CN101942473B

CN101942473B - 克氏原螯虾i型溶菌酶基因及其编码的溶菌酶与应用

Info

Publication number: CN101942473B
Application number: CN2010102547931A
Authority: CN
Inventors: 王金星; 赵小凡
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2010-08-17
Filing date: 2010-08-17
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2030-08-17
Also published as: CN101942473A

Abstract

本发明公开了一种克氏原螯虾i型溶菌酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并提供了其重组表达与纯化方法。本发明还提供了克氏原螯虾i型溶菌酶基因编码的溶菌酶多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，并提供了该基因序列的用途、溶菌酶的用途：本发明的溶菌酶既对革兰氏阳性菌有抑制活性，又对革兰氏阴性菌有抑制活性。利用本发明的克氏原螯虾i型溶菌酶基因通过基因工程方法将其转入作物，可以获得具有抗菌能力的作物。利用本发明获得的重组的溶菌酶可用于抗菌的饲料添加剂、食品保存、动植物基因转化和药物开发。

Description

克氏原螯虾i型溶菌酶基因及其编码的溶菌酶与应用

技术领域

本发明涉及一种i型溶菌酶基因及其编码的蛋白与应用，尤其涉及一种克氏原螯虾i型溶菌酶(i-type Lysozyme)基因及其编码的溶菌酶与所述基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用，属基因工程技术领域。

背景技术

由于无脊椎动物不存在适应性免疫，它们依靠先天免疫防御反应来清除或消灭病原，先天免疫反应包括细胞和体液免疫。而体液免疫的主要效应分子包括抗菌肽、酚氧化酶依赖性黑化系统和凋亡相关基因系统等；其中抗菌肽是生物机体在抵御病原微生物的防御反应过程中所产生的多肽，可以抑制或杀死病原微生物，是无脊椎动物重要的体液免疫效应分子。作为抗菌肽的一种，溶菌酶在宿主防御病原微生物入侵中起到重要作用。

与传统抗菌药物相比，抗菌肽具有以下优点：①稳定性高：研究表明许多抗菌肽在100℃加热10min条件下仍能保持一定活力，且对较大的离子强度和较低或较高的pH值都有较强的抗性；②特异性强：对正常真核细胞几乎没有毒性，仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞；③抗菌谱广：除了抗细菌外，有的抗菌肽还能作用于真菌、原虫、病毒及癌细胞等；④不易产生耐药性：由于抗菌肽的作用靶标主要是细菌的细胞膜，因此病原菌不易对其产生耐药性；⑤副作用小：其他抗生素容易杀死细菌释放内毒素而间接引起败血症，而抗菌肽能够与内毒素结合从而减少或避免脓毒性冲击。因而极有希望将抗菌肽开发成为一类新型的广谱高效抗菌药物。另外，抗菌肽还可以应用到食品工业，能快速抑制微生物的生长，人、畜食后易被体内蛋白酶水解消化且无毒副作用，在酸性条件下活性很强，具有良好的溶解性和稳定性，是一种极具发展前景的新型食品防腐剂。抗菌肽在农业工程上也有应用，利用昆虫抗菌肽培育具有抗病菌品种的作物，可大大减少农药用量，降低环境污染指数，生产出绿色农产品。昆虫抗菌肽被认为是最有发展前景的绿色饲料添加剂，抗菌肽可促进动物生长，提高动物抗病能力，且不容易产生耐药性。应用抗菌肽转基因工程技术，把特异的抗菌肽基因转入畜禽特定细胞让其表达，从而产生抗病新品种。可以预见，抗菌肽及其基因工程产品在医药卫生、食品工业、畜牧业及农业等方面将发挥极为重要的作用，抗菌肽的市场应用前景必将更为广阔。

溶菌酶(Lysozyme)是广泛存在于多细胞动物的一类抗菌肽，因其可以溶解细菌的细胞壁而得名。根据其结构和来源的不同，可以分为c型，g型，i型，植物型，细菌型和噬菌体型。其中i型溶菌酶在多种无脊椎动物中有报道，对其功能研究表明该类型溶菌酶可能有溶菌酶活性，异肽键酶活性，几丁质酶活性，和不依赖于酶活性的抗菌作用。这些功能决定了i型溶菌酶在抗菌和免疫方面起到作用。

克氏原螯虾(Procambarus clarkii)，俗称淡水小龙虾，是我国重要的水产养殖品种。小龙虾味道鲜美，磷、钙、铁等元素含量高，蛋白含量高，而脂肪含量低，是一种营养价值很高的经济型水产养殖品种。而且小龙虾的虾壳的提取物在工业、农业、医药和化工业中有着广泛的应用价值，因此，小龙虾的疾病预防和治疗方面的研究格外重要。小龙虾对环境的适应能力较强，对各种流行性的疾病有一定的抵抗能力，鉴于此，研究小龙虾的抗菌肽对于我们了解虾类的抗病机制有着重要的作用。

诸多研究表明，在虾类等节肢动物中存在多种可以抵抗外界病原微生物的蛋白或肽类，如对虾素、甲壳肽，溶菌酶等，但是在相关的报导中，未见有克氏原螯虾溶菌酶基因的报导。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种编码从克氏原螯虾中克隆的抗菌肽——溶菌酶的基因序列，并提供其重组表达与纯化方法。本发明的另一个目的是提供从克氏原螯虾中克隆的抗菌肽——溶菌酶的氨基酸序列。本发明还提供了该基因序列的用途，溶菌酶的用途。

本发明的克氏原螯虾i型溶菌酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中所示信息为：

(a)序列特征：

*长度：1022碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：克氏原螯虾(Procambius clarkii)

(f)序列描述：SEQ ID NO.1

tacggctgcg agaagacgac agaagggagt cgaagaaaca gcacggtcaa catgtcactg 60

gcaaaatctg cgctcttggg cttgacggca gccctcgtgg tcgtcttggt gactggtcag 120

cagtataccg gagtagatga aaattgccta ggatgtctgt gcgaggcctc tacgaagtgt 180

cagaaccggc ttgactgccc caacggctac tgcggcattt tcctcatctc ctgggctact 240

ggaagggaag ctggtcaacc caccctcaat aacgccgatc ccaacagcca gaccgcgtat 300

tcagattgta ccaacaaccc ggtgtgcgcg gctgagaccg tccgccgcta catgcagaat 360

tttgctcagg actgcaacag ggacggtgtg atcaactgtc aggactacgc cctgattcac 420

aagctgggca ggaacggctg ctacggctcc ctctcagggg aattcgccac actgtttgac 480

acgtgtcggg ccaaacttgg cgtccaataa gatgagcact aataccacac acaccgccag 540

agggaactga cggactgtga tgaggtcgac cctgtgatgt ggcttgggac gtgaacacct 600

ttactgtcct tttgttgatt tatggacggg aattcagcac cttttaaaaa agtcttctat 660

gggggcttcc ttggtggcag acattttttt gtaatttggc taatgttgtt tatttatcat 720

gtatatgttc cagttttttt catctatctt caactattaa aagcaaatct tttgtctcca 780

gaaatttaag agtttagcct tagttatgca gatctctgtg aatcatttat gttagtatat 840

atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatgtat atatacacac 900

aatgccattc actgtgacaa atgtgtgttc cttgtacatc catcaaacat ccatgtattc 960

gtgtaactga ttaataacta ataaaggtat ttaaacacat tttataaaaa aaaaaaaaaa 1020

aa 1022。

本发明的克氏原螯虾溶菌酶基因编码的溶菌酶多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中所示信息为：

(a)序列特征

*长度：152氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ ID NO.2

Met Ser Leu Ala Lys Ser Ala Leu Leu Gly Leu Thr Ala Ala Leu

5 10 15

Val Val Val Leu Val Thr Gly Gln Gln Tyr Thr Gly Val Asp Glu

20 25 30

Asn Cys Leu Gly Cys Leu Cys Glu Ala Ser Thr Lys Cys Gln Asn

35 40 45

Arg Leu Asp Cys Pro Asn Gly Tyr Cys Gly Ile Phe Leu Ile Ser

50 55 60

Trp Ala Thr Gly Arg Glu Ala Gly Gln Pro Thr Leu Asn Asn Ala

65 70 75

Asp Pro Asn Ser Gln Thr Ala Tyr Ser Asp Cys Thr Asn Asn Pro

80 85 90

Val Cys Ala Ala Glu Thr Val Cys Arg Tyr Met Gln Asn Phe Ala

95 100 105

Gln Asp Cys Asn Arg Asp Gly Val Ile Asn Cys Gln Asp Tyr Ala

110 115 120

Leu Ile His Lys Leu Gly Arg Asn Gly Cys Tyr Gly Ser Leu Ser

125 130 135

Gly Glu Phe Ala Thr Leu Phe Asp Thr Cys Arg Ala Lys Leu Gly

140 145 150

Val Gln

152。

本发明还提供了所述的SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的变异体，它编码具有少于8个氨基酸改变的同源变异蛋白，而且氨基酸改变是保守性氨基酸改变，例如：Tyr²⁵→Trp；Gly²⁷→Ala；Phe⁵⁷→Trp；Thr⁶³→Ser；Arg⁹⁹→Lys；Asp¹¹⁸→Glu。

本发明的克氏原螯i型溶菌酶cDNA的克隆方法是：利用克氏原螯虾的血细胞组织构建cDNA文库，然后进行随机测序，对所得序列进行相似性比对，得到溶菌酶的cDNA的部分序列，然后进行3’和5’端快速扩增，获得全长序列。

可以利用本发明的克氏原螯虾i型溶菌酶基因制备原核表达载体，转化大肠杆菌，表达具有抗菌活性的重组蛋白。例如：将获得的克氏原螯虾溶菌酶基因克隆到pET30a(+)载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)，进行诱导表达，纯化；并利用获得重组蛋白进行抑菌实验。其抗菌谱和抑菌效果见附图2。

由图2可以看到，溶菌酶既对革兰氏阳性菌有抑制活性，又对革兰氏阴性菌有抑制活性。

利用本发明的克氏原螯虾i型溶菌酶基因通过基因工程方法将其转入作物，可以获得具有抗菌能力的作物。

利用本发明获得的重组的溶菌酶可用于抗菌的饲料添加剂、食品保存、动植物基因转化和药物开发。

附图说明

图1为重组克氏原螯虾溶菌酶纯化后的电泳图；

其中，M：分子量标记，1.诱导前表达菌株，2.诱导后表达菌株，3.纯化的重组溶菌酶。

图2为重组溶菌酶对六种细菌的抑菌活性示意图。包括藤黄微球菌M.luteus，金黄色葡萄球菌S.aureus，枯草芽孢杆菌B.subtilis，大肠杆菌E.coli，绿脓假单胞菌P.aeruginosa，鳗弧菌V.anguillarum。纵坐标为相对菌浓度。PBS(磷酸盐缓冲液)作为阴性对照。Pclysi1为重组的溶菌酶蛋白，终浓度为1μM。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明：

实施例1：克氏原鳌虾i型溶菌酶基因cDNA的克隆

1)总RNA的提取：采用现有技术一步法提取总RNA。

2)cDNA第一链合成：4微升总RNA，加1微升SmartF(5’-TAC GGC TGC GAG AAG ACG ACAGAA GGG-3’)和1微升Oligoanchor R(5’-GAC CAC GCG TAT CGA TGT CGA CT₁₆(A/C/G)-3’)，72℃反应5分钟，后加5倍Buffer 4微升，dNTP 1.25微升，RNA酶抑制剂0.625微升，1微升MMLV逆转录酶，无RNase的灭菌水12.875微升42℃反应60分钟，70℃10分钟终止反应。

3)PCR反应：链式聚合酶反应(PCR)试剂与条件：

首先将下列试剂混在一起：

·10xTaq DNA聚合酶缓冲液5微升(μl)

·模板cDNA 1μl

·正向引物(10mM) 1μl

·反向引物(10mM) 1μl

·脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl

·Taq DNA聚合酶 0.25μl

·灭菌水 37.75μl

·总体积 50μl

根据克氏原鳌虾文库随机测序所得的序列设计的引物为：

正向引物：F1 5’GGC TAC TGC GGC ATT TTC CTC ATC 3’

反向引物：R1 5’GGA AAA TGC CGC AGT AGC CGT T 3’

PCR反应条件为：首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环：94℃30秒，53℃45秒，72℃45秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。

4)反应产物纯化：利用德国奎因(QIAGEN)公司产品QIAquick Gel Extraction Kit，操作步骤按产品说明书进行。

5)克氏原鳌虾溶菌酶cDNA克隆：取纯化产物3微升，连接于pMD 18-T载体(TaKaRa公司产品)。转化到大肠杆菌DH5α菌株，在含有氨苄青霉素(100微克/毫升)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal 0.2微克/毫升)和异丙基硫代半乳糖苷(IPTG 0.1摩尔/毫升)的平板生长过夜，挑取3个白斑，在LB液体培养基(5毫升，含100微克/毫升安苄青霉素)中培养过夜。

6)质粒纯化：收取过夜培养菌液2毫升，离心(6000转/分，3分钟)收集细胞。用微量DNA纯化试剂盒(Wizard plus SV Minipreps DNA Purification System，美国普洛麦格Promega公司)纯化质粒，纯化步骤按说明书进行。

7)序列测定与同源检索：取纯化质粒4微升，用载体引物T7进行全自动测序(本工作在上海生工公司完成)。将所得序列与基因库序列比较。

8)克氏原鳌虾溶菌酶cDNA 3’端快速扩增

根据得到的溶菌酶基因片段，正向引物F1和anchor R引物(5’-GAC CAC GCG TAT CGATGT CGA C3’)进行cDNA 3’端快速扩增，操作步骤按宝生物3’RACE试剂盒说明书进行。

取血细胞总RNA约20μg，其他试剂的调制和反应条件按说明书进行。用特异性引物F3与3’接头进行3’端PCR扩增，采用56℃退火，其余与上述的PCR扩增程序相同，对所得产物按前述方法进行克隆、验证和测序。

9)克氏原鳌虾溶菌酶cDNA 5’端克隆

以上述cDNA为模板，以试剂盒提供的5’PCR(5’-TAC GGC TGC GAG AAG ACG ACA GAA-3’)引物和反向引物R1为引物进行PCR扩增，获得克氏原鳌虾溶菌酶cDNA的5’序列。

将3’和5’端序列拼接，即获得SEQ ID NO.1所示克氏原鳌虾溶菌酶cDNA基因全长核苷酸序列。

实施例2：原核重组表达载体构建、表达与纯化

(1)根据克氏原螯虾溶菌酶的序列(去掉信号肽序列)和表达载体pPET30a(Novagen公司)的克隆位点，本发明选择了pET30a克隆位点的BamH I和Xho I酶切位点，因此，设计引物时在上游引物引入了BamH I酶切位点，下游引物上引入了Xho I酶切位点。

(2)基因扩增、克隆与重组质粒筛选

以pMD-18T-Lysi为模板，用设计的表达引物进行PCR反应，扩增条件为：94℃，2min预变性；94℃，30s，56℃，45s，72℃，45s，35个循环；72℃延伸10min。

2％的琼脂糖凝胶电泳PCR产物检测：

将PCR产物作制备电泳，用UNIQ-5 Column DNA Gel Extraction Kit(上海生工产品)回收、纯化PCR产物，经过BamH I和XhoI内切酶酶切，切下两端带有BamH I和Xho I内切酶位点的溶菌酶cDNA片段，同样表达载体pET30a经过BamH I和Xho I内切酶酶切，暴露出多克隆位点两端的BamH I和EcoR I内切酶位点。然后，将酶切后的扩增产物与表达载体用T4DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，LB+Kana(卡那霉素)平板PCR筛选阳性克隆。挑取PCR筛到的菌落，37℃振荡扩增培养并抽提质粒，BamH I和Xho I双酶切与测序验证后，即为重组表达质粒pET30a-lysi。接转化E.coli表达菌株BL21 DE3感受态细胞，涂布LB+Kana平板，37℃倒置过夜培养。

(3)筛选表达菌株

从上述LB+Kana平板上挑取5个单克隆菌落，2ml LB+Kana液体培养基37℃振荡过夜培养，次日，取20μl过夜培养液加入到2ml LB+Kana液体培养基中转培养，37℃振荡培养3h，至OD₆₀₀在0.5～0.7之间，然后加入IPTG至终浓度为1mmol，继续37℃振荡培养诱导表达4h。诱导前，从不同样品中取出0.5ml菌液，电泳检测时以未诱导菌株为对照。

表达完后，各取0.5ml菌液，5000r/min离心5min收集细胞，包括未诱导菌株的样品，重悬于100μl去离子水中，以此为电泳样品作12.5％的SDS-PGAE。根据电泳结果是否存在诱导表达的重组溶菌酶的条带，鉴定重组表达菌株。选取表达量高的菌株进行下面的大规模表达和纯化。

(5)重组溶菌酶表达与纯化

挑取表达菌株单克隆在LB+Kana液体培养基中37℃过夜振荡培养，次日，按照体积比1∶100加入到100ml LB+Kana培养基中转培养，37℃振荡培养3h后，再加入IPTG至终浓度为1mmol，再37℃振荡诱导培养4h。诱导前取出0.5ml的菌液，作为诱导前对照样品。诱导培养完后，菌液在合适的离心管中7000r/min离心10min收集细胞，细胞重悬于5ml预冷的1×PBS，加入50μl 20％的Triton X-100，充分混匀后冰浴30min。超声波破碎细胞，超声循环为：超声1秒(s)；间隔1s；全程40s。重复4次，每次间隙时将菌液在冰浴中混匀，避免局部温度太高，使蛋白质变性。最后，将破碎后的菌液10000r/min离心15min，收集上清液和沉淀，上清液和沉淀分别留样、备用。

重组蛋白以包含体的形式存在，以常规方法经过包含体纯化、复性和常规的组氨酸标签亲和层析，即获得到了重组蛋白——重组溶菌酶，电泳(SDS-PAGE)结果如图1所示。利用组氨酸标签抗体进行免疫印迹实验，证明所得到的重组蛋白就是SEQ ID NO.2序列所述的蛋白。

(6)重组蛋白活性测定

液体生长抑制方法检测重组的溶菌酶蛋白即Pclysi1的抗菌活性：分别取测试菌大肠杆菌、鳗弧菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌单菌落LB过夜培养液，用LB液体培养基稀释到OD₆₀₀＝0.01(约10⁶左右)为测试菌液。取100μl测试菌液分别与10μl的重组溶菌酶样品混匀，蛋白终浓度为1μM。于96孔培养板28℃振荡培养，24小时后用酶标仪测A₆₃₀吸收值，用Microsoft Excel处理数据，以PBS(磷酸盐缓冲液)作为阴性对照。

抑菌实验结果：重组溶菌酶对大肠杆菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌、和枯草芽孢杆菌有抑菌活性，如图2所示。

Claims

1.一种克氏原螯虾i型溶菌酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的克氏原螯虾i型溶菌酶基因编码的溶菌酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的克氏原螯虾i型溶菌酶基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：其方法是：通过基因重组技术使克氏原螯虾i型溶菌酶基因在大肠杆菌中进行表达，获得具有抗菌活性的重组蛋白。