CN105400813A - 一种重组表达人谷氨酸脱羧酶的毕赤酵母基因工程菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组表达人谷氨酸脱羧酶的毕赤酵母基因工程菌,属于基因工程技术领域。本发明将人谷氨酸脱羧酶基因GAD65与载体pPICZα连接构建表达载体pPICZα-hGAD65,电转至毕赤酵母X-33中,获得过量表达人谷氨酸脱羧酶(GAD65)的重组菌株。本发明的重组菌株经摇瓶发酵、Tricine-SDS-PAGE和Western?Blot鉴定,证实人源谷氨酸脱羧酶(GAD65)实现了诱导表达,通过对发酵上清液进行分离纯化得到融合蛋白,经过蛋白浓度测定,蛋白hGAD65浓度达到2.36g/L。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组表达人谷氨酸脱羧酶的毕赤酵母基因工程菌,属于基因工程领域。
背景技术
谷氨酸脱羧酶(glutamicaciddecarboxylase,GAD,EC4.1.1.15)在生物体内广泛存在,其催化谷氨酸生成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA),而GABA是哺乳动物体内一种重要的抑制性神经递质。在对自身免疫性疾病以及糖尿病研究中,特别是I型糖尿病,GAD、GABA以及谷氨酸脱羧酶抗体(glutamicaciddecarboxylaseantibody,GAD-Ab),等的水平作为病理分析、疾病诊断、免疫治疗的重要参数,历来备受研究者关注。
GAD存在两种异构体形式:分子量为65,000的GAD65和分子量为67,000的GAD67,两者分别由不同染色体上的非等位基因编码。GAD65基因位于第10染色体短臂(p)11.23区段,GAD67基因位于第2染色体长臂(q)31区段。它们的氨基酸同源性占60-70%,主要区别在1-95和325-355位氨基酸序列。70-90%的Ⅰ型糖尿病患者血清中可检测出GAD65抗体,15-25%的Ⅰ型糖尿病患者有GAD67抗体,说明Ⅰ型糖尿病患者体内GAD自身抗体主要是针对GAD65抗原的。
随着人们生活方式及饮食结构的改变,糖尿病在我国有着越来越高的发病率。减少糖尿病并发症成为一个棘手的问题。目前越来越多的人把目光转移到了利用基因工程手段获取GAD抗原。此种方法不仅原料消耗小,成本低,纯度高,且克服了由于GAD65蛋白在胰腺组织中含量极低,制备困难,以及人源组织不易获得等缺点,因而具有广泛的临床应用前景。
目前,虽然已有少数报道将哺乳动物来源的GAD65成功表达于微生物中,但存在表达量低、质粒表达量不稳定、酶活低、形成包涵体、胞内分泌等问题。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供一种重组表达人谷氨酸脱羧酶(GAD)的毕赤酵母基因工程菌,实现了人谷氨酸脱羧酶的活性表达、高效表达。本发明采用毕赤酵母为宿主和基因组整合性质粒pPICZα为表达载体,成功的把人源GAD65基因重组到毕赤酵母基因组上且形成产物分泌到胞外,这不仅克服了质粒表达的不稳定性、表达量低等问题,而且也简化了形成包涵体或胞内分泌所带来的工作量。所筛选得到重组菌株,经甲醇诱导能过量表达GAD65并分泌到胞外,其具有免疫原性。
本发明提供了一种高效活性表达人的谷氨酸脱羧酶的方法,是构建以毕赤酵母为宿主整合表达核苷酸序列如SEQIDNO:1所述的谷氨酸脱羧酶的重组菌,然后以该重组菌发酵生产人的谷氨酸脱羧酶。
在本发明的一种实施方式中,所述方法是将SEQIDNO:1所述的谷氨酸脱羧酶基因GAD65连接到表达载体pPICZα上,得到重组质粒pPICZα-hGAD65,然后电转入毕赤酵母X-33菌株,使GAD65全编码序列插入酵母基因组中,筛选得到重组菌。
在本发明的一种实施方式中,所述发酵是将重组菌活化后接种于BMGY培养基培养20h,然后静置弃上清,用BMMY培养基重悬菌体并加入甲醇诱导培养。
在本发明的一种实施方式中,所述发酵具体是:将重组菌单菌落接种于生长培养基BMGY中,30℃,200r/min培养20h;将菌液,室温静置1h,弃掉上清液,用30mLBMMY培养基重新悬浮菌体,加入100%甲醇至终浓度为1%(v/v),30℃,200r/min培养,每隔24h补加100%甲醇至终浓度为1%(v/v)进行诱导;诱导48h后,12000r/min离心5min,保留上清液,即为含有谷氨酸脱羧酶的液体。
本发明还提供一种毕赤酵母基因工程菌,所述基因工程菌以毕赤酵母为宿主表达核苷酸序列如SEQIDNO:1所述的谷氨酸脱羧酶。
在本发明的一种实施方式中,所述宿主是毕赤酵母X-33菌株。
在本发明的一种实施方式中,所述基因工程菌的构建:将SEQIDNO:1所述的谷氨酸脱羧酶基因GAD65连接到表达载体pPICZα上,得到重组质粒pPICZα-hGAD65,然后电转入毕赤酵母X-33菌株,使GAD65全编码序列插入酵母基因组中,筛选得到重组菌。
本发明还要求保护所述基因工程菌生产的谷氨酸脱羧酶,以及得到的谷氨酸脱羧酶在制备药物方面的应用。
本发明的有益效果:
本发明实现了人的谷氨酸脱羧酶的活性表达、高效表达,本发明使用毕赤酵母作为宿主,得到的基因工程菌经摇瓶发酵、Tricine-SDS-PAGE和WesternBlot鉴定,证实人源谷氨酸脱羧酶(GAD65)实现了诱导表达。最后,通过对发酵上清液进行分离纯化得到融合蛋白,经过蛋白浓度测定,融合蛋白hGAD65浓度达到2.36g/L。
附图说明
图1:表达载体菌体PCR验证;1为空载体PCR产物;2为含有pPICZα-hAGAD65质粒的DH5α重组子PCR产物;
图2:表达载体整合酵母基因组验证;
图3:重组毕赤酵母表达产物的检测;
图4:WesternBlot鉴定融合蛋白hGAD65(1:GAD+病人血清为一抗;2:GAD65单克隆抗体一抗)。
具体实施方式
低盐LB培养基(g/L):胰蛋白胨10g,NaCl5g,酵母粉5g;
YPD培养基(g/L):胰蛋白胨20g,酵母粉10g,葡萄糖20g;
YPDS培养基(g/L):胰蛋白胨20g,酵母粉10g,葡萄糖20g,山梨醇182g;
BMGY培养基(g/L):酵母粉10g,胰蛋白胨20g,甘油20g,(NH4)2SO410g,YNB3.4g,1moL/LKH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH6.0)100mL,生物素4×10-5g;
BMMY培养基(g/L):酵母粉10g,胰蛋白胨20g,(NH4)2SO410g,YNB3.4g,1moL/LKH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH6.0)100mL,生物素4×10-5g。
实施例1:重组菌的构建
(1)重组质粒pMD19-T-GAD65的构建
将核苷酸如SEQIDNO:1的GAD酶基因连接到pMD19-T质粒上,并转化大肠杆菌,验证正确的转化子,得到重组质粒pMD19-T-GAD65。抽提pMD19-T-GAD65和pPICZα质粒,然后以XhoI和NotI分别双酶pMD19-T-GAD65(合成的GAD65基因克隆至pMD19-T载体上)和pPICZα质粒4h,0.7%琼脂糖凝胶电泳分析。利用割胶回收试剂盒回收目的片段,16℃连接4h后,利用化学转化法,转化大肠杆菌DH5α,将转化后的菌液涂布到含终浓度为25μg/mLzeocin的低盐LB平板上,37℃培养24h后,挑选若干平板上生长出来的菌落,接种于2mL含终浓度为25μg/mLzeocin的低盐LB液体试管中培养,然后以5'AOX1和3'AOX1为引物,进行菌落PCR验证,结果阳性克隆扩增出2346bp片段,而以空载体pPICZα作为对照扩增出588b片段(如图1),与理论相符,说明目的基因已经连接到pPICZα载体上,经测序,表达载体的阅读框正确。得到重组质粒pPICZα-hGAD65。
(2)重组毕赤酵母的构建
以SacI线性化的表达载体pPICZα-hGAD65电转化X-33毕赤酵母,涂布100μg/mLzeocin的YPD抗性平板上进行后培养,将长出来的单菌落重新划线于此浓度抗性平板上,挑选长势好的单菌落作为进一步验证其酵母基因组中是否整合了表达载体,以上述株菌的基因组为模板,5'AOX1和3'AOX1为引物进行PCR验证,结果如图2所示,菌株扩增出2.2kb(基因组上的醇氧化酶基因)和2346bp(表达载体上的目的片段),而对照(整合了空载体pPICZα的重组毕赤酵母)扩增出2.2kb和588bp(空载体上的目的片段),表明此株菌可初步认为是成功整合了表达载体的重组毕赤酵母。将验证正确的菌株保种,送测序,测序结果表明,GAD65全编码序列正向插入酵母基因组中,阅读框的正确性。
其中酵母感受态的制备方法如下:
(1)从新鲜YPD平板上挑取X-33毕赤酵母菌落于25mLYPD液体培养基中,30℃,200r/min培养20h;
(2)将0.5mL上述培养液转接到25mLYPD液体培养基中,30℃,200r/min培养8h(大约OD600=1.3-1.5);
(3)吸取1mL上述菌液于1.5mL无菌的EP管中,4000r/min离心2min,收集菌体,用1.5mL预冷的无菌水,吹打悬浮细胞;
(4)4000r/min离心2min,收集菌体,用1mL预冷的无菌水重新悬浮细胞;
(5)4000r/min离心2min,收集菌体,用1.5mL预冷的1moL/L山梨醇悬浮细胞;
(6)4000r/min离心2min,收集菌体,用100μL预冷的1moL/L山梨醇混匀细胞,5min后方可使用。
电穿孔转化法如下:
(1)提前预热电穿孔仪;
(2)取80μL酵母感受态细胞与20μL线性化的表达载体,轻轻混匀,冰浴5min;后转入预冷的0.2cm电击杯中;
(3)将电击杯外水汽彻底擦干净,放入电击室;
(4)按电转参数:1.5kV,25μF,200,5ms进行电击;
(5)电击后立即加入1mL预冷的1moL/L山梨醇于电击杯中,轻轻吹打后,将内容物全部转入无菌的1.5mLEP管中,于30℃复活培养1h;
(6)4000r/min离心5min,去除750μL上清液,将剩余的菌液涂布到含有100μg/mLzeocin的YPDS平板上,30℃培养3-5d。
实施例2:重组菌发酵生产谷氨酸脱羧酶GAD65
融合蛋白hGAD65的诱导表达及产物的鉴定
(1)诱导表达
抽提测序正确的重组质粒pPICZα-hGAD65转化到毕赤酵母X-33,得到基因工程表达菌。
(a)将选定的重组毕赤酵母单菌落接种于50mL生长培养基BMGY/500mL三角瓶中,30℃,200r/min培养20h;
(b)将上述BMGY生长培养基中的菌液,室温静置1h,弃掉上清液,用30mLBMMY培养基重新悬浮菌体,加入100%甲醇至终浓度为1%(v/v),30℃,200r/min培养,每隔24h补加100%甲醇至终浓度为1%(v/v)进行诱导;
(c)甲醇诱导48h后,12000r/min离心5min,保留上清液,进行Tricine-SDS-PAGE蛋白凝胶电泳(图3)。
(2)表达产物hGAD65的Tricine-SDS-PAGE分析鉴定
按照ProteinAssayKitBradford蛋白质定量检测试剂盒说明,测定上清液中蛋白的相对分子量并对蛋白进行粗略定量分析。
Tricine-SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
(1)试剂配制:
30%T,3.3%C母液:称取29.0g聚丙烯酰胺和1.0g双丙烯酰胺,重蒸水溶解并定容至100mL,贮存于棕色瓶中,4℃保存;
10%过硫酸铵:称取1.0g过硫酸铵,用超纯水溶解并定容至10mL,4℃保存1-2周;
1.5MTrisBuffer,pH8.8分离胶用(室温保存):18.17gTris加浓HCL调至pH8.8,100mL;
0.5MTrisBuffer,pH6.8,积层胶用(室温):6.06gTris加浓HCL调至pH6.8,100mL;
10%过硫酸铵:称取1.0g过硫酸铵,用超纯水溶解并定容至10mL,4℃保存1-2周;
10%SDS(W/V):10g的SDS粉末溶解在水里,定容到100mL。
染色液:称取1.0g考马斯亮蓝R250、68mL乙酸和500mL甲醇,超纯水定容至1L;
脱色液:量取37.5mL乙酸,25mL甲醇,用超纯水定容至500mL;
电泳缓冲液:称取3.028gTrisBase,14.412g甘氨酸,1.00gSDS,用超纯水定容至1L。
(2)操作步骤:
①样品处理:取30μL蛋白样品液(发酵上清液)加入30μL2×缓冲液(1:1),沸水浴5min,-20℃保存,备用;
②按顺序分别配制分离胶、积层胶:取20mL干净小烧杯1只,根据各种胶的浓度,按表1依次加入各种试剂,轻轻混匀,避免产生气泡,最后加入10%过硫酸铵和TEMED,再轻轻混匀;
③将混匀的凝胶液迅速、平稳地注入两层玻璃板中,留出其余胶所需的空间,然后尽快在液面上小心注入一层水,以隔绝空气(注意尽量避免扰动胶液面),静置40-60min,每层胶完全聚合后,吸净上层液,再灌入另外一种胶,其中最后一层胶灌至玻璃板顶端,然后小心插入梳子,静置30-45min,待胶聚合;
④将胶板放入电泳槽中,向内层加电泳缓冲液,直至没过内层玻璃板,小心缓慢地取出梳子;
⑤取一定体积处理好的样品加入到样品孔中,点样后向外层加入电泳缓冲液至玻璃板高度一半以上;
⑥电泳:稳压120V;
⑦固定:将凝胶从玻璃板上取下,在固定液中固定30-40min;
⑧染色和脱色:倾出固定液,用去离子水漂洗1-2次,加入染色液染色40-60min;倾出染色液,用去离子水漂洗1-2次,加入脱色液脱色,期间更换脱色液3-4次。凝胶可在脱色液中保存一定时间。结果如图3所示。
表1Tricine-SDS-PAGE蛋白凝胶胶配方
(3)计算样品的相对迁移率(Rf)及分子量(MV):
(a)蛋白带相对迁移率的计算:根据weber公式
Rf=Sp/G2*G1/S
Rf:相对迁移率。
PS:样品迁移距离,样品染色带中心到分离胶上缘的距离。
S:指示剂迁移距离,指示剂色带中心到分离胶上缘的距离。
G1:染色前凝胶长度,染色前凝胶下缘到分离胶上缘的距离。
G2:脱色后凝胶长度,染色后凝胶下缘到分离胶上缘的距离。
(b)表达产物分子量的估算:
通过标准蛋白分子量及其迁移率,建立lgMV与Rf之间的回归方程,根据重组蛋白的Rf值计算分子量。
对筛选出的重组毕赤酵母,经过摇瓶诱导培养48h后,将含等量总蛋白浓度的上清液进行Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳,结果在65KD附近均出现目标条带,与预测大小相符,而对照:X-33(原始酵母)、S0(以空载体pPICZα进行电转化获得的重组毕赤酵母)均未出现(如图3),初步认为人的谷氨酸脱羧酶GAD65获得表达。
实施例3:重组菌发酵的谷氨酸脱羧酶GAD65的活性检测
采用WesternBlot鉴定融合蛋白hGAD65。
(1)以GAD抗体阳性的糖尿病病人血清为一抗:
①Tricine-SDS-PAGE:取摇瓶水平蛋白样品200μl沉样进行Tricine-SDS-PAGE;
②转印:取一张与凝胶大小相同的硝酸纤维素滤膜(NC)和6块3mm的滤纸浸泡于电转缓冲液中10-15min。电泳结束后,取下凝胶,切去积层胶做标记,用电转缓冲液漂洗并平衡20min。按照以下顺序安装:阳极-海绵-3张滤纸-NC膜-凝胶-3张滤纸-海绵-阴极。每放置一层,要去除各层之间的气泡,以免影响转移效果。用塑料支架夹紧固定上述各层,置于电泳转移槽中并接通电源,采用恒流方式0.8mA/cm2转移1小时;然后,将NC滤膜取出,放置干净的滤纸上,室温干燥30-60分钟。
③抗原抗体反应:将NC膜浸入适量的封闭液中,4℃放置过夜;以抗体稀释液清洗NC膜2次后将其置入一塑料袋中,然后,用抗体稀释液稀释病人血清抗体至1:100-1:1000,封闭塑料袋,37℃放置2小时。剪开塑料袋,以PBS清洗NC膜2次,加入l:200-1:1000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体,37℃放置2小时;
④显色:按照DAB显色试剂盒说明书,在干净的平皿中加入10ml蒸馏水,取A、B、C溶液各5滴,混匀后加入NC膜,约3分钟后显色;
(2)以人源GAD单克隆抗体标准品为一抗:
方法同(1)。
一抗为GAD(+)病人血清:由图4可见,用于WesternBlot检测的硝酸纤维素膜经底物显色后有一条小于66.4KD的单一条带,其位置与重组毕赤酵母诱导表达产物的特异性条带位置一致。
一抗为GAD65单克隆抗体:如图4,硝酸纤维素膜经底物显色后有一条小于66.4KD的单一条带,其位置与重组毕赤酵母诱导表达产物的特异性条带位置一致。
以上数据说明,采用本发明方法实现了人的GAD在毕赤酵母中的活性表达。
实施例4:产物蛋白的纯化与蛋白浓度的测定
(1)产物蛋白的纯化
取实施例2得到的诱导表达产物,经离心取上清液进行蛋白纯化,收集洗脱液并取20μl进行电泳鉴定。
纯化具体步骤:
(a)去掉镍柱上层管中储存液(20%的乙醇),10ml平衡液平衡镍柱;
(b)待平衡液流尽后,向镍柱上层管中加入样品(通过20μm滤膜),让其自然滴下;液体流尽后,加入10ml的平衡液,清洗杂蛋白,不需要收集
(c)洗杂结束后,先用3ml的含200mM咪唑的洗脱液洗脱收集;
(d)进行SDS-PAGE,检测洗脱目的蛋白。
(e)使用结束的镍柱,再次使用10ml的平衡进行平衡,流尽后,再用20%的乙醇保存。
其中,平衡液:20mM的磷酸盐缓冲液(NaH2PO4、Na2HPO4),500mMNaCl,20mM咪唑,pH7.4;洗脱液:20mM的磷酸盐缓冲液(NaH2PO4、Na2HPO4),500mMNaCl,200mM咪唑,pH7.4。
纯化产物仅在大小约为66.4KD处有一条蛋白质条带,并且其位置与诱导表达产物中的融合蛋白位置相一致。
(2)蛋白浓度的测定
Bradford法定量测hGAD65:
取10支试管,1支加待测样品,其余9支试管按顺序分别加入:0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0μL标准蛋白质溶液(BSA),每个样品准备3份。
(a)用0.9%NaCl溶液补充溶液总体积到0.1mL。
(b)各试管中分别加入1mLBradford工作液,2min内加完试剂,用比色皿在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值(A595)。
(c)测出A值以后,以A595值为纵坐标,标准蛋白(BSA)含量为横坐标,绘制标准曲线。
400ml酵母培养液表达的上清液中蛋白经镍柱纯化后共获得20ml洗脱液。以BSA为标识物,用Bradford法测蛋白hGAD65浓度为46.0mg/ml,则每升培养液可得蛋白=46.0×20÷400*1000=2.36g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.一种高效活性表达人的谷氨酸脱羧酶的方法,其特征在于,所述方法是构建以毕赤酵母为宿主表达核苷酸序列如SEQIDNO:1所述的谷氨酸脱羧酶的重组菌,然后以该重组菌发酵生产人的谷氨酸脱羧酶。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法是将SEQIDNO:1所述的谷氨酸脱羧酶基因GAD65连接到表达载体pPICZα上,得到重组质粒pPICZα-hGAD65,然后电转入毕赤酵母X-33菌株,使GAD65全编码序列插入酵母基因组中,筛选得到重组菌。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述发酵是将重组菌活化后接种于BMGY培养基培养20h,然后静置弃上清,用BMMY培养基重悬菌体并加入甲醇诱导培养。
4.一种毕赤酵母基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌以毕赤酵母为宿主表达核苷酸序列如SEQIDNO:1所述的谷氨酸脱羧酶。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌的构建:将SEQIDNO:1所述的谷氨酸脱羧酶基因GAD65连接到表达载体pPICZα上,得到重组质粒pPICZα-hGAD65,然后电转入毕赤酵母X-33菌株,使GAD65全编码序列插入酵母基因组中,筛选得到重组菌。
6.根据权利要求4所述的基因工程菌,其特征在于,所述宿主是毕赤酵母X-33菌株。
7.权利要求4-6任一所述基因工程菌生产的谷氨酸脱羧酶。
8.权利要求7所述谷氨酸脱羧酶在制备药物方面的应用。
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CN110438021A (zh) * | 2018-10-10 | 2019-11-12 | 福建师范大学 | 一种可高效加工前体蛋白的毕赤酵母工程菌构建方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO1997017451A2 (en) * | 1995-11-09 | 1997-05-15 | Zymogenetics, Inc. | Production of gad65 in methylotrophic yeast |
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2015
- 2015-12-28 CN CN201510997621.6A patent/CN105400813A/zh active Pending
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