CN104151401A - 融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法及其使用的蛋白片断 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的蛋白片段，其特征在于：为一种Bril蛋白片段或与该片段序列同源性大于90％的蛋白；或为一种T4L蛋白片段或与该片段序列同源性大于90％的蛋白。本发明还通过尝试在离子通道蛋白及运输蛋白的N-末端、C-末端或膜内环区插入BRIL，和T4L等融合蛋白片段构建融合蛋白表达质粒，从而改进其体外稳定性及可结晶性。成功得到稳定性好，表达量高，并可结晶的离子通道及运输蛋白。

Description

融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法及其使用的蛋白片断
技术领域
本发明涉及基因工程领域，更具体地，本发明涉及一种融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法及其使用的蛋白片断。
背景技术
离子通道蛋白(Ion channel)是一种成孔蛋白，它通过允许某种特定类型的离子依靠电化学梯度穿过该通道，来帮助细胞建立和控制质膜间的微弱电压压差。这些离子通道存在于所有细胞的细胞膜上。离子通道按离子分可以分为氯离子通道族，钾离子通道族，钠离子通道族，钙离子通道族，质子通道族和泛离子通道族
运输蛋白(transport protein)，能选择性地使非自由扩散的小分子物质透过质膜。运输蛋白能够使不溶于脂的绝大多数代谢上重要的分子和无机离子，可以有效地进出活细胞，而且有精细的控制机制，使其在细胞内外达到适度的浓度梯度，形成一定的膜电位差。运输蛋白根据作用方式分成三类：载体蛋白(carrier protein)、通道蛋白(channel protein)、离子泵(ion pump)。
由于电压激活的通道是神经冲动的基础，而传输激活的通道则负责触突之间的信号传导，因此离子通道及运输蛋白在神经系统里面扮演着极为重要的角色。事实上大多数生物的攻击性或者防御性神经毒素，都是通过调整通道的传导性以及动力学特征，来达到关闭或者麻痹系统的目的的。此外，离子通道及运输蛋白对于涉及细胞中快速变化的大量生物学过程也是一个关键结构。例如心肌、骨骼肌以及平滑肌的肌肉收缩过程，向上皮传输营养物质和离子，T细胞的激活，以及胰脏beta细胞释放胰岛素的过程。在研究新型药物的时候，离子通道及运输蛋白是一个非常常见的研究目标。
由于离子通道及运输蛋白在体内具有重要的生理功能，对离子通道及运输蛋白的结构和功能研究一直是一个很重要的研究热点和难点。然而，天然的离子通道及运输蛋白在体外并不稳定，很难得到高纯度的稳定的离子通道及运输蛋白。
近年来，有多个研究小组报道了从原核表达系统中纯化得到不同种属的离子通道蛋白并得到相应的晶体结构。目前的研究主要集中在对来源于原核生物的离子通道及运输蛋白，国内外鲜有对人源性的离子通道及运输蛋白有过表达纯化和结晶的报道。其主要原因是因为离子通道蛋白和运输蛋白可溶性很差，稳定性比较低，难以通过体外重组表达得到大量的稳定蛋白用于研究。本发明提供了一种融合表达离子通道及运输蛋白的方法，可应用于解决包括人源性离子通道蛋白和运输蛋白的体外稳定高表达问题。
发明内容
本发明旨在克服上述缺陷，解决离子通道及运输蛋白在体外重组表达所遇到的问题，为离子通道及运输蛋白的体外表达纯化，蛋白结晶提供技术平台，为离子通道及运输蛋白的结构研究和靶向离子通道及运输蛋白的药物研发打下基础。
本发明提供了一种应用BRIL或T4L蛋白片段进行离子通道蛋白及运输蛋白融合表达的新方法。
具体地，本发明提供了用于融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的蛋白片段，其特征在于：为一种Bril蛋白片段(氨基酸序列23-128，蛋白号：P0ABE7)或与该片段序列同源性大于90％的蛋白；或为一种T4L蛋白片段(氨基酸序列2-161，蛋白号：P00720)或与该片段序列同源性大于90％的蛋白。
其中，上述Bril蛋白片段或与该片段序列同源性大于90％的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1.1所示；上述T4L蛋白片段或与该片段序列同源性大于90％的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1.2所示。
此外，本发明还提供了上述Bril蛋白片段或与该片段序列同源性大于90％的蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.2.1所示；上述T4L蛋白片段或与该片段序列同源性大于90％的蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.2.2所示。
另外，本发明还提供了融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法，其特征在于：将上述蛋白片段的氨基酸序列插入到离子通道蛋白或运输蛋白的N-末端、C-末端或者膜内环区构建融合蛋白。
优选地，采用ASIC(酸敏感离子通道)及GLUT1(葡萄糖转运蛋白)。
具体地，本发明提供了含序列如SEQ ID NO.1.1，和序列如SEQ ID NO.1.2所示的离子通道融合表达蛋白在ASIC(酸敏感离子通道)及GLUT1(葡萄糖转运蛋白)的应用，即把上述BRIL,和T4L等蛋白片段插入到ASIC(酸离子通道)及GLUT1(葡萄糖转运蛋白)的不同区域(N-末端，C-末端或者膜内环区)构建融合蛋白。
进一步地说，即、将上述Bril蛋白片段与ASIC进行融合表达，得到的融合白蛋氨基酸序列如SEQ ID NO.3.1所示；或将上述T4L蛋白片段与ASIC进行融合表达，得到的融合白蛋氨基酸序列如SEQ ID NO.3.2所示。
以及，采用上述Bril蛋白片段构建的ASIC融合表达质粒，其蛋白序列如SEQ ID NO.4.1所示；或采用上述T4L蛋白片段构建的ASIC融合表达质粒，其蛋白序列如SEQ ID NO.4.2所示。
另外，本发明还将上述Bril蛋白片段与GLUT1进行融合表达，得到的融合白蛋氨基酸序列如SEQ ID NO.3.3所示；或将上述T4L蛋白片段与GLUT1进行融合表达，得到的融合白蛋氨基酸序列如SEQ ID NO.3.4所示。
以及，采用上述Bril蛋白片段构建的GLUT1融合表达质粒，其蛋白序列如SEQ ID NO.4.3所示；或采用上述T4L蛋白片段构建的GLUT1融合表达质粒，其蛋白序列如SEQ ID NO.4.4所示。
另外，本发明还发现上述人源性ASIC(酸离子通道)融合表达质粒可以在昆虫细胞(如:SF9、SF21、HiFive等)中表达，人源性GLUT1(葡萄糖转运蛋白)融合表达质粒在哺乳细胞(如:293,CHO等)中表达。
将上述中SEQ ID NO.4.1、SEQ ID NO.4.2、SEQ ID NO.4.3、SEQ ID NO.4.4所示的基因序列的构建到表达载体如：pFastBac1,PcDNA3.1，PET21b等上进行蛋白质表达。
本发明的作用和效果：
出于提高离子通道蛋白及运输蛋白可溶表达，及蛋白的稳定性考虑，本发明通过对目标离子通道及运输蛋白进行独特的改造，即、通过尝试在离子通道蛋白及运输蛋白的N-末端、C-末端或膜内环区插入BRIL,和T4L等融合蛋白片段构建融合蛋白表达质粒，从而改进其体外稳定性及可结晶性。成功得到稳定性好，表达量高，并可结晶的离子通道及运输蛋。
这类蛋白是非常重要的药物作用靶标蛋白，对这类蛋白的结构研究将有助于未来靶向离子通道及运输蛋白的药物的研究与开发。值得指出的是，根据本发明提供的方法，可广泛适用于各种离子通道及运输蛋白的研究。
经研究发现，本发明构建的融合蛋白既可以在昆虫细胞中表达，也可以在酵母中和哺乳动物细胞等细胞中进行表达，具有广泛的应用范围。
附图说明
附图1、两种ASIC1融合蛋白纯化后的电泳检测图；
其中，左图为T4L-ASIC融合蛋白；右图为BRIL-ASIC1融合蛋白。
附图2、两种ASIC1融合蛋白的UPLC检测图谱；
其中，左图为T4L-ASIC融合蛋白；右图为BRIL-ASIC1融合蛋白。
附图3、两种GLUT1融合蛋白纯化后的电泳检测图；
其中，左图为T4L-GLUT1融合蛋白；右图为BRIL-GLUT1融合蛋白。
附图4、两种GLUT1融合蛋白纯化后的电泳检测图；
其中，左图为T4L-GLUT1融合蛋白；右图为BRIL-GLUT1融合蛋白。
具体实施方式
本领域的技术人员能采用本领域熟知的方法能用于构建含BRIL,和T4L等蛋白片段的离子通道蛋白及运输蛋白融合表达质粒，这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等，所构建的离子通道蛋白及运输蛋白融合表达基因序列可以有效地连接到不同表达载体的适当启动子上，以指导mRNA合成。
构建好的质粒可以用本领域技术人员熟知的常规技术转染或转化到细胞，如可以用Bac-to-Bac技术把含融合表达基因的PFastBac载体转化到SF9细胞中进行表达，转化后细胞的培养和病毒的收集和传代等方法均为本领域技术人员所熟知的常规技术。
实施例1
ASIC1(酸敏感通道蛋白)融合蛋白的基因合成
化学合成
BRIL蛋白片段(氨基酸序列如SEQ ID NO.1.1所示)、核苷酸模板(SEQ IDNO.2.1)
(5’GCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAATGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAGCTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATTGATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACCCGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTG3’)，正向引物为:(5’CCCACCATCGGGCGCGGATCCATGCATCACCATCATCACCACCATCACGCTGATCTGGAAGACAATTGG3’)，反向引物为：(5’CCCCTGAAAGTACAGGTTTTCCAGGTACTTCTGAATGTATGC3’)，用PCR反应获得BRIL蛋白片段基因。
参考人类基因密码子，化学合成ASICI核苷酸模板(5’ATGGAACTGAAGGCCGAGGAGGAGGAGGTGGGTGGCGTCCAGCCGGTGAGCATCCAGGCCTTCGCCAGCAGCTCCACACTGCACGGCCTGGCCCACATCTTCTCCTACGAGCGCCTGTCTCTGAAGCGCGCACTGTGGGCCCTGTGCTTCCTGGGCTCCCTGGCTGTGCTGCTGTGTGTGTGCACGGAGCGCGTGCAGTACTACTTCCACTACCACCATGTCACCAAGCTCGACGAGGTGGCTGCCTCTCAGCTTACCTTCCCTGCTGTCACGCTGTGCAACCTCAACGAGTTCCGCTTTAGCCAAGTCTCCAAGAATGACCTGTATCATGCTGGCGAGCTGCTGGCCCTGCTCAACAACAGGTATGAGATACCAGACACACAGATGGCAGATGAAAAGCAGCTGGAGATACTGCAGGACAAAGCCAACTTCCGCAGCTTCAAACCCAAACCCTTCAACATGCGCGAGTTCTACGACCGCGCTGGCCACGACATTCGCGACATGCTGCTCTCCTGCCACTTCCGCGGCGAGGTCTGCAGCGCTGAAGACTTCAAGGTGGTCTTCACACGCTATGGAAAGTGCTACACGTTCAACTCCGGCCGCGATGGCCGCCCGCGCCTGAAGACCATGAAGGGTGGCACGGGCAATGGCCTGGAAATCATGCTGGACATCCAGCAGGACGAGTACCTGCCTGTGTGGGGCGAGACTGACGAGACGTCCTTCGAAGCAGGCATCAAAGTGCAGATCCATAGTCAGGATGAACCTCCTTTCATCGACCAGCTGGGCTTTGGCGTGGCCCCAGGCTTCCAGACCTTTGTGGCCTGCCAGGAGCAGCGCCTCATCTACCTGCCCCCACCCTGGGGCACCTGCAAAGCTGTTACCATGGACTCCGATTTGGATTTCTTCGACTCCTACAGCATCACTGCCTGCCGCATCGACTGTGAGACGCGCTACCTGGTGGAGAACTGCAACTGCCGCATGGTGCACATGCCAGGCGATGCCCCATACTGTACTCCAGAGCAGTACAAGGAGTGTGCAGATCCTGCTCTGGACTTCCTGGTGGAAAAGGACCAGGAGTACTGCGTGTGTGAAATGCCTTGCAACCTGACCCGCTATGGCAAAGAGCTGTCCATGGTCAAGATCCCCAGCAAAGCCTCAGCCAAGTACCTGGCCAAGAAGTTCAACAAATCTGAGCAATACATAGGCGAGAACATCCTGGTGCTGGACATTTTCTTTGAAGTCCTCAACTATGAGACCATTGAACAGAAGAAGGCCTATGAGATTGCAGGCCTCCTGGGTGACATCGGCGGCCAGATGGGCCTGTTCATCGGCGCCAGCATCCTCACGGTGCTGGAGCTCTTTGACTACGCCTACGAGGTCATTAAGCACAAGCTGTGCCGCCGCGGAAAATGCCAGAAGGAGGCCAAAAGGAGCAGTGCGGACAAGGGCGTGGCCCTCAGCCTGGACGACGTCAAAAGACACAACCCGTGCGAGAGCCTTCGCGGCCACCCTGCCGGCATGACATACGCTGCCAACATCCTGCCTCACCATCCGGCCCGCGGCACGTTCGAGGACTTTACCTGCTGA3’)，正向引物(5’GAAAACCTGTACTTTCAGGGGTCCACACTGCACGGCCTGGCCCACA3’)，反向引物(5’CTTGGTACCGCATGCCTCGAGTTACTTGTGCTTAATGACCTCGTAG3’)，用PCR反应获得基因ASICI(25-464)。正向引物(5’CCCACCATCGGGCGCGGATCCATGCATCACCATCATCACCACCATCACGAAAACCTGTACTTTCAG3’)，反向引物(5’CTTGGTACCGCATGCCTCGAGTTACTTGTGCTTAATGACCTCGTAG3’)，用PCR反应获得基因8*His-BRIL(23-128)-TEV-ASICI(25-464)。参照以上原理进行基因合成，正向引物引入限制性酶切位点BamHI，反向引物引入限制性酶切位点XhoI和终止密码子。
T4L蛋白(氨基酸如序列表1.2所示)其核苷酸模板如序列表2.2所示
(5’AACATCTTCGAGATGCTCCGTATCGACGAGGGCCTCAGGTTGAAGATCTATAAGGACACAGAGGGCTATTACACCATCGGTATTGGTCATCTCTTGACTAAGTCGCCTTCACTTAACGCAGCAAAATCCGAACTGGACAAGGCCATCGGTCGCAATACAAATGGTGTCATTACTAAGGACGAAGCTGAAAAGCTCTTCAACCAGGACGTTGATGCAGCTGTTCGCGGAATCCTGCGCAACGCAAAGCTCAAGCCGGTTTACGATTCTTTGGACGCCGTTCGCCGTGCGGCCTTGATTAACATGGTGTTTCAGATGGGTGAAACCGGAGTTGCAGGATTTACCAACTCGCTGAGGATGCTGCAACAAAAGAGATGGGACGAAGCCGCTGTGAATCTCGCCAAATCTAGGTGGTACAACCAGACACCCAATCGTGCGAAGAGAGTGATAACTACATTCCGCACCGGTACTTGGGACGCATAT
3’)，正向引物为:(5’CCCACCATCGGGCGCGGATCCATGCATCACCATCATCACCACCATCACAACATCTTCGAGATGCTCCGT3’)，反向引物为：(5’CCCCTGAAAGTACAGGTTTTCATATGCGTCCCAAGTACCGGTG3’)，用PCR反应获得T4L蛋白片段基因。
参考人类基因密码子，化学合成ASICI核苷酸模板(5’ATGGAACTGAAGGCCGAGGAGGAGGAGGTGGGTGGCGTCCAGCCGGTGAGCATCCAGGCCTTCGCCAGCAGCTCCACACTGCACGGCCTGGCCCACATCTTCTCCTACGAGCGCCTGTCTCTGAAGCGCGCACTGTGGGCCCTGTGCTTCCTGGGCTCCCTGGCTGTGCTGCTGTGTGTGTGCACGGAGCGCGTGCAGTACTACTTCCACTACCACCATGTCACCAAGCTCGACGAGGTGGCTGCCTCTCAGCTTACCTTCCCTGCTGTCACGCTGTGCAACCTCAACGAGTTCCGCTTTAGCCAAGTCTCCAAGAATGACCTGTATCATGCTGGCGAGCTGCTGGCCCTGCTCAACAACAGGTATGAGATACCAGACACACAGATGGCAGATGAAAAGCAGCTGGAGATACTGCAGGACAAAGCCAACTTCCGCAGCTTCAAACCCAAACCCTTCAACATGCGCGAGTTCTACGACCGCGCTGGCCACGACATTCGCGACATGCTGCTCTCCTGCCACTTCCGCGGCGAGGTCTGCAGCGCTGAAGACTTCAAGGTGGTCTTCACACGCTATGGAAAGTGCTACACGTTCAACTCCGGCCGCGATGGCCGCCCGCGCCTGAAGACCATGAAGGGTGGCACGGGCAATGGCCTGGAAATCATGCTGGACATCCAGCAGGACGAGTACCTGCCTGTGTGGGGCGAGACTGACGAGACGTCCTTCGAAGCAGGCATCAAAGTGCAGATCCATAGTCAGGATGAACCTCCTTTCATCGACCAGCTGGGCTTTGGCGTGGCCCCAGGCTTCCAGACCTTTGTGGCCTGCCAGGAGCAGCGCCTCATCTACCTGCCCCCACCCTGGGGCACCTGCAAAGCTGTTACCATGGACTCCGATTTGGATTTCTTCGACTCCTACAGCATCACTGCCTGCCGCATCGACTGTGAGACGCGCTACCTGGTGGAGAACTGCAACTGCCGCATGGTGCACATGCCAGGCGATGCCCCATACTGTACTCCAGAGCAGTACAAGGAGTGTGCAGATCCTGCTCTGGACTTCCTGGTGGAAAAGGACCAGGAGTACTGCGTGTGTGAAATGCCTTGCAACCTGACCCGCTATGGCAAAGAGCTGTCCATGGTCAAGATCCCCAGCAAAGCCTCAGCCAAGTACCTGGCCAAGAAGTTCAACAAATCTGAGCAATACATAGGCGAGAACATCCTGGTGCTGGACATTTTCTTTGAAGTCCTCAACTATGAGACCATTGAACAGAAGAAGGCCTATGAGATTGCAGGCCTCCTGGGTGACATCGGCGGCCAGATGGGCCTGTTCATCGGCGCCAGCATCCTCACGGTGCTGGAGCTCTTTGACTACGCCTACGAGGTCATTAAGCACAAGCTGTGCCGCCGCGGAAAATGCCAGAAGGAGGCCAAAAGGAGCAGTGCGGACAAGGGCGTGGCCCTCAGCCTGGACGACGTCAAAAGACACAACCCGTGCGAGAGCCTTCGCGGCCACCCTGCCGGCATGACATACGCTGCCAACATCCTGCCTCACCATCCGGCCCGCGGCACGTTCGAGGACTTTACCTGCTGA3’)，正向引物(5’GAAAACCTGTACTTTCAGGGGTCCACACTGCACGGCCTGGCCCACA3’)，反向引物(5’CTTGGTACCGCATGCCTCGAGTTACTTGTGCTTAATGACCTCGTAG3’)，用PCR反应获得基因ASICI(25-464)。正向引物(5’CCCACCATCGGGCGCGGATCCATGCATCACCATCATCACCACCATCACGAAAACCTGTACTTTCAG3’)，反向引物(5’CTTGGTACCGCATGCCTCGAGTTACTTGTGCTTAATGACCTCGTAG3’)，用PCR反应获得基因8*His-T4L(2-161)-TEV-ASICI(25-464)。参照以上原理进行基因合成，正向引物引入限制性酶切位点BamHI，反向引物引入限制性酶切位点XhoI和终止密码子。
PCR反应条件：在50μL反应体系中(PCR Buffer,1.5mM MgSO4,200μM dNTPs)加入扩增引物各0.2μM。充分混匀后开始PCR循环:94℃变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，68℃延伸2分钟，共进行30个循环,最后在68℃保温10分钟。PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收后用于克隆。
实施例2
ASIC1(酸敏感通道蛋白)融合蛋白的质粒构建
将实施例1中获得的PCR片段与经过限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切的载体pFastBac1(购自Invitrogen)进行连接。连接产物转化于感受态大肠杆菌DH5α中，体积不应超过感受态细胞的10％，轻轻旋转几次混匀内容物，冰浴30分钟，将管放入42℃水浴，定时60秒热休克，快速将管转移到冰浴120秒，使细胞冷却，每管加入400μl LB培养基,37℃缓摇60分钟，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因,低速离心2分钟，去上清，留约100μl培养基在离心管内，重悬菌体，用玻璃铺菌器将菌液在琼脂板上铺匀。将平板倒置于37℃恒温培养箱，12-16小时后可出现菌落。涂板后挑取阳性克隆进行鉴定。
实施例3
ASIC1(酸敏感通道蛋白)融合蛋白的表达
将实施例2中获得的重组质粒转化至DH10Bac E.coli感受态细胞中，体积不应该超过感受态细胞的5％，轻轻旋转几次混匀内容物。冰浴30分钟；将管放入42℃水浴，定时90秒热休克；快速将管转移到冰浴120秒，使细胞冷却；每管加入800ulLB培养基，37℃，缓摇4小时，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素标记基因；用玻璃铺菌器将30ul菌液在抗性琼脂板上铺匀；将平板倒置于37℃恒温培养箱中，30-48小时后可出现蓝白斑菌落；挑取阳性白斑单菌落接入5ml抗性LB，缓摇12-16h，取菌液进行PCR鉴定，结果显示杆粒重组正确。将重组杆粒经转染试剂转染到昆虫细胞中，4-5天后收取细胞上清液作为第一代杆状病毒。用第一代杆状病毒感染昆虫细胞72小时后，获得第二代病毒，用于组合多肽的表达；使用第二代病毒1:100体积比感染密度为2x10^6/ml的昆虫细胞sf9，继续培养72小时后，离心收细胞，PBS洗一遍细胞。
实施例4
ASIC1(酸敏感通道蛋白)融合蛋白的纯化
用100ml预冷的裂解液(25mM Tris pH8.0,10mM MgCl2,20mMKCl)重悬1L细胞到100m中，用匀浆器在冰上进行匀浆，匀浆后用超速离心机离心45分钟，去掉上清，重复洗涤步骤3次,再用高盐溶液重复洗涤步骤三次，提取好的细胞膜用加甘油的裂解液溶解并用液氮进行速冻，储存在-80C冰箱。在冰上融化解冻细胞膜,放置30分钟后按照每升细胞膜加入100ml溶膜缓冲液比例加入溶膜缓冲液，并继续在冰上放置过夜溶膜，用超速离心机在100,000g离心力下离心1小时，弃掉沉淀，上清与1ml用平衡缓冲液平衡好的Talon IMAC resin一起孵育过夜，次日，弃上清，加入适量平衡缓冲液重悬填料，将填料转移到自流柱里。依次用冲洗缓冲液1(25mMTris pH8.0；150mMNaCl；0.05％DDM；5mMMgCl2)洗10个柱体积，冲洗缓冲液2(25mMTris pH8.0；150mMNaCl；0.05％DDM；5mM MgCl2； 25mM Imid)洗10个柱体积，冲洗缓冲液3(25mMTris pH8.0；150mMNaCl；0.05％DDM；5mM MgCl2；50mM Imid)洗5个柱体积，然后用5个柱体积的洗脱缓(25mMTris pH8.0；150mMNaCl；0.05％DDM；5mM MgCl2；250mM Imid)冲液洗脱目的蛋白，纯化后得到的目的蛋白保存在-80℃，图1位三种融合蛋白的电泳检测结果。
从得率来看，经纯化后3种膜蛋白的得率都超过1mg/L细胞，具有较高的产率。
实施例5
发明融合ASIC1(离子通道蛋白)蛋白均一性检测
采用Waters公司的Acquity H-Class Bio UPLC系统进行检测，检测所用柱子为Sepax SEC250分子筛柱，上样前先用平衡缓冲液(25mMTris pH8.0；150mMNaCl；0.05％DDM；5mM MgCl2)洗柱子至基线没有太大变化止，然后将待检测的样品加入专用的96孔板中上样，积分处理采用仪器自带的软件。
按照上述方法对三种融合蛋白分别进行了检测，结果如图2所示，三种融合蛋白均一性都很好，能够检测到融合蛋白单体峰，且单体占蛋白样品的大部分。
实施例6
GLUT1(葡萄糖转运蛋白)融合蛋白的基因合成
T4L蛋白(氨基酸如序列表1.2所示)其核苷酸模板如序列表2.2所示
(5’AACATCTTCGAGATGCTCCGTATCGACGAGGGCCTCAGGTTGAAGATCTATAAGGACACAGAGGGCTATTACACCATCGGTATTGGTCATCTCTTGACTAAGTCGCCTTCACTTAACGCAGCAAAATCCGAACTGGACAAGGCCATCGGTCGCAATACAAATGGTGTCATTACTAAGGACGAAGCTGAAAAGCTCTTCAACCAGGACGTTGATGCAGCTGTTCGCGGAATCCTGCGCAACGCAAAGCTCAAGCCGGTTTACGATTCTTTGGACGCCGTTCGCCGTGCGGCCTTGATTAACATGGTGTTTCAGATGGGTGAAACCGGAGTTGCAGGATTTACCAACTCGCTGAGGATGCTGCAACAAAAGAGATGGGACGAAGCCGCTGTGAATCTCGCCAAATCTAGGTGGTACAACCAGACACCCAATCGTGCGAAGAGAGTGATAACTACATTCCGCACCGGTACTTGGGACGCATAT
3’)，正向引物为:(5’CCCGTTTCTGCTAGCAAGCTTACCATGAACATCTTCGAGATGCTCCGTATC3’)，反向引物为：(5’CAGCTTCTTGCTGCTGGGCTCCATATATGCGTCCCAAGTACCGGTGC3’)，用PCR反应获得T4L蛋白片段基因。
参考人类基因密码子，化学合成GLUT1模板(5’ATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGCTGACGGGTCGCCTCATGCTGGCCGTGGGAGGAGCAGTGCTTGGCTCCCTGCAGTTTGGCTACAACACTGGAGTCATCAATGCCCCCCAGAAGGTGATCGAGGAGTTCTACAACCAGACATGGGTCCACCGCTATGGGGAGAGCATCCTGCCCACCACGCTCACCACGCTCTGGTCCCTCTCAGTGGCCATCTTTTCTGTTGGGGGCATGATTGGCTCCTTCTCTGTGGGCCTTTTCGTTAACCGCTTTGGCCGGCGGAATTCAATGCTGATGATGAACCTGCTGGCCTTCGTGTCCGCCGTGCTCATGGGCTTCTCGAAACTGGGCAAGTCCTTTGAGATGCTGATCCTGGGCCGCTTCATCATCGGTGTGTACTGCGGCCTGACCACAGGCTTCGTGCCCATGTATGTGGGTGAAGTGTCACCCACAGCCCTTCGTGGGGCCCTGGGCACCCTGCACCAGCTGGGCATCGTCGTCGGCATCCTCATCGCCCAGGTGTTCGGCCTGGACTCCATCATGGGCAACAAGGACCTGTGGCCCCTGCTGCTGAGCATCATCTTCATCCCGGCCCTGCTGCAGTGCATCGTGCTGCCCTTCTGCCCCGAGAGTCCCCGCTTCCTGCTCATCAACCGCAACGAGGAGAACCGGGCCAAGAGTGTGCTAAAGAAGCTGCGCGGGACAGCTGACGTGACCCATGACCTGCAGGAGATGAAGGAAGAGAGTCGGCAGATGATGCGGGAGAAGAAGGTCACCATCCTGGAGCTGTTCCGCTCCCCCGCCTACCGCCAGCCCATCCTCATCGCTGTGGTGCTGCAGCTGTCCCAGCAGCTGTCTGGCATCAACGCTGTCTTCTATTACTCCACGAGCATCTTCGAGAAGGCGGGGGTGCAGCAGCCTGTGTATGCCACCATTGGCTCCGGTATCGTCAACACGGCCTTCACTGTCGTGTCGCTGTTTGTGGTGGAGCGAGCAGGCCGGCGGACCCTGCACCTCATAGGCCTCGCTGGCATGGCGGGTTGTGCCATACTCATGACCATCGCGCTAGCACTGCTGGAGCAGCTACCCTGGATGTCCTATCTGAGCATCGTGGCCATCTTTGGCTTTGTGGCCTTCTTTGAAGTGGGTCCTGGCCCCATCCCATGGTTCATCGTGGCTGAACTCTTCAGCCAGGGTCCACGTCCAGCTGCCATTGCCGTTGCAGGCTTCTCCAACTGGACCTCAAATTTCATTGTGGGCATGTGCTTCCAGTATGTGGAGCAACTGTGTGGTCCCTACGTCTTCATCATCTTCACTGTGCTCCTGGTTCTGTTCTTCATCTTCACCTACTTCAAAGTTCCTGAGACTAAAGGCCGGACCTTCGATGAGATCGCTTCCGGCTTCCGGCAGGGGGGAGCCAGCCAAAGTGACAAGACACCCGAGGAGCTGTTCCATCCCCTGGGGGCTGATTCCCAAGTGTGA3’)，正向引物(5’ATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGCTG3’)，反向引物(5’ATGATGGTGGTGATGGTGGTGATGGTGGTGTGTCTTGTCACTTTGGCTGGCTC3’)，用PCR反应获得基因GLUT1(1-478)。正向引物(5’CCCGTTTCTGCTAGCAAGCTTACCATGAACATCTTCGAGATGCTCCGTATC3’)，反向引物(5’GGTCGAGGTCGGGGGATCCTTAATGATGGTGGTGATGGTGGTGATG3’)，用PCR反应获得基因T4L-GLUT1(1-478)-10*His。参照以上原理进行基因合成，正向引物引入限制性酶切位点HindIII，反向引物引入限制性酶切位点BamHI和终止密码子。
BRIL蛋白片段(氨基酸序列如序列表1.1所示)核苷酸模板(序列表2.1)
(5’GCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAATGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAGCTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATTGATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACCCGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTG3’)，正向引物为:(5’GCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAAC3’)，反向引物为：(5’CAGGTACTTCTGAATGTATGCATTC’)，用PCR反应获得BRIL蛋白片段基因。
参考人类基因密码子，化学合成GLUT1核苷酸模板(5’ATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGCTGACGGGTCGCCTCATGCTGGCCGTGGGAGGAGCAGTGCTTGGCTCCCTGCAGTTTGGCTACAACACTGGAGTCATCAATGCCCCCCAGAAGGTGATCGAGGAGTTCTACAACCAGACATGGGTCCACCGCTATGGGGAGAGCATCCTGCCCACCACGCTCACCACGCTCTGGTCCCTCTCAGTGGCCATCTTTTCTGTTGGGGGCATGATTGGCTCCTTCTCTGTGGGCCTTTTCGTTAACCGCTTTGGCCGGCGGAATTCAATGCTGATGATGAACCTGCTGGCCTTCGTGTCCGCCGTGCTCATGGGCTTCTCGAAACTGGGCAAGTCCTTTGAGATGCTGATCCTGGGCCGCTTCATCATCGGTGTGTACTGCGGCCTGACCACAGGCTTCGTGCCCATGTATGTGGGTGAAGTGTCACCCACAGCCCTTCGTGGGGCCCTGGGCACCCTGCACCAGCTGGGCATCGTCGTCGGCATCCTCATCGCCCAGGTGTTCGGCCTGGACTCCATCATGGGCAACAAGGACCTGTGGCCCCTGCTGCTGAGCATCATCTTCATCCCGGCCCTGCTGCAGTGCATCGTGCTGCCCTTCTGCCCCGAGAGTCCCCGCTTCCTGCTCATCAACCGCAACGAGGAGAACCGGGCCAAGAGTGTGCTAAAGAAGCTGCGCGGGACAGCTGACGTGACCCATGACCTGCAGGAGATGAAGGAAGAGAGTCGGCAGATGATGCGGGAGAAGAAGGTCACCATCCTGGAGCTGTTCCGCTCCCCCGCCTACCGCCAGCCCATCCTCATCGCTGTGGTGCTGCAGCTGTCCCAGCAGCTGTCTGGCATCAACGCTGTCTTCTATTACTCCACGAGCATCTTCGAGAAGGCGGGGGTGCAGCAGCCTGTGTATGCCACCATTGGCTCCGGTATCGTCAACACGGCCTTCACTGTCGTGTCGCTGTTTGTGGTGGAGCGAGCAGGCCGGCGGACCCTGCACCTCATAGGCCTCGCTGGCATGGCGGGTTGTGCCATACTCATGACCATCGCGCTAGCACTGCTGGAGCAGCTACCCTGGATGTCCTATCTGAGCATCGTGGCCATCTTTGGCTTTGTGGCCTTCTTTGAAGTGGGTCCTGGCCCCATCCCATGGTTCATCGTGGCTGAACTCTTCAGCCAGGGTCCACGTCCAGCTGCCATTGCCGTTGCAGGCTTCTCCAACTGGACCTCAAATTTCATTGTGGGCATGTGCTTCCAGTATGTGGAGCAACTGTGTGGTCCCTACGTCTTCATCATCTTCACTGTGCTCCTGGTTCTGTTCTTCATCTTCACCTACTTCAAAGTTCCTGAGACTAAAGGCCGGACCTTCGATGAGATCGCTTCCGGCTTCCGGCAGGGGGGAGCCAGCCAAAGTGACAAGACACCCGAGGAGCTGTTCCATCCCCTGGGGGCTGATTCCCAAGTGTGA
3’)，正向引物(5’CCCGTTTCTGCTAGCAAGCTTACCATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGCTG3’)，反向引物(5’GTTTCCCAATTGTCTTCCAGATCAGCCTTGGCCCGGTTCTCCTCGTTG3’)，用PCR反应获得基因GLUT1(1-225),正向引物(5’GAATGCATACATTCAGAAGTACCTGGAGAAGAAGGTCACCATCCTGGAGC3’)，反向引物(5’ATGATGGTGGTGATGGTGGTGATGGTGGTGCACTTGGGAATCAGCCCCCA3’)，用PCR反应获得基因GLUT1(254-492)。正向引物(5’CCCGTTTCTGCTAGCAAGCTTACCATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGCTG3’)，反向引物(5’GGTCGAGGTCGGGGGATCCTTAATGATGGTGGTGATGGTGGTGATG3’)，用PCR反应获得基因GLUT1(1-225)-BRIL(130-233)-TEV-GLUT1(254-492)-10*His。参照以上原理进行基因合成，正向引物引入限制性酶切位点HindIII，反向引物引入限制性酶切位点BamHI和终止密码子。
实施例7
本发明GLUT1(葡萄糖转运蛋白)的表达
将实施案例4中1mg GLUT1质粒溶解于50ml Opti-MEM培养集中,混匀.并与3ml PEI(1mg/ml)溶于50Opti-MEM培养集中，混匀，室温孵育15分钟后加入到1L细胞密度为1.2x106cells/ml293F细胞中。37℃，5％CO2培养72小时，收细胞沉淀。
实施例8
发明GLUT1(运输蛋白)的纯化
用20ml预冷的裂解液(50mM Tris pH7.5,200mM NaCl,5％glycerol)重悬300mL细胞到20mL中，用匀浆器在冰上进行匀浆，匀浆后用超速离心机离心50分钟，去掉上清，重复洗涤步骤3次,再用高盐溶液(50mM Tris pH7.5,1M NaCl,5％glycerol)重复洗涤步骤两次。提取好的细胞膜按照每300mL细胞加入20mL溶膜缓冲液比例加入溶膜缓冲液(50mM Tris pH7.5,200mM NaCl,5％glycerol,1％DDM)，用匀浆器在冰上进行匀浆,并用磁力搅拌器在4℃过夜搅拌溶膜，用超速离心机在100,000g离心力下离心1小时，弃掉沉淀，上清与1mL用平衡缓冲液(50mM Tris pH7.5,200mM NaCl,5％glycerol，0.05％DDM)平衡好的Talon IMAC resin一起孵育3hrs，弃上清，加入适量平衡缓冲液重悬填料，将填料转移到自流柱里。依次用冲洗缓冲液1(250mM Tris pH7.5,200mMNaCl,5％glycerol，0.05％DDM)洗10个柱体积，冲洗缓冲液2(50mM Tris pH7.5,200mM NaCl,5％glycerol，0.05％DDM,20mMimidazole)洗10个柱体积，冲洗缓冲液3(50mM Tris pH7.5,200mM NaCl,5％glycerol，0.05％DDM,50mM imidazole)洗5个柱体积，然后用5个柱体积的洗脱缓(50mM Tris pH7.5,200mM NaCl,5％glycerol，0.05％DDM,250mMimidazole)冲液洗脱目的蛋白，纯化后得到的目的蛋白浓缩至400uL保存在-80℃。图3位三种融合蛋白的电泳检测结果。
从得率来看，经纯化后2种GLUT1融合蛋白的得率都超过0.5mg/L细胞，具有较高的产率。
实施例9
发明GLUT1(葡萄糖转运蛋白)融合蛋白均一性检测
采用Waters公司的Acquity H-Class Bio UPLC系统进行检测，检测所用柱子为Sepax SEC250分子筛柱，上样前先用平衡缓冲液(25mMTris pH8.0；150mMNaCl；0.05％DDM；5mM MgCl2)洗柱子至基线没有太大变化止，然后将待检测的样品加入专用的96孔板中上样，积分处理采用仪器自带的软件。
按照上述方法对三种融合蛋白分别进行了检测，结果如图4所示，2种GLUT1融合蛋白的均一性都很好，能够检测到融合蛋白单体峰，且单体占蛋白样品的大部分。

Claims (10)

1.用于融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的蛋白片段，其特征在于：
为一种Bril蛋白片段或与该片段序列同源性大于90％的蛋白；或
为一种T4L蛋白片段或与该片段序列同源性大于90％的蛋白。
2.如权利要求1所述的用于融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的蛋白片段，其特征在于：所述Bril蛋白片段或与该片段序列同源性大于90％的蛋白，其氨基酸序列和编码基因序列分别如SEQ ID NO.1.1和SEQ ID NO.2.1所示；
所述T4L蛋白片段或与该片段序列同源性大于90％的蛋白，其氨基酸序列和编码基因序列分别如SEQ ID NO.1.2和SEQ ID NO.2.2所示。
3.融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法，其特征在于：将如权利要求1或所述的蛋白片段的氨基酸序列插入到离子通道蛋白或运输蛋白的N-末端、C-末端或者膜内环区构建融合蛋白。
4.如权利要求3所述的融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法，其特征在于：
将所述Bril蛋白片段与ASIC1进行融合表达，得到的融合白蛋氨基酸序列如SEQ ID NO.3.1所示；或
将所述T4L蛋白片段与ASIC1进行融合表达，得到的融合白蛋氨基酸序列如SEQ ID NO.3.2所示。
5.如权利要求3所述的融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法，其特征在于：
采用所述Bril基因构建的ASIC1融合表达质粒，其基因序列如SEQ IDNO.4.1所示；或
采用所述T4L基因构建的ASIC1融合表达质粒，其基因序列如SEQ ID NO.4.2所示。
6.如权利要求3所述的融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法，其特征在于：
所述Bril蛋白片段与GLUT1进行融合表达，得到的融合白蛋氨基酸序列如SEQ ID NO.3.3所示；或
所述T4L蛋白片段与GLUT1进行融合表达，得到的融合白蛋氨基酸序列如SEQ ID NO.3.4所示。
7.如权利要求3所述的融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法，其特征在于：
采用所述Bril基因构建的GLUT1融合表达质粒，其基因序列如SEQ IDNO.4.3所示；或
采用所述T4L基因构建的GLUT1融合表达质粒，其基因序列如SEQ ID NO.4.4所示。
8.如权利要求5或7所述的融合表达质粒，其特征在于：可以在昆虫细胞中表达或在哺乳细胞中表达。
9.如权利要求5所述的融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法，其特征在于：将权利要求5中SEQ ID NO.4.1或SEQ ID NO.4.2所示的基因序列的构建到表达载体pFastBac1, PcDNA3.1，PET21b上进行不同表达系统的蛋白质表达。
10.如权利要求7所述的融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法，其特征在于：将权利要求7中SEQ ID NO.4.3或SEQ ID NO.4.4所示的基因序列的构建到表达载体pFastBac1,PcDNA3.1，PET21b上进行不同表达系统蛋白质表达。
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