PT2121919E - Receptores acoplados à proteína-g e métodos para a sua selecção - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"RECEPTORES ACOPLADOS À PROTEÍNA-G E MÉTODOS PARA A SUA SELECÇÃO"

Descrição [0001] A presente invenção refere-se a receptores acoplados à proteína-G (GPCR) e a métodos para a selecção dos mais estáveis. Em particular, refere-se à selecção e preparação de GPCR mutantes com uma maior estabilidade sob uma determinada condição, quando comparados às suas respectivas proteínas precursoras. Essas proteínas têm maior probabilidade de cristalizar e, portanto, é mais fácil determinar a sua estrutura do que as das proteínas precursoras. São também úteis para a descoberta de fármacos e estudos de desenvolvimento.

[0002] Ao longo dos últimos 20 anos, a taxa de determinação das estruturas de proteínas membranares tem aumentado gradualmente, contudo, o maior sucesso está associado à cristalização de proteínas da membrana bacteriana e não da eucariótica [1]. As proteínas da membrana bacteriana têm sido mais simples de sobrexpressar, através de técnicas padrão, em Escherichia coli do que as proteínas da membrana eucariótica [2,3] e estão longe de ser estáveis em detergentes, sendo esta estabilidade um pré-requisito essencial para a purificação e cristalização. Os projectos de sequenciação do genoma permitiram também a clonagem e expressão de numerosos homólogos de um transportador específico ou canal iónico, o que também melhora substancialmente a probabilidade de sucesso durante a cristalização. Contudo, das 120 estruturas de proteínas da membrana solucionadas até à data apenas sete são 1 estruturas de proteínas integrais da membrana de mamíferos (http://blanco.biomol.uci.edu/); cinco destas proteínas de membrana foram purificadas a partir de fontes naturais e são estáveis em soluções detergentes. Para além das dificuldades na sobrexpressão de proteínas da membrana eucariótica, estas são habitualmente pouco estáveis em soluções detergentes, o que restringe drasticamente o espectro de condições de cristalização que podem ser exploradas sem a sua desnaturação ou precipitação imediatas. 0 ideal será que as proteínas da membrana sejam estáveis durante diversos dias numa determinada solução detergente, contudo, os detergentes mais adequados à cultura de cristais com qualidade de difracção têm tendência para ser os detergentes mais desestabilizadores, ou seja, aqueles que incluem cadeias alifáticas curtas e grupos de "cabeça" pequenos ou carregados. Por outro lado, o que mais nos interessa solucionar são as estruturas de proteínas da membrana humana, já que a sua contribuição é requerida para o desenvolvimento de agentes terapêuticos pela indústria farmacêutica; frequentemente, verificam-se diferenças substanciais na farmacologia de receptores, canais e transportadores entre diferentes mamíferos, ao passo que o genoma das leveduras e bactérias pode não incluir quaisquer proteínas homólogas. Existe assim uma necessidade premente para o desenvolvimento de uma estratégia genérica que permita a produção de proteínas integrais da membrana eucariótica para cristalização, determinação estrutural e, potencialmente, outros fins tais como o exame toxicológico, bioensaio e a aplicações de biossensores.

[0003] As proteínas da membrana evoluíram para ser suficientemente estáveis na membrana e assegurar a viabilidade celular, mas não para ser estáveis em soluções 2 detergentes, o que sugere que as proteínas da membrana poderiam ser desenvolvidas de forma artificial e que poderiam ser isolados mutantes estáveis em detergente. Tal foi subsequentemente demonstrado para duas proteínas bacterianas, diacilglicerol quinase (DGK) [5,6] e bacteriorodopsina [7]. A mutagénese aleatória da DGK identificou mutações pontuais especificas que aumentaram a termoestabilidade e, quando combinadas, o seu efeito foi aditivo, de forma que o mutante com uma estabilidade óptima apresentou uma semivida de 35 minutos a 80°C, em contraste com a semivida de 6 minutos a 55°C da proteína nativa [6]. Foi demonstrado que o trímero do mutante da DGK resistente a detergentes se tornou estável em SDS sendo, portanto, provável que a estabilização do estado oligomérico tenha desempenhado um papel significativo na termoestabilização. Apesar do objectivo da mutagénese ter sido o de produzir uma proteína da membrana adequada para cristalização, permanece por determinar a estrutura da DGK e não existem registos da ocorrência de uma cristalização bem sucedida. Um estudo adicional acerca da bacteriorodopsina, concretizado através de mutagénese com exploração da cisterna ao longo da hélice B, demonstrou que não é possível prever que resíduos de aminoácidos conduziriam à termoestabilidade aquando da mutação nem, quando realizado em contexto estrutural, foi clara a origem da termoestabilização [7].

[0004] Os GPCR constituem uma grande família de proteínas que controlam diversos processos fisiológicos e são os alvos de muitos fármacos eficazes. Assim, estes possuem uma importância farmacológica considerável. É facultada uma lista de GPCR em Foord et al (2005) Pharmacol Rev. 57, 279-288. Os GPCR são geralmente instáveis quando isolados e, apesar de esforços consideráveis, não foi possível 3 cristalizá-los, com excepção da rodopsina bovina que é por natureza excepcionalmente estável.

[0005] Os GPCR são alvos de interesse farmacológico, é feita um referência particular a Overington et al (2006) Nature Rev. Drug Discovery 5, 993-996, que indica que mais de um quarto dos fármacos actuais têm um GPCR como alvo.

[0006] Pensa-se que os GPCR existem em múltiplas e distintas conformações associadas a diferentes classes farmacológicas de ligantes, tais como agonistas ou antagonistas, e que alternam entre estas conformações para poderem funcionar (Kenakin T. (1997) Ann NY Acad Sei 812, 116-125).

[0007] Será de notar que os métodos da invenção não incluem um método como o descrito por D'Antona et al., que inclui a ligação de [3H]CP55940 a um receptor canabinóide 1 (T210A) humano constitutivamente inactivo, onde o resíduo de treonina (Thr) na posição 210 é substituído por um resíduo de alanina (Ala).

[0008] A enumeração ou discussão de um documento pré-publicado não deve, necessariamente, ser considerada com um reconhecimento de que este integra o estado actual da técnica ou que seja do conhecimento geral.

[0009] Percebemos que existem dois graves problemas associados à tentativa de cristalização dos GPCR, nomeadamente, a sua falta de estabilidade em detergente e o facto de que estes existem em múltiplas conformações. Para poderem funcionar, os GPCR evoluíram para alternar entre duas conformações distintas, a forma ligada a agonistas e a forma ligada a antagonistas, podendo as alterações entre estas duas conformações ocorrer espontaneamente na ausência do ligante. É, então, provável que quaisquer receptores 4 purificados preencham uma mistura de conformações. A simples adição de ligantes aos GPCR durante os ensaios de cristalização não resultou na sua determinação estrutural. Para aumentar a probabilidade de cristalização, seleccionámos então múltiplas mutações que aperfeiçoaram a estabilidade do GPCR e, adicionalmente, bloquearam o receptor numa conformação biologicamente relevante.

[0010] Decidimos verificar se a estabilização de um GPCR numa conformação particular, biologicamente relevante, era possivel e se o efeito era suficientemente elevado ao ponto de melhorar significativamente a probabilidade de obter cristais com qualidade de difracção. No Exemplo 1, o receptor βΐ-adrenérgico (PAR) de eritrócitos de peru [8] foi seleccionado como objecto de teste para este estudo, por várias razões. 0 PAR é um receptor acoplado à proteina-G (GPCR) farmacologicamente bem desenvolvido, com vários ligantes disponíveis no mercado e sob a forma radiomarcada. Adicionalmente, a sobrexpressão do PAR foi particularmente bem sucedida utilizando o sistema de expressão em baculovirus, podendo este ser purificado em quantidades de miligramas numa forma funcional [9] . No Exemplo 2, foi utilizado um receptor de adenosina humano e no Exemplo 3, um receptor de neurotensina de ratazana. Método para a selecção de GPCR mutantes com elevada estabilidade [0011] Um primeiro aspecto da invenção fornece um método para a selecção de um receptor acoplado à proteina-G (GPCR) com elevada estabilidade conformacional, que compreende (a) fornecer um ou mais mutantes de um GPCR precursor, 5 (b) seleccionar um ligante de uma determinada classe, sendo este um ligante que se vincula ao GPCR precursor quando o GPCR se encontra numa determinada conformação, (c) determinar se o GPCR mutante ou cada GPCR mutante tem uma elevada estabilidade conformacional no que concerne à vinculação do ligante seleccionado, quando comparada com a estabilidade do precursor em relação à ligação desse mesmo ligante, através da medição da desnaturação expressa pela perda de capacidade de vinculação do ligante, sob condições desnaturantes tais como o calor, um detergente, agente caotrópico ou extremo de pH, e (d) seleccionar os mutantes que apresentam uma estabilidade conformacional reforçada face à do precursor em relação à vinculação desse mesmo ligante; onde a conformação especifica em que se encontra o GPCR no passo (c) corresponde à mesma classe de ligantes que o ligante seleccionado no passo (b).

[0012] Os inventores perceberam que, de forma a aumentar a probabilidade de cristalização de um GPCR numa forma biologicamente relevante (que, como tal, é farmacologicamente útil), é desejável não apenas o reforço da estabilidade da proteína mas também que esta apresente uma elevada estabilidade quando se encontra numa determinada conformação. A conformação é determinada por um ligante seleccionado e é biologicamente relevante, em particular, farmacologicamente relevante. Assim, o método da invenção pode ser considerado como um método de selecção dos mutantes de um GPCR que demonstram uma elevada estabilidade para uma determinada conformação, por exemplo, uma elevada termoestabilidade conformacional. O método pode ser utilizado para criar GPCR estáveis, conformacionalmente 6 bloqueados, através de mutagénese. Os GPCR mutantes seleccionados são formas efectivamente mais puras das proteínas precursoras, na medida em que uma maior proporção das mesmas ocupa um determinado estado conformacional. A escolha intencional de uma conformação seleccionada do receptor surgiu a partir de outras conformações, através da utilização de um ligante (ou ligantes) que se vincula preferencialmente a esta conformação e é, dessa forma, um importante aspecto da invenção. 0 método pode também ser considerado como um método de selecção dos GPCR mutantes mais maleáveis à cristalização.

[0013] Assim, a invenção inclui um método de selecção de um receptor acoplado à proteína-G (GPCR) com elevada estabilidade conformacional, que compreende (a) fornecer um ou mais mutantes de um GPCR precursor, (b) seleccionar um ligante de uma determinada classe, sendo este um ligante que se vincula ao GPCR precursor quando o GPCR se encontra numa determinada conformação, (c) determinar se o GPCR mutante ou cada GPCR mutante quando numa determinada conformação apresenta uma estabilidade conformacional reforçada no que concerne à vinculação do ligante seleccionado face à estabilidade do precursor em relação à ligação desse mesmo ligante quando este se encontra nessa mesma conformação, através da medição da desnaturação expressa pela perda de capacidade de vinculação do ligante, sob condições desnaturantes tais como o calor, um detergente, agente caotrópico ou extremo de pH, e (d) seleccionar os mutantes que apresentam uma estabilidade conformacional reforçada face à do 7 precursor em relação à vinculação desse mesmo ligante; onde a conformação específica em que se encontra o GPCR no passo (c) corresponde à mesma classe de ligantes que o ligante seleccionado no passo (b).

[0014] Em revisão da publicação acerca do genoma com potencial farmacológico por Hopkins & Groom (2002) Nature Rev. Drug Discovery 1, 727-730, inserimos na Tabela 1 uma lista de famílias proteicas, sendo muitas das quais GPCR. Overington et al., (2006) Nature Rev. Drug Discovery 5, 993-996, fornecem detalhes adicionais acerca dos alvos farmacológicos sendo indicado, na Figura 1, que mais de um quarto dos fármacos actuais têm os GPCR como alvo. Existem 52 alvos GPCR para os fármacos disponíveis para administração oral, entre um total de 186 alvos nesta categoria.

[0015] Os GPCR adequados para utilização na aplicação prática da invenção incluem, mas não exclusivamente, o receptores β-adrenérgico, o receptores da adenosina, particularmente o A2a, e o receptores da neurotensina (NTR). Outros GPCR são bem conhecidos na área e incluem os enumerados por Hopkins & Groom, supra. Foi adicionalmente elaborada uma lista dos GPCR pela International Union of Pharmacology (Foord et al (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288, sendo esta periodicamente actualizada em http://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorFamiliesForward).

Deve mencionar-se que os GPCR se encontram divididos em diferentes classes, principalmente em função das semelhanças entre as suas sequências de aminoácidos. São também divididos em famílias, em função dos ligantes naturais a que se vinculam. Todos os GPCR estão incluídos no âmbito da invenção.

[0016] As sequências de aminoácidos (e sequências de nucleótidos dos cDNA na base da sua codificação) de muitos GPCR encontram-se prontamente disponíveis, por exemplo, no GenBank. Em particular, Foord et al, supra, fornece os simbolos e as identificações dos qenes humanos, murinos e de ratazana da base de dados Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez). Será também de notar que uma vez que a sequência do genoma humano se encontra substancialmente completa, pode servir como base de dedução para as sequências de aminoácidos dos GPCR humanos.

[0017] Apesar do GPCR poder derivar de qualquer fonte, é particularmente preferível que esta seja eucariótica. É particularmente preferível se este derivar de uma fonte vertebrada, como um mamífero ou pássaro. É particularmente preferível se o GPCR for derivado de um rato, coelho ou cão, primata não-humano ou homem ou de uma galinha ou peru. Para que não subsistam dúvidas, incluímos na acepção do termo "derivado de" que um cDNA ou gene foi originalmente obtido a partir de material genético da fonte e que a proteína poderá, contudo, ser subsequentemente expressa por qualquer célula hospedeira. Assim, será evidente que um GPCR eucariótico (tal como um GPCR de aves ou mamíferos) possa ser expresso numa célula hospedeira procariótica, como a E. coli, e ser ainda considerado como derivado de aves ou mamíferos, conforme o caso.

[0018] 0 GPCR pode, em alguns casos, ser composto por mais de uma subunidade diferente. Por exemplo, o receptor do péptido associado ao gene da calcitonina requer a ligação de uma proteína de hélice transmembranar única (RAMP1) para poder adquirir as suas características fisiológicas de vinculação ao ligante. As proteínas efectoras, auxiliares 9 ou com interacção com o GPCR que se combinam ao mesmo para formar ou modular um complexo funcional, são bem conhecidas na área e incluem, por exemplo, quinases receptoras, proteinas-G e arrestinas (Bockaert et al (2004) Curr Opinion Drug Discov and Dev 7, 649-657).

[0019] Os mutantes do GPCR precursor podem ser produzidos através de qualquer meio apropriado e fornecidos sob qualquer forma adequada. Assim, por exemplo, pode ser produzida uma série de mutantes específicos da proteína precursora, onde cada resíduo de aminoácido na totalidade ou em parte desta proteína é individualmente alterado por outro resíduo de aminoácido. Por exemplo, poderá ser conveniente a realização de mutações nos locais da proteína que se prevêem ser expansores da membrana. A estrutura tridimensional da rodopsina é conhecida (Li et al (2004) J Mol Biol 343, 1409-1438; Palczewski et al (2000) Science 289, 739-745), sendo possível modelar alguns GPCR de acordo com a mesma. Assim, as partes do GPCR a mutar podem, convenientemente, ter como base a modelação. De modo semelhante, estão disponíveis aplicações informáticas que modelam as regiões dos GPCR com base na sua hidrofobicidade (Kyle & Dolittle (1982) J. Mol. Biol. 157, 105-132), podendo esses modelos ser utilizados aquando da selecção da proteina a mutar. Podem ser empregues a mutagénese dirigida convencional ou os procedimentos de reacção em cadeia da polimerase, bem conhecidos na área. É possível, mas menos desejável, utilizar métodos de visualização cromossómica na selecção da proteína mutante.

[0020] Habitualmente, cada aminoácido é substituído por Ala (ou seja, mutagénese de exploração de Ala), apesar de poder ser substituído por qualquer outro aminoácido. Se o aminoácido seleccionado for Ala, este poderá ser 10 convenientemente substituído por Leu. Em alternativa, o aminoácido pode ser substituído por Gly (ou seja, mutagénese de exploração de Gly), o que poderá permitir um acondicionamento mais próximo das hélices contíguas que poderão bloquear a proteína numa determinada conformação. Se o aminoácido seleccionado for Gly, este poderá ser convenientemente substituído por Ala.

[0021] Apesar do aminoácido seleccionado para substituir o aminoácido mencionado numa determinada posição ser habitualmente de ocorrência natural, tipicamente, um aminoácido "codificável", este poderá também ser não natural (circunstância em que a proteína é normalmente produzida através de síntese química ou pela utilização de enzimas aminoacil tRNA). Um aminoácido "codificável" é um aminoácido incorporado num polipéptido por tradução do mRNA. É também possível criar adições de aminoácidos não naturais ou introduzir ligações não peptídicas numa determinada posição através de modificação quimica covalente, por exemplo, por tratamento pós-translacional da proteína ou semi-síntese. Estas modificações pós-translacionais podem ser naturais, tais como a fosforilação, glicosilação ou a palmitoilação, sintéticas ou biossintéticas.

[0022] Em alternativa, os mutantes podem ser produzidos através de um processo de mutagénese aleatória, que pode ser da proteína inteira ou de uma porção seleccionada da mesma. Os processos de mutagénese aleatória são bem conhecidos na área.

[0023] Convenientemente, o GPCR mutante apresenta um aminoácido substituído em relação à proteína precursora (ou seja, encontra-se mutado numa posição de aminoácido). 11

Assim, pode ser avaliada a contribuição da substituição de um único aminoácido para a estabilidade conformacional. Contudo, o GPCR mutante avaliado quanto à estabilidade conf ormacional pode ter mais do que uma substituição de aminoácido relativamente à proteina precursora, tal como 2, 3, 4, 5 ou 6 substituições.

[0024] Tal como discutido seguidamente em maior detalhe, as combinações de mutações podem ser executadas com base nos resultados do método de selecção. Constatou-se que em alguns casos específicos a combinação de mutações numa única proteina mutante conduz a um reforço adicional da estabilidade conformacional. Assim, deverá ser notado que o método da invenção pode ser usado de forma interactiva por, por exemplo, pode ser executado para identificar as mutações simples que reforçam a estabilidade conformacional e combiná-las num único GPCR mutante, que corresponde ao fornecido na etapa (a) do método. Assim, as proteínas multiplamente mutadas podem ser seleccionadas através do método.

[0025] Não é necessário que o GPCR precursor seja uma proteina de ocorrência natural. Poderá, convenientemente, ser uma versão artificial com capacidade de expressão num organismo hospedeiro adequado, tal como a Escherichia coli. Por exemplo, conforme descrito no Exemplo 1, uma versão artificial conveniente do receptor β-adrenérgico de peru é uma versão truncada que não contém os resíduos 1-33 da sequência de aminoácidos (ou seja, βΑΕ34-424) . O GPCR precursor pode ser uma forma truncada da proteína de ocorrência natural (truncada em uma ou ambas as extremidades) ou uma fusão à proteína de ocorrência natural ou a um fragmento da mesma. Em alternativa ou adicionalmente, o GPCR precursor, comparado com um GPCR de 12 ocorrência natural, pode ser modificado de modo a beneficiar, por exemplo, a sua solubilidade e estabilidade proteolitica (por exemplo, por truncamento, deleção de loops ou pela mutação de locais de glicosilação ou das cadeias laterais reactivas de aminoácidos como a cisteina). Em todo o caso, o GPCR precursor é uma proteína capaz de estabelecer ligação com o ligante seleccionado, sendo este um ligante conhecido por se vincular ao GPCR de ocorrência natural. Convenientemente, o GPCR precursor é um receptor que pode afectar, para além de um ligante apropriado, uma ou mais das actividades a jusante, comummente conhecidas como susceptíveis à activação da proteína-G.

[0026] Contudo, será entendido que a estabilidade conformacional do mutante deve ser comparada à de um precursor, para que possa ser possível avaliar a ocorrência de um aumento na estabilidade conformacional.

[0027] É seleccionado um ligante, sendo este um ligante que se vincula ao GPCR precursor quando este se encontra numa determinada conformação. 0 ligante irá, tipicamente, vincular-se a uma determinada conformação do GPCR precursor (e poderá fazer com que o GPCR a adopte) mas não se ligará com a mesma intensidade a outra conformação que o GPCR possa adoptar. Assim, pode ser ponderada a presença do ligante para encorajar o GPCR a adoptar uma determinada conformação. Desse modo, o método pode ser considerado como uma forma de selecção dos GPCR mutantes que se encontram presos numa conformação com relevância biológica (por exemplo, estado de ligação ao receptor) e que são mais estáveis relativamente a essa conformação.

[0028] A conformação específica em que o GPCR se encontra 13 no passo (c) corresponde à classe do ligante seleccionado no passo (b).

[0029] 0 ligante seleccionado será, preferencialmente, da classe agonista de ligantes e a sua conformação especifica será uma conformação agonista ou será da classe antagonista de ligantes e a sua conformação especifica será uma conformação antagonista.

[0030] Preferencialmente, o ligante seleccionado é da classe agonista e a conformação especifica em que se encontra o GPCR no passo (c) é a conformação agonista.

[0031] Preferencialmente, a afinidade de vinculação do ligante seleccionado relativamente ao receptor mutante deverá ser igual ou superior à mesma afinidade para o receptor do tipo selvagem; os mutantes que apresentam uma ligação significativamente reduzida ao ligante seleccionado são, habitualmente, descartados.

[0032] Incluímos na acepção do termo "ligante" qualquer molécula que estabeleça ligação com o GPCR e faça com que este permaneça numa determinada conformação. 0 ligante será, preferencialmente, um ligante que faça com que mais de metade do total de moléculas do GPCR se encontre numa determinada conformação.

[0033] É conhecido um grande número de ligantes adequados.

[0034] Tipicamente, o ligante é um agonista total capaz de se ligar ao GPCR e de desencadear uma resposta biológica completa (100%) medida, por exemplo, através do acoplamento da proteína-G, de eventos de sinalização a jusante ou de um resultado fisiológico como a vasodilatação. Por 14 conseguinte, a resposta biológica é, habitualmente, uma alteração GDP/GTP na proteina-G, seguida pela estimulação da via efectora ligada. A medição é, normalmente, uma alteração GDP/GTP ou uma modificação do nivel de produto final da via efectora (por exemplo, AMPc, GMPc ou fosfatos de inositol). 0 ligante pode também ser um agonista parcial capaz de se ligar ao GPCR e de desencadear uma resposta biológica parcial (<100%) .

[0035] 0 ligante pode também ser um agonista inverso, que é uma molécula que estabelece ligação com um receptor e reduz a sua actividade basal (ou seja, não estimulada pelo agonista), por vezes, até zero.

[0036] 0 ligante pode também ser um antagonista, que é uma molécula que estabelece ligação com um receptor e bloqueia a ligação de um agonista impedindo, dessa forma, a existência de uma resposta biológica. Os agonistas inversos e parciais podem, sob determinadas condições de ensaio, ser antagonistas.

[0037] Os ligantes anteriores podem ser ortostéricos, implicando essa designação que estes se combinam com o mesmo local que o agonista endógeno; podem também ser alostéricos ou alotrópicos, implicando estas designações que estes se combinam a um local diferente do ortostérico. Os ligantes anteriores podem ser sintópicos, implicando essa designação que estes interagem com outro (s) ligante (s) no mesmo local ou num local sobreposto. Estes podem ser reversíveis ou irreversíveis.

[0038] No que concerne aos antagonistas, estes podem ser transponíveis, implicando esta designação que o efeito máximo do agonista não é reduzido quer pelo pré-tratamento, 15 quer pelo tratamento simultâneo com antagonistas; podem também ser intransponíveis, implicando esta designação que o efeito máximo do agonista é reduzido quer pelo pré-tratamento quer pelo tratamento simultâneo com antagonistas; podem ainda ser neutros, implicando esta designação que este é um antagonista sem actividade agonista inversa ou parcial. Os antagonistas são, normalmente, agonistas inversos.

[0039] Os ligantes para utilização na invenção podem também ser moduladores alostéricos, tais como moduladores alostéricos positivos, potenciadores, moduladores alostéricos negativos e inibidores. Estes podem funcionar como agonistas ou agonistas inversos em pleno direito ou apenas ter actividade na presença de um agonista ou agonista inverso, circunstância em que são utilizados em combinação com tais moléculas de forma a estabelecerem ligação com o GPCR.

[0040] Neubig et al (2003) Pharmacol. Rev. 55, 597-606, descrevem várias classes de ligantes.

[0041] Os ligantes anteriores são, preferencialmente, pequenas fracções orgânicas ou inorgânicas, mas poderão ser péptidos ou polipéptidos. Normalmente, quando o ligante é uma pequena fracção orgânica ou inorgânica tem uma Mr de 50 a 2000, tal como de 100 a 1000, por exemplo, de 100 a 500.

[0042] Habitualmente, o ligante estabelece ligação com o GPCR com uma Kd de mM a pM, por exemplo no intervalo entre μΜ (micromolar) a nM. Geralmente, são preferidos os ligantes com as Kd mais reduzidas.

[0043] Os ligantes de pequenas moléculas orgânicas são bem 16 conhecidos na área, ver, por exemplo, os Exemplos abaixo. Outros ligantes de pequenas moléculas incluem os receptores 5HT, um agonista total, e 5HT1A; eltoprazina, um agonista parcial, e o receptor 5HT1 (ver, Newman-Tancredi et al (1997) Neurophamacology 36, 451-459); (+)-butaclamol e espiperona são agonistas inversos do receptor de dopamina D2 (ver, Roberts & Strange (2005) Br. J. Pharmacol. 145, 34-42); e WIN55212-3 é um antagonista neutro do CB2 (Savinainen et al (2005) Br. J. Pharmacol. 145, 636-645).

[0044] O ligante pode ser um peptidomimético, um ácido nucleico, um ácido nucleico peptídico (PNA) ou um aptâmero. Pode ser um ião como Na+ ou Zn2+, um lipido como a oleamida ou um hidrato de carbono como a heparina.

[0045] O ligante pode ser um polipéptido que estabelece ligação com o GPCR. Tais polipéptidos (onde incluímos oligopéptidos) têm, habitualmente uma Mr de 500 a 50.000, podendo contudo ser maiores. O polipéptido pode ser uma proteína de ocorrência natural que interage com o GPCR ou qualquer outra proteína que interaja com o mesmo, um derivado ou um fragmento das mesmas, desde que conserve a sua ligação selectiva ao GPCR numa determinada conformação. As proteínas de interacção com o GPCR incluem as associadas à sinalização e tráfico, cuja actuação é frequentemente realizada através dos domínios PDZ na porção C-terminal do GPCR.

[0046] Os polipéptidos conhecidos pela vinculação de determinados GPCR incluem qualquer uma ou várias das seguintes: proteína G, arrestina, proteína RGS, quinase do receptor da proteína-G, RAMP, proteína 14-3-3, NSF, periplaquina, espinofilina, quinase GPCR, receptor tirosina-quinase, canal iónico ou subunidade do mesmo, 17 anquirina ou uma proteína de Shanks ou Homer. Outros polipéptidos incluem as subunidades do receptor NMDA, NRl ou NR2a, DRD1IP ou uma estrutura de domínio da fibronectina. 0 polipéptido pode ser um polipéptido que estabelece ligação com um domínio extracelular de um GPCR, como a fibulina-1. 0 polipéptido pode ser outro GPCR, que estabelece ligação com o GPCR seleccionado num hetero-oligómero. Uma análise das interacções proteína-proteína nos GPCR é apresentada em Milligan & White (2001) Trends Pharmacol. Sei. 22, 513-518 ou em Bockaert et al (2004) Curr. Opinion Drug Discov. Dev. 7, 649-657.

[0047] O ligante polipeptídico pode, convenientemente, ser um anticorpo que estabelece ligação com o GPCR. Incluímos na acepção do termo "anticorpo" os anticorpos de ocorrência natural, monoclonais ou fragmentos dos mesmos. Incluímos também os anticorpos sintéticos e moléculas que se assemelham aos anticorpos nas suas características de ligação, com inclusão das moléculas Fv de cadeia simples (scFv) e dos anticorpos de domínio (dAbs). Podem também ser mencionados anticorpos camelídeos ou anticorpos camelídeos sintéticos. Tais moléculas que ligam os GPCR são conhecidas na área, podendo qualquer procedimento ser realizado através de tecnologia bem conhecida. Os anticorpos adequados incluem os actualmente utilizados nos radioimunoensaios (RIA) para GPCR uma vez que têm tendência para reconhecer epítopos conformacionais.

[0048] O polipéptido pode também ser uma proteína de ligação com base numa estrutura modular, como as proteínas de repetição de anquirina ou armadilho, proteínas ricas em leucina, proteínas de repetição de tetratricopéptidos ou proteínas desenhadas com repetição de anquirina (DARPins), proteínas com base nos domínios da lipocalina ou 18 fibronectina ou suportes Affilin® baseados na cristalina gama humana ou ubiquitina humana.

[0049] Numa modalidade da invenção, o ligante é unido de forma covalente ao GPCR, tal como uma proteína-G ou proteina de fusão de arrestina. Alguns GPCR (por exemplo, o receptor de trombina) são clivados da região N-terminal pela protease e os novos N-terminais estabelecem ligação com o local agonista. Assim, tais GPCR são fusões naturais GPCR-ligante.

[0050] Deve mencionar-se que a utilização de anticorpos ou outros polipéptidos de ligação "universais" (como as proteínas G, conhecidas pela sua capacidade de vinculação a diferentes GPCR) pode ser particularmente vantajosa na aplicação do método a GPCR "órfãos", para os quais não se conhece o ligante natural ou de pequenas moléculas.

[0051] Após a selecção do ligante é, então, determinado se o GPCR mutante ou cada GPCR mutante apresenta uma estabilidade conformacional reforçada face à do GPCR precursor relativamente à vinculação do ligante seleccionado. Deverá ser referido que este passo (c) é um passo em que é determinado se o GPCR mutante ou cada GPCR mutante apresenta uma elevada estabilidade conformacional (em relação ao seu precursor) para uma determinada conformação, definida através do ligante seleccionado. Assim, o GPCR mutante apresenta uma elevada estabilidade conformacional no que concerne à vinculação do ligante seleccionado, medida através da vinculação do ligante ou durante a vinculação do ligante seleccionado. Tal como discutido em seguida, é particularmente preferível se o reforço da estabilidade conformacional for avaliado em simultâneo com a vinculação do ligante seleccionado. 19 [0052] A elevada estabilidade conformacional é, convenientemente, avaliada através da expansão da duração de vida do mutante sob as condições impostas, que podem conduzir à sua instabilidade (tais como o calor, condições associadas à presença de um detergente agressivo, agentes caotrópicos, etc.)· A desestabilização na condição imposta é, habitualmente, determinada pela avaliação da desnaturação ou perda estrutural. Tal como discutido em seguida, esta poderá manifestar-se através da perda de capacidade de vinculação do ligante ou pela perda de indicadores estruturais secundários ou terciários.

[0053] Tal como é em seguida descrito em relação à Figura 12 (que divulga uma modalidade preferencial em particular), existem diferentes formatos de ensaio que podem ser utilizados na determinação da estabilidade conformacional do GPCR mutante.

[0054] Numa modalidade, o GPCR mutante pode ser colocado em contacto com um ligante antes de ser sujeito a um procedimento em que é determinada a sua estabilidade conformacional (permanecendo o GPCR mutante e o ligante em contacto durante o período de teste). Assim, por exemplo, quando o método é utilizado para seleccionar um GPCR mutante que, quando se encontra numa determinada conformação, se vincula a um ligante e apresenta uma termoestabilidade reforçada, o receptor é colocado em contacto com o ligante antes de ser aquecido, utilizando-se a quantidade de ligante vinculado ao receptor para expressar a termoestabilidade em relação à do receptor precursor. Este procedimento fornece uma medida da quantidade de GPCR que conserva a capacidade de vinculação ao ligante após exposição a condições de desnaturação (por 20 exemplo, calor), que constitui, por sua vez, um indicador de estabilidade conformacional.

[0055] Numa modalidade alternativa (porém menos preferida), o GPCR é sujeito a um procedimento em que a estabilidade conformacional do mutante é determinada antes deste ser colocado em contacto com o ligante. Assim, por exemplo, quando o método é utilizado para seleccionar receptores membranares mutantes que, quando se encontram numa determinada conformação, se vinculam a um ligante e apresentam uma termoestabilidade reforçada, o receptor é aquecido primeiro, antes de ser colocado em contacto com o ligante, podendo então ser utilizada a quantidade de ligante vinculado ao receptor para expressar a termoestabilidade. Novamente, este procedimento fornece uma medida da quantidade de GPCR que conserva a sua capacidade de vinculação ao ligante após exposição a condições de desnaturação.

[0056] Deverá mencionar-se que, em ambas as modalidades, a comparação da estabilidade conformacional do mutante é concretizada em função da estabilidade da molécula precursora sob as mesmas condições.

[0057] Deverá ser referido que, em ambas as modalidades, os mutantes seleccionados são aqueles que apresentam uma estabilidade conformacional reforçada quando se encontram numa determinada conformação em comparação com a da sua proteína precursora.

[0058] A via preferida poderá depender do GPCR específico e será dependente do número de conformações acessíveis à proteína na ausência de ligante. Na modalidade descrita pela Figura 12, é preferível que o ligante esteja presente 21 durante o passo de aquecimento uma vez que este aumenta a probabilidade de selecção da conformação desejada.

[0059] A partir do precedente, deverá ser realçado que a invenção inclui um método de selecção de um GPCR mutante com um elevada termoestabilidade conformacional, que compreende (a) fornecer um ou mais mutantes de um GPCR precursor, (b) seleccionar um antagonista ou agonista que estabelece ligação com o GPCR precursor, (c) determinar se o mutante ou cada mutante tem uma elevada termoestabilidade conformacional na presença do antagonista ou agonista mencionado, através da medição da capacidade do GPCR mutante para vinculação do antagonista ou agonista mencionado a uma determinada temperatura e após um determinado período de tempo, comparativamente ao GPCR precursor e (d) seleccionar os GPCR mutantes que se ligam a mais antagonistas ou agonistas seleccionados, a uma determinada temperatura e após um determinado período de tempo, por comparação ao GPCR percursor, nas mesmas condições; em que a conformação específica em que se encontra o GPCR fornecido no passo (c) corresponde à classe de ligantes seleccionada no passo (b) . No passo (c) , é habitualmente utilizado um período fixo, a uma determinada temperatura, na medição da capacidade do GPCR para vinculação do antagonista ou agonista mencionado. No passo (c) seleccionam-se, habitualmente, uma temperatura e um momento no qual a vinculação pelo GPCR precursor do antagonista ou agonista mencionado é reduzida em 50%, durante o período fixo e a essa mesma temperatura (o que é indicativo de que 50% do receptor se encontra inactivo; "quasi" Tm) .

[0060] Convenientemente, quando o ligante é utilizado para a análise do GPCR (ou seja, é utilizado para determinar se 22 este se encontra num estado não desnaturado) , é marcado de forma detectável, por exemplo, marcado por fluorescência ou radiomarcado. Noutra modalidade, a vinculação do ligante pode ser avaliada pela medição da quantidade de ligante não vinculado através de um sistema de detecção secundário, por exemplo, um anticorpo ou outro parceiro de ligação de elevada afinidade ligado de forma covalente a uma fracção detectável, por exemplo, uma enzima que possa ser usada num ensaio colorimétrico (como a fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano silvestre). Pode também ser utilizada a metodologia FRET. Deverá ser referido que o ligante utilizado para avaliar o GPCR mutante na determinação da sua estabilidade conformacional não necessita de corresponder ao seleccionado no passo (b) do método.

[0061] Apesar de ser conveniente medir a estabilidade dos GPCR precursor e mutante através da utilização da sua capacidade de vinculação ao ligante enquanto indicadora da presença de uma proteína não desnaturada, são conhecidos outros métodos na área. Por exemplo, as alterações no espectro de fluorescência podem ser um indicador sensível de desdobramento, quer através da utilização da fluorescência intrínseca do triptofano, quer de sondas de fluorescência extrínsecas como o l-anilino-8-naftaleno sulfonato (ANS), por exemplo, como implementado no método Thermofluor™ (Mezzasalma et al, J Biomol Screening, 2007, Apr;12(3):418-428). A estabilidade proteolítica, a permuta de deutério/hidrogénio medida por espectroscopia de massa, os géis nativos azuis, a electroforese capilar de zona, o espectro de dicroísmo circular (CD) e a dispersão de luz podem também ser utilizadas na medição do desdobramento pela perda de sinais associados à estrutura secundária ou terciária. Contudo, todos estes métodos requerem que a proteína seja purificada em quantidades razoáveis antes de 23 poderem ser utilizados (por exemplo, quantidades pmol/nmol elevadas), ao passo que o método descrito nos Exemplos apenas utiliza quantidades pmol de GPCR essencialmente não purificado.

[0062] Numa modalidade preferida, são seleccionados no passo (b) dois ou mais ligantes da mesma classe, a presença de cada um destes levando a que o GPCR se apresente na mesma conformação especifica. Assim, nesta modalidade, podem ser utilizados um ou mais ligantes (quer naturais, quer não naturais) da mesma classe (por exemplo, agonista total e parcial, antagonista ou agonista inverso). A inclusão de múltiplos ligantes da mesma classe neste processo, quer em série, quer em paralelo, minimiza o risco teórico de sintetização inadvertida e de selecção de conformações de receptores multiplamente mutados substancialmente diferentes do seu precursor, por exemplo, no seu local de ligação, contudo, devido a alterações compensatórias, ainda assim capazes de vincular o ligante. Podem ser utilizados os seguintes passos para mitigar este risco: 1. Seleccionar um conjunto de ligantes quimicamente distinto (e.g., n=2-5), numa classe farmacológica comum, conforme evidenciado, por exemplo, através de um ensaio de ligação funcional ou espectroscópico. Deve considerar-se que estes ligantes se vinculam a uma região espacial comum do receptor, tal como é evidenciado, por exemplo, pelos estudos de ligação competitiva com receptores de tipo selvagem e/ou mutados, e/ou por modelação molecular, embora não venham necessariamente a expressar um farmacóforo comum. 2. Produzir um ou vários mutantes de receptores destinados a elevar a estabilidade conformacional e 24 testá-los para o estabelecimento de ligações fortes através da utilização de um conjunto completo de ligantes. Os ensaios podem ser paralelizados, multiplexados ou executados em série. 3. Confirmar a autenticidade do receptor mutante estabilizado, por exemplo, através da vinculação isotérmica de cada ligante e pela medição do desvio de estabilidade com o ligante (a janela deve, tipicamente, ser reduzida em função do tipo selvagem).

De modo a prevenir a ocorrência de alterações na afinidade aparente, causadas por perturbações no local de ligação aquando da mutação, deverão preferencialmente ser utilizados ligantes da mesma classe farmacológica mas de diferentes classes químicas para traçar o perfil do receptor. Estes deveriam, tipicamente, apresentar desvios similares a nível da afinidade (mutante vs. precursor, e.g., de tipo selvagem) apesar de possuírem diferentes propriedades de reconhecimento molecular. As experiências de ligação devem preferencialmente ser realizadas utilizando ligantes marcados inseridos na mesma classe farmacológica.

[0063] Todavia, deve reconhecer-se que podem existir substratos conformacionais específicos para classes químicas de ligantes que se inserem na mesma classe farmacológica, podendo estes ser especificamente estabilizados no processo, dependendo da classe química do ligante seleccionado.

[0064] Habitualmente, o ligante seleccionado estabelece ligação com um GPCR mutante com uma potência similar à da sua vinculação ao GPCR precursor. Habitualmente, os valores Kd para a vinculação do ligante específico ao GPCR mutante 25 e ao GPCR precursor devem ser entre 5-10 vezes o valor um do outro, por exemplo entre 2-3 vezes. Habitualmente, a vinculação do ligante ao GPCR mutante não deverá ser 5 vezes mais fraca ou 10 vezes mais forte do que a que vinculação ao GPCR precursor.

[0065] Tipicamente, os receptores mutantes que tenham sido conformacionalmente estabilizados na configuração escolhida devem vincular o ligante seleccionado com uma afinidade sensivelmente equivalente (isto é, normalmente entre 2-3 vezes) ou superior à do receptor precursor. No que concerne aos mutantes de conformação agonista, estes vinculam os agonistas com uma afinidade habitualmente igual ou superior à do GPCR precursor e os antagonistas com uma afinidade tipicamente igual ou inferior à do precursor. De modo semelhante, no que concerne aos mutantes de conformação antagonista, estes vinculam os antagonistas com uma afinidade habitualmente igual ou superior à do GPCR precursor e os agonistas com uma afinidade tipicamente igual ou inferior à do precursor.

[0066] Os mutantes que apresentam uma redução significativa (habitualmente superior a 2-3 vezes) a nível da afinidade para a selecção são normalmente rejeitados.

[0067] Tipicamente, a ordem de classificação da ligação de um conjunto de ligantes da mesma classe é comparável, apesar de poderem existir uma ou duas inversões da ordem ou um outlier do conjunto.

[0068] Numa modalidade adicional, podem ser utilizados dois ou mais ligantes que estabelecem ligação com o receptor em simultâneo, por exemplo, um modulador alostérico e um agonista ortostérico. 26 [0069] Para que não subsistam dúvidas, e como é evidente a partir dos Exemplos, pode não ser necessário utilizar múltiplos ligantes para que o método seja eficaz.

[0070] Numa modalidade adicional, pode ser vantajoso seleccionar os GPCR mutantes que, embora ainda capazes de vincular o ligante seleccionado, não conseguem estabelecer ligação com um segundo ligante seleccionado que se encontra numa classe diferente do primeiro, ou que o fazem de uma forma menos intensa que o GPCR precursor. Assim, por exemplo, o GPCR mutante pode ser um GPCR que seja seleccionado com base na sua elevada estabilidade conformacional em relação à vinculação de um antagonista seleccionado sendo, contudo, adicionalmente testado para determinar se estabelece ligação a um agonista total (ou se o faz de uma forma menos intensa do que o GPCR precursor). São seleccionados mutantes que não se vinculam ao agonista total (ou que apresentam uma ligação reduzida com o mesmo). Assim, é feita uma selecção adicional de um ligante que se encontre bloqueado numa determinada conformação.

[0071] Deverá ser referido que o ligante seleccionado (relativamente à etapa (b) do método) e o ligante adicional (segundo) podem, tal como anteriormente discutido, corresponder a qualquer par de classes ligantes, por exemplo: antagonista e agonista total; agonista total e antagonista total; antagonista e agonista inverso; agonista inverso e antagonista inverso; agonista inverso e agonista total; agonista total e agonista inverso; e assim sucessivamente.

[0072] É preferível que o receptor mutante vincule o receptor adicional (segundo) com uma afinidade 50% inferior 27 à do receptor precursor para esse mesmo ligante (segundo), mais preferencialmente, 10% inferior e, ainda com maior preferência, 1 ou 0,1 ou 0,01% inferior à do receptor precursor. Assim, a Ka para a interacção do segundo ligante com o receptor mutante é superior à do receptor precursor. Tal como ilustrado no Exemplo 1, o receptor β-adrenérgico mutante PAR-m23 (seleccionado através do método da invenção com a utilização de um antagonista) estabelece ligação com um agonista com uma magnitude inferior em 3 ordens à do seu precursor (ou seja, a Ka é 1000 x superior) . De modo semelhante, no Exemplo 2, o receptor de adenosina A2a mutante Rant21 estabelece ligação com o agonista com uma magnitude inferior em 2-4 ordens à do seu precursor.

[0073] Este tipo de contra selecção é útil por poder ser usado para direccionar o procedimento de mutagénese com maior especificidade (e, desse modo, de forma mais rápida e eficiente) ao longo de um percurso no sentido de uma conformação definida como pura, pelo ligante.

[0074] Preferencialmente, o GPCR mutante é fornecido numa forma solubilizada adequada, em que mantém a integridade estrutural e se encontra na sua forma funcional (por exemplo, é capaz de vincular o ligante). É utilizado um sistema de solubilização apropriado, como um detergente adequado (ou outro agente anfipático) , e um sistema tampão cuja selecção pode ser realizada por um especialista na área, em função da sua eficácia para uma proteína em particular. Os detergentes típicos que poderão ser utilizados incluem, por exemplo, dodecilmaltósido (DDM), CHAPS, octilglucósido (OG) ou muitos outros. Pode ser conveniente incluir outros compostos como o hemissuccinato de colesterol, o próprio colesterol ou heptano-1,2,3-triol. Pode ser útil a presença de glicerol, prolina ou betaína. É 28 importante que o GPCR, quando solubilizado da membrana em que reside, seja suficientemente estável para avaliação. Para alguns GPCR, a DDM será suficiente, contudo, poderá adicionar-se glicerol ou outros polióis para aumentar a estabilidade para efeitos de análise, se desejado. A estabilidade adicional para efeitos de análise pode ser conseguida, por exemplo, através da solubilização numa mistura de DDM, CHAPS e hemissuccinato de colesterol, opcionalmente na presença de glicerol. No caso dos GPCR particularmente instáveis, pode ser desejável solubilizá-los com digitonina, polímeros anfipáticos APols ou outros polímeros capazes de os solubilizar directamente a partir da membrana, na ausência de detergentes tradicionais e com a manutenção da estabilidade, normalmente, ao permitir que alguns lípidos permaneçam associados ao GPCR. Podem também ser utilizados nanodiscos para a solubilização de proteínas da membrana extremamente instáveis numa forma funcional.

[0075] O GPCR mutante é, habitualmente, fornecido num extracto em bruto (por exemplo, da fracção membranar da célula hospedeira em que foi expresso, como a E. coli) . Poderá ser disponibilizado numa forma em que a proteína mutante contém, pelo menos, 75%, mais preferencialmente, pelo menos 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% da proteína presente na amostra. Como é claro, o GPCR mutante é tipicamente solubilizado como acima discutido, pelo que se encontra normalmente associado a moléculas de detergente e/ou lipídicas.

[0076] Pode ser seleccionado um GPCR mutante que apresente uma estabilidade conformacional reforçada para qualquer desnaturante ou condição de desnaturação, como qualquer uma ou várias das seguintes: calor, um detergente, agente caotrópico ou extremo de pH. 29 [0077] No que concerne a uma elevada estabilidade conformacional ao calor (ou seja, termoestabilidade conformacional) , esta pode ser facilmente determinada pela medição da vinculação ao ligante ou através da utilização de métodos espectroscópicos como a fluorescência, CD ou dispersão luminosa, a uma determinada temperatura. Habitualmente, quando o GPCR se vincula a um ligante, a sua capacidade de vinculação ao ligante a uma determinada temperatura pode ser utilizada para determinar a termoestabilidade conformacional do mutante. Pode ser conveniente determinar uma "quasi Tm", ou seja, a temperatura em que 50% do receptor é inactivado sob as condições mencionadas, após incubação durante um determinado periodo (por exemplo, 30 minutos). Os GPCR mutantes de termoestabilidade mais elevada apresentam uma quasi Tm reforçada face à dos seus precursores.

[0078] No que concerne a uma elevada estabilidade conformacional para um detergente ou caotrópico, o GPCR é, habitualmente, incubado durante um período definido na presença de um agente detersivo ou caotrópico de teste, sendo a estabilidade conformacional determinada, por exemplo, através de um método de vinculação de ligantes ou espectroscópico, como anteriormente discutido.

[0079] No que concerne a um extremo de pH, seria seleccionado um teste comum de pH (por exemplo, na ordem de 4,5 a 5,5 (pH reduzido) ou de 8,5 a 9,5 (pH elevado).

[0080] Uma vez que são utilizados detergentes relativamente agressivos durante os procedimentos de cristalização, é preferível que o GPCR mutante seja conformacionalmente estável na presença de tais detergentes. A ordem de 30 "agressividade" de certos detergentes é: DDM, maltósido ou glucósido, Cu -► Ci0 -+C9 -C8 óxido de laurildimetilamina (LDAO) e SDS. É particularmente preferido que o GPCR mutante apresente uma maior estabilidade conformacional para o maltósido ou glucósido Cg, maltósido ou glucósido C8, LDAO e SDS, pelo que se torna preferível que sejam utilizados estes detergentes para testar a estabilidade.

[0081] Devido à sua facilidade de determinação, é preferível que seja determinada a termoestabilidade conformacional, sendo seleccionados os mutantes que apresentam uma termoestabilidade conformacional reforçada face à da sua proteína precursora. Deve ser referido que o calor está a actuar como desnaturante, podendo ser facilmente eliminado pelo arrefecimento da amostra, por exemplo, através da sua colocação em gelo. Acredita-se que a termoestabilidade pode também ser um guia para a estabilidade conformacional para outros desnaturantes ou condições de desnaturação. Assim, é provável que uma termoestabilidade conformacional elevada se traduza na estabilidade conformacional em detergentes desnaturantes, especialmente naqueles que são mais desnaturantes do que a DDM, por exemplo, os detergentes com um grupo de "cabeça" mais pequeno, uma cadeia alquilo mais curta e/ou um grupo de "cabeça" carregado. Constatámos que o GPCR termoestável também apresenta uma maior estabilidade relativamente a detergentes agressivos.

[0082] Quando a condição de desnaturação utilizada é um extremo de pH, deverá ser tido em consideração que este poderá ser rapidamente eliminado pela adição de um agente neutralizador. De modo semelhante, quando o desnaturante utilizado é um agente caotrópico, o efeito de desnaturação poderá ser eliminado pela diluição da amostra até uma 31 concentração inferior àquela em que o agente exerce o seu efeito caotrópico.

[0083] Numa modalidade da invenção em particular, o GPCR é um receptor β-adrenérgico (por exemplo, de peru) e o ligante é dihidroalprenolol (DHA), um antagonista.

[0084] Numa modalidade ainda preferível da invenção, o GPCR é um receptor de adenosina A2a (por exemplo, humano) e o ligante é ZM 241385 (4-[2-[[7-amino-2-(2-furil) [1,2,4]— triazolo [2,3-oí] [ 1,3,5] triazin-5-il] amino] etil] fenol) , um antagonista, ou NECA (adenosina 5'-N-etilcarboxamida), um agonista.

[0085] Noutra modalidade ainda mais preferível da invenção, o GPCR é um receptor de neurotensina (NTR) (por exemplo, de ratazana) e o ligante é neurotensina, um agonista.

[0086] Um segundo aspecto da invenção fornece um método de preparação de um GPCR mutante, que compreende: (a) executar o método do primeiro aspecto da invenção, (b) identificar a posição ou posições do resíduo ou resíduos de aminoácidos no mutante ou mutantes do GPCR que tenham sido seleccionadas pela elevada estabilidade conformacional, e (c) sintetizar um GPCR mutante que contém uma mutação em uma ou mais das posições identificadas.

[0087] Tal como pode ser observado nos Exemplos, a realização de alterações num único aminoácido presente no GPCR pode, surpreendentemente, reforçar a estabilidade conformacional da proteína relativamente à da precursora em 32 relação a uma condição específica em que a proteína se encontra numa determinada conformação. Assim, numa modalidade do método do segundo aspecto da invenção, é alterado um único aminoácido da proteína precursora a nível da proteína mutante. Habitualmente, o resíduo de aminoácido é substituído pelo resíduo encontrado no mutante testado no método do primeiro aspecto da invenção. Contudo, este pode ser substituído por qualquer outro resíduo de aminoácido, tal como qualquer resíduo de aminoácido de ocorrência natural (em particular, um resíduo de aminoácido "codificável") ou aminoácido não natural. Geralmente, por questões de conveniência, o resíduo de aminoácido é substituído por qualquer um dos 19 aminoácidos codificáveis. Preferencialmente, este será o resíduo de aminoácido substituído presente no mutante seleccionado no primeiro aspecto da invenção.

[0088] Tal como poderá ser observado através dos Exemplos, pode ser obtido um reforço adicional da estabilidade conformacional através da substituição de um ou mais dos aminoácidos presentes na proteína precursora. Habitualmente, cada um dos aminoácidos substituídos corresponde a um aminoácido que tenha sido identificado através do método do primeiro aspecto da invenção. Habitualmente, cada aminoácido identificado é substituído pelo aminoácido presente na proteína mutante apesar de, tal como acima referido, poder ser substituído por qualquer outro aminoácido.

[0089] Habitualmente, o GPCR mutante contém, em relação à sua proteína precursora, entre 1 e 10 substituições de aminoácidos, preferencialmente entre 1 e 8, tipicamente entre 2 e 6, por exemplo 2, 3, 4, 5 ou 6 substituições de aminoácidos. 33 [0090] Deverá ser referido que os múltiplos mutantes poderão ser sujeitos ao método de selecção do primeiro aspecto da invenção. Ou seja, os múltiplos mutantes poderão ser fornecidos no passo (a) do método do primeiro aspecto da invenção. Deverá ser referido que poderão ser produzidos através do primeiro e/ou segundo aspectos da invenção múltiplos GPCR mutagénicos, cuja conformação foi seleccionada para dar origem a proteina com múltiplas mutações pontuais muito estável a nivel conformacional.

[0091] Os GPCR podem ser preparados através de qualquer método adequado. A proteina mutante é, convenientemente, codificada por uma molécula de ácido nucleico adequada e expressa numa célula hospedeira apropriada. As moléculas adequadas de ácidos nucleicos que codificam o GPCR mutante podem ser produzidas através de técnicas genéricas de clonagem, mutagénese dirigida e PCR, tal como é bem conhecido na área. Os sistemas de expressão adequados incluem os constitutivos ou inductiveis em bactérias ou leveduras, sistemas de expressão virais, tais como o baculovirus, virus da floresta de Semliki e lentivirus, ou de transfecção transitória em células de insectos ou mamíferos. As células hospedeiras seleccionadas incluem as células E. coli, Lactococcus lactis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Spodoptera frugiperda e Trichoplusiani. As células hospedeiras animais adequadas incluem as HEK 293, COS, S2, CHO, NSO, DT40, e assim por diante. Sabe-se que alguns GPCR requerem a presença de lípidos específicos (e.g., colesterol) para funcionar. Nesse caso, torna-se desejável a selecção de uma célula hospedeira que os contenha. Em alternativa ou adicionalmente, o lípido poderá ser adicionado durante o processo de isolamento e purificação 34 da proteína mutante. Deverá ser referido que estes sistemas de expressão e células hospedeiras podem também ser usados no fornecimento do GPCR na etapa (a) do método do primeiro aspecto da invenção.

[0092] Os métodos biológicos moleculares para a clonagem e sintetização de genes e cDNA, mutação do DNA e expressão de polipéptidos a partir de polinucleótidos presentes em células hospedeiras são bem conhecidos na área, conforme exemplificado em "Molecular cloning, a laboratory manual", terceira edição, Sambrook, J. & Russell, D.W. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

[0093] Numa modalidade adicional do primeiro ou segundo aspectos da invenção é determinado se o GPCR mutante seleccionado ou preparado é capaz de se vincular a uma proteína-G. É também preferível se for determinado se o GPCR mutante seleccionado ou preparado é capaz de vincular uma pluralidade de ligantes da mesma classe que o ligante seleccionado com uma extensão e/ou ordem de classificação de afinidade comparáveis às do GPCR precursor.

[0094] Os GPCR mutantes com uma estabilidade conformacional reforçada face à dos seus precursores, particularmente aqueles com uma elevada termoestabilidade conformacional, podem ser preparados através dos métodos da invenção.

Receptor β-adrenérgico mutante [0095] Os receptores β-adrenérgicos são bem conhecidos na área. Estes partilham entre si a homologia de sequência e estabelecem ligação com a adrenalina.

[0096] Um receptor β-adrenérgico mutante que, quando 35 comparado ao receptor de tipo selvagem correspondente, apresenta um aminoácido diferente numa posição que corresponda a qualquer uma ou mais das posições: Ile 55, Gly 67, Arg 68, Vai 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Vai 160, Gin 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Vai 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334 e Phe 338, em consonância com a numeração do receptor β-adrenérgico apresentada na Figura 9, pode ser preparado através dos métodos da invenção: Ile 55, Gly 67, Arg 68, Vai 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Vai 160, Gin 194, Gly 197,

Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Vai 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334 e Phe 338, em consonância com a numeração do receptor β-adrenérgico apresentada na Figura 9, pode ser preparado através dos métodos da invenção.

[0097] O receptor β-adrenérgico mutante pode ser um mutante de qualquer receptor β-adrenérgico, desde que mutado em uma ou mais das posições de aminoácidos especificadas relativamente à sequência mencionada para o receptor β-adrenérgico de peru.

[0098] É preferível se o GPCR mutante for um GPCR que tenha, pelo menos, 20% da identidade da sequência de aminoácidos quando comparado com a sequência mencionada para o receptor β-adrenérgico de peru, conforme determinada através das aplicações MacVector e CLUSTALW (Thompson et al (1994) Nucl. Acids Res. 22, 4673-4680). Acids Res. 22, 4673-4680). Mais preferencialmente, o receptor mutante tem pelo menos 30, 40 ou 50% da identidade da sequência de aminoácidos. Existe, geralmente, um grau de identidade da sequência de aminoácidos mais elevado que é conservado em redor do local ortostérico ("activo") a que se vincula o ligante natural. 36 [0099] Tal como descrito no Exemplo 1 e na Figura 1 abaixo, a substituição individual dos seguintes resíduos de aminoácidos na sequência do receptor β-adrenérgico precursor de peru (conforme ilustrado na Figura 9) conduziu a um reforço da termoestabilidade: Ile 55, Gly 67, Arg 68, Vai 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Vai 160, Gin 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Vai 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334, Phe 338.

[0100] Assim, os métodos da invenção podem ser usados na preparação de receptores β-adrenérgicos de peru em que, relativamente ao seu precursor, os resíduos de aminoácidos tenham sido substituídos por outro resíduo de aminoácido. Os métodos da invenção podem ser usados na preparação de receptores β-adrenérgico mutantes a partir de outras fontes, em que um ou mais dos aminoácidos correspondentes no receptor precursor se encontram substituídos por outro resíduo de aminoácido. Para que não subsistam dúvidas, o precursor pode ser um receptor β-adrenérgico que possui uma sequência de ocorrência natural, uma forma truncada ou fusão quer de uma proteína de ocorrência natural como de um fragmento da mesma, ou conter mutações relativamente à sequência de ocorrência natural, desde que conserve a capacidade de vinculação ao ligante.

[0101] O termo "resíduo de aminoácido correspondente" inclui no seu sentido o resíduo de aminoácido constante noutro receptor β-adrenérgico que se alinha ao resíduo de aminoácido no receptor β-adrenérgico de peru, quando este e outro receptor β-adrenérgico são comparados através das aplicações MacVector e CLUSTALW.

[0102] A figura 9 ilustra um alinhamento entre o receptor 37 β-adrenérgico de peru e os receptores adrenérgicos βΐ, β2 e β3 humanos.

[0103] Pode observar-se que Ile 72 do βΐ humano corresponde a Ile 55 do receptor β-adrenérgico de peru; Ile 47 do β2 humano corresponde a Ile 55 do receptor β-adrenérgico de peru; e Thr51 do β3 humano corresponde a De 55 do receptor β-adrenérgico de peru. As outras correspondências de resíduos de aminoácidos em βΐ, β2 e β3 humanos podem ser facilmente identificadas através da Figura 9.

[0104] É preferível que o resíduo de aminoácido em particular seja substituído por Ala. Contudo, quando o resíduo de aminoácido em particular é Ala é preferível que este seja substituído por Leu (ver, por exemplo, Ala 234, Ala 282 e Ala 334 do β-adrenérgico de peru na Figura 1).

[0105] É preferível que o receptor β-adrenérgico mutante tenha, quando comparado com o seu precursor, um aminoácido diferente em mais do que uma posição, já que tal corresponde a uma maior probabilidade de reforço da estabilidade conformacional. Os mutantes de receptores adrenérgicos βΐ particularmente preferidos são aqueles em que um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos se encontram substituídos por outro resíduo de aminoácido; K85, Ml07, Y244, A316, F361 e F372. Habitualmente, o resíduo de aminoácido mencionado é substituído por Ala, Vai, Met, Leu ou Ile (a não ser que estes já sejam esse resíduo) .

[0106] São preferidos os receptores βΐ mutantes que tenham combinações de 3, 4, 5 ou 6 mutações como as acima descritas. 38 [0107] Os receptores β2 mutantes humanos são aqueles em que um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos se encontram substituídos por outro resíduo de aminoácido: K60, M82, Y219, C2 65, L310 e F321 : K60, M82, Y219, C265, L310 e F321. Habitualmente, o resíduo de aminoácido mencionado é substituído por Ala, Vai, Met, Leu ou Ile (a não ser que estes já sejam esse resíduo).

[0108] São preferidos os receptores β2 mutantes que tenham combinações de 3, 4, 5 ou 6 mutações como as acima descritas.

[0109] A figura 26 ilustra o efeito da termoestabilidade quando seis mutações termoestabilizadoras no β1-ιη23 (R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A, F338M) foram directamente transferidas para o receptor β2 humano (mutações equivalentes: K60S, M82V, Y219A, C265L, L310A, F321M), dando origem ao β2-ιη23 humano. As Tm para β2 e β2-ιη23 humanos foram de 29°C e 41°C, respectivamente, exemplificando, portanto, o princípio da transmissibilidade das mutações termoestabilizadoras de um receptor para outro. Assim, é particularmente preferido um receptor β2 humano que contenha as mutações K60S, M82V, Y219A, C265L, L310A e F321M.

[0110] Os receptores β3 humanos mutantes são aqueles em que um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos se encontrem substituídos por outro resíduo: W64, M86, Y224, P284, A330 e F341: W64, M86, Y224, P284, A330 e F341. Habitualmente, o resíduo de aminoácido mencionado é substituído por Ala, Vai, Met, Leu ou Ile (a não ser que estes já sejam esse resíduo). 39 [0111] São preferidos os receptores β3 mutantes que tenham combinações de 3, 4, 5 ou 6 mutações como as acima descritas.

[0112] As combinações de mutações particularmente preferidas são descritas em detalhe nas tabelas 1 e 2 do Exemplo 1, os métodos da invenção podem ser usados na preparação de receptores β-adrenérgicos mutantes de peru, assim como de receptores β-adrenérgicos mutantes onde os aminoácidos nas posições correspondentes tenham sido substituídos por outro residuo, tipicamente, pelo mesmo conforme indicado nas tabelas 1 e 2 do Exemplo 1.

[0113] Os mutantes particularmente preferidos são os que contêm mutações nos aminoácidos que correspondem ao residuo mencionado, em relação ao receptor β-adrenérgico de peru: (R68S, Y227A, A282L, A334L) (ver m6-10 na Tabela 2, abaixo) ; (M90V, Y227A , F338M) (ver m7-7 na Tabela 2, abaixo) ; (R68S, M90V, V230A, F327A, A334L) (ver mlO-8 na Tabela 2, abaixo); e (R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A, F338M) (ver m23 na Tabela 2, abaixo).

Receptor de adenosina mutante [0114] Os receptores de adenosina são bem conhecidos na área. Estes partilham entre si a homologia de sequência e estabelecem ligação com a adenosina.

[0115] Através dos métodos da invenção pode ser preparado um receptor de adenosina mutante que, quando comparado ao receptor de tipo selvagem correspondente, apresenta um aminoácido diferente numa posição que corresponda a qualquer uma ou mais das posições Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gin 210, Ser 213, 40

Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gin 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279,

Asn 284, Gin 311, Pro 313, Lys 315, Ala 54, Vai 57, His 75, Thr 88, Gly 114, Gly 118, Thr 119, Lys 122, Gly 123, Pro 149, Glu 151, Gly 152, Ala 203, Ala 204, Ala 231, Leu 235,

Vai 239, em consonância com a numeração do receptor A2a de adenosina humano, apresentada na Figura 10.

[0116] O receptor de adenosina mutante pode ser um mutante de qualquer receptor de adenosina, desde que mutado em uma ou mais das posições de aminoácidos especificadas em relação à sequência mencionada para o receptor A2a de adenosina humano.

[0117] É preferivel se o GPCR mutante for um GPCR que tenha, pelo menos, 20% da identidade da sequência de aminoácidos quando comparado com a sequência de aminoácidos mencionada para o receptor A2a de adenosina, conforme determinada através das aplicações MacVector e CLUSTALW. Preferencialmente, o GPCR mutante tem pelo menos 30, 40, 50 ou 60% da identidade da sequência. Tipicamente, existe um maior grau de conservação sequência no local de ligação da adenosina.

[0118] Conforme descrito no Exemplo 2, abaixo, a substituição individual dos seguintes resíduos de aminoácidos na sequência do receptor A2a de adenosina mutante (conforme ilustra a Figura 10) conduziu a um reforço da termoestabilidade, quando medida com a 5' -N-etilcarboxamidoadenosina (NECA):

Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203,

Leu 208, Gin 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223,

Thr 224, Gin 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, 41

Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gin 311, Pro 313, Lys 315.

[0119] A substituição dos seguintes residuos de aminoácidos na sequência do receptor A2a de adenosina humano (conforme ilustrado na Figura 10) conduziu a um reforço da termoestabilidade, quando medida com o antagonista do ZM 241385 (4-[2-[[7-amino-2-(2-furil) [1,2,4] - triazolo [2,3-oí] [1,3,5] triazin-5- il]amino]etil]fenol):

Ala 54, Vai 57, His 75, Thr 88, Gly 114, Gly 118, Thr 119, Lys 122, Gly 123, Pro 149, Glu 151, Gly 152, Ala 203, Ala 204, Ala 231, Leu 235, Vai 239.

[0120] Assim, os métodos da invenção podem ser usados na preparação dos receptores A2a de adenosina em que, relativamente ao seu precursor, um ou mais destes residuos de aminoácidos tenham sido substituídos por outro resíduo de aminoácido. Os métodos da invenção podem ser usados na preparação de receptores de adenosina mutantes a partir de outras fontes, em que um ou mais dos aminoácidos correspondentes no receptor precursor são substituídos por outro resíduo de aminoácido. Para que não subsistam dúvidas, o precursor pode ser um receptor de adenosina que possui uma sequência de ocorrência natural, uma forma truncada ou fusão quer de uma proteína de ocorrência natural como de um fragmento da mesma, ou conter mutações relativamente à sequência de ocorrência natural, desde que conserve a capacidade de vinculação ao ligante.

[0121] O termo "resíduo de aminoácido correspondente" inclui no seu sentido o resíduo de aminoácido constante noutro receptor de adenosina que se alinha ao resíduo de aminoácido no receptor A2a de adenosina humano, quando este 42 e outro receptor de adenosina são comparados através das aplicações MacVector e CLUSTALW.

[0122] A Figura 10 ilustra um alinhamento entre o receptor A2a de adenosina humano e outros três receptores de adenosina humanos (A2b, A3 e Al).

[0123] Pode observar-se que, por exemplo, Ser 115 no receptor A2b humano (indicado como AA2BR) corresponde a Gly 114 no receptor An. Pode, da mesma forma, observar-se que Ala 60 no receptor A3 (indicado como AA3R) corresponde a Ala 54 no receptor A2a e assim sucessivamente. As outras correspondências de resíduos de aminoácidos nos receptores A2b, A3 e Ai de adenosina humanos podem ser facilmente identificadas através da Figura 10.

[0124] É preferível que o resíduo de aminoácido no precursor seja substituído por Ala. Contudo, quando o resíduo de aminoácido no precursor é Ala, é preferível que este seja substituído por Leu.

[0125] É preferível que o receptor de adenosina mutante, quando comparado com o seu precursor, um aminoácido diferente em mais do que uma posição. Os receptores A2b de adenosina mutantes particularmente preferidos são aqueles em que um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos se encontram substituídos por outro resíduo de aminoácido: A55, T89, R123, L236 e V240. Habitualmente, o resíduo de aminoácido mencionado é substituído por Ala, Vai, Met, Leu ou Ile (a não ser que estes já sejam esse resíduo).

[0126] São preferidos os receptores A2b de adenosina mutantes que tenham combinações de 3, 4, 5 ou 6 mutações como as acima descritas. 43 [0127] Os receptores A3 de adenosina mutantes particularmente preferidos são aqueles em que um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácidos se encontram substituídos por outro resíduo de aminoácido: A60, T94, W128, L232 e L236. Habitualmente, o resíduo de aminoácido mencionado é substituído por Ala, Vai, Met, Leu ou Ile (a não ser que estes já sejam esse resíduo).

[0128] São preferidos os receptores A3 de adenosina mutantes que tenham combinações de 3, 4, 5 ou 6 mutações como as acima descritas.

[0129] Os receptores AI de adenosina humanos particularmente preferidos são aqueles em que um ou mais dos seguintes aminoácidos se encontram substituídos: A57, T91, A125, L236, e L240. Habitualmente, o resíduo de aminoácido mencionado é substituído por Ala, Vai, Met, Leu ou Ile (a não ser que estes já sejam esse resíduo).

[0130] As combinações de mutações particularmente preferidas encontram-se descritas em detalhe no Exemplo 2. Os métodos da invenção podem ser usados para a preparação destes receptores A2a de adenosina mutantes, assim como de outros receptores de adenosina mutantes em que os aminoácidos nas posições correspondentes tenham sido substituídos por outro resíduo, tipicamente, pelo mesmo, conforme indicado no Exemplo 2.

[0131] Os mutantes particularmente preferidos são os que contêm mutações nos aminoácidos que correspondem ao resíduo mencionado, em relação ao receptor A2a de adenosina humano: (A54L, K122A, L235A) (Rant 17); (A54L, T88A, V239A, A204L) (Rant 19); e (A54L, T88A, V239A, K122A) (Rant 21). 44

Receptor de neurotensina mutante [0132] Os receptores de neurotensina são conhecidos na área. Partilham homologia de sequência e ligam a neurotensina.

[0133] Através dos métodos da invenção pode ser preparado um receptor de neurotensina mutante que, quando comparado ao receptor de tipo selvagem correspondente, apresenta um aminoácido diferente numa posição que corresponde a qualquer uma ou mais das posições Ala 69, Leu 72, Ala 73,

Ala KD 00 Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Vai 165, Glu 166, Lys 176, Ala 177, Thr 179, Met 181, Ser 182, Arg 183, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Vai 229, Met 250, Ile 253, Leu 256, Ile 260, Asn 262, Vai 268, Asn 270, Thr 279, Met 293, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Vai 309, Leu 310, Vai 313, Phe 342, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Vai 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Cys 386, Pro 389, Gly 390, Trp 391, Arg 392, His 393, Arg 395, Lys 397 e Pro 399, em consonância com a numeração do receptor de neurotensina de ratazana apresentada na Figura 11.

[0134] É preferível se o GPCR mutante for um GPCR que tenha, pelo menos, 20% da identidade da sequência de aminoácidos quando comparado com a sequência de aminoácidos mencionada para o receptor de neurotensina de ratazana, tal como determinada através das aplicações MacVector e CLUSTALW. Preferencialmente, o GPCR mutante tem, pelo menos, 30, 40 ou 50% da identidade da sequência de aminoácidos.

[0135] 0 receptor de neurotensina mutante pode ser um 45 mutante de qualquer receptor de neurotensina, desde que mutado em uma ou mais das posições especificadas em relação à sequência mencionada para o receptor de neurotensina de ratazana.

[0136] Conforme descrito em seguida no Exemplo 3, a substituição individual dos seguintes resíduos de aminoácidos na sequência do receptor de neurotensina de ratazana (conforme ilustram as Figuras 11 e 28) conduziu a um reforço da termoestabilidade, quando considerada relativamente à ausência de neurotensina. Leu 72, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Lys 176, Thr 179, Met 181, Ser 182, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Leu 256, Asn 262, Vai 268, Met 293, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Ser 362, Ala 385, Cys 386, Trp 391, Arg 392, His 393, Lys 397, Pro 399.

[0137] Conforme descrito em seguida no Exemplo 3, a substituição individual dos seguintes resíduos de aminoácidos na sequência do receptor de neurotensina de ratazana (conforme ilustram as Figuras 11 e 28) conduziu a um reforço da termoestabilidade, quando considerada relativamente à presença de neurotensina. Ala 69, Ala 73, Ala 86, Ala 90, His 103, Vai 165, Glu 166, Ala 177, Arg 183, Vai 229, Met 250, Ile 253, Ile 260, Thr 279, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Vai 309, Leu 310, Vai 313, Phe 342, Phe 358, Vai 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Pro 389, Gly 390, Arg 395.

[0138] Assim, os métodos da invenção podem ser usados na preparação de receptores de neurotensina mutantes de ratazana em que, em relação ao seu precursor, os residuos de aminoácidos tenham sido substituídos por outro resíduo 46 de aminoácido. Os métodos da invenção podem também ser usados na preparação de receptores de neurotensina mutantes a partir de outras fontes, em que um ou mais dos aminoácidos correspondentes presentes no receptor precursor se encontram substituidos por outro residuo de aminoácido. Para que não subsistam dúvidas, o precursor pode ser um receptor de neurotensina cuja sequência seja de ocorrência natural, uma forma truncada ou fusão quer de uma proteína de ocorrência natural como de um fragmento da mesma ou, conter mutações relativamente à sequência de ocorrência natural, desde que conserve a capacidade de vinculação ao ligante.

[0139] Incluímos no significado do termo "resíduo de aminoácido correspondente" o resíduo de aminoácido constante noutro receptor de neurotensina, que se alinha ao resíduo de aminoácido presente no receptor de neurotensina de ratazana quando este e outro receptor de neurotensina são comparados através das aplicações MacVector e CLUSTALW.

[0140] A Figura 11 ilustra um alinhamento entre o receptor de neurotensina de ratazana e dois receptores de neurotensina humanos, 1 e 2. Pode observar-se que, por exemplo, Ala 85 do receptor de neurotensina 1 humano corresponde a Ala 86 do receptor de neurotensina de ratazana, Phe 353 do receptor de neurotensina 1 humano corresponde a Phe 358 do receptor de neurotensina de ratazana, e assim sucessivamente. As outras correspondências de resíduos de aminoácidos nos receptores de neurotensina humanos 1 e 2 podem ser facilmente identificadas com base na Figura 11.

[0141] É preferível que o resíduo de aminoácido no precursor seja substituído por Ala. Contudo, quando o 47 resíduo de aminoácido no precursor é Ala, é preferível que este seja substituído por Leu.

[0142] É preferível que o receptor de neurotensina mutante, quando comparado com o seu precursor, um aminoácido diferente em mais do que uma posição. Os receptores de neurotensina humanos (NTRl) particularmente preferidos são aqueles em que um ou mais dos seguintes aminoácidos se encontram substituídos por outro resíduo de aminoácido: Ala 85, His 102, Ile 259, Phe 337 e Phe 353. Habitualmente, o resíduo de aminoácido mencionado é substituído por Ala, Vai, Met , Leu ou Ile (a não ser que estes já sejam esse resíduo).

[0143] São preferidos os receptores de neurotensina mutantes humanos (NTRl) que tenham combinações de 3, 4 ou 5 mutações como as acima descritas.

[0144] Os receptores de neurotensina humanos (NTR2) particularmente preferidos são aqueles em que um ou mais dos seguintes aminoácidos se encontram substituídos por outro resíduo de aminoácido: V54, R69, T229, P331 e F347. Habitualmente, o resíduo de aminoácido mencionado é substituído por Ala, Vai, Met, Leu ou Ile (a não ser que estes já sejam esse resíduo). São preferidos os receptores de neurotensina mutantes humanos (NTR2) que tenham combinações de 3, 4 ou 5 mutações como as acima descritas.

[0145] As combinações de mutações particularmente preferidas encontram-se descritas, em detalhe no Exemplo 3. Os métodos da invenção podem ser usados para a preparação destes receptores de neurotensina mutantes de ratazana, assim como de outros receptores de neurotensina mutantes em que os aminoácidos nas posições correspondentes tenham sido 48 substituídos por outro resíduo, tipicamente, pelo mesmo, conforme indicado no Exemplo 3.

[0146] Os receptores de neurotensina mutantes particularmente preferidos são os que contêm mutações nos resíduos de aminoácidos que correspondem ao resíduo de aminoácido mencionado, em relação ao receptor de neurotensina de ratazana: (F358A, A86L, I260A, F342A) (Nag7m); (F358A, H103A, I260A, F342A) (Nag7n).

Receptor muscarínico mutante [0147] Os receptores muscarínicos são conhecidos na área. Partilham homologia de sequência e ligam a muscarina.

[0148] Através dos métodos da invenção pode ser preparado um receptor muscarínico mutante que, quando comparado ao receptor de tipo selvagem correspondente, apresenta um aminoácido diferente numa posição que corresponde a qualquer uma ou mais das posições Leu 65, Met 145, Leu 399, Ile 383 e Met 384, em consonância com a numeração do receptor muscarínico Ml humano apresentada na Figura 17:

Leu 65, Met 145, Leu 399, Ile 383 e Met 384, podem ser preparados por métodos da invenção.

[0149] É preferível se o GPCR mutante for um GPCR que tenha, pelo menos, 20% da identidade da sequência de aminoácidos quando comparado com a sequência de aminoácidos mencionada para o receptor muscarínico mutante humano, tal como determinada através das aplicações MacVector e CLUSTALW. Preferencialmente, o GPCR mutante tem, pelo menos, 30, 40 ou 50% da identidade da sequência de aminoácidos.

[0150] 0 receptor muscarínico mutante pode ser um mutante 49 de qualquer receptor de neurotensina, desde que mutado em uma ou mais das posições especificadas em relação à sequência de aminoácidos mencionada para o receptor muscarinico.

[0151] Assim, os métodos da invenção podem ser usados na preparação de um receptor muscarinico mutante humano em que, em relação ao seu precursor, os residuos de aminoácidos tenham sido substituídos por outro residuo de aminoácido. Os métodos da invenção podem ser usados na preparação de receptores muscarinicos mutantes a partir de outras fontes, em que um ou mais dos aminoácidos correspondentes presentes no receptor precursor se encontram substituídos por outro residuo de aminoácido. Para que não subsistam dúvidas, o precursor pode ser um receptor muscarinico cuja sequência seja de ocorrência natural, uma forma truncada ou fusão quer de uma proteina de ocorrência natural como de um fragmento da mesma ou, conter mutações relativamente à sequência de ocorrência natural, desde que conserve a capacidade de vinculação ao ligante.

[0152] Incluímos no significado do termo "residuo de aminoácido correspondente" o residuo de aminoácido constante noutro receptor muscarinico, que se alinha ao residuo de aminoácido presente no receptor muscarinico humano quando este e outro receptor de neurotensina são comparados através das aplicações MacVector e CLUSTALW.

[0153] É preferível que o aminoácido particular é substituído por um Ala. Contudo, quando o resíduo de aminoácido em particular é Ala, é preferível que este seja substituído por Leu. 50 [0154] Tal como ilustrado pelos Exemplos 1-3 e na descrição antecedente, identificámos a presença de mutações termoestabilizadoras amplamente dispersas ao longo das sequências dos receptores adrenérgico βΐ de peru, de adenosina humano, de neurotensina de ratazana e muscarinico humano. A Figura 17 fornece um alinhamento destas sequências com a do beta-2AR humano elaborado de forma a que as duas sequências, quando as mutações termoestabilizadoras se encontram posicionadas sobre as sequências, em 11 de um total de 70 casos, contenham mutações na mesma posição (assinaladas com uma estrela na Figura 17) . Assim, será de notar que uma vez que uma ou mais mutações tenham sido identificadas num GPCR, poderá ser gerado um GPCR com uma estabilidade reforçada através do alinhamento das sequências de aminoácidos dos GPCR e da concretização da mesma ou de outras mutações na posição ou posições correspondentes. Este conceito é claramente exemplificado na Figura 26, onde as seis mutações termoestabilizadoras no β1-ιη23 de peru foram directamente transferidas para o receptor β2 humano. O mutante resultante, β2-ιη23, apresentava uma Tm superior em 12 °C à do receptor β2 humano.

[0155] Assim, os GPCR mutantes preparados através dos métodos da invenção podem ser usados num método de produção de um GPCR com uma estabilidade conformacional reforçada face à do seu precursor, que engloba: (i) identificação, na sequência de aminoácidos, de um ou mais mutantes de um primeiro GPCR precursor com uma estabilidade conformacional reforçada face à do primeiro, da posição ou posições em que o mutante ou mutantes apresentam, pelo menos, um resíduo de 51 aminoácido diferente em comparação com o primeiro GPCR precursor e (ii) realização de uma ou mais mutações na sequência de aminoácidos que define um segundo GPCR na posição ou posições correspondentes para fornecer um ou mais mutantes de um segundo GPCR precursor com uma estabilidade conformacional reforçada face à do segundo precursor; onde [0156] o mutante ou mutantes de um primeiro GPCR precursor possam ser seleccionados ou preparados de acordo com os métodos da invenção. Assim, deverá ser referido que o mutante ou mutantes de um primeiro GPCR precursor podem ser preparados através dos métodos da invenção e utilizados num método para o desenvolvimento de GPCR estáveis, conformacionalmente bloqueados, por mutagénese.

[0157] Por exemplo, após a selecção dos GPCR mutantes que apresentam uma elevada estabilidade conformacional quando se encontram numa determinada conformação de acordo com os métodos da invenção, pode ser identificada a mutação estabilizadora e substituído o aminoácido que se encontra na posição correspondente num segundo GPCR para produzir um GPCR mutante com uma estabilidade conformacional reforçada numa determinada conformação, relativamente ao segundo GPCR precursor.

[0158] Para que não subsistam dúvidas, o primeiro precursor GPCR pode ser um GPCR cuja sequência seja de ocorrência natural, uma forma truncada ou fusão quer de uma proteína de ocorrência natural como de um fragmento da mesma ou, conter mutações relativamente à sequência de ocorrência natural, desde que conserve a capacidade de vinculação ao ligante. 52 [0159] Habitualmente, a identificação da posição ou posições em que o mutante ou mutantes apresentam pelo menos um resíduo de aminoácido diferente em relação ao primeiro GPCR precursor envolve o alinhamento das suas sequências de aminoácidos com a do GPCR precursor, por exemplo, através da aplicação Clustal W (Thompson et al., 1994).

[0160] Incluímos no significado do termo "posição ou posições correspondentes" a posição na sequência de aminoácidos de um segundo GPCR que se alinha com a posição na sequência de aminoácidos do primeiro GPCR, quando este e segundo são comparados por alinhamento, por exemplo, através das aplicações MacVector e Clustal W. Por exemplo, conforme demonstrado no alinhamento constante na Figura 17, as seis mutações estabilizadoras em β1-ιη23, R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A e F338M de peru encontram-se em posições que correspondem, respectivamente, aos resíduos K60, M82, Y219, C265, L310 e F321 no receptor β2 humano.

[0161] Depois de identificada a posição ou posições correspondentes na sequência de aminoácidos de um segundo GPCR, substituíram-se os aminoácidos nessas posições por outro aminoácido. Habitualmente, os aminoácidos são substituídos pelos mesmos que substituíram os aminoácidos nas posições correspondentes no mutante do primeiro GPCR precursor (excepto se estes já forem esse resíduo). Por exemplo, o resíduo de arginina na posição 68 do β1-ιη23 de peru (R68S) foi substituído por um de serina. Assim, na posição correspondente no receptor β2 humano, posição 60 (K60), o resíduo de lisina é, preferencialmente, substituído por um resíduo de serina.

[0162] As mutações podem, por exemplo, ser realizadas numa 53 sequência de aminoácidos como a acima descrita, através de técnicas bem estabelecidas na área.

[0163] Deverá ser referido que o segundo GPCR pode ser qualquer outro GPCR. Por exemplo, as mutações estabilizadoras num GPCR de uma espécie podem ser transferidas para um segundo GPCR, de outra espécie. Do mesmo modo, as mutações estabilizadoras numa determinada isoforma do GPCR podem ser transferidas para um segundo GPCR que corresponde a uma isoforma distinta. Preferencialmente, o segundo GPCR precursor é da mesma classe ou familia GPCR que o primeiro. A análise filogenética dividiu os GPCR em três classes principais com base na similaridade da sequência proteica, ou seja, nas classes 1, 2 e 3 cujos protótipos são a rodopsina, o receptor de secretina e os receptores metabotrópicos de glutamato, respectivamente (Foord et al. (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288). Assim, o segundo GPCR pode ser um GPCR que seja da mesma classe que o primeiro precursor. Do mesmo modo, dividiram-se os GPCR em famílias com base nos seus ligantes naturais, tais como glutamato e GABA. Assim, o segundo GPCR pode ser um GPCR que seja da mesma família que o primeiro precursor. Foi produzida uma lista de classes e famílias GPCR pela International Union of Pharmacology (Foord et al (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288) sendo esta periodicamente actualizada em http://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorFamiliesForward.

[0164] Deve ser referido que o segundo GPCR precursor deverá ser capaz de ser alinhado com o primeiro de modo a que as posições correspondentes às mutações no primeiro GPCR precursor possam ser identificadas no segundo. Assim, habitualmente, o segundo precursor GPCR tem, pelo menos, 20% da identidade de sequência do primeiro precursor e, de 54 preferência, pelo menos, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% da sua identidade de sequência. Contudo, alguns GPCR apresentam uma identidade de sequência reduzida (e.g.: GPCR das familias B e C) e são, simultaneamente, muito semelhantes a nivel estrutural. Assim, o limiar de 20% de identidade de sequência não é absoluto.

[0165] Os inventores fundamentaram que a identificação de padrões estruturais em que se situam uma ou mais mutações num GPCR mutante com uma elevada estabilidade conf ormacional será útil para a produção de outros GPCR mutantes com uma elevada estabilidade do mesmo tipo.

[0166] Assim, os GPCR mutantes preparados através dos métodos da invenção podem ser usados num método de produção de um receptor acoplado à proteina-G (GPCR) mutante com uma estabilidade conformacional reforçada face à do seu precursor, que engloba: (i) fornecer um ou mais mutantes de um primeiro GPCR precursor com uma estabilidade conformacional reforçada face à do primeiro precursor (ii) identificar num modelo da estrutura de proteínas membranares o padrão ou padrões estruturais em que o mutante ou mutantes apresentam, pelo menos, um aminoácido diferente do primeiro GPCR precursor, e (iii) realizar uma ou mais mutações na sequência de aminoácidos que define um ou mais padrões estruturais correspondentes num segundo GPCR precursor, para fornecer um ou mais mutantes com uma estabilidade conformacional reforçada face à do segundo precursor; onde a selecção do mutante ou mutantes de um primeiro 55 GPCR precursor possa ser concretizada de acordo com os métodos da invenção.

[0167] 0 mapeamento de mutações conformacionalmente estabilizadoras sobre um ou mais modelos estruturais conhecidos pode ser utilizado na identificação de determinados padrões estruturais em que estejam presentes mutações estruturais. Mapeámos mutações conformacionalmente estabilizadoras do receptor adrenérgico βΐ sobre modelos estruturais do receptor adrenérgico β2 (Rasmussen et al (2007) Nature 450, 383-387; Cherezov et al (2007) Science 318:1258-65; Rosenbaum et al (2007) Science 318:1266-1273) de modo a identificar os padrões supramencionados. Por exemplo, a Tabela (vi) apresenta as mutações do receptor β-adrenérgico de peru que mapeámos sobre o receptor adrenérgico β2 humano e a descrição dos motivos estruturais correspondentes, onde estas se encontram estabelecidas. Conforme discutido no Exemplo 4, o mapeamento da mutação Y227A (equivalente à Y219 no receptor β2 humano) sobre o receptor adrenérgico β2 humano revela a sua posição na interface entre hélices, de forma a que a mutação possa aperfeiçoar o acondicionamento na interface helicoidal (ver, Figuras 15, 16 e 23). De modo semelhante, o mapeamento da mutação M90V (equivalente à M82 no receptor β2 humano) sobre o receptor adrenérgico β2 humano revela que esta se encontra na hélice 2, num ponto em que esta se encontra torcida (ver Figuras 15, 16 e 20). Encontraram-se outras mutações presentes noutros padrões estruturais incluindo a superficie das hélices transmembranares direccionadas ao interior da bicamada lipidica, as regiões limítrofes hidrofóbica-hidrofílica, as bolsas de ligação proteica e as regiões de loop (ver, Tabela (vi) e as Figuras 18-19, 21-22, 24-25). 56 [0168] Tais padrões estruturais, em virtude de conterem mutações conformacionalmente estabilizadoras, são importantes na determinação da estabilidade da proteína. Assim, o direccionamento de mutações a estes padrões facilitará a produção de GPCR mutantes conformacionalmente estáveis. De facto, existiram vários casos em que foi mapeada mais do que uma mutação sobre o mesmo padrão estrutural. Por exemplo, as mutações Y227A, V230A e A234L no receptor adrenérgico βΐ de peru mapeadas sobre a interface helicoidal, as mutações V89L e M90V mapeadas sobre a mesma torção helicoidal e as mutações F327A e A334L mapeadas sobre a mesma superfície helicoidal, direccionada à bicamada lipídica (Tabela (vi)). Assim, quando uma mutação conformacionalmente estabilizadora tenha sido identificada, a determinação do padrão estrutural em que tal mutação se encontra irá permitir a identificação de outras mutações do mesmo tipo.

[0169] Deverá ser referido que o mutante ou mutantes de um primeiro GPCR precursor podem ser preparados através dos métodos da invenção e utilizados num método para o desenvolvimento de GPCR estáveis, conformacionalmente bloqueados, por mutagénese. Por exemplo, após a selecção dos mutantes GPCR que apresentam uma elevada estabilidade conformacional numa determinada conformação de acordo com os métodos da invenção, podem ser identificados os padrões estruturais em que se situam tais mutações estabilizadoras. A realização de uma ou mais mutações na sequência de aminoácidos que define o padrão estrutural correspondente noutro GPCR pode, então, ser utilizada para produzir um GPCR mutante com uma estabilidade conformacional reforçada face à do seu precursor. 57 [0170] Efectuámos um alinhamento múltiplo de sequências de aminoácidos dos receptores beta-2AR humano, NTR1 de ratazana, beta-1 AR de peru, de adenosina A2aR humano e muscarinico Ml humano (Figura 17) que demonstra que quando as mutações termoestabilizadoras identificadas (ver, Exemplos 1-3) se encontram posicionadas nas sequências então, em 11 de um total de 70 ocorrências, as duas sequências contêm mutações na mesma posição (assinaladas com uma estrela na Figura 17). Sem pretender ser limitados por qualquer teoria, os inventores acreditam que as mutações termoestabilizadoras presentes nestas posições devem apresentar uma transferibilidade aperfeiçoada para o mapeamento sobre um modelo estrutural de uma proteína da membrana. Assim, pode ser preparado, através dos métodos da invenção, o mutante do primeiro GPCR precursor que pode ser um mutante dos receptores beta-2AR humano, NTRl de ratazana, beta-1 AR de peru, de adenosina A2aR humano ou muscarinico Ml humano que, quando comparado ao receptor precursor correspondente, tem um aminoácido diferente numa posição que corresponde a qualquer uma ou mais das posições Ala 59, Vai 81, Ser 143, Lys 147, Vai 152, Glu 180, Vai 222, Ala 226, Ala 271, Leu 275 e Vai 317, em consonância com a numeração do receptor beta-2AR humano apresentada na Figura 17.

[0171] Para possibilitar a identificação do padrão ou padrões estruturais, as mutações conformacionalmente estabilizadoras são mapeadas sobre uma estrutura conhecida de uma proteína da membrana.

[0172] A "proteína da membrana" aqui mencionada é uma proteína que se encontra ligada ou associada à membrana de uma célula ou organelo. Preferencialmente, a proteína da 58 membrana é uma proteína integral que se encontra permanentemente inserida na membrana e pode apenas ser removida através da utilização de detergentes, solventes não polares ou agentes desnaturantes que afectam fisicamente a bicamada lipídica.

[0173] 0 modelo estrutural de uma proteína da membrana pode ser qualquer modelo estrutural. Por exemplo, o modelo pode ser o de uma estrutura cristalina conhecida. Os exemplos de GPCR com estruturas cristalinas incluem o receptor de rodopsina bovino (Palczewski, K. et al., Science 289, 739-745. (2000)) e o adrenérgico β2 humano (Rasmussen et al, Nature 450, 383-7 (2007); Cberezov et al (2007) Science 318:1258-65; Rosenbaum et al (2007) Science 318:1266-1273). As coordenadas para a estrutura do receptor adrenérgico β2 humano podem ser encontradas no RCSB Protein Data Bank, sob os códigos de admissão: 2rhl, 2r4r e 2r4s. Em alternativa, o modelo estrutural pode ser um modelo computorizado gerado com base na homologia ou através de métodos de predição estrutural de novo (Qian et al. Nature (2007) 450: 259-64). 259-64).

[0174] Deverá ser referido que as mutações conformacionalmente estabilizadoras de um determinado GPCR mutante podem ser mapeadas sobre um modelo estrutural de qualquer proteína da membrana cuja similaridade estrutural em relação ao GPCR seja suficiente. Em particular, o domínio da proteína da membrana deve apresentar uma similaridade estrutural suficiente em relação ao domínio do GPCR, em que se situa a mutação conformacionalmente estabilizadora, para que uma determinada mutação seja transmissível.

[0175] Um domínio de uma proteína é habitualmente definido 59 como uma montagem discretamente dobrada de elementos de uma estrutura secundária, podendo ser autónomo numa proteína simples ou parte de uma proteína maior, em combinação com outros domínios. É, frequentemente, uma unidade evolutiva funcional.

[0176] Os GPCR são, essencialmente, proteínas de domínio único, com excepção das que apresentam domínios N-terminal extensos. Assim, o modelo estrutural é, habitualmente, o de uma proteína da membrana que contém, pelo menos, um domínio que apresenta uma similaridade estrutural suficiente em relação ao do GPCR

[0177] A similaridade estrutural pode ser indirectamente determinada através da análise da identidade de sequência ou de forma directa, através da comparação de estruturas.

[0178] No que concerne à identidade da sequência, a sequência de aminoácidos que codifica o domínio do GPCR em que o mutante apresenta, pelo menos, um resíduo de aminoácido diferente em relação ao primeiro GPCR precursor é alinhada com uma sequência de aminoácidos para a qual se encontra disponível um modelo estrutural. Deverá ser referido que uma ou mais destas sequências podem conter um sequência inserida ou extensões N-terminal ou C-terminal, adicionais ao domínio conservado principal. Para um alinhamento ideal, tais sequências são removidas de modo a que não ocorra uma distorção da análise. As proteínas da membrana com uma sequência de identidade suficiente ao longo do domínio em questão podem, então, ser utilizadas como modelo estrutural para o mapeamento de mutações. Foi demonstrado que, no que concerne aos domínios de proteínas solúveis, a sua estrutura 3D é largamente conservada acima do limiar de 20% de identidade sequencial, bem conservada 60 acima de 30% de identidade sequencial, aumentando o nivel de conservação sequencial com a subida da percentagem de identidade sequencial, até 100% (Ginalski, K. Curr Op Struc Biol (2006) 16, 172-177). Assim, é preferível que o modelo estrutural da proteina da membrana seja um modelo de uma proteina de membrana que partilhe, pelo menos, 20% da identidade sequencial com o domínio do GPCR mutante que contém, pelo menos, um resíduo de aminoácido diferente em relação ao primeiro precursor e, de preferência, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% de identidade sequencial e, ainda com maior preferência, 95 ou 99%.

[0179] A medição da identidade sequencial pode realizada através de algoritmos como BLAST ou PSI-BLAST (Altschul et al, NAR (1997), 25, 3389-3402) ou por métodos com base nos Modelos Ocultos de Markov (Eddy S et al, J Comput Biol (1995) Spring 2 (1) 9-23). Habitualmente, a percentagem de identidade entre as sequências de dois polipéptidos pode ser determinada através de qualquer aplicação informática adequada como, por exemplo, a aplicação GAP do Grupo de Computação Genética da Universidade de Wisconsin, devendo referir-se que a percentagem de identidade é calculada em relação a polipéptidos cujas sequências tenham sido idealmente alinhadas. O alinhamento pode, em alternativa, ser executado através da aplicação Clustal W (Thompson et al, 1994). Os parâmetros utilizados podem ser os seguintes: Parâmetros rápidos de alinhamento em pares: Dimensão do comprimento K(palavra); 1, dimensão da janela; 5, penalização de lacuna; 3, número de diagonais superiores; 5. Método de pontuação: x por cento. Parâmetros de alinhamento múltiplo: penalização de abertura de lacuna; 10, penalização de extensão de lacuna; 0,05. Matriz de classificação: BLOSUM. 61 [0180] Para além da identidade de sequência, pode também ser directamente determinada a similaridade estrutural através da comparação de modelos. Os modelos estruturais podem ser usados na detecção de regiões de similaridade estrutural não evidentes a partir da simples comparação de modelos, que podem ou não ser contíguas na sequência. Por exemplo, pensa-se que os GPCR das famílias B e C partilham estruturas similares, contudo, a sua identidade sequencial é muito reduzida. De modo semelhante, as aquaporinas transportadoras de água SoPip2 de espinafre, AqpZ de E. coli, AqpM de Methanococcus, Aqp4 de ratazana, Aqpl humana e AqpO de ovelha partilham uma identidade entre sequências reduzida mas apresentam estruturas similares.

[0181] Os modelos estruturais de alta fidelidade podem ser construídos para proteínas de estrutura desconhecida através de pacotes de software comuns, como o MODELLER (Sali A & Blundell T, J Mol Biol (1993) 234(3) 779-815), onde a estrutura é modelada com base numa estrutura conhecida de uma proteína homóloga. Tal modelação é aperfeiçoada com o aumento da identidade sequencial. Habitualmente, a identidade sequencial entre a sequência de estrutura desconhecida e uma sequência de estrutura 3D conhecida é superior a 30% (Ginalski, K. Curr Op Struc Biol (2006) 16, 172-177). Adicionalmente, podem ser utilizados métodos de novo de predição estrutural, exclusivamente baseados na sequência, para modelar proteínas de estrutura desconhecida (Qian et al, (2007) Nature 450:259-64). Uma vez que as estruturas tenham sido experimentalmente determinadas ou derivadas, por modelação, podem ser detectadas as regiões de similaridade estrutural através da comparação de duas ou mais estruturas 3D. Estas podem, por exemplo, conter elementos de uma estrutura secundária de 62 uma determinada arquitectura e topologia que possam ser detectados através da utilização de uma aplicação como a DALI (Holm, L and Sander, C (1996) Science 273, 595-603) . Podem conter disposições locais de cadeias de aminoácidos, a estrutura polipeptidica de base ou conjuntos ou grupos específicos de átomos numa determinada disposição espacial, que podem também ser, por exemplo, detectados através de representações gráficas teóricas (Attymiuk,P et al, (2005) J Amer Soc Info Sei Tech 56 (5) 518-528). Nesta abordagem, os átomos ou grupos de átomos presentes nas proteínas ou regiões de proteínas a comparar são habitualmente representados como os nós de um gráfico cujos limites descrevem os ângulos e distâncias entre os nós. A existência de padrões comuns nestes gráficos é indicativa de padrões estruturais comuns. Esta abordagem pode ser alargada para incluir qualquer descritor de átomos ou grupos de átomos como o papel de dador ou aceitador ligado ao hidrogénio, a hidrofobicidade, forma, carga ou aromaticidade; por exemplo, as proteínas podem ser espacialmente mapeadas de acordo com tais descritores através da função GRID e a sua representação ser utilizada como base da pesquisa de similaridade (Baroni et al (2007) J Chem Inf Mod 47, 279-294) . As descrições dos métodos, disponibilidade do software, directrizes para a selecção de parâmetros definida pelo utilizador, limiares ou tolerâncias estão apresentados nas referências anteriores.

[0182] O modelo estrutural da proteína da membrana pode ser um modelo estrutural do GPCR. Deverá ser referido que o modelo estrutural de um GPCR pode ser um modelo do primeiro GPCR precursor. Por exemplo, as mutações estabilizadoras presentes num GPCR mutante com uma elevada estabilidade conformacional podem ser directamente mapeadas sobre a estrutura do primeiro GPCR precursor, sendo localizados e 63 identificados os motivos estruturais de tais mutações. Em circunstâncias em que a estrutura do primeiro GPCR precursor é desconhecida podem ser usados outros modelos estruturais do GPCR. Por exemplo, as mutações conformacionalmente estabilizadoras num GPCR de uma espécie podem ser mapeadas sobre um modelo estrutural conhecido do mesmo GPCR de outra espécie. Do mesmo modo, as mutações conformacionalmente estabilizadoras numa determinada isoforma do GPCR podem ser mapeadas sobre um modelo estrutural conhecido de outra isoforma do GPCR. Para além disso, as mutações conformacionalmente estabilizadoras de um GPCR podem ser mapeadas sobre um GPCR da mesma classe ou familia. Foi produzida uma lista de classes e familias GPCR pela International Union of Pharmacology (Foord et al (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288) sendo esta periodicamente actualizada em http://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorFamiliesForward.

[0183] Tal como acima descrito, deverá ser referido que o modelo estrutural pode ser o de qualquer GPCR desde que apresente uma similaridade estrutural suficiente ao longo do dominio em que o GPCR mutante apresenta, pelo menos, um aminoácido diferente em relação ao primeiro precursor. Assim, é preferível que o GPCR partilhe, pelo menos, 20% da identidade sequencial com o mutante do primeiro GPCR precursor ao longo do dominio da proteina que contenha, pelo menos, um residuo de aminoácido diferente em relação ao primeiro precursor e, de preferência, pelo menos 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% da identidade de sequência e, ainda com maior preferência, pelo menos 95 ou 99% da mesma. Contudo, os inventores reconhecem que o limiar de 20% de identidade sequencial não é absoluto. Os GPCR com menos de 20% de identidade sequencial em relação ao primeiro GPCR precursor podem também servir como um modelo estrutural 64 para o qual são transferidas mutações estabilizadoras, onde a identidade sequencial reduzida dos é compensada por outras semelhanças, incluindo, por exemplo, a presença dos mesmos padrões de sequência, a ligação à mesma proteina-G ou, quando em comparação com o primeiro GPCR precursor, o desempenho da mesma função ou apresentação dos mesmos gráficos de hidropatia.

[0184] O mapeamento das mutações conformacionalmente estabilizadoras sobre o modelo estrutural pode ser concretizado através de qualquer método adequado conhecido na área. Por exemplo, a sequência de aminoácidos para que está disponível o modelo estrutural é, habitualmente, alinhada com a sequência de aminoácidos do primeiro GPCR precursor. A localização da posição ou posições em que se encontra a diferença de, pelo menos, um aminoácido no GPCR mutante em relação ao primeiro precursor pode ser determinada na sequência de aminoácidos do GPCR para o qual se encontra disponível um modelo estrutural.

[0185] 0 termo 'padrão estrutural' inclui no seu significado uma descrição tridimensional da localização de uma mutação termoestabilizadora num modelo estrutural do GPCR. Por exemplo, o padrão estrutural pode ser qualquer padrão estrutural secundário ou terciário presente no GPCR. O termo 'padrão estrutural terciário' inclui no seu significado qualquer descritor de átomos ou de grupos de átomos, como o papel de dador ou aceitador ligado ao hidrogénio, hidrofobicidade, forma, carga ou aromaticidade. Por exemplo, as proteínas podem ser espacialmente mapeadas de acordo com tais descritores, através da função GRID, e a sua representação utilizada como base de definição para um padrão estrutural (Baroni et al (2007) J Chem Inf Mod 47,279-294). 65 [0186] A tabela (vi) apresenta os padrões estruturais em que se encontram as mutações estabilizadoras no receptor adrenérgico βΐ de peru. Conforme pode ser observado na tabela, as mutações encontram-se posicionadas em várias localizações diferentes. Três das mutações estão presentes nas regiões de loop que se prevêem ser acessíveis ao solvente aquoso. Oito das mutações estão presentes nas hélices a transmembranares direccionadas para o interior da bicamada lipídica, três das quais nas proximidades da terminação das hélices, podendo ser consideradas como presentes na camada limite hidrófoba-hidrofílica. Oito das mutações estão presentes entre as hélices α transmembranares, três das quais se encontram inseridas quer numa região torcida quer numa região distorcida da hélice e outras duas que ocorrem numa hélice mas que se encontram adjacentes a uma ou mais das demais hélices que contêm uma torção espacialmente adjacente ao resíduo mutado. Estas últimas mutações poderiam afectar o acondicionamento dos aminoácidos no interior da região torcida, o que poderia conduzir à termoestabilização. Outra das mutações está presente numa bolsa de ligação do substrato.

[0187] Assim, o padrão estrutural pode ser qualquer padrão de uma interface helicoidal, torção da hélice, hélice contrária à torção da hélice, superfície da hélice direccionada para o interior da bicamada lipídica, superfície da hélice direccionada à bicamada lipídica na camada limite hidrófoba-hidrofílica, uma região de loop ou uma bolsa de ligação da proteína.

[0188] A identificação de um padrão estrutural em que esteja presente uma mutação conformacionalmente 66 estabilizadora sugere a importância desse padrão na estabilidade da proteina. Assim, a realização de uma ou mais mutações na sequência de aminoácidos que define um ou vários padrões estruturais correspondentes num segundo GPCR precursor deverá fornecer um ou mais mutantes de um segundo GPCR precursor com uma estabilidade conformacional reforçada face à do primeiro precursor.

[0189] A sequência de aminoácidos que define um motivo estrutural é a sequência primária de residuos de aminoácidos que se combinam nas estruturas secundária ou terciária da proteina para dar origem ao padrão estrutural. Deverá ser referido que tal sequência de aminoácidos primária poderá conter residuos de aminoácidos contíguos ou não contíguos. Assim, a identificação da sequência de aminoácidos que define o padrão estrutural irá implicar a determinação dos residuos de aminoácidos envolvidos e, em seguida, a definição da sequência. As mutações podem, por exemplo, ser realizadas numa sequência de aminoácidos como a acima descrita, através de técnicas bem estabelecidas na área.

[0190] O termo "padrão ou padrões correspondentes" inclui no seu significado um ou vários padrões estruturais análogos identificados no modelo estrutural presente no segundo GPCR precursor. Por exemplo, se tiver sido identificada uma interface helicoidal, a interface helicoidal correspondente no segundo GPCR precursor será a interface que se encontra entre as hélices análogas às presentes no modelo estrutural. Se tiver sido identificada uma torção helicoidal, a hélice helicoidal correspondente será a torção na hélice análoga à presente no modelo estrutural. A identificação da presença de um ou vários padrões estruturais análogos no segundo GPCR precursor pode 67 ser realizada através da pesquisa de sequências de aminoácidos similares na sequência do segundo precursor que define o padrão ou padrões estruturais no modelo por, por exemplo, alinhamento de sequências. Para além disso, estão amplamente disponíveis no mercado algoritmos informáticos que podem ser utilizados na previsão da presença de padrões proteicos com base numa sequência de aminoácidos. Assim, com base na posição relativa de um determinado padrão estrutural presente na sequência de aminoácidos e na sua posição relativamente a outros padrões poderá ser, prontamente, identificado um padrão estrutural análogo. Deverá ser referido que se estiver disponível um modelo estrutural de um segundo GPCR precursor, o padrão ou padrões estruturais análogos poderão ser directamente mapeados sobre a estrutura da proteína. Habitualmente, a sequência de aminoácidos que define o padrão estrutural análogo partilha pelo menos 20% de identidade sequencial com a sequência que define o padrão no modelo estrutural, mais preferencialmente, pelo menos, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% e, ainda com maior preferência, 95 ou 99% da identidade sequencial.

[0191] O segundo GPCR precursor pode ser um primeiro GPCR precursor. Para que não subsistam dúvidas, o segundo GPCR precursor pode apresentar uma sequência de ocorrência natural de um primeiro GPCR precursor, ser uma forma truncada ou fusão quer de uma proteína de ocorrência natural como de um fragmento da mesma ou conter mutações relativamente à sequência de ocorrência natural, desde que conserve a capacidade de vinculação ao ligante.

[0192] Em alternativa, o segundo GPCR precursor pode no ser o primeiro GPCR precursor. Por exemplo, pode ter sido identificado um mutante de um primeiro GPCR precursor que 68 apresenta uma elevada estabilidade conformacional e continuar a ser desejada a produção de um mutante com elevada estabilidade conformacional a partir de um GPCR diferente. Preferencialmente, o segundo GPCR precursor é da mesma classe ou familia que o primeiro, tal como anteriormente descrito. Contudo, deverá ser referido que o segundo GPCR precursor pode ser qualquer GPCR conhecido desde que este partilhe uma similaridade estrutural suficiente com o primeiro precursor, de forma a que este contenha um padrão estrutural correspondente em que esteja presente a mutação conformacionalmente estabilizadora do mutante do primeiro GPCR precursor. Assim, habitualmente, o segundo GPCR precursor tem, pelo menos, 20% da identidade de sequência do primeiro precursor e, de preferência, pelo menos, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% da sua identidade de sequência. Contudo, tal como acima mencionado, alguns GPCR apresentam uma identidade sequencial reduzida (por exemplo, GPCR das famílias B e C) e são, simultaneamente, muito semelhantes a nível estrutural. Assim, o limiar de 20% de identidade de sequência não é absoluto.

[0193] Já que existem, potencialmente, milhares de mutações que podem ser analisadas num GPCR relativamente à elevada estabilidade conformacional, torna-se vantajoso ter apenas em vista determinadas mutações que são conhecidas como importantes para a conferência de estabilidade conformacional. Assim, deverá ser referido que os GPCR mutantes preparados através dos métodos da invenção podem ser utilizados num método de selecção de GPCR com elevada estabilidade. Em particular, a execução dos métodos anteriores em circunstâncias em que o mutante ou mutantes de um primeiro GPCR sejam seleccionados ou preparados de acordo com os métodos da invenção pode ser utilizada no direccionamento de mutações a determinados resíduos de 69 aminoácidos ou a sequências de aminoácidos que definam os padrões estruturais importantes para a determinação da estabilidade conformacional.

[0194] Assim, os métodos anteriores onde um ou vários mutantes de um primeiro GPCR são seleccionados ou preparados de acordo com os métodos da invenção podem ainda compreender: (I) a selecção de um ligante, sendo este um ligante que se vincula ao GPCR precursor quando o GPCR se encontra numa determinada conformação, (II) determinar se o mutante ou cada mutante do segundo GPCR precursor quando numa determinada conformação apresenta uma elevada estabilidade conformacional relativamente à vinculação do ligante face à estabilidade do segundo GPCR precursor quando se encontra nessa mesma conformação, relativamente à vinculação desse ligante, e (III) a selecção dos mutantes que apresentam uma estabilidade conformacional reforçada face à do segundo GPVCR precursor relativamente à vinculação do ligante seleccionado.

[0195] Deverá ser referido que os passos (I), (II) e (III) correspondem aos passos (b), (c) e (d) do método do primeiro aspecto da invenção acima descrito. Desse modo, as preferências para o ligante e métodos de ensaio da estabilidade correspondem às acima referidas em relação ao método do primeiro aspecto da invenção.

[0196] Pode ser produzido um GPCR mutante com uma elevada estabilidade conformacional em relação ao seu GPCR 70 precursor através do método acima descrito, composto pelos passos (I), (II) e (III) e com inclusão de quaisquer dos GPCR abaixo mencionados.

[0197] Por exemplo, o GPCR pode ser qualquer GPCR mutante que tenha, quando comparado com o seu precursor, um aminoácido diferente numa posição que corresponda a qualquer uma ou a mais das seguintes posições: (i) em consonância com a numeração apresentada para o receptor β-adrenérgico de peru apresentada na Figura 9: Ile 55, Gly 67, Arg 68, Vai 89, Met 90, Gly 67, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gin 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gin 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gin 311, Pro 313, Lys 315, (iii) em consonância com a numeração apresentada para o receptor de neurotensina de ratazana na Figura 11:

Ala 69, Leu 72, Ala 73, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Vai 165, Glu 166, Lys 176, Ala 177, Thr 179, Met 181, Ser 182, Arg 183, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Vai 229, Met 250, Ile 253, Leu 256, Ile 260, Asn 262, Vai 268, Asn 270, Thr 279, Met 293, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Vai 309, Leu 310, Vai 313, Phe 342, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Vai 360, Ser 362, Asn 37.0 , Ser 373, Phe 380, Ala 385, Cys 386, Pro 389, Gly 390, Trp 391, Arg 392, His 393, Arg 395, Lys 397, Pro 399 e (iv) em consonância com a numeração apresentada para o receptor muscarinico na Figura 17: Leu 65, Met 145, Leu 399, Ile 383 e Met 384.

[0198] O alinhamento das sequências de aminoácidos dos receptores βlAR de peru, adenosina humano, neurotensina de ratazana e muscarinico humano apresentado na Figura 17 demonstra que, em 11 de um total de 70 ocorrências, duas 71 sequências apresentam mutações na mesma posição, nomeadamente, nas posições Ala 59, Vai 81, Ser 143, Lys 147, Vai 152, Glu 180, Vai 222, Ala 226, Ala 271, Leu 275 e Vai 317, em consonância com a numeração apresentada para o β2Α13 humano na Figura 17.

[0199] Noutro exemplo, o GPCR mutante pode ser um receptor β-adrenérgico mutante. Por exemplo, o receptor β-adrenérgico mutante pode apresentar, pelo menos, um residuo de aminoácido diferente num padrão estrutural em que o receptor mutante possui, em relação ao seu precursor, um aminoácido diferente numa posição que corresponde a qualquer uma ou a mais das posições Ile 55, Gly 67, Arg 68, Vai 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Vai 160, Gin 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Vai 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334 e Phe 338, em consonância com a numeração do receptor β-adrenérgico de peru apresentada na Figura 17.

[0200] Noutro exemplo, o GPCR mutante pode ser um receptor de adenosina mutante. Por exemplo, o receptor de adenosina mutante pode apresentar, pelo menos, um residuo de aminoácido diferente num padrão estrutural em que o receptor mutante possui, em relação ao seu precursor, um aminoácido diferente numa posição que corresponde a qualquer uma ou a mais das posições Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gin 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gin 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr279, Asn 284, Gin 311, Pro 313 e Lys 315, em consonância com a numeração do receptor de adenosina A2a humano apresentada na Figura 10.

[0201] Noutro exemplo, o GPCR mutante pode ser um receptor 72 de neurotensina mutante. Por exemplo, o receptor de neurotensina mutante pode apresentar, pelo menos, um resíduo de aminoácido diferente num padrão estrutural em que o receptor mutante possui, em relação ao seu precursor, um aminoácido diferente numa posição que corresponde a qualquer uma ou a mais das posições Ala 69, Leu 72 , Ala 73, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Vai 165, Glu 166, Lys 176, Ala 177, Thr 179, Met 181, Ser 182, Arg 183, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Vai 229, Met 250, Ile 253, Leu 256, Ile 260, Asn 262, Vai 268, Asn 270, Thr 279, Met 293, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Vai 309, Leu 310, Vai 313, Phe 342, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Vai 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Cys 386, Pro 389, Gly 390, Trp 391, Arg 392, His 393, Arg 395, Lys 397 e Pro 399, em consonância com a numeração do receptor de neurotensina de ratazana apresentada na Figura 11.

[0202] Noutro exemplo, o GPCR mutante pode ser um receptor muscarínico mutante. Por exemplo, o receptor muscarínico mutante pode apresentar, pelo menos, um resíduo de aminoácido diferente num padrão estrutural em que o receptor mutante possui, em relação ao seu precursor, um aminoácido diferente numa posição que corresponde a qualquer uma ou a mais das posições Leu 65, Met 145, Leu 399, Ile 383 e Met 384, em consonância com a numeração do receptor muscarínico humano apresentada na Figura 17.

[0203] É preferível que os GPCR mutantes preparados através dos métodos da invenção possuam uma estabilidade conformacional reforçada para qualquer das condições desnaturantes como o calor, um detergente, agente caotrópico ou um extremo de pH. 73 [0204] É preferível que os GPCR preparados através dos métodos da invenção possuam uma elevada termoestabilidade conformacional.

[0205] É preferido que os GPCR humanos preparados através dos métodos da invenção, incluindo os receptores β-adrenérgico, de adenosina e neurotensina mutantes, possuam uma elevada termoestabilidade conformacional face à do seu precursor na presença ou ausência do respectivo ligante. Habitualmente, o ligante é um antagonista, um agonista total, parcial ou inverso, quer ortostérico quer alostérico. Tal como discutido acima, o ligante pode ser um polipéptido, por exemplo, um anticorpo.

[0206] É preferido que os GPCR mutantes preparados através dos métodos da invenção, por exemplo, um dos receptores β-adrenérgico, de adenosina ou neurotensina mutantes, sejam mais estáveis em pelo menos 2°C do que o seu precursor, de preferência, em pelo menos 5°C ou, ainda com maior preferência, em pelo menos 10, 15 ou 20°C. Habitualmente, a termoestabilidade dos receptores precursor e mutante é medida sob as mesmas condições. Habitualmente, a termoestabilidade é avaliada sob uma condição em que o GPCR se encontra numa determinada conformação. Habitualmente, esta condição seleccionada é a presença de um ligante que vincula o GPCR.

[0207] É preferível que os GPCR mutantes preparados através dos métodos da invenção, quando solubilizados e purificados num detergente adequado, apresentem uma termoestabilidade similar à da rodopsina bovina purificada em dodecilmaltosideo. É particularmente preferível que o GPCR mutante conserve, pelo menos, 50% da sua actividade de 74 ligação após aquecimento a 40°C, durante 30 minutos. É ainda preferível que o GPCR conserve, pelo menos, 50% da sua actividade de ligação após aquecimento a 55°C, durante 30 minutos.

[0208] Os GPCR mutantes preparado através dos métodos aqui divulgados são úteis para estudos de cristalização e programas de descoberta de fármacos. Podem ser usados em medições biofísicas dos parâmetros cinéticos e termodinâmicos de receptores/ligantes, por exemplo, através de ressonância de plasmão de superfície ou de técnicas baseadas na fluorescência. Podem ser usados em rastreios de vinculação de ligantes e ligados a superfícies sólidas para aplicação em rastreios de alto rendimento ou como chips biossensores. Os chips biossensores que contêm os GPCR mutantes podem ser usados na detecção de moléculas, especialmente, biomoléculas.

[0209] Um polinucleótido pode codificar GPCR mutantes preparados através dos métodos da invenção. Em particular, os polinucleótidos podem codificar os receptores β-adrenérgico, de adenosina ou neurotensina mutantes preparados através dos métodos da invenção. 0 polinucleótido pode ser DNA ou RNA. Habitualmente, encontra-se inserido num vector, sendo este um vector que pode ser utilizado na expressão do GPCR mutante mencionado. Os vectores adequados são aqueles que propagam e/ou permitem a expressão em células de bactérias, mamíferos ou insectos.

[0210] As células hospedeiras, por exemplo células bacterianas ou eucarióticas, podem conter um polinucleótido que codifica o GPCR mutante preparado através dos métodos 75 da invenção. As células adequadas incluem as de E. coli levedura, mamíferos e insectos.

[0211] A invenção será agora descrita em maior detalhe relativamente às Figuras e Exemplos que se seguem, onde:

Figura 1 Alterações de aminoácidos a nível do βΑΙΙ que conduziram à termoestabilidade. 0 quociente de estabilidade indica a % de actividade de ligação remanescente dos mutantes, após aquecimento da amostra a 32 °C, durante 30 minutos. Todos os valores estão normalizados em função do βΑΚ34_424 (50%, ilustrado por uma linha descontínua), para remoção de qualquer variabilidade experimental entre ensaios. As barras ilustram a estabilidade para cada mutante. As letras constantes no eixo X indicam o aminoácido presente no mutante. O aminoácido original e a sua posição no βΑΚ34-424 estão indicados em baixo. As barras correspondentes ao mesmo aminoácido no βΑΚ34_424 têm a mesma cor e apresentam setas indicativas das melhores mutações. Os erros foram calculados a partir de medições duplicadas, os melhores mutantes foram, posteriormente, reavaliados para determinar a Tm de cada mutação individual e fornecer uma ordem de classificação precisa para a estabilidade de cada mutante (ver Exemplo 1).

Figura 2 Cadeias laterais na rodopsina que se encontram em posições equivalentes às mutações termoestáveis no βΑΚ34_424 · Os resíduos de aminoácidos na rodopsina equivalentes aos resíduos de aminoácidos mutados no βΑΚ34_424 foram localizados na estrutura da rodopsina com base num alinhamento entre rodopsina, 76 receptor adrenérgico βΐ, receptor de neurotensina e receptor A2a de adenosina (dados não representados). As cadeias laterais na mesma hélice transmembranar são ilustradas como modelos de preenchimento espacial, na mesma cor. 0 nome e posição dos resíduos de aminoácidos correspondem aos designados na rodopsina.

Figura 3 Evolução da termostabilidade em PAR. A partir do pAR-mlO-8, as combinações de mutações foram sistematicamente reorganizadas para encontrar a combinação de mutações ideal (consultar, também, a Tabela 2) .

Figura 4 Estabilidade de pAR-m23 e PAR34-424 no estado apo ou em ligação com o antagonista [3H]-DHA. Para determinar a Tm na ausência de ligante (estado apo, linhas descontínuas), foram incubados receptores solubilizados em detergente durante 30 minutos, às temperaturas indicadas, antes da concretização do ensaio de ligação. Para determinar a Tm da forma ligada ao antagonista (linhas contínuas), foram pré-incubados receptores solubilizados em detergente com [3H]-DHA, às temperaturas indicadas. pAR-m23 (círculos) e βΑΚ34-424 (quadrados) . Os pontos de dados correspondem a medições duplicadas concretizadas numa experiência representativa.

Figura 5 Competição da ligação de agonistas a pAR-m23 e βΑΡ.34-424 . Foram realizados ensaios de ligação em receptores parcialmente purificados em DDM; pAR-m23 (triângulos) e PAR34-424 (quadrados) . Foi utilizado [3H]-DHA a uma concentração três vezes superior à KD do receptor parcialmente purificado (ver Métodos). A ligação de [3H]-DHA foi colocada em competição com concentrações crescentes de agonistas, norepinefrina 77 (a) e isoprenalina (b) , ou com um antagonista, alprenolol (c) . Os LogECso e valores correspondentes de EC5o foram calculados por regressão não linear através da aplicação GraphPad Prism, o erro para os logECso foi inferior a 10%. Os EC50 para a vinculação dos ligantes a βΑμ34-424 e βΑμ-ιη23 são: norepinef rina, βΑΚ.34-424 1,5 μΜ, βAR-m23 3, 7 mM; isoprenalina, βΑμ34_424 330 nM, βAR-m23 20 μΜ; alprenolol, βΑμ 78 nM, βAR-m23 112 nM.

Figura 6 Estabilidade de βΑμ-ιη23 e βΑΕ34-424 em cinco detergentes diferentes. As amostras de βΑμ34-424 (a) e βΑμ-ιη23 (b) , solubilizadas em DDM, foram parcialmente purificadas em colunas de agarose Ni-NTA, permitindo a permuta entre vários detergentes: DDM (quadrados), DM (triângulos), OG (triângulos invertidos), LDAO (diamantes) e NG (círculos). βΑμ é tão instável em OG, NG e LDAO que foi impossível medir qualquer actividade após a purificação a 6 °C. Os ensaios foram realizados de acordo com a descrição constante nos Métodos e a Tm é ilustrada entre as curvas e a linha descontínua. Os resultados correspondem a medições duplicadas concretizadas numa experiência representativa executada em paralelo. (c) Fotomicrografia de um cristal do mutante βΑμ-ιη23, que apresentou uma boa ordem por difracção de raios X.

Figura 7 Curva de termoestabilidade do βΑμ34-424 (Tm) . Foram realizados ensaios de ligação utilizando o [3H] -dihidroalprenolol (DHA) como radioligante, de acordo com a descrição constante em "Métodos". As amostras foram aquecidas durante 30 minutos, a diferentes temperaturas, antes do ensaio. Tm representa a temperatura em que a ligação se reduziu a 50%, valor ilustrado na forma de uma linha descontínua. Os pontos 78 de dados correspondem a duplicações de uma única experiência. Esta experiência foi repetida várias vezes, com resultados semelhantes.

Figura 8 Ensaios da saturação de ligação das membranas de PAR.34-424 e βΑΚ-ιη23. Os ensaios de ligação foram realizados de acordo com a descrição constante em "Métodos", utilizando [3H]-dihidroalprenolol (DHA) como radioligante; PAR34_424 (a) e βΑΚ-ιη23 (b) . Os gráficos de Scatchard são apresentados como inserções, em conjunto com os valores que correspondem a Bmax e KD. Os pontos de dados correspondem a duplicações concretizadas em duas experiências independentes, para cada proteina. Os dados foram analisados por regressão não linear através da aplicação Prism (GraphPad).

Figura 9 Alinhamento do receptor adrenérgico β de peru com os receptores humanos βΐ, β2 e β3.

Figura 10 Alinhamento dos receptores humanos da adenosina.

Figura 11 Alinhamento dos receptores da neurotensina.

Figura 12 Fluxograma que ilustra os dois formatos de ensaio diferentes dos ligantes ( + ) e (-) , utilizados para determinar a termoestabilidade do receptor.

Figura 13 Perfil farmacológico do receptor mutante A2a termoestável da adenosina, Rant21. Saturação da ligação de (A) antagonista e (B) agonista a receptores solubilizados. (C-F) Inibição da ligação de [3H]ZM241385 por concentrações crescentes de antagonistas (C) XAC e (D) teofilina e de agonistas (E) NECA e (F) R-PLA; a ligação de [3H]ZM241385 (10 nM) na ausência de ligante não marcado foi definida 79 para 100%. Cada receptor solubilizado foi incubado com ligantes durante uma hora, em gelo, num tampão de ligação (Tris 50mM, pH 7,5 e 0, 025% de DDM) com NaCl 400 mM (A, C-F). Os dados apresentados foram obtidos a partir de duas experiências independentes, com medições triplicadas para cada ponto de dados. Os valores de KD e Ki são facultados na Tabela (iii).

Figura 14 Os mutantes termoestáveis apresentam uma dependência lipidica reduzida (A) e uma elevada sobrevivência em concentrações mais altas de DDM (B), relativamente ao receptor de tipo selvagem quando submetidas a aquecimento. Os receptores foram solubilizados em 1% de DDM (diluído em Tris 50 mM, pH 7,5, e NaCl 400 mM) e imobilizados em agarose Ni-NTA para o passo IMAC. A alteração do tampão que contém a concentração apropriada de DDM e/ou lípidos foi realizada durante as lavagens e eluição das esferas Ni-NTA.

Figura 15 Mapeamento das mutações M90V, Y227A, A282L e F338M m23 no receptor adrenérgico βΐ para os seus resíduos homólogos (M82, Y219, C265 e A321, respectivamente), na estrutura do receptor adrenérgico β2 humano (Rasmussen et al. (2007) Nature 15;383-387; códigos de admissão pdb 2R4R e 2R4S) revela a sua posição numa interface helicoidais e torção helicoidal, respectivamente. Os resíduos de aminoácidos em posições equivalentes às mutações termoestabilizadoras no receptor adrenérgico βΐ de peru são ilustrados como modelos marcados de preenchimento espacial.

Figura 16 Mapeamento das mutações m23 no receptor adrenérgico βΐ de peru para os resíduos homólogos na 80 estrutura do receptor adrenérgico β2 humano (Cherezov et al (2007) Science, 318:1258-65; código de admissão pdb 2RH1) . O vestígio Ca do 32AR é apresentado com a fracção de fusão removida (lisozima T4). As seis mutações no βAR-m23 (R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A, F338M) são equivalentes aos resíduos de aminoácidos K60, M82, Y219, C265, L310 e F321 no β2ΑΗ humano. Lys60 encontra-se na terminação intracelular da Hélice 1 e aponta para a interface lípido-água. Met82 encontra-se nas proximidades do centro da Hélice 2 e aponta para o bolso de ligação do ligante; a distância mais próxima entre o substrato do carazolol e a cadeia lateral da Met é de 5,7 Â. Tyr219 encontra-se em frente à terminação intracelular da hélice 5, na interface hélice5-hélice6. Cys265 encontra-se no fim da região de loop entre as hélices 5 e 6 e aponta em direcção oposta às regiões transmembranares. Leu310 e Phe321 encontram-se na hélice 7 e apontam para a bicamada lipídica.

Figura 17 Alinhamento múltiplo das sequências dos receptores beta-2AR humano, NTR1 de ratazana, beta-1 AR humano, de adenosina A2aR e de muscarina Ml humanos. As mutações termoestabilizadoras estão assinaladas, em cada cadeia, por uma caixa. As mutações que ocorrem em duas ou mais sequências estão assinaladas por uma estrela.

Figura 18 Mapeamento da mutação 155A betalAR de peru (147 beta2AR humana) para a estrutura beta2AR humana (código de admissão pdb 2RH1). A mutação encontra-se na interface entre as 3 hélices (Hl, torção H2, torção H7). Esquerda: vista lateral; direita: vista de topo. 81

Figura 19 Mapeamento da mutação V89L betalAR de peru (V81 beta2AR humana) para a estrutura beta2AR humana (código de admissão pdb 2RH1). A mutação encontra-se na torção da hélice 2. As hélices estão numeradas e o antagonista ligado é ilustrado como um modelo de preenchimento espacial. Os residuos de aminoácidos em posições equivalentes as mutações termoestabilizadoras no receptor adrenérgico βΐ de peru são apresentados como modelos de preenchimento espacial, assinalados por razões de clareza. Esquerda: vista lateral; direita: vista de topo.

Figura 20 Mapeamento da mutação M90V betalAR de peru (M82 beta2AR humana) para a estrutura beta2AR humana (código de admissão pdb 2RH1). A mutação encontra-se na torção da hélice 2, orientada para o bolso de ligação. As hélices estão numeradas e o antagonista ligado é ilustrado como um modelo de preenchimento espacial. Os residuos de aminoácidos em posições equivalentes às mutações termoestabilizadoras no receptor adrenérgico βΐ de peru são apresentados como modelos de preenchimento espacial, assinalados por razões de clareza. Esquerda: vista lateral; direita: vista de topo.

Figura 21 Mapeamento da mutação I129V betalAR de peru (1121 beta2AR humana) para a estrutura beta2AR humana (código de admissão pdb 2RH1). A mutação encontra-se em oposição à torção na hélice 5. As hélices estão numeradas e o antagonista ligado é ilustrado como um modelo de preenchimento espacial. Os residuos de aminoácidos em posições equivalentes às mutações termoestabilizadoras no receptor adrenérgico βΐ de peru são apresentados como modelos de preenchimento 82 espacial, assinalados por razões de clareza. Esquerda: vista lateral; direita: vista inferior.

Figura 22 Mapeamento da mutação F338M betalAR de peru (F321 beta2AR humana) para a estrutura beta2AR humana (código de admissão pdb 2RH1). A mutação encontra-se na torção da hélice 7. As hélices estão numeradas e o antagonista ligado é ilustrado como um modelo de preenchimento espacial. Os residuos de aminoácidos em posições equivalentes às mutações termoestabilizadoras no receptor adrenérgico βΐ de peru são apresentados como modelos de preenchimento espacial, assinalados por razões de clareza. Esquerda: vista lateral; direita: vista de topo.

Figura 23 Mapeamento da mutação Y227A betalAR de peru (Y219 beta2AR humana) para a estrutura beta2AR humana (código de admissão pdb 2RH1). A mutação encontra-se na interface hélice-hélice. As hélices estão numeradas e o antagonista ligado é ilustrado como um modelo de preenchimento espacial. Os residuos de aminoácidos em posições equivalentes às mutações termoestabilizadoras no receptor adrenérgico βΐ de peru são apresentados como modelos de preenchimento espacial, assinalados por razões de clareza. Esquerda: vista lateral; direita: vista inferior.

Figura 24 Mapeamento da mutação A282L betalAR de peru (C265 beta2AR humana) para a estrutura beta2AR humana (código de admissão pdb 2RH1). A mutação encontra-se na região de loop. As hélices estão numeradas e o antagonista ligado é ilustrado como um modelo de preenchimento espacial. Os resíduos de aminoácidos em posições equivalentes às mutações termoestabilizadoras no receptor adrenérgico βΐ de peru são apresentados 83 como modelos de preenchimento espacial, assinalados por razões de clareza. Esquerda: vista lateral; direita: vista de topo.

Figura 25 Mapeamento da mutação R68S betalAR de peru (K60 beta2AR humana) para a estrutura beta2AR humana (código de admissão pdb 2RH1). A mutação encontra-se no limiar lipido-água, apontando para o solvente. As hélices estão numeradas e o antagonista ligado é ilustrado como um modelo de preenchimento espacial. Os resíduos de aminoácidos em posições equivalentes às mutações termoestabilizadoras no receptor adrenérgico βΐ de peru são apresentados como modelos de preenchimento espacial, assinalados por razões de clareza. Esquerda: vista lateral; direita: vista superior com ângulo.

Figura 26 Comparação da termoestabilidade de três receptores β-adrenérgicos (βΐ de peru () , βΐ (T) β2 (·) humanos) e de dois receptores termoestabilizados (β1-ιη23 de peru (A) e β2-ιη23 humano (♦) ) . As seis mutações termoestabilizadoras no β1-ιη23 (R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A, F338M) foram directamente transferidas para o receptor β2 humano (K60S, M82V, Y219A, C265L, L310A, F321M), dando origem ao β2-ιη23, com base no alinhamento constante na Figura 9. Os mutantes resultantes foram transitoriamente expressos em células de mamíferos, solubilizados em 0,1 % de dodecilmaltósido e avaliados quanto à sua termoestabilidade no estado desprovido de ligante (através do aquecimento do apo-estado, arrefecimento brusco em gelo, adição de 3H-DHA). As Tm aparentes para βΐ e β2-ιη23 de peru foram de 23°C e 45°C, respectivamente, dando origem a um ATm de 22°C, tal como anteriormente observado para o receptor expresso 84 por E. coli. As Tm para β2 e β2-ιη23 humanos foram de 29°C e 41°C, respectivamente, demonstrando que o receptor apo foi estabilizado por uma temperatura de 12 °C. Tal exemplifica o principio da transmissibilidade das mutações termoestabilizadoras de um receptor para outro que, neste caso, lhe é idêntico em 59%. 0 receptor βΐ humano (Tm~12°C) é muito menos estável que o receptor βΐ de peru.

Figura 27 Percentagem de identidade do receptor adrenérgico βΐ de peru, receptor de adenosina humano e do receptor de neurotensina de ratazana relativamente aos receptores β-adrenérgicos, de adenosina e de neurotensina humanos, respectivamente.

Figura 28 Alinhamento dos receptores da neurotensina.

Exemplo 1: Estabilização conformacional do receptor β-adrenérgico numa forma resistente a detergentes

Resumo [0212] Existem mais de 500 receptores acoplados à proteina-G (GPCR) não aromatizantes codificados pelo genoma humano, muitos dos quais se prevêem como potenciais alvos terapêuticos, porém, está apenas disponível uma estrutura para representar a totalidade da família, a da rodopsina bovina. Existem vários motivos para a ausência de progressos na determinação estrutural do GPCR, mas colocamos a hipótese de que o reforço da estabilidade detersiva destes receptores e o seu simultâneo bloqueio na conformação preferencial irá melhorar significativamente a probabilidade de cristalização. Foi desenvolvida uma estratégia genérica para o isolamento de mutantes 85 termoestáveis solubilizados em detergentes com base na mutagénese de exploração de alanina, seguida por um ensaio de estabilidade do receptor. De 318 mutantes testados, 15 apresentaram um aumento mensurável de estabilidade. Após a optimização do residuo de aminoácido no local de cada mutação inicial, foi construido um receptor idealmente estável através da combinação de mutações especificas. 0 receptor mais estável, 3AR-m23, continha 6 mutações pontuais que conduziram a uma Tm 21°C mais elevada que a da proteina nativa e, na presença de antagonista ligado, era tão estável como a rodopsina bovina. Além disso, o pAR-m23 era significativamente mais estável numa vasta gama de detergentes ideais para cristalização e encontrava-se, principalmente, numa conformação antagonista na ausência de ligante.

Resultados

Selecção de mutações simples que aumentam a termoestabilidade do receptor adrenérgico βΐ [0213] 0 βAR de eritrócitos de peru é um alvo ideal para os estudos estruturais por se encontrar bem caracterizado e ser expresso em niveis elevados em células de insectos, através do sistema de expressão do baculovirus [10,11]. A melhor sobrexpressão do βAR é obtida através da utilização de uma versão truncada do receptor que contém os residuos 34-424 (3AR34_424) [9], tendo esta sido utilizada como ponto de partida para este trabalho. A mutagénese por exploração de alanina foi utilizada para definir os residuos de aminoácidos presentes no βAR34-424 que, quando mutados, alteraram a termoestabilidade do receptor; se estivesse presente um residuo de alanina na sequência seria mutado por um de leucina. Realizou-se um total de 318 mutações aos 86 resíduos de aminoácidos 37-369, uma região que engloba os sete domínios transmembranares e 23 resíduos de aminoácidos no terminal C; não foram obtidas mutações em 15 dos resíduos de aminoácidos devido à existência de uma firme estrutura secundária no modelo de DNA. Após a sequenciação de cada mutante para assegurar que apenas se encontrava presente a mutação desejada, os receptores foram funcionalmente expressos em E. coli e testados relativamente à estabilidade.

[0214] 0 ensaio para a termoestabilidade foi realizado em receptores não purificados solubilizados em detergente através do aquecimento a 32°C durante 30 minutos, seguido de arrefecimento brusco em gelo e, então, pelo ensaio de vinculação do radioligante, utilizando o antagonista [3H]-dihidroalprenolol para determinar o número de moléculas β AR.34-424 funcionais remanescentes em comparação com o controlo não aquecido. O aquecimento do βΑΚ34-424 não mutado anterior ao ensaio, a 32°C durante 30 minutos, reduziu a vinculação a aproximadamente 50% do controlo não aquecido (Fig. 7) ; todos os dados obtidos a partir dos mutantes foram normalizados pela inclusão do βΑΚ34_424 como controlo, em todos os ensaios realizados. No primeiro ciclo de exploração, 18 dos mutantes apresentaram um aparente aumento a nivel da estabilidade, mantendo mais de 75% da vinculação antagonista após aquecimento e expressão em E. coli até, pelo menos, 50% dos niveis do βΑΚ34_424 nativo. Tendo em vista a possibilidade de um aumento adicional da estabilidade destes mutantes, cada um dos 18 resíduos foi mutado por 2-5 resíduos de aminoácidos alternativos, com diversas dimensões ou cargas (Figura 1) . Destes 18 mutantes, 12 não sofreram qualquer melhoria através das alterações adicionais, 5 apresentaram uma melhor termoestabilidade na presença de outro aminoácido e 1 das 87 mutações da exploração inicial revelou ser um falso positivo. Adicionalmente, foram mutados os 3 residuos que não foram estabilizados aquando da mutação para alanina (V89, S151, L221) para uma série de outros resíduos de aminoácidos; as duas posições que não tiveram influência sobre a termoestabilidade aquando da mutação para alanina não foram, também, afectadas pelas alterações adicionais. Pelo contrário, V89 demonstrou uma menor termoestabilidade quando mutado para alanina, porém, esta aumentou quando o resíduo foi mutado para Leu. Assim, a primeira exploração de alanina forneceu com sucesso dois terços dos melhores resíduos de aminoácidos entre todos os testados para qualquer posição.

[0215] A determinação da posição e ambiente previstos para cada um dos 16 resíduos de aminoácidos que produziram o aumento da termoestabilidade quando mutados, foi realizada através do alinhamento da sequência do βΑ13 com a da rodopsina, cuja estrutura é conhecida (Figura 2). Catorze destes resíduos foram previstos como presentes nas hélices a transmembranares, cinco deles em frente ao limite lipídico, quatro profundamente embebidos e os restantes nas interfaces entre as hélices. Seria expectável que alguns destes resíduos interagissem entre si na estrutura do βΑ13, como os resíduos de aminoácidos consecutivos G67 e R68 (V63 e Q64 na rodopsina) ou os aminoácidos inseridos no aglomerado Y227, R229, V230 e A234 na hélice 5 (Y223, Q225, L226 e V230 na rodopsina) . Os outros resíduos de aminoácidos que poderiam interagir no βAR eram Q194A no loop externo 2 e D322A no loop externo 3 (G182 e P285 na rodopsina, respectivamente).

[0216] 0 aumento na estabilidade que cada mutação individual produziu no βAR34-424 foi determinado através da 88 medição da Tm para cada mutante (dados não representados); neste contexto, a Tm corresponde à temperatura que proporcionou um decréscimo de 50% na ligação funcional após aquecimento do receptor durante 30 minutos. Cada mutação elevou a Tm do βΑΚ34-424 em 1-3°C, com a excepção de M90A e Y227A, que a elevaram em 8°C.

Combinação de mutações para a produção de um receptor idealmente estável

[0217] Inicialmente, foram combinadas as mutações intensificadoras da termoestabilidade que se encontravam em posições adjacentes na sequência de aminoácidos primária do βΑϊΙ. As construções compostas pelas mutações G67A e R68S ou por diferentes combinações de mutações na terminação da hélice 5 (Y227A, R229Q, V230A e A234L) foram expressas e avaliadas; os valores de Tm (dados não representados) foram mais elevados em apenas 1-3°C do que os obtidos para o βAR34-424 , sendo um dos mutantes, na realidade, ligeiramente menos estável, o que sugere que a combinação de mutações em posições adjacentes na cadeia primária de aminoácidos não aumenta significativamente a termoestabilidade. Subsequentemente, foram combinadas as mutações previstas como estruturalmente distantes. Foram concretizadas reacções PCR com várias combinações de primers para produzir combinações aleatórias de até 5 mutações distintas e, então, testada a sua termoestabilidade (Tabela 1). A melhor destas combinações elevou a Tm em mais de 10°C relativamente à do βAR34-424 . Existiu, em alguns casos, um claro efeito aditivo sobre a Tm com a incorporação sequencial de mutações individuais. Isto pode ser observado numa série de 3 mutantes, m4-l, m4-7 e m4-2, com a adição de V230A ao m4-l a causar uma elevação da Tm em 2°C e com a mutação adicional D332A no m4-7 a causar uma elevação da Tm em mais 3°C. Todos os mutantes que continham Y227A e M90A 89 apresentaram uma elevação da Tm em 10°C ou mais. A junção de apenas estas duas mutações elevou a Tm do PAR34_424 em 13°C (m7-5), contudo, a vinculação do antagonista total ao βAR.34-424 foi inferior a 50%, o que sugere um comprometimento da expressão deste mutante. 0 acréscimo de F338M ao m7-5 não elevou a sua termoestabilidade, porém, aumentou os niveis de expressão funcional em E. coli.

Tabela 1 Combinações de mutações por PCR. Foram realizadas 10 reacções PCR com a combinação de diferentes pares de primers que continham as mutações seleccionadas. As reacções PCR bem sucedidas são apresentadas na tabela. A estabilidade destes novos mutantes foi avaliada através do procedimento descrito pela Figura 7 e foi calculada a Tm. Os resultados são mostrados como a média ± E.P. de duplicados. PCR Receptor Mutações Tm (°C) β AR34-424 31,7+0,1 4 m4-l G67A, G98A 35,5+0,9 m4-2 G67A, G98A, V230A, D322A 40,9+0,9 m4-6 G98A, D322A 35,0+0,2 m4-7 G67A, G98A, V230A 38,0+1,2 6 m6-l Y227A, A234L, A282L, A334L 41,6+0,9 1 B R68S, Y227A, A234L, A282L 41,6+0,1 LO 1 1 ^ B R68S, A234L, A282L, A334L 41,9+0,5 σ) 1 1 e R685, Y227A, A234L, A282L, A334L 43,7+0,4 m6-l 0 R68S, Y227A, A282L, A334L 47,4+1,1 m6-ll R68S, A282L, A334L 39,1+0,5 7 m7-l M90V, A282L, F338M 43,0+0,8 ml-2 M90V, A282L 38,9+0,6 m7-5 M90V, Y227A 45,2+1,0 90 PCR Receptor Mutações Tm (°C) m7-6 M90V, I129V 40,0+0,6 ml-l M90V, Y227A, F338M 45,2+2,0 10 mlO-4 R68S, M90V, V230A, A334L 46,9+1,0 mlO-8 R68S, M90V, V230A, F327A, A334L 47,3+1,4 [0218] Os mutantes obtidos com maior estabilidade, todos expressos em niveis elevados em E. coli, foram m6-10, m7-7 e mlO-8. Estes mutantes continham, colectivamente, um total de 10 mutações diferentes, 8 das quais em pelo menos dois dos mutantes. Foi realizado um segundo ciclo de mutagénese utilizando mlO-8 como modelo e adicionando ou substituindo as mutações presentes em m6-10 e m7-7 (Fig. 3) ; algumas destas mutações foram realizadas em posições muito próximas na sequência de aminoácidos primária do 3AR e, desse modo, não tiveram um efeito aditivo como o acima mencionado, porém, muitas elevaram ainda mais a Tm (Tabela 2) . Por exemplo, a alteração de duas mutações no mlO-8 para criar o ml8 elevou a Tm a 49,6°C e a adição de A282L para criar o m23 elevou-a em mais 3°C, até 52,8°C. Estas modificações produziram o mutante βΑΚ34_424 mais termoestável até ao momento, que será designado βΑΚ-ιη23.

Tabela 2 Aperfeiçoamento da melhor combinação de mutações. Estes novos mutantes foram obtidos através da mistura das alterações presentes nos mutantes m6-10, ml-l e mlO-8, por PCR. A estabilidade destes novos mutantes foi avaliada através do procedimento descrito pela Figura 7 e foi calculada a Tm. Os resultados são mostrados como a média ± E.P. de duplicados.

Mutações Tm (°C) ml 7 R68S M90V Y227A V230A F327A A334L 48,2+1, 4 91

Mutações Tm (°C) ml 8 R68S M90V Y227A V230A A382L F327A F338M 49,6+0/ 9 ml 9 R68S M90V Y327A A382L F327A F338M 49,0+0, 8 m2 0 R68S M90V F327A A334L 48,4+0, 7 m21 R68S M90V Y227A F327A A334L 47,0+1, 3 m22 R68S M90V Y227A F327A A334L 47,4+0, 5 m23 R68S M90V Y227A A282L F327A F338M 52,8+1, 4 [0219] Os ensaios de termoestabilidade utilizados para o desenvolvimento de mutantes do βΑΚ34-424 foram realizados através do aquecimento do receptor na ausência do antagonista, porém, é bem conhecido que a vinculação do ligante estabiliza os receptores. Por conseguinte, os ensaios de estabilidade para βΑΚ34-424 e βΑΚ-ιη23 foram repetidos com o antagonista ligado aos receptores durante o passo de aquecimento (Fig. 4) . Conforme esperado, a Tm do receptor que continha o antagonista ligado durante a incubação foi superior à do receptor sem o antagonista. Quando em ligação com o antagonista, a Tm do βΑΚ34-424 subiu 6°C e a do βΑΚ-ιη23 aumentou 2°C, para 55 °C; o menor incremento observado para ο βΑΚ-ιη23 aquando da ligação ao antagonista sugere que o receptor já se encontra numa conformação mais estável, semelhante ao estado ligado ao antagonista do βΑΚ34-424 (ver também mais abaixo) . A Tm para ο βΑ]3-ιη23 ligado ao antagonista é muito semelhante à do estado escuro da rodopsina em dodecilmaltósido (DDM)[12], cuja estrutura foi solucionada por dois laboratórios 92 independentes [13,14]. Tal sugere que ο βΑΚ-ιη23 é suficientemente estável para cristalização.

Caracterização do pAR-m23 [0220] As três actividades caracteristicas avaliadas em βΑΚ-ιη23 e βΑΡ34-424 para a identificação do efeito das seis mutações foram a afinidade da ligação antagonista, a eficácia relativa e capacidade do βΑ]3-ιη23 para o acoplamento de proteinas-G. As experiências de saturação de ligação realizadas em membranas com utilização do

antagonista [3H]-dihidroalprenolol (Figura 8) mostraram que a sua afinidade de ligação ao βΑΚ-ιη23 (KD 6,5 ± 0,2 nM, n=2) era ligeiramente inferior à da ligação ao βΑΚ34_424 (KD 2,8 ±0,1 nM, n=2), o que sugere a existência de grandes perturbações na estrutura do βΑΚιη23 na conformação ligada ao antagonista. Isto é consistente com a observação de que nenhuma das mutações no βΑϊ1-ιη23 corresponde aos aminoácidos que se acreditam estar implicados na vinculação ao ligante. Ao contrário da ligação antagonista, a eficácia da ligação agonista pelo βΑϊ1-ιη23 é inferior em 3 ordens de magnitude à obtida pelo βΑΚ34-424 (Fig. 5) . A potência do agonista isoprenalina é consistentemente mais baixa para BARm23 e βAR34-424 do que para o agonista isoprenalina nativo, o que indica que a conformação ligada ao agonista dos dois receptores provavelmente será semelhante. Contudo, a forte diminuição da eficácia do agonista no βAR-m23 relativamente à do βΑΒ3 4-424 indica que as 6 mutações realizadas no βΑΝ m23 bloquearam o receptor numa conformação preferencialmente ligada ao antagonista. Na perspectiva da cristalização, esta conformação é um bónus acrescido para a termoestabilização uma vez que a existência de uma população proteica conformacionalmente homogénea é essencial para a produção de cristais com qualidade de difracção. 93 [0221] Todos os ensaios de termoestabilidade utilizados para a derivação do βΑ13-ιη23 foram realizados em receptores solubilizados em DDM. 0 objectivo do processo de termoestabilização era a produção de um receptor ideal para cristalografia, o que implica ser estável numa série de detergentes diferentes e não apenas em DDM. Por conseguinte, testámos a estabilidade de βΑΚ-ιη23 e βΑΚ numa variedade de diferentes detergentes, concentrando-nos nos detergentes de pequenas dimensões, preferencialmente utilizados na cristalização de proteínas integrais da membrana. As membranas preparadas a partir de bactérias E. coli que expressam βΑΚ-ιη23 ou βΑΚ34_424 foram solubilizadas em DDM, ligadas a agarose Ni-NTA e, então, lavadas com DDM, decilmaltósido (DM), octilglucósido (OG), óxido de laurildimetilamina (LDAO) ou nonilglucósido (NG) . Foram realizados ensaios de estabilidade para os receptores em cada um dos diferentes detergentes (Fig.6). 0 βΑΚ34-424 foi apenas estável em DDM e DM, sem receptores activos na eluição da resina lavada com OG, NG ou LDAO. Em contraste, ο βΑΚ-ιη23 funcional estava ainda presente em todos os detergentes, podendo ser determinada a sua Tm. Conforme esperado, os detergentes de menores dimensões foram consideravelmente mais desnaturantes que DDM (Tm 52°C) ou DM (Tm 48°C), com valores de Tm de 25°C (NG), 23°C (LDAO) e 17°C (OG) . A diferença de Tm entre βΑΚ-ιη23 e βΑΚ34-424 é de cerca de 20°C, independentemente dos receptores terem sido solubilizados em DDM ou DM; não sendo, então, surpreendente que não se encontre qualquer βΑΚ34_424 activo até mesmo em NG uma vez que a Tm prevista é de cerca de 5°C, resultando então numa rápida inactivação do receptor sob as condições utilizadas para purificação. A estratégia de purificação utilizada para a produção de βΑΚ-ιη23 foi intencionalmente seleccionada para ter como base a termoestabilidade, por 94 ser muito mais simples de aplicar que a selecção de estabilidade em detergentes de agressividade crescente. Contudo, é evidente que a elevação da termoestabilidade do βAR34-424 também resultou num incremento da sua tolerância a detergentes de pequenas dimensões, ideais para a cristalização de proteínas integrais da membrana.

Cristalização do GPCR mutante [0222] As tentativas iniciais de cristalização de diversos constructos do receptor β-adrenérgico de peru falharam. Apesar de terem sido realizadas experiências com uma variedade de condições, utilizando tanto a sequência nativa como constructos truncados e com deleção do loop, não foram obtidos cristais.

[0223] Contudo, assim que as mutações estabilizadoras do βΑΚ-ιη23 foram transferidas para os constructos, foram obtidos diversos cristais em diferentes detergentes e condições.

[0224] Os cristais mais estudados até ao momento foram obtidos através da utilização do constructo purificado beta-36 (resíduos de aminoácidos 34-367 do receptor β de peru com as seguintes alterações: mutações pontuais C116L e C358A; as 6 mutações termoestabilizadoras presentes no m23; substituição dos resíduos de aminoácidos 244-278 pela sequência ASKRK; um marcador C-terminal His6) expressos em células de insectos através do sistema de expressão do baculovírus, após a transferência do receptor para o detergente octiltioglucósido. 0 precipitante utilizado foi PEG600 ou PEG1000 e os cristais obtidos têm a forma de placas alongadas.

[0225] Foram também realizadas experiências para verificar 95 se, após terem sido determinadas as condições de cristalização usando o receptor estabilizado, é possivel obter cristais utilizando o constructo não-estabilizado original. É possível que pudessem ter sido obtidos cristais semelhantes ou, então, de pequenas dimensões porém, na verdade, o "tipo selvagem" (ou seja, a estrutura a partir da qual foi iniciada a mutagénese) nunca deu origem a quaisquer cristais.

[0226] Os cristais têm a forma de placas com um grupo espacial C2 e apresentam uma boa difracção, apesar das dimensões da célula poderem variar em função das condições de congelamento utilizadas.

[0227] Em geral, uma vez estabilizado, o GPCR pode ser sujeito a uma série de técnicas bem conhecidas para a determinação estrutural. A técnica mais comum para a cristalização de proteínas da membrana é a difusão de vapor (20, 21), usualmente através da utilização de alguns milhares de condições de cristalização, configuradas através de dispositivos robóticos comerciais (22). Por vezes, contudo, os cristais formados por difusão de vapor são pequenos e desordenados, podendo então ser empregues técnicas adicionais. Uma técnica envolve a co-cristalização (por difusão de vapor) da proteína da membrana com anticorpos que se ligam especificamente a epítopos conformacionais na superfície proteica (23, 24); esta pode aumentar a superfície hidrofílica da proteína e formar fortes contactos de cristal. Uma segunda alternativa é a utilização de uma matriz de cristalização diferente, frequentemente designada por fase cúbica lipídica ou mesofase lipídica (25, 26), que pode também ser desenvolvida numa plataforma robótica (27). Esta provou ter sucesso na produção de cristais de elevada qualidade de 96 proteínas com pequenas superfícies hidrofílicas, por exemplo, a bacteriorodopsina (28) . As estruturas de proteínas da membrana podem também ser determinadas a alta resolução, por cristalografia de electrões (29).

[0228] A evolução do βΑΚ-ιη23 a partir do βΑΚ34-424 , pela combinação da mutagénese por exploração de alanina e da selecção de mutantes termoestáveis, resultou num GPCR ideal para cristalografia. A Tm para ο βΑΡ-ιη23 é 21°C mais elevada que para ο βΑΚ34-424 e, na presença de antagonista, o primeiro apresenta uma estabilidade semelhante para a rodopsina. 0 aumento da Tm do βΑΚ-ιη23 resultou num reforço da sua estabilidade para uma série de detergentes de pequenas dimensões que inactivam ο βΑΚ34-424 · Adicionalmente, a estratégia de selecção empregue resultou num receptor que se encontra numa conformação preferencialmente ligada ao antagonista, podendo também aumentar a probabilidade de obtenção de cristais uma vez que a população de conformações deste receptor será mais homogénea que a do βΑΗ.34-424 de tipo selvagem. Assim, obtivemos um processo de estabilização conformacional num único procedimento de selecção.

[0229] Não é de todo claro o motivo pelo qual a introdução de determinadas mutações conduziu à termoestabilização do receptor. As posições equivalentes na rodopsina sugerem que os resíduos de aminoácidos mutados poderiam estar direccionados à bicamada lipídica, no centro do receptor ou nas interfaces entre estes dois ambientes. Perante as dificuldades associadas à compreensão da complexidade da termoestabilização de proteínas solúveis [ 15], parece improvável que as proteínas da membrana sejam mais fáceis de compreender; constatámos não existir qualquer padrão nos resíduos de aminoácidos presentes no βΑΚ que, quando 97 mutado, conduzisse à sua termoestabilidade. Contudo, uma vez que cerca de 5% dos mutantes produzidos eram mais estáveis que o receptor nativo, a mutagénese por exploração de alanina representa uma estratégia eficiente para a rápida identificação de mutantes termoestáveis.

[0230] 0 procedimento utilizado para produzir o PAR-m23 é igualmente aplicável a qualquer proteina da membrana que tenha um ensaio conveniente para a detecção de actividade na forma solubilizada em detergente. Apesar de termos seleccionado a estabilidade enquanto função da temperatura como o parâmetro primário mais conveniente, o procedimento pode ser facilmente alargado para a avaliação primária da estabilidade, por exemplo, num detergente agressivo, extremo de pH ou presença de sais caotrópicos. A estabilização conformacional de uma variedade de receptores, canais e transportadores humanos irá torná-los muito mais maleáveis à cristalografia e irá, também, permitir uma melhoria na resolução de proteínas da membrana que já tenham sido cristalizadas. Esperamos que a estabilização conformacional permita que a cristalização de proteínas da membrana se torne um problema mais tratável, com uma maior probabilidade de resolução do que a actualmente existente. Esta deve permitir uma cristalização rotineira de proteínas membranares humanas na indústria farmacêutica, resultando na obtenção de informações estruturais de grande valor para o desenvolvimento de fármacos.

MÉTODOS

[0231] Materiais. 0 receptor adrenérgico βΐ truncado de peru (βΑΚ.34-424 ) [9] foi gentilmente fornecido pelo Dr. Tony Wame (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK) . Este constructo do βΑΚ que codifica os resíduos 34-424 98 contém a mutação C116L, para melhoria da expressão [11], e um marcador C-terminal de 10 histidinas, para purificação. 0 1-[4,6-propil-3H]-dihidroalprenolol ([3H]-DHA) foi fornecido pela Amersham Bioscience e o (+) bitartarato de L-norepinefrina, o (-) cloridrato de isoprenalina, o (-) tartarato de alprenolol e o cloreto de s-propranolol forma fornecidos pela Sigma.

[0232] Mutagénese do |5AR. O cDNA do PAR foi ligado ao pRGIII para possibilitar a expressão funcional do receptor em E. Coli na forma da proteína de fusão MalE [16] . Os mutantes foram gerados por PCR utilizando o plasmídeo de expressão como modelo, através da metodologia QuikChange II (Stratagene). As reacções PCR foram transformadas em células ultra-competentes XLIO-Gold (Stratagene) e os clones individuais foram completamente sequenciados para verificar se apenas se encontrava presente a mutação pretendida. As diferentes mutações foram aleatoriamente combinadas por PCR, através da inclusão de todos os pares de primers que introduziram as seguintes mutações: Mut4, G67A, G068A, V230A, D322A e F327A; Mut6, R068S, Y227A, A234L, A282L e A334L; Mut7, M90V, I129V, Y227A, A282L e F338M; MutlO, R68S, M90V, V230A, F327A e A334L. As misturas PCR foram transformadas e os clones sequenciados, para determinar exactamente que mutações foram introduzidas.

[0233] Expressão proteica e preparações membranares. A expressão do PAR e dos mutantes foi realizada em células XL10 (Stratagene) . As culturas de 50 ml de meio 2xTY com ampicilina (100 yg/ml) foram desenvolvidas a 37°C, com agitação até ser atingida uma OD6oo=3 e, então, induzidas com IPTG 0,4 mM. As culturas induzidas foram incubadas a 25°C durante 4 horas, as células foram colhidas por centrifugação a 13.000 xg durante 1 minuto (alíquotas de 2 99 ml) e armazenadas a -20°C. Para os ensaios, as células foram quebradas por congelação e descongelação (5 ciclos), ressuspensas em 500 μΐ de tampão [Tris 20 mM pH 8, NaCl 0,4 mM, EDTA lmM e inibidores de protease (Complete™, Roche)]. Após incubação com 100 yg/ml de lisozima e DNase I (Sigma), durante 1 hora a 4°C, as amostras foram solubilizadas com DMM a 2%, em gelo, durante 30 minutos. O material insolúvel foi removido por centrifugação (15.000 xg, 2 minutos, 4°C) e o sobrenadante directamente utilizado em ensaios de vinculação de radioligantes.

[0234] Para as preparações membranares de grande escala, foram desenvolvidos 2L e 6L da cultura E. coli de βΑΚ e Mut23, conforme acima descrito. As células foram colhidas por centrifugação a 5.000 xg durante 20 minutos, congeladas em nitrogénio líquido e armazenadas a -80°C. Os sedimentos foram ressuspensos em 10 ml de Tris 20 mM pH 7,5, com lx cocktail de inibidores de protease (Complete™ EDTA-free, Roche) ; adicionou-se 1 mg de DNase I (Sigma) e o volume final foi completado para 100 ml. As células foram quebradas por uma prensa francesa (2 passagens, 20.000 psi) e centrifugadas a 12.000 xg, durante 45 minutos a 4°C, para remoção dos detritos celulares. O sobrenadante (membranas) foi centrifugado a 200.000 xg durante 30 minutos a 4°C; os sedimentos membranares foram ressuspensos em 15 ml de Tris 20 mM, pH 7,5, e armazenados em aliquotas de 1 ml a -80°C, após arrefecimento rápido em nitrogénio liquido. A concentração proteica foi determinada através do método do negro amido [17]. Estas amostras foram utilizadas em ensaios de vinculação de ligantes, após lavagem e solubilização em DDM a 2%, conforme acima descrito.

[0235] Para os ensaios de competição, assim como para avaliação em diferentes detergentes, o PAR solubilizado em 100 DDM foi parcialmente purificado em agarose Ni-NTA (Qiagen). Foram adicionados 200 μΐ de agarose Ni-NTA a 2 ml de amostras solubilizadas (10 mg/ml de proteínas da membrana) em Tris 10 mM pH 8, NaCl 0,4 M, imidazol 20 mM pH 8 e incubadas durante 1 hora, a 4°C. Após incubação, as amostras foram centrifugadas a 13.000 xg durante 30 segundos e lavadas duas vezes com 250 μΐ de tampão (Tris 20mM pH 8, NaCl 0,4 M, imidazol 20 mM) com detergente (DDM a 0,1% , DM a 0,1% , LDAO a 0,1% , NG a 0,3% ou OG a 0,7%).

[0236] Os receptores foram eluídos em 2 x 100 μΐ de tampão (NaCl 0,4 mM, EDTA 1 mM, imidazol 250 mM pH 8, acrescidos do detergente relevante). A KD para a ligação de [3H]-DHA a βAR.34-424 e PAR-m23, semi-purifiçados, foi de 3,7 nM e 12,5 nM, respectivamente, sendo a concentração final de [3H]-DHA utilizada nos ensaios de competição 3 vezes superior à KD, ou seja, de 12 nM para o PAR34_424 e de 40 nM para o 3AR-m23.

[0237] Vinculação radioligante e ensaios de termoestabilidade. Os ensaios de ligação de ponto único continham Tris 20 mM pH 8, NaCl 0,4 mM, EDTA 1 mM, DDM a 0,1% (ou detergente correspondente) com [3H]-DHA 50 nM e 20-100 pg de proteínas da membrana, num volume final de 120 μΐ; a equilibração ocorreu durante 1 hora, a 4°C. A termoestabilidade foi avaliada através da incubação da mistura de ensaio, com ou sem [3H]-DHA, à temperatura especificada, durante 30 minutos; as reacções foram colocadas em gelo adicionando, conforme necessário, [3H] — DHA e equilibradas durante mais uma hora. O radioligante vinculado ao receptor foi separado do livre por filtração em gel, conforme anteriormente descrito [18]. A ligação não específica foi determinada na presença de 1 μΜ de s-propranolol. As curvas de saturação foram obtidas a partir de um intervalo de concentrações de [3H]-DHA entre 0,4 nM e 101 100 nM. Os ensaios de competição foram realizados utilizando uma concentração de [1 2 3 4H] -DHA de 12 mM para o β AR34-424 e de 40 mM para o 3AR-m23 (ou seja, 3 vezes superior à KD) e várias concentrações de ligantes não marcados (0-100 mM). A radioactividade foi determinada através de um contador de cintilação liquido Beckman LS6000 e os dados foram analisados por regressão não linear utilizando a aplicação Prism (GraphPad).

[0238] Localização das mutações termoestáveis do pAR-m23 na estrutura da rodopsina. O ficheiro pdb para a estrutura da rodopsina, código de admissão 1GZM [14], foi descarregado do sitio Web do Protein Data Bank (www.pdb.org) e apresentado na aplicação PyMOLXllHybrid (DeLano Scientific). Os resíduos de aminoácidos equivalentes na rodopsina para as mutações no PAR foram localizados na estrutura da mesma com base num alinhamento entre os quatro GPCR que nos são mais familiares, nomeadamente, a rodopsina e os receptores adrenérgico βΐ, de neurotensina e de adenosina A2a [19]·

Exemplo 2: Mutantes do receptor de adenosina A2a (A2aR) com elevada termoestabilidade 102 1 [0239] 2

Foram produzidos 315 mutantes direccionados entre os resíduos 2-316 do A2aR. 3

Todos estes mutantes foram avaliados quanto à sua termoestabilidade através de um ensaio que mede a ligação agonista e antagonista após o passo de aquecimento (formato (-) Ligante, Figura 12). 4 a. 26 mutantes apresentaram uma maior estabilidade quando avaliados com 4H-NECA (agonista): G114 A, G118A, L167A, A184L, R199A, A203L, L208A, Q210A, S213A, E219A, R220A, S223A, T224A, Q226A, K227A, H230A, L241A, P260A, S263A, L267A, L272A, T279A, N284A, Q311A, P313A, K315A. b. 18 mutantes apresentaram uma maior estabilidade quando avaliados com 3H-ZM241385 (antagonista): A54L, V57A, H75A, T88A, r G114A, G118A, T119A, K122A, G123A, P149A, E151A, G152A, A203L, A204L, A231L, L235A, V239A. origem a 0 A2aR de 31 °C. 3. As mutações foram combinadas para dar mutantes numa suposta conformação antagonista, tipo selvagem ligado ao ZM2413 85 tem uma Tm de a. Rantl7 A54L+K122A+L235A com uma Tm de 48°C (ligado ao ZM241385) b. Rant 19 A54L, T88A, V239A+A204L com uma Tm de 47°C (ligado ao ZM241385) c. Rant21 A54L, T88A, V239A+K122A com uma Tm de 49°C (ligado ao ZM241385) 4. As mutações da exploração agonista foram combinadas, porém, apenas conduziram a um nivel muito reduzido de melhoria da Tm de +2°C.

Tabela (i) . Lista de mutações estabilizadoras no A2aR. Os mutantes foram expressos em E. coli, solubilizados em DDM a 2% + glicerol a 10% e testados para a vinculação de ligantes utilizando o agonista [3H]-NECA (à direita) e o antagonista [3H]-ZM241385 (esquerda). As concentrações de radioligantes encontravam-se entre 6-10 vezes acima da KD medida para o receptor de tipo selvagem. A expressão do receptor activo foi avaliada por vinculação de ligantes, a 103 4°C. A estabilidade foi analisada através de aquecimento do receptor solubilizado, no estado apo, a 30°C durante 30 minutos, seguido pela avaliação da actividade de ligação residual. Sob estas condições, a actividade do tipo selvagem é reduzida a 50% (DP = 15%). Os dados obtidos para a expressão e estabilidade foram normalizados em função dos conseguidos pelo receptor de tipo selvagem. As mutações incluidas nos ciclos de mutagénese subsequentes foram aquelas cuja expressão foi ã 30-40% e cuja estabilidade foi ^ 130-140%, comparativamente ao tipo selvagem. As linhas a negrito indicam a aglomeração de mutações.

Agonista Antagonista

Mutação Expressão (%) Estabilidade (%) Mutação Expressão (%) Estabilidade (%) peso 100 100 peso 100 100 S090A 151 151 A054L 90 140 G114A 62 143 V057A 44 144 G118A 71 151 H075A 82 152 L167A 41 174 T088A 67 230 A184L 140 150 G114A 73 153 R199A 73 202 G118A 84 148 A203L 42 172 T119A 90 148 L208A 276 215 K122A 52 153 Q210A 46 155 G123A 90 158 S213A 40 140 P149A 54 215 E219A 96 221 E151A 63 173 R220A 84 250 G142A 70 156 S223A 57 146 A203L 111 132 T224A 142 276 A204L 40 181 Q226A 119 217 A231L 90 148 K227A 87 222 L235A 85 140 H230A 57 154 V239A 91 134 L241A 139 156 P260A 70 169 104 S263A 60 158 L267A 40 187 L272A 34 157 T279A 125 158 N284A 64 151 Q311A 49 164 P313A 44 148 K315A 64 186

Tabela (ii). Estabilidade das melhores combinações. Os receptores foram solubilizados em DDM a 1% (sem glicerol). Foi obtido um perfil de fusão através do aquecimento do receptor solubilizado a diferentes temperaturas, na ausência (estado apo) ou presença de ligante (estado ocupado pelo ligante). Os dados ilustrados são representativos de, pelo menos, três experiências independentes. 0 DP é < 1 °C.

Tm (°C) |t„ (°C) - + j — + agoni sta agoni sta jantago jnista antago nista 32 Peso 21 29 peso |31 Rag 1 (A184L/R199A/L272 A) 26 34 Rant 5 |42 (A54L/T8 8A/V2 | 39A) | 46 Rag 23 (Rag 1+F79A /L208A) 22 38 Rant 21 141 (Rant | 5+K122A) ! 49 105

Tabela (±±±). Resumo dos resultados obtidos nos ensaios de competição do A2aR de tipo selvagem solubilizado em detergente e do mutante termoestável Rant 21. Os valores são representativos de duas experiências independentes. Cada ponto de dados foi avaliado em triplicado e representado graficamente como a média ± DP. Cada receptor solubilizado foi incubado com ligantes durante uma hora, em gelo, num tampão de ligação (Tris 50 mM, pH 7,5 e 0,025% de DDM) com NaCl 400 mM. A ligação de [3H]ZM241385 (10 nM) na ausência de ligante não marcado foi definida para 100%. Os dados apresentados foram obtidos a partir de duas experiências independentes, com medições triplicadas para cada ponto de dados. A incubação das amostras com ligantes decorreu durante uma hora, em gelo, com [3H]ZM241385 a uma concentração de 10 nM. Os valores de Ki foram calculados de acordo com a equação de Cheng-Prusoff através da equação de regressão não linear da aplicação Prism, com aplicação de uma KD para o [3H]ZM241385 de 12 nM para o tipo selvagem e de 15 nM para o Rant21. O Rant21 não se ligou suficientemente à NECA para possibilitar uma determinação precisa da Ki (por isso indicada como >lxl0_1) . A afinidade do Rant21 para o antagonista é enfraquecida 232 vezes para R-PIA e, pelo menos, 1900 vezes para NECA.

Competidor XAC iKi (M) ---------——------------- Ipeso |2,3 X 16~6 |Rant 21 !2,3 X 10"5 Teofilina jl,5 X IO-3 ]0, 9 X IO-3 NECA [TTo X IO-6 j>l x 10_1 R-PIA 11.6 X 10-5 |3, 6 X IO-3 106

Tabela (iv). Resumo de resultados obtidos nos ensaios de saturação com À2aR de tipo selvagem solubilizado em detergente e mutantes termoestáveis. Os valores são representativos de três experiências independentes. Cada ponto de dados foi avaliado em triplicado e representado graficamente como a média ± DP. Os dados foram filtrados para a equação de Michaelis-Menten através da equação de regressão não linear da aplicação Prism.

Receptor |KD (nM) [3H]NECA (agonista) [3H]ZM241385 (antagonista) peso 132 ± 1 12 ± 3 Rag 1 ]26 ± 0.4 26 ± 0.5 Rag 2 3 21 ± 1 62 ± 1 Rant 21 >450 15 ± 3

Tabela (v) . Resumo da estabilidade de receptores de tipo selvagem mutantes em diferentes detergentes A solubilização de receptores e a troca de detergente foram realizadas durante o passo IMAC. 0 DP é < 1°C. Não foi possivel determinar a Tm para algumas combinações receptor- detergente por o receptor ser demasiado instável (t).

Tm (°C)

Vinculação agonista ^Vinculação antagonista peso |Rag 23 |peso Rant 21 39 0,01% de DDM 27 134 12 5 0,1% de DM 23 12 9 110 28 25 0,3% de NM 22 5 2 8 |<4 0,3% de NG t jt jt 22 0,6% de OG <9 ] 16 jt 23 107

Tm (°C)

Vinculação agonista |Vinculação antagonista peso |Rag 23 |peso Rant 21 0,003% de LDAO 28 j 38 132 42 0,006% de FC12 37 13 9 143 49

Exemplo 3: Mutantes do receptor de neurotensina (NTR) com elevada termoestabilidade [0240]

1. Foram produzidos 340 mutantes direccionados entre os resíduos 61-400 do NTR 2. Inicialmente, todos estes mutantes foram avaliados quanto à sua termoestabilidade através de um ensaio com a medição da ligação à 3H-neurotensina (agonista), após o passo de aquecimento. 24 mutações conduziram a um pequeno mas significativo aumento a nível da

termoestabilidade. A356L, H103A, D345A, A86L, A385L Y349A, C386A, K397A, H393A, 1116A, F358A, S108A, M181A R392A, D113A, G209A, L205A, L72A, A120L, P399A, Y351A V268A, T207A, A155L, S362A, F189A, N262A, L109A, W391A T179A, S182A, M293A, L256A, F147A, D139A, S100A, K176A LI1IA, A90L, N270A. 3. Os mutantes testados para a termoestabilidade por aquecimento na ausência do agonista foram reavaliados através de um ensaio ligeiramente diferente, onde foram aquecidos na presença de 3H-neurotensina (formato Ligante(+), Figura 12). Os mutantes com uma termoestabilidade melhorada são: A69L, A73L, A86L, A90L, H103A, V165A, E166A, G215A, V229A, M250A, I253A, A177L, 108 R183A, Ι260Α, Τ279Α, Τ294Α, G306A, L308A, V309A, L310A, V313A, F342A, F358A, V360A, S362A, Ν370Α, S373A, F380A, A385L, Ρ389Α, G390A, R395A. 4. Existem também mutantes que apresentam um nível de expressão significativamente reforçado em relação ao do receptor de tipo selvagem, que poderiam ser utilizados para impulsionar os níveis de produção do receptor para cristalização: A86L, H103A, F358A, S362A, N370A, A385L, G390A. Todos estes apresentam uma elevada termoestabilidade. 5. As combinações preferenciais são a. Nag7m F358A+A86L+I260A+F342A, Tm de 51°C (ligado à neurotensina) b. Nag7n F358A+H103A+I260A+F342A, Tm de 51°C (ligado à neurotensina) 0 NTR de tipo selvagem tem uma Tm de 35 °C com ligação à neurotensina.

Exemplo 4: Identificação dos padrões estruturais em que se encontram as mutações estabilizadoras GPCR

[0241] A estrutura do receptor adrenérgico β2 (20, 21) foi determinada como sendo 59% idêntica à do receptor adrenérgico βΐ de peru, porém com um perfil farmacológico claramente diferente (22, 23) . De modo a determinar os padrões estruturais em que se encontram as mutações estabilizadoras do receptor βΐ de peru, procedemos ao seu mapeamento sobre a estrutura do β2 humano (21).

[0242] Os receptores β-adrenérgicos foram inicialmente alinhados através da aplicação ClustalW do pacote de 109 software MacVector; as mutações termoestabilizadoras no βΐ de peru foram destacadas em conjunto com o resíduo correspondente na sequência β2 humana. 0 modelo β2 humano (código de admissão pdb 2RH1) foi visualizado no Pymol e os aminoácidos pretendidos foram ilustrados como modelos de preenchimento espacial através de procedimentos genéricos conhecidos na área. Os padrões estruturais em que foram localizadas as mutações estabilizadoras foram determinados por inspecção visual.

[0243] A Tabela (vi) apresenta as posições equivalentes no receptor β2 que correspondem às mutações termoestabilizadoras no βΑΚ-ιη23 e os padrões estruturais em que estas se situam.

[0244] Conforme pode ser observado na Tabela (vi), as mutações encontram-se posicionadas em várias localizações diferentes. Três das mutações estão presentes nas regiões de loop que se prevêem ser acessíveis ao solvente aquoso (loop). Oito das mutações estão presentes nas hélices transmembranares α direccionadas para o interior da bicamada lipídica (lípido), três das quais nas proximidades da terminação das hélices e podem ser consideradas como presentes na camada limite hidrofílica (limite lipídico). Oito das mutações estão presentes entre as hélices α transmembranares (interface hélice-hélice) , três das quais inseridas quer numa região de torção quer numa região distorcida da hélice (torção) e outras duas ocorrem numa hélice mas estão adjacentes a uma ou mais das demais hélices que contêm uma torção espacialmente adjacente ao resíduo mutado (torção oposta). Estas últimas mutações poderiam afectar o acondicionamento dos aminoácidos no interior da região torcida, o que poderia conduzir à 110 termoestabilização. Outra das mutações está presente num bolsa de ligação do substrato (bolso).

Tabela (vi) Posição na estrutura β2 humana dos resíduos de aminoácidos equivalentes às mutações termoestabilizadoras encontradas no receptor βΐ de peru e padrões estruturais em que estas se encontram. βΐ de peru |β2 humanojDescrição Hélice 1 I55A jl47 jinterface da torção dajFig. 1 jhélice 3 §18 Hélice 1 G67A §A59 jlimite lipidico j Hélice 1 R68S |K60 jlimite lipidico jFig. 1 ! I25 Hélice 2 V89L jV81 jtorção jFig. ! 1 l19 Hélice 2 M90V jM82 jtorção jFig. 1 ! I20 Hélice 2 G98A | G 9 0 jbolso j Hélice 3 1129V S151E §1121 S143 \loop da torção oposta |Fig. 1 | ] 21 Hélice 4 V160A Q194A |V152 A186 jloop lipidico j Hélice 5 L221V |V213 jlípido j Hélice 5 Y227A § Y219 jinterface hélice-jFig. \ jhélice |23 Hélice R229Q |R221 jlípido j 111 βΐ de peru !β2 humano(Descrição 1 Hélice 5 V230A 1V222 |interface (hélice hélice-( Hélice A234L | A22 6 ΐ interface hélice-( 5 j (hélice Hélice A282L D322A |C265 K305(limite lipidico do(Fig. 6 § \loop (24 Hélice F327A |l310 (lipido 7 $ Hélice A334L V317 (lipido $ 7 ! ( Hélice F338M ÍF321 (torção (Fig. 7 5 (22 [0245] Estes padrões estruturais, em virtude de conterem mutações estabilizadoras, são importantes na determinação da estabilidade da proteina. Assim, o direccionamento de mutações a estes padrões facilitará a produção de GPCR mutantes estabilizados. De facto, existiram vários casos em que foi mapeada mais do que uma mutação sobre o mesmo padrão estrutural. Por exemplo, as mutações Y227A, V230A e A234L no receptor adrenérgico βΐ de peru mapeadas sobre a interface helicoidal, as mutações V89L e M90V mapeadas sobre a mesma torção helicoidal e as mutações F327A e A334L mapeadas sobre a mesma superfície helicoidal, direccionada à bicamada lipidica (Tabela (vi)). Assim, quando uma mutação estabilizadora tiver sido identificada, a determinação do padrão estrutural em que tal mutação se encontra irá permitir a identificação de outras mutações do mesmo tipo. 112 BIBLIOGRAFIA [0246] 1. S. H. White (2004) Protein Sei 13, 1948-1949. 2. C. G. Tate (2001) FEBS Left 504, 94-98. 3. R. Grisshammer, C. G. Tate (1995) Q Rev Biophys 28, 315-422 . 4. J. U. Bowie (2001) Curr Opin Struct Biol 11, 397-402. 5. F. W. Lau, S. Nauli, Y. Zhou, J. U. Bowie (1999) J Mol Biol 290, 559-564. 6. Y. Zhou, J. U. Bowie (2000) J Biol Chem 275, 6975-6979. 7. S. Faham, D. Yang, E. Bare, S. Yohannan, J. P. Whitelegge, J. U. Bowie (2004) J Mol Biol 335, 297-305. 8. Y. Yarden, H. Rodriguez, S. K. Wong, D. R. Brandt, D. C. May, J. Burnier, R. N. Harkins, E. Y. Chen, J. Ramachandran, A. Ullrich, et al (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 6795-6799. 9. T. Warne, J. Chirnside, G. F. Schertler (2003) Biochim Biophys Acta 1610, 133-140. 10. E. M. Parker, E. M. Ross (1991) J Biol Chem 266, 9987-9996. 11. E. M. Parker, K. Kameyama, T. Higashijima, E. M. Ross (1991) J Biol Chem 266, 519-527. 113 12. W. J. Degrip (1982) Methods in Enzymology 81, 256- 265. 13. K. Palczewski, T. Kumasaka, T. Hori, C. A. Behnke, H. Motoshima, B. A. Fox, I. Le Trong, D. C. Teller, T. Okada, R. E. Stenkamp, et al (2000) Science 289, 739- 745. 14. J. Li, P. C. Edwards, M. Burghainmer, C. Villa, G. F.

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Chem 115

Claims (22)

1. Reivindicações 1. Um método de selecção de um receptor acoplado á proteína-G {GPCR) com elevada estabilidade conformacional, caracterizado por compreender (a) fornecer um ou mais mutantes de um GPCR precursor, (b) seleccionar um ligante de uma determinada classe, sendo este um ligante que se vincula ao GPCR precursor quando o GPCR se encontra numa determinada conformação, (c) determinar se o GPCR mutante ou cada GPCR mutante tem uma elevada estabilidade conformacional no que concerne à vinculação do ligante seleccionado, quando comparada com a estabilidade do precursor em relação à ligação desse mesmo ligante, através da medição da desnaturação expressa pela perda de capacidade de vinculação do ligante, sob condições desnaturantes tais como o calor, a presença de um detergente, agente caotrópico ou extremo de pH, e (d) seleccionar os mutantes que apresentam uma estabilidade conformacional reforçada face à do precursor em relação à vinculação desse mesmo ligante; onde a conformação especifica em que se encontra o GPCR no passo (c) corresponde à mesma classe de ligantes que o ligante seleccionado no passo (b).
2. 2. Um método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por um ou mais mutantes serem postos em contacto com o ligante seleccionado antes do passo (c). 1
3. 3, Um método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por um ou mais mutantes serem fornecidos numa forma solubilizada.
4. 4. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado por o ligante seleccionado ser da classe agonista de ligantes e a sua conformação especifica ser uma conformação agonista ou ser da classe antagonista de ligantes e a sua conformação específica ser uma conformação antagonista.
5. 5. Um método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o ligante seleccionado ser da classe agonista e a conformação específica em que se encontra o GPCR no passo (c) ser a conformação agonista.
6. 6. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a afinidade de vinculação do mutante para o ligante seleccionado ser substancialmente igual ou superior à afinidade de vinculação do precursor para o ligante seleccionado.
7. 7. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser repetido por um ou mais ciclos nos quais os mutantes seleccionados apresentam uma elevada estabilidade conformacional no passo (a) representando o GPCR precursor num ciclo subsequente do método.
8. 8. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 caracterizado por ser seleccionado um GPCR mutante com uma estabilidade reforçada para qualquer das seguintes condições: calor, detergente, agente caotrópico ou extremo de pH. 2
9. 9. Um método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por ser seleccionado um GPCR mutante com elevada termoestabilidade.
10. 10. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por o ligante ser um agonista total ou um agonista parcial ou inverso, ou um antagonista.
11. 11. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por o ligante ser um polipéptido que se liga ao GPCR.
12. 12. Um método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o polipéptido ser qualquer um dos seguintes: anticorpo, anquirina, proteína G, proteína RGS, arrestina, quinase GPCR, quinase do receptor da tirosina, RAMP, NSF, GPCR, subunidades do receptor NMDA, NRl ou NR2a, DRD1IP, uma estrutura de domínio da fibronectina, ou um fragmento ou derivado destes que se liga ao GPCR.
13. 13. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por no passo (b) serem seleccionados dois ou mais ligantes, cuja presença mantém o GPCR na mesma conformação específica.
14. 14. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser seleccionado um GPCR mutante com capacidade reduzida de vinculação a um ligante de uma classe diferente da do ligante seleccionado no passo (b) em comparação com o seu precursor. 3
15. 15. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o GPCR ser qualquer um dos seguintes: receptor β-adrenérgico, receptor da adenosina e receptor da neurotensina.
16. 16. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por o ligante ser marcado de forma detectável.
17. 17. Um método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o ligante ser marcado por fluorescência.
18. 18. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por o passo (c) envolver o uso de FRET.
19. 19. Um método de preparação de um GPCR mutante, caracterizado por compreender (a) executar o método de qualquer uma das reivindicações 1-18, (b) identificar a posição ou posições do resíduo ou resíduos de aminoácidos no mutante ou mutantes do GPCR que tenham sido seleccionadas pela elevada estabilidade conformacional, e (c) sintetizar um GPCR mutante que contém um aminoácido de substituição numa ou mais das posições identificadas.
20. 20. Um método de acordo com a reivindicação 19 caracterizado por o GPCR mutante conter uma pluralidade de mutações relativamente ao GPCR precursor. 4
21. 21. Um método de acordo com a reivindicação 1 ou 19, caracterizado por ser determinado se o GPCR mutante seleccionado ou preparado é capaz de se vincular a uma proteina-G.
22. 22. Um método de acordo com a reivindicação 1 ou 19, caracterizado por ser determinado se o GPCR mutante seleccionado ou preparado é capaz de vincular uma pluralidade de ligantes da mesma classe que o ligante seleccionado com uma extensão e/ou ordem de classificação de afinidade comparáveis às do GPCR precursor. 5