CN101948843A - 草鱼胸腺素β11基因序列 - Google Patents

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辜文博
袁恬
府跃军
顾继锐
吴江
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Abstract

本发明公开了一种草鱼胸腺素β11的基因，以本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中胸腺素β11EST序列为模版设计引物，结合RACE技术，用PCR法扩增克隆得到草鱼胸腺素β11基因的全表达序列。对于研究草鱼胸腺素β11基因结构组成，探讨其在草鱼抗病机理的作用和功能区域位置，以及与其他物种的区别都提供了重要的理论依据。本发明对探索建立草鱼基因组计划与草鱼抗病机制的研究之间纽带的方法具有开创性作用。

Description

草鱼胸腺素β11基因序列 
技术领域
本发明涉及分子生物学中的基因克隆领域，尤其涉及草鱼胸腺素β11基因的核苷酸及氨基酸序列。 
背景技术
β-胸腺素(Thymosin β，Tβ)是一类结功能多样的小肽分子，分子量大小为5KD左右，等电点介于5～7之间，是细胞中主要的肌动蛋白单体结合蛋白，防止肌动蛋白单体聚合形成肌动蛋白纤维，维持G-肌动蛋白和F-肌动蛋白的动态平衡，对细胞骨架的稳定起至关重要的作用。胸腺素β还通过调节末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)的活性促进T细胞的分化成熟。此外，胸腺素β还具有缓解炎症、抑制细胞凋亡的功能，在肿瘤的发生中起重要作用。 
目前NCBI上只能查到较少种类鱼类的Tβ的全长cDNA，而在淡水经济鲤科鱼类中克隆到β-胸腺素(Thymosin β，Tβ)尚属首次。 
目前β-胸腺素在草鱼基因研究上还属空白。本基因的获得可以进一步研究该基因在草鱼细胞中的组成及基因结构，并为研究草鱼病害的防治提供新的思路。 
发明内容
本发明的目的是以本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中β-胸腺素EST序列为模版设计引物，结合RACE技术，用PCR法扩增克隆得到草鱼β-胸腺素基因的全表达序列。 
上述目地是通过以下技术方案来实现的： 
取出新鲜草鱼肠道组织，采用TRIzol(Invitrogen Corporation)一步法提取总RNA，甲醛变性凝胶电泳和DNA/RNA calculator(Qenequant)检测总RNA质量。 
本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中筛选到β-胸腺素EST序列，经测序比对后发现该EST序列具有β-胸腺素的完整3’端，欠缺cDNA序列的5’端。利用cDNA末端快速扩增技术(RapidAmplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的5端进行扩增。 
根据已知EST序列设计外侧和内侧两个特异引物： 
5端特异引物1：5’-GGCAATGCAGGGAAGGGAG-3’ 
5端特异引物2：5’-CGCCTGCTTCTCCTGTTCAATG-3’ 
通用引物： 
Long：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ 
Short：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ 
接头引物：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’ 
5端核心引物：5.’-(T)25V N-3’(N＝A，C，G，or T；V＝A，G.，or C) 
以接头引物和5端核心引物反转录合成的第一链cDNA为模版进行PCR反应，上游引物使用通用引物，下游引物使用5端特异引物1。PCR结果琼脂糖凝胶电泳胶回收后用通用引物和5端特异引物2进行PCR验证。将验证后的序列片段连接到pMD18-T质粒，转入E.Coli JM109菌株，经质粒酶切验证后用M13通用引物测序。扩增得到片段大小为170bp。 
再根据5端扩增片段和已知EST序列拼接，对全序列进行调整后获得了完整的草鱼β-胸腺素基因序列，既目的基因。 
草鱼β-胸腺素基因的获得可以进一步研究该基因在草鱼细胞中的组成及基因结构，并为研究草鱼病害的防治提供新的思路。 
具体实施方式
下面通过以下具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明的内容完全不局限于此。 
1.总RNA的提取 
挑选实验材料——健康雌性草鱼，体长570mm，约1.5冬龄(18个月)，2.4kg。取出新鲜草鱼肠道组织，液氮迅速冷冻后保存于-80℃冰箱备用。采用TRIzol(InvitrogenCorporation)一步法提取总RNA，甲醛变性凝胶电泳和DNA/RNA calculator(Qenequant)检测总RNA质量。 
2.cDNA第一链的合成 
取草鱼肠道细胞总RNA 5ug与反转录引物(5端核心引物和接头引物)各1ul(12uM)混合，70℃加热2分钟，立即放置冰上，然后加入5x buffer，10mM dNTP混合液，20mM DTT，M-MLV反转录酶，反应体系为10UL。反应过程为42℃1小时30分钟，之后加入90ul TE buffer(PH8.0)，72℃加热7分钟。最后得到100ul草鱼肠道细胞cDNA模板，放入-20℃保存备用。 
3.引物设计依据和合成方法 
在本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中筛选到含有β-胸腺素EST序列的转化子，送交测序，并将测序结果在GenBank中进行比对，比对结果显示该EST序列含有β-胸腺素cDNA的 完整3’端，欠缺cDNA序列的5’端。以该EST序列为模版设计2个5端特异引物，其中引物1用于初步扩增β-胸腺素的5端序列，引物2用于对初步扩增序列进行验证。引物序列设计后送交Invitrogen Corporation进行合成。 
5端特异引物1：5’-GGCAATGCAGGGAAGGGAG-3’ 
5端特异引物2：5’-CGCCTGCTTCTCCTGTTCAATG-3’ 
4.草鱼β-胸腺素基因cDNA全序列的克隆 
以草鱼β-胸腺素EST序列为模版设计的5端特异引物1和通用引物扩增片段约为170bp。 
4.1用第一链cDNA末端快速扩增技术进行初步PCR扩增 
以上述合成的第一链cDNA作为模板，根据已知EST序列设计特异性引物1，利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的5’末端进行扩增。 
在5’RACE中，利用末端转移酶和接头引物在cDNA的5’末端加上CCC后，以加尾后的cDNA作为模板，利用5端特异性引物1和通用引物进行PCR扩增，片段反应体系如下：第一链cDNA模板1.5uL，10xPCR反应缓冲液5uL，25mmol/L MgCl2 3uL，2.5mmol/L dNTP 2uL，10umol/L 5端特异引物1和通用引物各1uL，Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50uL。反应条件如下：1个循环，94℃变性2min；5个循环，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min；5个循环，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min；25个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。 
所扩增的PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，共得到3条清晰条带，大小分别为300bp、250bp、150bp，将其分别从凝胶中纯化回收。 
4.2用第一链cDNA末端快速扩增技术进行PCR验证扩增 
分别以4.1中扩增得到的3个片段为模板，根据已知EST序列设计特异性引物2，利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的5’末端进行验证扩增。 
利用5端特异性引物1和通用引物进行PCR扩增，片段反应体系如下：模板1.5uL(分别以4.1中扩增得到的3个片段为模板)，10xPCR反应缓冲液5uL，25mmol/L MgCl2 3uL，2.5mmol/L dNTP 2uL，10umol/L 5端特异引物2和通用引物各1uL，Taq酶1.25U，用PCR水将 反应体系补充至50uL。反应条件如下：1个循环，94℃变性2min；5个循环，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min；5个循环，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min；25个循环，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸2min；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。 
所扩增的PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，仅在以250bp片段为模板的反应体系中得到大小为150bp左右的清晰条带，从凝胶中纯化回收该片段。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA，经EcoR I和Hind III双酶切验证后，将具有插入片段质粒DNA的转化子送交InvitrogenCorporation，利用M13通用引物进行双向测序。 
4.3用第一链cDNA进行开放阅读框的PCR扩增 
以上述合成的第一链cDNA作为模板，根据5端扩增片段和已知EST序列拼接所得结果设计上下游引物对上述操作所的草鱼β-胸腺素基因的开放阅读框进行PCR扩增以验证所得序列的正确性。 
利用上下游引物进行PCR扩增，片段反应体系如下：模板1uL，10xPCR反应缓冲液5uL，25mmol/L MgCl2 3uL，2.5mmol/L dNTP 2uL，10umol/L上游引物和下游引物各1uL，Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50uL。反应条件如下：1个循环，94℃变性2min；30个循环，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。 
所扩增的PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到大小为250bp左右的清晰条带，从凝胶中纯化回收该片段。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA，经EcoR I和Hind III双酶切验证后，将具有插入片段质粒DNA的转化子送交Invitrogen Corporation，利用M13通用引物进行双向测序。 
将开放阅读框序列的测序结果与5端扩增片段和已知EST序列拼接所得序列进行比对，对全序列进行调整后获得了完整的草鱼β-胸腺素基因序列，既目的基因。 
5.草鱼β-胸腺素基因序列的确定 
将PCR反应所得5端扩增片段和开放阅读框片段分别克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA，经EcoR I和Hind III双酶切验证后，将具有插入片段质粒DNA的转化子送交Invitrogen Corporation，利用M13通用引物进行双向测序。所得结果用vector NT进行拼接，比对分析，获得一完整的cDNA序列。将该序 列用BLAST软件(http://www.ncbi.nim.nih.gov/blast)进行同源性测定，来确定为草鱼β-胸腺素基因同源序列。比对结果为： 
Figure DEST_PATH_GSB00000357594600051
根据Iron1995年的报道，只要两个序列间用BLAST软件比对后E-Value值小于0.005，则两个序列之间具有绝对的同源性，即证明序列为同一种基因序列。从比对结果看草鱼目的基因序列BLAST比对后，与其他物种的β-胸腺素基因的E值绝对小于0.005，所以证明所克隆的目的基因是β-胸腺素基因的同源序列。 
草鱼β胸腺素属于β胸腺素家族，位于氨基酸序列18-26位置的氨基酸是肌动蛋白结合区域，其主要是静电接触位点位点，是β胸腺素最为重要的保守区域。草鱼β胸腺素拥有该家族典型的的肌动蛋白结合位点(LKKTETQEK)，多重序列对比结果显示，β胸腺素在不同生物体中都高度保守。草鱼是我国特有鲤科大型经济鱼类，在本研究之前没有对其β胸腺素的研究报道。 
利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)提供的蛋白序列保守区分析软件进行保守区分析，发现草鱼β胸腺素具有典型的β胸腺素功能区保守序列，包括一个肌动蛋白结合位点(LKKTETQEK)。 
6.草鱼β胸腺素在被病菌感染草鱼胸腺中的表达 
按照前述的RNA提取、cDNA合成方法取不同时期(感染后第1、3、5、7天)人为被感染嗜水气单胞菌的草鱼胸腺以检验草鱼β胸腺素对诱导胸腺T细胞分化是否直接发生作用。β-actin作为内参以调节cDNA模板的量，使模板数一致，从而通过PCR技术检验基因表达量。所用引物为： 
β-actin： 
sense：5’-3’         ATAGCCGTGACCTGACTGACT 
Anti-sense：5’-3’    ATACAAGACTCCATACCCAAGAA 
目的基因特异引物： 
sense：5’-3’         TACAGACTGTTTGGTTTG 
Anti-sense：5’-3’    TCACGAGGCCGCCTGCTTCTC 
结果显示，随着感染时间的增加，草鱼β胸腺素在草鱼胸腺中表达量也随之增加。 
Figure ISA00000168731700021

Claims (1)

1.一种草鱼草鱼胸腺素β11基因，其特征在于具有以下RNA核苷酸及相应的氨基酸序列：
gctaaagacttcaaactacagtccgtctacgaagcagacaaccaatc                    47
atg tct gac aaa cca aac ctg gat gag gtc                            77
Met Ser Asp Lys Pro Asn Leu Asp Glu Val                10
1                5                  10
acc agc ttt gac aaa acc aag ttg aag aag                            107
Thr Ser Phe Asp Lys Thr Lys Leu Lys Lys                20
11               15                  20
act gag aca cag gag aaa aac cca ctg cca                            137
Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro                30
21               25                  30
tct aaa gaa acc att gaa cag gag aag cag                            167
Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln                40
31               35                  4Q
gcg gcc tcg tga agacacaagctgccatcatgcactgtgcacactcc                214
Ala Ala Ser                                            43
41       43
ccttcttttcattcacttcttttagcagtataactttgtaaccaaaatgtaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaactcgagggacccatcctcg                                    320。 
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