CN111909947B - 一种仿刺参β-胸腺素的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体关于一种仿刺参β‑胸腺素的制备及应用；本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种仿刺参β‑胸腺素及其应用。仿刺参β‑胸腺素重组蛋白，是以仿刺参cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增β‑胸腺素基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为重组蛋白。本发明β‑胸腺素加入灿烂弧菌后能够显著抑制其活性，有效的抵抗病原菌对仿刺参的侵染。

Description

一种仿刺参β-胸腺素的制备及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其是一种仿刺参β-胸腺素的制备及应用。
背景技术
胸腺素是具有生物活性的多肽，最早是从小牛胸腺中提取出来的，分为α（PI<5）、β(5<PI<7)、和γ(PI>7)亚型。β-胸腺素家族分子量约为5KDa, 由40-44个氨基酸组成，在生物体内的表达具有物种特异性。β-胸腺素能够调节单体肌动蛋白浓度，维持细胞骨架重排的动力学，参与细胞的迁移、分化、细胞分裂等细胞活动。另外β-胸腺素作为抗菌肽，也具有抗菌和抗病毒等方面的活性。
CN1644586A涉及氧化胸腺素β4在治疗中的应用，尤其是在治疗与炎症反应或感染性休克有关的病症中的应用。该发明也提供含有氧化胸腺素β4和适宜赋型剂的药物制剂。
CN105504043B涉及改进的β胸腺素片段，具体而言，该发明提供了一种具有对应于胸腺素β4、胸腺素β10和/或胸腺素15氨基酸序列的一部分的氨基酸序列的肽片段，以及使用所述肽片段的治疗方法。
CN101948843A公开了一种草鱼胸腺素β11的基因，以本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中胸腺素β11EST序列为模版设计引物，结合RACE技术，用PCR法扩增克隆得到草鱼胸腺素β11基因的全表达序列。对于研究草鱼胸腺素β11基因结构组成，探讨其在草鱼抗病机理的作用和功能区域位置，以及与其他物种的区别都提供了重要的理论依据。该发明对探索建立草鱼基因组计划与草鱼抗病机制的研究之间纽带的方法具有开创性作用。
近年来，抗生素滥用导致细菌耐药性日益严重，β-胸腺素作为一种具有天然抗菌活性的多肽，将为抗菌新药的研发提供了一条新的途径。同时，β-胸腺素也可用于水产养殖中病害的防治。目前在海洋生物中已经展开了对胸腺素的相关研究，太平洋牡蛎的胸腺素表现出较强的抗菌抗病毒能力，克氏原螯虾胸腺素具有抗病毒能力，金鲳鱼胸腺素具有抗菌抑菌的能力，斑马鱼胸腺素能够与细菌结合、凝集并损伤细菌。仿刺参作为我国重要的水产养殖品种，随着养殖规模的不断扩大，病害成为限制其发展的一个关键因素。其中最常见的病害是“腐皮综合症”，主要采用投喂抗生素的方式来进行预防和治疗。因此，研究仿刺参中β-胸腺素的抗菌活性，将有助于免疫增强剂的开发，推动仿刺参养殖业健康可持续发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种仿刺参β-胸腺素的制备及应用。
本发明的一种仿刺参β-胸腺素的制备及应用，其技术方案包括以下具体步骤：
（1）仿刺参β-胸腺素表达载体的构建，采用引物F1：TATAGGATCCATGAGTGACAAACCAGACATC；R1：TATACTCGAGCTATGTTGCTTTCTCCTGCTC；扩增仿刺参β-胸腺素基因；
PCR反应程序94℃ 2min；(94℃ 1min，55℃1min，72℃ 2min)×25；72℃ 5min；PCR产物用天根试剂盒纯化；将表达载体PGEX-4T用限制性内切酶BamhI和XhoI酶切后回收后回收4.9 kb 片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA 连接酶连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有氨苄霉素(50μg /ml)的LB培养基中培养过夜（18-24h）；筛选阳性转化子提取质粒，命名为tPexT，采用上述引物F1和R1进行PCR扩增，产物经过测序证明质粒tPexT中所插入的序列与β-胸腺素基因序列一致。
（2）仿刺参β-胸腺素重组蛋白的表达，将质粒tPexT在含有氨苄霉素(50μg/ml) 的LB 液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液，加入100ml 新鲜的含有氨苄霉素(50μg/ml) 的LB 液体培养基中，于37℃下转速220rpm 摇动培养至OD595为1.0，加入终浓度为0.1mM 的IPTG，37℃继续以转速220rpm摇动培养3.5h，而后以4000rpm，4℃离心10min，收集菌液；
（3）仿刺参β-胸腺素重组蛋白的纯化，向菌液中加入5ml 裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2 小时，直至菌悬液变澄清为止，将菌液以12000rpm，4℃离心20min，回收上清；将上清中的蛋白用亲和层析柱回收纯化；将纯化的蛋白经SDS-PAGE（15%）电泳检测(8v/cm电压下电泳25-30min，随后15v/cm 电压下电泳2-2.5h)，PGEX-4T载体上GST标签大小是26KD，目的蛋白大小是4.6KD，所以检测蛋白大小为31KD。
所述的亲和层析柱为一种β-胸腺素重组蛋白亲和层析柱，利用IGG-FC片段结合蛋白偶联到氨基活化琼脂糖载体上，再利用交联剂对氨基活化琼脂糖载体进行交联后装填亲和柱。
所述氨基活化琼脂糖载体采用琼脂糖载体与盐酸在氯化锌的作用被氯化，再与3-氨基甘油在乙醇钠作用下发生反应制备得到。
所述的亲和层析柱为一种β-胸腺素重组蛋白亲和层析柱，其制备方法如下：
步骤1：按照质量份数，将5-10份的琼脂糖载体用100-200份的质量百分比浓度5-10%的盐酸，0.2-0.6份的氯化锌，控温40-55℃，溶胀活化5-10h；再加入0.5-3份的3-氨基甘油，0.3-2份乙醇钠混合均匀，控温65-85℃，搅拌2-6h，反应结束冷却至5-10℃，过滤，然后将活化后的琼脂糖载体用去离子水洗涤，至检测洗液中无锌离子，得到氨基活化琼脂糖载体，
其反应机理示意如下：
首先；琼脂糖载体与盐酸在氯化锌的作用下被氯化，以下仅为其部分反应的示意式，不代表其全部的反应。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
氯化的琼脂糖载体与3-氨基甘油在乙醇钠作用下发生反应，以下仅为其部分反应的示意式，不代表其全部的反应。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
步骤2：然后加入100-150份去离子水， 15-32份的1.6-3.8mg/ml的IGG-FC片段结合蛋白室温反应4-8h，完成反应后先用pH值为7.4 的磷酸缓冲液 PBS 洗涤氨基活化琼脂糖载体，然后将琼脂糖载体用40-80份的 pH值为7.4的硼酸缓冲液循环洗涤，所述的pH值为7.4的硼酸缓冲液中含有2.3-3.8mM的交联剂N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酯，室温交联 30-60min，完成后加入10-18份的质量百分比浓度为6-12%的乙醇胺水溶液终止反应5-15min；完成后用pH值为7.4 的 PBS 缓冲溶液洗涤氨基活化琼脂糖载体3-10次，然后将交联后的改性琼脂糖载体装入层析柱中，即可得到所述的一种β-胸腺素重组蛋白亲和层析柱。
所述的裂解液为化学细胞裂解液或酶细胞裂解液。
所述的一种仿刺参β-胸腺素的应用是作为抗菌新药代替传统的抗生素，应用于养殖病害防治。
β-胸腺素重组蛋白在大肠杆菌进行表达的反应机理：
将β-胸腺素mRNA连接到具有N-GST标签的PGEX-4T载体上，PGEX-4T载体序列中含有tac启动子，在没有诱导物存在的情况下，质粒上携带的lacIq基因产物可以有效的抑制tac启动子的转录。当有诱导剂IPTG存在时，IPTG可以和阻遏蛋白结合，tac启动子开始转录。大肠杆菌BL21可以高表达融合有GST标签的蛋白。
β-胸腺素能够对引起仿刺参腐皮综合症的灿烂弧菌产生显著抑制效果的反应机理：
β-胸腺素作为一种抗菌肽具有结合病原菌的能力，其表面携带的正电荷通过静电作用和细菌表面的负电荷发生作用，破坏细菌细胞壁进而抑制细菌生长。
本发明的优点在于：①β-胸腺素来源于仿刺参，是天然活性多肽。②β-胸腺素重组蛋白在大肠杆菌进行表达，成本低、产量高、易于操作。③β-胸腺素能够对引起仿刺参腐皮综合症的灿烂弧菌产生显著抑制效果。
附图说明：
图1为仿刺参β-胸腺素目的序列扩增电泳图
图2为仿刺参β-胸腺素重组蛋白SDS-PAGE图
图3为仿刺参β-胸腺素所属家族的结构模型
具体实施方式
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1. 质粒提取、DNA产物纯化、回收，皆使用 “天根生物技术（北京）有限公司”的相应试剂盒。
2. 重组蛋白转化大肠杆菌BL21中进行原核表达，参考Hanahan 方法(Sambrookand Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)。
3. CCK-8细菌活性检测试剂盒购自于贝博生物科技有限公司。
本发明中的β-胸腺素序列为序列表SEQ ID NO.1中的氨基酸序列。
序列表SEQ ID NO.1为：
MSDKPDISEVNSFDKTKLKKTETAEKNTLPTKETIEQEKAT
（a）序列特征：
长度：41
类型：氨基酸序列
链型：单链
拓扑结构：线性
最初来源：仿刺参
结构特点：富含碱性氨基酸
采用CCK-8细菌活性检测法测定仿刺参β-胸腺素的抑菌活性。
①灿烂弧菌悬液的制备。将实验室保藏的灿烂弧菌进行活化，在2216E液体培养基中28℃条件下培养至对数生长期（1×106 CFU/ml），调整菌浓度在CCK-8溶液中培养2h后，OD450的值为1.0。②β-胸腺素蛋白溶液的配制。将上述实施例2 纯化的β-胸腺素在PBS 中稀释至100μg/ml，取10μl加入180μl ①中的菌液中，即为测试组。取10μl PBS加入180μl①中的菌液中，即为对照组。仅加入 ①中所述的190μl培养基，无细菌的，为空白组。③细菌活性检测。在96 孔板内每孔接种190μl ②中所述的细菌悬液，每组做六个重复。每孔加入10μl 的染色溶液。将培养板在培养箱中28℃，避光培养2h。用酶标仪测定在450nm 处的吸光度。
细菌活力计算：
各重复孔的OD 值取平均数。
细菌活力% =（测试孔OD-空白OD/对照孔OD-空白OD）×100
实施例1
一种仿刺参β-胸腺素的制备及应用，其技术方案包括以下具体步骤：
（1）仿刺参β-胸腺素表达载体的构建，采用引物F1：TATAGGATCCATGAGTGACAAACCAGACATC；R1：TATACTCGAGCTATGTTGCTTTCTCCTGCTC；扩增仿刺参β-胸腺素基因；
PCR反应程序94℃ 2min；(94℃ 1min，55℃1min，72℃ 2min)×25；72℃ 5min；PCR产物用天根试剂盒纯化；将表达载体PGEX-4T用限制性内切酶BamhI和XhoI酶切后回收后回收4.9 kb 片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA 连接酶连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有氨苄霉素(50μg /ml)的LB培养基中培养过夜（18h）；筛选阳性转化子提取质粒，命名为tPexT，采用上述引物F1和R1进行PCR扩增，产物经过测序证明质粒tPexT中所插入的序列与β-胸腺素基因序列一致。
（2）仿刺参β-胸腺素重组蛋白的表达，将质粒tPexT在含有氨苄霉素(50μg/ml) 的LB 液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液，加入100ml 新鲜的含有氨苄霉素(50μg/ml) 的LB 液体培养基中，于37℃下转速220rpm 摇动培养至OD595为1.0，加入终浓度为0.1mM 的IPTG，37℃继续以转速220rpm摇动培养3.5h，而后以4000rpm，4℃离心10min，收集菌液；
（3）仿刺参β-胸腺素重组蛋白的纯化，向菌液中加入5ml 裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1 小时，直至菌悬液变澄清为止，将菌液以12000rpm，4℃离心20min，回收上清；将上清中的蛋白用亲和层析柱回收纯化；将纯化的蛋白经SDS-PAGE（15%）电泳检测(8v/cm 电压下电泳25min，随后15v/cm 电压下电泳2h)，PGEX-4T载体上GST标签大小是26KD，目的蛋白大小是4.6KD，所以检测蛋白大小为31KD。
所述裂解液为终浓度的100mM GSH, 1% Triton X-100, 58mM Na2HPO4,17mMNaH2PO4,68mM NaCl, pH8.0。
所述的亲和层析柱为一种β-胸腺素重组蛋白亲和层析柱，其制备方法如下：
步骤1：将5g的琼脂糖载体用100g的质量百分比浓度5%的盐酸，0.2g的氯化锌，控温40℃，溶胀活化5h；再加入0.5g的3-氨基甘油，0.3g乙醇钠混合均匀，控温65℃，搅拌2h，反应结束冷却至5℃，过滤，然后将活化后的琼脂糖载体用去离子水洗涤，至检测洗液中无锌离子，得到氨基活化琼脂糖载体，
步骤2：然后加入100g去离子水， 15g的1.6mg/ml的IGG-FC片段结合蛋白室温反应4h，完成反应后先用pH值为7.4 的磷酸缓冲液 PBS 洗涤氨基活化琼脂糖载体，然后将琼脂糖载体用40g的 pH值为7.4的硼酸缓冲液循环洗涤，所述的pH值为7.4的硼酸缓冲液中含有2.3mM的交联剂N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酯，室温交联 30min，完成后加入10g的质量百分比浓度为6%的乙醇胺水溶液终止反应5min；完成后用pH值为7.4 的 PBS 缓冲溶液洗涤氨基活化琼脂糖载体3次，然后将交联后的改性琼脂糖载体装入层析柱中，即可得到所述的一种β-胸腺素重组蛋白亲和层析柱。
所述的裂解液为化学细胞裂解液。
所述的一种仿刺参β-胸腺素的应用是作为抗菌新药代替传统的抗生素，应用于养殖病害防治。
实施例2
一种仿刺参β-胸腺素的制备及应用，其技术方案包括以下具体步骤：
（1）仿刺参β-胸腺素表达载体的构建，采用引物F1：TATAGGATCCATGAGTGACAAACCAGACATC；R1：TATACTCGAGCTATGTTGCTTTCTCCTGCTC；扩增仿刺参β-胸腺素基因；
PCR反应程序94℃ 2min；(94℃ 1min，55℃1min，72℃ 2min)×25；72℃ 5min；PCR产物用天根试剂盒纯化；将表达载体PGEX-4T用限制性内切酶BamhI和XhoI酶切后回收后回收4.9 kb 片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA 连接酶连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有氨苄霉素(50μg /ml)的LB培养基中培养过夜（24h）；筛选阳性转化子提取质粒，命名为tPexT，采用上述引物F1和R1进行PCR扩增，产物经过测序证明质粒tPexT中所插入的序列与β-胸腺素基因序列一致。
（2）仿刺参β-胸腺素重组蛋白的表达，将质粒tPexT在含有氨苄霉素(50μg/ml) 的LB 液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液，加入100ml 新鲜的含有氨苄霉素(50μg/ml) 的LB 液体培养基中，于37℃下转速220rpm 摇动培养至OD595为1.0，加入终浓度为0.1mM 的IPTG，37℃继续以转速220rpm摇动培养3.5h，而后以4000rpm，4℃离心10min，收集菌液；
（3）仿刺参β-胸腺素重组蛋白的纯化，向菌液中加入5ml 裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动2 小时，直至菌悬液变澄清为止，将菌液以12000rpm，4℃离心20min，回收上清；将上清中的蛋白用亲和层析柱回收纯化；将纯化的蛋白经SDS-PAGE（15%）电泳检测(8v/cm 电压下电泳30min，随后15v/cm 电压下电泳2.5h)，PGEX-4T载体上GST标签大小是26KD，目的蛋白大小是4.6KD，所以检测蛋白大小为31KD。
所述的亲和层析柱为一种β-胸腺素重组蛋白亲和层析柱，其制备方法如下：
步骤1：将7g的琼脂糖载体用150g的质量百分比浓度8%的盐酸，0.4g的氯化锌，控温48℃，溶胀活化7h；再加入1g的3-氨基甘油，0.9g乙醇钠混合均匀，控温80℃，搅拌4h，反应结束冷却至8℃，过滤，然后将活化后的琼脂糖载体用去离子水洗涤，至检测洗液中无锌离子，得到氨基活化琼脂糖载体，
步骤2：然后加入120g去离子水， 22g的1.9mg/ml的IGG-FC片段结合蛋白室温反应7h，完成反应后先用pH值为7.4 的磷酸缓冲液 PBS 洗涤氨基活化琼脂糖载体，然后将琼脂糖载体用70g的 pH值为7.4的硼酸缓冲液循环洗涤，所述的pH值为7.4的硼酸缓冲液中含有2.8mM的交联剂N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酯，室温交联 50min，完成后加入15g的质量百分比浓度为8%的乙醇胺水溶液终止反应10min；完成后用pH值为7.4 的 PBS 缓冲溶液洗涤氨基活化琼脂糖载体7次，然后将交联后的改性琼脂糖载体装入层析柱中，即可得到所述的一种β-胸腺素重组蛋白亲和层析柱。
所述的裂解液为酶细胞裂解液。
所述的一种仿刺参β-胸腺素的应用是作为抗菌新药代替传统的抗生素，应用于养殖病害防治。
实施例3
本发明的一种仿刺参β-胸腺素的制备及应用，其技术方案包括以下具体步骤：
（1）仿刺参β-胸腺素表达载体的构建，采用引物F1：TATAGGATCCATGAGTGACAAACCAGACATC；R1：TATACTCGAGCTATGTTGCTTTCTCCTGCTC；扩增仿刺参β-胸腺素基因；
PCR反应程序94℃ 2min；(94℃ 1min，55℃1min，72℃ 2min)×25；72℃ 5min；PCR产物用天根试剂盒纯化；将表达载体PGEX-4T用限制性内切酶BamhI和XhoI酶切后回收后回收4.9 kb 片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA 连接酶连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有氨苄霉素(50μg /ml)的LB培养基中培养过夜（18h）；筛选阳性转化子提取质粒，命名为tPexT，采用上述引物F1和R1进行PCR扩增，产物经过测序证明质粒tPexT中所插入的序列与β-胸腺素基因序列一致。
（2）仿刺参β-胸腺素重组蛋白的表达，将质粒tPexT在含有氨苄霉素(50μg/ml) 的LB 液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液，加入100ml 新鲜的含有氨苄霉素(50μg/ml) 的LB 液体培养基中，于37℃下转速220rpm 摇动培养至OD595为1.0，加入终浓度为0.1mM 的IPTG，37℃继续以转速220rpm摇动培养3.5h，而后以4000rpm，4℃离心10min，收集菌液；
（3）仿刺参β-胸腺素重组蛋白的纯化，向菌液中加入5ml 裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1 小时，直至菌悬液变澄清为止，将菌液以12000rpm，4℃离心20min，回收上清；将上清中的蛋白用亲和层析柱回收纯化；将纯化的蛋白经SDS-PAGE（15%）电泳检测(8v/cm 电压下电泳30min，随后15v/cm 电压下电泳2.5h)，PGEX-4T载体上GST标签大小是26KD，目的蛋白大小是4.6KD，所以检测蛋白大小为31KD。
所述的亲和层析柱为一种β-胸腺素重组蛋白亲和层析柱，其制备方法如下：
步骤1：将10g的琼脂糖载体用200g的质量百分比浓度10%的盐酸，0.6g的氯化锌，控温55℃，溶胀活化10h；再加入3g的3-氨基甘油，2g乙醇钠混合均匀，控温85℃，搅拌6h，反应结束冷却至10℃，过滤，然后将活化后的琼脂糖载体用去离子水洗涤，至检测洗液中无锌离子，得到氨基活化琼脂糖载体，
步骤2：然后加入150g去离子水，32g的3.8mg/ml的IGG-FC片段结合蛋白室温反应8h，完成反应后先用pH值为7.4 的磷酸缓冲液 PBS 洗涤氨基活化琼脂糖载体，然后将琼脂糖载体用80g的 pH值为7.4的硼酸缓冲液循环洗涤，所述的pH值为7.4的硼酸缓冲液中含有3.8mM的交联剂N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酯，室温交联 60min，完成后加入18g的质量百分比浓度为12%的乙醇胺水溶液终止反应15min；完成后用pH值为7.4 的 PBS 缓冲溶液洗涤氨基活化琼脂糖载体10次，然后将交联后的改性琼脂糖载体装入层析柱中，即可得到所述的一种β-胸腺素重组蛋白亲和层析柱。
所述的裂解液为酶细胞裂解液。
所述的一种仿刺参β-胸腺素的应用是作为抗菌新药代替传统的抗生素，应用于养殖病害防治。
实施例4
本发明的一种仿刺参β-胸腺素的制备及应用，其技术方案包括以下具体步骤：
（1）仿刺参β-胸腺素表达载体的构建，采用引物F1：TATAGGATCCATGAGTGACAAACCAGACATC；R1：TATACTCGAGCTATGTTGCTTTCTCCTGCTC；扩增仿刺参β-胸腺素基因；
PCR反应程序94℃ 2min；(94℃ 1min，55℃1min，72℃ 2min)×25；72℃ 5min；PCR产物用天根试剂盒纯化；将表达载体PGEX-4T用限制性内切酶BamhI和XhoI酶切后回收后回收4.9 kb 片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA 连接酶连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有氨苄霉素(50μg /ml)的LB培养基中培养过夜（24h）；筛选阳性转化子提取质粒，命名为tPexT，采用上述引物F1和R1进行PCR扩增，产物经过测序证明质粒tPexT中所插入的序列与β-胸腺素基因序列一致。
（2）仿刺参β-胸腺素重组蛋白的表达，将质粒tPexT在含有氨苄霉素(50μg/ml) 的LB 液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液，加入100ml 新鲜的含有氨苄霉素(50μg/ml) 的LB 液体培养基中，于37℃下转速220rpm 摇动培养至OD595为1.0，加入终浓度为0.1mM 的IPTG，37℃继续以转速220rpm摇动培养3.5h，而后以4000rpm，4℃离心10min，收集菌液；
（3）仿刺参β-胸腺素重组蛋白的纯化，向菌液中加入5ml 裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2 小时，直至菌悬液变澄清为止，将菌液以12000rpm，4℃离心20min，回收上清；将上清中的蛋白用亲和层析柱回收纯化；将纯化的蛋白经SDS-PAGE（15%）电泳检测(8v/cm电压下电泳30min，随后15v/cm 电压下电泳2.5h)，PGEX-4T载体上GST标签大小是26KD，目的蛋白大小是4.6KD，所以检测蛋白大小为31KD。
所述的亲和层析柱为一种β-胸腺素重组蛋白亲和层析柱，其制备方法如下：
步骤1：将5g的琼脂糖载体用200g的质量百分比浓度5%的盐酸， 0.6g的氯化锌，控温40℃，溶胀活化10h；再加入0.5g的3-氨基甘油，0.3g乙醇钠混合均匀，控温85℃，搅拌6h，反应结束冷却至5℃，过滤，然后将活化后的琼脂糖载体用去离子水洗涤，至检测洗液中无锌离子，得到氨基活化琼脂糖载体，
步骤2：然后加入100g去离子水，32g的1.6mg/ml的IGG-FC片段结合蛋白室温反应8h，完成反应后先用pH值为7.4 的磷酸缓冲液 PBS 洗涤氨基活化琼脂糖载体，然后将琼脂糖载体用40g的 pH值为7.4的硼酸缓冲液循环洗涤，所述的pH值为7.4的硼酸缓冲液中含有2.3mM的交联剂N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酯，室温交联 60min，完成后加入18g的质量百分比浓度为6%的乙醇胺水溶液终止反应15min；完成后用pH值为7.4 的 PBS 缓冲溶液洗涤氨基活化琼脂糖载体3次，然后将交联后的改性琼脂糖载体装入层析柱中，即可得到所述的一种β-胸腺素重组蛋白亲和层析柱。
所述的裂解液为化学细胞裂解液。
所述的一种仿刺参β-胸腺素的应用是作为抗菌新药代替传统的抗生素，应用于养殖病害防治。
对比例1
本发明的一种仿刺参β-胸腺素的制备及应用，其技术方案包括以下具体步骤：
（1）仿刺参β-胸腺素表达载体的构建，采用引物F1：TATAGGATCCATGAGTGACAAACCAGACATC；R1：TATACTCGAGCTATGTTGCTTTCTCCTGCTC；扩增仿刺参β-胸腺素基因；
PCR反应程序94℃ 2min；(94℃ 1min，55℃1min，72℃ 2min)×25；72℃ 5min；PCR产物用天根试剂盒纯化；将表达载体PGEX-4T用限制性内切酶BamhI和XhoI酶切后回收后回收4.9 kb 片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA 连接酶连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有氨苄霉素(50μg /ml)的LB培养基中培养过夜（18h）；筛选阳性转化子提取质粒，命名为tPexT，采用上述引物F1和R1进行PCR扩增，产物经过测序证明质粒tPexT中所插入的序列与β-胸腺素基因序列一致。
（2）仿刺参β-胸腺素重组蛋白的表达，将质粒tPexT在含有氨苄霉素(50μg/ml) 的LB 液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液，加入100ml 新鲜的含有氨苄霉素(50μg/ml) 的LB 液体培养基中，于37℃下转速220rpm 摇动培养至OD595为1.0，加入终浓度为0.1mM 的IPTG，37℃继续以转速220rpm摇动培养3.5h，而后以4000rpm，4℃离心10min，收集菌液；
（3）仿刺参β-胸腺素重组蛋白的纯化，向菌液中加入5ml 裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1 小时，直至菌悬液变澄清为止，将菌液以12000rpm，4℃离心20min，回收上清；将上清中的蛋白用亲和层析柱回收纯化；将纯化的蛋白经SDS-PAGE（15%）电泳检测(8v/cm 电压下电泳25min，随后15v/cm 电压下电泳2h)，PGEX-4T载体上GST标签大小是26KD，目的蛋白大小是4.6KD，所以检测蛋白大小为31KD。
所述裂解液为终浓度的100mM GSH, 1% Triton X-100, 58mM Na2HPO4,17mM NaH2PO4,68mM NaCl, pH8.0。
所述的亲和层析柱为一种β-胸腺素重组蛋白亲和层析柱，其制备方法如下：
步骤1：将5g的琼脂糖载体用100g的质量百分比浓度5%的盐酸，0.2g的氯化锌，控温40℃，溶胀活化5h；反应结束冷却至5℃，过滤，然后将活化后的琼脂糖载体用去离子水洗涤，至检测洗液中无锌离子，得到氨基活化琼脂糖载体，
步骤2：然后加入100g去离子水， 15g的1.6mg/ml的IGG-FC片段结合蛋白室温反应4h，完成反应后先用pH值为7.4 的磷酸缓冲液 PBS 洗涤氨基活化琼脂糖载体，然后将琼脂糖载体用40g的 pH值为7.4的硼酸缓冲液循环洗涤，所述的pH值为7.4的硼酸缓冲液中含有2.3mM的交联剂N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酯，室温交联 30min，完成后加入10g的质量百分比浓度为6%的乙醇胺水溶液终止反应5min；完成后用pH值为7.4 的 PBS 缓冲溶液洗涤氨基活化琼脂糖载体3次，然后将交联后的改性琼脂糖载体装入层析柱中，即可得到所述的一种β-胸腺素重组蛋白亲和层析柱。
所述的裂解液为化学细胞裂解液。
所述的一种仿刺参β-胸腺素的应用是作为抗菌新药代替传统的抗生素，应用于养殖病害防治。
对比例2
本发明的一种仿刺参β-胸腺素的制备及应用，其技术方案包括以下具体步骤：
（1）仿刺参β-胸腺素表达载体的构建，采用引物F1：TATAGGATCCATGAGTGACAAACCAGACATC；R1：TATACTCGAGCTATGTTGCTTTCTCCTGCTC；扩增仿刺参β-胸腺素基因；
PCR反应程序94℃ 2min；(94℃ 1min，55℃1min，72℃ 2min)×25；72℃ 5min；PCR产物用天根试剂盒纯化；将表达载体PGEX-4T用限制性内切酶BamhI和XhoI酶切后回收后回收4.9 kb 片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA 连接酶连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有氨苄霉素(50μg /ml)的LB培养基中培养过夜（18h）；筛选阳性转化子提取质粒，命名为tPexT，采用上述引物F1和R1进行PCR扩增，产物经过测序证明质粒tPexT中所插入的序列与β-胸腺素基因序列一致。
（2）仿刺参β-胸腺素重组蛋白的表达，将质粒tPexT在含有氨苄霉素(50μg/ml) 的LB 液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液，加入100ml 新鲜的含有氨苄霉素(50μg/ml) 的LB 液体培养基中，于37℃下转速220rpm 摇动培养至OD595为1.0，加入终浓度为0.1mM 的IPTG，37℃继续以转速220rpm摇动培养3.5h，而后以4000rpm，4℃离心10min，收集菌液；
（3）仿刺参β-胸腺素重组蛋白的纯化，向菌液中加入5ml 裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1 小时，直至菌悬液变澄清为止，将菌液以12000rpm，4℃离心20min，回收上清；将上清中的蛋白用亲和层析柱回收纯化；将纯化的蛋白经SDS-PAGE（15%）电泳检测(8v/cm 电压下电泳25min，随后15v/cm 电压下电泳2h)，PGEX-4T载体上GST标签大小是26KD，目的蛋白大小是4.6KD，所以检测蛋白大小为31KD。
所述裂解液为终浓度的100mM GSH, 1% Triton X-100, 58mM Na2HPO4,17mM NaH2PO4,68mM NaCl, pH8.0。
所述的亲和层析柱为一种β-胸腺素重组蛋白亲和层析柱，其制备方法如下：
步骤1：将5g的琼脂糖载体用100g的质量百分比浓度5%的盐酸，0.2g的氯化锌，控温40℃，溶胀活化5h；再加入0.5g的3-氨基甘油，0.3g乙醇钠混合均匀，控温65℃，搅拌2h，反应结束冷却至5℃，过滤，然后将活化后的琼脂糖载体用去离子水洗涤，至检测洗液中无锌离子，得到氨基活化琼脂糖载体，
步骤2：然后加入用pH值为7.4 的 PBS 缓冲溶液洗涤氨基活化琼脂糖载体3次，然后将交联后的改性琼脂糖载体装入层析柱中，即可得到所述的一种β-胸腺素重组蛋白亲和层析柱。
所述的裂解液为化学细胞裂解液。
所述的一种仿刺参β-胸腺素的应用是作为抗菌新药代替传统的抗生素，应用于养殖病害防治。
对比例3
本发明的一种仿刺参β-胸腺素的制备及应用，其技术方案包括以下具体步骤：
（1）仿刺参β-胸腺素表达载体的构建，采用引物F1：TATAGGATCCATGAGTGACAAACCAGACATC；R1：TATACTCGAGCTATGTTGCTTTCTCCTGCTC；扩增仿刺参β-胸腺素基因；
PCR反应程序94℃ 2min；(94℃ 1min，55℃1min，72℃ 2min)×25；72℃ 5min；PCR产物用天根试剂盒纯化；将表达载体PGEX-4T用限制性内切酶BamhI和XhoI酶切后回收后回收4.9 kb 片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA 连接酶连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有氨苄霉素(50μg /ml)的LB培养基中培养过夜（18h）；筛选阳性转化子提取质粒，命名为tPexT，采用上述引物F1和R1进行PCR扩增，产物经过测序证明质粒tPexT中所插入的序列与β-胸腺素基因序列一致。
（2）仿刺参β-胸腺素重组蛋白的表达，将质粒tPexT在含有氨苄霉素(50μg/ml) 的LB 液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液，加入100ml 新鲜的含有氨苄霉素(50μg/ml) 的LB 液体培养基中，于37℃下转速220rpm 摇动培养至OD595为1.0，加入终浓度为0.1mM 的IPTG，37℃继续以转速220rpm摇动培养3.5h，而后以4000rpm，4℃离心10min，收集菌液；
（3）仿刺参β-胸腺素重组蛋白的纯化，向菌液中加入5ml 裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1小时，直至菌悬液变澄清为止，将菌液以12000rpm，4℃离心20min，回收上清；将上清中的蛋白用亲和层析柱回收纯化；将纯化的蛋白经SDS-PAGE（15%）电泳检测(8v/cm 电压下电泳25min，随后15v/cm 电压下电泳2h)，PGEX-4T载体上GST标签大小是26KD，目的蛋白大小是4.6KD，所以检测蛋白大小为31KD。
所述裂解液为终浓度的100mM GSH, 1% Triton X-100, 58mM Na2HPO4,17mM NaH2PO4,68mM NaCl, pH8.0。
所述的亲和层析柱为一种β-胸腺素重组蛋白亲和层析柱，其制备方法如下：
加入100g去离子水， 15g的1.6mg/ml的IGG-FC片段结合蛋白室温反应4h，完成反应后先用pH值为7.4 的磷酸缓冲液 PBS 洗涤琼脂糖载体，然后将琼脂糖载体用40g的 pH值为7.4的硼酸缓冲液循环洗涤，所述的pH值为7.4的硼酸缓冲液中含有2.3mM的交联剂N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酯，室温交联 30min，完成后加入10g的质量百分比浓度为6%的乙醇胺水溶液终止反应5min；完成后用pH值为7.4 的 PBS 缓冲溶液洗涤氨基活化琼脂糖载体3次，然后将交联后的改性琼脂糖载体装入层析柱中，即可得到所述的一种β-胸腺素重组蛋白亲和层析柱。
所述的裂解液为化学细胞裂解液。
所述的一种仿刺参β-胸腺素的应用是作为抗菌新药代替传统的抗生素，应用于养殖病害防治。
以上实施例中加入10μl 5μg/μl β-胸腺素的测试组对细菌活性的抑制率测试结果如下表所示：
项目 抑制率 改性琼脂糖载体收率（%）
实施例1 35.7 96.4
实施例2 36.2 97.2
实施例3 36.8 97.8
实施例4 36.1 96.9
对比例1 34.7 92.1
对比例2 30.9 87.2
对比例3 33.8 81.6
仿刺参β-胸腺素序列如下：
Met Ser Asp Lys Pro Asp Ile Ser Glu Val Asn Ser Phe Asp Lys Thr Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr
1 5 10 15 20
Ala Glu Lys Asn Thr Leu Pro Thr Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Ala Thr
25 30 35 40
<110>辽宁省海洋水产科学研究院
<120>一种仿刺参β-胸腺素的制备及应用
<160>1
<210>1
<211>41
<212>PRT
<213>仿刺参
<400>1
Met Ser Asp Lys Pro Asp Ile Ser Glu Val Asn Ser Phe Asp Lys
1 5 10 15
Thr Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Ala Glu Lys Asn Thr Leu Pro
20 25 30
Thr Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Ala Thr
35 40

Claims (2)

1.一种仿刺参β-胸腺素，其特征在于所述仿刺参β-胸腺素的氨基酸序列如序列表SEQID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的一种仿刺参β-胸腺素的应用，其特征在于所述应用是在制备抗菌新药中的应用，所述抗菌新药代替传统的抗生素，应用于养殖病害防治，所述抗菌为抗引起仿刺参腐皮综合症的灿烂弧菌。
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