CN107082804A - 一种卵形鲳鲹β‑胸腺素及其应用 - Google Patents

一种卵形鲳鲹β‑胸腺素及其应用 Download PDF

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Abstract

一种卵形鲳鲹β‑胸腺素及其应用，本发明涉及分子生物学领域，所述卵形鲳鲹β‑胸腺素的cDNA核苷酸的序列如SEQ ID NO.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2，本发明还提供所述卵形鲳鲹β‑胸腺素在抗细菌疾病药物及其应用，以及卵形鲳鲹β‑胸腺素的重组蛋白表达方法，本发明的β‑胸腺素能够显著抑制致病菌的生长，并且注射鱼类之后能够显著提高鱼类的抗病能力。

Description

一种卵形鲳鲹β-胸腺素及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体说的是一种卵形鲳鲹β-胸腺素及其作为免疫增强剂在抗细菌性疾病性能方面的应用。
背景技术
卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)是我国海南、广东和广西等南方沿海地区重要的海水养殖鱼类，随着养殖规模的不断扩大，病害发生日益严重。胸腺是机体免疫系统中重要的中枢免疫器官之一，胸腺素是由Goldstein和White在1966年首次从胎牛胸腺蛋白提取液中分离得到的具有生活活性的多肽类物质。其中β-胸腺素结构高度保守，由40-44个氨基酸残基组成，分子质量约为5.0kD。胸腺素不仅具有免疫调节活性，促进T细胞的成熟的作用，同时在调节生殖系统、神经内分泌系统中亦具有重要作用。目前胸腺素作为一种免疫调节剂或增强剂，已经在医学临床广泛运用。由于其能够协调内分泌，调节免疫平衡，提高机体抵抗外界病原的入侵，在兽医临床的防治试验中也有不错的效果。然而鱼类β-胸腺素的功能和应用潜能尚不清楚。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种卵形鲳鲹β-胸腺素及其抗病性能方面的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种卵形鲳鲹β-胸腺素，所述卵形鲳鲹β-胸腺素的cDNA核苷酸的序列如SEQ ID NO.1：
ACTACTGCTGCAACGCACTGACCAGAGACCTTCCAGCGATCCCGTCAGCCAACGCTTCGACTCTCTGCAACCATGAGTGACAACAAGCCCGACATCTCAGACGTGACCAGCTTCGACAAGACCAAACTGAAGAAGACGGAGACTCAAGAGAAAAACACACTGCCAACCAAAGAAACCATCGAACAGGAGAAGTCAGAGTCATCATGAAGATCAGTCCTCCTGTACACTGCACATTCCACAAGCCTTGCCTCTTTCAACCTTTTCCAACATGTATTCCAAGTTGCAGAACTTAATAATTGACAAAACGTTGGCTGTACAACCACACAACTCAACTTGCCTAGATGTCCCTCTGGTACAGTGAGGAAGTGGTGGCTCAATGTCGGCATGAGTTCCTGGTCACCTGTTTTTTGCTGGGGCTGTATCTCAAGGTGTCATGAAACAACTGAGGGACCTACACTTCATGATTTGTAGCCCTGCTCTAGCCACCTGTGAATGCTCACAAAGCAAGCTGTTTCTTTTTGTAAAAAAAAATCTGGAATGCACAAGTTTGTTAAATATGCAAAATAAAAAATGTAAACTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA；
所述卵形鲳鲹β-胸腺素的的氨基酸序列如SEQ ID NO.2：
MSDNKPDISDVTSFDKTKLKKTETQEKNTLPTKETIEQEKSESS
本发明还提供所述卵形鲳鲹β-胸腺素在鱼类抗细菌疾病药物。
本发明还提供所述卵形鲳鲹β-胸腺素在鱼类抗细菌疾病药物中的应用。
进一步，所述的细菌为缓爱德华氏菌病、哈维氏弧菌病或无乳链球菌病。
本发明提供了卵形鲳鲹β-胸腺素抗病基因及其编码蛋白质的重组表达方法，具体为提取卵形鲳鲹的RNA，将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，以下述序列为引物，通过PCR获得β-胸腺素抗病基因的基因序列，所述引物的序列为：
TroTβ-F：5’-gatatcATGAGTGACAACAAGCCC-3’；
TroTβ-R：5’-gatatcTGATGACTCTGACTTCTCC-3’。
反应条件：94℃预变性2min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸5min；扩增后的片段经胶回收后与pMD19-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌落进行PCR检测；检测正确后提取重组质粒，EcoRV限制性内切酶酶切后回收132bp片段；提取PET-32a质粒同时质粒经EcoRV酶切后，利用T4连接酶将上述132bp回收片段连接构建重组质粒；重组质粒经基因测序验证含有β-胸腺素基因，将其命名为pTroTβ；
将上述的质粒pTroTβ用常规方法转入表达菌株BL21感受态细胞中，在含有50ug/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12-20小时，挑取阳性转化子，将其命名为BL21/pTroTβ；
将BL21/pTroTβ菌株接种至含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，30℃条件下，200rpm/min振荡培养至OD600约为0.6，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.5mmol/L进行诱导表达，30℃条件下继续以200rpm/min摇动培养6h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液，加入6ml裂解液，-80℃速冻之后，4℃解冻，而后再进行超声破碎后，以10000g,4℃离心30min,回收上清液并进行层析柱回收纯化。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明的β-胸腺素能够显著抑制致病菌的生长，并且注射鱼类之后能够显著提高鱼类的抗病能力。
附图说明
图1为本发明实施提供的诱导及纯化的β-胸腺素蛋白电泳图。泳道M，分子量标准；泳道2，对照；泳道3，β-胸腺素诱导；泳道4，β-胸腺素纯化。
图2为本发明实施提供的纯化的β-胸腺素蛋白抑制致病菌生长的生长曲线图。A为抑制迟缓爱德华氏菌生长曲线图，B为抑制哈维氏弧菌生长曲线图，C为抑制无乳链球菌生长曲线图。其中空心圆形曲线为对照蛋白，实心圆形曲线为本发明实施提供的纯化的β-胸腺素蛋白。
图3为实验鱼注射纯化的β-胸腺素蛋白后肾脏、脾脏及肝脏中的细菌在各个时间点的数量图：A、肝脏，B、脾，C、肾。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的技术方案不受实施例任何形式上的限制。
实施例
一种卵形鲳鲹β-胸腺素，所述卵形鲳鲹β-胸腺素的cDNA核苷酸的序列如SEQ IDNO.1；所述卵形鲳鲹β-胸腺素的的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。
提取卵形鲳鲹的RNA，将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，以下述序列为引物，通过PCR获得β-胸腺素抗病基因的基因序列，所述引物的序列为：
TroTβ-F：5’-gatatcATGAGTGACAACAAGCCC-3’；
TroTβ-R：5’-gatatcTGATGACTCTGACTTCTCC-3’。
反应条件：94℃预变性2min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸5min。扩增后的片段经胶回收后与pMD19-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌落进行PCR检测。检测正确后提取重组质粒，EcoRV限制性内切酶酶切后回收132bp片段。提取PET-32a质粒同时质粒经EcoRV酶切后，利用T4连接酶将上述132bp回收片段连接构建重组质粒。重组质粒经基因测序验证含有β-胸腺素基因，将其命名为pTroTβ。
β-胸腺素重组蛋白的诱导表达和纯化
将上述的质粒pTroTβ用常规方法转入表达菌株BL21感受态细胞中(购于全式金科技有限公司，北京)，在含有氨苄青霉素(50ug/ml)的LB固体培养基上培养12-20小时，挑取阳性转化子，将其命名为BL21/pTroTβ。
将BL21/pTroTβ菌株接种至含氨苄青霉素(50ug/ml)的LB培养基中，30℃条件下，200rpm/min振荡培养至OD600约为0.6，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mmol/L进行诱导表达，30℃条件下继续以200rpm/min摇动培养6h，而后以5000g,4℃离心10min，收集菌液，加入6ml裂解液，-80℃速冻之后，4℃解冻，而后再进行超声破碎后，以10000g,4℃离心30min,回收上清。讲上清中的蛋白用亲和层析柱HisTrap HPCplumne(购于美国GE Healthcare公司)回收纯化。将诱导的蛋白、纯化的蛋白及对照空载体诱导的蛋白用SDS-PAGE电泳分析检测(8v/cm电压下电泳25-30min，随后15v/cm电压下电泳2-2.5h)，测定其诱导及分子量大小(参见图1)。发现蛋白质质量与β-胸腺素质量一致。
所述裂解液为终浓度50mM NaH2PO4，300mM NaCl和10mM imidazole，PH8.0。
实施例2β-胸腺素的抑菌作用
将实施例1述纯化的β-胸腺素蛋白在PBS中稀释至1ug/ul。将迟缓爱德华氏菌，哈维氏弧菌和无乳链球菌，在LB培养基中，30℃条件下，200rpm/min振荡培养至OD600约为0.6，分别取50ul菌液与50ulβ-胸腺素稀释液混匀，在30℃，250rpm转速下，Growth Curves公司的Bioscreen C进行测量，OD600每小时测量一次，连续测量96小时，β-胸腺素蛋白可以显著抑制缓爱德华氏菌，哈维氏弧菌和无乳链球菌的生长，结果见图2。
实施例3β-胸腺素蛋白注射鱼类后显著提高鱼类的抗病感染能力
将实施例1纯化的β-胸腺素蛋白在PBS中稀释至200ug/ml，即为β-胸腺素稀释液。将30条卵形鲳鲹(重约15g)随机分为2组，每组15条。将两组分别命名为A和B，A组的每条鱼分别注射100ulβ-胸腺素稀释液，将B组分别注射100ul PBS。
将迟缓爱德华氏菌在LB培养基中，30℃条件下，200rpm/min振荡培养至OD600约为0.6，估算1OD＝5*108CFU/ml，于PBS中稀释至106CFU/ml，即为缓爱德华氏菌细菌悬液。
攻毒感染
在将A和B组实验鱼注射100ulβ-胸腺素稀释液或100ul PBS 1天后，每条鱼注射100ul上述步骤制备的缓爱德华氏菌细菌悬液进行人工感染。在感染后6h，12h及24h，取鱼的肾脏、脾脏及肝脏，组织研磨于PBS中制备各组织悬液，组织悬液涂布LB固体平板，30℃培养24h后，进行细菌的菌落计算。结果表明，A组鱼肾脏、脾脏及肝脏的细菌数在各个时间点均显著(P<0.05)低于B组鱼组织中的细菌数，见图3。
所述PBS组分的配方为：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO4 2mmol/L，pH7.2～7.4。
这些结果表明，β-胸腺素能够显著抑制致病菌的生长，并且能够显著增强鱼类抵抗细菌的侵染能力。因此，卵形鲳鲹β-胸腺素可以制备成预防缓爱德华氏菌病、哈维氏弧菌病或无乳链球菌病的注射制剂。
SEQUENCE LISTING
<110> 海南大学
<120> 一种卵形鲳鲹β-胸腺素及其应用
<130> 无
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 602
<212> DNA
<213> Trachinus draco
<400> 1
actactgctg caacgcactg accagagacc ttccagcgat cccgtcagcc aacgcttcga 60
ctctctgcaa ccatgagtga caacaagccc gacatctcag acgtgaccag cttcgacaag 120
accaaactga agaagacgga gactcaagag aaaaacacac tgccaaccaa agaaaccatc 180
gaacaggaga agtcagagtc atcatgaaga tcagtcctcc tgtacactgc acattccaca 240
agccttgcct ctttcaacct tttccaacat gtattccaag ttgcagaact taataattga 300
caaaacgttg gctgtacaac cacacaactc aacttgccta gatgtccctc tggtacagtg 360
aggaagtggt ggctcaatgt cggcatgagt tcctggtcac ctgttttttg ctggggctgt 420
atctcaaggt gtcatgaaac aactgaggga cctacacttc atgatttgta gccctgctct 480
agccacctgt gaatgctcac aaagcaagct gtttcttttt gtaaaaaaaa atctggaatg 540
cacaagtttg ttaaatatgc aaaataaaaa atgtaaactg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600
aa 602
<210> 2
<211> 44
<212> PRT
<213> Trachinus draco
<400> 2
Met Ser Asp Asn Lys Pro Asp Ile Ser Asp Val Thr Ser Phe Asp Lys
1 5 10 15
Thr Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Thr Leu Pro Thr
20 25 30
Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Ser Glu Ser Ser
35 40
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ATGAGTGACAACAAGCCC
<400> 3
atgagtgaca acaagccc 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TGATGACTCTGACTTCTCC
<400> 4
tgatgactct gacttctcc 19

Claims (6)

1.一种卵形鲳鲹β-胸腺素，其特征在于所述卵形鲳鲹β-胸腺素的cDNA核苷酸的序列如SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述的一种卵形鲳鲹β-胸腺素，其特征在于卵形鲳鲹β-胸腺素的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。
3.根据权利要求1所述的一种卵形鲳鲹β-胸腺素，其特征在于所述卵形鲳鲹β-胸腺素在鱼类抗细菌疾病药物。
4.根据权利要求1所述的卵形鲳鲹β-胸腺素在鱼类抗细菌疾病药物中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的细菌为缓爱德华氏菌病、哈维氏弧菌病或无乳链球菌病。
6.权利要求1所述卵形鲳鲹β-胸腺素的重组蛋白表达方法，具体为提取卵形鲳鲹的RNA，将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，以下述序列为引物，通过PCR获得β-胸腺素抗病基因的基因序列，所述引物的序列为：
TroTβ-F：5’-gatatcATGAGTGACAACAAGCCC-3’，
TroTβ-R：5’-gatatcTGATGACTCTGACTTCTCC-3’；
反应条件：94℃预变性2min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸5min；扩增后的片段经胶回收后与pMD19-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌落进行PCR检测；检测正确后提取重组质粒，EcoRV限制性内切酶酶切后回收132bp片段；提取PET-32a质粒同时质粒经EcoRV酶切后，利用T4连接酶将上述132bp回收片段连接构建重组质粒；重组质粒经基因测序验证含有β-胸腺素基因，将其命名为pTroTβ；
将上述的质粒pTroTβ用常规方法转入表达菌株BL21感受态细胞中，在含有50ug/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12-20小时，挑取阳性转化子，将其命名为BL21/pTroTβ；
将BL21/pTroTβ菌株接种至含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，30℃条件下，200rpm/min振荡培养至OD600约为0.6，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.5mmol/L进行诱导表达，30℃条件下继续以200rpm/min摇动培养6h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液，加入6ml裂解液，-80℃速冻之后，4℃解冻，而后再进行超声破碎后，以10000g,4℃离心30min,回收上清液并进行层析柱回收纯化得到卵形鲳鲹β-胸腺素蛋白。
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