JP5722927B2 - チロトロピン受容体の結合対象及びその使用 - Google Patents
チロトロピン受容体の結合対象及びその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5722927B2 JP5722927B2 JP2013007593A JP2013007593A JP5722927B2 JP 5722927 B2 JP5722927 B2 JP 5722927B2 JP 2013007593 A JP2013007593 A JP 2013007593A JP 2013007593 A JP2013007593 A JP 2013007593A JP 5722927 B2 JP5722927 B2 JP 5722927B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- binding
- tsh receptor
- tsh
- antibody
- molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 623
- 238000009739 binding Methods 0.000 title claims abstract description 623
- 102000015486 thyroid-stimulating hormone receptor activity proteins Human genes 0.000 title description 5
- 108040006218 thyroid-stimulating hormone receptor activity proteins Proteins 0.000 title description 5
- 102000003911 Thyrotropin Receptors Human genes 0.000 claims abstract description 599
- 108090000253 Thyrotropin Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 599
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 120
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 88
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 55
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 74
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 74
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 70
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 57
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 53
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 49
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 42
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 35
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 35
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 34
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 33
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 25
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 24
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 24
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 23
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 23
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 22
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 20
- 230000003491 cAMP production Effects 0.000 claims description 19
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 14
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 14
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 claims 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 159
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 159
- 101000772267 Homo sapiens Thyrotropin receptor Proteins 0.000 description 69
- 102100029337 Thyrotropin receptor Human genes 0.000 description 67
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 57
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 48
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 47
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 47
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 44
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 40
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 34
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 32
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 30
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 29
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 29
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- 108091022930 Glutamate decarboxylase Proteins 0.000 description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 23
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 18
- 102100035902 Glutamate decarboxylase 1 Human genes 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 17
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 16
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 16
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 16
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 15
- 108091033319 polynucleotide Chemical group 0.000 description 15
- 239000002157 polynucleotide Chemical group 0.000 description 15
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 15
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 14
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 12
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 12
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 12
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 12
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 8
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 7
- 229960000874 thyrotropin Drugs 0.000 description 7
- 230000001748 thyrotropin Effects 0.000 description 7
- 102000008214 Glutamate decarboxylase Human genes 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 4
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 4
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 4
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 4
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 4
- MZIYRTZAYQIAHW-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-8-(2-methylpropyl)-3,7-dihydropurine-2,6-dione Chemical compound N1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=C(CC(C)C)N2 MZIYRTZAYQIAHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010036012 Iodide peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 102000014169 Steroid 21-Hydroxylase Human genes 0.000 description 3
- 108010011732 Steroid 21-Hydroxylase Proteins 0.000 description 3
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 3
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 3
- 102000014267 Thyroid peroxidases Human genes 0.000 description 3
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical compound IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 3
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 3
- 230000006552 constitutive activation Effects 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 206010015108 Epstein-Barr virus infection Diseases 0.000 description 2
- ARPVSMCNIDAQBO-YUMQZZPRSA-N Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ARPVSMCNIDAQBO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- VLDVBZICYBVQHB-IUCAKERBSA-N His-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CN=CN1 VLDVBZICYBVQHB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 206010020850 Hyperthyroidism Diseases 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 description 2
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000007994 TES buffer Substances 0.000 description 2
- 108010066702 Thyrotropin Alfa Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003202 long acting thyroid stimulator Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- HKAVADYDPYUPRD-UHFFFAOYSA-N 1h-pyrazine-2-thione Chemical compound SC1=CN=CC=N1 HKAVADYDPYUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012232 AGPC extraction Methods 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010009685 Cholinergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 208000003807 Graves Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 208000024799 Thyroid disease Diseases 0.000 description 1
- 102100027188 Thyroid peroxidase Human genes 0.000 description 1
- 208000026062 Tissue disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000034337 acetylcholine receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- -1 aliphatic amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- YDMCWONVABEGBK-UHFFFAOYSA-N carbamimidoylazanium;phenoxide Chemical compound NC(N)=N.OC1=CC=CC=C1 YDMCWONVABEGBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000000960 hypophysis hormone Substances 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000012332 laboratory investigation Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 230000036473 myasthenia Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 102000004217 thyroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000721 thyroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/575—Hormones
- G01N2333/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明は、チロトロピン受容体（ＴＳＨ受容体又はＴＳＨＲ）の結合対象（モノクローナル抗体又は組み換え抗体等）と、その使用とに関する。
チロトロピン又は甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）は、甲状腺の機能を調整する上で重要な役割を果たす下垂体ホルモンである。その放出は、視床下部において形成されるＴＲＨホルモンによって刺激され、ＴＳＨは、重要な甲状腺ホルモンであるチロキシン（Ｔ４）及びトリヨードチロニン（Ｔ３）の形成及び放出を制御する。フィードバックメカニズムに基づいて、血清の甲状腺ホルモン含有量は、ＴＳＨの放出を制御する。甲状腺細胞によるＴ３及びＴ４の形成は、下垂体が放出したＴＳＨが甲状腺細胞膜のＴＳＨ受容体と結合する手順により、ＴＳＨによって刺激される。
グレーブス病（一般的な自己免疫疾患）では、ＴＳＨ受容体抗体（ＴＲＡｂ）が形成され、こうした自己抗体は、ＴＳＨの作用を模倣するような形でＴＳＨ受容体と結合し、甲状腺を刺激して、高いレベルの甲状腺ホルモンを生成させる。こうした自己抗体は、刺激活性を有するとされている。一部の患者において、自己抗体は、ＴＳＨ受容体と結合するものの、甲状腺ホルモンの生成を刺激せず、遮断活性を有するとされている（J Sanders, Y Oda, S-A Roberts, M Maruyama, J Furmaniak, B Rees Smith:「チロトロピン受容体の機能−構造関係の理解」Balliere's Clinical Endocrinology and Metabolism; Ed TF Davis 1997; 11(3): 451-479; Pub Balliere Tindall, London）。
ＴＳＨ受容体抗体の測定は、グレーブス病その他の甲状腺疾患の診断及び管理にとって重要である。現在、ＴＳＨ受容体抗体の測定には三種類のアッセイが使用されている：
（ａ）ＴＳＨ受容体抗体がＴＳＨとＴＳＨ受容体調製物との結合を阻害する能力を測定する競合結合測定法、
（ｂ）ＴＳＨ受容体抗体が培養物においてＴＳＨ受容体を発現する細胞を刺激する能力を測定するバイオアッセイ、及び
（ｃ）ＴＳＨ受容体抗体によるＴＳＨ受容体調製物の免疫沈降。
（ａ）ＴＳＨ受容体抗体がＴＳＨとＴＳＨ受容体調製物との結合を阻害する能力を測定する競合結合測定法、
（ｂ）ＴＳＨ受容体抗体が培養物においてＴＳＨ受容体を発現する細胞を刺激する能力を測定するバイオアッセイ、及び
（ｃ）ＴＳＨ受容体抗体によるＴＳＨ受容体調製物の免疫沈降。
こうしたアッセイを使用したＴＳＨ受容体抗体の測定については、次の参考文献において説明されている：
J Sanders, Y Oda, S-A Roberts, M Maruyama, J Furmaniak, B Rees Smith、「チロトロピン受容体の機能−構造関係の理解」、Balliere's Clinical Endocrinology and Metabolism; Ed TF Davis 1997; 11(3): 451-479; Pub Balliere Tindall, London.
J Sanders, Y Oda, S Roberts, A Kiddie, T Richards, J Bolton, V McGrath, S Walters, D Jaskolski, J Furmaniak, B Rees Smith;「ＴＳＨ受容体自己抗体と125Ｉ標識ＴＳＨ受容体との相互作用」、Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1999; 84(10): 3792-3802.
J Sanders, Y Oda, S-A Roberts, M Maruyama, J Furmaniak, B Rees Smith、「チロトロピン受容体の機能−構造関係の理解」、Balliere's Clinical Endocrinology and Metabolism; Ed TF Davis 1997; 11(3): 451-479; Pub Balliere Tindall, London.
J Sanders, Y Oda, S Roberts, A Kiddie, T Richards, J Bolton, V McGrath, S Walters, D Jaskolski, J Furmaniak, B Rees Smith;「ＴＳＨ受容体自己抗体と125Ｉ標識ＴＳＨ受容体との相互作用」、Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1999; 84(10): 3792-3802.
患者のリンパ球に由来するＴＳＨ受容体に対するヒトモノクローナル抗体が、例えば、競合結合測定法においてＴＳＨの代わりとなるもの等、グレーブス病の病原の理解と、ＴＳＨ受容体抗体を測定する新しい方法の開発とにとって価値のある試薬であることは長年に渡って認識されてきた。更に、患者の血清のＴＳＨ受容体抗体は通常、強力な甲状腺刺激物質（ＴＳＨアゴニスト）であるため、ヒトモノクローナルＴＳＨ受容体抗体を刺激することは、ＴＳＨ受容体を含む組織（例えば、甲状腺組織又は甲状腺癌組織）が刺激を必要とする時のｉｎ ｖｉｖｏでの応用にとって価値がある。更に、一部の患者の血清のＴＳＨ受容体抗体は強力なＴＳＨアンタゴニスト（抗体を遮断する）であるため、ＴＳＨアンタゴニストであるヒトモノクローナルＴＳＨ受容体抗体は、ＴＳＨ受容体を含む組織（例えば、甲状腺組織又は甲状腺癌組織）が不活性化を必要とする時、或いは、ＴＳＨ、ＴＳＨ受容体抗体、又はその他の刺激物質に反応しないようにするべきである時、ｉｎ ｖｉｖｏでの応用にとって価値がある。
更に、このようなｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでのヒトモノクローナルＴＳＨ受容体抗体の主要な利点の一つは、抗体を操作できる相対的な容易さであることも認識されている。例えば、ＴＳＨアゴニスト又はアンタゴニスト活性の度合いを含む、親和性及び生物学的特徴といった特徴を変更するための、モノクローナル抗体のＴＳＨ受容体結合領域の操作である。更に、モノクローナル抗体は、ｉｎｖｉｖｏにおいてＴＳＨよりも遙かに長い半減期を有しており、これは特定のｉｎ ｖｉｖｏでの応用において大きな利点となり得る。更に、抗体の半減期は、容易に操作可能であり、例えば、抗体のＦａｂ断片は、完全なＩｇＧよりも遙かに短い半減期を有する。こうしたＴＳＨ受容体抗体の一般的な特性については、B Rees Smith, SM McLachlan, J Furmaniak、「チロトロピン受容体に対する自己抗体」、Endocrine Reviews 1988; 9: 106-121と、B Rees Smith, KJ Dorrington, DS Munro、「長時間作用性甲状腺刺激物質γＧ−グロブリンサブユニットの甲状腺刺激特性」、Biochimica et Biophysica Acta 1969; 192: 277-285と、KJ Dorrington, DS Munro、「長時間作用性甲状腺刺激物質」、Clinical Pharmacology and Therapeutics 1966; 7: 788-806とのような刊行物において説明されている。
ヒトモノクローナルＴＳＨ受容体抗体の更なる利点は、新型のＴＳＨ受容体抗体結合部位を特定及び提供する使用法にある。例えば、ＴＳＨ受容体と結合するヒトモノクローナルＴＳＨ受容体抗体の領域に対する抗体の生成によるものである。このように生成された抗イディオタイプ抗体の一部は、ＴＳＨ受容体抗体と、ＴＳＨと、関連化合物とのアッセイのための新しいリガンドとしての可能性を有する。更には、ＴＳＨ受容体抗体と、ＴＳＨと、関連化合物との作用を調整するためのｉｎ ｖｉｖｏでの有効な作用物質となり得る。
モノクローナル抗体を使用して、新型の抗体結合部位を特定及び提供するその他の方法は、周知である。例えば、JC Scott及びGP Smith、「エピトープライブラリによるペプチドリガンドの探索」、Science 1990; 249(4967): 386-390と、MA Myers, JM Davis, JC Tong, J Whisstock, M Scealy, IR MacKay, MJ Rowley、「ペプチドファージディスプレイ及び分子モデリングによって特定された糖尿病自己抗原ＧＡＤ65での配座エピトープ」、Journal of Immunology 2000; 165: 3830-3838と、によって説明されるような、ファージディスプレイランダムペプチドライブラリの抗体スクリーニングによるものである。非ペプチド化合物及び非ペプチド化合物のライブラリの抗体スクリーニングも実行可能である。
こうした手順を使用して特定及び提供された新型のＴＳＨ受容体抗体結合部位は、更に、ＴＳＨ受容体抗体と、ＴＳＨと、関連化合物とのアッセイにおける新しいリガンドとして有用となり得る。更には、ＴＳＨ受容体抗体と、ＴＳＨと、関連化合物との作用を調整するためのｉｎ ｖｉｖｏでの有効な作用物質となり得る。
ヒトモノクローナルＴＳＨ受容体抗体の潜在的価値を考慮して、こうした抗体を生成するために、長年に渡って多大な努力がなされてきた（例えば、B Rees Smith, SM McLachlan, J Furmaniak、「チロトロピン受容体に対する自己抗体」、Endocrine Reviews 1988; 9: 106-121参照）。しかしながら、現在まで、こうした努力は不成功に終わっている（例えば、SM McLachlan, B Rapoport、「ＴＳＨ受容体に対するモノクローナルヒト自己抗体――聖杯とそれを探す理由」、Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1996; 81: 3152-3154、及びJHW van der Heijden, TWA de Bruin, KAFM Gludemans, J de Kruif, JP Banga, T Logtenberg、「グレーブス病のチロトロピン受容体に対するヒトモノクローナル自己抗体を取得するための半合成ライブラリアプローチの限界」、Clinical and Experimental Immunology 1999; 118: 205-212参照）。
本発明の目的は、ＴＳＨ受容体自己抗体のＴＳＨ受容体との相互作用に相当する形でＴＳＨ受容体との相互作用が可能なＴＳＨ受容体の結合対象を提供することであり、特に、本発明の目的は、甲状腺機能亢進グレーブス病患者の血清においてＴＳＨ受容体抗体との間で見られるようなものに相当するＴＳＨ受容体との相互作用を発現する、ＴＳＨ受容体に対するヒトモノクローナル抗体を提供すること、及び、その組み換え調製物を提供することである。ヒトモノクローナルＴＳＨ受容体抗体を生成する大きな困難は、本明細書で説明する本発明において克服されている。特に、甲状腺機能亢進グレーブス病患者の血清において見られる自己抗体の特徴を備えたヒトモノクローナルＴＳＨ受容体抗体の生成の成功について説明する。我々が生成したヒトＴＳＨ受容体モノクローナル抗体（本明細書において、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１として説明される）は、ＴＳＨ受容体と結合する標識ＴＳＨを少量の抗体が阻害し、少量が強力な甲状腺刺激物質として機能するような形で、高い親和性でＴＳＨ受容体と結合する。抗体のＦａｂ断片と組み換えＦａｂ調製物とは、同様に効果的な甲状腺刺激物質であり、完全なＩｇＧとして結合する標識ＴＳＨの阻害物質である。モノクローナルＦａｂ及び／又は完全なＩｇＧは、１２５Ｉ又はビオチンにより標識可能であり、ＴＳＨ受容体と結合することが証明できる。こうした結合は、患者血清のＴＳＨ受容体自己抗体によって阻害される。
本発明は、したがって、ＴＳＨ受容体の結合対象を提供し、結合対象は、ＴＳＨ受容体と反応するヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体、或いはその一つ以上の断片を含むか、或いは、これらに由来する。
特に、本発明は、ＴＳＨ受容体の結合対象を提供し、結合対象は、ＴＳＨ受容体と反応するヒトモノクローナル抗体、又はその一つ以上の断片を含むか、或いは、これらに由来する。
特に、本発明は、ＴＳＨ受容体の結合対象を提供し、結合対象は、ＴＳＨ受容体と反応するヒト組み換え抗体、又はその一つ以上の断片を含むか、或いは、これらに由来する。
特に、本発明は、ＴＳＨ受容体と反応するヒトモノクローナル抗体、又はその一つ以上の断片を提供する。
特に、本発明は、ＴＳＨ受容体と反応するヒト組み換え抗体、又はその一つ以上の断片を提供する。特に、本発明は、ＴＳＨ受容体と反応するヒト組み換え抗体の一つ以上の断片を提供する。
本発明による結合対象、及び特に、本発明によるＴＳＨ受容体と反応するヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体は、更に、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨを阻害する能力、及び／又はＴＳＨ受容体を刺激する能力によって特徴付けることが可能であり、その両方は、グレーブス病患者から取得した血清に存在するＴＳＨ受容体自己抗体の阻害及び刺激特性のそれぞれに相当すると考えられる。
更に具体的には、本発明による結合対象、及び特に、本発明によるヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体は、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１５単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位の、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨに対する阻害活性、或いは、こうしたモノクローナル抗体又は組み換え抗体の一つ以上の断片によって特徴付けることが可能である。
更に具体的には、本発明による結合対象、及び特に、本発明によるヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体は、更に、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２４０単位の、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成に対する刺激活性、或いは、こうしたモノクローナル抗体又は組み換え抗体の一つ以上の断片によって特徴付けることが可能である。
本発明の好適な実施形態において、本発明による結合対象、及び特に、本発明によるヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体は、
（ｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１５単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位の、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨに対する阻害活性、及び、
（ｉｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２４０単位の、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成に対する刺激活性、
或いは、こうしたモノクローナル抗体又は組み換え抗体の一つ以上の断片によって特徴付けることが可能である。
（ｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１５単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位の、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨに対する阻害活性、及び、
（ｉｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２４０単位の、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成に対する刺激活性、
或いは、こうしたモノクローナル抗体又は組み換え抗体の一つ以上の断片によって特徴付けることが可能である。
ＴＳＨ受容体と反応するモノクローナル抗体又は組み換え抗体の一つ以上の断片、特に例えば、ＴＳＨ受容体と反応するモノクローナル抗体又は組み換え抗体の一つ以上のＦａｂ断片を、本発明による結合対象が含むか、或いはこれらに由来する場合、こうした結合対象は、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２４０単位の、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨに対する阻害活性によって特徴付け可能であることが好ましい。
更に、ＴＳＨ受容体と反応するモノクローナル抗体又は組み換え抗体の一つ以上の断片、特に例えば、ＴＳＨ受容体と反応するモノクローナル抗体又は組み換え抗体の一つ以上のＦａｂ断片を、本発明による結合対象が含むか、或いはこれらに由来する場合、こうした結合対象は、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約５０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１００単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２００単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約４００単位の、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成に対する刺激活性によって特徴付け可能であることが好ましい。
更に、ＴＳＨ受容体と反応するモノクローナル抗体又は組み換え抗体の一つ以上の断片、特に例えば、ＴＳＨ受容体と反応するモノクローナル抗体又は組み換え抗体の一つ以上のＦａｂ断片を、本発明による結合対象が含むか、或いはこれらに由来する場合、こうした結合対象は、
（ｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２４０単位の、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨに対する阻害活性、及び、
（ｉｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約５０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１００単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２００単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約４００単位の、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成に対する刺激活性、によって特徴付け可能であることが好ましい。
（ｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２４０単位の、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨに対する阻害活性、及び、
（ｉｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約５０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１００単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２００単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約４００単位の、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成に対する刺激活性、によって特徴付け可能であることが好ましい。
好適な場合において、本発明は、ＴＳＨ受容体の結合対象（通常は、ヒトモノクローナル抗体）を提供し、結合対象は、好ましくはＴＳＨ受容体を刺激するように、ＴＳＨ受容体と結合可能であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示したようなＶＨドメインと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４から選択されたアミノ酸配列を備えた一つ以上のＶＨ ＣＤＲを含むＶＨドメインとによって構成されたグループから選択された抗体ＶＨドメインを含む。
本発明の第一の実施形態では、したがって、ＴＳＨ受容体の結合対象（通常は、ヒトモノクローナル抗体）が提供され、結合対象は、好ましくはＴＳＨ受容体を刺激するように、ＴＳＨ受容体と結合可能であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示したような抗体ＶＨドメインを含む。
本発明の第二の実施形態では、ＴＳＨ受容体の結合対象（通常は、ヒトモノクローナル抗体）が提供され、結合対象は、好ましくはＴＳＨ受容体を刺激するように、ＴＳＨ受容体と結合可能であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４から選択されたアミノ酸配列を備えた一つ以上のＶＨ ＣＤＲを含む抗体ＶＨドメインを含む。
本発明による結合対象は、抗体ＶＬドメインが存在しない状態で、実質的に上記のような抗体ＶＨドメインを含むことが可能であると理解されよう。単一の免疫グロブリンドメイン、特にＶＨドメインが、特異的な形で標的抗原に結合できることは公知である。代替として、本発明による結合対象は、この技術で周知の手法を利用して、ＴＳＨ受容体のためのＶＨ及びＶＬドメインを共に含む抗体結合部位を提供するために、抗体ＶＬドメインと対を成す抗体ＶＨドメインを含むことができる（Biochim. Biophys. Acta, 192 (1969) 277-285; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89, pp 10026-10030, November 1992）。
好適な場合においては、しかしながら、本発明は、ＴＳＨ受容体の結合対象を提供し、結合対象は、好ましくはＴＳＨ受容体を刺激するように、ＴＳＨ受容体と結合可能であり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示したようなＶＨドメインと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４から選択されたアミノ酸配列を備えた一つ以上のＶＨ ＣＤＲを含むＶＨドメインと、
によって構成されたグループから選択された抗体ＶＨドメイン、及び／又は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示したようなＶＬドメインと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９から選択されたアミノ酸配列を備えた一つ以上のＶＬ ＣＤＲを含むＶＬドメインと、
によって構成されたグループから選択された抗体ＶＬドメインを含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示したようなＶＨドメインと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４から選択されたアミノ酸配列を備えた一つ以上のＶＨ ＣＤＲを含むＶＨドメインと、
によって構成されたグループから選択された抗体ＶＨドメイン、及び／又は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示したようなＶＬドメインと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９から選択されたアミノ酸配列を備えた一つ以上のＶＬ ＣＤＲを含むＶＬドメインと、
によって構成されたグループから選択された抗体ＶＬドメインを含む。
本発明によれば、実質的に上記のような結合対象は、実質的に上記のような抗体ＶＬドメインと対を成す実質的に上記のような抗体ＶＨドメインを含み、ＴＳＨ受容体のためのＶＨ及びＶＬドメインを共に含む抗体結合部位を提供することが好適となる場合があり、但し、更に説明するように、抗体ＶＨドメイン又は抗体ＶＬドメインは、ＴＳＨ受容体を結合するために独立して使用してよい。したがって、実質的に上記のような結合対象は、抗体ＶＬドメインが存在しない状態で、実質的に上記のような抗体ＶＨドメインを含むことができると理解されよう。更に、したがって、実質的に上記のような結合対象は、抗体ＶＨドメインが存在しない状態で、実質的に上記のような抗体ＶＬドメインを含むことができると理解されよう。代替として、実質的に上記のような結合対象は、実質的に上記のような抗体ＶＬドメインと対を成す抗体ＶＨドメインを含み、ＴＳＨ受容体のためのＶＨ及びＶＬドメインを共に含む抗体結合部位を提供できる。
本発明による好適な実施形態は、したがって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示したような抗体ＶＬドメインと対を成すＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示したような抗体ＶＨドメインを含む実質的に上記のような結合対象を含み、ＴＳＨ受容体のためのこうしたＶＨ及びＶＬドメインを共に含む抗体結合部位を提供できる。
更に、本発明によれば、実質的に上記のようなＶＨドメインは、本明細書で具体的に説明したもの以外のＶＬドメインと対を成してもよいと予想される。更に、本発明によれば、実質的に上記のようなＶＬドメインは、本明細書で具体的に説明したもの以外のＶＨドメインと対を成してもよいと予想される。
本発明の更なる実施形態によれば、ＴＳＨ受容体のために実質的に上記のような結合対象が提供され、結合対象は、ＴＳＨ受容体を刺激するように、ＴＳＨ受容体と結合可能であり、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４から選択されたアミノ酸配列を備えた一つ以上のＶＨ ＣＤＲを含むＶＨドメイン
を含む抗体ＶＨドメイン、及び／又は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９から選択されたアミノ酸配列を備えた一つ以上のＶＬ ＣＤＲを含むＶＬドメイン、
を含む抗体ＶＬドメイン、を含むことができる。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４から選択されたアミノ酸配列を備えた一つ以上のＶＨ ＣＤＲを含むＶＨドメイン
を含む抗体ＶＨドメイン、及び／又は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９から選択されたアミノ酸配列を備えた一つ以上のＶＬ ＣＤＲを含むＶＬドメイン、
を含む抗体ＶＬドメイン、を含むことができる。
上で参照した一つ以上のＣＤＲは、上記のＶＨ及びＶＬドメインから取りだし、適切なフレームワークに組み込んでよい。例えば、実質的に上記のような一つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列は、本明細書で具体的に開示するｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１とは異なる抗体のフレームワーク領域に組み込んでよく、こうした抗体は、これにより、一つ以上のＣＤＲを組み込み、ＴＳＨ受容体との結合が可能となり、好ましくは、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体を刺激する。代替として、本発明は、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体を刺激するようにＴＳＨ受容体と結合可能で、本明細書で具体的に説明されるような一つ以上のＣＤＲに代表されるようなアミノ酸の一次構造配座を、随意的に更なるアミノ酸と共に含むポリペプチドを提供してよく、更なるアミノ酸は、本明細書で説明するような一つ以上のＣＤＲのＴＳＨ受容体に対する結合親和性を強化してよく、或いは、ポリペプチドのＴＳＨ受容体に対する結合特性に作用する役割を実質的に有していなくてもよい。
本発明は、更に、本明細書で説明する特定のヒトモノクローナル抗体と、ＶＨドメインと、ＣＤＲと、本明細書で説明するポリペプチドとの変異体、類似体、誘導体、及び断片を包含し、変異体、類似体、誘導体、及び断片は、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体と相互作用する（例えば、ＴＳＨ受容体を刺激する等の）能力を保持する。
「変異体」、「類似体」、「誘導体」、及び「断片」という用語は、本明細書での使用において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示したようなＶＨドメイン及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示したようなＶＬドメインを有するヒトモノクローナル抗体と本質的に同じ生物学的機能又は活性を、特にＴＳＨ受容体に対するその結合特性に関して保持する抗体、抗体断片、又はポリペプチドとして特徴付けることができる。適切な場合、変異体、類似体、誘導体、及び断片と、本明細書で説明するような断片の変異体、類似体、及び誘導体とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示したようなＶＨドメイン及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示したようなＶＬドメインを有するヒトモノクローナル抗体の数個又は少数（５乃至１０個、１乃至５個、又は１乃至３個）のアミノ酸残基に、任意の組み合わせで、置換、欠失、又は付加が生じた、アミノ酸の一次構造配座を有する。これらの中で特に好適なものは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示したようなＶＨドメイン及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示したようなＶＨドメインを有するヒトモノクローナル抗体の生物学的活性又は機能を改変しない、或いは実質的に改変しない、サイレント置換、付加、及び欠失である。保守的置換は、以下で更に詳細に説明するように、好適となる可能性がある。
更に詳しくは、本発明によるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示したようなＶＨドメイン及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示したようなＶＬドメインを有するヒトモノクローナル抗体の変異体、類似体、又は誘導体は、一つ以上のアミノ酸残基が保存又は非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）と置換されたもの、或いは、一つ以上のアミノ酸残基が置換基グループ又はその他を含むものにしてよい。こうした変異体、誘導体、及び類似体は、本明細書の教示から当業者の範囲内に入ると考えられる。
最も一般的には、変異体、類似体、又は誘導体は、保守的アミノ酸置換によって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示したようなＶＨドメイン及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示したようなＶＬドメインを有する基準ヒトモノクローナル抗体から変化するものである。こうした置換は、一定のアミノ酸を同様の特性である別のアミノ酸によって置換するものである。保守的置換として一般に見られるものは、脂肪族アミノ酸Ａ、Ｖ、Ｌ、及びＩ間と、水酸残基Ｓ及びＴ間と、酸性残基Ｄ及びＥ間と、アミド残基Ｎ及びＯ間と、塩基残基Ｋ及びＲ間と、芳香族残基Ｆ及びＹ間とでの相互の交換である。
本明細書での使用において、断片という用語は、特に、具体的に本明細書で説明するような抗体の断片に関連し、本発明の重要な態様を形成すると理解されよう。これにより、本発明によって提供されるようなヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体は、以下の断片のいずれかとして提供され得る：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインで構成されるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成されるＦｄ断片、（ｉｉｉ）ＶＬ及びＶＨドメインで構成されるＦｖ断片、（ｉｖ）ＶＨドメインで構成されるｄＡｂ断片、（ｖ）分離ＣＤＲ領域、（ｖｉ）二つの連結Ｆａｂ断片を含む二価の断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、及び（ｖｉｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが二ドメインを関連付けて抗原結合部位を形成可能なペプチドリンカによって連結される、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）。
代替として、本発明によるヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体は、完全なＩｇＧ抗体を含んでよく、これにより、抗体は可変及び定常領域を含む。
本発明は、更に、ＴＳＨ受容体との結合について、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象（通常は、ヒトモノクローナル抗体）との競合が可能な、ＴＳＨ受容体と結合できる更なる結合対象を提供し、更なる結合対象は、ＴＳＨを含まない。好ましくは、この更なる結合対象は、ＴＳＨ受容体のエピトープ領域のための結合部位を有し、ＴＳＨ受容体との結合について、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象（通常は、ヒトモノクローナル抗体）との競合が可能な、更なる抗体を含んでよい。こうした適切な更なる結合対象は、この技術で公知の手法でのＴＳＨ受容体によるマウスの免疫付与を利用して、好ましくは実質的に実施例において説明するような手法によって生成可能な、マウスモノクローナル抗体を含むことができる。
本発明は、更に、ＴＳＨ受容体と反応するヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体、或いはその一つ以上の断片を含むことが可能な、ＴＳＨ受容体と結合できる更なる結合対象を提供してよい。特に、この更なる結合対象は、ＴＳＨ受容体のエピトープ領域のための結合部位を有する更なる抗体を含んでよく、更なる抗体は、ＴＳＨ受容体と結合可能であり、ＴＳＨ受容体との結合について、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象（通常は、ヒトモノクローナル抗体）との競合が可能である。適切な場合、こうした更なる結合対象は、ＴＳＨ受容体との相互作用について、実質的に本明細書で説明するような結合対象（ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１等）と競合可能なＴＳＨ受容体の更なる結合対象が得られるように、スポット突然変異又はその他の適切な突然変異生成手法によって、本明細書で説明するような特定の結合対象、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１から誘導可能である。
好ましくは、ＴＳＨ受容体の更なる結合対象は、モノクローナル抗体又は組み換え抗体を含むことが可能であり、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１５単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位の、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨに対する阻害活性、或いは、抗体の一つ以上の断片によって特徴付けることが可能である。本発明によるこうした更なる結合対象は、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２４０単位の、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成に対する刺激活性、或いは、抗体の一つ以上の断片によって特徴付け可能であることも好適となり得る。
本発明のこうした更なる結合対象は、
（ｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１５単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位の、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨに対する阻害活性、及び
（ｉｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２４０単位の、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成に対する刺激活性、
或いは、抗体の一つ以上の断片によって特徴付け可能であることも更により好適となり得る。
（ｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１５単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位の、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨに対する阻害活性、及び
（ｉｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２４０単位の、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成に対する刺激活性、
或いは、抗体の一つ以上の断片によって特徴付け可能であることも更により好適となり得る。
本発明による更なる結合対象を提供する好適なマウスモノクローナル抗体は、実施例に関連して調製され、図９乃至１２及び配列リスト１９乃至３８に例示されるようなアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を有する。本発明によれば、したがって、ＴＳＨ受容体の更なる結合対象（通常、マウスモノクローナル抗体）が提供され、更なる結合対象は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示したような抗体ＶＨドメインを含む。
本発明で提供されるような更なる結合対象は、更に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２から選択されたアミノ酸配列を備えた一つ以上のＶＨ ＣＤＲを含む抗体ＶＨドメインを含むものとして特徴付けできる。
本発明による更なる結合対象は、抗体ＶLドメインが存在しない状態で、実質的に上記のような抗体ＶＨドメインを含むことが可能であると理解されよう。単一の免疫グロブリンドメイン、特にＶＨドメインが、特異的な形で標的抗原に結合できることは公知である。代替として、本発明による更なる結合対象は、この技術で周知の手法を利用して、ＴＳＨ受容体のためのＶＨ及びＶＬドメインを共に含む抗体結合部位を提供するために、抗体ＶＬドメインと対を成す抗体ＶＨドメインを含むことができる（Biochim. Biophys. Acta, 192 (1969) 277-285; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89, pp 10026-10030, November 1992）。
好適な場合においては、しかしながら、本発明は、ＴＳＨ受容体の更なる結合対象を提供し、結合対象は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示したようなＶＨドメインと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２から選択されたアミノ酸配列を備えた一つ以上のＶＨ ＣＤＲを含むＶＨドメインと、によって構成されたグループから選択された抗体ＶＨドメイン、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４に示したようなＶＬドメインと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７から選択されたアミノ酸配列を備えた一つ以上のＶＬ ＣＤＲを含むＶＬドメインと、によって構成されたグループから選択された抗体ＶＬドメインを含む。
本発明によれば、実質的に上記のような更なる結合対象は、実質的に上記のような抗体ＶＬドメインと対を成す実質的に上記のような抗体ＶＨドメインを含み、ＴＳＨ受容体のためのＶＨ及びＶＬドメインを共に含む抗体結合部位を提供することが好適となる場合があり、但し、更に説明するように、抗体ＶＨドメイン又は抗体ＶＬドメインは、ＴＳＨ受容体を結合するために独立して使用してよい。したがって、実質的に上記のような更なる結合対象は、抗体ＶＬドメインが存在しない状態で、実質的に上記のような抗体ＶＨドメインを含むことができると理解されよう。更に、したがって、実質的に上記のような更なる結合対象は、抗体ＶＨドメインが存在しない状態で、実質的に上記のような抗体ＶＬドメインを含むことができると理解されよう。代替として、実質的に上記のような更なる結合対象は、実質的に上記のような抗体ＶＬドメインと対を成す抗体ＶＨドメインを含み、ＴＳＨ受容体のためのＶＨ及びＶＬドメインを共に含む抗体結合部位を提供できる。
本発明による好適な実施形態は、したがって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４に示したような抗体ＶＬドメインと対を成すＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示したような抗体ＶＨドメインを含む実質的に上記のような更なる結合対象を含み、ＴＳＨ受容体のためのこうしたＶＨ及びＶＬドメインを共に含む、抗体結合部位を提供できる。
更に、本発明によれば、実質的に上記のようなＶＨドメインは、本明細書で具体的に説明したもの以外のＶＬドメインと対を成してもよいと予想される。更に、本発明によれば、実質的に上記のようなＶＬドメインは、本明細書で具体的に説明したもの以外のＶＨドメインと対を成してもよいと予想される。
本発明の更なる実施形態によれば、ＴＳＨ受容体のために実質的に上記のような更なる結合対象が提供され、更なる結合対象は、ＴＳＨ受容体の刺激を阻害するように、ＴＳＨ受容体と結合可能であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２から選択されたアミノ酸配列を備えた一つ以上のＶＨ ＣＤＲを含むＶＨドメインを含む抗体ＶＨドメイン、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７から選択されたアミノ酸配列を備えた一つ以上のＶＬ ＣＤＲを含むＶＬドメイン、を含む抗体ＶＬドメイン、を含むことができる。
上で参照した一つ以上のＣＤＲは、上記のＶＨ及びＶＬドメインから取りだし、適切なフレームワークに組み込んでよい。例えば、実質的に上記のような一つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列は、本明細書で具体的に開示する９Ｄ３３とは異なる抗体のフレームワーク領域に組み込んでよく、こうした抗体は、これにより、一つ以上のＣＤＲを組み込み、ＴＳＨ受容体との結合が可能となる。代替として、本発明は、ＴＳＨ受容体と結合可能で、本明細書で具体的に説明されるような一つ以上のＣＤＲに代表されるようなアミノ酸の一次構造配座を、随意的に更なるアミノ酸と共に含むポリペプチドを提供してよく、更なるアミノ酸は、本明細書で説明するような一つ以上のＣＤＲのＴＳＨ受容体に対する結合親和性を強化してよく、或いは、ポリペプチドのＴＳＨ受容体に対する結合特性に作用する役割を実質的に有していなくてもよい。
本明細書での使用において、断片という用語は、特に、具体的に本明細書で説明するような抗体の断片に関連し、本発明の重要な態様を形成すると理解されよう。これにより、本発明による更なる結合対象は、以下の断片のいずれかとして提供され得る：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインで構成されるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成されるＦｄ断片、（ｉｉｉ）ＶＬ及びＶＨドメインで構成されるＦｖ断片、（ｉｖ）ＶＨドメインで構成されるｄＡｂ断片、（ｖ）分離ＣＤＲ領域、（ｖｉ）二つの連結Ｆａｂ断片を含む二価の断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、及び（ｖｉｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが二ドメインを関連付けて抗原結合部位を形成可能なペプチドリンカによって連結される、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）。
代替として、９Ｄ３３等の本発明によるマウスモノクローナル抗体又は組み換え抗体は、完全なＩｇＧ抗体を含んでよく、これにより、抗体は可変及び定常領域を含む。
本発明では更に、以下を含むポリヌクレオチドが提供される：
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示したような、抗体ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はＣＤＲのアミノ酸配列を符号化する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８に示したようなヌクレオチド配列、
（ｉｉ）実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗原）を符号化するか、或いは、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗原）の抗体ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はＣＤＲのアミノ酸配列を符号化する、ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）遺伝コードの縮重により、コドン配列において（ｉ）の任意の配列と異なるヌクレオチド配列、
（ｉｖ）（ｉ）の任意の配列の対立変形物を含むヌクレオチド配列、
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、又は（ｉｖ）の配列のいずれかの断片を含むヌクレオチド配列、及び特に、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、又は（ｖ）の配列のいずれかの断片を含み、実質的に上記のようなヒトモノクローナル抗体のＦａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、分離ＣＤＲ領域、Ｆ（ａｂ’）２断片、又はｓｃＦｖ断片を符号化するヌクレオチド配列、
（ｖｉ）ヌクレオチド塩基の突然変異、欠失、又は置換により、（ｉ）の任意の配列と異なり、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象（通常は、ヒトモノクローナル抗体）を符号化するか、或いは、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象（通常は、ヒトモノクローナル抗体）の抗体ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はＣＤＲのアミノ酸配列を符号化するヌクレオチド配列。
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示したような、抗体ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はＣＤＲのアミノ酸配列を符号化する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８に示したようなヌクレオチド配列、
（ｉｉ）実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗原）を符号化するか、或いは、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗原）の抗体ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はＣＤＲのアミノ酸配列を符号化する、ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）遺伝コードの縮重により、コドン配列において（ｉ）の任意の配列と異なるヌクレオチド配列、
（ｉｖ）（ｉ）の任意の配列の対立変形物を含むヌクレオチド配列、
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、又は（ｉｖ）の配列のいずれかの断片を含むヌクレオチド配列、及び特に、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、又は（ｖ）の配列のいずれかの断片を含み、実質的に上記のようなヒトモノクローナル抗体のＦａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、分離ＣＤＲ領域、Ｆ（ａｂ’）２断片、又はｓｃＦｖ断片を符号化するヌクレオチド配列、
（ｖｉ）ヌクレオチド塩基の突然変異、欠失、又は置換により、（ｉ）の任意の配列と異なり、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象（通常は、ヒトモノクローナル抗体）を符号化するか、或いは、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象（通常は、ヒトモノクローナル抗体）の抗体ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はＣＤＲのアミノ酸配列を符号化するヌクレオチド配列。
本発明では更に、以下を含むポリヌクレオチドが提供される：
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７に示したような、抗体ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はＣＤＲのアミノ酸配列を符号化する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３６、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３７に示したようなヌクレオチド配列、
（ｉｉ）実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の更なる結合対象（通常、マウスモノクローナル抗原）を符号化するか、或いは、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の更なる結合対象（通常、マウスモノクローナル抗原）の抗体ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はＣＤＲのアミノ酸配列を符号化する、ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）遺伝コードの縮重により、コドン配列において（ｉ）の任意の配列と異なるヌクレオチド配列、
（ｉｖ）（ｉ）の任意の配列の対立変形物を含むヌクレオチド配列、
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、又は（ｉｖ）の配列のいずれかの断片を含むヌクレオチド配列、及び特に、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、又は（ｖ）の配列のいずれかの断片を含み、実質的に上記のようなマウスモノクローナル抗体のＦａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、分離ＣＤＲ領域、Ｆ（ａｂ’）２断片、又はｓｃＦｖ断片を符号化するヌクレオチド配列、
（ｖｉ）ヌクレオチド塩基の突然変異、欠失、又は置換により、（ｉ）の任意の配列と異なり、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の更なる結合対象（通常は、マウスモノクローナル抗体）を符号化するか、或いは、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の更なる結合対象（通常は、マウスモノクローナル抗体）の抗体ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はＣＤＲのアミノ酸配列を符号化するヌクレオチド配列。
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７に示したような、抗体ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はＣＤＲのアミノ酸配列を符号化する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３６、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３７に示したようなヌクレオチド配列、
（ｉｉ）実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の更なる結合対象（通常、マウスモノクローナル抗原）を符号化するか、或いは、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の更なる結合対象（通常、マウスモノクローナル抗原）の抗体ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はＣＤＲのアミノ酸配列を符号化する、ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）遺伝コードの縮重により、コドン配列において（ｉ）の任意の配列と異なるヌクレオチド配列、
（ｉｖ）（ｉ）の任意の配列の対立変形物を含むヌクレオチド配列、
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、又は（ｉｖ）の配列のいずれかの断片を含むヌクレオチド配列、及び特に、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、又は（ｖ）の配列のいずれかの断片を含み、実質的に上記のようなマウスモノクローナル抗体のＦａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、分離ＣＤＲ領域、Ｆ（ａｂ’）２断片、又はｓｃＦｖ断片を符号化するヌクレオチド配列、
（ｖｉ）ヌクレオチド塩基の突然変異、欠失、又は置換により、（ｉ）の任意の配列と異なり、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の更なる結合対象（通常は、マウスモノクローナル抗体）を符号化するか、或いは、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の更なる結合対象（通常は、マウスモノクローナル抗体）の抗体ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はＣＤＲのアミノ酸配列を符号化するヌクレオチド配列。
本発明による変形ポリヌクレオチドは、適切な場合、その全長に渡って（ｉ）の任意のポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％一致しており、極めて好適なものは、その全長に渡って（ｉ）の任意のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％一致する領域を含むポリヌクレオチドであり、その全長に渡って（ｉ）の任意のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％一致するポリヌクレオチドが特に好適であり、こうした特に好適なポリヌクレオチドのうち、少なくとも９５％一致するものは、とりわけ好適である。
本発明は、更に、実質的に上記のようなポリヌクレオチドを運び、宿主生物のゲノムにポリヌクレオチドを導入可能な生物学的機能ベクタ系を提供する。
本発明は、更に、本発明のポリヌクレオチドにより形質転換された宿主細胞と、組み換え手法による本発明のＴＳＨ受容体の結合対象の生成とに関する。宿主細胞は、ポリヌクレオチドを組み込み、本発明のＴＳＨ受容体の結合対象を発現するように遺伝子操作可能である。
本発明によるヒトモノクローナル抗体、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１のアミノ酸配列、及びそれを符号化するヌクレオチド配列と、本発明による更なる結合対象を表すマウスモノクローナル抗体、９Ｄ３３のアミノ酸配列、及びそれを符号化するヌクレオチド配列とは、下で説明する配列リストに記載されており、次のように指定できる。
ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１について：
アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１ ＶＨ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２ ＶＨＣＤＲＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３ ＶＨＣＤＲＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４ ＶＨＣＤＲＩＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５ 重鎖可変及び隣接定常領域
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６ ＶＬ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７ ＶＬＣＤＲＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８ ＶＬＣＤＲＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９ ＶＬＣＤＲＩＩＩ
ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ ＶＨ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１ ＶＨＣＤＲＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２ ＶＨＣＤＲＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３ ＶＨＣＤＲＩＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４ 重鎖可変及び隣接定常領域
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５ ＶＬ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６ ＶＬＣＤＲＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７ ＶＬＣＤＲＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８ ＶＬＣＤＲＩＩＩ
９Ｄ３３について：
アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９ ＶＨ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０ ＶＨＣＤＲＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１ ＶＨＣＤＲＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２ ＶＨＣＤＲＩＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３ 重鎖可変及び隣接定常領域
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４ ＶＬ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５ ＶＬＣＤＲＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６ ＶＬＣＤＲＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７ ＶＬＣＤＲＩＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８ 軽鎖可変及び隣接定常領域
ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９ ＶＨ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０ ＶＨＣＤＲＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１ ＶＨＣＤＲＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２ ＶＨＣＤＲＩＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３ 重鎖可変及び隣接定常領域
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４ ＶＬ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５ ＶＬＣＤＲＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３６ ＶＬＣＤＲＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３７ ＶＬＣＤＲＩＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３８ 軽鎖可変及び隣接定常領域
ｈＭａｂ ＴＳＨＲ１についての上記配列は、更に、次の図４、５、６、及び７を参照して確認できる。
アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１ ＶＨ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２ ＶＨＣＤＲＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３ ＶＨＣＤＲＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４ ＶＨＣＤＲＩＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５ 重鎖可変及び隣接定常領域
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６ ＶＬ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７ ＶＬＣＤＲＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８ ＶＬＣＤＲＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９ ＶＬＣＤＲＩＩＩ
ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０ ＶＨ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１ ＶＨＣＤＲＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２ ＶＨＣＤＲＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３ ＶＨＣＤＲＩＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４ 重鎖可変及び隣接定常領域
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５ ＶＬ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６ ＶＬＣＤＲＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７ ＶＬＣＤＲＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８ ＶＬＣＤＲＩＩＩ
９Ｄ３３について：
アミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９ ＶＨ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０ ＶＨＣＤＲＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１ ＶＨＣＤＲＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２ ＶＨＣＤＲＩＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３ 重鎖可変及び隣接定常領域
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４ ＶＬ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５ ＶＬＣＤＲＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６ ＶＬＣＤＲＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７ ＶＬＣＤＲＩＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８ 軽鎖可変及び隣接定常領域
ヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９ ＶＨ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０ ＶＨＣＤＲＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１ ＶＨＣＤＲＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２ ＶＨＣＤＲＩＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３ 重鎖可変及び隣接定常領域
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４ ＶＬ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５ ＶＬＣＤＲＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３６ ＶＬＣＤＲＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３７ ＶＬＣＤＲＩＩＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３８ 軽鎖可変及び隣接定常領域
ｈＭａｂ ＴＳＨＲ１についての上記配列は、更に、次の図４、５、６、及び７を参照して確認できる。
図４は、以下と共に、ｈＭａｂ ＴＳＨＲ１重鎖ヌクレオチド配列を、隣接定常領域と併せて示す図
図４ａは、ヌクレオチド配列自体を記載する図
図４ａは、ヌクレオチド配列自体を記載する図
図４ｂは、ＰＣＲプライマ、ＣＤＲＩ、ＣＤＲＩＩ、ＣＤＲＩＩＩ、及び定常領域を注記したヌクレオチド配列を記載する図
図５は、以下と共に、ｈＭａｂ ＴＳＨＲ１重鎖アミノ酸配列を、隣接定常領域と併せて示す図
図５ａは、アミノ酸配列自体を記載する図
図５は、以下と共に、ｈＭａｂ ＴＳＨＲ１重鎖アミノ酸配列を、隣接定常領域と併せて示す図
図５ａは、アミノ酸配列自体を記載する図
図５ｂは、ＣＤＲＩ、ＣＤＲＩＩ、ＣＤＲＩＩＩ、及び定常領域を注記したアミノ酸配列を記載する図
図６は、以下と共に、ｈＭａｂ ＴＳＨＲ１軽鎖ヌクレオチド配列を示す図
図６ａは、ヌクレオチド配列自体を記載する図
図６は、以下と共に、ｈＭａｂ ＴＳＨＲ１軽鎖ヌクレオチド配列を示す図
図６ａは、ヌクレオチド配列自体を記載する図
図６ｂは、ＰＣＲプライマ、ＣＤＲＩ、ＣＤＲＩＩ、及びＣＤＲＩＩＩ領域を注記したヌクレオチド配列を記載する図
図７は、以下と共に、ｈＭａｂ ＴＳＨＲ１軽鎖アミノ酸配列を示す図
図７ａは、アミノ酸配列自体を記載する図
図７は、以下と共に、ｈＭａｂ ＴＳＨＲ１軽鎖アミノ酸配列を示す図
図７ａは、アミノ酸配列自体を記載する図
図７ｂは、ＣＤＲＩ、ＣＤＲＩＩ、及びＣＤＲＩＩＩ領域を注記したアミノ酸配列を記載する図
上記から、ｈＭａｂ ＴＳＨＲ１のＶＨ鎖について、図４ｂに図示したようなＣＤＲＩ、ＣＤＲＩＩ、及びＣＤＲＩＩＩ領域のヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１、１２、及び１３に図示したＶＨＣＤＲＩ、ＶＨＣＤＲＩＩ、及びＶＨＣＤＲＩＩＩ配列に対応し、図５ｂに図示したようなＣＤＲＩ、ＣＤＲＩＩ、及びＣＤＲＩＩＩ領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、３、及び４に図示したＶＨＣＤＲＩ、ＶＨＣＤＲＩＩ、及びＶＨＣＤＲＩＩＩ配列に対応すると理解されよう。更に、上記から、ｈＭａｂ ＴＳＨＲ１のＶＬ鎖について、図６ｂに図示したようなＣＤＲＩ、ＣＤＲＩＩ、及びＣＤＲＩＩＩ領域のヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６、１７、及び１８に図示したＶＬＣＤＲＩ、ＶＬＣＤＲＩＩ、及びＶＬＣＤＲＩＩＩ配列に対応し、図７ｂに図示したようなＣＤＲＩ、ＣＤＲＩＩ、及びＣＤＲＩＩＩ領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、８、及び９に図示したＶＬＣＤＲＩ、ＶＬＣＤＲＩＩ、及びＶＬＣＤＲＩＩＩ配列に対応すると理解されよう。
（この技術で公知の手法により決定された）ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂの結晶構造の分析により、縮重したＰＣＲプライマを使用して決定されたＨＣ及びＬＣヌクレオチド配列の精緻化が可能となった。特に、ヌクレオチド１１５乃至１２０に関するＨＣ配列決定のアーチファクトが特定された。配列決定では、ｃａｃｇｔｇ（アミノ酸ＨｉｓＶａｌへ転写）を示したが、結晶構造では、アミノ酸Ｇｌｎ Ｌｅｕ（ｃａｇｃｔｇとなる塩基に対応）を、添付図面及び配列リストに示す精緻化された配列と共に示した。結晶構造分析は、特に縮重ＰＣＲプライマ領域において、ＨＣ及びＬＣ由来アミノ酸配列の精緻化も可能にした。ＬＣの場合、ａａ２は、ＲＴ−ＰＣＲではＰｒｏとされたが、結晶構造からはＴｈｒとなった。ＨＣの場合、ａａ２は、ＲＴ−ＰＣＲではＭｅｔとされたが、結晶構造からはＶａｌとなった。同じく、こうした精緻化配列は、添付図面及び配列リストに示している。
９Ｄ３３についての上記配列は、更に、次の図９、１０、１１、及び１２を参照して確認できる。
図９は、以下と共に、９Ｄ３３重鎖ヌクレオチド配列を、隣接定常領域と併せて示す図
図９ａは、ヌクレオチド配列自体を記載する図
図９は、以下と共に、９Ｄ３３重鎖ヌクレオチド配列を、隣接定常領域と併せて示す図
図９ａは、ヌクレオチド配列自体を記載する図
図９ｂは、ＰＣＲプライマ、ＣＤＲＩ、ＣＤＲＩＩ、ＣＤＲＩＩＩ、及び定常領域を注記したヌクレオチド配列を記載する図
図１０は、以下と共に、９Ｄ３３重鎖アミノ酸配列を、隣接定常領域と併せて示す図
図１０ａは、アミノ酸配列自体を記載する図
図１０は、以下と共に、９Ｄ３３重鎖アミノ酸配列を、隣接定常領域と併せて示す図
図１０ａは、アミノ酸配列自体を記載する図
図１０ｂは、ＣＤＲＩ、ＣＤＲＩＩ、ＣＤＲＩＩＩ、及び定常領域を注記したアミノ酸配列を記載する図
図１１は、以下と共に、９Ｄ３３軽鎖ヌクレオチド配列を示す図
図１１ａは、ヌクレオチド配列自体を記載する図
図１１は、以下と共に、９Ｄ３３軽鎖ヌクレオチド配列を示す図
図１１ａは、ヌクレオチド配列自体を記載する図
図１１ｂは、ＰＣＲプライマ、ＣＤＲＩ、ＣＤＲＩＩ、ＣＤＲＩＩＩ、及び定常領域を注記したヌクレオチド配列を記載する図
図１２は、以下と共に、９Ｄ３３軽鎖アミノ酸配列を示す図
図１２ａは、アミノ酸配列自体を記載する図
図１２は、以下と共に、９Ｄ３３軽鎖アミノ酸配列を示す図
図１２ａは、アミノ酸配列自体を記載する図
図１２ｂは、ＣＤＲＩ、ＣＤＲＩＩ、ＣＤＲＩＩＩ、及び定常領域を注記したアミノ酸配列を記載する図
上記から、９Ｄ３３のＶＨ鎖について、図９ｂに図示したようなＣＤＲＩ、ＣＤＲＩＩ、及びＣＤＲＩＩＩ領域のヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０、３１、及び３２に図示したＶＨＣＤＲＩ、ＶＨＣＤＲＩＩ、及びＶＨＣＤＲＩＩＩ配列に対応し、図１０ｂに図示したようなＣＤＲＩ、ＣＤＲＩＩ、及びＣＤＲＩＩＩ領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０、２１、及び２２に図示したＶＨＣＤＲＩ、ＶＨＣＤＲＩＩ、及びＶＨＣＤＲＩＩＩ配列に対応すると理解されよう。更に、上記から、９Ｄ３３のＶＬ鎖について、図１１ｂに図示したようなＣＤＲＩ、ＣＤＲＩＩ、及びＣＤＲＩＩＩ領域のヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５、３６、及び３７に図示したＶＬＣＤＲＩ、ＶＬＣＤＲＩＩ、及びＶＬＣＤＲＩＩＩ配列に対応し、図１２ｂに図示したようなＣＤＲＩ、ＣＤＲＩＩ、及びＣＤＲＩＩＩ領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５、２６、及び２７に図示したＶＬＣＤＲＩ、ＶＬＣＤＲＩＩ、及びＶＬＣＤＲＩＩＩ配列に対応すると理解されよう。
本発明は、更に、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体に対するヒトモノクローナル抗体を提供するプロセスを提供し、プロセスは、
（ｉ）対象者からのリンパ球ソースを提供するステップを備え、対象者は、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨの阻害に関して、血清１ｍＬ当たりＮＩＢＳＣ９０／６７２約０．０４単位より大きなＴＳＨ受容体抗体活性を有し、更に、
（ｉｉ）（ｉ）の当該リンパ球ソースからリンパ球を分離するステップと、
（ｉｉｉ）分離リンパ球を不死化するステップと、
（ｉｖ）実質的に上記のようなＴＳＨ受容体に対するヒトモノクローナル抗体を分泌する不死化コロニを生成するために、不死化リンパ球をクローニングするステップと、を備える。
（ｉ）対象者からのリンパ球ソースを提供するステップを備え、対象者は、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨの阻害に関して、血清１ｍＬ当たりＮＩＢＳＣ９０／６７２約０．０４単位より大きなＴＳＨ受容体抗体活性を有し、更に、
（ｉｉ）（ｉ）の当該リンパ球ソースからリンパ球を分離するステップと、
（ｉｉｉ）分離リンパ球を不死化するステップと、
（ｉｖ）実質的に上記のようなＴＳＨ受容体に対するヒトモノクローナル抗体を分泌する不死化コロニを生成するために、不死化リンパ球をクローニングするステップと、を備える。
代替として、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体に対するヒトモノクローナル抗体を提供するプロセスは、
（ｉ）対象者からのリンパ球ソースを提供するステップを備え、対象者は、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成の刺激活性に関して、血清１ｍＬ当たりＮＩＢＳＣ９０／６７２約０．１単位より大きなＴＳＨ受容体抗体活性を有し、更に
（ｉｉ）（ｉ）の当該リンパ球ソースからリンパ球を分離するステップと、
（ｉｉｉ）分離リンパ球を不死化するステップと、
（ｉｖ）実質的に上記のようなＴＳＨ受容体に対するヒトモノクローナル抗体を分泌する不死化コロニを生成するために、不死化リンパ球をクローニングするステップと、を備えるプロセスとして定義できる。
（ｉ）対象者からのリンパ球ソースを提供するステップを備え、対象者は、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成の刺激活性に関して、血清１ｍＬ当たりＮＩＢＳＣ９０／６７２約０．１単位より大きなＴＳＨ受容体抗体活性を有し、更に
（ｉｉ）（ｉ）の当該リンパ球ソースからリンパ球を分離するステップと、
（ｉｉｉ）分離リンパ球を不死化するステップと、
（ｉｖ）実質的に上記のようなＴＳＨ受容体に対するヒトモノクローナル抗体を分泌する不死化コロニを生成するために、不死化リンパ球をクローニングするステップと、を備えるプロセスとして定義できる。
好ましくは、本発明によるプロセスは、末梢血、甲状腺組織、脾臓組織、リンパ節、又は骨髄からリンパ球を分離するステップを備え、最も一般的には末梢血から分離する。通常、本発明による方法において使用するリンパ球のソースは、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨの阻害に関して１ｍＬ当たりＮＩＢＳＣ９０／６７２約０．１単位より大きな、或いは、更に一般的には、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨの阻害に関して１ｍＬ当たりＮＩＢＳＣ９０／６７２約０．２単位より大きな、或いは、更に一般的には、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨの阻害に関して１ｍＬ当たりＮＩＢＳＣ９０／６７２約０．３単位より大きな、及び、好ましくは、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨの阻害に関して１ｍＬ当たりＮＩＢＳＣ９０／６７２約０．３乃至０．５単位の範囲以上の、血清ＴＳＨ受容体抗体レベルを有する対象者から取得されたものとして、更に特徴付け可能である。代替として、又は追加として、本発明による方法において使用するリンパ球のソースは、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成の刺激活性に関して１ｍＬ当たりＮＩＢＳＣ９０／６７２約０．２単位より大きな、或いは、更に一般的には、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成の刺激活性に関して１ｍＬ当たりＮＩＢＳＣ９０／６７２約０．５単位より大きな、及び、好ましくは、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成の刺激活性に関して１ｍＬ当たりＮＩＢＳＣ９０／６７２約０．５乃至１．０単位の範囲以上の、血清ＴＳＨ受容体抗体レベルを有する対象者から取得されたものとして、更に特徴付け可能である。上記から、リンパ球を分離する対象者のＴＳＨ受容体に対する免疫反応は、好ましくは、高活性期にあるべきであると理解されよう。
好ましくは、本発明によるプロセスは、分離リンパ球をエプスタインバーウイルスに感染させるステップを備え、適切な場合、このように不死化したリンパ球をマウス／ヒト細胞株に融合させる。適切な場合、本発明によるプロセスは、更に、ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１単位／Ｌの感度を有するアッセイシステムにおいて、例えば、ＴＳＨ受容体と結合する１２５Ｉ ＴＳＨの阻害によって、結果として生じたＴＳＨ受容体抗体のクローンをスクリーニングするステップを備える。
本発明は、更に、ＴＳＨ受容体に対するヒト組み換え抗体、又はその一つ以上の断片を調製するプロセスを提供し、プロセスは、実質的に上記のようなプロセスによって本発明で提供されるようなＴＳＨ受容体に対するヒトモノクローナル抗体、或いはそこから誘導された一つ以上の断片のクローニング及び発現を備える。
本発明は、更に、実質的に上記のようなプロセスによって取得されたＴＳＨ受容体に対するヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体を提供する。好ましくは、本発明による、このように取得されたＴＳＨ受容体に対するヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体は、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１５単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位の、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨに対する阻害活性、或いは、こうしたヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体の一つ以上の断片によって特徴付けることが可能である。
更に具体的には、本発明によるヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体は、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２４０単位の、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成に対する刺激活性、或いは、こうしたヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体の一つ以上の断片によって更に特徴付け可能であることが好適となり得る。
本発明の好適な実施形態において、本発明によるヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体は、
（ｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１５単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位の、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨに対する阻害活性、及び、
（ｉｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２４０単位の、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成に対する刺激活性、
或いは、こうしたヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体の一つ以上の断片によって特徴付けることが可能である。
（ｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１５単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位の、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨに対する阻害活性、及び、
（ｉｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２４０単位の、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成に対する刺激活性、
或いは、こうしたヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体の一つ以上の断片によって特徴付けることが可能である。
更に、本発明による、このように取得されたヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体の一つ以上の断片、特に例えば、その一つ以上のＦａｂ断片は、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２４０単位の、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨに対する阻害活性によって特徴付け可能であることが好適となり得る。更に、こうした一つ以上の断片は、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約５０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１００単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２００単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約４００単位の、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成に対する刺激活性によって特徴付け可能であることが好適となり得る。
更に好ましくは、こうした一つ以上Ｆａｂ断片は、
（ｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２４０単位の、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨに対する阻害活性と、
（ｉｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約５０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１００単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２００単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約４００単位の、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成に対する刺激活性と、によって特徴付け可能である。
（ｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２４０単位の、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨに対する阻害活性と、
（ｉｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約５０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１００単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２００単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約４００単位の、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成に対する刺激活性と、によって特徴付け可能である。
実質的に上記のようなプロセスは、更に、更なるプロセス段階を備えてよく、これにより、取得されたヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体は、適切な更なる処理手法（スポット突然変異その他のような突然変異生成手法等）を施され、ＴＳＨ受容体との総合作用について、実質的に上記のような結合対象（ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１等）との競合が可能なＴＳＨ受容体の更なる結合対象が取得される。こうした更なる処理手法は、当業者に周知である。本発明は、更に、こうした更なる処理手法によって取得されたＴＳＨ受容体に対する更なる結合対象を提供する。
好ましくは、こうしたＴＳＨ受容体の更なる結合対象は、モノクローナル抗体又は組み換え抗体を含むことが可能であり、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１５単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位の、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨに対する阻害活性、或いは、その一つ以上の断片によって特徴付けることが可能である。本発明によるこうした更なる結合対象は、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２４０単位の、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成に対する刺激活性、或いは、その一つ以上の断片によって特徴付け可能であることも好適となり得る。
本発明のこうした更なる結合対象は、
（ｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１５単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位の、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨに対する阻害活性、及び
（ｉｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位、又は更により好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２４０単位の、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成に対する刺激活性、
或いは、その一つ以上の断片によって特徴付け可能であることも、更により好適となり得る。
（ｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１５単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、又は更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位の、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨに対する阻害活性、及び
（ｉｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約３０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約６０単位、更に好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約１２０単位、又は更により好ましくは、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも約２４０単位の、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成に対する刺激活性、
或いは、その一つ以上の断片によって特徴付け可能であることも、更により好適となり得る。
本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）は、診断及び治療用途を有してよい。
したがって、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）は、患者の血清内のＴＳＨ受容体に対する自己抗体を検出するスクリーニング方法と、更には診断方法とにおいて利用できる。これにより、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）は、ＴＳＨ受容体に対する自己抗体を検出するスクリーニング方法と、更には診断方法とにおいて使用される、これまでに説明した競合対象の代わりに、或いはこれに加えて、利用できる。同様に、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）は、ＴＳＨ受容体に対する自己抗体を検出する際に使用するキットにおいて使用される、これまでに説明した競合対象の代わりに、或いはこれに加えて、利用できる。
したがって、本発明は、更に、ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体をスクリーニングする方法を提供し、当該方法は、
（ａ）当該対象者からの当該体液試料を提供するステップと、
（ｂ）結合分子の一つ以上のペアを提供するステップと、を備え、当該結合ペアの第一の分子は、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象又は更なる結合対象が相互作用する結合領域を含み、更に、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）ＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と相互作用できるように、結合分子の当該一つ以上のペアに当該試料を接触させるステップと、
（ｄ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供するステップと、を備える。
（ａ）当該対象者からの当該体液試料を提供するステップと、
（ｂ）結合分子の一つ以上のペアを提供するステップと、を備え、当該結合ペアの第一の分子は、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象又は更なる結合対象が相互作用する結合領域を含み、更に、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）ＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と相互作用できるように、結合分子の当該一つ以上のペアに当該試料を接触させるステップと、
（ｄ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供するステップと、を備える。
上記のような自己抗体の検出のための本発明による方法は、その使用によって達成可能な感度のレベルに関して、特に有利である。これについては、実施例及び図面を参照して更に例示可能であり、図３ａは、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１−ビオチンに基づくＴＳＨＲ自己抗体アッセイと以前のアッセイとの比較のグラフ表示である。ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１−ビオチンに基づくアッセイの感度は、検出可能な国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２の濃度によれば明らかに優れている。これは、図３ｂに図示したグレーブス病患者７２人からの血清の調査において確認された。
したがって、本発明では、更に、ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体をスクリーニングする方法が提供され、当該方法は、
（ａ）当該対象者からの当該体液試料を提供するステップと、
（ｂ）結合分子の一つ以上のペアを提供するステップと、を備え、当該結合ペアの第一の分子は、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象又は更なる結合対象が相互作用する結合領域を含み、当該結合分子の相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものであり、更に、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）本発明によるＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と相互作用できるように、結合分子の当該一つ以上のペアに当該試料を接触させるステップと、
（ｄ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供するステップと、を備える。
（ａ）当該対象者からの当該体液試料を提供するステップと、
（ｂ）結合分子の一つ以上のペアを提供するステップと、を備え、当該結合ペアの第一の分子は、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象又は更なる結合対象が相互作用する結合領域を含み、当該結合分子の相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものであり、更に、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）本発明によるＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と相互作用できるように、結合分子の当該一つ以上のペアに当該試料を接触させるステップと、
（ｄ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供するステップと、を備える。
上記感度は、ＴＳＨ受容体に対するヒト又は非ヒトポリクローナル抗体、ＴＳＨ、或いはその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは、明確な感度の方法又はキットを提供できるようなＴＳＨ受容体に対する十分な親和性を一般に示す、１０１０モル−１以上のＴＳＨ受容体に対する親和性を有するＴＳＨ受容体の結合対象を用いて、本発明によるアッセイ方法又はキットにおいても達成できる。こうしたポリクローナル抗体、ＴＳＨ、或いはその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片の調製は、この技術において周知である。例えば、ＴＳＨの過剰活性類似体は、Nature, Biotechnology, Volume 14, October 1995, pages 1257-1263において説明されているが、この論文では、本発明によって提供される方法又はキットにおける、こうしたＴＳＨの使用を開示していない。
したがって、本発明では、更に、ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体をスクリーニングする方法が提供され、当該方法は、
（ａ）当該対象者からの当該体液試料を提供するステップと、
（ｂ）結合分子の一つ以上のペアを提供するステップと、を備え、当該結合ペアの第一の分子は、ＴＳＨ受容体に対するヒト又は非ヒトポリクローナル抗体を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該ポリクローナル抗体が相互作用する結合領域を含み、当該結合分子の相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものであり、更に、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）当該ポリクローナル抗体と相互作用できるように、結合分子の当該一つ以上のペアに当該試料を接触させるステップと、
（ｄ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供するステップと、を備える。
（ａ）当該対象者からの当該体液試料を提供するステップと、
（ｂ）結合分子の一つ以上のペアを提供するステップと、を備え、当該結合ペアの第一の分子は、ＴＳＨ受容体に対するヒト又は非ヒトポリクローナル抗体を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該ポリクローナル抗体が相互作用する結合領域を含み、当該結合分子の相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものであり、更に、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）当該ポリクローナル抗体と相互作用できるように、結合分子の当該一つ以上のペアに当該試料を接触させるステップと、
（ｄ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供するステップと、を備える。
本発明では、更に、ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体をスクリーニングする方法が提供され、当該方法は、
（ａ）当該対象者からの当該体液試料を提供するステップと、
（ｂ）結合分子の一つ以上のペアを提供するステップと、を備え、当該結合ペアの第一の分子は、ＴＳＨ、或いはその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該ＴＳＨ、或いはその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片が相互作用する結合領域を含み、当該結合分子の相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものであり、更に、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）当該ＴＳＨ、或いはその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片と相互作用できるように、結合分子の当該一つ以上のペアに当該試料を接触させるステップと、
（ｄ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供するステップと、を備える。
（ａ）当該対象者からの当該体液試料を提供するステップと、
（ｂ）結合分子の一つ以上のペアを提供するステップと、を備え、当該結合ペアの第一の分子は、ＴＳＨ、或いはその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該ＴＳＨ、或いはその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片が相互作用する結合領域を含み、当該結合分子の相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものであり、更に、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）当該ＴＳＨ、或いはその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片と相互作用できるように、結合分子の当該一つ以上のペアに当該試料を接触させるステップと、
（ｄ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供するステップと、を備える。
本発明では、更に又、ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体をスクリーニングする方法が提供され、当該方法は、
（ａ）当該対象者からの当該体液試料を提供するステップと、
（ｂ）結合分子の一つ以上のペアを提供するステップと、を備え、当該結合ペアの第一の分子は、１０１０モル−１以上のＴＳＨ受容体に対する親和性を有するＴＳＨ受容体の結合対象を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象が相互作用する結合領域を含み、当該結合分子の相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものであり、更に、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）ＴＳＨの当該結合対象と相互作用できるように、結合分子の当該一つ以上のペアに当該試料を接触させるステップと、
（ｄ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供するステップと、を備える。
（ａ）当該対象者からの当該体液試料を提供するステップと、
（ｂ）結合分子の一つ以上のペアを提供するステップと、を備え、当該結合ペアの第一の分子は、１０１０モル−１以上のＴＳＨ受容体に対する親和性を有するＴＳＨ受容体の結合対象を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象が相互作用する結合領域を含み、当該結合分子の相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものであり、更に、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）ＴＳＨの当該結合対象と相互作用できるように、結合分子の当該一つ以上のペアに当該試料を接触させるステップと、
（ｄ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供するステップと、を備える。
本発明では、ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体を検出するための、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）の使用法も提供され、当該結合対象又は更なる結合対象とＴＳＨ受容体との相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものとなる。
本発明では、ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体を検出するための、ＴＳＨ受容体に対するヒト又は非ヒトポリクローナル抗体の使用法も提供され、当該ポリクローナル抗体とＴＳＨ受容体との相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものとなる。
本発明では、ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体を検出するための、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）の使用法も提供され、当該結合対象又は更なる結合対象とＴＳＨ受容体との相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものとなる。
本発明では、ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体を検出するための、ＴＳＨ、或いはその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片の使用法も提供され、当該ＴＳＨ、或いはその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片とＴＳＨ受容体との相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものとなる。
本発明では、ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体を検出するための、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）の使用法も提供され、当該結合対象又は更なる結合対象とＴＳＨ受容体との相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものとなる。
本発明では、ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体を検出するための、１０１０モル−１以上のＴＳＨ受容体に対する親和性を有するＴＳＨ受容体の結合対象の使用法も提供され、当該結合対象とＴＳＨ受容体との相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものとなる。
一つ以上の結合ペアの結合分子は、抗原−抗体（例えば、［ＴＳＨ受容体又はエピトープ］−［モノクローナル又は組み換えＴＳＨ受容体抗体］）、抗イディオタイプ抗体−モノクローナル又は組み換えＴＳＨ受容体抗体、或いは新規のＴＳＨ受容体抗体結合要素−モノクローナル又は組み換えＴＳＨ受容体抗体にすることができると理解されよう。好ましくは、結合ペアの結合分子は、抗原−抗体、即ち、［ＴＳＨ受容体又はその一つ以上のエピトープ］−［モノクローナル又は組み換えＴＳＨ受容体抗体］であり、エピトープは、「自立」したものでよく、或いは、より大きな足場ポリペプチド又はその他に存在してもよい。
好ましくは、本発明は、ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体をスクリーニングする方法を提供し、当該方法は、
（ａ）当該対象者からの当該体液試料を提供するステップと、
（ｂ）ＴＳＨ受容体とＴＳＨ受容体に反応して生成された自己抗体との相互作用を可能にする条件下で、当該試料を、（ｉ）全長ＴＳＨ受容体又は一つ以上のそのエピトープ、或いはＴＳＨ受容体の一つ以上のエピトープを含むポリペプチド、及び（ｉｉ）本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）に接触させ、当該ＴＳＨ受容体、又は当該一つ以上のそのエピトープ、或いは当該ポリペプチドが、当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いはＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と相互作用できるようにするステップと、
（ｃ）当該ＴＳＨ受容体、又は当該一つ以上のそのエピトープ、或いは当該ポリペプチドと当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供するステップと、を備える。
（ａ）当該対象者からの当該体液試料を提供するステップと、
（ｂ）ＴＳＨ受容体とＴＳＨ受容体に反応して生成された自己抗体との相互作用を可能にする条件下で、当該試料を、（ｉ）全長ＴＳＨ受容体又は一つ以上のそのエピトープ、或いはＴＳＨ受容体の一つ以上のエピトープを含むポリペプチド、及び（ｉｉ）本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）に接触させ、当該ＴＳＨ受容体、又は当該一つ以上のそのエピトープ、或いは当該ポリペプチドが、当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いはＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と相互作用できるようにするステップと、
（ｃ）当該ＴＳＨ受容体、又は当該一つ以上のそのエピトープ、或いは当該ポリペプチドと当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供するステップと、を備える。
特定の実施形態において、本発明による方法は、本発明によって提供される方法の特定の実施形態における実質的に上記のようなポリクローナル抗体、ＴＳＨ、又はその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、若しくは断片、或いはＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象と、結合ペアの第二の分子、或いはＴＳＨ受容体、又はその一つ以上のエピトープ、若しくはポリペプチドとの相互作用において競合する、一つ以上の競合対象を利用してもよい。こうした競合対象は、ＴＳＨ、或いは、ＴＳＨ受容体に反応するマウスモノクローナル抗体等、ＴＳＨ受容体に反応する一つ以上のモノクローナル抗体を含んでよい。
好ましくは、上述した本発明による方法は、更に、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と、適切な場合には、上記のような一つ以上の競合対象とのための標識手段を提供するステップを備え、適切な標識手段は、酵素標識、同位体標識、化学発光標識、蛍光標識、及びその他を含む。
本発明は、更に、ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体をスクリーニングするキットを提供し、当該キットは、
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを備え、当該結合ペアの第一の分子は、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象又は更なる結合対象が相互作用する結合領域を含み、更に、
（ｂ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）ＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と相互作用できるように、当該対象者からの当該体液試料を結合分子の当該一つ以上のペアに接触させる手段と、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供する手段と、を備える。
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを備え、当該結合ペアの第一の分子は、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象又は更なる結合対象が相互作用する結合領域を含み、更に、
（ｂ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）ＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と相互作用できるように、当該対象者からの当該体液試料を結合分子の当該一つ以上のペアに接触させる手段と、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供する手段と、を備える。
本発明は、更に、ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体をスクリーニングするキットを提供し、当該キットは、
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを備え、当該結合ペアの第一の分子は、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象又は更なる結合対象が相互作用する結合領域を含み、当該結合分子の相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものであり、更に、
（ｂ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）本発明によるＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と相互作用できるように、当該対象者からの当該体液試料を結合分子の当該一つ以上のペアに接触させる手段と、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供する手段と、を備える。
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを備え、当該結合ペアの第一の分子は、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象又は更なる結合対象が相互作用する結合領域を含み、当該結合分子の相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものであり、更に、
（ｂ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）本発明によるＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と相互作用できるように、当該対象者からの当該体液試料を結合分子の当該一つ以上のペアに接触させる手段と、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供する手段と、を備える。
本発明は、更に、ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体をスクリーニングするキットを提供し、当該キットは、
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを備え、当該結合ペアの第一の分子は、ＴＳＨ受容体に対するヒト又は非ヒトポリクローナル抗体を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該ポリクローナル抗体が相互作用する結合領域を含み、当該結合分子の相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものであり、更に、
（ｂ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）当該ポリクローナル抗体と相互作用できるように、当該対象者からの当該体液試料を結合分子の当該一つ以上のペアに接触させる手段と、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供する手段と、を備える。
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを備え、当該結合ペアの第一の分子は、ＴＳＨ受容体に対するヒト又は非ヒトポリクローナル抗体を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該ポリクローナル抗体が相互作用する結合領域を含み、当該結合分子の相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものであり、更に、
（ｂ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）当該ポリクローナル抗体と相互作用できるように、当該対象者からの当該体液試料を結合分子の当該一つ以上のペアに接触させる手段と、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供する手段と、を備える。
本発明は、更に、ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体をスクリーニングするキットを提供し、当該キットは、
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを備え、当該結合ペアの第一の分子は、ＴＳＨ、或いはその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該ＴＳＨ、或いはその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片が相互作用する結合領域を含み、当該結合分子の相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものであり、更に、
（ｂ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）当該ＴＳＨ、或いはその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片と相互作用できるように、当該対象者からの当該体液試料を結合分子の当該一つ以上のペアに接触させる手段と、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供する手段と、を備える。
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを備え、当該結合ペアの第一の分子は、ＴＳＨ、或いはその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該ＴＳＨ、或いはその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片が相互作用する結合領域を含み、当該結合分子の相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものであり、更に、
（ｂ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）当該ＴＳＨ、或いはその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片と相互作用できるように、当該対象者からの当該体液試料を結合分子の当該一つ以上のペアに接触させる手段と、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供する手段と、を備える。
本発明は、更に、ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体をスクリーニングするキットを提供し、当該キットは、
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを備え、当該結合ペアの第一の分子は、１０１０モル−１以上のＴＳＨ受容体に対する親和性を有するＴＳＨ受容体の結合対象を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象が相互作用する結合領域を含み、当該結合分子の相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものであり、更に、
（ｂ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）ＴＳＨ受容体の当該結合対象と相互作用できるように、当該対象者からの当該体液試料を結合分子の当該一つ以上のペアに接触させる手段と、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供する手段と、を備える。
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを備え、当該結合ペアの第一の分子は、１０１０モル−１以上のＴＳＨ受容体に対する親和性を有するＴＳＨ受容体の結合対象を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象が相互作用する結合領域を含み、当該結合分子の相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものであり、更に、
（ｂ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）ＴＳＨ受容体の当該結合対象と相互作用できるように、当該対象者からの当該体液試料を結合分子の当該一つ以上のペアに接触させる手段と、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供する手段と、を備える。
一つ以上の結合ペアの結合分子は、抗原−抗体（例えば、［ＴＳＨ受容体又はエピトープ］−［モノクローナル又は組み換えＴＳＨ受容体抗体］）、抗イディオタイプ抗体−モノクローナル又は組み換えＴＳＨ受容体抗体、或いは新規のＴＳＨ受容体抗体結合要素−モノクローナル又は組み換えＴＳＨ受容体抗体にすることができると理解されよう。好ましくは、結合ペアの結合分子は、抗原−抗体、即ち、［ＴＳＨ受容体又はその一つ以上のエピトープ］−［モノクローナル又は組み換えＴＳＨ受容体抗体］であり、エピトープは、「自立」したものでよく、或いは、より大きな足場ポリペプチド又はその他に存在してもよい。
本発明は、好ましくは、ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体をスクリーニングするキットを提供し、当該キットは、
（ａ）全長ＴＳＨ受容体、又は一つ以上のそのエピトープ、或いはＴＳＨ受容体の一つ以上のエピトープを含むポリペプチドと、
（ｂ）本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と
（ｃ）ＴＳＨ受容体とＴＳＨ受容体に反応して生成された自己抗体との相互作用を可能にする条件下で、当該対象者からの当該体液試料、当該ＴＳＨ受容体、又は当該一つ以上のそのエピトープ、或いは当該ポリペプチドと、ＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）とを接触させ、当該ＴＳＨ受容体、又は当該一つ以上のそのエピトープ、或いは当該ポリペプチドが、当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いはＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と相互作用できるようにする手段と、
（ｄ）当該ＴＳＨ受容体、又は当該一つ以上のそのエピトープ、或いは当該ポリペプチドと当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供する手段と、を備える。
（ａ）全長ＴＳＨ受容体、又は一つ以上のそのエピトープ、或いはＴＳＨ受容体の一つ以上のエピトープを含むポリペプチドと、
（ｂ）本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と
（ｃ）ＴＳＨ受容体とＴＳＨ受容体に反応して生成された自己抗体との相互作用を可能にする条件下で、当該対象者からの当該体液試料、当該ＴＳＨ受容体、又は当該一つ以上のそのエピトープ、或いは当該ポリペプチドと、ＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）とを接触させ、当該ＴＳＨ受容体、又は当該一つ以上のそのエピトープ、或いは当該ポリペプチドが、当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いはＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と相互作用できるようにする手段と、
（ｄ）当該ＴＳＨ受容体、又は当該一つ以上のそのエピトープ、或いは当該ポリペプチドと当該試料中に存在する当該自己抗体との相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供する手段と、を備える。
特定の実施形態において、本発明によるキットは、更に、それぞれ上で定義されるようなポリクローナル抗体、ＴＳＨ、又はその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、若しくは断片、或いはＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象と、結合ペアの第二の分子、或いはＴＳＨ受容体、又はその一つ以上のエピトープ、或いはポリペプチドとの反応において競合する、一つ以上の競合対象を備えてもよい。こうした競合対象は、ＴＳＨ、或いは、ＴＳＨ受容体に反応するマウスモノクローナル抗体等、ＴＳＨ受容体に反応する一つ以上のモノクローナル抗体を含んでよい。
適切な場合、上述したキットは、更に、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と、適切な場合には、上記のような一つ以上の競合対象とのための標識手段を備え、適切な標識手段は、実質的に上記のようなものである。
ＴＳＨ受容体に対する自己抗体が存在する状態では、上記のような方法又はキットにおいて、ＴＳＨ受容体とＴＳＨ受容体の結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）との結合は、減少する。
本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）は、更に、ＴＳＨ及び関連リガンドのために、実質的に上記のようなアッセイ方法及びキットにおいて利用できる。
したがって、本発明は、更に、ＴＳＨ及び関連リガンドのアッセイを行う方法を提供し、当該方法は、
（ａ）ＴＳＨ又は関連リガンドを含有する疑いがある試料又は含有する試料を提供するステップと、
（ｂ）結合分子の一つ以上のペアを提供するステップと、を備え、当該結合ペアの第一の分子は、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象又は更なる結合対象が相互作用する結合領域を含み、更に、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ又は関連リガンド、或いは（ｉｉ）ＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と相互作用できるように、結合分子の当該一つ以上のペアに当該試料を接触させるステップと、
（ｄ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在するＴＳＨ又は関連リガンドとの相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ又は関連リガンドの存在の示度を提供するステップと、を備える。
（ａ）ＴＳＨ又は関連リガンドを含有する疑いがある試料又は含有する試料を提供するステップと、
（ｂ）結合分子の一つ以上のペアを提供するステップと、を備え、当該結合ペアの第一の分子は、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象又は更なる結合対象が相互作用する結合領域を含み、更に、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ又は関連リガンド、或いは（ｉｉ）ＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と相互作用できるように、結合分子の当該一つ以上のペアに当該試料を接触させるステップと、
（ｄ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在するＴＳＨ又は関連リガンドとの相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ又は関連リガンドの存在の示度を提供するステップと、を備える。
本発明は、更に、ＴＳＨ又は関連リガンドのアッセイを行うキットを提供し、当該キットは、
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを備え、当該結合ペアの第一の分子は、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象又は更なる結合対象が相互作用する結合領域を含み、更に、
（ｂ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ又は関連リガンド、或いは（ｉｉ）ＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と相互作用できるように、ＴＳＨ又は関連リガンドを含有する疑いがある試料又は含有する試料を結合分子の当該一つ以上のペアに接触させる手段と、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在するＴＳＨ又は関連リガンドとの相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ又は関連リガンドの存在の示度を提供するステップと、を備える。
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを備え、当該結合ペアの第一の分子は、本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象又は更なる結合対象が相互作用する結合領域を含み、更に、
（ｂ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ又は関連リガンド、或いは（ｉｉ）ＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）と相互作用できるように、ＴＳＨ又は関連リガンドを含有する疑いがある試料又は含有する試料を結合分子の当該一つ以上のペアに接触させる手段と、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在するＴＳＨ又は関連リガンドとの相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ又は関連リガンドの存在の示度を提供するステップと、を備える。
本発明は、更に、ＴＳＨ受容体の更なる結合対象を特定する方法も提供し、更なる結合対象は、ＴＳＨ受容体との結合が可能で、ＴＳＨ受容体との結合について、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象と競合し、更なる結合対象はＴＳＨを含まず、方法は、
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを提供するステップを備え、当該結合ペアの第一の分子は、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象が相互作用する結合領域を含み、更に、
（ｂ）アッセイの対象となる更なる結合対象を、ＴＳＨ受容体との結合について（ａ）の当該結合ペアの当該第一の分子と競合するＴＳＨ受容体の潜在的な更なる結合対象として提供するステップと、
（ｃ）（ａ）の当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）（ｂ）の当該更なる結合分子、或いは（ｉｉ）（ａ）の当該結合ペアの当該第一の分子と相互作用できるように、（ｂ）の当該更なる結合分子を（ａ）の結合分子の当該一つ以上のペアに接触させるステップと、
（ｄ）（ａ）の当該結合ペアの当該第二の分子と（ｂ）の当該更なる結合分子との相互作用をモニタリングし、これにより、（ｂ）の当該更なる結合分子がＴＳＨ受容体との結合について（ａ）の当該結合ペアの当該第一の分子と競合するかのアッセイを行うステップと、を備える。
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを提供するステップを備え、当該結合ペアの第一の分子は、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象が相互作用する結合領域を含み、更に、
（ｂ）アッセイの対象となる更なる結合対象を、ＴＳＨ受容体との結合について（ａ）の当該結合ペアの当該第一の分子と競合するＴＳＨ受容体の潜在的な更なる結合対象として提供するステップと、
（ｃ）（ａ）の当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）（ｂ）の当該更なる結合分子、或いは（ｉｉ）（ａ）の当該結合ペアの当該第一の分子と相互作用できるように、（ｂ）の当該更なる結合分子を（ａ）の結合分子の当該一つ以上のペアに接触させるステップと、
（ｄ）（ａ）の当該結合ペアの当該第二の分子と（ｂ）の当該更なる結合分子との相互作用をモニタリングし、これにより、（ｂ）の当該更なる結合分子がＴＳＨ受容体との結合について（ａ）の当該結合ペアの当該第一の分子と競合するかのアッセイを行うステップと、を備える。
本発明は、更に、ＴＳＨ受容体の更なる結合対象を特定するキットを提供し、更なる結合対象は、ＴＳＨ受容体との結合が可能で、ＴＳＨ受容体との結合について、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象と競合し、更なる結合対象はＴＳＨを含まず、キットは、
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを備え、当該結合ペアの第一の分子は、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象が相互作用する結合領域を含み、更に、
（ｂ）ＴＳＨ受容体との結合について（ａ）の当該結合ペアの当該第一の分子と競合するＴＳＨ受容体の潜在的な更なる結合対象としてアッセイの対象となる更なる結合対象に、（ａ）の結合分子の当該一つ以上のペアを接触させ、（ａ）の当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該更なる結合分子、或いは（ｉｉ）（ａ）の当該結合ペアの当該第一の分子と相互作用できるようにする手段と、
（ｃ）（ａ）の当該結合ペアの当該第二の分子と当該更なる結合分子との相互作用をモニタリングし、これにより、当該更なる結合分子がＴＳＨ受容体との結合について（ａ）の当該結合ペアの当該第一の分子と競合するかのアッセイを行う手段と、を備える。
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを備え、当該結合ペアの第一の分子は、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象を含み、当該結合ペアの第二の分子は、当該結合対象が相互作用する結合領域を含み、更に、
（ｂ）ＴＳＨ受容体との結合について（ａ）の当該結合ペアの当該第一の分子と競合するＴＳＨ受容体の潜在的な更なる結合対象としてアッセイの対象となる更なる結合対象に、（ａ）の結合分子の当該一つ以上のペアを接触させ、（ａ）の当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該更なる結合分子、或いは（ｉｉ）（ａ）の当該結合ペアの当該第一の分子と相互作用できるようにする手段と、
（ｃ）（ａ）の当該結合ペアの当該第二の分子と当該更なる結合分子との相互作用をモニタリングし、これにより、当該更なる結合分子がＴＳＨ受容体との結合について（ａ）の当該結合ペアの当該第一の分子と競合するかのアッセイを行う手段と、を備える。
本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）の更なる応用は、新型のＴＳＨ受容体抗体結合部位を特定及び提供するための使用である。本発明では、したがって、ＴＳＨ受容体の一つ以上のエピトープ領域を特定するプロセスが提供され、プロセスは、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）を、全長ＴＳＨ受容体又は一つ以上のその断片に接触させ、ＴＳＨ受容体の当該結合対象又は更なる結合対象と、当該全長ＴＳＨ受容体又は当該一つ以上のその断片との相互作用を可能にするステップと、当該結合対象又は更なる結合対象が相互作用する当該全長ＴＳＨ受容体又は当該一つ以上のその断片のアミノ酸を特定するステップとを備える。適切な場合、結合対象が相互作用したＴＳＨ受容体のアミノ酸を特定するために、結合対象又は更なる結合対象とＴＳＨ受容体の選択された断片及び全長ＴＳＨ受容体との相互作用が分析される。
更に、本発明は、ＴＳＨ受容体と結合する本発明によるモノクローナルＴＳＨ受容体抗体の領域に対する抗体の生成を可能にする。このように生成された抗イディオタイプ抗体は、ＴＳＨ受容体自己抗体、ＴＳＨ、及び関連化合物のアッセイのための新しいリガンドとしての可能性を有する。更に、ＴＳＨ受容体自己抗体、ＴＳＨ、及び関連化合物の作用を調節するｉｎ ｖｉｖｏでの有効な作用物質となり得る。したがって、本発明は、更に、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）の結合領域に対して生成された一つ以上の抗イディオタイプ抗体を提供し、その調製については、実施例において更に説明される。
モノクローナル抗体を使用して、新型の抗体結合部位を特定及び提供するその他の方法は周知である。例えば、JC Scott及びGP Smith、「エピトープライブラリによるペプチドリガンドの探索」、Science 1990; 249(4967): 386-390と、MA Myers, JM Davis, JC Tong, J Whisstock, M Scealy, IR MacKay, MJ Rowley、「ペプチドファージディスプレイ及び分子モデリングによって特定された糖尿病自己抗原ＧＡＤ65での配座エピトープ」、Journal of Immunology 2000; 165: 3830-3838と、によって説明されるような、ファージディスプレイランダムペプチドライブラリの抗体スクリーニングによるものである。非ペプチド化合物及び非ペプチド化合物のライブラリの抗体スクリーニングも実行可能である。
こうした手順を使用して特定及び提供された新型のＴＳＨ受容体抗体結合部位は、ＴＳＨ受容体自己抗体、ＴＳＨ、及び関連化合物のアッセイにおける新しいリガンドとしても有用となり得る。更に、ＴＳＨ受容体自己抗体、ＴＳＨ、及び関連化合物の作用を調節するｉｎ ｖｉｖｏでの有効な作用物質となり得る。
実質的に上記のような本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）は、治療においても有効に利用できる。したがって、本発明によって、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）の投与を備える治療の方法と、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）を（一つ以上の薬学的に許容できるその担体、希釈剤、又は賦形剤と共に）含む薬剤組成物と、薬剤又は組成物の製造における、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）の使用とが提供される。
ＴＳＨ受容体の結合対象、特に、本発明による患者のリンパ球に由来するＴＳＨ受容体に対するヒトモノクローナル抗体は、上記のように、例えば、競合結合測定法においてＴＳＨの代わりとなるもの等、グレーブス病の病原の理解と、ＴＳＨ受容体自己抗体を測定する新しい方法の開発とにとって価値のある試薬となる。更に、本発明による刺激性結合対象は、ＴＳＨ受容体を含む組織（例えば、甲状腺組織又は甲状腺癌組織）が刺激を必要とする時のｉｎ ｖｉｖｏでの用途を有する。したがって、本発明は、甲状腺組織及び／又はＴＳＨ受容体を含む組織において使用する薬剤又は組成物を提供する、特に、本発明によるＴＳＨ受容体の刺激性結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）は、腫瘍学、特に、甲状腺癌の診断、管理、及び利用において利用できる。
代替として、本発明のよるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象は、強力なＴＳＨ又は自己抗体アンタゴニスト（遮断抗体）となることが可能であり、本発明によるこうした遮断性ＴＳＨ受容体抗体は、ＴＳＨ受容体を含む組織（例えば、甲状腺組織又は甲状腺癌組織）の活性を、ＴＳＨ、ＴＳＨ受容体自己抗体、又はその他の刺激物質に対して、不活性化、或いは反応しないようにする必要がある時、ｉｎ ｖｉｖｏでの用途にとって価値がある。
更に、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象は、ＴＳＨ受容体を含む組織を、ＴＳＨ、ＴＳＨ受容体自己抗原、又はその他の刺激物質に対して不活性化可能な、又は反応しないようにできる、一つ以上の更なる作用物質と共に、組み合わせて提供される。通常、一つ以上の更なる作用物質は、ＴＳＨ受容体から独立して機能する。
ＴＳＨ受容体自己抗体の結合が不活性化又は阻害を必要とする場合の特定の治療用途は、ＴＳＨ受容体に対する自己免疫に関連する眼の後眼窩組織の疾患の治療におけるものであり、したがって、ＴＳＨ受容体自己抗体の結合を阻害するための、９Ｄ３３等、ＴＳＨ受容体と相互作用する遮断抗体の使用は、こうした疾患の治療において、重要な治療上の有用性を有する。ＴＳＨ受容体に対する自己免疫に関連する眼の後眼窩組織の上記疾患等、ＴＳＨ受容体自己抗体の結合の阻害を必要とする自己免疫疾患の治療は、代替として、本発明によって提供されるような結合対象又は更なる結合対象に対する抗イディオタイプ抗体を利用してよく、本明細書で説明する本発明の更なる態様からのこうした抗イディオタイプ抗体と、その更なる調製の詳細とについては、実施例で提示する。
更に詳しくは、したがって本発明は、ＴＳＨ受容体に対する自己免疫に関連する眼の後眼窩組織の疾患の治療における、ＴＳＨ受容体に対する更なる結合対象の使用を提供し、更なる結合対象は、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）のＴＳＨ受容体との結合を実質的に阻害する。本発明は、更に、ＴＳＨ受容体の活性化及び／又は刺激に関連する眼の後眼窩組織の疾患の治療用薬剤の製造における、ＴＳＨ受容体に対する更なる結合対象の使用を提供し、更なる結合対象は、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）のＴＳＨ受容体との結合を実質的に阻害する。更に、ＴＳＨ受容体に対する自己免疫に関連する眼の後眼窩組織の疾患を治療する方法が提供され、方法は、こうした疾患に罹患した患者又はこうした疾患の疑いがある患者に対する、ＴＳＨ受容体に対する更なる結合対象の治療有効量の投与を備え、更なる結合対象は、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）のＴＳＨ受容体との結合を実質的に阻害する。本発明のこうした実施形態において使用する更なる結合対象は、好ましくは、ＴＳＨ受容体との、本発明で提供されるような結合対象の結合、及びこのようなＴＳＨ受容体自己抗体の結合を実質的に阻害する遮断抗体を含み、こうした好適な抗体は、本明細書で説明したような９Ｄ３３を含むことができる。
本発明は更に、ＴＳＨ受容体に対する自己免疫に関連する眼の後眼窩組織の疾患の治療における、本発明による結合対象又は更なる結合対象の結合領域に対して生成された抗イディオタイプ抗体の使用を提供する。本発明は、更に、ＴＳＨ受容体の活性化及び／又は刺激に関連する眼の後眼窩組織の疾患の治療用薬剤の製造における、本発明による結合対象又は更なる結合対象の結合領域に対して生成された抗イディオタイプ抗体の使用を提供する。更に、ＴＳＨ受容体に対する自己免疫に関連する眼の後眼窩組織の疾患を治療する方法が提供され、方法は、こうした疾患に罹患した患者又はこうした疾患の疑いがある患者に対する、本発明による結合対象又は更なる結合対象の結合領域に対して生成された抗イディオタイプ抗体の治療有効量の投与を備える。
こうしたｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの応用において、ＴＳＨと比較した本発明で提供されるようなモノクローナル抗体の主要な利点の一つは、こうした抗体を操作できる相対的な容易さである。例えば、ＴＳＨアゴニスト又はアンタゴニスト活性の度合いを含む、親和性及び生物学的特徴といった特徴を変更するための、本発明によるモノクローナル抗体のＴＳＨ受容体結合領域の操作である。更に、本発明によるモノクローナル抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＴＳＨよりも遙かに長い半減期を有しており、これは特定のｉｎ ｖｉｖｏでの応用において大きな利点となり得る。更に、抗体の半減期は、操作可能であり、例えば、抗体のＦａｂ断片は、完全なＩｇＧよりも遙かに短い半減期を有する。
本発明による薬学的組成物は、経口、非経口、及び局所投与に適したものを含み、但し、最適な経路は、一般に、患者の状態と治療する特定の疾患とによって決まる。患者に投与される実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象の正確な量は、担当医師の責任となるが、但し、利用される容量は、患者の年齢及び性別、治療する特定の疾患、及び実質的に上記のような投与の経路を含む多数の要素によって決まる。
本発明では、更に、甲状腺組織及び／又はＴＳＨ受容体を含む組織を刺激する方法が提供され、方法は、こうした刺激を必要とする患者に対して、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象の診断又は治療有効量を投与するステップを備える。
本発明は、更に、甲状腺組織及び／又はＴＳＨ受容体を含む組織を刺激する上で同時に、別個に、又は連続して使用する、甲状腺組織及び／又はＴＳＨ受容体を含む組織を刺激可能な一つ以上の更なる作用物質と共に、実質的に上記のようなＴＳＨ受容体の結合対象を組み合わせて提供する。好ましくは、一つ以上の更なる作用物質は、組み換えヒトＴＳＨ及び／又はその一つ以上の変異体、類似体、誘導体、及び断片、或いは、こうした断片の変異体、類似体、又は誘導体を含む。代替として、一つ以上の更なる作用物質は、ＴＳＨ受容体との結合から独立して機能できる。
本発明によるＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）は、市販のキットで使用するＴＳＨ受容体抗体又は抗体群を含む必要がある患者血清の代替ソースとしても利用できる。更に、ＴＳＨ受容体の結合対象又は更なる結合対象（通常、ヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体）は、所定の濃度のＴＳＨ受容体抗体又は抗体群を含む必要がある調製物において、本発明に従って提供可能であり、これにより、ＴＳＨ受容体に対して、刺激活性等、所定の活性を備えた調製物が提供できる。随意的に、こうした調製物は、更に、ＧＡＤ、ＴＰＯ、又はその他に対するモノクローナル抗体等、一つ以上の更なるヒトモノクローナル抗体を含んでもよい。
以下の例示的な説明は、本明細書で使用した特定の用語の理解を容易にするために提供される。こうした説明は、便宜的に提供されるものであり、本発明を限定するものではない。
「ＴＳＨ受容体の結合対象」とは、ＴＳＨ受容体に対する結合特異性を有する分子を表す。本明細書で説明する結合対象は、天然に由来してよく、或いは、全体又は一部が合成的に生成されてもよい。こうした結合対象は、ＴＳＨ受容体の一つ以上のエピトープと特異的に結合し、したがって、これに対して相補的である、ドメイン又は領域を有する。特に、本明細書で説明する結合対象は、ＴＳＨ受容体に対するモノクローナル抗体又は組み換え抗体にすることが可能であり、更に詳しくは、ＴＳＨ受容体に対するヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体にすることが可能である。
「Ｃドメイン」とは、抗体分子において相対的に定常であるアミノ酸配列の領域を意味する。
「ＣＤＲ」とは、抗体分子の重鎖及び軽鎖に存在し、最も配列変動性の大きな領域を表す相補性決定領域を意味する。ＣＤＲは、可変ドメインの約１５乃至２０％に相当し、抗体の抗原結合部位を表す。
「ＦＲ」とは、フレームワーク領域を意味し、ＣＤＲに存在しない可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインの残りの部分を表す。
「ＨＣ」とは、重鎖可変ドメインとＩｇＧ定常領域の第一のドメインとを含む抗体分子の重鎖の一部を意味する。
「宿主細胞」は、形質転換又はトランスフェクションされた細胞であり、或いは、外因性ポリヌクレオチド配列による形質転換又はトランスフェクションが可能な細胞である。
「同一性」は、この技術で知られるものとして、配列を比較することで決定されるような、二つ以上のポリペプチド配列間又は二つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。
「ＬＣ」とは、抗体分子の軽鎖を意味する。
「ＮＩＢＳＣ９０／６７２」は、甲状腺刺激活性の国際標準である。甲状腺刺激活性の国際標準は、ＴＳＨ受容体自己抗体を有する単一のヒト患者からの凍結乾燥血漿蛋白質を含む一群のアンプルで構成される。この調製物は、国際共同研究において評価されたもので、甲状腺刺激及び甲状腺受容体結合活性の両方を有することが証明されている。ＷＨＯの生物学標準化専門委員会は、１９９５年の第４６回会合において、コード９０／６７２の調製物を甲状腺刺激抗体の国際標準に定めた。各アンプルは、０．０２Ｍリン酸緩衝液と、透析ヒト血漿蛋白質と、定義によるアンプル当たり０．１国際単位（１００ミリ国際単位）とを含む溶液１．０ｍｌの凍結乾燥残留物を含む。
本明細書で説明するヒトモノクローナル抗体による「ＴＳＨ受容体の刺激」は、ＴＳＨ受容体に結合するその能力と、これにより、ＴＳＨ受容体とのこうした結合の結果として、例えば、環状ＡＭＰの生成をもたらす能力とを意味する。こうした刺激は、ＴＳＨ又はＴＳＨ受容体自己抗体とＴＳＨ受容体との結合において見られる反応と類似しており、これにより、本明細書で説明するヒトモノクローナル抗体は、本質的に、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨ又はＴＳＨ受容体自己抗体により見られるものと同じ又は類似する結合反応を提供する。
「Ｖドメイン」とは、抗体分子内の可変性の高いアミノ酸配列の領域を意味する。
「ＶＨドメイン」とは、抗体分子の重鎖の可変領域又はドメインを意味する。
「ＶＬドメイン」とは、抗体分子の軽鎖の可変領域又はドメインを意味する。
次に、本発明について、以下の図面及び実施例により例示し、図面及び実施例は、本発明の範囲を決して限定しない。
実施例
材料及び方法
リンパ球の分離及びヒトモノクローナルＴＳＨ受容体自己抗体のクローニング
血液は、高レベルのＴＳＨ受容体に対する血清自己抗体（ＴＲＡｂ）を有するグレーブス病及び一型糖尿病の患者から取得した。この研究について、倫理委員会の承認を取得した。末梢血リンパ球を、血液試料２０ｍLからＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国チャルフォントセントジャイルズ、ＨＰ８ ４ＳＰ）で分離し、その後、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）（ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ−ＥＣＡＣＣ、英国ポートンダウン、ＳＰ４ ０ＪＧ）に感染させ、以前に説明したようにマウスマクロファージ支持細胞層で培養した（N Hayakawa, LDKE Premawardhana, M powell, M Masuda, C Arnold, J Sanders, M Evans, S Chen, JC Jaume, S Baekkeskov, B Rees Smith, J Furmaniak、「グルタミン酸デカルボキシラーゼに対するヒトモノクローナル自己抗体の分離及び特徴付け」、Autoimmunity 2002; 35: 343-355）。次に、ＥＢＶ不死化Ｂリンパ球を、マウス／ヒトハイブリッド細胞株Ｋ６Ｈ６／Ｂ５と融合し（WL Carroll, K Thilemans, J Dilley, R Levy、「ヒトＢ細胞腫瘍との融合対象としてのマウス×ヒトヘテロハイブリドーマ」、Journal of Immunological Methods 1986; 89: 61-72）、５細胞／ウェル及び最終時１／２細胞／ウェルで希釈を限定することにより二度クローニングし、単一のコロニを得た（RI Freshney, MG Freshney編、Culture of immortalized cells、Wiley-Liss, New York 1996; 283-297内のBJ Bolton, NK Spurr、「Ｂリンパ球」）。オリジナルのウェルと後続のクローンとは、可溶化ＴＳＨ受容体と結合する１２５Ｉ−ＴＳＨの阻害により、ＴＳＨ受容体に関してスクリーニングした（下記参照）。ＴＳＨ受容体自己抗体を生成する単一のクローンを組織培養フラスコで成長させた。
材料及び方法
リンパ球の分離及びヒトモノクローナルＴＳＨ受容体自己抗体のクローニング
血液は、高レベルのＴＳＨ受容体に対する血清自己抗体（ＴＲＡｂ）を有するグレーブス病及び一型糖尿病の患者から取得した。この研究について、倫理委員会の承認を取得した。末梢血リンパ球を、血液試料２０ｍLからＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国チャルフォントセントジャイルズ、ＨＰ８ ４ＳＰ）で分離し、その後、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）（ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ−ＥＣＡＣＣ、英国ポートンダウン、ＳＰ４ ０ＪＧ）に感染させ、以前に説明したようにマウスマクロファージ支持細胞層で培養した（N Hayakawa, LDKE Premawardhana, M powell, M Masuda, C Arnold, J Sanders, M Evans, S Chen, JC Jaume, S Baekkeskov, B Rees Smith, J Furmaniak、「グルタミン酸デカルボキシラーゼに対するヒトモノクローナル自己抗体の分離及び特徴付け」、Autoimmunity 2002; 35: 343-355）。次に、ＥＢＶ不死化Ｂリンパ球を、マウス／ヒトハイブリッド細胞株Ｋ６Ｈ６／Ｂ５と融合し（WL Carroll, K Thilemans, J Dilley, R Levy、「ヒトＢ細胞腫瘍との融合対象としてのマウス×ヒトヘテロハイブリドーマ」、Journal of Immunological Methods 1986; 89: 61-72）、５細胞／ウェル及び最終時１／２細胞／ウェルで希釈を限定することにより二度クローニングし、単一のコロニを得た（RI Freshney, MG Freshney編、Culture of immortalized cells、Wiley-Liss, New York 1996; 283-297内のBJ Bolton, NK Spurr、「Ｂリンパ球」）。オリジナルのウェルと後続のクローンとは、可溶化ＴＳＨ受容体と結合する１２５Ｉ−ＴＳＨの阻害により、ＴＳＨ受容体に関してスクリーニングした（下記参照）。ＴＳＨ受容体自己抗体を生成する単一のクローンを組織培養フラスコで成長させた。
ＴＳＨ受容体抗体調製物の生成、純化、及び標識
マウスＴＳＨ受容体ＭＡｂは、以前に説明したように生成し（Y Oda, J Sanders, M Evans, A Kiddie, A Munkley, C James, T Richards, J Wills, J Furmaniak, B Rees Smith、「モノクローナル抗体を使用したヒトチロトロピン（ＴＳＨ）受容体のエピトープ分析」、Thyroid 2000; 10: 1051-1059）、更に、ｐｃＤＮＡ３．１においてクローニングした全長ＴＳＨＲ ｃＤＮＡにより免疫性を与えたマウスから作成した（UA Hasan, AM Abai, DR Harper, BW Wren, WJW Morrow、「核酸免疫付与：第三世代ワクチンに関する概念及び手法」 Jpirnal of Immunological Methods 1999; 228:1-22）。
マウスＴＳＨ受容体ＭＡｂは、以前に説明したように生成し（Y Oda, J Sanders, M Evans, A Kiddie, A Munkley, C James, T Richards, J Wills, J Furmaniak, B Rees Smith、「モノクローナル抗体を使用したヒトチロトロピン（ＴＳＨ）受容体のエピトープ分析」、Thyroid 2000; 10: 1051-1059）、更に、ｐｃＤＮＡ３．１においてクローニングした全長ＴＳＨＲ ｃＤＮＡにより免疫性を与えたマウスから作成した（UA Hasan, AM Abai, DR Harper, BW Wren, WJW Morrow、「核酸免疫付与：第三世代ワクチンに関する概念及び手法」 Jpirnal of Immunological Methods 1999; 228:1-22）。
ＩｇＧは、ＰｒｏｓｅｐＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＵＫＬｔｄ．、英国ウォトフォード、ＷＤ１８ ８ＹＨ）での親和性クロマトグラフィを使用して、製造者の取扱説明書と、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって評価した純度とにより、組織培養の上清から純化した。
ヒト重鎖アイソタイプは、放射状拡散アッセイを使用して決定した（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ、英国バーミンガム、Ｂ２９ ６ＡＴ）。ヒト軽鎖アイソタイプは、抗ヒトカッパ鎖及び抗ヒトラムダ鎖特異性マウスモノクローナル抗体によるウェスタンブロットを使用して決定した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ．、英国ギリンガム、ＳＰ８ ４ＸＴ）。
純化ＩｇＧ調製物は、（特定のモノクローナル抗体に応じて）１：１０乃至１：１００の酵素／蛋白質比でｍｅｒｃｕｒｉｐａｐａｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により処理し、Ｐｒｏｓｅｐ Ａカラムを通過させ、Ｆａｂ調製物から完全なＩｇＧ又はＦｃ断片を全て除去した（Y Oda, J Sanders, S Roberts, M Maruyama, R Kato, M Perez, VB Petersen, N Wedlock, J Furmaniak, B Rees Smith、「ＴＳＨ受容体に対する抗体の結合特性」、Journal of Molecular Endocrinology 1998; 20: 233-244）。完全なＩｇＧは、Ｆａｂ調製物において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは検出されなかった。モノクローナル抗体のＩｇＧ及びＦａｂ調製物は、以前に説明したように１２５Ｉにより標識した（Y Oda, J Sanders, S Roberts, M Maruyama, R Kato, M Perez, VB Petersen, N Wedlock, J Furmaniak, B Rees Smith、「ＴＳＨ受容体に対する抗体の結合特性」、Journal of Molecular Endocrinology 1998; 20: 233-244）。ＩｇＧ調製物は、ビオチンヒドラジド（Ｐｉｅｒｃｅ、米国ロックフォード、ＩＬ６１１０５）により、製造者の取扱説明書に従って標識した。ヒトモノクローナルＴＳＨ受容体自己抗体のＦａｂ断片の結晶を取得し、標準的な手法を使用して、その結晶構造を決定した。
患者
様々な罹患期間のグレーブス病患者からの血清を調査した。調査した患者の血清は、ＴＳＨ受容体と結合する１２５Ｉ標識ＴＳＨの阻害を示した（下記参照）。加えて、アジソン病（Ａ１及びＡ２）及び２ｌ−ＯＨに対する高レベルの自己抗体（１ｍＬ当たり１１３及び１９７０単位、ＲＳＲキット）を有する患者二人からの血清と、一型糖尿病（Ｄ１及びＤ２）及び高レベルのＧＡＤ６５（１ｍＬ当たり３７００及び３７．５単位、ＲＳＲキット）を有する患者二人からの血清とを調査した。患者からは、調査についてのインフォームドコンセントを取得した。健康な供血者からの血清（Ｇｏｌｄｅｎ Ｗｅｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、米国ビスタ、ＣＡ９２０８３から購入）も調査した。ＴＲＡｂの第一の国際標準調製物（９０／６７２）は、国立生物基準管理研究所（ＮＩＢＳＣ、英国ポッターズバー、ＥＮ６３ＱＨ）から取得した。
様々な罹患期間のグレーブス病患者からの血清を調査した。調査した患者の血清は、ＴＳＨ受容体と結合する１２５Ｉ標識ＴＳＨの阻害を示した（下記参照）。加えて、アジソン病（Ａ１及びＡ２）及び２ｌ−ＯＨに対する高レベルの自己抗体（１ｍＬ当たり１１３及び１９７０単位、ＲＳＲキット）を有する患者二人からの血清と、一型糖尿病（Ｄ１及びＤ２）及び高レベルのＧＡＤ６５（１ｍＬ当たり３７００及び３７．５単位、ＲＳＲキット）を有する患者二人からの血清とを調査した。患者からは、調査についてのインフォームドコンセントを取得した。健康な供血者からの血清（Ｇｏｌｄｅｎ Ｗｅｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、米国ビスタ、ＣＡ９２０８３から購入）も調査した。ＴＲＡｂの第一の国際標準調製物（９０／６７２）は、国立生物基準管理研究所（ＮＩＢＳＣ、英国ポッターズバー、ＥＮ６３ＱＨ）から取得した。
ＴＳＨ受容体と結合する１２５Ｉ−ＴＳＨ及び１２５Ｉ−マウスＴＳＨＲＭＡｂの阻害
結合阻害アッセイは、以前に説明したようなＴＳＨ受容体被覆チューブを使用して実行した（J Sanders, Y Oda, S Roberts, A Kiddie, T Richards, J Bolton, V McGrath, S Walters, D Jaskolski, J Furmaniak, B Rees Smith、「ＴＳＨ受容体自己抗体と125Ｉ標識ＴＳＨ受容体との相互作用」、Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1999; 84: 3797-3802）（ＲＳＲ Ｌｔｄの試薬）。簡単に言うと、試料（組織培養上清、純化ＩｇＧ又はＦａｂ断片、患者の血清又はＮＩＢＳＣ９０／６７２基準）１００μＬを、ＴＳＨ受容体被覆チューブにおいて、室温で二時間、穏やかに振動させて培養した。吸引後、チューブをアッセイ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ トリスＨＣｌ ｐＨ７．８、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）１ｍＬにより二度洗浄した後、１２５Ｉ−ＴＳＨ又は１２５Ｉ−ＭＡｂ（５×１０４ｃｐｍ）１００μＬを追加し、室温で一時間、振動させて培養した。その後、チューブをアッセイ緩衝液１ｍＬで二度洗浄し、吸引して、ガンマカウンタにおいて計数した。
結合阻害アッセイは、以前に説明したようなＴＳＨ受容体被覆チューブを使用して実行した（J Sanders, Y Oda, S Roberts, A Kiddie, T Richards, J Bolton, V McGrath, S Walters, D Jaskolski, J Furmaniak, B Rees Smith、「ＴＳＨ受容体自己抗体と125Ｉ標識ＴＳＨ受容体との相互作用」、Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1999; 84: 3797-3802）（ＲＳＲ Ｌｔｄの試薬）。簡単に言うと、試料（組織培養上清、純化ＩｇＧ又はＦａｂ断片、患者の血清又はＮＩＢＳＣ９０／６７２基準）１００μＬを、ＴＳＨ受容体被覆チューブにおいて、室温で二時間、穏やかに振動させて培養した。吸引後、チューブをアッセイ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ トリスＨＣｌ ｐＨ７．８、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）１ｍＬにより二度洗浄した後、１２５Ｉ−ＴＳＨ又は１２５Ｉ−ＭＡｂ（５×１０４ｃｐｍ）１００μＬを追加し、室温で一時間、振動させて培養した。その後、チューブをアッセイ緩衝液１ｍＬで二度洗浄し、吸引して、ガンマカウンタにおいて計数した。
結合の阻害は、次のように計算した。
１００×１−試験材料が存在する場合の結合ｃｐｍ
対照材料が存在する場合の結合ｃｐｍ
使用した対照材料は、培地、健康な供血者の血清プール、或いはその他の記載のものとした。
対照材料が存在する場合の結合ｃｐｍ
使用した対照材料は、培地、健康な供血者の血清プール、或いはその他の記載のものとした。
甲状腺刺激活性の分析
モノクローナル自己抗体調製物と患者の血清とがｈＴＳＨ受容体（細胞当たり約５０，０００受容体）を発現するＣＨＯ細胞において環状ＡＭＰ（又はｃＡＭＰ）の生成を刺激する能力（Y Oda, J Sanders, S Roberts, M Maruyama, R Kato, M Perez, VB Petersen, N Wedlock, J Furmaniak, B Rees Smith、「ＴＳＨ受容体に対する抗体の結合特性」、Journal of Molecular Endocrinology 1998; 20: 233-244）は、R Latif, P Graves, TF Davies、「ヒトチロトロピン受容体のオリゴマ化」Journal of Biological Chemistry 2001; 276: 45217-45224の方法に従って実行した。簡単に言うと、ＣＨＯ細胞を８６ウェルプレートに接種し（ウェル当たり３０，０００細胞）、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄ、英国ペイズリ、ＰＡ４ ９ＲＦ）において２４時間培養した。その後、ウシ胎仔血清なしで、ＤＭＥＭにおいて、培養を更に２４時間継続した。次に、ＤＭＥＭを除去し、試験ＴＳＨ、ＩｇＧ、Ｆａｂ、及び血清（１ｇ／Ｌグルコースと、２０ｍｍｏｌ／ＬＨｅｐｅｓと、２２２ｍｍｏｌ／Ｌスクロースと、１５ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ３イソブチル−１−メチルキサンチン ｐＨ７．４と、を含有するＮａＣｌなしのハンクの緩衝食塩溶液において１００μｌを希釈）を追加し、３７℃で一時間培養した。試験溶液の除去後、細胞を溶解させ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国チャルフォントセントジャイルズ、ＨＰ８ ４ＳＰのＢｉｏｔｒａｋ酵素イムノアッセイシステムを使用して、環状ＡＭＰのアッセイを行った。一部の実験では、患者の血清とＴＳＨＲに対するマウスモノクローナル抗体とがＴＳＨ又はｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１の刺激活性を阻害する能力を評価した。これは、（ａ）ＴＳＨ又はｓＭＡｂ ＴＳＨＲ１単独の刺激作用と（ｂ）患者の血清又はマウスモノクローナル抗体が存在する場合のＴＳＨ又はｓＭＡｂ ＴＳＨＲ１の刺激作用とを比較することで実行した。
モノクローナル自己抗体調製物と患者の血清とがｈＴＳＨ受容体（細胞当たり約５０，０００受容体）を発現するＣＨＯ細胞において環状ＡＭＰ（又はｃＡＭＰ）の生成を刺激する能力（Y Oda, J Sanders, S Roberts, M Maruyama, R Kato, M Perez, VB Petersen, N Wedlock, J Furmaniak, B Rees Smith、「ＴＳＨ受容体に対する抗体の結合特性」、Journal of Molecular Endocrinology 1998; 20: 233-244）は、R Latif, P Graves, TF Davies、「ヒトチロトロピン受容体のオリゴマ化」Journal of Biological Chemistry 2001; 276: 45217-45224の方法に従って実行した。簡単に言うと、ＣＨＯ細胞を８６ウェルプレートに接種し（ウェル当たり３０，０００細胞）、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄ、英国ペイズリ、ＰＡ４ ９ＲＦ）において２４時間培養した。その後、ウシ胎仔血清なしで、ＤＭＥＭにおいて、培養を更に２４時間継続した。次に、ＤＭＥＭを除去し、試験ＴＳＨ、ＩｇＧ、Ｆａｂ、及び血清（１ｇ／Ｌグルコースと、２０ｍｍｏｌ／ＬＨｅｐｅｓと、２２２ｍｍｏｌ／Ｌスクロースと、１５ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ３イソブチル−１−メチルキサンチン ｐＨ７．４と、を含有するＮａＣｌなしのハンクの緩衝食塩溶液において１００μｌを希釈）を追加し、３７℃で一時間培養した。試験溶液の除去後、細胞を溶解させ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国チャルフォントセントジャイルズ、ＨＰ８ ４ＳＰのＢｉｏｔｒａｋ酵素イムノアッセイシステムを使用して、環状ＡＭＰのアッセイを行った。一部の実験では、患者の血清とＴＳＨＲに対するマウスモノクローナル抗体とがＴＳＨ又はｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１の刺激活性を阻害する能力を評価した。これは、（ａ）ＴＳＨ又はｓＭＡｂ ＴＳＨＲ１単独の刺激作用と（ｂ）患者の血清又はマウスモノクローナル抗体が存在する場合のＴＳＨ又はｓＭＡｂ ＴＳＨＲ１の刺激作用とを比較することで実行した。
可変領域遺伝子分析
トータルＲＮＡは、酸フェノールグアニジン法（P Chomezynski, N Sacchi、「酸グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出によるＲＮＡ分離の単一ステップ法」、Analytical Biochemistry 1987; 162: 156-159）を使用してＴＳＨ自己抗体を生成するクローンの１×１０７細胞から調製し、ｍＲＮＡは、オリゴｄＴ磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｄ、英国ウィラル、ＣＨ６２ ３ＱＬ）を使用して調製した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄ、英国ペイズリ、ＰＡ４ ９ＲＦからの試薬を使用して実行した。
トータルＲＮＡは、酸フェノールグアニジン法（P Chomezynski, N Sacchi、「酸グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出によるＲＮＡ分離の単一ステップ法」、Analytical Biochemistry 1987; 162: 156-159）を使用してＴＳＨ自己抗体を生成するクローンの１×１０７細胞から調製し、ｍＲＮＡは、オリゴｄＴ磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｄ、英国ウィラル、ＣＨ６２ ３ＱＬ）を使用して調製した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄ、英国ペイズリ、ＰＡ４ ９ＲＦからの試薬を使用して実行した。
センス鎖オリゴヌクレオチドプライマは、英国医学研究審議会のＶ−ｂａｓｅデータベース（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）により推奨された配列を使用して設計した。ヒトＩｇＧ１重鎖及びラムダ軽鎖に特異的なアンチセンスプライマは、ＤＮＡ配列を符号化する定常領域に基づくものとした。センス及びアンチセンスプライマは、両方とも、ＰＣＲ産物のクローニングを促進するために付加的な５’限定エンドヌクレアーゼ部位配列を含んだ。ＩｇＧ１重鎖及びラムダ軽鎖ＲＴ−ＰＣＲ反応は、適切なプライマの完全なパネルを使用して実行した。全てのプライマは、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄで合成されたものである。ＲＴ反応は、５０℃で１０分間発生させ、直後に、ＰＣＲ４０サイクル（１５秒９４℃、３０秒５５℃、３０秒７２℃）を行った。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、ｐＵＣ１８においてクローニングし、Ｐｒｏｍｅｇａ ＵＫ Ｌｔｄ、英国サウスハンプトン、ＳＯ１６ ７ＮＳのＷｉｚａｒｄキットを使用してＤＮＡを調製し、サンガ−クールソン法によって配列を決定した（F Sanger, S Nicklen, AR Coulson、「連鎖停止阻害物質によるＤＮＡ配列決定」、Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 1977; 74: 5463-5467）。Ｖ領域配列は、Ｉｇ ｂｌａｓｔ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／ｉｇｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を使用して、ヒトＩｇ遺伝子の利用可能な配列と比較した。
免疫沈降アッセイ（ＩＰＡ）
全長ＴＳＨ受容体を符号化するｃＤＮＡを、ｐＹＥＳ２（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてＴ７プロモータの下流に配置し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴｎＴシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ ＵＫ Ｌｔｄ）において使用して、以前に説明したように３５Ｓ−メチオニンにより標識されたＴＳＨ受容体を生成した（L Prentice, J Sanders, M Perez, R Kato, J Sawicka, Y Oda, D Jaskoiski, J Furmaniak, B Rees Smith、「チロトロピン（ＴＳＨ）受容体自己抗体は、ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳システムにおいて生成されたＴＳＨ受容体と結合するように思えない」、Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1997; 82: 1288-1292）。簡単に言うと、ＨＳＢ（１０ｍｍｏｌ／ＬトリスＨＣｌ ｐＨ８．３、２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、及び１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン）において希釈した３５Ｓ標識ＴＳＨ受容体（２５０００乃至３００００ｃｐｍ）５０μＬを、希釈した試験試料の重複５０μＬアリコートに追加し、室温で二時間培養した。その後、プロテインＡセファロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の追加により免疫複合物を沈殿させ、シンチレーションカウンタにおいて計数した。
全長ＴＳＨ受容体を符号化するｃＤＮＡを、ｐＹＥＳ２（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてＴ７プロモータの下流に配置し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴｎＴシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ ＵＫ Ｌｔｄ）において使用して、以前に説明したように３５Ｓ−メチオニンにより標識されたＴＳＨ受容体を生成した（L Prentice, J Sanders, M Perez, R Kato, J Sawicka, Y Oda, D Jaskoiski, J Furmaniak, B Rees Smith、「チロトロピン（ＴＳＨ）受容体自己抗体は、ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳システムにおいて生成されたＴＳＨ受容体と結合するように思えない」、Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1997; 82: 1288-1292）。簡単に言うと、ＨＳＢ（１０ｍｍｏｌ／ＬトリスＨＣｌ ｐＨ８．３、２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、及び１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン）において希釈した３５Ｓ標識ＴＳＨ受容体（２５０００乃至３００００ｃｐｍ）５０μＬを、希釈した試験試料の重複５０μＬアリコートに追加し、室温で二時間培養した。その後、プロテインＡセファロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の追加により免疫複合物を沈殿させ、シンチレーションカウンタにおいて計数した。
ＴＳＨ受容体の調製及びウェスタンブロット
全長ヒトＴＳＨ受容体をＣＨＯ−Ｋ１細胞において発現させ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により抽出し、以前に説明したように、ＴＳＨ受容体モノクローナル抗体親和性クロマトグラフィにより純化した（Y Oda, J Sanders, M Evans, A Kiddie, A Munkley, C James, T Richards, J Wills, J Furmaniak, B Rees Smith、「モノクローナル抗体を使用したヒトチロトロピン（ＴＳＨ）受容体のエピトープ分析」、Thyroid 2000; 10: 1051-1059）。
全長ヒトＴＳＨ受容体をＣＨＯ−Ｋ１細胞において発現させ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により抽出し、以前に説明したように、ＴＳＨ受容体モノクローナル抗体親和性クロマトグラフィにより純化した（Y Oda, J Sanders, M Evans, A Kiddie, A Munkley, C James, T Richards, J Wills, J Furmaniak, B Rees Smith、「モノクローナル抗体を使用したヒトチロトロピン（ＴＳＨ）受容体のエピトープ分析」、Thyroid 2000; 10: 1051-1059）。
純化ＣＨＯ細胞で生成したＴＳＨ受容体を、９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に広げ、ニトロセルロース上にブロットし、以前に説明したように、試験抗体と反応させた（Y Oda, J Sanders, M Evans, A Kiddie, A Munkley, C James, T Richards, J Wills, J Furmaniak, B Rees Smith、「モノクローナル抗体を使用したヒトチロトロピン（ＴＳＨ）受容体のエピトープ分析」、Thyroid 2000; 10: 1051-1059）。
ＴＳＨ受容体ペプチドを使用したエピトープ分析
ヒトＴＳＨ受容体の細胞外ドメイン全体をカバーする、それぞれの長さが２５ａａである２６のペプチドは、Ｊ Ｍｏｒｒｉｓ博士から快く提供された（JC Morris, ER Bergert, DJ McCormick、「ヒトチロトロピン受容体の構造−機能研究。合成ヒトＴＳＨ受容体ペプチドによる標識チロトロピン（ＴＳＨ）の結合の阻害」Journal of Biological Chemistry 1993; 268: 10900-10905）。Ｍ２１−ＯＨ５ ＭＡｂと結合するヒト２１−ＯＨペプチド（Ｃ１、ＳＳＳＲＶＰＹＫＤＲＡＲＬＰＬ）（S Chen, J Sawicka, L Prentice, JF Sanders, H Tanaka, V Petersen, C Betterle, M Volpato, S Roberts, M Powell, B Rees Smith, J Furmaniak、「モノクローナル抗体のパネルを使用したステロイド２１−ヒドロキシラーゼ上の自己抗体エピトープの分析」Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1998; 83: 2977-2986）を陽性対照として使用し、ＧＡＤ６５に対するヒトモノクローナル抗体（N Hayakawa, LDKE Premawardhana, M Powell, M Masuda, C Arnold, J Sanders, M Evans, S Chen, JC Jaurne, S Baekkeskov, B Rees Smith, J Furimaniak、「グルタミン酸デカルボキシラーゼに対するヒトモノクローナル自己抗体の分離及び特徴付け」、Autoimmunity 2002; 35: 343-355）を陰性対照として使用した。ペプチドＥＬＩＳＡは、以前に説明したように実施した（Y Oda, J Sanders, M Evans, A Kiddie, A Munkley, C James, T Richards, J Wills, J Furmaniak, B Rees Smith、「モノクローナル抗体を使用したヒトチロトロピン（ＴＳＨ）受容体のエピトープ分析」、Thyroid 2000; 10: 1051-1059）。
ヒトＴＳＨ受容体の細胞外ドメイン全体をカバーする、それぞれの長さが２５ａａである２６のペプチドは、Ｊ Ｍｏｒｒｉｓ博士から快く提供された（JC Morris, ER Bergert, DJ McCormick、「ヒトチロトロピン受容体の構造−機能研究。合成ヒトＴＳＨ受容体ペプチドによる標識チロトロピン（ＴＳＨ）の結合の阻害」Journal of Biological Chemistry 1993; 268: 10900-10905）。Ｍ２１−ＯＨ５ ＭＡｂと結合するヒト２１−ＯＨペプチド（Ｃ１、ＳＳＳＲＶＰＹＫＤＲＡＲＬＰＬ）（S Chen, J Sawicka, L Prentice, JF Sanders, H Tanaka, V Petersen, C Betterle, M Volpato, S Roberts, M Powell, B Rees Smith, J Furmaniak、「モノクローナル抗体のパネルを使用したステロイド２１−ヒドロキシラーゼ上の自己抗体エピトープの分析」Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1998; 83: 2977-2986）を陽性対照として使用し、ＧＡＤ６５に対するヒトモノクローナル抗体（N Hayakawa, LDKE Premawardhana, M Powell, M Masuda, C Arnold, J Sanders, M Evans, S Chen, JC Jaurne, S Baekkeskov, B Rees Smith, J Furimaniak、「グルタミン酸デカルボキシラーゼに対するヒトモノクローナル自己抗体の分離及び特徴付け」、Autoimmunity 2002; 35: 343-355）を陰性対照として使用した。ペプチドＥＬＩＳＡは、以前に説明したように実施した（Y Oda, J Sanders, M Evans, A Kiddie, A Munkley, C James, T Richards, J Wills, J Furmaniak, B Rees Smith、「モノクローナル抗体を使用したヒトチロトロピン（ＴＳＨ）受容体のエピトープ分析」、Thyroid 2000; 10: 1051-1059）。
モノクローナルＴＳＨＲ自己抗体調製物とプラスチックチューブ又はＥＬＩＳＡプレートウェルに被覆したＴＳＨ受容体との相互作用
（ａ）１２５Ｉ標識自己抗体
患者の血清を含む試験試料（１００μＬ）を、ＴＳＨ受容体被覆チューブ（ＲＳＲ Ｌｔｄ．）において、室温で二時間、穏やかに振動させて培養した。吸引後、チューブをアッセイ緩衝液１ｍＬにより二度洗浄した後、標識自己抗体調製物（３０，０００ｃｐｍ）を追加し、室温で一時間、振動させて培養した。その後、チューブをアッセイ緩衝液１ｍＬで二度洗浄し、吸引して、ガンマカウンタにおいて計数した。１２５Ｉ標識自己抗体結合の阻害は、ＴＳＨ結合の阻害に関する式を使用して計算した（上記参照）。
（ａ）１２５Ｉ標識自己抗体
患者の血清を含む試験試料（１００μＬ）を、ＴＳＨ受容体被覆チューブ（ＲＳＲ Ｌｔｄ．）において、室温で二時間、穏やかに振動させて培養した。吸引後、チューブをアッセイ緩衝液１ｍＬにより二度洗浄した後、標識自己抗体調製物（３０，０００ｃｐｍ）を追加し、室温で一時間、振動させて培養した。その後、チューブをアッセイ緩衝液１ｍＬで二度洗浄し、吸引して、ガンマカウンタにおいて計数した。１２５Ｉ標識自己抗体結合の阻害は、ＴＳＨ結合の阻害に関する式を使用して計算した（上記参照）。
（ｂ）ビオチン標識モノクローナル自己抗体及びビオチン標識ＴＳＨ
以前に説明した手順（J Bolton, J sanders, Y Oda, C Chapman, R Konno, J Furmaniak and B Rees Smith、「ＥＬＩＳＡによる甲状腺刺激ホルモン受容体自己抗体の測定」、Clinical Chemistry, 1999; 45: 2285-2287）を使用した。簡単に言うと、患者の血清を含む試験試料（７５μＬ）を、ＴＳＨ受容体被覆ＥＬＩＳＡプレートウェル（ＲＳＲ Ｌｔｄ）において、ＥＬＩＳＡプレート振動装置上で振動（毎分２００回）させて二時間培養した。次に、試験試料を除去し、ウェルをアッセイ緩衝液で一度洗浄し、その後、ビオチン標識モノクローナルＴＳＨ受容体自己抗体（１００μＬ中１ｎｇ）又はビオチン標識ブタＴＳＨ（ＲＳＲ Ｌｔｄ、１００μＬ中５ｎｇ）を追加し、室温で２５分間、振動させて培養を継続した。ウェルを一度洗浄し、ストレプトアビジンペロキシダーゼ（ＲＳＲ Ｌｔｄ、１００μＬ中１０ｎｇ）を追加し、室温で２０分間、振動させて培養を継続した。その後、ウェルを三度洗浄し、ペロキシダーゼ基質のテトラメチルベンジジン（ＲＳＲ Ｌｔｄ、１００μＬ）を追加した。室温で３０分間、振動なしで培養後、０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ５０μＬを追加し、基質反応を停止し、各ウェルの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダにおいて４５０ｎｍで読み取った。ビオチニル化ＭＡｂ又はＴＳＨ結合の阻害は、次のように計算された指数として表現した。
以前に説明した手順（J Bolton, J sanders, Y Oda, C Chapman, R Konno, J Furmaniak and B Rees Smith、「ＥＬＩＳＡによる甲状腺刺激ホルモン受容体自己抗体の測定」、Clinical Chemistry, 1999; 45: 2285-2287）を使用した。簡単に言うと、患者の血清を含む試験試料（７５μＬ）を、ＴＳＨ受容体被覆ＥＬＩＳＡプレートウェル（ＲＳＲ Ｌｔｄ）において、ＥＬＩＳＡプレート振動装置上で振動（毎分２００回）させて二時間培養した。次に、試験試料を除去し、ウェルをアッセイ緩衝液で一度洗浄し、その後、ビオチン標識モノクローナルＴＳＨ受容体自己抗体（１００μＬ中１ｎｇ）又はビオチン標識ブタＴＳＨ（ＲＳＲ Ｌｔｄ、１００μＬ中５ｎｇ）を追加し、室温で２５分間、振動させて培養を継続した。ウェルを一度洗浄し、ストレプトアビジンペロキシダーゼ（ＲＳＲ Ｌｔｄ、１００μＬ中１０ｎｇ）を追加し、室温で２０分間、振動させて培養を継続した。その後、ウェルを三度洗浄し、ペロキシダーゼ基質のテトラメチルベンジジン（ＲＳＲ Ｌｔｄ、１００μＬ）を追加した。室温で３０分間、振動なしで培養後、０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ５０μＬを追加し、基質反応を停止し、各ウェルの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダにおいて４５０ｎｍで読み取った。ビオチニル化ＭＡｂ又はＴＳＨ結合の阻害は、次のように計算された指数として表現した。
１００×１−４５０ｎｍでの試験試料の吸光度
４５０ｎｍでの陰性血清対照の吸光度
ＴＳＨ受容体被覆チューブに対するモノクローナル自己抗体結合のスキャッチャード分析
アッセイ緩衝液５０μＬ中の未標識ＩｇＧ又はＦａｂと、１２５Ｉ標識ｈＭＡｂ ＩｇＧ又はＦａｂ（アッセイ緩衝液中３０，０００ｃｐｍ）５０μＬとを、室温で二時間、穏やかに振動させて培養し、アッセイ緩衝液１ｍＬで二度洗浄し、ガンマカウンタにおいて計数した。結合したＩｇＧ又はＦａｂの濃度を結合／遊離と対比してプロットし（G Scatchard、「小分子及びイオンに対する蛋白質の誘引」、Annals of the New York Academy of Sciences 1949; 51: 660-672）、結合定数を導いた。
４５０ｎｍでの陰性血清対照の吸光度
ＴＳＨ受容体被覆チューブに対するモノクローナル自己抗体結合のスキャッチャード分析
アッセイ緩衝液５０μＬ中の未標識ＩｇＧ又はＦａｂと、１２５Ｉ標識ｈＭＡｂ ＩｇＧ又はＦａｂ（アッセイ緩衝液中３０，０００ｃｐｍ）５０μＬとを、室温で二時間、穏やかに振動させて培養し、アッセイ緩衝液１ｍＬで二度洗浄し、ガンマカウンタにおいて計数した。結合したＩｇＧ又はＦａｂの濃度を結合／遊離と対比してプロットし（G Scatchard、「小分子及びイオンに対する蛋白質の誘引」、Annals of the New York Academy of Sciences 1949; 51: 660-672）、結合定数を導いた。
モノクローナルＴＳＨ受容体自己抗体により被覆したチューブとのＴＳＨ受容体の結合
患者の血清を含む試験試料（１００μＬ）と界面活性剤可溶化ＴＳＨ受容体（２０μＬ）とを、室温で一時間培養した。次に、培養混合物の重複５０μＬアリコートを、ＴＳＨ受容体自己抗体Ｆａｂにより被覆（１０μｇ／ｍＬを２００μＬ、４℃で一晩経過後、洗浄及びポストコーティング）されたプラスチックチューブ（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に加えた。室温で一時間、穏やかに振動させて培養した後、チューブを洗浄し、１２５Ｉ標識ＴＳＨ受容体Ｃ末端モノクローナル抗体４Ｅ３１（J Sanders, Y Oda, A Kiddie, T Richards, J Bolton, V McGrath, S Walters, D Jaskolski, J Furmaniak, B Rees Smith;「ＴＳＨ受容体自己抗体と125Ｉ標識ＴＳＨ受容体との相互作用」、Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1999; 84: 379７-3802）１００μＬ（４０，０００ｃｐｍ）を追加し、更に一時間、穏やかに振動させて培養を継続した。その後、チューブを洗浄し、１２５Ｉを計数した。
患者の血清を含む試験試料（１００μＬ）と界面活性剤可溶化ＴＳＨ受容体（２０μＬ）とを、室温で一時間培養した。次に、培養混合物の重複５０μＬアリコートを、ＴＳＨ受容体自己抗体Ｆａｂにより被覆（１０μｇ／ｍＬを２００μＬ、４℃で一晩経過後、洗浄及びポストコーティング）されたプラスチックチューブ（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に加えた。室温で一時間、穏やかに振動させて培養した後、チューブを洗浄し、１２５Ｉ標識ＴＳＨ受容体Ｃ末端モノクローナル抗体４Ｅ３１（J Sanders, Y Oda, A Kiddie, T Richards, J Bolton, V McGrath, S Walters, D Jaskolski, J Furmaniak, B Rees Smith;「ＴＳＨ受容体自己抗体と125Ｉ標識ＴＳＨ受容体との相互作用」、Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1999; 84: 379７-3802）１００μＬ（４０，０００ｃｐｍ）を追加し、更に一時間、穏やかに振動させて培養を継続した。その後、チューブを洗浄し、１２５Ｉを計数した。
Ｅ ｃｏｌｉにおける組み換えｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂのクローニング及び発現
ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１重鎖ＲＴ−ＰＣＲ産物（可変領域遺伝子分析の項参照）を、Ｘｈｏｌ及びＳｐｅｌ限定エンドヌクレアーゼにより切断し、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１軽鎖ＲＴ−ＰＣＲ産物をＳａｃｌ及びＸｂａｌ限定エンドヌクレアーゼにより切断し、重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡの両方を、ｌａｃＺプロモータの制御下で、Ｉｍｍｕｎｏｚａｐ Ｈ／Ｌベクタ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｅｕｒｏｐｅ、オランダ、アムステルダム）においてクローニングした（I Matthews, G Sims, S Ledwidge, D Stott, D Beeson, N Willcox, A Vincent、「筋無力症の経産婦におけるアセチルコリン受容体に対する抗体：胎児性抗原による免疫付与の証拠」、Laboratory Investigation 2002, 82: 1-11）。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎミディプラスミド純化キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ、英国クローリ、ＲＨ１０ ９ＡＸ）を使用して調製し、サンガ−クールソン法（F Sanger, S Nicklen, AR Coulson、「連鎖停止阻害物質によるＤＮＡ配列決定」、Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 1977; 74: 5463-5467）を使用して配列決定することでｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡの存在を確認した。プラスミドＤＮＡを二種類のＥ ｃｏｌｉ株、（ａ）ＸＬｌ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び（ｂ）ＨＢ２１５１（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）において形質転換し、ＬＢアンピシリン（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／ＬＮａＣｌ、終濃度１００μｇ／ｍＬアンピシリン）寒天プレート（１５ｇ／Ｌ寒天）上において、３７℃で一晩成長させた。前培養物（ＬＢアンピシリン３ｍＬ＋１％グルコース中の一コロニ）を、３７℃で一晩、振動させて成長させた。組み換えＦａｂの生成は、グルコースが存在する場合に阻害される。一晩培養後の前培養物は、１／１００に希釈し（ＬＢアンピシリン５０ｍＬ中０．５ｍＬ）、ＯＤ６００が０．４乃至０．６となるまで３７℃で成長させた。こうした培養物を、３０℃で２０分間振動させた。その後、イソプロピル−β−Ｄチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を追加して終濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌとし、培養物を３０℃で一晩（１６時間）、振動させて引き続き培養した。次に、培養物を４℃で３０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離し、培養上清及びペレットを回収した。ペレットは、氷温ＴＥＳ緩衝液（０．２ｍｏｌ／ＬトリスＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、０．５ｍｏｌ／Ｌスクロース）中で渦動により再懸濁させた。Ｈ２Ｏ中で５倍に希釈した氷温ＴＥＳ緩衝液を更に１．５ｍＬ追加し、混合物を再度渦動させ、氷上で３０分間培養し、その後、遠心分離して、第二の上清又はペリプラズム画分（ＰＦ）を得た。培養上清及びＰＦを、０．４５μｍフィルタにより濾過し、１０ｍｍｏｌ／ＬトリスｐＨ７．５、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌにおいて一晩透析した。非形質転換ＸＬｌ−ＢｌｕｅＭＲＦ’及びＨＢ２１５１細胞と、ＩＰＴＧなしでグルコースにより成長させた、即ち、非誘導性の、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１プラスミドにより形質転換したＸＬｌ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（ＸＬｌ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’／ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１）並びにｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１プラスミドにより形質転換したＨＢ２１５１（ＨＢ２１５１／ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１）とからの培養上清又はＰＦも調製した。培養上清及びＰＦでは、（ａ）ＴＳＨＲと結合するＴＳＨを阻害する能力と、（ｂ）ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞における環状ＡＭＰ生成を刺激する能力と、（ｃ）ラジオイムノアッセイによる組み換えＦａｂの総濃度とについてアッセイを行った。このアッセイでは、アッセイ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ＬトリスＨＣｌ ｐＨ７．８、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）において希釈した培養上清及びＰＦを含むキャリブレータ及び試験材料（１００μＬを重複して作成）を、Ｆａｂ特異性ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、英国プール、ＢＨ１２ ４ＱＨ）によって被覆したプラスチックチューブにおいて、室温で一時間培養した。その後、チューブをアッセイ緩衝液（２×１ｍＬ）により洗浄し、１２５Ｉ標識ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ（３０，０００ｃｐｍ）１００μＬを追加した後、室温で培養した。一時間後、チューブを再度洗浄し（２×１ｍＬ）、１２５Ｉを計数した。結合したものの計数は、キャリブレータ（５乃至５００ｎｇ／ｍＬ）におけるＦａｂ（ハイブリドーマ生成ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ）の濃度と、このキャリブレーション曲線から外れて読み取られた様々な試験材料における組み換えＦａｂの濃度とに対してプロットした。このアッセイの検出限界は、５乃至１０ｎｇ／ｍＬのＦａｂとした。
ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１重鎖ＲＴ−ＰＣＲ産物（可変領域遺伝子分析の項参照）を、Ｘｈｏｌ及びＳｐｅｌ限定エンドヌクレアーゼにより切断し、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１軽鎖ＲＴ−ＰＣＲ産物をＳａｃｌ及びＸｂａｌ限定エンドヌクレアーゼにより切断し、重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡの両方を、ｌａｃＺプロモータの制御下で、Ｉｍｍｕｎｏｚａｐ Ｈ／Ｌベクタ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｅｕｒｏｐｅ、オランダ、アムステルダム）においてクローニングした（I Matthews, G Sims, S Ledwidge, D Stott, D Beeson, N Willcox, A Vincent、「筋無力症の経産婦におけるアセチルコリン受容体に対する抗体：胎児性抗原による免疫付与の証拠」、Laboratory Investigation 2002, 82: 1-11）。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎミディプラスミド純化キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ、英国クローリ、ＲＨ１０ ９ＡＸ）を使用して調製し、サンガ−クールソン法（F Sanger, S Nicklen, AR Coulson、「連鎖停止阻害物質によるＤＮＡ配列決定」、Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 1977; 74: 5463-5467）を使用して配列決定することでｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡの存在を確認した。プラスミドＤＮＡを二種類のＥ ｃｏｌｉ株、（ａ）ＸＬｌ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び（ｂ）ＨＢ２１５１（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）において形質転換し、ＬＢアンピシリン（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／ＬＮａＣｌ、終濃度１００μｇ／ｍＬアンピシリン）寒天プレート（１５ｇ／Ｌ寒天）上において、３７℃で一晩成長させた。前培養物（ＬＢアンピシリン３ｍＬ＋１％グルコース中の一コロニ）を、３７℃で一晩、振動させて成長させた。組み換えＦａｂの生成は、グルコースが存在する場合に阻害される。一晩培養後の前培養物は、１／１００に希釈し（ＬＢアンピシリン５０ｍＬ中０．５ｍＬ）、ＯＤ６００が０．４乃至０．６となるまで３７℃で成長させた。こうした培養物を、３０℃で２０分間振動させた。その後、イソプロピル−β−Ｄチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を追加して終濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌとし、培養物を３０℃で一晩（１６時間）、振動させて引き続き培養した。次に、培養物を４℃で３０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離し、培養上清及びペレットを回収した。ペレットは、氷温ＴＥＳ緩衝液（０．２ｍｏｌ／ＬトリスＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、０．５ｍｏｌ／Ｌスクロース）中で渦動により再懸濁させた。Ｈ２Ｏ中で５倍に希釈した氷温ＴＥＳ緩衝液を更に１．５ｍＬ追加し、混合物を再度渦動させ、氷上で３０分間培養し、その後、遠心分離して、第二の上清又はペリプラズム画分（ＰＦ）を得た。培養上清及びＰＦを、０．４５μｍフィルタにより濾過し、１０ｍｍｏｌ／ＬトリスｐＨ７．５、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌにおいて一晩透析した。非形質転換ＸＬｌ−ＢｌｕｅＭＲＦ’及びＨＢ２１５１細胞と、ＩＰＴＧなしでグルコースにより成長させた、即ち、非誘導性の、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１プラスミドにより形質転換したＸＬｌ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（ＸＬｌ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’／ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１）並びにｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１プラスミドにより形質転換したＨＢ２１５１（ＨＢ２１５１／ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１）とからの培養上清又はＰＦも調製した。培養上清及びＰＦでは、（ａ）ＴＳＨＲと結合するＴＳＨを阻害する能力と、（ｂ）ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞における環状ＡＭＰ生成を刺激する能力と、（ｃ）ラジオイムノアッセイによる組み換えＦａｂの総濃度とについてアッセイを行った。このアッセイでは、アッセイ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ＬトリスＨＣｌ ｐＨ７．８、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）において希釈した培養上清及びＰＦを含むキャリブレータ及び試験材料（１００μＬを重複して作成）を、Ｆａｂ特異性ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、英国プール、ＢＨ１２ ４ＱＨ）によって被覆したプラスチックチューブにおいて、室温で一時間培養した。その後、チューブをアッセイ緩衝液（２×１ｍＬ）により洗浄し、１２５Ｉ標識ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ（３０，０００ｃｐｍ）１００μＬを追加した後、室温で培養した。一時間後、チューブを再度洗浄し（２×１ｍＬ）、１２５Ｉを計数した。結合したものの計数は、キャリブレータ（５乃至５００ｎｇ／ｍＬ）におけるＦａｂ（ハイブリドーマ生成ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ）の濃度と、このキャリブレーション曲線から外れて読み取られた様々な試験材料における組み換えＦａｂの濃度とに対してプロットした。このアッセイの検出限界は、５乃至１０ｎｇ／ｍＬのＦａｂとした。
組み換え４Ｂ４（グルタミン酸デカルボキシラーゼ又はＧＡＤに対するヒトＭＡｂ）及び組み換えハイブリッドＦａｂ（ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１及び４Ｂ４の混合ＨＣ及びＬＣ）のクローニング及び発現
組み換え４Ｂ４ Ｆａｂ（４Ｂ４については、N Hayakawa, LDKE Premawardhana, M powell, M Masuda, C Arnold, J Sanders, M Evans, S Chen, JC Jaume, S Baekkeskov, B Rees Smith, J Furmaniak、「グルタミン酸デカルボキシラーゼに対するヒトモノクローナル自己抗体の分離及び特徴付け」、Autoimmunity 2002; 35: 343-355において詳細に説明される）及び組み換えハイブリッドＦａｂは、組み換えｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂについて説明したように、ＨＣ及びＬＣのそれぞれをＩｍｍｕｎｏｚａｐＨ／Ｌベクタにおいてクローニングすることで生成し、ＨＢ２１５１細胞において発現させた。培養上清及びペリプラズム画分では、（ａ）ＴＳＨＲと結合するＴＳＨを阻害する能力と、（ｂ）上記のような組み換えＦａｂの総濃度とについてアッセイを行った。加えて、ＧＡＤ Ａｂ活性を、下記のように評価した。
組み換え４Ｂ４ Ｆａｂ（４Ｂ４については、N Hayakawa, LDKE Premawardhana, M powell, M Masuda, C Arnold, J Sanders, M Evans, S Chen, JC Jaume, S Baekkeskov, B Rees Smith, J Furmaniak、「グルタミン酸デカルボキシラーゼに対するヒトモノクローナル自己抗体の分離及び特徴付け」、Autoimmunity 2002; 35: 343-355において詳細に説明される）及び組み換えハイブリッドＦａｂは、組み換えｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂについて説明したように、ＨＣ及びＬＣのそれぞれをＩｍｍｕｎｏｚａｐＨ／Ｌベクタにおいてクローニングすることで生成し、ＨＢ２１５１細胞において発現させた。培養上清及びペリプラズム画分では、（ａ）ＴＳＨＲと結合するＴＳＨを阻害する能力と、（ｂ）上記のような組み換えＦａｂの総濃度とについてアッセイを行った。加えて、ＧＡＤ Ａｂ活性を、下記のように評価した。
培養上清及びペリプラズム画分における組み換えＧＡＤ Ａｂ活性の測定
ＧＡＤに対するヒトモノクローナル抗体（４Ｂ４）との１２５Ｉ標識ＧＡＤ（ＲＳＲ Ｌｔｄ、英国カーディフ、ＣＦ２３ ８ＨＥ）の結合を阻害するＧＡＤ Ａｂ Ｆａｂ調製物の能力に基づくアッセイを使用した。このアッセイでは、ＧＡＤ Ａｂアッセイ緩衝液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ＬトリスＨＣｌｐＨ８．０、０．１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｇ／Ｌウシ血清アルブミン、０．５ｇ／Ｌ ＮａＮ３）において希釈した試験試料（５０μＬを重複して作成）を、１２５Ｉ標識ＧＡＤ（ＧＡＤＡｂアッセイ緩衝液５０μＬ中３０，０００ｃｐｍ）と共に、室温で一時間培養した。その後、４Ｂ４ ＩｇＧ ５０μＬ（ＧＡＤ Ａｂアッセイ緩衝液中０．１μｇ／ｍＬ）を追加し、室温で２４時間、培養を継続した。その後、固相プロテインＡ（ＧＡＤ Ａｂアッセイ緩衝液中５０μＬ、ＲＳＲ Ｌｔｄより）を追加し、４Ｂ４ ＩｇＧ−１２５Ｉ標識ＧＡＤの複合物を沈殿させた（プロテインＡは、Ｆａｂ及び１２５Ｉ標識ＧＡＤの複合物とは反応しない）。プロテインＡとの反応を室温で一時間継続させた後、遠心分離（１５００ｇで３０分間、４℃）により沈殿物をペレットにし、ＧＡＤ Ａｂアッセイ緩衝液１ｍＬにより洗浄し、１２５Ｉを計数した。４Ｂ４ ＩｇＧが存在しない場合の１２５Ｉ標識ＧＡＤ結合は、追加した総ｃｐｍの４乃至５％となった。
ＧＡＤに対するヒトモノクローナル抗体（４Ｂ４）との１２５Ｉ標識ＧＡＤ（ＲＳＲ Ｌｔｄ、英国カーディフ、ＣＦ２３ ８ＨＥ）の結合を阻害するＧＡＤ Ａｂ Ｆａｂ調製物の能力に基づくアッセイを使用した。このアッセイでは、ＧＡＤ Ａｂアッセイ緩衝液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ＬトリスＨＣｌｐＨ８．０、０．１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｇ／Ｌウシ血清アルブミン、０．５ｇ／Ｌ ＮａＮ３）において希釈した試験試料（５０μＬを重複して作成）を、１２５Ｉ標識ＧＡＤ（ＧＡＤＡｂアッセイ緩衝液５０μＬ中３０，０００ｃｐｍ）と共に、室温で一時間培養した。その後、４Ｂ４ ＩｇＧ ５０μＬ（ＧＡＤ Ａｂアッセイ緩衝液中０．１μｇ／ｍＬ）を追加し、室温で２４時間、培養を継続した。その後、固相プロテインＡ（ＧＡＤ Ａｂアッセイ緩衝液中５０μＬ、ＲＳＲ Ｌｔｄより）を追加し、４Ｂ４ ＩｇＧ−１２５Ｉ標識ＧＡＤの複合物を沈殿させた（プロテインＡは、Ｆａｂ及び１２５Ｉ標識ＧＡＤの複合物とは反応しない）。プロテインＡとの反応を室温で一時間継続させた後、遠心分離（１５００ｇで３０分間、４℃）により沈殿物をペレットにし、ＧＡＤ Ａｂアッセイ緩衝液１ｍＬにより洗浄し、１２５Ｉを計数した。４Ｂ４ ＩｇＧが存在しない場合の１２５Ｉ標識ＧＡＤ結合は、追加した総ｃｐｍの４乃至５％となった。
ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１に対する抗イディオタイプ抗体の生成
完全フロイントアジュバント内のｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ ５０μｇと、その２５日後の不完全フロイントアジュバント内のｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ ５０μｇの第二の注射と、脾臓除去四日前のｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ ５０μｇの更なる注射とにより、生後六乃至八週間のＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内で免疫付与した。抗体陽性マウス（下記参照）からの脾臓細胞を、マウス骨髄腫細胞株、及びＴＳＨＲ ＭＡｂのために上機能に分離されたモノクローナル抗体に融合させた。マウス血清及び細胞培養ウェル内の抗イディオタイプ抗体のレベルは、ＴＳＨＲ被覆チューブと結合する１２５Ｉ−ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂの阻害によって測定した。特に、試験試料の重複６０μＬアリコート（アッセイ緩衝液：５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ＬトリスＨＣｌｐＨ７．８、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により希釈）を、１２５Ｉ−ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ（アッセイ緩衝液において希釈された３００００ｃｐｍ）と共に、室温で一時間培養した。混合物１００μＬを、開始緩衝液２０μＬ（上記参照）と共に、重複ＴＳＨＲ被覆チューブ（ＲＳＲ Ｌｔｄ）へ移動させ、室温で更に二時間、振動させて培養を継続した。その後、チューブをアッセイ緩衝液２×１ｍＬで洗浄し、１２５Ｉを計数した。ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１に反応する抗イディオタイプ抗体の存在は、標識ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＦａｂのＴＳＨＲ被覆チューブとの結合を阻害する試験試料の能力から明らかとなった。
完全フロイントアジュバント内のｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ ５０μｇと、その２５日後の不完全フロイントアジュバント内のｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ ５０μｇの第二の注射と、脾臓除去四日前のｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ ５０μｇの更なる注射とにより、生後六乃至八週間のＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内で免疫付与した。抗体陽性マウス（下記参照）からの脾臓細胞を、マウス骨髄腫細胞株、及びＴＳＨＲ ＭＡｂのために上機能に分離されたモノクローナル抗体に融合させた。マウス血清及び細胞培養ウェル内の抗イディオタイプ抗体のレベルは、ＴＳＨＲ被覆チューブと結合する１２５Ｉ−ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂの阻害によって測定した。特に、試験試料の重複６０μＬアリコート（アッセイ緩衝液：５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ＬトリスＨＣｌｐＨ７．８、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により希釈）を、１２５Ｉ−ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ（アッセイ緩衝液において希釈された３００００ｃｐｍ）と共に、室温で一時間培養した。混合物１００μＬを、開始緩衝液２０μＬ（上記参照）と共に、重複ＴＳＨＲ被覆チューブ（ＲＳＲ Ｌｔｄ）へ移動させ、室温で更に二時間、振動させて培養を継続した。その後、チューブをアッセイ緩衝液２×１ｍＬで洗浄し、１２５Ｉを計数した。ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１に反応する抗イディオタイプ抗体の存在は、標識ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＦａｂのＴＳＨＲ被覆チューブとの結合を阻害する試験試料の能力から明らかとなった。
結果
患者の血液２０ｍＬから取得したリンパ球（３０×１０６）を、マウスマクロファージの支持細胞層上のＥＢＶの上清２００μＬと共に、４８ウェルプレート上で、１ウェル当たり１×１０６で平板培養した。ＥＢＶ感染後１１日目に、１２５Ｉ−ＴＳＨ結合の阻害について上清をモニタした。一つのウェルでは、結合の阻害について陽性であることが確認され、阻害のレベルは、１６日目には９０％の阻害を上回るまでに増加し、このレベルは２４日目まで維持され、その後、低下した。培養物を拡張し、ＥＢＶ感染後２１、２３、２６、及び２７日目にＫ６Ｈ６／Ｂ５細胞と融合させ、合計７回の融合実験を実施した。各融合物を３×９６ウェルプレート（即ち、合計２１枚のプレート）で平板培養し、１２５Ｉ−ＴＳＨ結合阻害活性を有する抗体を安定して生成する一つのウェルを取得した。この後、三ラウンドの再クローニングを行い、ＴＳＨ受容体と結合する標識ＴＳＨを阻害したヒトモノクローナル抗体を生成する単一のクローンを発生させた。このヒトモノクローナルＴＳＨ受容体自己抗体は、指定されたｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１となり、ラムダ軽鎖を有するサブクラスＩｇＧ１に含まれた。
患者の血液２０ｍＬから取得したリンパ球（３０×１０６）を、マウスマクロファージの支持細胞層上のＥＢＶの上清２００μＬと共に、４８ウェルプレート上で、１ウェル当たり１×１０６で平板培養した。ＥＢＶ感染後１１日目に、１２５Ｉ−ＴＳＨ結合の阻害について上清をモニタした。一つのウェルでは、結合の阻害について陽性であることが確認され、阻害のレベルは、１６日目には９０％の阻害を上回るまでに増加し、このレベルは２４日目まで維持され、その後、低下した。培養物を拡張し、ＥＢＶ感染後２１、２３、２６、及び２７日目にＫ６Ｈ６／Ｂ５細胞と融合させ、合計７回の融合実験を実施した。各融合物を３×９６ウェルプレート（即ち、合計２１枚のプレート）で平板培養し、１２５Ｉ−ＴＳＨ結合阻害活性を有する抗体を安定して生成する一つのウェルを取得した。この後、三ラウンドの再クローニングを行い、ＴＳＨ受容体と結合する標識ＴＳＨを阻害したヒトモノクローナル抗体を生成する単一のクローンを発生させた。このヒトモノクローナルＴＳＨ受容体自己抗体は、指定されたｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１となり、ラムダ軽鎖を有するサブクラスＩｇＧ１に含まれた。
様々な濃度のｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＩｇＧ及びＦａｂがＴＳＨ受容体と結合する標識ＴＳＨを阻害する能力は、図１に図示されている。図１において確認できるように、こうした調製物は、僅か１ｎｇ／ｍＬでＴＳＨ結合を阻害し、１０００ｎｇ／ｍＬでは９０％を越える阻害が得られた。ＴＳＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＩｇＧ及びＦａｂも、図２に図示したように、ＴＳＨ受容体によりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞における環状ＡＭＰの生成を刺激した。ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＩｇＧ及びＦａｂは、僅か１ｎｇ／ｍＬで、環状ＡＭＰの強力な刺激を発生させた。同様のレベルの刺激は、０．１ｎｇ／ｍＬのブタＴＳＨ及び１０ｎｇ／ｍＬのヒトＴＳＨにより観察された。最初のリンパ球提供者からの血清（リンパ球分離用の血液試料と同時に取得）がＴＳＨ受容体と結合する標識ＴＳＨを阻害する能力及びＴＳＨ受容体トランスフェクションＣＨＯにおける環状ＡＭＰ生成を刺激する能力の比較は、図３に図示されている。ＴＳＨ結合の阻害は、５００倍に希釈した血清で検出でき、一方、環状ＡＭＰの刺激は、５０００倍に希釈した血清で検出できた。
１２５Ｉ標識ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＩｇＧは、ＴＳＨ受容体被覆チューブに結合し、スキャッチャード分析は、結合定数１０１０モル−１を示した。この結合は、（標識ＴＳＨ結合の阻害によって検出可能な）ＴＳＨ受容体自己抗体を有するグレーブス病患者からの血清によって阻害された（表１）。１２５Ｉ標識ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂも、ＴＳＨ受容体被覆チューブに結合し（スキャッチャード分析による結合定数＝４．５×１０１０モル−１）、この結合は、ＴＳＨ受容体自己抗体陽性のグレーブス血清によって阻害された（表２）。加えて、界面活性剤可溶化調製物は、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１により被覆したプラスチックチューブに結合可能であり、この結合は、ＴＳＨ受容体自己抗体を含有する血清により阻害可能となった（表３）。
図４に図示したように、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１−ビオチンは、ＴＳＨ受容体被覆ＥＬＩＳＡプレートに結合し、この結合は国際基準調製物ＮＩＢＳＣ９０／６７２及びグレーブス病患者からの血清によって阻害された。結合の阻害は、健康な供血者からの血清では観察されなかった。図３ａは、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１−ビオチンに基づいたＴＳＨＲ自己抗体のアッセイと以前のアッセイとの比較のグラフ表示である。ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１−ビオチンに基づくアッセイの感度は、検出可能な国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２の濃度によれば明らかに優れている。これは、図３ｂに図示したグレーブス病患者７２人からの血清の調査において確認された。健康な供血者の血清（ｎ＝１００）及び非甲状腺疾患の対象者からの血清（ｎ＝４３）では、この調査において、それぞれｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１結合の１０％までの阻害及びＴＳＨ結合の１１％までの阻害が発生した。
ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＩｇＧは、ウェスタンブロット分析において、全長ＴＳＨ受容体調製物とは反応せず、免疫沈降アッセイ及びＴＳＨ受容体ペプチドＥＬＩＳＡにおいても、３５Ｓ標識全長ＴＳＨ受容体と十分に反応しなかった。こうした反応性の欠如は、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１がＴＳＨ受容体の直線エピトープではなく立体配座エピトープと反応することを示している。
ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１を符号化する遺伝子の配列分析は、重鎖Ｖ領域の遺伝子がＶＨ５ファミリであり、Ｄ遺伝子がＤ６−１３ファミリであり、Ｊ遺伝子がＪＨ５ファミリであることを示し、軽鎖について、Ｖ遺伝子領域がＶＬ１−１１生殖細胞系に由来し、Ｊ遺伝子領域がＪＬ３ｂ生殖細胞系に由来することを示した。重鎖ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ図４及び５に図示されており、軽鎖ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ図６及び７に図示されている。こうした配列は、縮重したＰＣＲプライマを使用して決定したＨＣ及びＬＣヌクレオチド配列の精緻化である。特に、ヌクレオチド１１５乃至１２０に関するＨＣ配列決定のアーチファクトが特定された。配列決定では、ｃａｃｇｔｇ（アミノ酸Ｈｉｓ Ｖａｌへ転写）を示したが、結晶構造では、より高い信頼性で、アミノ酸ＧｌｎＬｅｕ（ｃａｇｃｔｇとなる塩基に対応）を示した。結晶構造分析は、特に縮重ＰＣＲプライマ領域において、ＨＣ及びＬＣ由来アミノ酸配列の精緻化も可能にした。ＬＣの場合、アミノ酸２は、ＲＴ−ＰＣＲではＰｒｏとされたが、結晶構造からはＴｈｒとなった。ＨＣの場合、アミノ酸２は、ＲＴ−ＰＣＲではＭｅｔとされたが、結晶構造からはＶａｌとなった。
標識ＴＳＨ結合の阻害に関する、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＩｇＧ調製物とＴＳＨ受容体自己抗体の国際標準との活性の比較は、表５に示している。これにより、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＩｇＧの比活性は、アッセイを血清において実施した時には蛋白質１ｍｇ当たりＮＩＢＳＣ９０／６７２ １３８単位、アッセイをアッセイ緩衝液において実施した時には１ｍｇ当たり１６３単位になると推定可能である（二値の平均＝１５０単位／ｍｇ）。ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ調製物は、血清及びアッセイ緩衝液中において、それぞれ１ｍｇ当たり２８８及び３０９単位となった（二値の平均＝３００単位／ｍｇ）。表６は、リンパ球提供者の血清及び提供者の血清ＩｇＧの同様の分析を示している。確認できるように、提供者の血清は、平均０．３８単位／ｍＬのＮＩＢＳＣ９０／６７２を含み（血清及びアッセイ緩衝液において、それぞれ０．３６及び０．４）、提供者の血清ＩｇＧは蛋白質１ｍｇ当たり０．０５９単位の平均比活性を有する。こうした結果は、表７にまとめられており、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ＩｇＧの比活性（１５０単位／ｍｇ）との比較は、ＴＳＨ結合の阻害に関して、モノクローナル自己抗体ＩｇＧがリンパ球提供者の血清ＩｇＧの２５００倍の活性を有することを示す。
ＴＳＨ受容体によりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞における環状ＡＭＰの刺激に関する、様々なＩｇＧ及び血清調製物の活性の初期評価も、表７に示している。環状ＡＭＰの刺激のアッセイは、アッセイ内とアッセイ間とにおける大きな可変性を特徴とする。これは、９６ウェルプレートに最初に接種した細胞の数及び質のばらつきと、その後の４８時間の接種細胞の成長速度のばらつきとを含む、いくつかの要素に関連する。そのため、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＩｇＧ及びＦａｂ、リンパ球提供者の血清及び血清ＩｇＧ、及びＮＩＢＳＣ９０／６７２のアッセイは、反復して実施し、その結果は表８にまとめている。ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＩｇＧの比活性は、刺激アッセイにおいて、リンパ球提供者の血清ＩｇＧの０．１単位と比較して、１ｍｇ当たり３１８単位となり、即ち、モノクローナル自己抗体ＩｇＧは、環状ＡＭＰ生成の刺激に関して、提供者の血清ＩｇＧの約３０００倍の活性を有した。この値は、ＴＳＨ結合阻害の測定で観察された２５００倍の値との妥当な一致を示している（上記と表５及び６とを参照）。表９は、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＩｇＧ及びＦａｂとリンパ球提供者の血清ＩｇＧＴＳＨ受容体刺激作用の更なる分析を示している。
ＴＳＨ受容体を発現するＣＨＯ細胞における環状ＡＭＰの生成の刺激に対するブタＴＳＨ及びｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＩｇＧの影響は、表１０に示す結果から確認できるように、加法的なものとなった。
基準調製物ＮＩＢＳＣ９０／６７２による環状ＡＭＰ刺激アッセイにおいて観察された代表的な結果は、表１１に示している。
表１２及び１３は、それぞれ標識ＴＳＨ結合の阻害及び環状ＡＭＰ生成の刺激に関する様々なＥ．ｃｏｌｉ培養上清の作用を示している。両Ｅ．ｃｏｌｉ株の（ｈＭＡｂＴＳＨＲ１プラスミドによる）形質転換及びＩＰＴＧ誘導培養物は、ＴＳＨ結合の有効な阻害物質（表１２）及び環状ＡＭＰ生成の強力な刺激物資（表１３）として機能する十分な量の組み換えｈＭＡｂＴＳＨＲ Ｆａｂを生成した。（非形質転換細胞及び形質転換済み非誘導細胞からの）対照培養上清は、検出可能なレベルの結合阻害（表１２）又は刺激（表１３）活性を生成しなかった。
更なる対照実験では、ＧＡＤに対するヒトモノクローナル抗体（４Ｂ４）のＨＣ及びＬＣのクローニング及び発現によって生成した組み換えヒト抗体Ｆａｂについて分析した。培養上清及びペリプラズム画分の分析は、組み換え４Ｂ４Ｆａｂが検出可能なＴＳＨ結合の阻害活性（表１４及び１５）又はＴＳＨＲ刺激活性（表１６及び１７）を有していないことを示した。更に、（ａ）ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＨＣ及び４Ｂ４ ＬＣと、（ｂ）ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＬＣ及び４Ｂ４ ＨＣとで構成されるハイブリッドＦａｂは、いずれのアッセイでもＴＳＨＲとの相互作用を示さなかった（表１４乃至１７）。こうした様々な組み換えＦａｂ調製物におけるＧＡＤ Ａｂ活性のアッセイでは、４Ｂ４ ＨＣ及び４Ｂ４ＬＣにより形質転換した細胞におけるＧＡＤ Ａｂの発現のみが検出可能となった（表１８及び１９）。組み換えｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂは、検出可能なＧＡＤ Ａｂ活性を示さず、４Ｂ４とｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＨＣ及びＬＣとの混合物で構成される組み換えＦａｂハイブリッドも同様となった（表１８及び１９）。
ＴＳＨＲによりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞における環状ＡＭＰ生成を刺激するｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１の能力は、ＴＳＨアンタゴニストとして機能するＴＳＨＲ自己抗体を含む患者の血清によって阻害された（図８）。加えて、ＴＳＨＲに対するマウスモノクローナル抗体（９Ｄ３３）は、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１の刺激活性を遮断可能（表２０）となった一方で、別のＴＳＨＲマウスＭＡｂ（２Ｂ４）は効果がなかった。しかしながら、２Ｂ４は、９Ｄ３３のようにＴＳＨの刺激活性を遮断できた（表２１）。表２２は、ＴＳＨＲプラスチックチューブとの１２５Ｉ標識ＴＳＨ及び１２５Ｉ標識ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１の結合を阻害する２Ｂ４及び９Ｄ３３の能力を示している。９Ｄ３３は、標識ＴＳＨの結合と標識ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１の結合とを極めて効果的に阻害できた（１０μｇ／ｍＬで５０％を越える阻害）。２Ｂ４は、ＴＳＨＲと結合する標識ＴＳＨの有効な阻害物質（１μｇ／ｍＬで８０％を越える阻害）となったが、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１の結合（１μｇ／ｍＬで１１％の阻害）又は９Ｄ３３の結合（１μｇ／ｍＬで２２％の阻害）に対しては小さな効果のみを有した。ＴＳＨＲ被覆チューブに対する標識９Ｄ３３の結合は、ＴＳＨＲ自己抗体を含有するグレーブス病患者の血清によって阻害され（ＴＳＨＲに結合する標識ＴＳＨの阻害によって測定）、一方、健康な供血者の血清と、他の自己免疫疾患患者からの血清とは、殆ど又は全く効果がなかった（表２３）。ＴＳＨＲに結合する標識９Ｄ３３は、ＴＳＨアゴニスト又はアンタゴニスト特性を有するＴＳＨＲ自己抗体（表２４）と、国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２（表２５）とによって阻害された。スキャッチャード分析は、プラスチックチューブ上に被覆したＴＳＨ受容体に対して、９Ｄ３３及び２Ｂ４がそれぞれ２×１０１０モル−１及び１×１０１０モル−１の親和性を有することを示した。
ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂによるマウスの免疫付与では、ＴＳＨＲと結合するＦａｂの能力を阻害するような形でｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂと結合可能なマウス血清中の抗体（ポリクローナル抗体）の生成が生じた（表２６）。更に、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂにより免疫付与されたマウスの脾臓細胞から生成されたモノクローナル抗体は、ＴＳＨＲと結合するＦａｂを阻害することが可能となった（表２７）。
我々の分析全体は、ヒトモノクローナル自己抗体ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１がリンパ球提供者血清中のＴＳＨ受容体自己抗体のＴＳＨ受容体結合及び甲状腺刺激特性を有することを示している。上で詳述したように、モノクローナル抗体は、組み換えＦａｂ調製物としても生成された。
結論
（ａ）我々は、提供患者血清中のＴＳＨ受容体自己抗体と同様の特性を有するＴＳＨ受容体に対するヒトモノクローナル自己抗体を生成した。モノクローナル抗体は、組み換えＦａｂ調製物としても生成された。
（ａ）我々は、提供患者血清中のＴＳＨ受容体自己抗体と同様の特性を有するＴＳＨ受容体に対するヒトモノクローナル自己抗体を生成した。モノクローナル抗体は、組み換えＦａｂ調製物としても生成された。
（ｂ）モノクローナル抗体ＩｇＧ及びＦａｂと組み換えＦａｂ調製物とは、強力な甲状腺刺激物質であり、ＴＳＨ受容体と結合する標識ＴＳＨの有効な阻害物質である。
（ｃ）標識ＭＡｂ ＩｇＧ及びＦａｂ調製物とＴＳＨ受容体との結合は、グレーブス病患者からのＴＳＨ受容体自己抗体陽性血清によって阻害されるが、健康な供血者の血清又は他の自己免疫疾患患者からの血清では阻害されない。ＴＳＨ受容体と結合する標識ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１の阻害に基づくＴＳＨＲ自己抗体のアッセイシステムは、今までに説明された他のアッセイよりも感度が高い。
（ｄ）ＴＳＨアンタゴニストとして機能するＴＳＨ受容体自己抗体と、ＴＳＨアゴニストとして機能するＴＳＨ受容体自己抗体とは、ＴＳＨ受容体と結合する標識ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１を阻害する。
（ｅ）プラスチックチューブ上に被覆されたｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１調製物は、ＴＳＨ受容体と結合し、この結合は、様々な患者の血清中のＴＳＨ受容体自己抗体によって阻害される。
（ｆ）ＴＳＨＲと結合するｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１を阻害するマウスモノクローナル抗体（９Ｄ３３）は、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１及びＴＳＨの刺激活性を遮断することも確認された。
（ｇ）ＴＳＨ受容体と結合するのを阻害するような形でｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１と結合するｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１に対するマウスポリクローナル及びモノクローナル抗体を生成した。したがって、こうした抗イディオタイプ抗体は、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１についてＴＳＨＲと競合し、これにより、ＴＳＨＲ自己抗体の結合対象が必要な用途において、ＴＳＨＲの有用な代替となり得る。
（ｈ）こうした結果は、ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１及び／又はその誘導体及び／又はその競合対象を、以下においてＴＳＨの代用として使用できることを示す。
（ｉ）ＴＳＨ受容体自己抗体、ＴＳＨ、及び関連リガンドのアッセイ
（ｉｉ）ＴＳＨアゴニスト又はＴＳＨアンタゴニスト活性の提供が関与する様々なｉｎｖｉｖｏ用途
（ｉｉｉ）新型のＴＳＨ受容体自己抗体結合部位の特定及び提供
表１ ＴＳＨ受容体と結合する１２５Ｉ標識ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＩｇＧに対する患者血清の影響、及びＴＳＨ受容体と結合する１２５Ｉ標識ＴＳＨに対する影響との比較
（ｉｉ）ＴＳＨアゴニスト又はＴＳＨアンタゴニスト活性の提供が関与する様々なｉｎｖｉｖｏ用途
（ｉｉｉ）新型のＴＳＨ受容体自己抗体結合部位の特定及び提供
表１ ＴＳＨ受容体と結合する１２５Ｉ標識ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＩｇＧに対する患者血清の影響、及びＴＳＨ受容体と結合する１２５Ｉ標識ＴＳＨに対する影響との比較
Ｇ１乃至Ｇ１１は、グレーブス病の病歴を有する患者からの血清である。
Ｇ９の血清は、高レベルのＴＳＨ遮断を有する（即ち、ＴＳＨアンタゴニスト活性）。
Ｇ１０及びＧ１１は、高レベルの甲状腺刺激活性を有する。
Ｇ１０は、リンパ球提供者の血清である。
／１０、／２０等は、健康な供血者の血清プールでの希釈係数を示す。
Ｎ１乃至Ｎ１０は、健康な供血者からの血清である。
Ｄ１は、一型糖尿病患者からのものである（グルタミン酸デカルボキシラーゼに対する自己抗体について陽性）。
Ａ１及びＡ２は、アジソン病患者からのものである（ステロイド２１−ヒドロキシラーゼ自己抗体について陽性）。
健康な供血者の血清プールが存在する場合、１２５Ｉ標識ＭＡｂ ＩｇＧの約２５％がＴＳＨＲ被覆チューブと結合した。
表２ ＴＳＨ受容体と結合する１２５Ｉ標識ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂに対する患者血清の影響、及びＴＳＨ受容体と結合する１２５Ｉ標識ＴＳＨに対する影響との比較
表２ ＴＳＨ受容体と結合する１２５Ｉ標識ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂに対する患者血清の影響、及びＴＳＨ受容体と結合する１２５Ｉ標識ＴＳＨに対する影響との比較
表３ ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂにより被覆したプラスチックチューブとのＴＳＨＲの結合、及びＴＳＨＲ自己抗体を含有する血清によるＴＳＨＲ結合の阻害
１ ＴＳＨＲ結合は、ＴＳＨＲＣ末端に対する１２５Ｉ標識マウスモノクローナル抗体を使用して検出し、総ｃｐｍ＝１チューブ当たり３９，０００とした。
表４ ＴＳＨＲにより被覆したＥＬＩＳＡプレートウェルとのビオチン標識ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１及びビオチン標識ＴＳＨの結合に対する患者血清試料の影響
ＨＢＤ＝健康な供血者の血清
Ｕ／ｍＬは、ＮＩＢＳＣ９０／６７２の単位である。
血清Ｐ１乃至Ｐ７は、グレーブス病患者からのものである。
表５ ＷＨＯ基準調製物ＮＩＢＳＣ９０／６７２とｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ＩｇＧ及びＦａｂ調製物とによるＴＳＨ結合の阻害
１ 健康な供血者の血清プールで、この血清プールのみが存在する場合、総ｃｐｍの１４．９％がＴＳＨＲと結合した。緩衝液のみが存在する場合、総ｃｐｍの１４．７％がＴＳＨＲと結合した。
２ ２Ｇ４は、甲状腺ペロキシダーゼに対するヒトモノクローナル自己抗体である。
表６ リンパ球提供者の血清及び提供者の血清ＩｇＧによるＴＳＨ結合の阻害
１ 健康な供血者の血清プールで、この血清プールのみが存在する場合、総ｃｐｍの１４．７％がＴＳＨＲと結合した。緩衝液のみが存在する場合、総ｃｐｍの１６．３％がＴＳＨＲと結合した。
２ 記載の単位は、ＮＩＢＳＣ９０／６７２国際ＴＳＨＲ自己抗体基準調製物である。
表７ ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１とリンパ球提供者の血清及びＩｇＧ調製物との比活性
１ 記載の単位はＮＩＢＳＣ９０／６７２である。
２ 値は、血清及びアッセイ緩衝液において得られた結果の平均である（表５及び６参照）。
表８ いくつかの環状ＡＭＰ刺激アッセイにおいて決定されたｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１とリンパ球提供者の血清及び血清ＩｇＧとの比活性の概要
表９ 環状ＡＭＰ刺激アッセイにおけるｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＩｇＧ及びＦａｂとリンパ球提供者の血清ＩｇＧとの影響の更なる分析
１ ２Ｇ４は、甲状腺ペロキシダーゼに対するヒトモノクローナル自己抗体である。
表１０ 環状ＡＭＰ刺激アッセイにおけるＴＳＨ及びｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ ＩｇＧの相加効果
１ 記載の値は、厳密に一致する重複した決定での平均である。
表１１ 環状ＡＭＰ刺激アッセイにおけるＮＩＢＳＣ９０／６７２の影響
表１２ 二種類のＥ ｃｏｌｉ株（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’及びＨＢ２１５１細胞）において発現される組み換えｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂによる、ＴＳＨＲ被覆チューブと結合する１２５Ｉ−ＴＳＨの阻害
１ アッセイ緩衝液＝５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ トリスＨＣｌ ｐＨ７．８
２ 全ての希釈は、アッセイ緩衝液におけるものである。
３ 結合の阻害は、次の式を使用して計算した。
Ａ＝試験試料が存在する場合の結合
Ｂ＝アッセイ緩衝液が存在する場合の結合
表１３ 二種類のＥ ｃｏｌｉ株（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’及びＨＢ２１５１細胞）において発現される組み換えｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂによる、ＴＳＨＲによってトランスフェクションしたＣＨＯ細胞におけるｃＡＭＰ生成の刺激
１ アッセイ緩衝液＝１ｇ／Ｌグルコースと、２０ｍｍｏｌ／ＬＨｅｐｅｓと、２２２ｍｍｏｌ／Ｌスクロースと、１５ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ２イソブチル−１−メチルキサンチンｐＨ７．４と、を含有するハンクの緩衝食塩溶液（ＮａＣｌなし）
２ アッセイ緩衝液における希釈
３ 基礎値＝アッセイ緩衝液のみが存在する場合に生成されるｃＡＭＰ
表１４ 組み換えｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ、組み換え４Ｂ４ Ｆａｂ（ＧＡＤに対するヒトＭＡｂ）、及び組み換えハイブリッドＦａｂ（二つのＦａｂのＨＣ及びＬＣの混合）による、ＴＳＨＲ被覆チューブと結合する１２５Ｉ−ＴＳＨの阻害。Ｅ ｃｏｌｉ ＨＢ２１５１細胞における発現
ペリプラズム画分のアッセイ
ペリプラズム画分のアッセイ
１ 結合の阻害は、次の式を使用して計算した。
Ａ＝試験試料が存在する場合の１２５Ｉ−ＴＳＨ結合％
Ｂ＝アッセイ緩衝液が存在する場合の１２５Ｉ−ＴＳＨ結合％
ａ 非誘導細胞におけるＴＳＨＲ Ａｂ活性の検出は、ＩＰＴＧが存在しない場合にＦａｂの低レベルの発現を提供するプロモータの構成的活性によるものとした。
ｕｄ＝検出不可
表１５ 組み換えｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ、組み換え４Ｂ４ Ｆａｂ（ＧＡＤに対するヒトＭＡｂ）、及び組み換えハイブリッドＦａｂ（二つのＦａｂのＨＣ及びＬＣの混合）による、ＴＳＨＲ被覆チューブと結合する１２５Ｉ−ＴＳＨの阻害。Ｅ ｃｏｌｉ ＨＢ２１５１細胞における発現
培養上清のアッセイ
培養上清のアッセイ
１ 表１４の脚注参照
ｕｄ＝検出不可
表１６ 組み換えｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ、組み換え４Ｂ４ Ｆａｂ（ＧＡＤに対するヒトＭＡｂ）、及び組み換えハイブリッドＦａｂ（二つのＦａｂのＨＣ及びＬＣの混合）による、ＴＳＨＲによってトランスフェクションしたＣＨＯ細胞における環状ＡＭＰ生成の刺激。Ｅ ｃｏｌｉ ＨＢ２１５１細胞における発現
培養上清のアッセイ
培養上清のアッセイ
１ アッセイ緩衝液：１ｇ／Ｌグルコースと、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈｅｐｅｓと、２２２ｍｍｏｌ／Ｌスクロースと、１５ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ２イソブチル−１−メチルキサンチン ｐＨ７．４と、を含有するハンクの緩衝食塩溶液（ＮａＣｌなし）
２ アッセイ緩衝液における希釈
３ 基礎値＝アッセイ緩衝液のみが存在する場合に生成される環状ＡＭＰ
ａ 非誘導細胞における環状ＡＭＰ刺激活性の検出は、ＩＰＴＧが存在しない場合にＦａｂの低レベルの発現を提供するプロモータの構成的活性によるものとした。総組み換えＦａｂレベルは検出不可だったが（検出限界＝５乃至１０ｎｇ／ｍＬ）、環状ＡＭＰ刺激アッセイは、僅か０．３ｎｇ／ｍＬのｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂを検出可能である。
ｕｄ＝検出不可
表１７ 組み換えｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ、組み換え４Ｂ４ Ｆａｂ（ＧＡＤに対するヒトＭＡｂ）、及び組み換えハイブリッドＦａｂ（二つのＦａｂのＨＣ及びＬＣの混合）による、ＴＳＨＲによってトランスフェクションしたＣＨＯ細胞における環状ＡＭＰ生成の刺激。Ｅ ｃｏｌｉ ＨＢ２１５１細胞における発現
ペリプラズム画分のアッセイ
ペリプラズム画分のアッセイ
ｕｄ＝検出不可； １、２、３ 表１６の脚注参照
ａ 非誘導細胞におけるＴＳＨＲＡｂ活性の検出は、ＩＰＴＧが存在しない場合に低レベルの発現を提供するプロモータの構成的活性によるものとした。
表１８ 組み換えｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ、組み換え４Ｂ４ Ｆａｂ、及び組み換えハイブリッドＦａｂ（二つのＦａｂのＨＣ及びＬＣの混合）による、１２５Ｉ−ＧＡＤと結合する４Ｂ４ ＩｇＧ（ＧＡＤに対するハイブリドーマ生成ヒトＭＡｂ）の阻害。Ｅ ｃｏｌｉ ＨＢ２１５１細胞における発現
ペリプラズム画分のアッセイ
ペリプラズム画分のアッセイ
１ 結合の阻害は、次の式を使用して計算した。
Ａ＝試験試料が存在する場合の１２５Ｉ−ＧＡＤ結合
Ｂ＝アッセイ緩衝液が存在する場合の１２５Ｉ−ＧＡＤ結合
ｕｄ＝検出不可
表１９ 組み換えｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ、組み換え４Ｂ４ Ｆａｂ、及び組み換えハイブリッドＦａｂ（二つのＦａｂのＨＣ及びＬＣの混合）による、１２５Ｉ−ＧＡＤと結合する４Ｂ４ ＩｇＧ（ＧＡＤに対するハイブリドーマ生成ヒトＭＡｂ）の阻害。Ｅ ｃｏｌｉ ＨＢ２１５１における発現
培養上清のアッセイ
培養上清のアッセイ
１ 表１８の脚注参照
ｕｄ＝検出不可
表２０ ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞における環状ＡＭＰ生成のｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１誘導刺激における、ＴＳＨＲに対するマウスモノクローナル抗体の影響
１ 全ての希釈は、アッセイ緩衝液（１ｇ／Ｌグルコースと、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈｅｐｅｓと、２２２ｍｍｏｌ／Ｌスクロースと、１５ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ２イソブチル−１−メチルキサンチン ｐＨ７．４と、を含有するハンクの緩衝食塩溶液（ＮａＣｌなし））において行った。
２ 基礎値＝アッセイ緩衝液のみが存在する場合の環状ＡＭＰ生成
３ ２Ｇ２は、サイログロブリンに対するマウスモノクローナル抗体である（１００μｇ／ｍＬのＩｇＧ調製物）。
４ ２Ｂ４及び９Ｄ３３は、ＴＳＨＲに対するマウスモノクローナル抗体である（１００μｇ／ｍＬのＩｇＧ調製物）。
表２１ ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞における環状ＡＭＰ生成のｐＴＳＨ誘導刺激における、ＴＳＨＲに対するマウスモノクローナル抗体の影響
１、２、４ 表２０の脚注参照。個々の実験では、サイログロブリンに対する対照マウスＭＡｂ（２Ｇ２ ＩｇＧ１００μｇ／ｍＬ）は、環状ＡＭＰ生成のｐＴＳＨ（０．５ｎｇ／ｍＬ）刺激に対する影響を有していないことが明らかとなった（ｐＴＳＨ及びアッセイ緩衝液＝１２．７×基礎値、ｐＴＳＨ及び２Ｇ２＝１１．７×基礎値）。
表２２ 様々なＭＡｂによる、ＴＳＨＲ被覆チューブと結合する１２５Ｉ−ＴＳＨ、１２５Ｉ−ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１、又は１２５Ｉ−９Ｄ３３の阻害
１ 全ての希釈は、健康な供血者の血清プール（ＨＢＤプール）におけるものである。
２ 結合の阻害は、次の式を使用して計算した。
Ａ＝試験試料が存在する場合の結合％
Ｂ＝アッセイ緩衝液が存在する場合の結合％
サイログロブリンに対する対照マウスＭＡｂ（２Ｇ２ ０．００１乃至１００μｇ／ｍＬ）は、標識ＴＳＨ、ｈＭＡｂＴＳＨＲ１、又は９Ｄ３３の結合に影響しなかった。
表２３ ＴＳＨＲ被覆チューブと結合する１２５Ｉ−９Ｄ３３及び１２５Ｉ−ＴＳＨに対する患者血清の影響
１ ＨＢＤプール＝健康な供血者の血清プール
Ｇ１乃至Ｇ２０は、グレーブス病患者からの血清である。
Ｄ１及びＤ２は、一型糖尿病患者からのものである（グルタミン酸デカルボキシラーゼに対する自己抗体について陽性）。
Ａ１及びＡ２は、アジソン病患者からのものである（ステロイド２１−ヒドロキシラーゼ自己抗体について陽性）。
Ｎ１乃至Ｎ９は、健康な供血者からの血清である。
２ 結合の阻害は、次の式を使用して計算した。
Ａ＝試験血清が存在する場合の結合％
Ｂ＝健康な供血者の血清プールが存在する場合の結合％
表２４ ＴＳＨＲ被覆チューブと結合する１２５Ｉ−９Ｄ３３に対する、ＴＳＨアゴニスト及びＴＳＨアンタゴニスト活性を有する患者血清の影響
１ ＨＢＤプール＝健康な供血者の血清プールであり、試験血清は、このプールにおいて希釈した。
血清Ａ及びＢは、ＴＳＨアンタゴニスト活性を有する。
血清Ｃ及びＤは、ＴＳＨアゴニスト活性を有する。
２ 結合の阻害は、表２３で使用した式により計算した。
表２５ ＴＳＨＲ被覆チューブと結合する１２５Ｉ−９Ｄ３３及び１２５Ｉ−ＴＳＨに対するＮＩＢＳＣ９０／６７２の影響
１ ９０／６７２は、健康な供血者の血清プールにおいて希釈した。
２ 結合の阻害は、表２３で使用した式により計算した。
表２６ ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂにより免疫付与したマウスからの血清中のポリクローナルｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１抗イディオタイプ抗体による、ＴＳＨＲ被覆チューブと結合する１２５Ｉ−ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂの阻害
１ 試験試料は、アッセイ緩衝液において希釈した。アッセイ緩衝液が存在する場合の結合は、４３％となった。
２ 結合の阻害は、次の式を使用して計算した。
Ａ＝試験試料が存在する場合の１２５Ｉ−ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ結合％
Ｂ＝アッセイ緩衝液が存在する場合の１２５Ｉ−ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂ結合％
表２７ マウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体７Ｅ５１ ＩｇＧによる、ＴＳＨＲ被覆チューブと結合する１２５Ｉ−ｈＭＡｂ ＴＳＨＲ１ Ｆａｂの阻害
１ 表２６の脚注参照
Claims (14)
- ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体をスクリーニングする方法であって、
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを提供するステップであって、
当該結合ペアの第一の分子は、（ｉ）ＴＳＨ受容体と反応するヒトモノクローナル若しくは組み換え抗体又はその１以上の断片、又は（ｉｉ）ＴＳＨ受容体との結合について、前記ヒトモノクローナル抗体若しくは組み換え抗体又はその断片と競合する、ＴＳＨ受容体の更なる抗体若しくはその断片を含み、
当該結合ペアの当該第一の分子は、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも１５単位の、ＴＳＨ受容体でコーティングされた管を使用して決定されたＴＳＨ受容体への１２５Ｉ標識ＴＳＨ結合に関する阻害活性を有し、
当該結合ペアの第二の分子は、全長ＴＳＨ受容体、１以上のＴＳＨ受容体のエピトープ、又は１以上のＴＳＨ受容体のエピトープを含むポリペプチドであり、
（ｂ）当該結合ペアの当該第二の分子が、（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）前記ヒトモノクローナル抗体若しくは組み換え抗体又はその１以上の断片、又は前記ＴＳＨ受容体の更なる抗体若しくはその断片と相互作用できるように、結合分子の当該一つ以上のペアに当該試料を接触させるステップと、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との前記相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供するステップと、を備える方法。 - 前記ステップ（ａ）における前記結合分子の相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるものである、請求項１記載のＴＳＨ受容体に対する自己抗体をスクリーニングする方法。
- ＴＳＨ及び関連リガンドの生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）アッセイを行う方法であって、
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを提供するステップであって、
当該結合ペアの第一の分子は、（ｉ）ＴＳＨ受容体と反応するヒトモノクローナル抗体若しくは組み換え抗体又はその１以上の断片、又は（ｉｉ）ＴＳＨ受容体との結合について、前記ヒトモノクローナル抗体若しくは組み換え抗体又はその断片と競合する、更なる抗体若しくはその断片を含み、
前記結合ペアの第一の分子は、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも１５単位の、ＴＳＨ受容体でコーティングされた管を使用して決定されたＴＳＨ受容体への１２５Ｉ標識ＴＳＨ結合に関する阻害活性を有し、
当該結合ペアの第二の分子は、前記抗体若しくはその断片、又は前記更なる抗体若しくはその断片が相互作用する結合領域を含み、
（ｂ）当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）ＴＳＨ又は関連リガンドを含有する疑いがある試料又は含有する試料中に存在するＴＳＨ又は関連リガンド、或いは（ｉｉ）前記ヒトモノクローナル抗体若しくは組み換え抗体又はその１以上の断片、又は前記ＴＳＨ受容体の更なる抗体若しくはその断片と相互作用できるように、結合分子の当該一つ以上のペアに当該試料を接触させるステップと、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在するＴＳＨ又は関連リガンドとの前記相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ又は関連リガンドの存在の示度を提供するステップと、を備える方法。 - ＴＳＨ受容体の更なる抗体又はその断片を特定する方法であって、更なる抗体又はその断片は、ＴＳＨ受容体との結合が可能で、ＴＳＨ受容体との結合について、ＴＳＨ受容体と反応するヒトモノクローナル若しくは組み換え抗体又はその１以上の断片と競合し、
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを提供するステップであって、
当該結合ペアの第一の分子は、（ｉ）ＴＳＨ受容体のヒトモノクローナル抗体若しくは組み換え抗体又はその断片を含み、
前記結合ペアの第一の分子は、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも１５単位の、ＴＳＨ受容体でコーティングされた管を使用して決定されたＴＳＨ受容体への１２５Ｉ標識ＴＳＨ結合に関する阻害活性を有し、
当該結合ペアの第二の分子は、前記抗体若しくはその断片、又は前記更なる抗体若しくはその断片が相互作用する結合領域を含み、
（ｂ）アッセイの対象となる更なる結合分子を、ＴＳＨ受容体との結合について（ａ）の当該結合ペアの当該第一の分子と競合するＴＳＨ受容体の潜在的な更なる抗体として提供するステップと、
（ｃ）（ａ）の当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）（ｂ）の当該更なる結合分子、或いは（ｉｉ）（ａ）の当該結合ペアの当該第一の分子と相互作用できるように、（ｂ）の当該更なる結合分子を（ａ）の結合分子の当該一つ以上のペアに接触させるステップと、
（ｄ）（ａ）の当該結合ペアの当該第二の分子と（ｂ）の当該更なる結合分子との相互作用をモニタリングし、これにより、（ｂ）の当該更なる結合分子がＴＳＨ受容体との結合について（ａ）の当該結合ペアの当該第一の分子と競合するかのアッセイを行うステップと、を備える方法。 - ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体をスクリーニングするキットであって、
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを備え、
当該結合ペアの第一の分子は、（ｉ）ＴＳＨ受容体と反応するヒトモノクローナル若しくは組み換え抗体又はＴＳＨ受容体との反応性を有するその１以上の断片、又は（ｉｉ）ＴＳＨ受容体との結合について、前記ヒトモノクローナル若しくは組み換え抗体又はその断片と競合する、更なる抗体若しくはその断片を含み、
前記結合ペアの第一の分子は、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも１５単位の、ＴＳＨ受容体でコーティングされた管を使用して決定されたＴＳＨ受容体への１２５Ｉ標識ＴＳＨ結合に関する阻害活性を有し、
当該結合ペアの第二の分子は、前記抗体若しくはその断片又は前記更なる抗体若しくはその断片が相互作用する結合領域を含み、
（ｂ）当該結合ペアの当該第二の分子が、（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）前記ヒトモノクローナル若しくは組み換え抗体又はその１以上の断片、又は前記ＴＳＨ受容体の更なる抗体若しくはその断片と相互作用できるように、当該対象者からの当該体液試料を結合分子の当該一つ以上のペアに接触させる手段と、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との前記相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供する手段と、を備えるキット。 - 前記結合ペアの前記第一及び第二の分子の相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるものである、請求項５記載のキット。
- ＴＳＨ受容体に対する免疫反応に関連する自己免疫疾患に罹患している疑いがある対象者、こうした疾患を起こしやすい対象者、こうした疾患を有する対象者、又はこうした疾患から回復中の対象者から取得した体液試料中のＴＳＨ受容体に対する自己抗体をスクリーニングするキットであって、
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを備え、
当該結合ペアの第一の分子は、１０１０モル−１以上のＴＳＨ受容体に対する親和性を有する、ＴＳＨ受容体のヒトモノクローナル抗体若しくは組み換え抗体又はその断片を含み、
当該結合ペアの第一の分子は、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも１５単位の、ＴＳＨ受容体でコーティングされた管を使用して決定されたＴＳＨ受容体への１２５Ｉ標識ＴＳＨ結合に関する阻害活性を有し、
当該結合ペアの第二の分子は、全長ＴＳＨ受容体、全長ＴＳＨ受容体のエピトープ、又は全長ＴＳＨ受容体の１以上のエピトープを含むポリペプチドを含み、当該結合分子の前記相互作用は、０．４Ｕ／Ｌの国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２に本質的に対応する当該試料における自己抗体力価が検出できるようなものであり、更に、
（ｂ）当該結合ペアの当該第二の分子が、（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ受容体に対する自己抗体、或いは（ｉｉ）当該ＴＳＨ受容体の抗体と相互作用できるように、当該対象者からの当該体液試料を結合分子の当該一つ以上のペアに接触させる手段と、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在する当該自己抗体との前記相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ受容体に対する当該自己抗体の存在の示度を提供する手段と、を備えるキット。 - ＴＳＨ又は関連リガンドのアッセイを行うキットであって、
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを備え、
当該結合ペアの第一の分子は、（ｉ）ＴＳＨ受容体と反応するヒトモノクローナル若しくは組み換え抗体又はその１以上の断片、又は（ｉｉ）ＴＳＨ受容体との結合について、前記ヒトモノクローナル抗体若しくは組み換え抗体又はその断片と競合する、ＴＳＨ受容体の更なる抗体若しくはその断片、を含み、
前記結合ペアの第一の分子は、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも１５単位の、ＴＳＨ受容体でコーティングされた管を使用して決定されたＴＳＨ受容体への１２５Ｉ標識ＴＳＨ結合に関する阻害活性を有し、
当該結合ペアの第二の分子は、前記抗体若しくはその断片、又は前記更なる抗体若しくはその断片が相互作用する結合領域を含み、更に、
（ｂ）当該結合ペアの当該第二の分子が、（ｉ）当該試料中に存在するＴＳＨ又は関連リガンド、或いは（ｉｉ）ヒトモノクローナル抗体若しくは組み換え抗体又はその１以上の断片、又は前記ＴＳＨ受容体の更なる抗体若しくはその断片と相互作用できるように、ＴＳＨ又は関連リガンドを含有する疑いがある試料又は含有する試料を、結合分子の当該一つ以上のペアに接触させる手段と、
（ｃ）当該結合ペアの当該第二の分子と当該試料中に存在するＴＳＨ又は関連リガンドとの前記相互作用をモニタリングし、これにより、当該試料中のＴＳＨ又は関連リガンドの存在の示度を提供するステップと、を備えるキット。 - ＴＳＨ受容体の更なる抗体又はその断片を特定するキットであって、前記更なる抗体又はその断片は、ＴＳＨ受容体との結合が可能で、ＴＳＨ受容体との結合について、ＴＳＨ受容体と反応するヒトモノクローナル若しくは組み換え抗体又はその１以上の断片と競合し、
（ａ）結合分子の一つ以上のペアを備え、
当該結合ペアの第一の分子は、ＴＳＨ受容体と反応するヒトモノクローナル若しくは組み換え抗体又はその１以上の断片を含み、
前記第一の分子は、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも１５単位の、ＴＳＨ受容体でコーティングされた管を使用して決定されたＴＳＨ受容体への１２５Ｉ標識ＴＳＨ結合に関する阻害活性を有し、
当該結合ペアの第二の分子は、前記抗体若しくはその断片又は前記更なる抗体若しくはその断片が相互作用する結合領域を含み、
（ｂ）ＴＳＨ受容体との結合について（ａ）の前記結合ペアの前記第一の分子と競合する、潜在的なＴＳＨ受容体の更なる抗体としてアッセイの対象となる更なる結合対象に、（ａ）の結合分子の当該一つ以上のペアを接触させ、（ａ）の当該結合ペアの当該第二の分子が（ｉ）当該更なる結合分子、或いは（ｉｉ）（ａ）の当該結合ペアの当該第一の分子と相互作用できるようにする手段と、
（ｃ）（ａ）の当該結合ペアの当該第二の分子と当該更なる結合分子との相互作用をモニタリングし、これにより、当該更なる結合分子がＴＳＨ受容体との結合について（ａ）の当該結合ペアの当該第一の分子と競合するかのアッセイを行う手段と、
を備えるキット。 - 前記ヒトモノクローナル若しくは組み換え抗体又はその１以上の断片は、ＴＳＨ受容体と結合するＴＳＨの阻害と、ＴＳＨ受容体を発現する細胞によるｃＡＭＰ生成の刺激とについて、患者の血清ＴＳＨ受容体自己抗体の特徴を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法又は請求項５〜９のいずれか１項に記載のキット。
- 前記ヒトモノクローナル若しくは組み換え抗体又はその１以上の断片は、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも１５単位の、ＴＳＨ受容体でコーティングされた管を使用して決定されたＴＳＨ受容体への１２５Ｉ標識ＴＳＨ結合に関する阻害活性により特徴付けられるか、又は前記ＴＳＨ受容体への１２５Ｉ標識ＴＳＨ結合に関する阻害活性が、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも１２０単位である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法又は請求項５〜９のいずれか１項に記載のキット。
- 前記ヒトモノクローナル若しくは組み換え抗体又はその１以上の断片は、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも３０単位である、１細胞当たり５０，０００ヒトＴＳＨ受容体を発現するＣＨＯ細胞によるｃＡＭＰの生成に関する刺激活性により特徴付けられるか、又は前記１細胞当たり５０，０００のヒトＴＳＨ受容体を発現するＣＨＯ細胞によるｃＡＭＰの生成に関する刺激活性が、１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも２４０単位である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法又は請求項５〜９のいずれか１項に記載のキット。
- 前記ヒトモノクローナル若しくは組み換え抗体又はその１以上の断片は、
（ｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも３０単位の、ＴＳＨ受容体でコーティングされた管を使用して決定されたＴＳＨ受容体への１２５Ｉ標識ＴＳＨ結合に関する阻害活性；及び
（ｉｉ）１ｍｇ当たり国際標準ＮＩＢＳＣ９０／６７２少なくとも５０単位である、１細胞当たり５０，０００ヒトＴＳＨ受容体を発現するＣＨＯ細胞によるｃＡＭＰの生成に関する刺激活性；
により特徴付けられる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法又は請求項５〜９のいずれか１項に記載のキット。 - 前記更なる抗体又はそのフラグメントは、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のヒトモノクローナル又は組み換え抗体のために定義された特性を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法又は請求項５〜９のいずれかに記載のキット。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB0227964.4A GB0227964D0 (en) | 2002-11-29 | 2002-11-29 | Binding partners for the thyrotropin receptor and uses thereof |
| GB0227964.4 | 2002-11-29 | ||
| GB0302140.9 | 2003-01-29 | ||
| GBGB0302140.9A GB0302140D0 (en) | 2002-11-29 | 2003-01-29 | Binding partners for the thyrotropin receptor and uses thereof |
| GB0315147.9 | 2003-06-27 | ||
| GB0315147A GB0315147D0 (en) | 2002-11-29 | 2003-06-27 | Binding partners for the thyrotropin receptor and uses thereof |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004570698A Division JP5314234B2 (ja) | 2002-11-29 | 2003-11-28 | チロトロピン受容体の結合対象及びその使用 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2013126987A JP2013126987A (ja) | 2013-06-27 |
| JP2013126987A5 JP2013126987A5 (ja) | 2013-12-05 |
| JP5722927B2 true JP5722927B2 (ja) | 2015-05-27 |
Family
ID=9948838
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2013007593A Expired - Lifetime JP5722927B2 (ja) | 2002-11-29 | 2013-01-18 | チロトロピン受容体の結合対象及びその使用 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5722927B2 (ja) |
| AT (1) | ATE525086T1 (ja) |
| ES (2) | ES2371244T3 (ja) |
| GB (2) | GB0227964D0 (ja) |
| HU (1) | HUE034370T2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5304939B1 (ja) * | 2012-05-31 | 2013-10-02 | 大日本印刷株式会社 | 光学積層体、偏光板、偏光板の製造方法、画像表示装置、画像表示装置の製造方法及び画像表示装置の視認性改善方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9909661D0 (en) * | 1998-06-06 | 1999-06-23 | Rsr Ltd | Assays for TSH receptor autoantibodies |
| US8110664B2 (en) * | 2002-11-29 | 2012-02-07 | Rsr Limited | Binding partners for the thyrotropin receptor and uses thereof |
-
2002
- 2002-11-29 GB GBGB0227964.4A patent/GB0227964D0/en not_active Ceased
-
2003
- 2003-01-29 GB GBGB0302140.9A patent/GB0302140D0/en not_active Ceased
- 2003-11-28 ES ES03778537T patent/ES2371244T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-28 HU HUE10184462A patent/HUE034370T2/en unknown
- 2003-11-28 AT AT03778537T patent/ATE525086T1/de active
- 2003-11-28 ES ES10184462.9T patent/ES2624241T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2013
- 2013-01-18 JP JP2013007593A patent/JP5722927B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB0227964D0 (en) | 2003-01-08 |
| ATE525086T1 (de) | 2011-10-15 |
| JP2013126987A (ja) | 2013-06-27 |
| GB0302140D0 (en) | 2003-03-05 |
| ES2371244T3 (es) | 2011-12-28 |
| ES2624241T3 (es) | 2017-07-13 |
| HUE034370T2 (en) | 2018-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8753637B2 (en) | Binding partners for the thyrotropin receptor and uses thereof | |
| JP5982698B2 (ja) | Ｄｌｌ４に特異的に結合する新規モノクローナル抗体及びその用途 | |
| US10613099B2 (en) | Cell lines expressing surface bound anti-idiotype antibodies against anti-CD22 antibodies and uses thereof | |
| JP7215759B2 (ja) | ４－１ｂｂ抗体およびその製造方法と使用 | |
| EP3878869A1 (en) | Nkg2a antibody, preparation method therefor and application thereof | |
| US20140243265A1 (en) | Antibodies to modified human igf-1/e peptides | |
| RU2710439C2 (ru) | Новое антитело против пресепсина | |
| US7935793B2 (en) | Treatment of inflammatory bowel diseases with anti-IP-10 antibodies | |
| US20120070845A1 (en) | Methods, systems and reagents for improved immunodetection | |
| CN115515984A (zh) | 一种抗cd19抗体的抗体及其制备和应用 | |
| JP2729159B2 (ja) | ヒトグリセンチンのモノクローナル抗体、この抗体を産生するハイブリドーマおよびそれを用いるヒトグリセンチンの定量法 | |
| EP1708961B1 (en) | Anti-ip-10 antibodies | |
| JP5722927B2 (ja) | チロトロピン受容体の結合対象及びその使用 | |
| JP2011160696A (ja) | 修飾ヒトｉｇｆ−１／ｅペプチドに対する抗体 | |
| CN113999306A (zh) | 一种获得识别空间构象表位抗体的方法 | |
| JPWO2005056597A1 (ja) | 免疫グロブリンＦｃ受容体タンパク質 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131018 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140624 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140919 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150224 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150326 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5722927 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |