JP7223490B2 - 糖タンパク質ホルモン受容体変異 - Google Patents
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Description
本発明は、概して、糖タンパク質ホルモン受容体に関し、排他的ではないが特に甲状腺刺激ホルモン(TSH)受容体(TSHR)に関する。本発明は、かかる受容体の、特にTSHRの調製品の熱安定性を向上する、変異、特に単一点変異に関する。更に、本発明は、かかる調製品の安定性をなお更に向上するために、一緒に組み合わせられた単一点変異に関する。本発明はまた、自己免疫、特にTSHR自己免疫に関連した疾患を診断、経過観察及び予測するために、TSHR自己抗体(TRAb)などの自己抗体の存在を検出するための、TSHR調製品を含む、熱安定性の糖タンパク質ホルモン受容体の調製品を使用する方法にも関する。
(TSH受容体)
TSHRは、G-タンパク質共役受容体(GPCR)ファミリーの一員であり、且つ以下の3つのドメインからなる:細胞外ロイシン-リッチ反復ドメイン(LRD)、ヒンジ領域、及び細胞内C-末端を伴う膜貫通ドメイン(TMD)(Nunez Miguel Rらの文献、(2004) Thyroid, 14: 991-1011)。TSHR260は、残基22-260からなり、且つLRDのほとんどを包含している、TSHRのサブドメインである(Sanders Jらの文献、(2007) Thyroid 17:395-410)。TSHR260は、完全長TSHRと同様にTRAbへの結合を示す(Rees Smith Bらの文献、(2009) Hormone and Metabolic Research, 41: 448-455、及びWO 2010/073012)。
自己免疫甲状腺疾患は、有病率が100,000名あたり600~1000名の最も一般的な自己免疫状態の一つである(Jacobson DLらの文献、(1997) Clinical Immunology and Immunopathology, 84: 223-243、及びCooper GSらの文献、(2009) Journal of Autoimmunity, 33: 197-207)。自己免疫システムにより標的化される主要な甲状腺自己抗原は、甲状腺ペルオキシダーゼ(TPO)、サイログロブリン(Tg)及びTSHRである。TPO自己抗体(TPOAb)及びサイログロブリン自己抗体(TgAb)は、橋本甲状腺炎、グレーヴス病及び分娩後甲状腺炎(PPT)を含む、様々な形のAITDの甲状腺自己免疫の血清学的マーカーである(Rees Smith Bらの文献、(2007) Thyroid, 17: 923-938)。TRAbは、TSHR自己免疫の、特にグレーヴス病のマーカーである。更にTRAbは、グレーヴス病の病理に関わっている。TRAbの2つの主要な型が存在する:刺激型及び遮断型(Rees Smith Bらの文献、(2007) 前掲、及びRees Smith Bらの文献、(2009) 前掲)。
刺激活性又は遮断活性を持つ患者TRAbは、互いに及びTSH結合部位と重なるTSHR LRD上の領域に結合することは、当該技術分野において良く実証されている。しかし、様々な血清中に存在する自己抗体と接触するTSHR残基には、微妙な差異が存在する(Rees Smith Bらの文献、(2007) 前掲)。ヒトモノクローナル自己抗体M22及びK1-70は、AITD患者におけるTRAbの代表であることも、実証されている(Sanders Jらの文献、(2007) 前掲、Rees Smith Bらの文献、(2009) 前掲、Evans Mらの文献、(2010) Clinical Endocrinology, 73: 404-412、Nunez Miguelらの文献、(2012) 前掲)。TSH及びTRAbとのTSHR相互作用の原理は、患者TSHR自己抗体を検出するために、様々なアッセイにおいて利用されている。
a) TSH受容体の調製品へのTSH又はヒトモノクローナルTRAbの結合を阻害する患者血清TRAbの能力を測定する、競合結合アッセイ;
b) 培養物中のTSH受容体を発現している細胞を刺激するTRAbの能力を測定する、バイオアッセイ;
c) TRAbと標識されたTSH受容体調製品との免疫沈降;並びに
d) 二価TRAbが、1本のアームでELISAプレートウェル上にコートされたTSHRに結合し、且つ他方のアームで液相TSHR260-アルカリホスファターゼ融合タンパク質(TSHR260-AP)へ結合し、架橋を形成する、架橋型アッセイ。
Sanders Jらの文献、(1997) 前掲、
Sanders Jらの文献、(1999) Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 84: 3797-3802、
Rees Smith Bらの文献、(2004) Thyroid, 14: 830-835、
Rees Smith Bらの文献、 (2009) 前掲。
本発明者らは、TSHR及びTSHR260などのタンパク質は、安定性が悪く、且つ精製時に変性されることを理解している。従って、より熱安定したタンパク質、例えば、より熱安定したTSHR260及び完全長TSHRは、以下を含む多くの適用を有するであろう:
a) 高度に精製されたTSHR260及び完全長TSHRの使用可能な(enabling)生成、
b) TRAbを検出するために改善されたアッセイの設計、
c) 抗体の安定化を伴わずに、高度に精製されたTSHR260の使用可能な結晶化、
d) 新規へ薬物スカフォールドを同定するための、リガンド-フリーTSHR260の結晶を、断片ライブラリーへ入れ(soak into)、引き続きX-線結晶解析することによる、薬物の設計、
e) TSHR260の外側の完全長TSHRの領域の増大した熱安定性を得るための戦略の設計。
・β-シートにおいて、アミノ酸残基の位置及び環境は、二次構造の決定に重要な極性及び非極性残基の周期性を伴うβ-シートの形成及び安定性において、重要な役割を果たす(Xiong Hらの文献、(1995) Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 92: 6349-6353)。β-鎖の好ましい残基周期性は、「0+0-0+0」であり、ここで「0」は、Ile又はThrなどの非極性残基であり、「+」は陽性残基、好ましくはArgであり、並びに「-」は陰性残基、好ましくはAspである。
・ロイシンリッチドメイン(LRD)は、ロイシンリッチ反復(LRR)モチーフの一般的なコンセンサス配列LxxLxLxxNxLxxLpxxoFxxLxxを有し、ここで「L」はLeu、Ile、Val又はPheであり、「N」はAsn、Thr、Ser又はCysであり、「o」は非極性であり、並びに「x」は非保存残基である(Matsushima Nらの文献、(2010) BMC Microbiology, 10: 235-245)。残基は、このモチーフに合わせるために、変異することができる。
・タンパク質を安定化又は脱安定化する傾向があるアミノ酸を、コンピュータによるか、中等温度好性生物及び好熱性生物における相同タンパク質の配列の比較若しくはそれらのプロテオームのアミノ酸組成の比較によるか、又は実験的に、変異体の熱力学特性の測定によるかのいずれかにより確定する。異なる残基は、それらがタンパク質の表面又はコア上のいずれにあるかによって(Yokota Kらの文献、(2006) Science and Technology of Advanced Materials, 7: 255-262)、又は二次構造要素におけるそれらの位置によって(Xiong H, らの文献、(1995) 前掲;Vogt Gらの文献、(1997) Journal of Molecular Biology, 269: 631-643;Minor DL及びKim PSの文献、(1994) Nature 367: 660-663、並びにMinor DL及びKim PSの文献、(1994) Nature, 371: 264)、異なる安定化作用を有する。安定化残基は、表面上のGlu、Lys、Arg及びTyr残基、並びにコア内のAlaを含み;他方で、Gln、Met、Cys及びSer及びAsnは、脱安定化する傾向がある(Cambillau C及びClaverie J-Mの文献、(2000) Journal of Biological Chemistry, 275: 32383-32386;Kim CA及びBerg JMの文献、(1993) Nature, 362:267-270;Kumar Sらの文献、(2000) Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, 17 Suppl 1: 79-85;Minor D及びKim PSの文献、1994a+b 前掲;Montanucci Lらの文献、(2008) Bioinformatics, 24: i190-i195;Pack SP及びYoo YJの文献、(2004) Journal of Biotechnology, 111: 269-277;Smith CKらの文献、(1994) Biochemistry 33: 5510-5517;Szilagy A及びZavodsky Pの文献(2000) Structure, 8: 493-504;Vogt Gらの文献、(1997) 前掲;Yokota Kらの文献、(2006) 前掲)。
・好熱性生物は、中等温度好性生物よりも、より多い帯電された残基、及びより少ない極性非帯電残基を有する傾向がある(Cambillau C及びClaverie J-Mの文献、(2000) 前掲)。イオン対の数及び配置は、タンパク質の熱安定性の向上において大きな役割を果たす(Vetriani CDLらの文献、(1998) Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 95: 12300-12305;Kumar Sらの文献、(2000) 前掲;Montanucciらの文献、(2008) 前掲;Szilagy A及びZavodsky Pの文献、(2000) 前掲)。これは恐らく、好熱性タンパク質における高頻度のGlu及びLysを説明している。
・異なる生物のタンパク質相同体のコンセンサス配列への残基の変異は、可能性のある熱安定化変異を確定するために、使用することができる。これを使用し、5℃~36℃の見かけの融解温度(Tm)の上昇を伴う、免疫グロブリンドメイン、GroELミニシャペロン、p53及びフィターゼを含む、広範なタンパク質のより熱安定性変異体を作出することができる(Lehmann M及びWyss Mの文献、(2001) Current Opinion in Biotechnology, 12: 371-375において検証)。
・好適な骨格ねじれ角を持つ残基は、タンパク質の剛性、従って安定性を向上するためにProへ、又は左巻きらせん形構造の残基の拘束されたねじれ角を減少するためにGlyへのいずれかに変異することができる(Vielle C及びZiekus GJの文献、(2001) Microbiology and Molecular Biology Reviews, 65:1-43)。
・コンピュータモデリングを、タンパク質の熱安定性に対する変異の作用を予測するために使用することができるが、得られた結果は定まらない。
EP 1565493B1に記載された発明は、強力な刺激活性及びTSHRとのその相互作用を伴うヒトモノクローナル自己抗体(M22又はhMAb TSHR1)の特性に関する詳細を提供する。M22 FabとTSHR LRDの間の相互作用は、WO 2008/025991A1に記載されたように、これら2つの分子間の複合体のX線回折分析(分解能2.55Å)から分子レベルで解析される。
本発明は、排他的ではなく全般的にTSHRに関し、且つ排他的ではないが特に残基22-260の間のTSHR配列(TSHR260)に関する(図3及び4;配列番号:3及び4)。本発明の更なる態様は、残基毎に理論的アプローチの組合せにより決定された別のアミノ酸に変異される、特に新規の理論的-系統的変異誘発アプローチを使用し、アミノ酸変異を設計するための、特にTSHR260におけるアミノ酸変異に関する。更に本発明は、数多くの変異体を作製し且つ試験するためのハイスループット法に関する。本発明の一態様は、排他的ではないが特に、野生型TSHR260(TSHR260-WT)に対するより大きい熱安定性により特徴付けられた単一アミノ酸変異を含むTSHR260を作製することに関する。
本発明の一態様に従い、1つ以上の変異を含む、変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片が提供され、ここで該変異体TSHRは、同等の野生型TSHR又は断片に対して増大した熱安定性を有する。この変異は、好ましくは点変異である。以下において、使用される用語「変異体」は、完全長TSHR及び任意のその断片、例えば断片TSHR260(図3及び4;配列番号:3及び4)の両方を指す。熱安定性が更に以下において、考察され、且つ定義される。
i)変異体又はその断片を含む組成物を、カラムクロマトグラフィーにより精製する工程;
ii)精製された変異体又はその断片を収集する工程:を含む方法を、提供する。
1) I253R (図5及び6;配列番号:27及び45)
2) D143P+I253R (図5及び6;配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P+D143P+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P+D143P+D151E+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C+R112P+D143P+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C+R112P+D143P+S166T+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45)。
i)該変異体又はその断片を含む組成物を、陽イオン交換又は陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製する工程;
ii)該変異体又はその断片を、抗体アフィニティクロマトグラフィーにより更に精製する工程;
iii)任意に、該変異体又はその断片を、金属イオンアフィニティクロマトグラフィーにより更に精製する工程;
iv)精製された変異体又はその断片を収集する工程:を含む。
H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R。
1) I253R (図5及び6;配列番号:27及び45)
2) D143P+I253R (図5及び6;配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P+D143P+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P+D143P+D151E+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C+R112P+D143P+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C+R112P+D143P+S166T+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45)。
1) I253R (図5及び6;配列番号:27及び45)
2) D143P+I253R (図5及び6;配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P+D143P+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P+D143P+D151E+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C+R112P+D143P+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C+R112P+D143P+S166T+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45):
しかし前述のように、脱グリコシル化は、原則として本明細書に記載及び請求された変異体のいずれか一つに適用され得る。
a) 対象由来の試料、例えば体液試料を提供する工程;
b) TSHR又はその断片の第一の給源の1種以上を提供する工程;
c) TSHRの第二の給源の1種以上を提供する工程であって、ここで第二の給源は、本発明の変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片である工程;
d) 該TSHRの第一及び第二の給源を、同時に又は連続して該試料、例えば体液試料と接触させ、これにより該TSHRに対する抗体が、[第一の給源のTSHR]-[TSHR抗体]-[第二の給源のTSHR]を含む1種以上の複合体を形成する工程;
e) 工程(d)の前に又は同時に又は引き続き、固定手段を提供し、これにより工程(d)で形成された複合体中に存在する該TSHRの第一の給源が、工程(d)の前に、又は同時に、又は引き続き固形支持体に固定される工程;
f) 工程(d)の前に又は同時に又は引き続き、直接又は間接に検出可能な標識手段を提供し、これにより工程(d)で形成された複合体中に存在する該TSHRの第二の給源に、工程(d)の前に、又は同時に、又は引き続きかかる直接又は間接標識手段を提供する工程;並びに
g) 該体液試料中のTSHR抗体の存在の指標を提供するために、工程(e)に従い工程(d)において形成された複合体の存在を検出する工程:を含む。
a) TSHR又はその断片の1種以上の第一の給源;
b) TSHRの1種以上の第二の給源であって、ここで該第二の給源が、本明細書記載の本発明の変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片であるもの;
c)該TSHRの第一及び第二の給源を、TSHRに対する被検自己抗体を含むと考えられる試料と、同時に又は連続して接触させる手段であり、これにより該TSHRに対する抗体が、[第一の給源のTSHR]-[TSHR抗体]-[第二の給源のTSHR]を含む1種以上の複合体を形成する手段;
d)工程(c)において形成された複合体中に存在する該TSHRの第一の給源を、工程(c)の前に、又は同時に、又は引き続き固形支持体へ固定するための固定手段;
e) 該複合体の形成の前に、又は同時に、又は引き続き標識された工程(c)において形成された複合体中に存在する該TSHRの第二の給源を、直接又は間接に標識するための検出可能な標識手段;並びに
f) 該試料中のTSHR抗体の存在の指標を提供するために、工程(c)において形成された複合体の存在を検出する手段:を含む。
1) I253R (図5及び6;配列番号:27及び45)
2) D143P+I253R (図5及び6;配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P+D143P+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P+D143P+D151E+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C+R112P+D143P+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C+R112P+D143P+S166T+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45)。
本発明のTSHR分子及び方法は、ここで、単なる例証として、添付図面、図1~30を参照し、説明する:
(TSHR260変異のコンピュータモデリング)
コンピュータモデリングは、Discovery studios v3.5 (Accelrys Software社、Accelrys Ltd, Cambridge, CB4 0WN, UK)により、Calculate Mutation Energy Stabilityプロトコールを使用し、行った。TSHR260-M22 Fab複合体の結晶構造(PDBコード:3G04;RCSBタンパク質データバンクからwww.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3go4で入手可能)を、全ての変異に関する初期モデルとして使用し、M22のTSHR260への結合を妨害しない変異が選択されたことを確実にした。TSHR260構造の各残基を、その他の19の可能なアミノ酸の各々に変異し、この変異エネルギーデータを収集し比較した。
1. Pro又はGlyアミノ酸に関して好ましい立体構造を予測する残基のねじれ角、
2. 他の生物及び他の糖タンパク質からのTSHRコンセンサス配列、
3. LRR及び/又はβ-シートにおける残基の位置、
4. タンパク質の表面又はコア中の残基の位置。
プライマーを、点変異をTSHR260へ導入するために、PrimerXウェブサイト(www.bioinformatics.org/primerx/index.htm)を使用し、設計した。このタンパク質-ベースのプライマーデザインの選択肢を、QuikChange SDMプロトコールを使用し、且つそれらのオーバーハングが2~10残基であるプライマー対を選択して、使用した。プライマーは、融解温度73℃~84℃(理想的には76℃より高い)を有し、長さ27~49塩基対であり、且つGC含量33%~70%(理想的には40%より大きい)を有した。プライマーは、Sigma Genosys社(Haverhill, CB9 8QP, UK)から、10μM水溶液中で、96-ウェルフォーマット中に注文した。
TSHR260-6His鋳型構築体(ヒトTSHRのコーディングアミノ酸1-260;野生型TSHR 260のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の各々については、図3(配列番号:3)及び4(配列番号:4)を参照)を、鋳型として完全長ヒトTSHR(Oda Yらの文献、(1998) Journal of Molecular Endocrinology, 20: 233-244)を使用し、6個のHisタグをC末端へ追加し、先に増幅した。TSHRの残基1-260は、完全長TSHRから、BamHI制限部位をヒトTSHRアミノ酸1-260のN末端に、及び1個のアミノ酸リンカー(Asn)、6個のHisタグ、停止コドン及びXbaI制限部位をC末端に追加する2種のプライマー
標準クローニング手順に従い、TSHR完全長ヌクレオチド配列(Oda Yらの文献、(1998) 前掲)を、pcDNA5.1/FRTベクター(Invitrogen社)へ、BamHI及びXhoI制限部位を用いてクローニングした。完全長配列内の変異を、変異誘発を96ウェルプレートフォーマットの代わりに0.2mL PCRチューブ内で行う以外は、TSHR260変異に関して先に記載したQuikChange II方式によるPCRを使用する部位特異的変異誘発により、作製した。PCR反応物を、形質転換し、増大し、これらの変異を、TSHR260 PCR産物に関して前述のように配列決定することにより検証した。完全長野生型TSHRのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列について、各々、図1(配列番号:1)及び図2(配列番号:2)参照。
トランスフェクションの1日前に、1.5×105個CHO-K1細胞/ウェルを、24-ウェル細胞培養プレート(Nunc社)へプレーティングした。トランスフェクトされるべき各ウェルに関して、pcDNA3.1+(0.2μg/μL)中の5μL TSHR260-6His変異体を、20μL Optipro SFM(Life Technologies社, Paisley, PA4 9RF, UK)と混合した。Optipro SFM 22.5μL中に希釈したFreestyle Max試薬(Life Technologies社)2.5μLを、各DNA/Optipro SFM混合物へ添加し、室温で10~20分間インキュベーションした。DNA/Freestyle Max混合物40μLを、24-ウェルプレート中のCHO-K1細胞に添加し、37℃で40~48時間インキュベーションした。その後培地へと分泌された発現されたTSHRタンパク質を、13000rpmで2分間の遠心分離により収集し、細胞デブリを除去し、上清を-70℃で保存した。
Flp-In-CHO細胞(Invitrogen社, Paisley, PA4 9RF, UK;O'Gorman, S.、Fox, D. T.及びWahl, G. M.の文献、(1991) Science, 251: 1351-1355)のコンフルエンスフラスコを使用し、抗生物質を含まない、DMEM(Invitrogen社)、10%ウシ胎仔血清(FCS)(Invitrogen社)、1×L-グルタミン(Invitrogen社)及び1×非必須アミノ酸(NEAA)(Invitrogen社)の入った24ウェルプレートのウェルに1×105~1.5×105個細胞/ウェルで播種した。細胞を、37℃、5%CO2及び湿度>95%で一晩インキュベーションした。
(14C4)
TSHR260-結合アッセイにおいて使用される14C4 TSHRマウスモノクローナル抗体は、cDNA免疫化により調製した。簡単には、6~8週齢のNMRI(非近交系)マウスに、10μMカルディオトキシン100μLを、筋肉内注射し、その5日後完全長TSHR cDNA (pRC/CMVhTSHR;Odaらの文献、(1998) 前掲)100μgにより、筋肉内免疫化した。TSHR DNA免疫化は、3週間間隔で、合計5回注射を繰り返した(Hasanらの文献、(1999) J. Immunol. Methods, 229:1-22)。TSHRに結合する125I-標識したTSHの阻害により、マウス出血液(bleeds)を、TSHR抗体の存在下について試験した(RSR社, Cardiff, UKにより製造されたアッセイ)。モノクローナル抗体を、血清中最高TSHR抗体力価を持つマウス由来の脾臓細胞を用いて作製した。単離した脾臓細胞を、マウス骨髄腫細胞系(X63_Ag8.653;ECACC, Porton Down, UK)と比1:2で混合し、先に説明された方法(de St Groth, S. F.及びScheidegger, D.の文献、(1980) Journal of immunological methods, 35, 1-21)に従い、10%DMSO及び50%PEG(Sigma Aldrich社, Poole, UK)を用いて融合した。細胞を、DMEM(ハイブリッドを選択するためにHATを含有する20%ウシ胎仔血清を補充した)中で培養し、48-ウェルプレートにプレーティングした。14C4を得るために、細胞培養物由来の上清を、125I-TSH標識されたTSHR複合体の免疫沈降により、TSHR抗体に関してスクリーニングした。これらのアッセイにおいて、完全長TSHRは、125I-TSHを用いて標識し、125I-TSH-TSHR複合体を形成する。125I-TSH-TSHR複合体は、TSHと同時にTSHRへの結合が可能である抗体により結合される。次にこの複合体を、標準PEG沈降技術を用い、沈殿させることができ、ペレット中の放射能を測定する。陽性ウェル由来の細胞を、限界希釈により2回再クローニングし、必要なモノクローナル抗体を発現しているクローンを得る。14C4 IgGは、TSHRの凸面上の立体配座エピトープに結合し、同時にTSH又は患者TRAbのTSHRの凹面への結合を可能にする。14C4は、RSR社(Cardiff, UK)から入手可能である(www.rsrltd.com)。
(www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3go4)
M22(hMAb TSHR1)は、グレーヴス病患者由来の末梢血リンパ球から得られた、ヒト甲状腺刺激モノクローナル自己抗体である(Sandersらの文献、(2003) Lancet 362: 126-128)。簡単に述べると、リンパ球を、甲状腺機能亢進症で高レベルのTSHR自己抗体(グレーヴス病が原因)を有する19歳男性の末梢血20mLから単離した。これらのリンパ球を、エプスタイン・バー・ウイルスにより感染させ、標準技術(Hayakawa Nらの文献、(2002) Autoimmunity, 35: 343-55)を使用し、マウス/ヒトハイブリッド細胞株(K6H6/B5;ECACC, Porton Down, UK)と融合させた。これらの細胞を、48-ウェルプレートにプレーティングし、上清を、TSHRコートされたチューブに結合する125I-TSHの阻害によりスクリーニングした(アッセイ RSR社, Cardiff, UK)。次に陽性ウェルを、高濃度のTSHR自己抗体M22を産生する単独コロニーが単離されるまで、限界希釈により再クローニングした。M22(hMAb TSHR1)は、甲状腺刺激抗体に関するWHO第2回国際標準NIBSCコード:08/204として、当該技術分野において周知である(Burns Cらの文献、(2010)、甲状腺刺激抗体に関する提唱された第2回国際標準のWHO国際協同研究、生物学的標準化に関する専門家会議、Geneva、2010年10月18~22日、WHO/BS/10.214、下記で入手可能:www.who.int/biologicals/expert_committee/BS_2142_Thyroid_Stimulating_Autoantibody.pdf)。M22(hMAb TSHR1)は、RSR社(Cardiff, UK(前掲))から購入可能である。
本発明の文脈において、熱安定性は、一般に言われるように、変異体TSHR又はその断片(TSHR260変異体など)が、指定された時間、所定の温度に曝された後で、その正常な生物活性を保持する能力である。好適には、温度曝露後に残存する活性変異体タンパク質の割合により決定することができる。活性変異体タンパク質の量の一つの好適な測定は、結合アッセイにおいて、抗体又は自己抗体をTSHRへ結合する能力を保持する変異体タンパク質の割合である。従って所定の温度への曝露後に残存する活性変異体タンパク質の量は、時間の関数として測定することができ、且つその温度での熱安定性曲線-例えば図7に示したもの-が得られる。従って変異体タンパク質の半減期-すなわち、活性タンパク質の量がその最初の値の50%まで低下する(すなわち、50%は失活又は変性される)のに要する時間-が、誘導され得る。変異体タンパク質の半減期は、タンパク質の熱安定性の簡便な定量的測定をもたらし、且つこれは、熱安定性が増大又は減少したかを評価するために、同等の変異されないTSHR又はその断片(すなわち、野生型TSHR又はその断片、例えば野生型TSHR260など)の半減期と比較することができる。
Maxisorp 96-ウェルELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、1.5mM NaN3、0.01g/Lフェノールレッド、pH9.2)中の1μg/mL 14C4 Fab2 (Jeffreys Jらの文献、(2002) Thyroid, 12: 1051-1061、及びSanders Jらの文献、(2007) 前掲)の150μLアリコートによりコートし、室温で3時間、次に4℃で一晩インキュベーションした。ウェルは、洗浄緩衝液(50mM NaCl;20mMトリス pH7.8;1%v/v トリトンX-100)により3回洗浄し、且つ被験試料(一過性トランスフェクションされたCHO-K1細胞から収集されたTSHR260-6His)150μLを、各ウェルに適用し、室温で1時間インキュベーションし、TSHR260を14C4-Fab2へ結合させた。次にウェルを洗浄し、アッセイ緩衝液75μL(50mM NaCl、20mMトリス(pH7.8)、1%v/vトリトンX-100、1g/L BSA、50mg/L正常マウスIgG)及び健常血液ドナー血清プール(NPS)75μLと共に、室温で1時間、ELISAプレート振盪機上で、1分間に500回振盪しながら、インキュベーションした。その後、これらのウェルの内容物を空にし、ウェルを洗浄し、M22 Fab-ペルオキシダーゼコンジュゲート(M22-POD、RSR社, Cardiff, CF23 8HE, UK)の100μLを各ウェルに添加した。振盪せずに室温で25分間インキュベーションした後、プレートウェルを再度洗浄し、引き続きテトラメチルベンジジン100μLを添加し、更に振盪せずに室温で25分間インキュベーションした。50μLの0.5M H2SO4の添加により、反応を停止し、各ウェルの吸光度を、ELISAプレートリーダー上で450nmで測定した(図12a)。
一過性トランスフェクションされたCHO-K1細胞から収集されたTSHR260-6His試料を、CHO-K1培地((-)DMEM、10%FBS、2×グルタチオン、1×ペニシリン/ストレプトマイシン、1×NEAA)中に、1/4希釈した。各試料に関して、100μLアリコートを、42℃で30分間加熱し、その間二番目の同一試料を氷上に維持した。次に試料を、TAT緩衝液(50mM NaCl、10mMトリス(pH7.8)、1%v/vトリトンX-100、1g/L BSA、0.2g/Lアジ化ナトリウム)中に1/5希釈し、150μLアリコートを、前述のように実行したTSHR260-結合アッセイに2つ組で適用した(図12a)。検出されたTSHRタンパク質の量(前記TSHR260結合アッセイ参照)を、i)TSHR260-WT標準の割合、及びii)加熱後に残存する活性TSHRタンパク質の画分として表現した。これを、加熱後に残存するTSHR260-WT標準の画分と比較し、TSHR260-WT標準安定性の割合として変異体安定性を生じた。検出された活性TSHRタンパク質の量が、正確に決定されるにはあまりにも高いか低い場合は、この結合アッセイを、TSHR260変異体の異なる希釈で繰り返した。
CHO-K1細胞において一過性に発現され且つ前述のように上清から収集されたTSHR260変異体を、CHO-K1培地中に25%TSHR260-WT標準(前記参照)まで希釈した。100μLアリコートを、37℃で0~30日間、又は42℃、50℃、55℃、若しくは60℃で0~3時間加熱した。次に試料を、TAT緩衝液(試料87.5μL+TAT緩衝液350μL)中に1/5で希釈し、150μLアリコートを、2つ組で前述のTSHR260-結合アッセイ(図12b)に適用した。アッセイデータを、時間に対してプロットし、指数関数曲線にフィットさせ、且つ変異体の半減期(t1/2)を計算し、TSHR260-WT、TSHR260-I253R又はTSHR260-JMG45と比較した(表5に規定)。
TSHR260変異体の発現レベルを、Bio-Dotマイクロ濾過装置(Bio-Rad Laboratories社, Hemel Hempstead, HP2 7DX, UK)を使用する、ドットブロットアッセイにより決定した。前述のトランスフェクトされた細胞培養物から収集したTSHR260-6His調製品の50μLアリコートを、Bio-Dot装置に適用し、重力流により、ニトロセルロースメンブレンを通した。続いて、これらの試料を、重力流により、リン酸緩衝食塩水(PBS、8g/L NaCl、1.15g/Lリン酸水素二ナトリウム、0.2g/Lリン酸二水素カリウム、0.2g/L塩化カリウム、pH7.4)50μLと共に流した。次にメンブレン上の試料を、洗浄緩衝液(PBS中0.5%(v/v)Tween)400μLにより洗浄し、真空を適用し、メンブレンを通して洗浄緩衝液を吸引した。次にメンブレンを、Bio-Dot装置から取り外し、PBS中の0.1mg/Lポリ酢酸ビニルとのインキュベーションにより、穏やかに振盪しながら、1分間ブロックした。このメンブレンを、洗浄緩衝液で洗浄し(3×3分間、室温、振盪しながら)、抗体緩衝液(PBS中180g/L D-グルコース、10%(v/v)ウシ胎仔血清、10%(v/v)~87%グリセロール、0.5%(v/v)Tween)中に希釈した一次抗体であるTSHRモノクローナル抗体18C5-IgG(0.01mg/mL)又は8E2-IgG(0.02mg/mL)(Jeffreys Jらの文献、(2002) 前掲)と共に、室温で振盪しながら1時間インキュベーションした。再度メンブレンを、洗浄緩衝液で洗浄し(3×3分間、室温、振盪しながら)、その後PBS中の二次抗体であるヤギ抗-マウスHRP(0.04μg/mL, Sigma社)と共に室温で振盪しながら1時間インキュベーションした。再度洗浄緩衝液でメンブレンを洗浄した後(3×3分間、室温、振盪しながら)、メンブレンを、化学発光基質であるSuper Signal West Pico Stable Peroxide(ThermoScientific社)及びSuper Signal West Pico Luminal Enhancer (ThermoScientific社)と共にインキュベーションした。
完全長野生型TSHR及び変異型TSHR(JMG37、JMG45及びJMG52)の「オン-プレート」安定性を試験するために、96-ウェルMaxisorp ELISAプレート(Nunc社)を、以下のようにコートした。14C4 Fab2を、コーティング緩衝液中に1μg/mLまで希釈し、96-ウェルELISAプレートの各ウェルへ、150μLアリコートとした。これを、室温で3時間インキュベーションし、引き続き4℃で一晩インキュベーションした。ELISAプレートウェルを、洗浄緩衝液で3回洗浄し、未結合の抗体を除去した。野生型及び変異型TSHR試料を、-80℃から取り出し、室温で解凍し、氷上に配置した(0℃)。次にTSHR試料を、TAT緩衝液中に希釈した。各希釈物150μLを、4個のELISAプレートウェルへピペッティングし、4℃で一晩インキュベーションした。プレートを、洗浄緩衝液で3回洗浄し、14C4 Fab2に結合していないTSHRを除去した。TAT緩衝液を、各ウェルに添加し(150μL)、次に接着プレートカバーを適用して、ウェルを密封した。次に各プレートを、42℃又は50℃に設定したインキュベーター内に配置した。96-ウェルプレートの1ストリップ(8ウェル)を、各プレートから、5、10、15、20、30、45、60、90、120及び180分後に取り外し、スペアELISAプレートラックに挿入し、これを次に氷上に維持した。180分間の時間経過が完了した後、受容体希釈緩衝液を、ELISAウェルから吸引した。
Maxisorp ELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液中の1μg/mL 14C4 Fab2の150μLアリコートによりコートし、室温で3時間、その後4℃で一晩インキュベーションした。TSHR260変異体を、CHO-K1培地中に希釈し、次にTAT緩衝液中に1/5希釈した。或いは、完全長TSHR変異体を、TAT緩衝液中に希釈した。ウェルを洗浄し、TSHR260又は完全長TSHR被験試料150μLを、各ウェルに適用し、且つ室温で1時間インキュベーションし、TSHR260又は完全長TSHRを14C4-Fab2へ結合させた。次にこれらのウェルを洗浄し、アッセイ緩衝液75μL及び健常血液ドナー血清75μLと共に、室温で1時間、ELISAプレート振盪機上で1分間に500回振盪しながら、インキュベーションした。その後ウェルの内容物を空にし、ウェルを洗浄し、100μLのM22-POD(RSR社)、K1-18ペルオキシダーゼコンジュゲート(K1-18-POD;RSR社)又はK1-70ペルオキシダーゼコンジュゲート(K1-70-POD;RSR社)の濃度範囲10μg/mL~1ng/mLと共に、インキュベーションした。振盪せずに室温で25分間インキュベーションした後、プレートウェルを再度洗浄し、テトラメチルベンジジン100μLを添加し、更に振盪せずに室温で25分間インキュベーションした。この反応を、0.5M H2SO4の50μLの添加により停止し、各ウェルの吸光度を、ELISAプレートリーダー上で、450nmで読み取った。非特異的結合に関して、CHO-K1培地を、TAT緩衝液中に希釈し、TSHR260変異体又は完全長TSHR変異体に関するように、陰性対照として、ウェルに適用し、変動する濃度のM22-POD、K1-18 POD又はK1-170 PODとのインキュベーションを含む、同じ様式で処理した。GraphPad Prism(GraphPad Software社, La Jolla, CA, USA)を使用し、M22-POD、K1-18-POD及びK1-70-PODに関する結合曲線をプロットし、マッチした濃度のM22-POD、K1-18 POD又はK1-70 PODとインキュベーションしたTSHR260又はTSHR試料のOD450から、陰性CHO-K1対照のOD450を減算することにより、非特異的結合について補正した。非線形回帰(1-部位特異的結合飽和曲線)を使用し、平衡結合定数(Kd)を計算し、これは、受容体(完全長TSHR又はTSHR260変異体)の半分がリガンドに結合されるリガンド(M22-POD、K1-18-POD又はK1-70-POD)の濃度である。Kdは、1/Kaに等しく、ここでKaは親和定数である(図12a及び図14a)。
ELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液中の1μg/mL 14C4 Fab2の150μLアリコートでコートし、室温で3時間、その後4℃で一晩インキュベーションした。TSHR260-WT、TSHR-JMG37、TSHR-JMG45、TSHR-JMG52及びTSHR-JMG55を、培地中に希釈し、引き続きTAT緩衝液中に1/5希釈した。ウェルを洗浄し、完全長TSHR被験試料150μLを、各ウェルに適用し、室温で1時間インキュベーションし、TSHR260を14C4-Fab2へ結合させた。次にこれらのウェルを洗浄し、アッセイ緩衝液75μL及びTRAb陽性患者血清又はNPS中に希釈したM22 IgG、K1-18 IgG若しくはK1-70 IgG (1000ng/mL~0.1ng/mL)の75μLと共に、室温で1時間、ELISAプレート振盪機上で1分間に500回振盪しながら、インキュベーションした。その後ウェルの内容物を空にし、ウェルを洗浄し、89.5ng/mL M22-POD(RSR社) 100μLを各ウェルに添加した。振盪せずに室温で25分間インキュベーションした後、プレートウェルを再度洗浄し、引き続きテトラメチルベンジジン100μLを添加し、更に振盪せずに室温で25分間インキュベーションした。この反応を、0.5M H2SO4の50μLの添加により停止し、各ウェルの吸光度を、ELISAプレートリーダー上で、450nmで読み取った(図12c)。
ELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液中の1μg/mL 14C4 Fab2の150μLアリコートでコートし、室温で3時間、その後4℃で一晩インキュベーションした。完全長TSHR-WT、TSHR-JMG37、TSHR-JMG45及びTSHR-JMG52を、TAT緩衝液中に希釈した。ウェルを洗浄し、完全長TSHR被験試料150μLを、各ウェルに適用し、4℃で一晩インキュベーションし、完全長TSHR変異体を14C4-Fab2へ結合させた。次にこれらのウェルを洗浄し、アッセイ緩衝液75μL及びTRAb陽性患者血清又はNPS中に希釈したM22 IgG、K1-18 IgG若しくはK1-70 IgG(1000ng/mL~0.1ng/mL)の75μLと共に、室温で1時間、ELISAプレート振盪機上で1分間に500回振盪しながら、インキュベーションした。その後ウェルの内容物を空にし、ウェルを洗浄し、89.5ng/mL M22-POD(RSR社) 100μLを各ウェルに添加した。振盪せずに室温で25分間インキュベーションした後、プレートウェルを再度洗浄し、引き続きテトラメチルベンジジン100μLを添加し、更に振盪せずに室温で25分間インキュベーションした。この反応を、0.5M H2SO4の50μLの添加により停止し、各ウェルの吸光度を、ELISAプレートリーダー上で、450nmで読み取った(図14e)。
Flp-Inシステムを使用する変異されたTSHR構築体のチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞へのトランスフェクションは、WO2006/016121Aに記載されている。
ミドリザル、アカゲザル、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ヒツジ及びウマ由来のTSHRのタンパク質配列(図10;配列番号:47-56)並びにヒトFSHR(図11;配列番号:57)及びヒトLHR(図 11;配列番号:58)由来のタンパク質配列を、Uniprotデータベースから入手し、DNAStar MegAlign(v. 9.1, DNAStar社, Madison, WI, USA)を用い、ヒトTSHRのタンパク質配列(図2;配列番号:2)と並置した。
本発明の標識された変異体の一例(アルカリホスファターゼ標識を含むTSHR260)を、以下に説明しているが、望ましいならば、異なる標識及び異なる長さの変異体TSHR(完全長TSHRを含む)を使用することができることは理解されるであろう。他の標識は、例えば、酵素標識、同位体標識、化学発光標識、蛍光標識及び色素からなる群から選択されてよく、このようなものは当該技術分野において公知である。かかる標識は、いずれか適切な様式、例えば、好適な構築体を使用する遺伝子融合を介して(更に以下に記載)又は化学標識により、追加することができる。当業者は、特定の標識に必要な関連技術を熟知しているであろう。いずれか好適なビオチン化プロセスに関与するビオチン標識を、使用してよい。
特異的変異をTSHR260-AP構築体のTSHR配列(図15及び16;配列番号:59及び60)へ導入するために使用した方法は、TSHR260変異に関して先に説明したものである。TSHR変異(図5及び6;配列番号:14、16、18、19、20、23、27、32、34、36、37、38、41及び45)は、TSHR260-AP構築体へ逐次導入し、以下に詳述した8種の異なる構築体(TSHR260-AP-I253R、TSHR260-AP-JMG22、TSHR260-AP-JMG37、TSHR260-AP-JMG45、TSHR260-AP-JMG52、TSHR260-AP-JMG55、TSHR-AP-JMG57及びTSHR260-AP-JMG58)を生じた。アミノ酸残基の番号付けは、そのアミノ酸が未変性の野生型TSHR配列において認められる位置を指す:
TSHR260-AP-I253R=TSHR260-AP+I253R (図5及び6;配列番号:27及び45)
TSHR260-AP-JMG22=TSHR260-AP+D143P+I253R (図5及び6;配列番号:18、27、36及び45)
TSHR260-AP-JMG37=TSHR260-AP+R112P+D143P+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、27、34、36及び45)
TSHR260-AP-JMG45=TSHR260-AP+R112P+D143P+D151E+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
TSHR260-AP-JMG52=TSHR260-AP+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
TSHR260-AP-JMG55=TSHR260-AP+H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
TSHR260-AP-JMG57=TSHR260-AP+H63C+R112P+D143P+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
TSHR260-AP-JMG58=TSHR260-AP+H63C+R112P+D143P+S166T+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45)。
(4E31)
4E31抗体は、TSHRのC-末端の残基603-764(C-TSHR)に対するマウスモノクローナル抗体であり、これは完全長TSHRをELISAプレートウェル上に固定するために使用することができる(EP 1021721B1、Boltonらの文献、(1999) 前掲)。マウスの免疫化のために、C-TSHRを、標準プロトコールを使用し、グルタチオンS-転移酵素(GST)との融合タンパク質として、大腸菌において発現させた(Oda Yらの文献、(1998) 前掲)。最後の162アミノ酸をコードしているcDNAの3’末端(1809-2295 bp)は、pGEX2Tベクター(Pharmacia Biotech社, St. Albans ALI 3AW UK)において、GST融合タンパク質とインフレームでクローニングした。pGEX-2T/C-TSHRプラスミドで形質転換した大腸菌(UT580株)を一晩培養したものを、2×YTG培地(16g/Lトリプトン、10g/L酵母抽出物、5g/L NaCl、20g/L グルコース、pH7.0)へ1/5希釈し、30℃で3時間インキュベーションした。その後、C-TSHR/GST融合タンパク質発現を誘導するために、イソプロピル-3-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を、最終濃度1mMとなるよう添加し、引き続き更に3時間インキュベーションした。この細菌ペレットを、1%(v/v)トリトンX-100を含有するPBS(8g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.44g/L Na2HPO4、0.24g/L KH2PO4、pH7.4)中に再浮遊させ、氷上で1分間3回音波処理した。封入体をペレット化し、4M尿素で洗浄し、8M尿素中で可溶化させ、還元条件下の9%ポリアクリルアミドゲル(SDS-ポリアクリルアミド電気泳動、SDS-PAGE)上で分離した。C-TSHR/GST融合タンパク質(MW 44kDa)を、0.1M NaHCO3及び0.1% SDS(pH7.8)中のポリアクリルアミドゲル切片から電気溶出させ、50mMトリス-HCl(pH8.0)に対し透析し、-70℃でアリコートで保存した。
K1-70は、甲状腺機能低下症患者の末梢血リンパ球から入手された、TSHRに対する遮断型ヒトモノクローナル自己抗体である(Evansらの文献、(2010) Clinical Endocrinology, 73: 404-412;EP2367850)。簡単には、リンパ球を、54歳の甲状腺機能低下症で高レベルのTSHR抗体を持つ患者の末梢血20mLから単離した。リンパ球を、エプスタイン・バー・ウイルスにより感染させ、標準技術を使用し、マウス/ヒトハイブリッド細胞株(K6H6/B5;ECACC, Porton Down, UK)と融合させた(Hayakawa Nらの文献、(2002) 前掲)。これらの細胞を、48-ウェルプレート上にプレーティングし、TSHRコートされたチューブに結合する125I-TSHの阻害を基にしたアッセイを使用し、上清をスクリーニングした(アッセイキットはRSR社(Cardiff, UK)から入手可能)。次に陽性ウェルを、高濃度のTSHR自己抗体K1-70を生成する単独コロニーが単離されるまで、限界希釈により再クローニングした。K1-70は、RSR社(Cardiff, UK (前掲))から購入可能である。
詳細は先の「TSHR260結合アッセイにおいて使用した抗体」に記載。
架橋ELISAを、先に記した方法を基に使用した(図13a、Rees Smith, Bらの文献、(2009) 前掲、WO2010/073012A2)。このELISAは、二価TSHR抗体の、ELISAプレートウェル上にコートされたTSHRに対する1つの抗原結合部位に、及び液相中のTSHR260-APへの他の抗原結合部位に、結合する能力、すなわち、架橋を形成する能力を基にしている。CHO細胞において発現された完全長界面活性剤-可溶化された受容体の形のTSHRを、前述のC-末端抗体4E31を介して、ELISAプレートウェル上にコートした(Bolton, Jらの文献、(1999) 前掲)。このアッセイにおいて、出発緩衝液(50mM NaCl;20mMトリス(pH7.8);1g/L BSA;50mg/L正常マウスIgG;1%トリトンX-100(pH7.8))75μL及び被験試料(健常血液ドナー血清のプール中に希釈した又はアッセイ緩衝液[50mM NaCl、20mM トリス(pH7.8)、1%トリトンX-100、1g/L BSA]中に希釈した患者血清又はモノクローナル抗体)75μLを、完全長界面活性剤-可溶化されたTSHRによりコートされたELISAプレートウェルに添加し、室温で2時間、振盪しながら(500rpm)インキュベーションした。次に、ウェルの内容物を除去し、ウェルを洗浄緩衝液(50mM NaCl、20mMトリス(pH7.8)、1%トリトンX-100)で3回洗浄し、引き続きTSHR260-AP(0.2g/L MgCl2-6H2O及び2g/L BSAを含有する洗浄緩衝液中に希釈した)100μLを添加した。室温で1時間振盪しながら(500rpm)インキュベーションした後、ウェルを空にし、洗浄し(3回)、且つp-ニトロフェニルリン酸(pNpp)基質(Europa Bioproducts社, Ely, Cambridge UK)100μLを添加し、このプレートを暗所で45分間インキュベーションした。その後、停止溶液(1M NaOH)100μLを添加し、吸光度を、ELISAプレートリーダーにおいて405nmで読み取った。結果を、OD405nm吸光度値として表し、各試料中のTRAbの濃度を、ヒトモノクローナルTSHR自己抗体K1-70により作製された標準曲線を使用し、計算した。
前述のように昆虫細胞において発現され且つ上清から収集されたTSHR260-AP変異体(配列番号に関して「安定化アミノ酸変異を含むTSHR260-AP構築体の作製」参照)を、0.2g/L MgCl2-6H2O及び2g/L BSAを含有する洗浄緩衝液中に希釈し、TSHR260-AP架橋ELISAにおいて好適な吸光度を生じた(図13b)。150μLアリコートを、50℃、60℃、又は65℃で、0~3時間加熱した。試料100μLを、2つ組で、前述のTSHR260-AP架橋ELISAに適用した(図13b)。アッセイデータを、時間に対してプロットし、指数関数曲線にフィットさせ、変異体の半減期(t1/2)を計算し、TSHR260-AP WT(図15及び16;配列番号:59及び60)、TSHR260-AP-JMG22又はTSHR260-AP-JMG45(「安定化アミノ酸変異を含むTSHR260-AP構築体の作製」において先に規定)と比較した。
前述のTSHR260架橋ELISAは、複合されないTSHR260及びTSHR260-Mab複合体を検出する阻害ELISAを形成するために改変することができる(図13c)。このアッセイにおいて、出発緩衝液(TRAb ELISAについて記載;Bolton J,らの文献、(1999) 前掲)75μL及び1μg/mL M22 IgG又は1μg/mL K1-70 IgGの75μLを、完全長界面活性剤-可溶化TSHRでコートされたELISAプレートウェルへ添加し、且つ室温で30分間振盪しながら(500rpm)インキュベーションした。次にウェルの内容物を除去し、ウェルを洗浄緩衝液(50mM NaCl、20mMトリス(pH7.8)、1%トリトンX-100)で洗浄し、引き続き被験試料(すなわち、非標識化TSHR260又はTSHR260-Mab複合体)を1ウェルにつき100μL添加した。室温で1時間振盪しながら(500rpm)インキュベーションした後、ウェルの内容物を除去し、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄し、TSHR260-AP(0.2g/L MgCl2-6H2O及び2g/L BSAを含有する洗浄緩衝液中に希釈した)100μLを添加した。室温で30分間振盪しながら(500rpm)インキュベーションした後、ウェルを空にし、洗浄し(3回)、且つp-ニトロフェニルリン酸(pNpp)基質(Europa Bioproducts Ltd, Ely, Cambridge UK) 100μLを添加し、このプレートを45分間インキュベーションした。その後、停止溶液(1M NaOH)50μLを添加し、吸光度を、ELISAプレートリーダーにおいて405nmで読み取った。未標識のTSHR260を含む被験試料による標識されたTSHR260結合(すなわち、TSHR260-AP)の阻害は、以下のように表現した:100×(1-緩衝液のみの405nmの吸光度に対する被験試料の405nm吸光度の比)。
TSHR260の部分精製において使用したTSHRの凸面に対する2H11、25E1、23H4、9B7及び36F11 TSHRマウスモノクローナル抗体を、cDNA免疫化により調製した。簡単には、6~8週齢のOF1(非近交系)マウスに、10μMカルディオトキシン100μlを、筋肉内注射し、その5日後完全長TSHR cDNA (pRC/CMVhTSHR;Odaらの文献、(1998) 前掲)100μgにより、筋肉内免疫化した。TSHR DNA免疫化は、3週間間隔で、合計5回注射を繰り返した(Hasanらの文献、(1999) J. Immunol. Methods, 229:1-22)。TSHRに結合するビオチン-標識した14C4 IgGの阻害により、マウス出血液を、TSHRの凸面に対する抗体の存在について試験した(RSR社, Cardiff, UKにより製造されたアッセイ)。モノクローナル抗体を、血清中に最高TSHR抗体力価を持つマウス由来の脾臓細胞を用いて作製した。単離した脾臓細胞を、マウス骨髄腫細胞系(Sp2/O-Ag14))と、標準手順(de St Groth, S. F.及びScheidegger, D.の文献、(1980) Journal of Immunological Methods, 35, 1-21)を用い、融合した。細胞を、DMEM(ハイブリッドを選択するためにHATを含有する15%ウシ胎仔血清を補充した)中で培養し、96-ウェルプレートにプレーティングした。TSHRの凸面に対する抗体を得るために、細胞培養物由来の上清を、ELISAプレートウェル上にコートされたTSHRに結合するビオチン標識された14C4 IgGの阻害により、スクリーニングした。完全長TSHRが4E31(TSHRのC末端に対する抗体)を使用しELISAプレートウェルに結合されるこれらのアッセイにおいて、培養物上清中のTSHR抗体は、固定されたTSHRへ結合し、且つTSHRの凸面に対する抗体(すなわち、14C4結合部位と重複している)を含むウェルは、ビオチン標識化された14C4のTSHRへの結合を阻害する。陽性ウェル由来の細胞を、限界希釈により2回再クローニングし、必要なモノクローナル抗体を発現しているクローンを得る。
High-Five(商標)昆虫細胞(Invitrogen社からのBTI-TN-5B1-4)を、Insect Xpress培地(Lonza社)において維持した。2L又は0.2Lの振盪-フラスコに、細胞密度およそ1.00×106個細胞/mLで播種し、27℃で一晩(その時点以降、温度は23℃に低下した)110rpmでインキュベーションした。細胞を、バキュロウイルスストックにより、Bac-to-Bacシステム(Invitrogen社)を用いて、感染多重度(MOI)0.012pfu/mLで感染させた。TSHR260(図4;配列番号:4)又はTSHR260-JMG55のいずれかを含む培養物上清を、感染後120時間で、500gで10分間の4℃での遠心分離により収集した。上清200mLにつき完全プロテアーゼ阻害剤(Roche Diagnostics社, Lewes, UK)1錠を添加し、その後精製まで-70℃で貯蔵した。
High-Five(商標)昆虫細胞を、およそ96時間後に、TSHRモノクローナル抗体(14C4、2H11、25E1、36F11、9B7又は23H4 IgG)の2mg/Lを培養培地に添加した以外は、TSHR260について前述したように培養し、且つ感染させた。TSHR260-TSHR Mab複合体を含む培養物上清を、感染後120時間で、500gで10分間の4℃での遠心分離により収集した。上清200mLにつき完全プロテアーゼ阻害剤(Roche Diagnostics社, Lewes, UK)1錠を添加し、その後個々の複合体のPIによって決まる陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィーのいずれかによる精製まで、-70℃で貯蔵した。
TSHR260を含む培養物上清(100mL)を、HPLC等級の水により1:1希釈し、2Mトリスを用い、pH9.0に調節し、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製のために、ストリームラインDEAEマトリクス15mLの上に装加した。このカラムを、10mMトリス-HCl(pH9.0)、50mM NaClにより洗浄し、引き続き500mM NaCl及び10mMトリス-HCl(pH9.0)により溶出した。溶出した物質を、50mM NaCl、10mMトリス-HCl(pH8.0)に対して透析した。溶出画分中のTSHR260の存在は、アミノ酸246-260内のTSHRエピトープと反応性であるマウスモノクローナル抗体(TSHR MAb 18C5、Jeffreys Jらの文献、2002) 前掲)(10μg/mL)を使用する、ウェスタンブロット分析、及びTSHR260架橋阻害ELISAにおいて測定した活性(図13c)により確認した。
TSHR260-14C4-IgG複合体を含有する培養物上清(200mL)を、未複合のTSHR260に関して前述したように、HPLC等級の水により1:1希釈し、2Mトリスを用い、pH9.0に調節し、ストリームラインDEAEマトリクス15mLの上に装加し、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
下記のものと同等な精製を、本発明の他の変異体に使用することができる。TSHR260-JMG55は、以下を使用するカラムクロマトグラフィーの3ラウンドにより精製した:a)ストリームラインダイレクトHSTマトリクス上の陽イオン交換クロマトグラフィー;b)セファロースに結合した14C4上のモノクローナル抗体アフィニティクロマトグラフィー;及び、c)ニッケル-アフィニティクロマトグラフィー。TSHR260-JMG55を含有する培養物上清(12L)を、500mMリン酸ナトリウム(NaH2PO4)により、pH6.0に調節した。ツイーン80を最終濃度0.015%v/vまで添加し、培養物上清を、ストリームライン25拡張床クロマトグラフィーシステム(GE Healthcare社)中のストリームラインダイレクトHSTマトリクス75mL上に装加した。2つの更なる12Lのバッチを、個別の実験において同じ様式で処理した。
Maxisorp 96-ウェルELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液(5μg/mL BSAを含有する15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、1.5mM NaN3、0.01g/Lフェノールレッド、pH9.2)中の精製したJMG55-TSHR260-4.5の4μg/mL又は0.4μg/mLの150μLアリコートでコートし、4℃で一晩インキュベーションした。ウェルを、洗浄緩衝液(50mM NaCl;20mMトリス(pH7.8);1%v/v トリトンX-100)で3回洗浄し、引き続き250μLのポスト-コート緩衝液(154mM NaCl、58mMショ糖、3g/L BSA、0.2g/Lアジ化ナトリウム)により1時間インキュベーションした。ウェルを、洗浄緩衝液で3回洗浄し、アッセイ緩衝液(50mM NaCl、20mMトリス(pH7.8)、1%v/v トリトンX-100、1g/L BSA) 75μL及び健常血液ドナー血清プール(NPS) 75μLと共に、室温で1時間、ELISAプレート振盪機上で1分間に500回振盪しながらインキュベーションした。その後、ウェルの内容物を空にし、ウェルを洗浄し、濃度範囲(0.25~7.5μg/mL)の100μLのM22 Fab-ペルオキシダーゼコンジュゲート(M22-POD, RSR社, Cardiff, CF23 8HE, UK)、K1-70 IgG-ペルオキシダーゼコンジュゲート(K1-70-POD)又はK1-18 IgG-ペルオキシダーゼコンジュゲート(K1-18-POD)のいずれかを、各ウェルに添加した。室温で振盪せずに25分間インキュベーションした後、プレートウェルを再度洗浄し、引き続きテトラメチルベンジジン100μLを添加し、更に室温で25分間、振盪せずにインキュベーションした。反応を、50μLの0.5M H2SO4の添加により停止し、各ウェルの吸光度を、ELISAプレートリーダー上で450nmで読み取った(図12d)。
脱グリコシル化は、本発明の他の変異体へ、下記のように適用することができる。脱グリコシル化反応は、50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)中で、エンドグリコシダーゼF3(Endo F3, Sigma社)及び5μgのTSHR260-JMG55-4.5の0mU/mg、40mU/mg、60mU/mg及び80mU/mg(Endo F3:TSHR260-JMG55-4.5 比)を用いて、20℃で、24時間、72時間及び120時間行った。これらの反応は、12%非還元SDS-PAGE上で、SimplyBlue SafeStain (Invitrogen社)染色及びTSHRマウスモノクローナル抗体8E2を使用するウェスタンブロットにより、分析した。TSHR260-JMG55-4.5の分子量の何らかの変化を、Mark12分子量マーカー(Invitrogen社)を用いて決定した。TSHR260-JMG55-4.5の活性は、脱グリコシル化後、TSHR260-結合アッセイにより決定した(図12a)。
ブタTSHR完全長ヌクレオチド配列(図17;配列番号:61)を、ブタの甲状腺cDNAライブラリー(EP 1021721B1)からクローニングした。簡単には、総RNAを、酸フェノールグアニジン法(P Chomczynski、N Sacchiの文献;グアニジウムチオシアン酸-フェノール-クロロホルム抽出によるRNA単離の単工程法(Single step method of RNA isolation by guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction);Analytical Biochemistry, 1987;162: 156-159)を用い、ブタ甲状腺組織2.5gから調製した。mRNAを、DynalビーズmRNA精製キット(Dynal Biotec社;Wirral, CH62 3QL, UK)を用いて調製した。このmRNAを使用し、ZapExpress cDNA GigapackクローニングキットIII(Stratagene社, Cambridge CB4 4DF UK)を使ってcDNAライブラリーを作製した。4種の変性オリゴヌクレオチドを、公知のTSHR配列(マウス、ラット、ヒト、イヌ及びウシ)に作製し、ブタTSHRの2つの断片を、PCRを使用し増幅した。これらを配列決定し、それらのTSHR cDNAとの相同性を検証し、且つ完全長ブタTSHRクローンのcDNAライブラリーをスクリーニングするために使用した。3種の完全長クローンを入手し、完全に配列決定した。標準クローニング手順を使用し、ブタTSHR cDNAのコーディング配列を、pcDNA5.1/FRTベクター(Invitrogen社)のBamHI及びNotI制限部位へクローニングした。アミノ酸配列は、図18(配列番号:62)参照。
完全長マウス及びブタTSHRの野生型及び変異体の熱安定性を、「完全長TSHR変異体の熱安定性」において以下に説明した(図14c)ような、55℃で加熱された4E31-コートされたプレートに結合されたTSHRが関与している、安定性アッセイBにおいて試験した(図14c)。
Flp-Inシステムを使用する、野生型及び変異型TSHR構築体のチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞へのトランスフェクションは、WO2006/016121Aに説明されている。
完全長野生型又は変異型TSHR(ヒト、ブタ又はマウス)を発現しているCHO細胞を、コンフルエンスまで成長させ、175cm2細胞培養フラスコから剥離し、且つこの細胞ペレットを、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)を含有する50mM NaCl、10mMトリス-HCl(pH7.5)により洗浄し、その後同じ緩衝液中でホモジナイズした。12000gで30分間4℃での遠心分離後、細胞膜を、1%トリトンX-100の添加以外はホモジナイゼーションに使用したものと同じ緩衝液(およそ4×108個細胞について緩衝液4mL)中で可溶化した。可溶化された受容体調製品を、90000gで2時間、4℃で遠心分離し、上清を-70℃で貯蔵した。
Maxisorpアッセイチューブ(Nunc社)を、コーティング緩衝液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、1.5mM NaN3、0.01g/Lフェノールレッド、pH9.2)中の10μg/mL 4E31-Fab2の200μLアリコートによりコートし、37℃で90分間、その後4℃で一晩インキュベーションした。ウェルを、アッセイ緩衝液(50mM NaCl;20mMトリス-HCl(pH7.8)、1%トリトン-X-100)により3回洗浄した。完全長TSHR調製品を、アッセイ緩衝液中に希釈し、200μLアリコートを、4E31-コートされたチューブ内で、4℃で一晩インキュベーションした。ウェルは、アッセイ緩衝液で3回洗浄した。アッセイ緩衝液中の非標識TSH 50μL、125I-標識されたTSH(アッセイ緩衝液中30,000cpm)50μL及び出発緩衝液(50mM NaCl;20mMトリス-HCl(pH7.8)、1%トリトンX-100、1g/L BSA、50mg/L正常マウスIgG)50μLを、コートされたチューブに適用し、室温で2時間、穏やかに振盪しながらインキュベーションし、アッセイ緩衝液1mLで2回洗浄し、ガンマカウンターにおいてカウントした。結合TSH、対、結合/未結合TSHの濃度を、プロットし(G Scatchardの文献、(1949)、Annals of the New York Academy of Sciences, 51: 660-672)、会合定数を誘導した。
更にTSHRのLRDにおいて確定された熱安定化変異に対し、TSHR-JMG55のTMDの配列を試験し、更なる熱安定化変異が、TSHRのこのドメインで確定できるかどうかを決定した。以下の3つの原理を使用し、TSHRのTMD内の可能性のある熱安定化変異を予測した:i) 他の生物のTSHR相同体のコンセンサス配列を使用し、可能性のある熱安定化変異を確定した;ii) TSHRのより低い基本cAMPシグナル伝達活性を生じる変異(SSFAデータベースから検索(www.ssfa-gphr.de);Kreuchwig Aらの文献、(2013) Mol Endocrinol. 8: 1357-63)を、これらは、GPCRに関して、活性立体構造よりもより熱安定性であるTSHRの不活性立体構造を安定化し得るので、試験した;並びに、iii) 他のGPCR、すなわち、β1-アドレナリン受容体(β1AR、Serrano-Vegaらの文献、(2008) PNAS, 105: 877-82;Miller JL及びTate CGの文献、(2011) J. Mol. Bio. 413: 628-38)、A2Aアデノシン受容体(A2AR;Dore ASらの文献、(2011) Structure, 19: 1283-93)、NTS1ニューロテンシン受容体(NTS1R;Egloff Pらの文献、(2014) PNAS, 111: E655-62;Shibata Yらの文献、(2009) J. Mol. Bio. 390: 262-277)、及びコルチコトロピン-放出因子受容体-1(CRF1R;Hollenstein Kらの文献、(2013) Nature, 499: 438-443)において熱安定化するとして確定された変異を、TSHRへ移入した。合計で56種の可能性のある熱安定化変異が、確定され:10種のTSHRコンセンサス変異、19種のTSHR不活性化変異、26種のGPCR熱安定化変異、及び1種の変異Y601A、これは、TSHRにおいて不活性化し且つβ1-アドレナリン受容体において熱安定化するの両方である(表59)。
トランスフェクションの前日に、2.2×105個CHO-K1細胞/ウェルを、90mm細胞培養皿(Nunc社)へ播種した。トランスフェクトされるべき各90mm皿について、pcDNA3.1(+)中のTSHR-JMG55変異体30μgを、Optipro SFM (Life Technologies社, Paisley, PA4 9RF, UK)600μLと混合した。Optipro SFM 540μL中に希釈したFreestyle Max試薬(Life Technologies社)60μLを、各DNA/Optipro SFM混合物へ添加し、室温で10~20分間インキュベーションした。1200μL DNA/Freestyle Max混合物を、90mm皿中のCHO-K1細胞へ添加し、37℃で40~48時間インキュベーションした。細胞単層を4mL PBSですすぐことにより、TSHR-TMD変異体を発現しているCHO-K1細胞を収集し、次にスクレーピングによりこれらの細胞を1mL PBS中に収集し、細胞を移した。これらの細胞を、1.5mLバイアル中で、13000rpmで1分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを-70℃で貯蔵した。必要ならば、各細胞ペレットを、可溶化緩衝液(50mM NaCl、10mMトリス(pH7.8)、1%v/vトリトンX-100、完全プロテアーゼ阻害剤(Roche社))1mL中に懸濁することにより可溶化し、且つ氷上で少なくとも30分間インキュベーションした。その後この物質は、直ちに使用するか、又は-70℃で貯蔵した。
(4E31)
「TSHR260-AP架橋ELISAにおいて使用した抗体」において先に詳述した。
(14C4)
「TSHR260結合アッセイにおいて使用した抗体」において先に詳述した。
(M22)
「TSHR260結合アッセイにおいて使用した抗体」において先に詳述した。
Maxisorp 96-ウェルELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、1.5mM NaN3、0.01g/Lフェノールレッド、pH9.2)中の1μg/mL 14C4-Fab2(Jeffreys Jらの文献、(2002) 前掲、及びSanders Jらの文献、(2007) 前掲)又は1μg/mL 4E31-Fab2(EP 1021721B1、Boltonらの文献、(1999) 前掲)の150μLアリコートによりコートし、室温で3時間、次に4℃で一晩インキュベーションした。ウェルを、洗浄緩衝液(50mM NaCl;20mMトリス(pH7.8);1%v/vトリトンX-100)で3回洗浄し、且つTAT緩衝液(50mM NaCl、10mMトリス(pH7.8)、1%v/vトリトンX-100、1g/L BSA、0.2g/Lアジ化ナトリウム)中に希釈した被験試料(一過性トランスフェクトされたCHO-K1細胞から収集されたTSHR)150μLを、各ウェルに適用し、室温で1時間又は4℃で一晩インキュベーションし、TSHRを、14C4-Fab2又は4E31-Fab2コートされたプレートへ結合させた。
TSHR変異体の熱安定性を、以下の3つの異なる様式で測定した:A) 14C4-コートされたELISAプレートウェルに結合されたTSHR変異体の加熱(図14b);B) 4E31-コートされたELISAプレートウェルに結合されたTSHR変異体の加熱(図14c);及び、C) 溶液中のTSHR変異体の加熱、その後アッセイのためのそれらの4E31-コートされたELISAプレートウェルへの結合(図14d)。
(単一変異)
本発明者らの実験において、TSHR260の239の単一変異体を調製し、発現させた。特にそのアミノ酸のMet22からLeu260までの各残基を変異させたものは、各位置で最も熱安定であると推定した(表1)。これらの変異体を、TSHR260-結合アッセイにおいて結合及び安定性について、スクリーニングした(図12a、b、表2)。このスクリーンで確定された64種の最良候補の42℃での半減期を決定し、且つ野生型TSHR260(TSHR260-WT、平均t1/2=30.7±1.1分)と比較し、変異体とTSHR260-WTの間の半減期の差(Δt1/2)、及び変異体半減期とTSHR260-WT半減期の間の安定性比を生じた(表3)。これらの熱安定性曲線は、42℃でのタンパク質の半減期の17分間の増加をもたらし、TSHR260-WTの熱安定性が少なくとも60%有意に向上された、17種の変異を確定した(P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y)(図5及び6;配列番号:11-25、27-43、45及び46)(表3)。最良の単一変異体I253R(配列番号:45)は、42℃での熱安定性をTSHR260-WTよりも3.0±0.4倍向上し、すなわち、42℃でのTSHR260の半減期を、53±6分だけ増大した(図7a)。これはまた、50℃での熱安定性をTSHR260-WTよりも2.85±0.13倍向上した。
TSHR260-結合アッセイにおいて検出されたTSHR260の量は、異なる変異体について変動し(TSHR260-WTの0%~1000%)、従って発現された各変異体の総量は、ドットブロットアッセイを使用し測定した。ドットブロットアッセイの結果は、表4に示している。ドットブロットアッセイにより測定された発現レベルは、TSHR260-WTに対して規定し、且つ同じくTSHR260-WTに対して規定したTSHR260-結合アッセイの結果と比較した。TSHR260-結合アッセイの結果とドットブロットの結果の間の比は、(TSHR260-結合÷ドットブロット)で計算し、ドットブロットアッセイにおいて検出されたTSHR260の総量と、TSHR260-結合アッセイにおいて検出された活性TSHR260の量の間に大きい解離が存在する場合を決定した。
TSHR260の二重変異体は、表5に示したように、変異P142I(配列番号:35)及びI253R(配列番号:45)を、最良の安定化変異に加えることにより作製し;変異体JMG1-JMG15及びJMG31は、P142Iを伴う二重変異体である。変異体JMG15-JMG29は、I253Rを伴う二重変異体である。P142Iは大きい熱安定化の影響を有し、TSHR260の熱安定性を5倍向上するが、これは非常に低レベルで発現された。この低い発現レベルはまた、P142Iを含む二重変異体の場合にも認められた。従って、更なる変異誘発及び熱安定性アッセイは、I253R変異体にのみ継続した。
変異体JMG30-JMG42は、変異D143P(配列番号:36)を最も安定化している二重変異に加えた、TSHR260の三重変異体である(表5)。2種の三重変異体I167F+D143P+I253R及びT179C+D143P+I253Rは、それらの各二重変異体JMG25(I167F+I253R)及びJMG29(T179C+I253R)は発現レベルが悪かったので、作製しなかった。
変異体JMG43-JMG48は、変異R112P(配列番号:34)を最も安定化している三重変異体に加えた、TSHR260の四重変異体である(表5)。熱安定性曲線を、50℃及び55℃で四重変異体について決定し、これらの温度でのI253Rの熱安定性と比較した(表8及び表9)。最も熱安定性の四重変異体は、JMG45(I253R+D143P+R112P+D151E)(各々、配列番号:45、36、34及び37)であり、これは、50℃での半減期226±31分を有し、且つTSHR260-I253Rよりも58±6倍大きい熱安定性であった(図7c)。55℃で、これは半減期27±3分を有し、且つTSHR260-I253Rよりも54±7倍大きい熱安定性であった(図7d)。60℃で、これは、半減期2.40±0.16分を有した。
変異体JMG49-JMG52は、D151E(配列番号:37)を四重変異体に加えた、TSHR260の五重変異体である(表5)。最も熱安定性の五重変異体は、JMG52(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R)(各々、配列番号:45、36、34、37及び41)であった(表9及び表10)。これは、55℃での半減期66±12分を有し、且つTSHR260-I253Rよりも125.1±0.6倍大きい熱安定性であった(図7d)。60℃で、これは半減期7.1±0.6分を有し、且つTSHR260-JMG45よりも3.0±0.2倍大きい熱安定性であった(図7e)。
六重変異は、五重変異体JMG50にS166T(配列番号:38)又はV169R(配列番号:41)変異を加えることにより作製し、JMG54(I253R+D143P+R112P+D151E+H63C+S166T)(各々、配列番号:45、36、34、37、32及び38)及びJMG55(I253R+D143P+R112P+D151E+H63C+V169R)(各々、配列番号:45、36、34、37、32及び41)を生じた(表5及び表10)。これらは、55℃で正確に測定するにはあまりにも熱安定性であり、そのため熱安定性は60℃で測定した(図7e)。JMG54は、60℃で半減期9.6±1.5分を有し、TSHR260-JMG45よりも4.0 ±0.4倍大きい熱安定性であった。JMG55は、60℃で半減期13±3分を有し、TSHR260-JMG45よりも5.2±0.9倍大きい熱安定性であった。JMG55は、TSHR260-JMG45よりも5.2倍大きい熱安定性であり、これはTSHR260-I253Rよりも56倍より大きい熱安定性であり、これは次にTSHR260-WTよりも3.1倍より大きい熱安定性であった。他の熱安定性比の比較は、要素の安定性比を、積算し、全体の熱安定性比を得ることができることを示唆している(表12)。従って、JMG55は、TSHR260-WTよりもおよそ900倍大きい熱安定性である。
最も安定した単一、二重、三重、四重、五重及び六重TSHR260変異体(I253R、JMG22(I253R+D143P)、JMG37(I253R+D143P+R112P)、JMG45(I253R+D143P+R112P+D151E)、JMG52(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R)及びJMG55(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R+H63C))の熱安定性を、TSHR260-WTに対し37℃で測定した。これらの変異体の半減期を、37℃での熱安定性曲線から計算し、且つ表11に示している。表11はまた、TSHR260-WTと比較した各変異体の安定性比も示している。これらは、他の温度で観察された安定性比(表12)と一致する。
TSHR260-WTと比較した変異体の安定性比は、異なる温度で、すなわち、42℃及び50℃で、大きくは変化しない。50℃以上では、TSHR260-WTは安定ではなく、これは参照調製品として使用することはできない。従って、より好適な変異体を、代わりに選択した。次に参照としてのこのより安定した変異体で得られた安定性比を、TSHR260-WTと比べ安定した参照変異体の安定性比で積算した(表12)。例えば、JMG37は、55℃で、TSHR260-WTよりも3.1倍より熱安定性であるI253Rよりも12.0±0.9倍より熱安定性である。従って、JMG37は、55℃でTSHR260-WTよりも12.0×3.1=37±3倍より熱安定性であると計算され、これは37℃でのTSHR260-WTに対する測定された熱安定性比(34±5倍)に良く対応している。
14C4-Fab2でコートされたELISAプレートに結合された完全長TSHR-WT(配列番号:2)、TSHR-JMG37(配列番号:45、36、34)、TSHR-JMG45(配列番号:45、36、34、37)、TSHR-JMG52(配列番号:45、36、34、37、41)及びTSHR-JMG55(配列番号:45、36、34、37、32、41)の熱安定性を、プレートを42℃又は50℃で加熱することにより、決定した。予想外に、完全長TSHR変異体であるTSHR-JMG37、TSHR-JMG45、TSHR-JMG52及びTSHR-JMG55は、TSHR-WTよりもかなりより熱安定性であった(表13、表14)。50℃で、TSHR-WTは半減期33分を有し、TSHR-JMG37は半減期110分を有し、且つTSHR-WTよりも3.4倍熱安定性であり、TSHR-JMG45は半減期173分を有し、且つTSHR-WTよりも5.3倍熱安定性であり、TSHR-JMG52は半減期175分を有し、且つTSHR-WTよりも5.4倍熱安定性であり、並びにTSHR-JMG55は半減期226分を有し、TSHR-WTよりも6.9倍熱安定性である(図8)。
TSHR260変異体及び完全長TSHRに結合するM22-POD、K1-18 POD及びK1-70 PODを、TSHR260変異体又は完全長TSHR変異体によりコートされたELISAプレートに結合するTRAb-ペルオキシダーゼコンジュゲート(すなわち、M22-POD、K1-18 POD又はK1-70 POD)の濃度を変動し、並びに基質テトラメチルベンジジンと一緒にインキュベーションすることによるTRAb-ペルオキシダーゼコンジュゲートの結合を検出することにより、試験した。受容体(TSHR又はTSHR260変異体)の半分がリガンドに結合されるリガンド(TRAb-ペルオキシダーゼ)の濃度である結合定数(Kd)を、TSHR260-WT又は適切なら完全長TSHR-WTの結合定数に対して決定した。試験した変異は、M22-POD、K1-18-POD又はK1-70-PODのいずれかへの完全長TSHR又はTSHR260の結合に影響を及ぼさなかった(表15から表21)。
M22-PODとのインキュベーション前に、受容体(TSHR260変異体及び完全長TSHR変異体)を、M22と同じ部位で結合する変動する濃度のK1-18 IgG及びK1-70 IgGとインキュベーションすることは、M22-POD結合の阻害を測定し、且つこれは受容体-抗体相互作用が、熱安定化変異により影響を受けたかどうかを示す。K1-18 IgG及びK1-70 IgGは、M22-PODのTSHR260変異体及び完全長TSHR変異体への結合を、各々、TSHR260-WT及び完全長TSHR-WTへの結合と同じ程度、阻害する。これらの結果は、これらの変異は、モノクローナルTSHR抗体のTSHR260又は完全長TSHRへの結合には影響を及ぼさないことを指摘している(表22から表25)。
TSHR260及び完全長TSHRの熱安定化された変異体が、患者血清中のTRAbを検出するアッセイにおける使用に適しているかどうかを決定するために、患者血清が、M22-PODのTSHR260-WT、TSHR260-JMG52、TSHR260-JMG55、完全長TSHR-WT、TSHR-JMG45及びTSHR-JMG52への結合を阻害する能力を、測定した(図12c、図14e)。患者血清は、M22-PODのTSHR260-JMG52及びTSHR260-JMG55への結合を、TSHR260-WTへの結合と同様に阻害した(表27、表29)。更に、患者血清は、M22-PODの完全長TSHR-JMG45及び完全長TSHR-JMG52への結合を、完全長TSHR-WTへの結合と同様に阻害した(表28、表29)。従って、熱安定性TSHR260又は完全長TSHR変異体は、患者血清中のTRAbを検出するアッセイにおける使用に適している。
TSH、M22 Fab及びK1-18 IgGによる完全長TSHR及び完全長TSHR変異体(FlpIn CHO細胞において発現される)の刺激を、異なる濃度範囲のTSH、M22-Fab又はK1-18 IgGを使用し生成されたサイクリックAMPの量を測定することにより、決定した。各アッセイにおいて、TSHR変異体の刺激を、同じアッセイにおいて検出されたTSHR-WTの刺激と比較した。EC50、すなわち最大刺激反応の50%を生じる作用物質(TSH、M22-Fab、又はK1-18 IgG)の濃度を、各変異体について計算し、TSHR-WTと比較した(表30から表39)。驚くべきことに、これらの変異は、TSH、M22又はK1-18による刺激に反応したサイクリックAMP生成に対する、顕著な作用を有さなかったが、四重変異体TSHR-JMG45(I253R+D143P+R112P+D151E)、五重変異体TSHR-JMG52(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R)及び六重変異体TSHR-JMG55(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R+H63C)について、TSHR-WTと比べ、M22のEC50において小さい増加が存在した(表38)。
異なる哺乳動物種から現在入手可能なTSHR配列の間には、高い配列相同性(86~97.5%配列同一性)が存在する。このことは、ヒトTSHR(hTSHR)において確定された熱安定化変異のほとんどは、これらの相同体において熱安定化することを示唆している。表42は、熱安定性を向上するためにヒトTSHRにおいて変異されたアミノ酸のほとんどは、種を超えて保存されることを示している。Pro28、Leu59、Thr62、Leu64、Arg112、Pro142、Asp143、Asp151、Ser166、Pro168、Asn170、Thr179及びIle253は、全ての種を超えて保存されている(表42)。熱安定化変異H63Cの場合、63位は、Hisではなく、イヌTSHRにおいてはGlnであり、且つアカゲザル及びミドリザルの両方においてはArgである。これらの残基は、His及びCysの両方と極めて異なるので、Cysへの変異が、依然熱安定化するかどうかを予測することは困難である。マウス、ラット及びヒツジの熱安定化変異I167Fに関して、167位は、IleではなくValである。Ile及びValは両方共類似した脂肪族アミノ酸であるので、恐らくPheへの変異は依然、熱安定化するであろう。熱安定化変異V169Rの場合、169位は、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、ヒツジ及びウマのTSHR配列においてはAlaであり、これはヒトにおいて存在する脂肪族Valに類似しており、従って、Argへの変異も、これらのTSHRにおいて熱安定化するであろうと予想される。対照的に、マウス及びラットにおいて、残基169はGluであり、これはArgのように帯電された残基であり、従ってArgへの変異は、ヒトTSHRにおけるような、劇的な安定化作用を有さないだろう。熱安定化変異R255Yに関して、マウス及びラットは、255位に、他のTSHR配列に存在するArgではなく、Lysを有し、これらは両方共正帯電したアミノ酸である。従ってTyrへの変異は依然、255位で熱安定化することができるだろう。
更に2種の熱安定性五重TSHR260変異体を作製し、熱安定性について試験し:TSHR260-JMG57(I253R+D143P+R112P+V169R+H63C)(各々、配列番号:45、36、34、41及び32)及びTSHR260-JMG58(I253R+D143P+R112P+S166T+H63C)(各々、配列番号:45、36、34、38及び32)は、それぞれ、55℃での半減期40±2分及び31.4±0.4分を有し、四重変異体TSHR260-JMG45よりも熱安定性は1.64±0.07倍及び1.28±0.05倍である。TSHR260-JMG57及びTSHR260-JMG58はまた、M22-POD結合アッセイの阻害において、患者血清を検出する能力を維持している(図12c、表44)。
本アッセイ(図13a)は、固定された完全長野生型TSHRとアルカリホスファターゼ標識されたTSHR260変異体(TSHR260-AP-I253R、TSHR260-AP-JMG22、TSHR260-AP-JMG37、TSHR260-AP-JMG45、TSHR260-AP-JMG52、TSHR260-AP-JMG55、TSHR260-AP-JMG57及びTSHR260-AP-JMG58)の間に架橋を形成する、ヒトモノクローナル刺激型TSHR自己抗体(M22 IgG及びK1-18 IgG)並びにヒトモノクローナル遮断型TSHR自己抗体(K1-70 IgG)の二価の特性に頼っている(配列番号については「安定化アミノ酸変異を含むTSHR260-AP構築体の作製」参照)。健常血液ドナー血清のプール中に希釈した場合、M22 IgG、K1-70 IgG及びK1-18 IgGは全て、類似した用量依存的様式でTSHR260-AP変異体及び野生型TSHR260-APに結合した(表45a-c;e-g)。更に、アッセイ緩衝液に希釈した場合、M22 IgG、K1-70 IgG及びK1-18 IgGは全て、類似した用量依存的様式でTSHR260-AP変異体及び野生型TSHR260-APへ結合した(表46a-c;e-g)。健常血液ドナー血清又はアッセイ緩衝液中に希釈したGADに対する陰性対照ヒトモノクローナル自己抗体(5B3 IgG)を、結合について試験した(表45d及び表46d)。5B3 IgG(陰性対照抗体)と野生型TSHR260-AP又はTSHR260-AP変異体のいずれかの間に、結合は認められなかった(健常血液ドナー血清中に希釈したものについては吸光度値0.0016-0.033、及びアッセイ緩衝液中に希釈したものについては0.001-0.034)。これらの実験は、刺激活性又は遮断活性のいずれかを持つヒトモノクローナルTSHR自己抗体のアルカリホスファターゼ標識されたTSHR260変異体へ結合する能力を明らかにしている。
12種のTRAb陽性患者血清(G1-G12)及び11種のTRAb陰性患者血清(N1-N11)を、二価で結合し、且つ固定された完全長TSHRとアルカリホスファターゼ標識されたTSHR260 (TSHR260-AP)変異体(TSHR260-AP-I253R、TSHR260-AP-JMG22、TSHR260-AP-JMG37、TSHR260-AP-JMG45、TSHR260-AP-JMG52、TSHR260-AP-JMG55、TSHR260-AP-JMG57及びTSHR260-AP-JMG58)の間に架橋を形成するそれらの能力について試験した(図13a)。TRAb陽性及びTRAb陰性血清の結合は、野生型及び変異体TSHR260-APの両方について類似していた(表47a)。各患者血清についてのTRAb濃度を計算するためのK1-70 IgG標準曲線の使用は、変異体TSHR260-AP構築体について計算したTRAb濃度は、野生型TSHR260-APアッセイの平均に匹敵することを示した(表47b)。野生型TSHR260-APで決定された平均TRAb濃度に比べた、各TSHR260-AP変異体で得られたアッセイ結果についてピアソン相関を行い、良好なr-値を生じ(表47c)、これは患者血清TRAbは、野生型TSHR260-AP及びTSHR260-AP変異体へ同様の様式で結合することを明らかにしている。
TSHR260-AP変異体の半減期(t1/2)を、2つ組測定を用い、各TSHR260-AP構築体について、各温度で、時間経過データ(0時間-3時間)を指数関数曲線にフィットすることにより計算した(図13b)。試験した各構築体の、各温度での半減期を、表48に示している。各TSHR260-AP変異体に関する半減期を、TSHR260-AP-JMG45(65℃)、TSHR260-AP-JMG22(60℃)又はTSHR260-AP-WT(50℃)の半減期と比較した。これから、予測された安定性比を計算し、TSHR260-AP-WTと比較した各TSHR260-AP変異体の全般的安定性を示すことができる。TSHR260-AP-JMG22、TSHR260-AP-JMG45及びTSHR260-AP-JMG55は、TSHR260-AP-WTよりも、各々、およそ11倍、66倍及び165倍大きい半減期を有した。TSHR260-AP-WTとTSHR260-AP変異体の間の安定性の増大は、アルカリホスファターゼ融合タンパク質を伴わないTSHR260と比べ減少されたが、TSHR260-AP構築体の熱安定性は、アルカリホスファターゼを伴わない同等の構築体よりも大きかった。50℃でのTSHR260-AP-WTの半減期は、野生型TSHR260(アルカリホスファターゼを伴わず)の半減期よりも2.9倍大きかった。同様に、60℃でTSHR260-AP-JMG45及びTSHR260-AP-JMG55は、アルカリホスファターゼを伴わない同等のTSHR260構築体よりも、各々、3.2倍及び1.5倍大きい半減期を有した。
陰イオン交換クロマトグラフィーを使用する精製の後、溶出した野生型TSHR260プールは、TSHR260架橋阻害ELISAにおいて、陰イオン交換カラム上に装加された最初の物質よりも、およそ1/80の活性を含んだ(図25a)。これらの結果は、野生型TSHR260は、精製の間、本質的に不安定であり、陰イオン交換クロマトグラフィー精製のわずか1ラウンドの後、1/80までの活性の喪失を伴うことを確認している。
先に本発明者らは、TSHR260(野生型)は、ヒトモノクローナル甲状腺刺激性自己抗体M22との複合体において、安定化され、精製され及び結晶化され得ることを示した(WO 2008/025991A1)。M22は、TSHR260断片へ高親和性(5×1010L/mol)で結合するが、容易に解離せず、且つTSHR260断片への患者血清自己抗体の結合を阻害する(EP 1565493B1、Nakatakeらの文献、(2006) Thyroid, 16: 1077-1084)。従って、TSHR260-M22の複合体の形成及び精製は、患者自己抗体のTSHRへの結合を検出するアッセイシステムにおいて使用するため又は他の目的のための複合されないTSHR260の精製方法としては、使用することができない。
TSHR260-JMG55を含有する昆虫細胞培養物上清36Lの陽イオン交換クロマトグラフィーによる最初の精製は、TSHR260結合アッセイにおいて測定した30U/mgから15,872U/mgへの、TSHR260-JMG55の比活性の529倍の増加を示した(図12a、表49)。TSHR260-JMG55の単位は、「Freestyle Max試薬を使用するTSHR260変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション」において説明したように、TSHR260標準に対して規定される。
Endo F3非含有の脱グリコシル化緩衝液中の精製されたTSHR260-JMG55-4.5の1、3及び5日間の20℃でのインキュベーションは、分子量が減少しないことを示した(図28A)。対照的に、40mU/mg、60mU/mg又は80mU/mgのEndo F3によるTSHR260-JMG55-4.5の脱グリコシル化は、各々、120時間、72時間及び24時間での分子量のおよそ2kDaの最大減少を生じた(図28A及び28B)。20℃で120時間インキュベーションした後の脱グリコシルされたTSHR260-JMG55-4.5の活性の分析は、TSHR260-結合アッセイにおいて決定し(図12a)、且つ-70℃で貯蔵した未処置の精製TSHR260-JMG55-4.5物質の活性と比較した(表52)。TSHR260-JMG55-4.5の無酵素(0mU/mg)、酵素40mU/mg、60mU/mg又は80mU/mgとのインキュベーションは、それぞれ、未処置の精製TSHR260-JMG55-4.5物質の活性の、111%、100%、104%及び104%を生じた。
最も熱安定性の高いヒトTSHR変異体であるJMG55(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R+H63C)の同等の変異を、マウスTSHR(I253R+D143P+R112P+D151E+E169R+H63C)(図23;ヌクレオチド配列は配列番号:67及び図24;アミノ酸配列は配列番号:68)及びブタTSHR(I253R+D143P+R112P+D151E+A169R+H63C)(図21;ヌクレオチド配列は配列番号:65及び図22;アミノ酸配列は配列番号:66)へ移入した(表54)。6つの変異型残基中の5つは、ヒト、マウス及びブタのTSHRで同一であった。残基169のみ、種間で異なり:ヒトTSHRにおいてこれはバリンであり、マウスTSHRにおいてこれはグルタミン酸であり、且つブタTSHRにおいてこれはアラニンである。マウス及びブタの両方のTSHR残基169は、ヒトTSHR-JMG55におけるようにアルギニンへ変異された。完全長変異体マウスTSHR及びブタTSHRを、熱安定性125I-TSHとの結合親和性及びCHO細胞へトランスフェクトされた場合の刺激に対する反応性に関して、それぞれの完全長野生型TSHRと比較した。
完全長野生型及び変異型マウス、ブタ及びヒトTSHRの熱安定性を、安定性アッセイBにおいて45℃で測定した(図14c)。安定性アッセイBは、TSHR変異体の4E31-コートされたプレートへの一晩の結合、その後のプレートの水浴中45℃での最大3時間の加熱に関与している。加熱後に残存する活性TSHRの割合は、TSHR-結合アッセイにおいて測定する(図14a、表55)。
完全長野生型マウス及びブタTSHR並びに完全長マウス及びブタTSHR-JMG55同等変異体の、TSH及びM22 Fabによる刺激(表54)(Flp-In CHO細胞において発現された)を、2種のTSHR作用物質(TSH又はM22-Fab)の異なる濃度範囲で生成されたサイクリックAMPの量を測定することにより、評価した。各アッセイにおいて、TSHR変異体の刺激は、TSHR-WTの刺激と比較した(同じアッセイにおいて測定)。EC50、すなわち最大刺激反応の50%を生じる作用物質の濃度を、各変異体について算出し、且つTSHR-WTと比較した(表56及び表57)。完全長ヒトTSHR-WT及び完全長ヒトTSHR-JMG55変異と同様に、JMG55の同等な変異は、同等のマウス又はブタTSHR-WTと比べ、TSH又はM22による刺激に反応したサイクリックAMP生成に対する顕著な作用を有さなかった。
ヒト、マウス及びブタの野生型TSHR(CHO細胞において発現され且つ界面活性剤可溶化された)への125I-TSH結合は、各々、類似した親和定数1.80×109L/mol、1.58×109L/mol及び1.99×109L/molを生じた(表58)。界面活性剤可溶化された完全長変異型ヒト(JMG55)、マウス及びブタTSHR(JMG55同等物;表54)への125I-TSH結合も、同じく野生型TSHRに比し類似した親和定数(各々、0.98×109L/mol、0.87×109L/mol及び1.25×109L/mol)を示した。このことは、TSHの完全長TSHRへの結合は、異なるTSHR種においてJMG55同等なTSHR変異により影響されないことを示している。
合計で56種のTSHRの膜貫通ドメイン内の可能性のある熱安定化変異を確定した:10種のTSHRコンセンサス変異、19種のTSHR不活性化変異、26種のGPCR熱安定化変異、並びに1種のTSHRにおいて不活性化し且つβ1-アドレナリン受容体において熱安定化するの両方である変異(Y601A)(表59)。これらの単一変異を、既にLRDに位置した6つの熱安定化変異(I253R、D143P、R112P、D151E、H63C及びV169R) (配列番号:45、36、34、37、32及び41)を含む、完全長TSHR-JMG55に加えた。
3種の単一TSHR-JMG55 TMD変異体T477I、V595I及びI648L(図30;各々、配列番号:97、100及び103)は、3つの熱安定性アッセイ全てにおいて熱安定性をかなり増大したので、これらを更なる変異誘発のために選択した。これらの3種の変異は、互いに及び他の最も熱安定化する単一変異(n=17)と組合せて、TSHR-JMG55の二重変異体を形成した(表61並びに図29及び30;各々、配列番号:69-88及び配列番号:89-108)。変異体JMG59からJMG73は、T477Iと組合せ、変異体JMG74からJMG92は、V595Iと組合せ、及びJMG93からJMG111は、I648Lと組合せる。JMG66とJMG82は同一であり(JMG55+T477I+V595I)、JMG68とJMG101は同一であり(JMG55+T477I+I648L)、並びにJMG87とJMG104は同一である(JMG55+V595I+I648L)。構築体JMG85(JMG55+V595I+C600R)は、変異V595I及びC600Rは非常に近く且つ恐らく互いに干渉するので、作製しなかった。
TSHR-JMG91及びTSHR-JMG84は、二重TSHR変異体熱安定性アッセイにおいて熱安定化された15種の単一変異と組み合わせた(表61)。安定性アッセイCにおけるこれらの変異体の増大した熱安定性のために、可溶化されたTSHR変異体を、先に使用した33℃の代わりに、40℃で加熱した。三重変異体の一部は、安定性アッセイA及びBにおいて、二重変異体TSHR-JMG91(JMG55+V595I+Y678L)又はTSHR-JMG84(JMG55+V595I+K565L)に対し熱安定化されるのに対し、TSHR-JMG84上に構築された完全長TSHR-JMG55の三重TMD変異体(JMG127からJMG142)のみ、熱安定性アッセイCにおいて40℃で熱安定化される(表64)。TSHR-JMG55の三重変異体の全般的に最大の熱安定化は、TSHR-JMG131(JMG55+V595I+K565L+N455A)[JMG55(配列番号:45、36、34、37、32、41)+V595I(配列番号:100)+K565L(配列番号:99)+N455A (配列番号:93)]である。安定性アッセイAにおいて、TSHR-JMG131は、55℃での半減期60分を有し、これはTSHR-JMG84の半減期38±4分を1.5倍向上した。55℃での安定性アッセイBにおいて、TSHR-JMG131は、半減期32分を有し、これはTSHR-JMG84の半減期23±7分を1.1倍向上した。40℃での安定性アッセイCにおいて、TSHR-JMG131は、47分の半減期を有し、これは、40℃で半減期14±3分を有するTSHR-JMG84よりも熱安定性が3.5倍上回る。
完全長TSHR変異体、TSHR-JMG55、TSHR-JMG55-V595I、TSHR-JMG84(JMG55+V595I+K565L)及びTSHR-JMG91(JMG55+V595I+Y678L)に結合するM22-POD、K1-18-POD及びK1-70-PODを、TSHR変異体でコートされたELISAプレートに結合するTRAb-ペルオキシダーゼコンジュゲート(すなわち、M22-POD、K1-18 POD又はK1-70 POD)の濃度を変動し、且つ基質テトラメチルベンジジンとのインキュベーションによりTRAb-ペルオキシダーゼコンジュゲートの結合を検出することにより、試験した(図14a)。結合定数(Kd)、すなわち、受容体の半分がリガンドに結合するリガンド(TRAb-ペルオキシダーゼ)の濃度を、決定した(表65)。試験した変異は、TSHR-JMG55と比べ、TSHR変異体のM22-POD、K1-18-POD又はK1-70-PODのいずれかへの結合に影響を及ぼさなかった(表65から表67)。
完全長TSHR-JMG55変異体TSHR-JMG55、TSHR-JMG55-V595I、TSHR-JMG84(JMG55+V595I+K565L)及びTSHR-JMG91(JMG55+V595I+Y678L)へのM22-POD結合の阻害を、TSHR変異体をM22 IgG、K1-18 IgG、K1-70 IgG又はTRAb陽性患者血清とインキュベーションし、その後M22-PODとインキュベーションすることにより、決定した(図14e)。M22 IgG、K1-18 IgG、K1-70 IgG及びTRAb陽性患者血清は、M22-PODの完全長TSHR変異体への結合を、TSHR-JMG55と同じ程度に、阻害する。これらの結果は、これらの変異は、モノクローナルTSHR抗体の完全長TSHRへの結合に影響を及ぼさないことを示している(表68から表70)。同様に、TRAb陽性患者血清は、TSHR-JMG55と類似した、TSHR-JMG55変異体へのM22-POD結合の阻害を示す(表71)。従って、これらの完全長TSHR変異体は、患者血清中のTRAbを検出するためのアッセイにおける使用に適している。
表72は、熱安定性を向上するためにヒトTSHRにおいて変異されたTMD内に位置したアミノ酸のほとんどは、ヒト、マウス及びブタのTSHRを超えて保存されていることを示している。Glu409、Asp410、His443、Leu452、Asn455、Met463、Tyr466、Leu467、Thr477、Gln489、Lys565、Cys600、Tyr601、Lys660、Tyr667、Ser671及びTyr678は、全ての種を超えて保存されている。残基595は、ヒト及びマウスにおいてはValであるが、しかしブタにおいてはThrである。ブタTSHRにおけるThr595のIleへの変異は恐らく、熱安定化されるであろう。残基648は、ヒトにおいてはIleであるが、マウス及びブタにおいてはLeuである。従って、マウス及びブタのTSHRは、既にhTSHRにおけるI648L熱安定化変異の標的残基を有する。別の脂肪族残基であるValへの変異は、熱安定性を変更し得る。
本発明は、理論的-系統的変異誘発を基に、TSHRなどの、糖タンパク質ホルモン受容体タンパク質の熱安定性を向上する新規アプローチを示す。ここで、わずかな安定化する変異を理論的に設計するアプローチは、TSHR配列中の熱安定化位置を確定するために、タンパク質内の各残基をアラニンへ変異する系統的変異誘発アプローチの力と組合せられる。理論的-系統的変異誘発アプローチにおいて、TSHRタンパク質における各位置に関して、最も可能性のある安定化変異(コンピュータ法又は理論的方法の組合せにより、本発明者らにより予測された)が、作製され、且つ熱安定化特性について試験される。本発明において、ハイスループット法は、最も熱安定化する変異を確定するために、多くの変異体を作製し且つスクリーニングすることを可能にする。これは、その他の点で可能性のあるものよりも、TSHR配列中のより熱安定化する変異の確定を可能にした。本発明に記載の方法は、他のタンパク質の熱安定性を向上するために適用することもできる。本発明の方法は、特に、TSHR260の熱安定性を最大900倍向上する、より熱安定性のTSHR260変異体を作製するためにうまく組合せられるTSHR260の17種の大いに熱安定化する変異(P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y)の確定が可能である(図5及び6;配列番号:11-25、27-43、45及び46)。これらの変異体は依然、TSHR260-WTと類似の方式で、TSHRを刺激するヒト自己抗体M22に結合する。最も安定化した単一(TSHR260-I253R)(配列番号:45)、二重(TSHR260-JMG22:I253R(配列番号:45)+D143P(配列番号:36))、三重(TSHR260-JMG37:I253R(配列番号:45)+D143P(配列番号:36)+R112P(配列番号:34))、四重(TSHR260-JMG45:I253R(配列番号:45)+D143P(配列番号:36)+R112P(配列番号:34)+D151E(配列番号:37))、五重(TSHR260-JMG52:I253R(配列番号:45)+D143P(配列番号:36)+R112P(配列番号:34)+D151E(配列番号:37)+V169R(配列番号:41))、並びに六重(TSHR260-JMG55:I253R(配列番号:45)+D143P(配列番号:36)+R112P(配列番号:34)+D151E(配列番号:37)+V169R(配列番号:41)+H63C(配列番号:32))のTSHR260変異体の熱安定性は、各々、TSHR260の熱安定性を、およそ3.1、13、42、174、450、700及び900倍向上する。更に、完全長TSHRの場合、三重(TSHR-JMG37:I253R+D143P+R112P)、四重(TSHR-JMG45:I253R+D143P+R112P+D151E)、五重(TSHR-JMG52:I253R+D143P+R112P+D151E+V169R)、並びに六重(TSHR260-JMG55:I253R+D143P+R112P+D151E+V169R+H63C)のTSHR変異体は、完全長野生型TSHRに対する熱安定性を向上する。
M22は、TSHRに対するヒトモノクローナル自己抗体である。
実験1:TSHR-WTに関して:EC50(M22)=1.62ng/mL、EC50(TSH)=1.02ng/mL。TSHR-JMG37に関して:EC50(M22)=0.94ng/mL、EC50(TSH)=0.39ng/mL。
実験2:TSHR-WTに関して: EC50(M22)=2.13ng/mL、EC50(TSH)=0.77ng/mL。TSHR-JMG37に関して:EC50(M22)=3.10ng/mL、EC50(TSH)=0.86ng/mL。
実験1:TSHR-WTに関して:EC50(M22)=1.52ng/mL、EC50(TSH)=0.82ng/mL。TSHR-JMG45に関して:EC50(M22)=5.37ng/mL、EC50(TSH)=0.84ng/mL。
実験2:TSHR-WTに関して:EC50(M22)=1.97ng/mL、EC50(TSH)=0.64ng/mL。TSHR-JMG45に関して:EC50(M22)=4.03ng/mL、EC50(TSH)=0.63ng/mL。
実験1:TSHR-WTに関して:EC50(M22)=1.92ng/mL、EC50(TSH)=0.42ng/mL。TSHR-JMG52に関して:EC50(M22)=3.72ng/mL、EC50(TSH)=0.43ng/mL。
実験2:TSHR-WTに関して: EC50(M22)=1.40ng/mL、EC50(TSH)=0.67ng/mL。TSHR-JMG52に関して:EC50(M22)=3.27ng/mL、EC50(TSH)=0.99ng/mL。
実験1:TSHR-WTに関して:EC50(M22)=1.53ng/mL、EC50(TSH)=1.11ng/mL。TSHR-JMG55に関して:EC50(M22)=2.87ng/mL、EC50(TSH)=0.934ng/mL。
実験2:TSHR-WTに関して:EC50(M22)=1.30ng/mL、EC50(TSH)=0.445ng/mL。TSHR-JMG55に関して:EC50(M22)=3.90ng/mL、EC50(TSH)=0.609ng/mL。
実験1:TSHR-WTに関して:EC50(K1-18)=13.3ng/mL、EC50(TSH)=0.64ng/mL。TSHR-JMG37に関して:EC50(K1-18)=11.3ng/mL、EC50(TSH)=0.53ng/mL。
実験2:TSHR-WTに関して:EC50(K1-18)=12.8ng/mL、EC50(TSH)=0.71ng/mL。TSHR-JMG37に関して:EC50(K1-18)=11.1ng/mL、EC50(TSH)=0.58ng/mL。
実験1:TSHR-WTに関して:EC50(K1-18)=12.9ng/mL、EC50(TSH)=0.57ng/mL。TSHR-JMG45に関して:EC50(K1-18)=22.5ng/mL、EC50(TSH)=0.63ng/mL。
実験2:TSHR-WTに関して:EC50(K1-18)=17.8ng/mL、EC50(TSH)=0.82ng/mL。TSHR-JMG45に関して:EC50(K1-18)=16.0ng/mL、EC50(TSH)=0.77ng/mL。
実験1:TSHR-WTに関して:EC50(K1-18)=17.9ng/mL、EC50(TSH)=0.69ng/mL。TSHR-JMG52に関して:EC50(K1-18)=14.9ng/mL、EC50(TSH)=0.51ng/mL。
実験2:TSHR-WTに関して:EC50(K1-18)=14.3ng/mL、EC50(TSH)=1.00ng/mL。TSHR-JMG52に関して:EC50(K1-18)=19.7ng/mL、EC50(TSH)=0.99ng/mL。
実験1:TSHR-WTに関して:EC50(K1-18)=11.1ng/mL、EC50(TSH)=0.50ng/mL。TSHR-JMG55に関して:EC50(K1-18)=14.3ng/mL、EC50(TSH)=0.48ng/mL。
実験2:TSHR-WTに関して:EC50(K1-18)=12.0ng/mL、EC50(TSH)=0.62ng/mL。TSHR-JMG55に関して:EC50(K1-18)=28.2ng/mL、EC50(TSH)=0.81ng/mL。
a:14C4活性は、TSHR結合アッセイにおいて検出されたような、14C4-コートされたELISAプレートウェルに結合した場合の、非加熱試料の活性である。安定性アッセイAにおける使用に関して、試料は、14C4活性10U/mLまで希釈した。U/mlの定義に関しては、「Freestyle Max試薬を使用する完全長TSHR変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション」の項を参照されたい。
b:4E31活性は、TSHR結合アッセイにおいて検出されたような、4E31-コートされたELISAプレートウェルに結合した場合の、非加熱試料の活性である。安定性アッセイBにおける使用に関して、試料は、4E31活性10U/mLまで希釈し、且つ安定性アッセイCにおける使用に関しては、試料は、最終濃度12.5U/mlまで希釈した。U/mlの定義に関しては、「Freestyle Max試薬を使用する完全長TSHR変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション」を参照されたい。
c:安定性アッセイA及びBにおいて、各変異体の半減期は、14C4-プレート(安定性アッセイA、図14b)又は4E31-コートされたELISAプレートウェル(安定性アッセイB、図14c)のTSHR変異体によるコーティングにより決定される。結合したTSHRを伴うプレートのストリップは、55℃で最大2時間加熱した。活性TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットし、且つ指数関数的減衰曲線にフィットさせた。各実験において、TSHR-JMG55の熱安定性(半減期、t1/2)を測定し、これを使用し、同じ実験におけるTSHR-JMG55変異体の半減期と比較した半減期比を決定した。
d:安定性アッセイC(図14d)において、各TSHR-JMG55変異体の可溶化されたアリコートを、溶液中、33℃で最大2時間加熱した。活性TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットし、且つ二相指数関数的減衰曲線にフィットさせた。10、30及び120分間加熱後に残存する活性TSHR-JMG55変異体の割合を、算出し、且つTSHR-JMG55と比較した。見かけの半減期は、TSHR-JMG55変異体が、その活性の半分を喪失する時点である。これを使用し、同じ実験において測定したTSHR-JMG55の見かけの半減期により除算することにより、半減期比を算出した。
太字は、二重変異体の作製に使用した、20種の最も熱安定化している変異体である。実験は、2つ組でアッセイされた各アッセイにおいて、各変異体について1回行った。「n.d.」=決定されず(determined)。
JMG66は、JMG82と同一であり、JMG68は、JMG101と同一であり、及びJMG87は、JMG104と同一である。変異V595I及びC600Rは、非常に近く且つ恐らく互いに干渉することが見込まれるので、JMG85構築体は作製されなかった。
a:14C4活性は、TSHR結合アッセイにおいて検出されたような、14C4-コートされたELISAプレートウェルに結合した場合の、非加熱試料の活性である。U/mlの定義に関しては、「Freestyle Max試薬を使用する完全長TSHR変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション」を参照されたい。
b:4E31活性は、TSHR結合アッセイにおいて検出されたような、4E31-コートされたELISAプレートウェルに結合した場合の、非加熱試料の活性である。安定性アッセイCにおける使用に関しては、試料は、最終濃度12.5U/mlまで希釈した。U/mlの定義に関しては、「Freestyle Max試薬を使用する完全長TSHR変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション」を参照されたい。
c:安定性アッセイCにおいて、各TSHR変異体の可溶化されたアリコートを、溶液中、33℃で最大2時間加熱した。残存する活性TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットした(図14d)。10、30及び120分間加熱後に残存する活性TSHR変異体の割合を、算出し、且つJMG59からJMG73についてTSHR-JMG55-T477Iと、JMG74からJMG92の場合はTSHR-JMG55-V595Iと、又はJMG93からJMG111についてはTSHR-JMG55-I648Lと比較した。加えて、見かけの半減期は、TSHR-JMG55変異体が、その活性の半分を喪失する時点である。これを使用し、同じ実験において測定したTSHR-JMG55-T477I、TSHR-JMG55-V595I又はTSHR-JMG55-I648Lの見かけの半減期により除算することにより、半減期比を算出した。
実験は、(2つ組でアッセイされた)各アッセイにおいて、各変異体について1回行った。「n.d.」=決定されず。
a:安定性アッセイA及びBにおいて、各変異体の半減期は、最初に、14C4-コートされたELISAプレートウェルへの(安定性アッセイA、図14b)又は4E31-コートされたELISAプレートウェル(安定性アッセイB、図14c)への変異体の結合により測定した。結合した変異体TSHRを伴うプレートウェルのストリップは、55℃で最大2時間加熱した。残存する活性変異体TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットした。各実験において、TSHR-JMG55-V595Iの熱安定性(半減期、t1/2)を測定し、これを使用し、同じ実験におけるTSHR-JMG55-V595Iの半減期と比較した各変異体に関する半減期比を決定した。
b:安定性アッセイC(図14d)において、TSHR変異体の可溶化されたアリコートを、溶液中、33℃で最大2時間加熱した。活性TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットした。10、30及び120分間加熱後に残存する活性TSHR変異体の割合を、算出し、且つTSHR-JMG55-V595Iと比較した。見かけの半減期は、TSHR-JMG55変異体が、その活性の半分を喪失する時点である。これを使用し、同じ実験において測定したTSHR-JMG55-V595Iの見かけの半減期により除算することにより、半減期比を算出した。
全体で最も熱安定化変異体であるJMG91及びJMG84は、太字で示し、且つこれらを、三重変異体作製の基本として使用した。実験は、(2つ組でアッセイされた)各アッセイにおいて、各変異体について1回行った。「n.d.」=決定されず。
a:安定性アッセイA(図14b)及びB(図14c)において、各変異体の半減期は、最初に、14C4-コートされたELISAプレートウェルへの(安定性アッセイA)又は4E31-コートされたELISAプレートウェル(安定性アッセイB)への変異体の結合により測定した。結合した変異体TSHRを伴うプレートウェルのストリップは、55℃で最大2時間加熱した。残存する活性変異体TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットした。各実験において、TSHR-JMG91又はTSHR-JMG84の熱安定性(半減期、t1/2)を測定し、これを使用し、同じ実験におけるTSHR-JMG91又はTSHR-JMG84の半減期と比較した各変異体に関する半減期比を決定した。
c:安定性アッセイC(図14d)において、TSHR変異体の可溶化されたアリコートを、溶液中、40℃で最大2時間加熱した。残存する活性TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットし、二相指数関数的減衰曲線にフットさせた。10、30及び120分間加熱後に残存する活性TSHR変異体の割合を、算出し、且つTSHR-JMG91又はTSHR-JMG84と比較した(JMG112からJMG126はTSHR-JMG91と比較し、且つJMG127からJMG142はTSHR-JMG84と比較した)。同じく見かけの半減期は、TSHR-JMG55変異体が、その活性の半分を喪失する時点と決定した。これを使用し、同じ実験において測定したTSHR-JMG91又はTSHR-JMG84の見かけの半減期により除算することにより、半減期比を算出した。
実験は、(2つ組でアッセイされた)各アッセイにおいて、各変異体について1回行った。「n.d.」=決定されず。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
(構成1)
1つ以上の変異を含む、変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片であって、ここで該変異体TSHRが、同等の野生型TSHR又は断片に対して増大した熱安定性を有する、前記変異体TSHR又はその断片。
(構成2)
前記1つ以上の変異が、TSHRの細胞外ロイシン-リッチ反復ドメイン(LRD)内にある、構成1記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成3)
前記1つ以上の変異が、TSHRの残基22~260(TSHR260)内にある、構成1又は2記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成4)
前記TSHR又はその断片が、哺乳動物種に由来する、構成1~3のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成5)
前記TSHR又はその断片が、ヒトTSHR由来であるか、又はこれから誘導される、構成4記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成6)
前記TSHR又はその断片が、サル、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ヒツジ又はウマのTSHR(配列番号:47-56)由来であるか、又はこれらから誘導される、構成4記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成7)
TSHR自己抗体に結合する、構成1~6のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成8)
前記TSHR自己抗体が、M22、K1-70又はK1-18である、構成7記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成9)
前記変異体の42℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも1.5倍以上大きい、構成1~8のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成10)
前記変異体の42℃での半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも2倍以上大きい、構成9記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成11)
前記変異体の42℃での半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも3倍以上大きい、構成9又は10記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成12)
前記変異体が、単一点変異を含む、構成1~11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成13)
前記変異体が、二重点変異を含む、構成1~11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成14)
前記変異体の42℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも3.5倍以上大きい、構成13記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成15)
前記変異体の42℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも5倍以上大きい、構成13又は14記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成16)
前記変異体の42℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも7倍以上大きい、構成13、14又は15記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成17)
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも3倍以上大きい、構成13~16のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成18)
前記変異体が、三重点変異を含む、構成1~11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成19)
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253Rを含むTSHR260変異体の半減期よりも9倍以上大きい、構成18記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成20)
前記変異体が、四重点変異を含む、構成1~11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成21)
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253R(配列番号:27及び45、それぞれ、DNA及びタンパク質)を含むTSHR260変異体の半減期よりも20倍以上大きい、構成20記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成22)
前記変異体の55℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253R(配列番号:27及び45、それぞれ、DNA及びタンパク質)を含むTSHR260変異体の半減期よりも12倍以上大きい、構成20記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成23)
前記変異体が、五重点変異を含む、構成1~11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成24)
前記変異体の55℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253R(配列番号:27及び45、それぞれ、DNA及びタンパク質)を含むTSHR260変異体の半減期よりも40倍以上大きい、構成23記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成25)
前記変異体が、六重点変異を含む、構成1~11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成26)
前記変異体の55℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253R(配列番号:27及び45、それぞれ、DNA及びタンパク質)を含むTSHR260変異体の半減期よりも800倍以上大きいか、又は四重点変異I253R+D143P+R112P+D151E(配列番号:27、18、16、19(DNA)及び配列番号:45、36、34、37(タンパク質))を含むTSHR260変異体の半減期よりも1.2倍以上大きい、構成25記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成27)
前記変異体の60℃でのその半減期により決定される熱安定性が、四重点変異I253R+D143P+R112P+D151E(配列番号:27、18、16、19(DNA)及び配列番号:45、36、34、37(タンパク質))を含むTSHR260変異体の半減期よりも3倍以上大きい、構成25記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成28)
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型完全長TSHRの半減期よりも3倍以上大きい、完全長TSHR変異体である、構成1~11のいずれか一項記載の変異体TSHR。
(構成29)
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも5倍以上大きい、構成28記載の変異体TSHR。
(構成30)
前記変異体が、TSHRの残基22~260(TSHR260)内に、3つ以上の点変異を含む、構成28又は29記載の変異体TSHR。
(構成31)
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になる、構成1~27のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成32)
前記変異体が、P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y(配列番号:11-25、27及び28(DNA)、配列番号:29-43、45及び46(タンパク質))のいずれかからの単一点変異を含む、構成1~12又は28~29又は31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成33)
前記変異体が、2つの点変異を含み、その一方がI253Rであり、その二番目が、構成32記載の様々な変異である、構成1~11又は13~17又は28~29又は31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成34)
前記変異体が、3つの点変異を含み、その一つがI253R(配列番号:27及び45)であり、その二番目がD143P(配列番号:18及び36)であり、並びにその三番目がP28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D151E、S166T、P168Y、V169R及びN170W(配列番号:11-17、19-25及び28(DNA)、配列番号:29-35、37-43及び46(タンパク質))のひとつである、構成1~11又は18~19又は28~31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成35)
前記変異体が、4つの点変異を含み、その一つがI253R(配列番号:27及び45)であり、その二番目がD143P(配列番号:18及び36)であり、並びにその三番目がR112P(配列番号:16及び34)であり、並びにその四番目が、L59F、H63C、D151E、S166T、V169R及びN170W(配列番号:12、14、19、20、23及び24(DNA)、配列番号:30、32、37、38、41及び42(タンパク質))のひとつである、構成1~11又は20~22又は28~31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成36)
前記変異体が、5つの点変異を含み、その一つがI253R(配列番号:27及び45)であり、その二番目がD143P(配列番号:18及び36)であり、その三番目がR112P(配列番号:16及び34)であり、その四番目がD151E(配列番号:19及び37)又はH63C(配列番号:14及び32)であり、並びにその五番目が、L59F、H63C、D151E、S166T及びV169R(配列番号:12、14、19、20、23(DNA)、配列番号:30、32、37、38、41(タンパク質))のひとつである、構成1~11又は23~24又は28~31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成37)
前記変異体が、6つの変異を含み、そのひとつがI253Rであり、その二番目がD143P(配列番号:18及び36)であり、その三番目がR112P(配列番号:16及び34)であり、その四番目がD151E(配列番号:19及び37)であり、その五番目がH63C(配列番号:14及び32)であり、並びにその六番目がS166T(配列番号:20及び38)又はV169R(配列番号:23及び41)のいずれかである、構成1~11又は25~31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成38)
前記変異体が、P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y(配列番号:11-25、27及び28(DNA)、配列番号:29-43、45及び46(タンパク質))のいずれかから選択された1、2、3、4、5又は6の単一点変異を含む、構成1~37のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成39)
前記変異体が、TSHR260からなり、且つ同等の野生型が、野生型TSHR260からなる、構成31~37のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成40)
前記変異体が、下記の変異のセットの一つ:
1) I253R (図5及び6;配列番号:27及び45)
2) D143P+I253R (図5及び6;配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P+D143P+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P+D143P+D151E+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C+R112P+D143P+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C+R112P+D143P+S166T+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45):を含む、構成1~8又は31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成41)
前記変異体へのモノクローナルTSHR抗体又はTSHの結合が、同じモノクローナルTSHR抗体の同等の野生型TSHR又は断片への結合と比べた場合に、影響されないか、又は実質的に影響されない、構成1~40のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成42)
前記変異体が、検出可能な標識を含む、構成1~41のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成43)
前記標識が、酵素標識、同位体標識、化学発光標識、蛍光標識及び色素からなる群から選択される、構成42記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成44)
前記標識が、アルカリホスファターゼ(AP)標識又はビオチン標識を含む、構成42又は43記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成45)
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になる、構成41、42、43又は44記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成46)
前記変異体が、アルカリホスファターゼ(AP)標識を含む、構成45記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成47)
前記変異体が、構成32~40のいずれか一項以上に記載の1つ以上の変異を含む、構成46記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成48)
前記変異体が、2つ以上の点変異を含み、且つここで該変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも5倍以上大きい、構成45、46又は47記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成49)
前記変異体が、4つ以上の点変異を含み、且つここで該変異体の60℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも50倍以上大きい、構成45、46又は47記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成50)
前記変異体が、6つ以上の点変異を含み、且つここで該変異体の65℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも100倍以上大きいか又は150倍以上大きい、構成45、46又は47記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成51)
前記熱安定性が、図12bに示された安定性アッセイにより測定される、構成1~50のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成52)
膜貫通ドメイン(TMD)内に1つ以上の変異を含む変異体TSHR又はその断片であって、ここで該変異体TSHRが、同等の野生型TSHR又は断片に対して増大した熱安定性を有する、前記変異体TSHR又はその断片。
(構成53)
前記変異体TSHR又はその断片が、完全長TSHRであるか、又は完全長TSHRに比べて、該変異体中に存在するアミノ酸の数により測定される時、完全長TSHRの長さの少なくとも70%以上、少なくとも80%以上、若しくは少なくとも90%以上を含む、構成52記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成54)
前記変異体が、膜貫通ドメイン内ではない1つ以上の追加的変異を更に含み、この1つ以上の追加的変異が、構成2~51のいずれか一項以上に記載されている、構成52又は53記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成55)
前記追加的変異が、膜貫通ドメイン内ではない、少なくとも2つ以上の追加的変異を含み、この2つ以上の追加的変異が、構成2~51のいずれか一項以上に記載されている、構成54記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成56)
前記追加的変異が、六重点変異H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (TSHR-JMG55)(配列番号:14、16、18、19、23及び27(DNA)、配列番号:32、34、36、37、41及び45(タンパク質))を含む、構成55記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成57)
前記膜貫通ドメイン(TMD)内の1つ以上の変異が、膜貫通ドメイン内ではない該追加的変異のみを含む、同等の変異体TSHR又はその断片に対して、増大した熱安定性を提供する、構成54、55又は56記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成58)
前記変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が、膜貫通ドメイン内ではない該追加的変異のみを含む、同等のTSHR又は断片の半減期よりも1.2倍以上大きいか、又は1.3倍以上大きい、構成54~57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成59)
前記変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が、六重変異H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (TSHR-JMG55)(配列番号:14、16、18、19、23及び27(DNA)、配列番号:32、34、36、37、41及び45(タンパク質))を含むTSHR変異体の半減期よりも、1.2倍以上大きいか、又は1.3倍以上大きい、構成54~57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成60)
前記変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が、2倍以上大きい、構成58又は59記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成61)
前記変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が、3倍以上大きいか、又は5倍以上大きい、構成58又は59記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成62)
前記熱安定性が、図14dに示された安定性アッセイCにより測定される、構成58~61のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成63)
前記熱安定性が、図14b及び図14cにおいてそれぞれ示された、安定性アッセイA又は安定性アッセイBのいずれかにより測定される、構成58~61のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成64)
変異体が、膜貫通ドメイン(TMD)内に2つの点変異を含み、ここで図14dに示された安定性アッセイCにより測定された33℃でのその半減期により決定される該変異体の熱安定性が、膜貫通ドメイン(TMD)内にT477I(配列番号:77及び97)、V595I(配列番号:80及び100)又はI648L(配列番号:83及び103)から選択された単一点変異のみを含む、同等のTSHR又は断片の半減期よりも、1.1倍以上大きい、構成54~57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成65)
変異体が、膜貫通ドメイン(TMD)内に2つの点変異を含み、ここで図14b及び14cにそれぞれ示された安定性アッセイA又は安定性アッセイBにより測定された55℃でのその半減期により決定される該変異体の熱安定性が、膜貫通ドメイン(TMD)内にT477I(配列番号:77及び97)、V595I(配列番号:80及び100)又はI648L(配列番号:83及び103)から選択された単一点変異のみを含む、同等のTSHR又は断片の半減期よりも、1.5倍以上大きい、構成54~57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成66)
前記TMD内の2つの点変異の少なくとも一方が、T477I(配列番号:77及び97)、V595I(配列番号:80及び100)又はI648L(配列番号:83及び103)から選択される、構成64又は65記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成67)
変異体が、膜貫通ドメイン(TMD)内に3つの点変異を含み、ここで図14dに示された安定性アッセイCにより測定された40℃でのその半減期により決定される該変異体の熱安定性が、膜貫通ドメイン(TMD)内に、その第一の変異がV595I(配列番号:80及び100)であり、且つその第二の変異がY678L(配列番号:87及び107)又はK565L(配列番号:79及び99)から選択される二重点変異を含む、同等のTSHR又は断片の半減期よりも、1.2倍以上大きいか、又は2倍以上大きいか、又は3倍以上大きい、構成54~57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成68)
変異体が、膜貫通ドメイン(TMD)内に3つの点変異を含み、ここで図14b及び14cにそれぞれ示された安定性アッセイA又は安定性アッセイBにより測定された55℃でのその半減期により決定される該変異体の熱安定性が、膜貫通ドメイン(TMD)内に、その第一の変異がV595I(配列番号:80及び100)であり、且つその第二の変異がY678L(配列番号:87及び107)又はK565L(配列番号:79及び99)から選択される二重点変異を含む、同等のTSHR又は断片の半減期よりも、1.2倍以上大きい、構成54~57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成69)
前記膜貫通ドメイン(TMD)内の変異が、E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、T477I、Q489H、K565L、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671A、Y678L、Y678A (配列番号:69-88(DNA)、配列番号:89-108(タンパク質))のいずれかから選択される単一点変異を含む、構成52~57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成70)
前記膜貫通ドメイン(TMD)内の変異が、2つの点変異を含み、その一つがT477I(配列番号:77及び97)又はV595I(配列番号:80及び100)又はI648L(配列番号:83及び103)であり、並びにその二番目が、構成69記載の様々な変異である、構成52~57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成71)
前記膜貫通ドメイン(TMD)内の変異が、3つの点変異を含み、その一つがV595L(配列番号:80及び100)であり、並びにその二番目が、Y678L(配列番号:87及び107)又はK565L(配列番号:79及び99))であり、並びにその三番目が、構成69記載の様々な変異である、構成52~57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成72)
1つ以上の変異を含む変異体TSHR又はその断片の精製方法であって、ここで該変異体TSHRが、同等の野生型TSHR又は断片に対して増大した熱安定性を有し、該方法が:
i) 変異体又はその断片を含む組成物を、カラムクロマトグラフィーにより精製する工程;
ii) 精製された変異体又はその断片を収集する工程:を含む、前記方法。
(構成73)
前記組成物が、培養物上清を含む、構成72記載の方法。
(構成74)
前記変異体TSHR又はその断片が、構成2~71のいずれか一項記載のものである、構成72又は73記載の方法。
(構成75)
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、且つ下記の変異のセットのひとつ:
1) I253R (図5及び6;配列番号:27及び45)
2) D143P+I253R (図5及び6;配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P+D143P+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P+D143P+D151E+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C+R112P+D143P+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C+R112P+D143P+S166T+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45):を含む、構成74記載の方法。
(構成76)
前記カラムクロマトグラフィーが、陽イオン交換又は陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、構成72~75のいずれか一項記載の方法。
(構成77)
前記工程i)の前又は後のいずれかに、該変異体又はその断片を含む組成物を、アフィニティクロマトグラフィーにより精製する工程を更に含む、構成72~76のいずれか一項記載の方法。
(構成78)
前記アフィニティクロマトグラフィーが、抗体アフィニティクロマトグラフィー及び/又は金属イオンアフィニティクロマトグラフィーを含む、構成77記載の方法。
(構成79)
前記方法が:
i) 該変異体又はその断片を含む組成物を、陽イオン交換又は陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製する工程;
ii) 該変異体又はその断片を、抗体アフィニティクロマトグラフィーにより更に精製する工程;
iii) 任意に、該変異体又はその断片を、金属イオンアフィニティクロマトグラフィーにより更に精製する工程;
iv) 精製された変異体又はその断片を収集する工程:を含む、構成72~78のいずれか一項記載の方法。
(構成80)
前記工程(ii)の抗体が、TSHR細胞外ドメイン内の立体配座エピトープに結合するモノクローナル抗体である、構成79記載の方法。
(構成81)
前記工程(iii)が、ニッケル-アフィニティクロマトグラフィーを含む、構成79又は80記載の方法。
(構成82)
前記アフィニティクロマトグラフィーが、抗体アフィニティクロマトグラフィーであり、且つ任意にpH5.0±0.2の溶出緩衝液による溶出が先行する、pH4.5±0.2の溶出緩衝液による溶出を含む、構成77~81のいずれか一項記載の方法。
(構成83)
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、且つH63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)の変異のセットを含む、構成72~82のいずれか一項記載の方法。
(構成84)
構成72~83のいずれか一項記載の方法により得られた、構成2~71のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
(構成85)
構成72~83のいずれか一項記載の方法により入手可能な、構成2~71のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
(構成86)
前記変異体が、TSHRのサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、且つ下記の変異のセットのひとつ:
1) I253R (図5及び6;配列番号:27及び45)
2) D143P+I253R (図5及び6;配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P+D143P+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P+D143P+D151E+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C+R112P+D143P+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C+R112P+D143P+S166T+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45):を含む、構成84又は85記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
(構成87)
前記変異体が、構成42~46のいずれか一項記載の検出可能な標識を含む、構成84、85又は86記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
(構成88)
前記精製された変異体のTSHR活性アッセイにおける活性が、同じTSHR活性アッセイにおいて測定された培養物上清由来の未精製の変異体の活性よりもより大きいことを特徴とする、構成1~71のいずれか一項又は構成84~87のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
(構成89)
前記精製された変異体のTSHR活性アッセイにおける活性が、同じTSHR活性アッセイにおいて測定された培養物上清由来の未精製の変異体の活性と比べ、500倍以上大きいことを特徴とする、構成1~71のいずれか一項又は構成84~87のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
(構成90)
前記活性が、1000倍以上大きい、構成89記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
(構成91)
前記活性が、5000倍以上大きい、構成89又は90記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
(構成92)
前記活性が、タンパク質1mgあたりの活性として表現された比活性である、構成88~91のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
(構成93)
前記TSHR活性アッセイが、該変異体のTSHR自己抗体へ結合する能力を測定する、構成88~92のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
(構成94)
前記TSHR自己抗体が、M22、K1-70又はK1-18である、構成93記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
(構成95)
前記TSHR活性アッセイが、ELISAプレートに直接又は間接に結合された試験されるべき変異体を含む、構成88~94のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
(構成96)
前記TSHR活性アッセイが、図12a又は図13cに示されたアッセイを含む、構成88~95のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
(構成97)
前記変異体が、TSHRのサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、且つ構成86に示された変異のセットの一つを含む、構成88~96のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
(構成98)
前記変異体が、H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)の変異のセットを含む、構成88~97のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
(構成99)
前記変異体又はその断片が、脱グリコシル化されている、構成1~71又は構成84~98のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成100)
前記変異体が、少なくともひとつの二重点変異を含む、構成99記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成101)
前記変異体が、TSHRのサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、且つ下記の変異のセットのひとつ:
1) I253R (図5及び6;配列番号:27及び45)
2) D143P+I253R (図5及び6;配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P+D143P+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P+D143P+D151E+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C+R112P+D143P+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C+R112P+D143P+S166T+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45):を含む、構成99又は100記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成102)
TSHRに対する被検自己抗体を検出するための診断方法であって、該方法が、被検自己抗体の試料を、構成1~71又は84~101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片と接触させることを含む、前記診断方法。
(構成103)
前記被検自己抗体の試料が、かかる被検自己抗体を含むと考えられる対象から単離された、構成102記載の診断方法。
(構成104)
前記試料が、ヒト又は動物の患者の血清を含む、構成102又は103記載の診断方法。
(構成105)
前記方法が:
a) 対象由来の体液試料を提供する工程;
b) TSHR又はその断片の第一の給源の1種以上を提供する工程;
c) TSHRの第二の給源の1種以上を提供する工程であって、ここで第二の給源は、構成1~71又は84~101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片である工程;
d) 該TSHRの第一及び第二の給源を、同時に又は連続して該体液試料と接触させ、これにより該TSHRに対する抗体が、[第一の給源のTSHR]-[TSHR抗体]-[第二の給源のTSHR]を含む1種以上の複合体を形成する工程;
e) 工程(d)の前に又は同時に又は引き続き、固定手段を提供し、これにより工程(d)で形成された複合体中に存在する該TSHRの第一の給源が、工程(d)の前に、又は同時に、又は引き続き固形支持体に固定される工程;
f) 工程(d)の前に又は同時に又は引き続き、直接又は間接に検出可能な標識手段を提供し、これにより工程(d)で形成された複合体中に存在する該TSHRの第二の給源に、工程(d)の前に、又は同時に、又は引き続きかかる直接又は間接標識手段を提供する工程;並びに
g) 該体液試料中のTSHR抗体の存在の指標を提供するために、工程(e)に従い工程(d)において形成された複合体の存在を検出する工程:を含む、構成102、103又は104記載の診断方法。
(構成106)
前記工程(b)において提供されたTSHRの該第一の給源が、TSH受容体の1以上のエピトープ、又はTSH受容体の1以上のエピトープを含むポリペプチドを含む、完全長TSHRである、構成105記載の診断方法。
(構成107)
前記工程(b)において提供されたTSHRの該第一の給源が、構成1~71又は84~101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片である、構成105記載の診断方法。
(構成108)
前記TSHRの第一の給源又はTSHRの第二の給源のいずれか、又は両方の変異体TSHR又はその断片が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になる、構成102~106のいずれか一項記載の診断方法。
(構成109)
前記標識手段が、構成42~46のいずれか一項記載の検出可能な標識を含む、構成105~108のいずれか一項記載の診断方法。
(構成110)
前記変異体が、標識手段により、直接標識される、構成109記載の診断方法。
(構成111)
前記標識手段が、アルカリホスファターゼ(AP)標識を含む、構成109又は110記載の診断方法。
(構成112)
前記TSHRの第一の給源が固形支持体へ固定される固定手段が、モノクローナル抗体、組換え抗体、合成抗体又はそれらの断片を含む、構成105~111のいずれか一項記載の診断方法。
(構成113)
前記TSHRに対する被検自己抗体を検出するためのキットであって、該キットが:
a) TSHR又はその断片の1種以上の第一の給源;
b) TSHRの1種以上の第二の給源であって、ここで該第二の給源が、構成1~71又は84~101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片であるもの;
c) 該TSHRの第一及び第二の給源を、TSHRに対する被検自己抗体を含むと考えられる試料と、同時に又は連続して接触させる手段であって、これにより該TSHRに対する抗体が、[第一の給源のTSHR]-[TSHR抗体]-[第二の給源のTSHR]を含む1種以上の複合体を形成する手段;
d) (c)において形成された複合体中に存在する該TSHRの第一の給源を、(c)の前に、又は同時に、又は引き続き、固形支持体へ固定するための固定手段;
e) 該複合体の形成の前に、又は同時に、又は引き続き標識された(c)において形成された複合体中に存在する該TSHRの第二の給源を、直接又は間接に標識するための検出可能な標識手段;並びに
f) 該試料中のTSHR抗体の存在の指標を提供するために、(c)において形成された複合体の存在を検出する手段:を含む、前記キット。
(構成114)
構成106~112のいずれか一項以上に記載の特徴のいずれかひとつ以上を含む、構成113記載のキット。
(構成115)
前記(a)において提供された該TSHRの第一の給源が、構成1~71又は84~101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片である、構成113又は構成114記載のキット。
(構成116)
構成1~71又は84~101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片がそれに直接又は間接に結合された固形支持体。
(構成117)
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になる、構成116記載の固形支持体。
(構成118)
前記変異体が、下記の変異のセットの一つ:
1) I253R (図5及び6;配列番号:27及び45)
2) D143P+I253R (図5及び6;配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P+D143P+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P+D143P+D151E+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C+R112P+D143P+V169R+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C+R112P+D143P+S166T+I253R (図5及び6;配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45):を含む、構成116又は117記載の固形支持体。
(構成119)
前記変異体が、該支持体に直接結合される、構成116~118のいずれか一項記載の固形支持体。
(構成120)
前記支持体が、1個以上のウェルを含むELISAプレートである、構成116~119のいずれか一項記載の固形支持体。
(構成121)
構成116~120のいずれか一項記載の固形支持体を含む、キット。
(構成122)
前記TSHRに対するモノクローナル自己抗体若しくはそれらの断片、TSHRに対する組換え抗体又は患者のTRAbを検出するための、構成116~120のいずれか一項記載の固形支持体、又は、構成121記載のキットの使用。
(構成123)
医薬品中での使用のための、構成1~71又は84~101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成124)
前記TSHRモノクローナル自己抗体又は患者TRAbの検出において使用するための、構成1~71又は84~101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成125)
循環している患者TRAbを吸収させるために治療的有効量で使用するための、構成1~71又は84~101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
(構成126)
小型分子薬物の新規スカフォールドを同定するための小型-分子断片スクリーニングのための、構成1~71又は84~101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片の使用。
(構成127)
構成1~71又は84~101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片へ結合されている固相カラムを通して対象の血液の試料を通過させ、且つ該変異体TSHR又はその断片上に該血液中の循環TRAbを吸収させることを含む、対象におけるTSH受容体に対する免疫応答に関連した自己免疫疾患を治療するインビトロ方法。
(構成128)
下記の点変異の1以上:T56V、L58Y、N106P、P136I、D137P、Q145E、I160F、N163W、S172C、R247Y、E357K、D358K、Q391N、L400Y、N403A、I411V、Y414F,L415P、T425I、Q437H、K513L、V543I、C548R、Y549F、S596L、K608D、H615V、S619A、Y626L及びY626A:を含む、変異体卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)又はその断片。
(構成129)
下記の点変異の1以上:P33E、L56F、V61Y、K109P、P139I、D140P、I164F、P165Y、N167W、S176C、I249R、E354K、D355K、R388N、L397Y、N400A、M408V、Y411F、L412P、T422I、Q434H、K510L、V540I、C545R、Y546F、A593L、K605D、Y612V、S616A、Y623L又はY623A:を含む、変異体黄体化ホルモン受容体(LHR)又はその断片。
(構成130)
それぞれ、ヒトFSHR又はLHRである、構成128記載の変異体卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)又はその断片、若しくは、構成129記載の変異体黄体化ホルモン受容体(LHR)又はその断片。
(構成131)
a. 図6(配列番号:29-46)又は図30(配列番号:89-108)に示された変異体TSHR又はその断片のアミノ酸配列をコードしている、図5(配列番号:11-28)又は図29(配列番号:69-88)に示された、ヌクレオチド配列;
b. コードの縮重のために、コドン配列において(a)の任意の配列とは異なるヌクレオチド配列;
c. (a)の任意の配列の対立遺伝子変動を含むヌクレオチド配列;
d. (a-c)の任意の配列の断片を含むヌクレオチド配列;
e. ヌクレオチド塩基の変異、欠失又は置換のために、(a)の配列と異なり、且つ変異体TSHR又はその断片のアミノ酸配列をコードしている、ヌクレオチド配列:を含むポリヌクレオチド。
(構成132)
構成131記載のポリヌクレオチドを保有し、且つ宿主生物のゲノムへこのポリヌクレオチドを導入することが可能である、生物学的機能性ベクターシステム。
(構成133)
構成131記載のポリヌクレオチドで形質転換される宿主細胞。
Claims (54)
1) I253R(図5及び6;配列番号:27及び45)
2) D143P+I253R(図5及び6;配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P+D143P+I253R(図5及び6;配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P+D143P+D151E+I253R(図5及び6;配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(図5及び6;配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(図5及び6;配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C+R112P+D143P+V169R+I253R(図5及び6;配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C+R112P+D143P+S166T+I253R(図5及び6;配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45):を含む、請求項1~3のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
TSHR260-AP-I253R=TSHR260-AP+I253R(図5及び6;配列番号:27及び45)
TSHR260-AP-JMG22=TSHR260-AP+D143P+I253R(図5及び6;配列番号:18、27、36及び45)
TSHR260-AP-JMG37=TSHR260-AP+R112P+D143P+I253R(図5及び6;配列番号:16、18、27、34、36及び45)
TSHR260-AP-JMG45=TSHR260-AP+R112P+D143P+D151E+I253R(図5及び6;配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
TSHR260-AP-JMG52=TSHR260-AP+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(図5及び6;配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
TSHR260-AP-JMG55=TSHR260-AP+H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(図5及び6;配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
TSHR260-AP-JMG57=TSHR260-AP+H63C+R112P+D143P+V169R+I253R(図5及び6;配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
TSHR260-AP-JMG58=TSHR260-AP+H63C+R112P+D143P+S166T+I253R(図5及び6;配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45)
から選択される、請求項16記載の変異体TSHR又はその断片。
(a) 陽イオン又は陰イオン交換クロマトグラフィー;
(b) 抗体アフィニティクロマトグラフィー;及び
(c) 金属イオンアフィニティクロマトグラフィーを用いるカラムクロマトグラフィーによるものである、前記精製すること;並びに
ii) 精製された変異体TSHR又はその断片を収集することを含む、請求項1~17のいずれか1項記載の変異体TSHR又はその断片を精製する方法。
i) 変異体又はその断片及び任意に培養上清を含む組成物を精製することであって:
(a) 陽イオン交換クロマトグラフィー;
(b) モノクローナル抗体がTSHR細胞外ドメイン内の立体配座エピトープと結合し、かつ画分をそれぞれpH4.5±0.2又はpH5.0±0.2の緩衝液によって溶出し、プールし、かつ透析する、モノクローナル抗体アフィニティクロマトグラフィー;及び
(c) ニッケルイオンアフィニティクロマトグラフィーを使用するカラムクロマトグラフィーによるものである、前記精製すること;並びに
ii) 精製した変異体TSHR又はその断片を収集することを含む、請求項18記載の方法。
a) 対象由来の体液試料を提供する工程;
b) TSHR又はその断片の第一の給源の1種以上を提供する工程;
c) TSHRの第二の給源の1種以上を提供する工程であって、ここで第二の給源は、請求項1~17、21及び22のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片である、前記工程;
d) 該TSHRの第一及び第二の給源を、同時に又は連続して該体液試料と接触させ、これにより該TSHRに対する抗体が、[第一の給源のTSHR]-[TSHR抗体]-[第二の給源のTSHR]を含む1種以上の複合体を形成する工程;
e) 工程(d)の前に又は同時に又は引き続き、固定手段を提供し、これにより工程(d)で形成された複合体中に存在する該TSHRの第一の給源が、工程(d)の前に、又は同時に、又は引き続き固形支持体に固定される工程;
f) 工程(d)の前に又は同時に又は引き続き、直接又は間接に検出可能な標識手段を提供し、これにより工程(d)で形成された複合体中に存在する該TSHRの第二の給源に、工程(d)の前に、又は同時に、又は引き続きかかる直接又は間接標識手段を提供する工程;並びに
g) 該体液試料中のTSHR抗体の存在の指標を提供するために、工程(e)に従い工程(d)において形成された複合体の存在を検出する工程:を含む、請求項23記載の方法。
a) TSHR又はその断片の1種以上の第一の給源;
b) TSHRの1種以上の第二の給源であって、ここで該第二の給源が、請求項1~17、21及び22のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片である、前記第二の給源;
c) 該TSHRの第一及び第二の給源を、TSHRに対する被検自己抗体を含むと考えられる試料と、同時に又は連続して接触させる手段であって、これにより該TSHRに対する抗体が、[第一の給源のTSHR]-[TSHR抗体]-[第二の給源のTSHR]を含む1種以上の複合体を形成する、前記手段;
d)(c)において形成された複合体中に存在する該TSHRの第一の給源を、(c)の前に、又は同時に、又は引き続き、固形支持体へ固定するための固定手段;
e) 該複合体の形成の前に、又は同時に、又は引き続き標識された(c)において形成された複合体中に存在する該TSHRの第二の給源を、直接又は間接に標識するための検出可能な標識手段;並びに
f) 該試料中のTSHR抗体の存在の指標を提供するために、(c)において形成された複合体の存在を検出する手段:を含む、前記キット。
1) I253R(図5及び6;配列番号:27及び45)
2) D143P+I253R(図5及び6;配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P+D143P+I253R(図5及び6;配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P+D143P+D151E+I253R(図5及び6;配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(図5及び6;配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C+R112P+D143P+D151E+V169R+I253R(図5及び6;配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C+R112P+D143P+V169R+I253R(図5及び6;配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C+R112P+D143P+S166T+I253R(図5及び6;配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45)
からなる群から選択される変異のセットの一つを含む、請求項36記載の固形支持体。
b. コードの縮重のために、コドン配列において(a)の任意の配列とは異なるヌクレオチド配列;
c.(a)の任意の配列の対立遺伝子変動を含むヌクレオチド配列;又は
e. ヌクレオチド塩基の変異、欠失又は置換のために、(a)の配列と異なり、且つ請求項1~17、21及び22のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片のアミノ酸配列をコードしている、ヌクレオチド配列:を含むポリヌクレオチド。
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