中加热该平板直至3小时测量每个构建体的半衰期。活性TSHR蛋白的量通过TSHR结合测定(图14c)确定。结果根据时间绘图并拟合为双相指数衰减曲线。半衰期是TSHR丧失其一半活性的时间。示出的结果是平均值±SD，n＝2。
表56：不同浓度M22IgG和TSH对刺激表达野生型或突变的小鼠TSHR的CHO细胞中环AMP产生的作用
示出的结果是一式三份确定的平均值±SD。将样品在环AMP测定缓冲液中稀释。对于mTSHR-WT：EC50(M22)＝13.09ng/ml；EC50(TSH)＝0.81ng/ml。对于mTSHR-突变体：EC50(M22)＝20.36ng/ml；EC50(TSH)＝1.41ng/ml。突变的mTSHR基于人TSHR突变体JMG55，小鼠TSHR中突变的氨基酸与人TSHR-JMG55构建体中突变的氨基酸类似，包括H63C、R112P、D143P、D151E、E169R(类似于hTSHR V169R)和I253R。
表57：不同浓度的M22IgG和TSH对刺激表达野生型或突变的猪TSHR的CHO细胞中环AMP产生的作用
示出的结果是一式三份确定的平均值±SD。将样品在环AMP测定缓冲液中稀释。对于pTSHR-WT:EC50(M22)＝6.23ng/ml；EC50(TSH)＝0.79ng/ml。对于mTSHR-突变体：EC50(M22)＝6.53ng/ml；EC50(TSH)＝1.04ng/ml。突变的pTSHR基于人TSHR突变体JMG55，在猪TSHR中突变的氨基酸类似于在人TSHR-JMG55构建体中突变的氨基酸，包括H63C、R112P、D143P、D151E、A169R(类似于hTSHR V169R)和I253R。
表58：TSH与不同物种(人、小鼠和猪)的全长野生型和突变TSHR的结合常数
结合常数从一式两份确定的一个实验中计算。
表59：在TSHR-JMG55的TMD中产生的单一氨基酸突变
表60：在TMD中具有一个突变的TSHR-JMG55突变体的稳定性
所有这些TSHR突变体还含有6个JMG55突变：I253R、D143P、R112P、D151E、H63C和V169R。
a14C4活性是如在TSHR结合测定中检测的未处理样品当结合14C4包被的ELISA平板孔时的活性。对于用于稳定性测定A中，将样品稀释为10U/mL14C4活性。见“使用Freestyle Max试剂在CHO-K1细胞中瞬时转染全长TSHR突变体”章节对于U/ml的定义。”
b4E31活性是如在TSHR结合测定中检测的当未处理样品结合4E31包被的ELISA平板孔时的活性。对于用于稳定性测定B中，将样品稀释为10U/mL 4E31活性，对于用于稳定性测定C中，将样品稀释为终浓度12.5U/ml。见在“使用Freestyle Max试剂在CHO-K1细胞中瞬时转染全长TSHR突变体”章节中对于U/ml的定义。
c在稳定性测定A和B中，每个突变体的半衰期是通过使TSHR突变体结合14C4包被的平板孔(稳定性测定A，图14b)或者4E31包被的ELISA平板孔(稳定性测定B，图14c)而确定的。将结合TSHR的平板条在55℃加热直至2小时。活性TSHR蛋白质的量通过TSHR结合测定确定，根据时间绘图并拟合为指数衰减曲线。在每个实验中，测量TSHR-JMG55的热稳定性(半衰期，t1/2)并用于确定与在相同实验中TSHR-JMG55突变体的半衰期相比的半衰期比率。
d在稳定性测定C中(图14d)，将每个TSHR-JMG55突变体的溶解的等份在33℃在溶液中加热直至2小时。活性TSHR蛋白的量通过TSHR结合测定确定，根据时间绘图并拟合为双相指数衰减曲线。计算在加热10、30和120分钟后剩余的活性TSHR-JMG55突变体的百分比并与TSHR-JMG55对比。表观半衰期是TSHR-JMG55突变体丧失其一半活性的时间点。这用于通过将其除以在相同实验中测量的TSHR-JMG55表观半衰期计算半衰期比率。
粗体字是20个最具热稳定性的突变体，其用于产生双重突变体。在每个测定中每个突变体进行一次实验，一式两份测定。n.d.＝确定的。
表61：在TSHR-JMG55TMD中组合单一突变以产生双重、三重和TSHR-JMG55突变体
列出的所有TSHR突变体均含有JMG55的6个突变：I253R、D143P、R112P、D151E、H63C和V169R。
JMG66等于JMG82，JMG68等于JMG101，JMG87等于JMG104。未产生JMG85构建体，因为突变V595I和C600R太接近且很可能彼此干扰。
表62：在TMD中具有双重突变的TSHR-JMG55突变体的热稳定性：稳定性测定C
TSHR突变体如在表61中定义。
a14C4活性是如在TSHR结合测定中检测的未处理样品当结合14C4包被的ELISA平板孔时的活性。见“使用Freestyle Max试剂在CHO-K1细胞中瞬时转染全长TSHR突变体”章节对于U/ml的定义。”
b4E31活性是如在TSHR结合测定中检测的当未处理样品结合4E31包被的ELISA平板孔时的活性。对于用于稳定性测定C中，将样品稀释为终浓度12.5U/ml。见在“使用Freestyle Max试剂在CHO-K1细胞中瞬时转染全长TSHR突变体”章节中对于U/ml的定义。
c在稳定性测定C中，将每个TSHR突变体的溶解的等份在33℃在溶液中加热直至2小时。保留的活性TSHR蛋白的量通过TSHR结合测定确定并根据时间绘图(图14d)。计算在加热10、30和120分钟后剩余的活性TSHR突变体的百分比并针对JMG59-JMG73与TSHR-JMG55-T477I、在JMG74-JMG92情况中与TSHR-JMG55-V595I或者针对JMG93-JMG111与TSHR-JMG55-I648L进行对比。此外，表观半衰期是TSHR-JMG55突变体丧失其一半活性的时间点。这用于通过将其除以在相同实验中测量的TSHR-JMG55-T477I、TSHR-JMG55-V595I或TSHR-JMG55-I648L的表观半衰期计算半衰期比率。
在每个测定中每个突变体进行一次实验(一式两份测定)。n.d.＝未确定。表63：在TSHR-JMG55(JMG74-JMG92)的TMD中具有双重突变的突变体的热稳定性：
TSHR突变体如在表61中定义。
a在稳定性测定A和B中，每个突变体的半衰期是通过首先使突变体结合14C4包被的ELISA平板孔(稳定性测定A，图14b)或4E31包被的ELISA平板孔(稳定性测定B，图14c)而确定的。将结合突变体TSHR的平板孔条在55℃加热直至2小时。剩余的活性突变体TSHR蛋白的量通过TSHR结合测定确定并根据时间绘图。在每个实验中，测量TSHR-JMG55-V595I的热稳定性(半衰期，t1/2)并用于确定每个突变体与在相同实验中TSHR-JMG55-V595I的半衰期相比的半衰期比率。
b在稳定性测定C(图14d)中，将TSHR突变体的溶解的等份在33℃在溶液中加热直至2小时。活性TSHR蛋白的量通过TSHR结合测定确定并根据时间绘图。计算在加热10、30和120分钟后剩余的活性TSHR突变体的百分比并与TSHR-JMG55-V595I进行对比。表观半衰期是TSHR-JMG55突变体丧失其一半活性的时间点。这用于通过将其除以在相同实验中测量的TSHR-JMG55-V595I的表观半衰期计算半衰期比率。
整体而言最具热稳定性的突变体JMG91和JMG84以粗体字示出，这些突变体用作产生三重突变体的基础。在每个测定中每个突变体进行一次实验(一式两份测定)。n.d.＝确定的。
表64：在TSHR-JMG55(JMG112-JMG142)的TMD中具有三重突变的突变体的热稳定性：稳定性测定A、B和C
TSHR突变体如在表61中定义。
a在稳定性测定A(图14b)和稳定性测定B(图14c)中，每个突变体的半衰期通过首先使突变体结合14C4包被的ELISA平板孔(稳定性测定A)或4E31包被的ELISA平板孔(稳定性测定B)而确定。将结合突变体TSHR的平板孔条在55℃加热直至2小时。剩余的活性突变体TSHR蛋白的量通过TSHR结合测定确定并根据时间绘图。在每个实验中，测量TSHR-JMG91或TSHR-JMG84的热稳定性(半衰期，t1/2)并用于确定每个突变体与在相同实验中TSHR-JMG91或TSHR-JMG84的半衰期相比的半衰期比率。
c在稳定性测定C(图14d)中，将TSHR突变体的溶解的等份在40℃在溶液中加热直至2小时。剩余的活性TSHR蛋白的量通过TSHR结合测定确定，根据时间绘图并拟合为双相指数衰减曲线。计算在加热10、30和120分钟后剩余的活性TSHR突变体的百分比并与TSHR-JMG91或者TSHR-JMG84(JMG112-JMG126与TSHR-JMG91对比，JMG127-JMG142与TSHR-JMG84对比)进行对比。也确定表观半衰期，这是TSHR-JMG55突变体丧失其一半活性的时间点。这用于通过将其除以在相同实验中测量的TSHR-JMG91或TSHR-JMG84的表观半衰期来计算半衰期比率。
在每个测定中每个突变体进行一次实验(一式两份测定)。n.d.＝未确定。
表72：在小鼠和猪TSHR中hTSHR-JMG55突变的等价残基
hTSHR-JMG55的大多数热稳定性突变残基在小鼠和猪TSHR中是非常保守的。只有在位置595和648的残基在物种间是不同的。残基595在人和小鼠中是缬氨酸，但是在猪中是苏氨酸。残基648在人中是异亮氨酸，但是在小鼠和猪中是亮氨酸。
表73：与人FSHR和人LHR中等价氨基酸残基对比在人TSHR的TMD中热稳定性氨基酸残基的分析
hFSHR(SEQ ID No:57)和hLHR(SEQ ID No:58)中与hTSHR(SEQ ID No:2)中相同的残基以粗体字表示。除此之外，在受体之间的许多氨基酸差异限于具有相似性质的氨基酸，例如碱性、酸性、脂肪族或芳香族。类似的热稳定性突变从hTSHR转移至hFSHR和hLHR很可能改良这些受体的热稳定性。
序列表
<110> RSR有限公司
<120> 糖蛋白激素受体突变
<130> CRT/JAA/29903 GB
<160> 108
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2295
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgaggccgg cggacttgct gcagctggtg ctgctgctcg acctgcccag ggacctgggc 60
ggaatggggt gttcgtctcc accctgcgag tgccatcagg aggaggactt cagagtcacc 120
tgcaaggata ttcaacgcat ccccagctta ccgcccagta cgcagactct gaagcttatt 180
gagactcacc tgagaactat tccaagtcat gcattttcta atctgcccaa tatttccaga 240
atctacgtat ctatagatgt gactctgcag cagctggaat cacactcctt ctacaatttg 300
agtaaagtga ctcacataga aattcggaat accaggaact taacttacat agaccctgat 360
gccctcaaag agctccccct cctaaagttc cttggcattt tcaacactgg acttaaaatg 420
ttccctgacc tgaccaaagt ttattccact gatatattct ttatacttga aattacagac 480
aacccttaca tgacgtcaat ccctgtgaat gcttttcagg gactatgcaa tgaaaccttg 540
acactgaagc tgtacaacaa cggctttact tcagtccaag gatatgcttt caatgggaca 600
aagctggatg ctgtttacct aaacaagaat aaatacctga cagttattga caaagatgca 660
tttggaggag tatacagtgg accaagcttg ctggacgtgt ctcaaaccag tgtcactgcc 720
cttccatcca aaggcctgga gcacctgaag gaactgatag caagaaacac ctggactctt 780
aagaaacttc cactttcctt gagtttcctt cacctcacac gggctgacct ttcttaccca 840
agccactgct gtgcctttaa gaatcagaag aaaatcagag gaatccttga gtccttgatg 900
tgtaatgaga gcagtatgca gagcttgcgc cagagaaaat ctgtgaatgc cttgaatagc 960
cccctccacc aggaatatga agagaatctg ggtgacagca ttgttgggta caaggaaaag 1020
tccaagttcc aggatactca taacaacgct cattattacg tcttctttga agaacaagag 1080
gatgagatca ttggttttgg ccaggagctc aaaaaccccc aggaagagac tctacaagct 1140
tttgacagcc attatgacta caccatatgt ggggacagtg aagacatggt gtgtaccccc 1200
aagtccgatg agttcaaccc gtgtgaagac ataatgggct acaagttcct gagaattgtg 1260
gtgtggttcg ttagtctgct ggctctcctg ggcaatgtct ttgtcctgct tattctcctc 1320
accagccact acaaactgaa cgtcccccgc tttctcatgt gcaacctggc ctttgcggat 1380
ttctgcatgg ggatgtacct gctcctcatc gcctctgtag acctctacac tcactctgag 1440
tactacaacc atgccatcga ctggcagaca ggccctgggt gcaacacggc tggtttcttc 1500
actgtctttg caagcgagtt atcggtgtat acgctgacgg tcatcaccct ggagcgctgg 1560
tatgccatca ccttcgccat gcgcctggac cggaagatcc gcctcaggca cgcatgtgcc 1620
atcatggttg ggggctgggt ttgctgcttc cttctcgccc tgcttccttt ggtgggaata 1680
agtagctatg ccaaagtcag tatctgcctg cccatggaca ccgagacccc tcttgctctg 1740
gcatatattg tttttgttct gacgctcaac atagttgcct tcgtcatcgt ctgctgctgt 1800
tatgtgaaga tctacatcac agtccgaaat ccgcagtaca acccagggga caaagatacc 1860
aaaattgcca agaggatggc tgtgttgatc ttcaccgact tcatatgcat ggccccaatc 1920
tcattctatg ctctgtcagc aattctgaac aagcctctca tcactgttag caactccaaa 1980
atcttgctgg tactcttcta tccacttaac tcctgtgcca atccattcct ctatgctatt 2040
ttcaccaagg ccttccagag ggatgtgttc atcctactca gcaagtttgg catctgtaaa 2100
cgccaggctc aggcataccg ggggcagagg gttcctccaa agaacagcac tgatattcag 2160
gttcaaaagg ttacccacga gatgaggcag ggtctccaca acatggaaga tgtctatgaa 2220
ctgattgaaa agtcccatct aaccccaaag aagcaaggcc aaatctcaga agagtatatg 2280
caaacggttt tgtaa 2295
<210> 2
<211> 764
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro
1 5 10 15
Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His
20 25 30
Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro
35 40 45
Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu
50 55 60
Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg
65 70 75 80
Ile Tyr Val Ser Ile Asp Leu Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser
85 90 95
Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg
100 105 110
Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu
115 120 125
Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu
130 135 140
Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp
145 150 155 160
Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys
165 170 175
Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val
180 185 190
Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn
195 200 205
Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val
210 215 220
Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala
225 230 235 240
Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn
245 250 255
Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu
260 265 270
Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn
275 280 285
Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser
290 295 300
Ser Met Gln Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser
305 310 315 320
Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp Ser Ile Val Gly
325 330 335
Tyr Lys Glu Lys Ser Lys Phe Gln Asp Thr His Asn Asn Ala His Tyr
340 345 350
Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln
355 360 365
Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His
370 375 380
Tyr Asp Tyr Thr Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro
385 390 395 400
Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Lys Phe
405 410 415
Leu Arg Ile Val Val Trp Phe Val Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gly Asn
420 425 430
Val Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Asn Val
435 440 445
Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly
450 455 460
Met Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr His Ser Glu
465 470 475 480
Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Pro Gly Cys Asn Thr
485 490 495
Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu
500 505 510
Thr Val Ile Thr Leu Glu Arg Trp Tyr Ala Ile Thr Phe Ala Met Arg
515 520 525
Leu Asp Arg Lys Ile Arg Leu Arg His Ala Cys Ala Ile Met Val Gly
530 535 540
Gly Trp Val Cys Cys Phe Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Val Gly Ile
545 550 555 560
Ser Ser Tyr Ala Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Thr Glu Thr
565 570 575
Pro Leu Ala Leu Ala Tyr Ile Val Phe Val Leu Thr Leu Asn Ile Val
580 585 590
Ala Phe Val Ile Val Cys Cys Cys Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val
595 600 605
Arg Asn Pro Gln Tyr Asn Pro Gly Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys
610 615 620
Arg Met Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Ile Cys Met Ala Pro Ile
625 630 635 640
Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ile Leu Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val
645 650 655
Ser Asn Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Leu Asn Ser Cys
660 665 670
Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp
675 680 685
Val Phe Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ile Cys Lys Arg Gln Ala Gln
690 695 700
Ala Tyr Arg Gly Gln Arg Val Pro Pro Lys Asn Ser Thr Asp Ile Gln
705 710 715 720
Val Gln Lys Val Thr His Asp Met Arg Gln Gly Leu His Asn Met Glu
725 730 735
Asp Val Tyr Glu Leu Ile Glu Asn Ser His Leu Thr Pro Lys Lys Gln
740 745 750
Gly Gln Ile Ser Glu Glu Tyr Met Gln Thr Val Leu
755 760
<210> 3
<211> 780
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
atgaggccgg cggacttgct gcagctggtg ctgctgctcg acctgcccag ggacctgggc 60
ggaatggggt gttcgtctcc accctgcgag tgccatcagg aggaggactt cagagtcacc 120
tgcaaggata ttcaacgcat ccccagctta ccgcccagta cgcagactct gaagcttatt 180
gagactcacc tgagaactat tccaagtcat gcattttcta atctgcccaa tatttccaga 240
atctacgtat ctatagatgt gactctgcag cagctggaat cacactcctt ctacaatttg 300
agtaaagtga ctcacataga aattcggaat accaggaact taacttacat agaccctgat 360
gccctcaaag agctccccct cctaaagttc cttggcattt tcaacactgg acttaaaatg 420
ttccctgacc tgaccaaagt ttattccact gatatattct ttatacttga aattacagac 480
aacccttaca tgacgtcaat ccctgtgaat gcttttcagg gactatgcaa tgaaaccttg 540
acactgaagc tgtacaacaa cggctttact tcagtccaag gatatgcttt caatgggaca 600
aagctggatg ctgtttacct aaacaagaat aaatacctga cagttattga caaagatgca 660
tttggaggag tatacagtgg accaagcttg ctggacgtgt ctcaaaccag tgtcactgcc 720
cttccatcca aaggcctgga gcacctgaag gaactgatag caagaaacac ctggactctt 780
<210> 4
<211> 260
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro
1 5 10 15
Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His
20 25 30
Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro
35 40 45
Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu
50 55 60
Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg
65 70 75 80
Ile Tyr Val Ser Ile Asp Leu Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser
85 90 95
Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg
100 105 110
Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu
115 120 125
Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu
130 135 140
Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp
145 150 155 160
Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys
165 170 175
Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val
180 185 190
Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn
195 200 205
Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val
210 215 220
Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala
225 230 235 240
Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn
245 250 255
Thr Trp Thr Leu
260
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
cactgcagga tccaaatgag gccggcggac ttg 33
<210> 6
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
cagtcctcta gattatcagt gatggtggtg gtgatggtta agagtccagg tgttcttgct 60
at 62
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
cactgcgaat tcaaaatgag gccggcggac ttgctg 36
<210> 8
<211> 48
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
gttctcctcc tcaactggga tgatgttaag agtccaggtg tttcttgc 48
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<211> 48
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
gcaagaaaca cctggactct taacatcatc ccagttgagg aggagaac 48
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
taatacgact cactataggg 20
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
ggaatggggt gttcgtctcc agagtgcgag tgccatcagg aggag 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
cccagtacgc agactctgaa gttcattgag actcacctga gaact 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
cagactctga agcttattga ggtgcacctg agaactattc caagt 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
actctgaagc ttattgagac ttgcctgaga actattccaa gtcat 45
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
ctgaagctta ttgagactca ctacagaact attccaagtc atgca 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
cacatagaaa ttcggaatac ccccaactta acttacatag accct 45
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<213> Homo sapiens
<400> 17
aacactggac ttaaaatgtt catcgacctg accaaagttt attcc 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
actggactta aaatgttccc tcccctgacc aaagtttatt ccact 45
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
ctgaccaaag tttattccac tgagatattc tttatacttg aaatt 45
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<213> Homo sapiens
<400> 20
acagacaacc cttacatgac gaccatccct gtgaatgctt ttcag 45
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
gacaaccctt acatgacgtc attccctgtg aatgcttttc aggga 45
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
aacccttaca tgacgtcaat ctacgtgaat gcttttcagg gacta 45
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
ccttacatga cgtcaatccc taggaatgct tttcagggac tatgc 45
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<213> Homo sapiens
<400> 24
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<213> Homo sapiens
<400> 25
tttcagggac tatgcaatga atgcttgaca ctgaagctgt acaac 45
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<213> Homo sapiens
<400> 26
ctgtacaaca acggctttac tgaggtccaa ggatatgctt tcaat 45
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<213> Homo sapiens
<400> 27
ctggagcacc tgaaggaact gagagcaaga aacacctgga ctctt 45
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<211> 39
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 28
cacctgaagg aactgatagc atacaacacc tggactctt 39
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Glu Cys Glu Cys His Gln Glu Glu
1 5 10 15
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Phe Ile Glu Thr His Leu Arg Thr
1 5 10 15
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Val His Leu Arg Thr Ile Pro Ser
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr Cys Leu Arg Thr Ile Pro Ser His
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Tyr Arg Thr Ile Pro Ser His Ala
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Pro Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro
1 5 10 15
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<213> Homo sapiens
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Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Ile Asp Leu Thr Lys Val Tyr Ser
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Pro Leu Thr Lys Val Tyr Ser Thr
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<213> Homo sapiens
<400> 37
Leu Thr Lys Val Tyr Ser Thr Glu Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Thr Asp Asn Pro Tyr Met Thr Thr Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Asp Asn Pro Tyr Met Thr Ser Phe Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Tyr Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu
1 5 10 15
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<213> Homo sapiens
<400> 41
Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Arg Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Trp Ala Phe Gln Gly Leu Cys Asn
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Phe Gln Gly Leu Cys Asn Glu Cys Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Glu Val Gln Gly Tyr Ala Phe Asn
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Arg Ala Arg Asn Thr Trp Thr Leu
1 5 10 15
<210> 46
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Tyr Asn Thr Trp Thr Leu
1 5 10
<210> 47
<211> 764
<212> PRT
<213> Cercopithecus aethiops
<400> 47
Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Val Leu Pro
1 5 10 15
Arg Asp Leu Gly Gly Lys Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys Gln
20 25 30
Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro
35 40 45
Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr Arg Leu
50 55 60
Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Ser Leu Pro Asn Ile Ser Arg
65 70 75 80
Ile Tyr Leu Ser Ile Asp Ala Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser
85 90 95
Phe Tyr Asn Leu Asn Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg
100 105 110
Ser Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu
115 120 125
Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu
130 135 140
Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp
145 150 155 160
Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys
165 170 175
Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Ile
180 185 190
Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn
195 200 205
Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val
210 215 220
Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser His Thr Ser Val Thr Ala
225 230 235 240
Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn
245 250 255
Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu
260 265 270
Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn
275 280 285
Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser
290 295 300
Ser Met Gln Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser
305 310 315 320
Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Asp Asp Gly Ile Val Gly
325 330 335
Tyr Lys Glu Lys Ser Lys Phe Gln Asp Ala His Asn Asn Ala His Tyr
340 345 350
Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln
355 360 365
Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His
370 375 380
Tyr Asp Tyr Thr Val Cys Gly Asp Asn Glu Asp Met Val Cys Thr Pro
385 390 395 400
Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Lys Phe
405 410 415
Leu Arg Ile Val Val Trp Phe Val Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gly Asn
420 425 430
Val Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Asn Val
435 440 445
Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly
450 455 460
Met Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr His Ser Glu
465 470 475 480
Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Pro Gly Cys Asn Thr
485 490 495
Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu
500 505 510
Thr Val Ile Thr Leu Glu Arg Trp Tyr Ala Ile Thr Phe Ala Met Arg
515 520 525
Leu Asp Arg Lys Ile Arg Leu Arg His Ala Cys Ala Ile Met Val Gly
530 535 540
Gly Trp Val Cys Cys Phe Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Val Gly Ile
545 550 555 560
Ser Ser Tyr Ala Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Thr Glu Thr
565 570 575
Pro Leu Ala Leu Ala Tyr Ile Val Phe Val Leu Thr Leu Asn Ile Val
580 585 590
Ala Phe Val Ile Val Cys Cys Cys Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val
595 600 605
Arg Asn Pro Gln Tyr Asn Pro Gly Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys
610 615 620
Arg Met Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Met Cys Met Ala Pro Ile
625 630 635 640
Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ile Leu Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val
645 650 655
Ser Asn Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Leu Asn Ser Cys
660 665 670
Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp
675 680 685
Val Phe Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ile Cys Lys Arg Gln Ala Gln
690 695 700
Ala Tyr Arg Gly Gln Arg Val Pro Pro Lys Asn Ser Thr Asp Ile Gln
705 710 715 720
Val Gln Lys Val Thr His Glu Met Arg Gln Gly Leu His Asn Met Glu
725 730 735
Asp Val Tyr Glu Leu Ile Glu Asn Ser His Leu Thr Pro Lys Lys Gln
740 745 750
Gly Gln Ile Ser Glu Glu Tyr Thr Gln Thr Val Leu
755 760
<210> 48
<211> 764
<212> PRT
<213> Macaca mulatta
<400> 48
Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Val Leu Pro
1 5 10 15
Arg Asp Leu Gly Gly Lys Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys Gln
20 25 30
Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro
35 40 45
Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr Arg Leu
50 55 60
Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Ser Leu Pro Asn Ile Ser Arg
65 70 75 80
Ile Tyr Leu Ser Ile Asp Ala Thr Leu Gln Gln Leu Glu Thr His Ser
85 90 95
Phe Tyr Asn Leu Asn Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg
100 105 110
Ser Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu
115 120 125
Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu
130 135 140
Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp
145 150 155 160
Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys
165 170 175
Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Ile
180 185 190
Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn
195 200 205
Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val
210 215 220
Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser His Thr Ser Val Thr Ala
225 230 235 240
Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn
245 250 255
Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu
260 265 270
Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn
275 280 285
Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Pro Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser
290 295 300
Ser Met Gln Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser
305 310 315 320
Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Asp Asp Gly Ile Val Gly
325 330 335
Tyr Lys Glu Lys Ser Lys Phe Gln Asp Ala His Asn Asn Ala His Tyr
340 345 350
Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln
355 360 365
Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His
370 375 380
Tyr Asp Tyr Thr Val Cys Gly Asp Asn Glu Asp Met Val Cys Thr Pro
385 390 395 400
Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Lys Phe
405 410 415
Leu Arg Ile Val Val Trp Phe Val Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gly Asn
420 425 430
Val Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Asn Val
435 440 445
Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly
450 455 460
Met Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr His Ser Glu
465 470 475 480
Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Pro Gly Cys Asn Thr
485 490 495
Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu
500 505 510
Thr Val Ile Thr Leu Glu Arg Trp Tyr Ala Ile Thr Phe Ala Met Arg
515 520 525
Leu Asp Arg Lys Ile Arg Leu Arg His Ala Cys Ala Ile Met Val Gly
530 535 540
Gly Trp Val Cys Cys Phe Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Val Gly Ile
545 550 555 560
Ser Ser Tyr Ala Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Thr Glu Thr
565 570 575
Pro Leu Ala Leu Ala Tyr Ile Val Phe Val Leu Thr Leu Asn Ile Val
580 585 590
Ala Phe Val Ile Val Cys Cys Cys Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val
595 600 605
Arg Asn Pro Gln Tyr Asn Pro Gly Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys
610 615 620
Arg Met Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Ile Cys Met Ala Pro Ile
625 630 635 640
Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ile Leu Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val
645 650 655
Ser Asn Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Leu Asn Ser Cys
660 665 670
Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp
675 680 685
Val Phe Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ile Cys Lys Arg Gln Ala Gln
690 695 700
Ala Tyr Arg Gly Gln Arg Val Pro Pro Lys Asn Ser Thr Asp Ile Gln
705 710 715 720
Val Gln Lys Val Thr His Glu Met Arg Gln Asp Leu His Asn Met Gln
725 730 735
Asp Val Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Ser His Leu Thr Pro Lys Lys Gln
740 745 750
Gly Gln Ile Ser Glu Glu Tyr Thr Gln Thr Val Leu
755 760
<210> 49
<211> 764
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 49
Met Ser Leu Thr Pro Leu Leu Gln Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Pro
1 5 10 15
Arg Ser Leu Arg Gly Lys Gly Cys Pro Ser Pro Pro Cys Glu Cys His
20 25 30
Gln Glu Asp Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile His Ser Ile Pro
35 40 45
Pro Leu Pro Pro Asn Thr Gln Thr Leu Lys Phe Ile Glu Thr His Leu
50 55 60
Lys Thr Ile Pro Ser Arg Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg
65 70 75 80
Ile Tyr Leu Ser Ile Asp Ala Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser Gln Ser
85 90 95
Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Met Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg
100 105 110
Ser Leu Thr Tyr Ile Asn Pro Gly Ala Leu Lys Asp Leu Pro Leu Leu
115 120 125
Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Arg Ile Phe Pro Asp Leu
130 135 140
Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Val Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp
145 150 155 160
Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Ala Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys
165 170 175
Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val
180 185 190
Gln Gly His Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn
195 200 205
Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val
210 215 220
Phe Ser Gly Pro Thr Leu Leu Asp Val Ser Tyr Thr Ser Val Thr Ala
225 230 235 240
Leu Pro Pro Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn
245 250 255
Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu
260 265 270
Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn
275 280 285
Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser
290 295 300
Ser Ile Arg Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Val Asn Gly
305 310 315 320
Pro Phe Tyr Gln Glu Tyr Glu Glu Asp Leu Gly Asp Thr Ser Val Gly
325 330 335
Asn Lys Glu Asn Ser Lys Phe Gln Asp Thr His Ser Asn Ser His Tyr
340 345 350
Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln
355 360 365
Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His
370 375 380
Tyr Asp Tyr Thr Val Cys Gly Gly Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro
385 390 395 400
Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Arg Phe
405 410 415
Leu Arg Ile Val Val Trp Phe Val Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gly Asn
420 425 430
Val Phe Val Leu Val Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Thr Val
435 440 445
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450 455 460
Met Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr Gln Ser Glu
465 470 475 480
Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Pro Gly Cys Asn Thr
485 490 495
Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu
500 505 510
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515 520 525
Leu Asp Arg Lys Ile Arg Leu Arg His Ala Tyr Ala Ile Met Ala Gly
530 535 540
Gly Trp Val Cys Cys Phe Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Val Gly Ile
545 550 555 560
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
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Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn
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Pro Leu Ala Leu Ala Tyr Ile Ala Leu Val Leu Leu Leu Asn Val Val
580 585 590
Ala Phe Val Ile Val Cys Ser Cys Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val
595 600 605
Arg Asn Pro Gln Tyr Asn Pro Arg Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys
610 615 620
Arg Met Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Met Cys Met Ala Pro Ile
625 630 635 640
Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Leu Met Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val
645 650 655
Thr Asn Ser Gly Val Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Leu Asn Ser Cys
660 665 670
Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp
675 680 685
Val Phe Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Leu Cys Lys His Gln Ala Gln
690 695 700
Ala Tyr Gln Ala Gln Arg Val Cys Pro Asn Asn Asn Thr Gly Ile Gln
705 710 715 720
Ile Gln Lys Ile Pro Gln Asp Thr Arg Gln Ser Leu Pro Asn Val Gln
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Gly Arg Ile Ser Glu Glu Tyr Thr Gln Thr Ala Leu
755 760
<210> 55
<211> 764
<212> PRT
<213> Ovis aries
<400> 55
Met Arg Pro Thr Pro Leu Leu Arg Leu Ala Leu Leu Leu Val Leu Pro
1 5 10 15
Ser Ser Leu Trp Gly Glu Arg Cys Pro Ser Pro Pro Cys Glu Cys Arg
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Lys Thr Ile Pro Ser Arg Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg
65 70 75 80
Ile Tyr Leu Ser Ile Asp Ala Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Ile
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225 230 235 240
Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn
245 250 255
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Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn
275 280 285
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp
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<210> 56
<211> 764
<212> PRT
<213> Equus caballus
<400> 56
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<210> 57
<211> 695
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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Ile Ser Arg Thr Arg Ile His Ser Leu Pro Ser Tyr Gly Leu Glu Asn
225 230 235 240
Leu Lys Lys Leu Arg Ala Arg Ser Thr Tyr Asn Leu Lys Lys Leu Pro
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Ser Tyr Ser Arg Gly Phe Asp Met Thr Tyr Thr Glu Phe Asp Tyr Asp
325 330 335
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Val Ile Leu Thr Thr Ser Gln Tyr Lys Leu Thr Val Pro Arg Phe Leu
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Leu Ile Ala Ser Val Asp Ile His Thr Lys Ser Gln Tyr His Asn Tyr
420 425 430
Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Ala Gly Cys Asp Ala Ala Gly Phe Phe
435 440 445
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450 455 460
Leu Glu Arg Trp His Thr Ile Thr His Ala Met Gln Leu Asp Cys Lys
465 470 475 480
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485 490 495
Ala Phe Ala Ala Ala Leu Phe Pro Ile Phe Gly Ile Ser Ser Tyr Met
500 505 510
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515 520 525
Leu Tyr Val Met Ser Leu Leu Val Leu Asn Val Leu Ala Phe Val Val
530 535 540
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Ile Val Ser Ser Ser Ser Asp Thr Arg Ile Ala Lys Arg Met Ala Met
565 570 575
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580 585 590
Ile Ser Ala Ser Leu Lys Val Pro Leu Ile Thr Val Ser Lys Ala Lys
595 600 605
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<210> 58
<211> 699
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
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50 55 60
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65 70 75 80
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Leu Leu Asn Leu Ser Glu Ile Leu Ile Gln Asn Thr Lys Asn Leu Arg
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Tyr Ile Glu Pro Gly Ala Phe Ile Asn Leu Pro Arg Leu Lys Tyr Leu
115 120 125
Ser Ile Cys Asn Thr Gly Ile Arg Lys Phe Pro Asp Val Thr Lys Val
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Phe Ser Ser Glu Ser Asn Phe Ile Leu Glu Ile Cys Asp Asn Leu His
145 150 155 160
Ile Thr Thr Ile Pro Gly Asn Ala Phe Gln Gly Met Asn Asn Glu Ser
165 170 175
Val Thr Leu Lys Leu Tyr Gly Asn Gly Phe Glu Glu Val Gln Ser His
180 185 190
Ala Phe Asn Gly Thr Thr Leu Thr Ser Leu Glu Leu Lys Glu Asn Val
195 200 205
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210 215 220
Lys Thr Leu Asp Ile Ser Ser Thr Lys Leu Gln Ala Leu Pro Ser Tyr
225 230 235 240
Gly Leu Glu Ser Ile Gln Arg Leu Ile Ala Thr Ser Ser Tyr Ser Leu
245 250 255
Lys Lys Leu Pro Ser Arg Glu Thr Phe Val Asn Leu Leu Glu Ala Thr
260 265 270
Leu Thr Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Arg Asn Leu Pro Thr Lys
275 280 285
Glu Gln Asn Phe Ser His Ser Ile Ser Glu Asn Phe Ser Lys Gln Cys
290 295 300
Glu Ser Thr Val Arg Lys Val Asn Asn Lys Thr Leu Tyr Ser Ser Met
305 310 315 320
Leu Ala Glu Ser Glu Leu Ser Gly Trp Asp Tyr Glu Tyr Gly Phe Cys
325 330 335
Leu Pro Lys Thr Pro Arg Cys Ala Pro Glu Pro Asp Ala Phe Asn Pro
340 345 350
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355 360 365
Ile Asn Ile Leu Ala Ile Met Gly Asn Met Thr Val Leu Phe Val Leu
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Leu Thr Ser Arg Tyr Lys Leu Thr Val Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn
385 390 395 400
Leu Ser Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly Leu Tyr Leu Leu Leu Ile Ala
405 410 415
Ser Val Asp Ser Gln Thr Lys Gly Gln Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp
420 425 430
Trp Gln Thr Gly Ser Gly Cys Ser Thr Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe
435 440 445
Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu Thr Val Ile Thr Leu Glu Arg
450 455 460
Trp His Thr Ile Thr Tyr Ala Ile His Leu Asp Gln Lys Leu Arg Leu
465 470 475 480
Arg His Ala Ile Leu Ile Met Leu Gly Gly Trp Leu Phe Ser Ser Leu
485 490 495
Ile Ala Met Leu Pro Leu Val Gly Val Ser Asn Tyr Met Lys Val Ser
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Thr Asp Phe Thr Cys Met Ala Pro Ile Ser Phe Phe Ala Ile Ser Ala
580 585 590
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595 600 605
Val Leu Phe Tyr Pro Ile Asn Ser Cys Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala
610 615 620
Ile Phe Thr Lys Thr Phe Gln Arg Asp Phe Phe Leu Leu Leu Ser Lys
625 630 635 640
Phe Gly Cys Cys Lys Arg Arg Ala Glu Leu Tyr Arg Arg Lys Asp Phe
645 650 655
Ser Ala Tyr Thr Ser Asn Cys Lys Asn Gly Phe Thr Gly Ser Asn Lys
660 665 670
Pro Ser Gln Ser Thr Leu Lys Leu Ser Thr Leu His Cys Gln Gly Thr
675 680 685
Ala Leu Leu Asp Lys Thr Arg Tyr Thr Glu Cys
690 695
<210> 59
<211> 2292
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 59
atgaggccgg cggacttgct gcagctggtg ctgctgctcg acctgcccag ggacctgggc 60
ggaatggggt gttcgtctcc accctgcgag tgccatcagg aggaggactt cagagtcacc 120
tgcaaggata ttcaacgcat ccccagctta ccgcccagta cgcagactct gaagcttatt 180
gagactcacc tgagaactat tccaagtcat gcattttcta atctgcccaa tatttccaga 240
atctacgtat ctatagatgt gactctgcag cagctggaat cacactcctt ctacaatttg 300
agtaaagtga ctcacataga aattcggaat accaggaact taacttacat agaccctgat 360
gccctcaaag agctccccct cctaaagttc cttggcattt tcaacactgg acttaaaatg 420
ttccctgacc tgaccaaagt ttattccact gatatattct ttatacttga aattacagac 480
aacccttaca tgacgtcaat ccctgtgaat gcttttcagg gactatgcaa tgaaaccttg 540
acactgaagc tgtacaacaa cggctttact tcagtccaag gatatgcttt caatgggaca 600
aagctggatg ctgtttacct aaacaagaat aaatacctga cagttattga caaagatgca 660
tttggaggag tatacagtgg accaagcttg ctggacgtgt ctcaaaccag tgtcactgcc 720
cttccatcca aaggcctgga gcacctgaag gaactgatag caagaaacac ctggactctt 780
aacatcatcc cagttgagga ggagaacccg gacttctgga accgcgaggc agccgaggcc 840
ctgggtgccg ccaagaagct gcagcctgca cagacagccg ccaagaacct catcatcttc 900
ctgggcgatg ggatgggggt gtctacggtg acagctgcca ggatcctaaa agggcagaag 960
aaggacaaac tggggcctga gatacccctg gccatggacc gcttcccata tgtggctctg 1020
tccaagacat acaatgtaga caaacatgtg ccagacagtg gagccacagc cacggcctac 1080
ctgtgcgggg tcaagggcaa cttccagacc attggcttga gtgcagccgc ccgctttaac 1140
cagtgcaaca cgacacgcgg caacgaggtc atctccgtga tgaatcgggc caagaaagca 1200
gggaagtcag tgggagtggt aaccaccaca cgagtgcagc acgcctcgcc agccggcacc 1260
tacgcccaca cggtgaaccg caactggtac tcggacgccg acgtgcctgc ctcggcccgc 1320
caggaggggt gccaggacat cgctacgcag ctcatctcca acatggacat tgacgtgatc 1380
ctaggtggag gccgaaagta catgtttcgc atgggaaccc cagaccctga gtacccagat 1440
gactacagcc aaggtgggac caggctggac gggaagaatc tggtgcagga atggctggcg 1500
aagcgccagg gtgcccggta tgtgtggaac cgcactgagc tcatgcaggc ttccctggac 1560
ccgtctgtga cccatctcat gggtctcttt gagcctggag acatgaaata cgagatccac 1620
cgagactcca cactggaccc ctccctgatg gagatgacag aggctgccct gcgcctgctg 1680
agcaggaacc cccgcggctt cttcctcttc gtggagggtg gtcgcatcga ccatggtcat 1740
catgaaagca gggcttaccg ggcactgact gagacgatca tgttcgacga cgccattgag 1800
agggcgggcc agctcaccag cgaggaggac acgctgagcc tcgtcactgc cgaccactcc 1860
cacgtcttct ccttcggagg ctaccccctg cgagggagct ccatcttcgg gctggcccct 1920
ggcaaggccc gggacaggaa ggcctacacg gtcctcctat acggaaacgg tccaggctat 1980
gtgctcaagg acggcgcccg gccggatgtt accgagagcg agagcgggag ccccgagtat 2040
cggcagcagt cagcagtgcc cctggacgaa gagacccacg caggcgagga cgtggcggtg 2100
ttcgcgcgcg gcccgcaggc gcacctggtt cacggcgtgc aggagcagac cttcatagcg 2160
cacgtcatgg ccttcgccgc ctgcctggag ccctacaccg cctgcgacct ggcgcccccc 2220
gccggcacca ccgacgccgc gcacccgggt tactctagag tcggggcggc cggccgcttc 2280
gagcagacat ga 2292
<210> 60
<211> 763
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro
1 5 10 15
Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His
20 25 30
Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro
35 40 45
Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu
50 55 60
Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg
65 70 75 80
Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser
85 90 95
Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg
100 105 110
Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu
115 120 125
Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu
130 135 140
Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp
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tacgtgaaga tctacatcac agtccgaaat ccccagtata acccgggaga caaagacact 1860
aaaattgcca aaaggatggc tgtgttgatc ttcactgact tcatgtgcat ggccccgatc 1920
tccttttacg ccctctcagc acttatgaac aagcctctca tcactgtcac caactccaaa 1980
atcttgctcg ttctcttcta cccacttaac tcctgtgcca acccgttcct ctatgccatt 2040
ttcaccaaag ccttccagag ggatgtgttt atcctgctca gcaagttcgg cttctgtaaa 2100
cgccaggctc aggcataccg gggtcagaga gtgtctccaa agaacagcac tggtattcag 2160
gtccaaaagg ttacccaaaa catgaggcaa agtctcccca acatgcagga tgactatgaa 2220
ctgcttgaaa actcgcatct aacccacaaa aagcatgacc aaatttcaaa ggagtataag 2280
caaccagttt tgtaa 2295
<210> 66
<211> 764
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 66
Met Ser Leu Thr Pro Leu Leu Gln Leu Ala Leu Leu Leu Ala Leu Pro
1 5 10 15
Arg Ser Leu Arg Gly Lys Gly Cys Pro Ser Pro Pro Cys Glu Cys His
20 25 30
Gln Glu Asp Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile His Ser Ile Pro
35 40 45
Pro Leu Pro Pro Asn Thr Gln Thr Leu Lys Phe Ile Glu Thr Cys Leu
50 55 60
Lys Thr Ile Pro Ser Arg Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg
65 70 75 80
Ile Tyr Leu Ser Ile Asp Ala Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser Gln Ser
85 90 95
Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Met Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Thr Tyr Ile Asn Pro Gly Ala Leu Lys Asp Leu Pro Leu Leu
115 120 125
Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Arg Ile Phe Pro Pro Leu
130 135 140
Thr Lys Val Tyr Ser Thr Glu Val Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp
145 150 155 160
Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Arg Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys
165 170 175
Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val
180 185 190
Gln Gly His Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn
195 200 205
Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val
210 215 220
Phe Ser Gly Pro Thr Leu Leu Asp Val Ser Tyr Thr Ser Val Thr Ala
225 230 235 240
Leu Pro Pro Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Arg Ala Arg Asn
245 250 255
Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu
260 265 270
Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn
275 280 285
Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser
290 295 300
Ser Ile Arg Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Val Asn Gly
305 310 315 320
Pro Phe Tyr Gln Glu Tyr Glu Glu Asp Leu Gly Asp Ser Ser Val Gly
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Asn Lys Glu Asn Ser Lys Phe Gln Asp Thr His Ser Asn Ser His Tyr
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Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln
355 360 365
Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His
370 375 380
Tyr Asp Tyr Thr Val Cys Gly Gly Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro
385 390 395 400
Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Arg Phe
405 410 415
Leu Arg Ile Val Val Trp Phe Val Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gly Asn
420 425 430
Val Phe Val Leu Val Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Thr Val
435 440 445
Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly
450 455 460
Met Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr Gln Ser Glu
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
Thr Val Ile Thr Leu Glu Arg Trp Tyr Ala Ile Thr Phe Ala Met Arg
515 520 525
Leu Asp Arg Lys Ile Arg Leu Arg His Ala Tyr Ala Ile Met Ala Gly
530 535 540
Gly Trp Val Cys Cys Phe Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Val Gly Ile
545 550 555 560
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565 570 575
Pro Leu Ala Leu Ala Tyr Ile Ile Leu Val Leu Leu Leu Asn Ile Val
580 585 590
Ala Phe Thr Ile Val Cys Ser Cys Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val
595 600 605
Arg Asn Pro Gln Tyr Asn Pro Gly Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys
610 615 620
Arg Met Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Met Cys Met Ala Pro Ile
625 630 635 640
Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Leu Met Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val
645 650 655
Thr Asn Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Leu Asn Ser Cys
660 665 670
Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp
675 680 685
Val Phe Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Phe Cys Lys Arg Gln Ala Gln
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Ala Tyr Arg Gly Gln Arg Val Ser Pro Lys Asn Ser Thr Gly Ile Gln
705 710 715 720
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755 760
<210> 67
<211> 2295
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 67
atgaggccag ggtccctgct gctgcttgtt ctgctgctcg ccctgtccag gagcctgcgg 60
ggcaaagagt gtgcgtctcc accctgtgag tgtcaccagg aggacgactt cagagtcacc 120
tgcaaggagc tccaccgaat ccccagcctg ccgcccagca cccagactct gaagctcatc 180
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ttccctccct tgaccaaaat ttattccacg gagatattct ttatacttga aatcacagac 480
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tccaagttcc aggagagccc aagcaactct cactattacg tcttctttga agaacaagag 1080
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caaacagcct tgtaa 2295
<210> 68
<211> 764
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 68
Met Arg Pro Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Leu Ala Leu Ser
1 5 10 15
Arg Ser Leu Arg Gly Lys Glu Cys Ala Ser Pro Pro Cys Glu Cys His
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Gln Glu Asp Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Glu Leu His Arg Ile Pro
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Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr Cys Leu
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Lys Thr Ile Pro Ser Leu Ala Phe Ser Ser Leu Pro Asn Ile Ser Arg
65 70 75 80
Ile Tyr Leu Ser Ile Asp Ala Thr Leu Gln Arg Leu Glu Pro His Ser
85 90 95
Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Met Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Thr Glu Leu Pro Leu Leu
115 120 125
Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Arg Ile Phe Pro Pro Leu
130 135 140
Thr Lys Ile Tyr Ser Thr Glu Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp
145 150 155 160
Asn Pro Tyr Met Thr Ser Val Pro Arg Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys
165 170 175
Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val
180 185 190
Gln Gly His Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn
195 200 205
Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Ala Ile Asp Asn Asp Ala Phe Gly Gly Val
210 215 220
Tyr Ser Gly Pro Thr Leu Leu Asp Val Ser Ser Thr Ser Val Thr Ala
225 230 235 240
Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Arg Ala Lys Asp
245 250 255
Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu
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Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn
275 280 285
Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser
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305 310 315 320
Pro Ile Tyr Gln Glu Tyr Glu Glu Asp Pro Gly Asp Asn Ser Val Gly
325 330 335
Tyr Lys Gln Asn Ser Lys Phe Gln Glu Ser Pro Ser Asn Ser His Tyr
340 345 350
Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Val Val Gly Phe Gly Gln
355 360 365
Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Glu Ser His
370 375 380
Tyr Asp Tyr Thr Val Cys Gly Asp Asn Glu Asp Met Val Cys Thr Pro
385 390 395 400
Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Arg Phe
405 410 415
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Ile Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Thr Val
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Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly
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Val Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr His Ser Glu
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485 490 495
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<210> 69
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<400> 74
ctggcctttg cggatttctg cgtggggatg tacctgctcc tcatc 45
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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gcggatttct gcatggggat gttcctgctc ctcatcgcct ctgta 45
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
<400> 77
atcgcctctg tagacctcta catccactct gagtactaca accat 45
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 78
tacaaccatg ccatcgactg gcacacaggc cctgggtgca acacg 45
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<213> Homo sapiens
<400> 79
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<213> Homo sapiens
<400> 81
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<210> 82
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<213> Homo sapiens
<400> 82
ttcgtcatcg tctgctgctg tttcgtgaag atctacatca cagtc 45
<210> 83
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 83
tcattctatg ctctgtcagc actgctgaac aagcctctca tcact 45
<210> 84
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<213> Homo sapiens
<400> 84
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<213> Homo sapiens
<400> 85
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<213> Homo sapiens
<400> 86
gtactcttct atccacttaa cgcctgtgcc aatccattcc tctat 45
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
<400> 88
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<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89
Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Lys Asp Ile Met Gly Tyr Lys Phe
1 5 10 15
<210> 90
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 90
Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Glu Ile Met Gly Tyr Lys Phe Leu
1 5 10 15
<210> 91
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 91
Leu Leu Ile Leu Leu Thr Ser Asn Tyr Lys Leu Asn Val Pro Arg
1 5 10 15
<210> 92
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
Lys Leu Asn Val Pro Arg Phe Tyr Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala
1 5 10 15
<210> 93
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 93
Val Pro Arg Phe Leu Met Cys Ala Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys
1 5 10 15
<210> 94
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 94
Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Val Gly Met Tyr Leu Leu Leu Ile
1 5 10 15
<210> 95
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 95
Ala Asp Phe Cys Met Gly Met Phe Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val
1 5 10 15
<210> 96
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 96
Asp Phe Cys Met Gly Met Tyr Pro Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp
1 5 10 15
<210> 97
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 97
Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Ile His Ser Glu Tyr Tyr Asn His
1 5 10 15
<210> 98
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98
Tyr Asn His Ala Ile Asp Trp His Thr Gly Pro Gly Cys Asn Thr
1 5 10 15
<210> 99
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 99
Val Gly Ile Ser Ser Tyr Ala Leu Val Ser Ile Cys Leu Pro Met
1 5 10 15
<210> 100
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 100
Thr Leu Asn Ile Val Ala Phe Ile Ile Val Cys Cys Cys Tyr Val
1 5 10 15
<210> 101
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 101
Ala Phe Val Ile Val Cys Cys Arg Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr
1 5 10 15
<210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
Phe Val Ile Val Cys Cys Cys Phe Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val
1 5 10 15
<210> 103
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 103
Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Leu Leu Asn Lys Pro Leu Ile Thr
1 5 10 15
<210> 104
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 104
Leu Ile Thr Val Ser Asn Ser Asp Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr
1 5 10 15
<210> 105
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 105
Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Val Pro Leu Asn Ser Cys Ala Asn
1 5 10 15
<210> 106
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 106
Val Leu Phe Tyr Pro Leu Asn Ala Cys Ala Asn Pro Phe Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 107
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 107
Ser Cys Ala Asn Pro Phe Leu Leu Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Ser Cys Ala Asn Pro Phe Leu Ala Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe
1 5 10 15

Claims (133)

1.突变体促甲状腺激素受体(TSHR)或其片段，其包含一或多个突变，其中所述突变体TSHR与等价的野生型TSHR或片段相比具有增加的热稳定性。
2.权利要求1的突变体TSHR或其片段，其中所述一或多个突变在TSHR的胞外亮氨酸富集的重复结构域(LRD)中。
3.权利要求1或2的突变体TSHR或其片段，其中所述一或多个突变在TSHR的残基22-260(TSHR260)内。
4.前述任何权利要求的突变体TSHR或其片段，其中所述TSHR或其片段来自哺乳动物物种。
5.权利要求4的突变体TSHR或其片段，其中所述TSHR或其片段来自或者衍生自人TSHR。
6.权利要求4的突变体TSHR或其片段，其中所述TSHR或其片段来自或者衍生自猴、猪、牛、猫、狗、小鼠、大鼠、羊或者马TSHR(SEQ ID No:47-56)。
7.前述任何权利要求的突变体TSHR或其片段，其结合TSHR自身抗体。
8.权利要求7的突变体TSHR或其片段，其中所述TSHR自身抗体是M22、K1-70或K1-18。
9.前述任何权利要求的突变体TSHR或其片段，其中通过在42℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是等价野生型TSHR或片段的半衰期的1.5倍或更高。
10.权利要求9的突变体TSHR或其片段，其中通过在42℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是等价的野生型TSHR或片段的半衰期的2倍或更高。
11.权利要求9或10的突变体TSHR或其片段，其中通过在42℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是等价的野生型TSHR或片段的半衰期的3倍或更高。
12.前述任何权利要求的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体含有单一点突变。
13.权利要求1-11任一项的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体含有双重点突变。
14.权利要求13的突变体TSHR或其片段，其中通过在42℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是等价的野生型TSHR或片段的半衰期的3.5倍或更高。
15.权利要求13或14的突变体TSHR或其片段，其中通过在42℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是等价的野生型TSHR或片段的半衰期的5倍或更高。
16.权利要求13、14或15的突变体TSHR或其片段，其中通过在42℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是等价的野生型TSHR或片段的半衰期的7倍或更高。
17.权利要求13-16任一项的突变体TSHR或其片段，其中通过在50℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是等价的野生型TSHR或片段的半衰期的3倍或更高。
18.权利要求1-11任一项的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体含有三重点突变。
19.权利要求18的突变体TSHR或其片段，其中通过在50℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是包含单一点突变I253R的TSHR260突变体的半衰期的9倍或更高。
20.权利要求1-11任一项的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体含有四重点突变。
21.权利要求20的突变体TSHR或其片段，其中通过在50℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是包含单一点突变I253R的TSHR260突变体(SEQ ID No:27和45，分别为DNA和蛋白质序列)的半衰期的20倍或更高。
22.权利要求20的突变体TSHR或其片段，其中通过在55℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是包含单一点突变I253R的TSHR260突变体(SEQ ID No:27和45，分别为DNA和蛋白质序列)的半衰期的12倍或更高。
23.权利要求1-11任一项的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体含有五重点突变。
24.权利要求23的突变体TSHR或其片段，其中通过在55℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是包含单一点突变I253R的TSHR260突变体(SEQ ID No:27和45，分别为DNA和蛋白质序列)的半衰期的40倍或更高。
25.权利要求1-11任一项的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体含有六重点突变。
26.权利要求25的突变体TSHR或其片段，其中通过在55℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是包含单一点突变I253R的TSHR260突变体(SEQ ID No:27和45，分别为DNA和蛋白质序列)的半衰期的800倍或更高，或者是包含四重点突变I253R+D143P+R112P+D151E的TSHR260突变体(SEQ ID No:27、18、16、19(DNA)，SEQ ID No:45、36、34、37(蛋白质))的半衰期的1.2倍或更高。
27.权利要求25的突变体TSHR或其片段，其中通过在60℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是包含四重点突变I253R+D143P+R112P+D151E的TSHR260突变体(SEQ ID No:27、18、16、19(DNA)和SEQ ID No:45、36、34、37(蛋白质))的半衰期的3倍或更高。
28.权利要求1-11任一项的突变体TSHR，其是全长TSHR突变体，其中通过在50℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是等价的野生型全长TSHR的半衰期的3倍或更高。
29.权利要求28的突变体TSHR，其中通过在50℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是等价的野生型TSHR或片段的半衰期的5倍或更高。
30.权利要求28或29的突变体TSHR，其中所述突变体在TSHR的残基22-260(TSHR260)内包含三个或更多个点突变。
31.权利要求1-27任一项的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体由或者基本由TSHR受体的亚结构域TSHR260组成。
32.权利要求1-12或28-29或31任一项的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体包含如下任一的单一点突变：P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R和R255Y(SEQ ID No:11-25、27和28(DNA)，SEQ IDNo:29-43、45和46(蛋白质))。
33.权利要求1-11或13-17或28-29或31任一项的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体含有两个点突变，一个是I253R，第二个是根据权利要求32的不同的突变。
34.权利要求1-11或18-19或28-31任一项的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体含有三个点突变，一个是I253R(SEQ ID No:27和45)，第二个是D143P(SEQ ID No:18和36)，以及第三个是P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D151E、S166T、P168Y、V169R和N170W之一(SEQ ID No:11-17、19-25和28(DNA)，SEQ ID No:29-35、37-43和46(蛋白质))。
35.权利要求1-11或20-22或28-31任一项的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体含有四个点突变，一个是I253R(SEQ ID No:27和45)，第二个是D143P(SEQ ID No:18和36)，第三个是R112P(SEQ ID No:16和34)，以及第四个是L59F、H63C、D151E、S166T、V169R和N170W(SEQ ID No:12、14、19、20、23和24(DNA)，SEQ ID No:30、32、37、38、41和42(蛋白质))之一。
36.权利要求1-11或23-24或28-31任一项的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体含有五个点突变，一个是I253R(SEQ ID No:27和45)，第二个是D143P(SEQ ID No:18和36)，第三个是R112P(SEQ ID No:16和34)，第四个是D151E(SEQ ID No:19和37)或H63C(SEQ IDNo:14和32)，以及第五个是L59F、H63C、D151E、S166T和V169R(SEQ ID No:12、14、19、20、23(DNA)，SEQ ID No:30、32、37、38、41(蛋白质))之一。
37.权利要求1-11或25-31任一项的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体含有六个突变，一个是I253R，第二个是D143P(SEQ ID No:18和36)，第三个是R112P(SEQ ID No:16和34)，第四个是D151E(SEQ ID No:19和37)，第五个是H63C(SEQ ID No:14和32)，以及第六个是S166T(SEQ ID No:20和38)或者V169R(SEQ ID No:23和41)。
38.前述任何权利要求的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体含有选自如下任意的1、2、3、4、5或6个单一点突变：P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R和R255Y(SEQ ID No:11-25、27和28(DNA)，SEQ ID No:29-43，45和46(蛋白质))。
39.权利要求31-37任一项的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体由TSHR260组成，并且所述等价野生型由野生型TSHR260组成。
40.权利要求1-8或31任一项的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体包含如下突变组之一：
1)I253R(图5和6；SEQ ID No:27和45)
2)D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:18、27、36和45)
3)R112P+D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、27、34、36和45)
4)R112P+D143P+D151E+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、19、27、34、36、37和45)
5)R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:16,18,19,23,27,34,36,37,41和45)
6)H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ IDNo:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41和45)
7)H63C+R112P+D143P+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、23、27、32、34、36、41和45)
8)H63C+R112P+D143P+S166T+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、20、27、32、34、36、38和45)。
41.前述任何权利要求的突变体TSHR或其片段，其中单克隆TSHR抗体或TSH与突变体的结合，当与相同单克隆TSHR抗体与等价野生型TSHR或片段的结合相比时，不受影响或者基本不受影响。
42.前述任何权利要求的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体包含可检测标记。
43.权利要求42的突变体TSHR或其片段，其中所述标记选自酶标记、同位素标记、化学发光标记、荧光标记和染料。
44.权利要求42或43的突变体TSHR或其片段，其中所述标记包含碱性磷酸酶(AP)标记或生物素标记。
45.权利要求41、42、43或44的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体由或者基本由TSHR受体的亚结构域TSHR260组成。
46.权利要求45的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体包含碱性磷酸酶(AP)标记。
47.权利要求46的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体包含权利要求32-40任一项中所述的一或多个突变。
48.权利要求45、46或47的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体包含两个或更多个点突变，及其中通过在50℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是等价野生型TSHR或片段的半衰期的5倍或更高。
49.权利要求45、46或47的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体含有四个或更多个点突变，及其中通过在60℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是等价野生型TSHR或片段的半衰期的50倍或更高。
50.权利要求45、46或47的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体含有六个或更多个点突变，及其中通过在65℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是等价野生型TSHR或片段的半衰期的100倍或更高或者150倍或更高。
51.权利要求1-50任一项的突变体TSHR或其片段，其中热稳定性是通过在图12b中示出的稳定性测定测量的。
52.在跨膜结构域(TMD)内包含一或多个突变的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体TSHR与等价野生型TSHR或片段相比具有增加的热稳定性。
53.权利要求52的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体TSHR或其片段是全长TSHR或者通过与全长TSHR相比在突变体中存在的氨基酸数目测量，包含全长TSHR的长度的至少70％或更多、至少80％或更多、或者至少90％或更多。
54.权利要求52或53的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体进一步包含不在所述跨膜结构域中的一或多个进一步的突变，该一或多个进一步的突变如权利要求2-51任一项或多项所述。
55.权利要求54的突变体TSHR或其片段，其中所述进一步的突变包含不在所述跨膜结构域中的至少两或更多个进一步的突变，该两或更多个进一步的突变如权利要求2-51任一项或多项所述。
56.权利要求55的突变体TSHR或其片段，其中所述进一步的突变包含六重点突变H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(TSHR-JMG55)(SEQ ID No:14、16、18、19、23和27(DNA)，SEQ ID No:32、34、36、37、41和45(蛋白质))。
57.权利要求54、55或56的突变体TSHR或其片段，其中与仅包含不在所述跨膜结构域内的所述进一步突变的等价突变体TSHR或其片段相比，在所述跨膜结构域(TMD)内的所述一或多个突变提供了增加的热稳定性。
58.权利要求54-57任一项的突变体TSHR或其片段，其中通过在33℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是仅包含不在所述跨膜结构域内的所述进一步突变的等价TSHR或片段的半衰期的1.2倍或更高，或者1.3倍或更高。
59.权利要求54-57任一项的突变体TSHR或其片段，其中通过在33℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是包含六重突变H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(TSHR-JMG55)(SEQ ID No:14、16、18、19、23和27(DNA)，SEQ ID No:32、34、36、37、41和45(蛋白质))的TSHR突变体的半衰期的1.2倍或更高或者1.3倍或更高。
60.权利要求58或59的突变体TSHR或其片段，其中通过在33℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是2倍高或更高。
61.权利要求58或59的突变体TSHR或其片段，其中通过在33℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是3倍高或更高，或者5倍高或更高。
62.权利要求58-61任一项的突变体TSHR或其片段，其中热稳定性通过在图14d中示出的稳定性测定C测量。
63.权利要求58-61任一项的突变体TSHR或其片段，其中热稳定性通过分别在图14b和14c中示出的稳定性测定A或者稳定性测定B测量。
64.权利要求54-57任一项的突变体TSHR或其片段，所述突变体在跨膜结构域(TMD)中含有两个点突变，其中通过图14d示出的稳定性测定C测量的在33℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是在所述跨膜结构域(TMD)中仅包含选自T477I(SEQ ID No:77和97)、V595I(SEQ ID No:80和100)或者I648L(SEQ ID No:83和103)的单一点突变的等价TSHR或片段的半衰期的1.1倍或更高。
65.权利要求54-57任一项的突变体TSHR或其片段，所述突变体在跨膜结构域(TMD)中含有两个点突变，其中通过分别在图14b和14c所示的稳定性测定A或稳定性测定B测量的在55℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是在跨膜结构域(TMD)中仅包含选自T477I(SEQ ID No:77和97)、V595I(SEQ ID No:80和100)或者I648L(SEQ ID No:83和103)的单一点突变的等价TSHR或片段的半衰期的1.5倍或更高。
66.权利要求64或65的突变体TSHR或其片段，其中所述TMD中所述两个点突变的至少一个选自T477I(SEQ ID No:77和97)、V595I(SEQ ID No:80和100)或者I648L(SEQ ID No:83和103)。
67.权利要求54-57任一项的突变体TSHR或其片段，所述突变体在跨膜结构域(TMD)中含有三个点突变，其中通过如图14d所示稳定性测定C测量的在40℃的半衰期而确定的所述突变体的热稳定性是在所述跨膜结构域(TMD)中包含双重点突变的等价TSHR或片段的半衰期的1.2倍或更高，或者2倍或更高，或者3倍或更高，所述双重点突变的第一个突变是V595I(SEQ ID No:80和100)且第二个突变选自Y678L(SEQ ID No:87和107)或者K565L(SEQ IDNo:79和99)。
68.权利要求54-57任一项的突变体TSHR或其片段，所述突变体在跨膜结构域(TMD)中含有三个点突变，其中通过分别在图14b和14c所示的稳定性测定A或稳定性测定B测量的在55℃的半衰期确定的所述突变体的热稳定性是在所述跨膜结构域(TMD)中包含双重点突变的等价TSHR或片段的半衰期的1.2倍或更高，所述双重点突变的第一个突变是V595I(SEQID No:80和100)且第二个突变选自Y678L(SEQ ID No:87和107)或者K565L(SEQ ID No:79和99))。
69.权利要求52-57任一项的突变体TSHR或其片段，其中在跨膜结构域(TMD)中的所述突变含有选自如下任一个的单一点突变：E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、T477I、Q489H、K565L、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671A、Y678L、Y678A(SEQ ID No:69-88(DNA)、SEQ ID No:89-108(蛋白质))。
70.权利要求52-57任一项的突变体TSHR或其片段，其中在跨膜结构域(TMD)中的所述突变含有两个点突变，其中一个突变是T477I(SEQ ID No:77和97)或V595I(SEQ ID No:80和100)或I648L(SEQ ID No:83和103)，且另一个突变是根据权利要求69的不同的突变。
71.权利要求52-57任一项的突变体TSHR或其片段，其中在跨膜结构域(TMD)中的所述突变含有三个点突变，一个是V595L(SEQ ID No:80和100)，第二个是Y678L(SEQ ID No:87和107)或K565L(SEQ ID No:79和99))以及第三个是根据权利要求69的不同的突变。
72.纯化包含一或多个突变的突变体TSHR或其片段的方法，其中所述突变体TSHR与等价野生型TSHR或片段相比具有增加的热稳定性，所述方法包括：
i)通过柱层析纯化包含所述突变体或其片段的组合物；
ii)收集纯化的突变体或其片段。
73.权利要求72的方法，其中所述组合物包含培养上清。
74.权利要求72或73的方法，其中所述突变体TSHR或其片段如权利要求2-71任一项所限定。
75.权利要求74的方法，其中所述突变体由或者基本由TSHR受体的亚结构域TSHR260组成，并包含如下突变组之一：
1)I253R(图5和6；SEQ ID No:27和45)
2)D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:18、27、36和45)
3)R112P+D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、27、34、36和45)
4)R112P+D143P+D151E+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、19、27、34、36、37和45)
5)R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、19、23、27、34、36、37、41和45)
6)H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41和45)
7)H63C+R112P+D143P+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、23、27、32、34、36、41和45)
8)H63C+R112P+D143P+S166T+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、20、27、32、34、36、38和45)。
76.权利要求72-75任一项的方法，其中所述柱层析包括阳离子交换或者阴离子交换层析。
77.权利要求72-76任一项的方法，进一步包括在步骤i)之前或之后通过亲和性层析纯化包含所述突变体或其片段的组合物。
78.权利要求77的方法，其中所述亲和性层析包括抗体亲和性层析和/或金属离子亲和性层析。
79.权利要求72-78任一项的方法，所述方法包括：
i)通过阳离子交换或者阴离子交换柱层析纯化包含所述突变体或其片段的组合物；
ii)通过抗体亲和性层析进一步纯化所述突变体或其片段；
iii)任选通过金属离子亲和性层析进一步纯化所述突变体或其片段；
iv)收集纯化的突变体或其片段。
80.权利要求79的方法，其中步骤(ii)中的抗体是单克隆抗体，其结合TSHR胞外结构域中的构象表位。
81.权利要求79或80的方法，其中步骤(iii)包括镍亲和性层析。
82.权利要求77-81任一项的方法，其中所述亲和性层析是抗体亲和性层析，包括用洗脱缓冲液在pH 4.5+/-0.2洗脱，任选之前用洗脱缓冲液在pH 5.0+/-0.2洗脱。
83.权利要求72-82任一项的方法，其中所述突变体由或者基本由TSHR受体的亚结构域TSHR260组成，及包含如下突变组：
H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41和45)
84.通过权利要求72-83任一项的方法获得的纯化的权利要求2-71任一项定义的突变体TSHR或其片段。
85.通过权利要求72-83任一项的方法可获得的纯化的权利要求2-71任一项定义的突变体TSHR或其片段。
86.权利要求84或85的纯化的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体由或者基本由TSHR的亚结构域TSHR260组成，并包含如下突变组之一：
1)I253R(图5和6；SEQ ID No:27和45)
2)D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:18、27、36和45)
3)R112P+D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、27、34、36和45)
4)R112P+D143P+D151E+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、19、27、34、36、37和45)
5)R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:16,18、19、23、27、34、36、37、41和45)
6)H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41和45)
7)H63C+R112P+D143P+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、23、27、32、34、36、41和45)
8)H63C+R112P+D143P+S166T+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、20、27、32、34、36、38和45)。
87.权利要求84、85或86的纯化的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体包含权利要求42-46任一项的可检测标记。
88.权利要求1-71任一项或者权利要求84-87任一项的纯化的突变体TSHR或其片段，特征在于在TSHR活性测定中所述纯化的突变体的活性高于在相同TSHR活性测定中测量的来自培养上清的未纯化的突变体的活性。
89.权利要求1-71任一项或者权利要求84-87任一项的纯化的突变体TSHR或其片段，特征在于在TSHR活性测定中所述纯化的突变体的活性是在相同TSHR活性测定中测量的来自培养上清的未纯化的突变体的活性的500倍或更高。
90.权利要求89的纯化的突变体TSHR或其片段，其中所述活性是1000倍或更高。
91.权利要求89或90的纯化的突变体TSHR或其片段，其中所述活性是5000倍或更高。
92.权利要求88-91任一项的纯化的突变体TSHR或其片段，其中所述活性是以活性/mg蛋白质表示的比活性。
93.权利要求88-92任一项的纯化的突变体TSHR或其片段，其中所述TSHR活性测定测量所述突变体结合TSHR自身抗体的能力。
94.权利要求93的纯化的突变体TSHR或其片段，其中所述TSHR自身抗体是M22、K1-70或K1-18。
95.权利要求88-94任一项的纯化的突变体TSHR或其片段，其中所述TSHR活性测定包括待检测的突变体与ELISA平板的直接或间接结合。
96.权利要求88-95任一项的纯化的突变体TSHR或其片段，其中所述TSHR活性测定包括图12a或图13c所示测定。
97.权利要求88-96任一项的纯化的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体由或者基本由TSHR的亚结构域TSHR260组成，并包含权利要求86所示突变组之一。
98.权利要求88-97任一项的纯化的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体包含如下突变组：H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41和45)。
99.权利要求1-71或者权利要求84-98任一项的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体或其片段是去糖基化的。
100.权利要求99的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体包含至少双重点突变。
101.权利要求99或100的突变体TSHR或其片段，其中所述突变体由或者基本由TSHR的亚结构域TSHR260组成，并包含如下突变组之一：
1)I253R(图5和6；SEQ ID No:27和45)
2)D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:18、27、36和45)
3)R112P+D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、27、34、36和45)
4)R112P+D143P+D151E+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、19、27、34、36、37和45)
5)R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、19、23、27、34、36、37、41和45)
6)H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41和45)
7)H63C+R112P+D143P+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、23、27、32、34、36、41和45)
8)H63C+R112P+D143P+S166T+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、20、27、32、34、36、38和45)。
102.检测TSHR的分析物自身抗体的诊断方法，所述方法包括将分析物自身抗体样品与权利要求1-71或者84-101任一项的突变体TSHR或其片段接触。
103.权利要求102的诊断方法，其中所述分析物自身抗体样品已经分离自确信含有这种分析物自身抗体的对象。
104.权利要求102或103的诊断方法，其中所述样品包含人或动物患者血清。
105.权利要求102、103或104的诊断方法，所述方法包括：
a)提供对象的体液样品；
b)提供一或多个第一来源的TSHR或其片段；
c)提供一或多个第二来源的TSHR，其中所述第二来源是权利要求1-71或者84-101任一项的突变体TSHR或其片段；
d)将所述第一和第二来源的TSHR同时或者相继与所述体液样品接触，从而所述抗体与TSHR形成包含[第一来源的TSHR]-[TSHR抗体]-[第二来源的TSHR]的一或多种复合物；
e)在步骤(d)之前、与步骤(d)同时或者在步骤(d)之后提供固定工具，从而在步骤(d)形成的复合物中存在的所述第一来源的TSHR在步骤(d)之前、与步骤(d)同时或者在步骤(d)之后固定在固体支持物上；
f)在步骤(d)之前、与步骤(d)同时或者在步骤(d)之后提供直接或间接的可检测标记工具，从而在步骤(d)形成的复合物中存在的所述第二来源的TSHR在步骤(d)之前、与步骤(d)同时或者在步骤(d)之后提供给这种直接或间接的标记工具；及
g)根据(e)检测在(d)中形成的复合物的存在，以提供在所述体液样品中存在TSHR抗体的指示。
106.权利要求105的诊断方法，其中在(b)中提供的所述第一来源的TSHR是全长TSHR，包括TSH受体的一或多个表位或者包含TSH受体的一或多个表位的多肽。
107.权利要求105的诊断方法，其中在(b)中提供的所述第一来源的TSHR是权利要求1-71或者84-101任一项的突变体TSHR或其片段。
108.权利要求102-106任一项的诊断方法，其中所述第一来源的TSHR或者第二来源的TSHR或者这二者的突变体TSHR或其片段由或者基本由TSHR受体的亚结构域TSHR260组成。
109.权利要求105-108任一项的诊断方法，其中所述标记工具包括权利要求42-46任一项的可检测标记。
110.权利要求109的诊断方法，其中所述突变体用所述标记工具直接标记。
111.权利要求109或110的诊断方法，其中所述标记工具包括碱性磷酸酶(AP)标记。
112.权利要求105-111任一项的诊断方法，其中将所述第一来源的TSHR固定于固体支持物上的所述固定工具包括单克隆抗体、重组抗体、合成抗体或其片段。
113.检测TSHR的分析物自身抗体的试剂盒，该试剂盒包含：
a)一或多个第一来源的TSHR或其片段；
b)一或多个第二来源的TSHR，其中所述第二来源是权利要求1-71或者84-101任一项的突变体TSHR或其片段；
c)将所述第一和第二来源的TSHR同时或相继与确信含有TSHR的分析物自身抗体的样品接触的工具，从而所述抗体与TSHR形成包含[第一来源的TSHR]-[TSHR抗体]-[第二来源的TSHR]的一或多种复合物；
d)将在(c)形成的复合物中存在的所述第一来源的TSHR在(c)之前或与(c)同时或在(c)之后固定于固体支持物的固定工具；
e)在所述复合物形成之前、同时或之后直接或间接标记标记的在(c)形成的复合物中存在的所述第二来源的TSHR的可检测标记工具；及
f)检测在(c)中形成的复合物的存在的工具，以提供在所述样品中存在TSHR抗体的指示。
114.权利要求113的试剂盒，其包含在权利要求106-112任一项或多项中描述的任一或多个特征。
115.权利要求113或114的试剂盒，其中在(a)中提供的所述第一来源的TSHR是权利要求1-71或者84-101任一项的突变体TSHR或其片段。
116.权利要求1-71或者84-101任一项的突变体TSHR或其片段直接或间接结合的固体支持物。
117.权利要求116的固体支持物，其中所述突变体由或者基本由TSHR受体的亚结构域TSHR260组成。
118.权利要求116或117的固体支持物，其中所述突变体包含如下突变组之一：
1)I253R(图5和6；SEQ ID No:27和45)
2)D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:18、27、36和45)
3)R112P+D143P+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、27、34、36和45)
4)R112P+D143P+D151E+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、19、27、34、36、37和45)
5)R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:16、18、19、23、27、34、36、37、41和45)
6)H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41和45)
7)H63C+R112P+D143P+V169R+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、23、27、32、34、36、41和45)
8)H63C+R112P+D143P+S166T+I253R(图5和6；SEQ ID No:14、16、18、20、27、32、34、36、38和45)。
119.权利要求116-118任一项的固体支持物，其中所述突变体直接结合所述支持物。
120.权利要求116-119任一项的固体支持物，其中所述支持物是包含一或多个孔的ELISA平板。
121.包含权利要求116-120任一项的固体支持物的试剂盒。
122.权利要求116-120任一项的固体支持物或者权利要求121的试剂盒在检测TSHR的单克隆自身抗体或其片段、TSHR的重组抗体或者患者TRAb中的应用。
123.权利要求1-71或者84-101任一项的突变体TSHR或其片段，用于医学中。
124.权利要求1-71或者84-101任一项的突变体TSHR或其片段，用于检测TSHR单克隆抗体或患者TRAb。
125.权利要求1-71或者84-101任一项的突变体TSHR或其片段，用于以治疗有效量吸收循环中的患者TRAb。
126.权利要求1-71或者84-101任一项的突变体TSHR或其片段在筛选小分子片段以鉴别新的小分子药物支架中的应用。
127.治疗在对象中与TSHR受体免疫反应相关的自身免疫疾病的一种体外方法，该方法包括将对象的血液样品经过具有与其结合的权利要求1-71或者84-101任一项的突变体TSHR或其片段的固相柱，及将所述血液中循环的TRAb吸收至所述突变体TSHR或其片段。
128.包含一或多个如下点突变的突变体促卵泡激素受体(FSHR)或其片段：T56V、L58Y、N106P、P136I、D137P、Q145E、I160F、N163W、S172C、R247Y、E357K、D358K、Q391N、L400Y、N403A、I411V、Y414F,L415P、T425I、Q437H、K513L、V543I、C548R、Y549F、S596L、K608D、H615V、S619A、Y626L和Y626A。
129.包含一或多个如下点突变的突变体促黄体生成激素受体(LHR)或其片段：P33E、L56F、V61Y、K109P、P139I、D140P、I164F、P165Y、N167W、S176C、I249R、E354K、D355K、R388N、L397Y、N400A、M408V、Y411F、L412P、T422I、Q434H、K510L、V540I、C545R、Y546F、A593L、K605D、Y612V、S616A、Y623L或Y623A。
130.权利要求128的突变体促卵泡激素受体(FSHR)或其片段或者权利要求129的突变体促黄体生成激素受体(LHR)或其片段，其分别是人FSHR或者LHR。
131.一种多核苷酸，其包含：
a.图5(SEQ ID No:11-28)或图29(SEQ ID No:69-88)所示核苷酸序列，其编码图6(SEQID No:29-46)或图30(SEQ ID No:89-108)所示的突变体TSHR或其片段的氨基酸序列；
b.由于密码子简并导致在密码子序列中与(a)所示任何序列不同的核苷酸序列；
c.包含(a)所示任何序列的等位基因变异的核苷酸序列；
d.包含(a-c)所示任何序列的片段的核苷酸序列；
e.由于核苷酸碱基的突变、缺失或取代所致与(a)所示序列不同的核苷酸序列，其编码突变体TSHR或其片段的氨基酸序列。
132.生物功能载体系统，其携带权利要求131的多核苷酸及能将所述多核苷酸导入宿主生物体的基因组。
133.宿主细胞，其用权利要求131的多核苷酸转化。
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