CN101942464B - 中国明对虾泛素连接酶基因及其编码的泛素连接酶与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中国明对虾泛素连接酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并提供了其重组表达与纯化方法。本发明还提供了中国明对虾泛素连接酶基因编码的泛素连接酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，并提供了该基因序列的用途、泛素连接酶的用途：可以利用中国明对虾泛素连接酶基因制备原核表达载体，转化大肠杆菌，表达具有抗病毒活性的重组蛋白。利用本发明获得的重组的泛素连接酶蛋白可用于抗病毒的饲料添加剂、动植物基因转化和药物开发。

Description

中国明对虾泛素连接酶基因及其编码的泛素连接酶与应用

技术领域

本发明涉及一种对虾泛素连接酶基因及其编码的泛素连接酶蛋白与应用，尤其涉及一种中国明对虾泛素连接酶基因及其编码的泛素连接酶与其在制备具有抗病毒活性的重组蛋白中的应用，属基因工程技术领域。

背景技术

众所周知，无脊椎动物虽然不存在适应性免疫，但它们具有强大的先天免疫防御反应，主要包括细胞和体液免疫，依靠这些防御反应清除或消灭病原。除此之外，近来许多研究发现泛素-蛋白酶体系统在免疫信号转导过程中发挥重要的调控功能，该系统是目前已知最重要且有高度选择性的蛋白质降解体系。泛素系统可以通过识别某些酪氨酸磷酸化标记的免疫细胞膜受体使其降解，从而终止免疫信号转导。另外，在免疫系统重要转录因子NF-kapa-B活化的不同阶段也有泛素系统参与。通过作用于免疫信号转导过程的多个环节，泛素系统调控免疫应答及炎症反应。泛素连接酶E2(Ubiquitin-conjugating enzyme，E2)是泛素与蛋白结合所需的第二个酶，属于E2蛋白超家族，细胞中含有多个基因，每个基因都含有一个保守的14-16KD的核心区域，为(Ubiquitin-conjugating，UBC)结构域，这一区域可能参与E2和E3的结合。在UBC结构域中包含一个非常保守的半胱氨酸残基，此残基直接参与泛素分子的共价连接。我们的研究发现中国对虾泛素连接酶E2基因及其编码的泛素连接酶具有明确的抑制白斑综合症病毒(White spot syndrome virus，WSSV)的功能。

与传统抗病毒药物相比，原核表达的重组蛋白药物具有以下优点：①稳定性较高，在100℃加热10min条件下仍能保持一定活力；②对正常真核细胞几乎没有毒性，③抗病毒专一性强，针对多种对虾致病性的白斑综合症病毒具有明显的抑制效果。因此极有希望将重组蛋白药物开发成为一类新型的高效抗病毒药物。对甲壳类水产养殖中的疾病防治具有重要的实际意义。

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)，俗称中国对虾、中国虾，是我国重要的水产养殖品种。中国对虾味道鲜美，磷、钙、铁等元素含量高，蛋白含量高，而脂肪含量低，是一种营养价值很高的经济型水产养殖品种。而且中国对虾的虾壳的提取物在工业、农业、医药和化工业中有着广泛的应用价值。但是自上世纪90年代以来，中国对虾受到了白斑病病毒的严重影响，造成了巨大的经济损失。因此，中国对虾的疾病预防和治疗方面的研究格外重要。

诸多研究表明，在对虾等节肢动物中存在多种可以抵抗外界病原微生物的蛋白或肽类，如对虾素、甲壳肽(crustins)等，但是在相关的报导中，未见有中国明对虾的泛素连接酶基因及应用的报导。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种编码从中国明对虾中克隆泛素连接酶基因序列，并提供其重组表达与纯化方法。本发明的另一个目的是提供从中国明对虾中克隆的泛素连接酶氨基酸序列。本发明还提供了该基因序列的用途，泛素连接酶的用途。

本发明的中国明对虾泛素连接酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中所示信息为：

(a)序列特征：

*长度：784碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)

(f)序列描述：SEQ ID NO.1

atgacggcac tgcagagaat aaccaaggag atgcaggacc tggccgacga cccgctgggc 60

cagttctcgg tgggccccgt gggaaccgac ctcttccact gccaggcgac cgtcatgggg 120

ccccgtggct cgccctacga aggcggcctc ttcgacctca gcgtcgattt ccccaaatca 180

taccctttcc agcccccgca gattaaattt aaaactccaa tctaccacat gaacgtcggc 240

ccatacggag atatctgcct tgacatactg gataaaaact ggtcccccgc tctctctatc 300

tctaaagttc tgctggtgat ctgcgttctc atgacggacc caaatcctga cgacccgtta 360

agattcaacc tccgagacga atataagaag gacgtctcgg tctacgagaa caatgcacgc 420

cagtggacac gccagcatgc tatgtgattc cttccttcta tgctcacggg cttgtcaact 480

tgctgctcgc atgaatgtca gtatatgctc acgtggatga tgaaattata tcgaagtgaa 540

ccgtaataca gatacgatgg aaacatcatt attcctaaac atacacatca tgcttaaaac 600

aagtatgctc atatgtaaac cattatatac tcacactcat atgaggaaag gtgcttaagt 660

tgttaatttg tatatgttgg catttgttat gaaagggaag caagggtcgt tgaattgttg 720

atcttctgtt tttcttttct tcaattgaat taaaatacaa acgttaaaaa aaaaaaaaaa 780

aaaa                                                              784。

本发明的中国明对虾泛素连接酶基因编码的泛素连接酶多肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，其中所示信息为：

(a)序列特征

*长度：148氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ ID NO.2

Met Thr Ala Leu Gln Arg Ile Thr Lys Glu Met Gln Asp Leu Ala Asp Asp Pro Leu Gly

                 5                   10                 15                  20

Gln Phe Ser Val Gly Pro Val Gly Thr Asp Leu Phe His Cys Gln Ala Thr Val Met Gly

                25                  30                  35                   40

Pro Arg Gly Ser Pro Tyr Glu Gly Gly Leu Phe Asp Leu Ser Val Asp Phe Pro Lys Ser

                45                  50                  55                   60

Tyr Pro Phe Gln Pro Pro Gln Ile Lys Phe Lys Thr Pro Ile Tyr His Met Asn Val Gly

                65                  70                  75                   80

Pro Tyr Gly Asp Ile Cys Leu Asp Ile Leu Asp Lys Asn Trp Ser Pro Ala Leu Ser Ile

                85                  90                  95                  100

Ser Lys Val Leu Leu Val Ile Cys Val Leu Met Thr Asp Pro Asn Pro Asp Asp Pro Leu

                105                 110                 115                 120

Arg Phe Asn Leu Arg Asp Glu Tyr Lys Lys Asp Val Ser Val Tyr Glu Asn Asn Ala Arg

                125                 130                 135                 140

Gln Trp Thr Arg Gln His Ala Met

                145         148。

本发明还提供了所述的SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的变异体，它编码具有1个氨基酸改变的同源变异蛋白，而且氨基酸改变是保守性氨基酸改变，即Cys86-Ser。

本发明的中国明对虾泛素连接酶cDNA的克隆方法是：利用中国明对虾的肝胰腺构建cDNA文库，根据其他物种同源序列设计兼并引物进行PCR扩增，对所得序列进行相似性比对，得到了泛素连接酶的cDNA的3’端序列，然后进行5’端快速扩增，获得全长序列。

可以利用本发明的中国明对虾泛素连接酶基因制备原核表达载体，转化大肠杆菌，表达具有抗病毒活性的重组蛋白。

利用本发明获得的重组的泛素连接酶蛋白可用于抗病毒的饲料添加剂、动植物基因转化和药物开发。

附图说明

图1为重组中国明对虾泛素连接酶纯化后的电泳图；

其中，泳道1，诱导前菌液总蛋白；泳道2，诱导后菌液总蛋白；泳道3，纯化的中国明对虾泛素连接酶蛋白；泳道M，蛋白分子量marker。

图2为重组蛋白FcUbc对病毒感染的对虾的成活率的影响示意图；

将重组蛋白FcUbc与病毒WSSV孵育，再注射对虾(图中的FcUbc+WSSV组)36小时后的死亡率30％左右。作为阳性对照组，①HaGK+WSSV组：表示另外1种重组蛋白与病毒WSSV孵育，然后注射对虾，36小时后100％死亡；②WSSV组：表示病毒不经任何处理，直接注射36小时后100％死亡。Tris-HCl组作为阴性对照：表示只给健康对虾注射Tris-盐酸缓冲液，对虾死亡率与FcUbc+WSSV组相当。

图3为重组的FcUbc对WSSV复制的影响；其中，(A)图为半定量PCR扩增WSSV的片段结果。(B)图为实时定量PCR进行病毒的绝对定量；

对虾分为四组处理，分别注射PBS(阴性对照)，WSSV(阳性对照)，BSA+WSSV，FcUbc+WSSV；分别在24h、48h和72h提取基因组，扩增WSSV片段。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：中国明对虾泛素连接酶cDNA的克隆

1)总RNA的提取：采用现有技术一步法提取总RNA。

2)cDNA第一链合成：4微升总RNA，加1微升SmartF(5’-TAC GGC TGC GAG AAGACG ACA GAA GGG-3’)和1微升Oligoanchor R(5’-GAC CAC GCG TAT CGA TGT CGACT16(A/C/G)-3’)，72℃反应5分钟，后加5倍Buffer 4微升，dNTP 1.25微升，RNA酶抑制剂0.625微升，1微升M-MLV逆转录酶，无RNase的灭菌水12.875微升42℃反应60分钟，70℃10分钟终止反应。

3)中国明对虾泛素连接酶cDNA 3’端快速扩增

根据其他物种中泛素连接酶的保守序列设计兼并引物F1，与通用后引物3’primerPCR扩增泛素连接酶3’端：

正向引物：F1 5’TTCCTTCCTTCTATGCTCACG 3’

反向引物：3’primer 5’GTCGACATCGATACGCGTGGTC 3’

PCR反应：链式聚合酶反应(PCR)试剂与条件：

首先将下列试剂混在一起：

·10x Taq DNA聚合酶缓冲液2.5微升(μl)

·模板cDNA                  1μl

·正向引物(10mM)            1μl

·反向引物(10mM)            1μl

·脱氧核苷酸混合物(dNTP)    2μl

·Taq DNA聚合酶             0.125μl

·灭菌水                    17.375μl

·总体积                    25μl

PCR反应条件为：首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环：94℃30秒，53℃45秒，72℃45秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。

4)反应产物纯化：利用申能博彩公司产品3S柱离心式琼脂糖DNA纯化试剂盒，操作步骤按产品说明书进行。

5)PCR产物连入克隆载体转化克隆菌株：取纯化产物3μl，连接于pBluescript载体(TaKaRa公司产品)。转化到大肠杆菌DH5α菌株，在含有氨苄青霉素(100微克/毫升)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal 0.2微克/毫升)和异丙基硫代半乳糖苷(IPTG 0.1摩尔/毫升)的平板生长过夜，挑取3个白斑，在LB液体培养基(3毫升，含100微克/毫升安苄青霉素)中培养过夜。

6)质粒纯化：收取过夜培养菌液2毫升，离心(6000转/分，3分钟)收集细胞。

7)序列测定与同源检索：取纯化质粒4微升，用载体引物T7进行全自动测序(本工作在上海生工公司完成)。将所得序列与基因库序列比较，与泛素连接酶的相似性很高。

8)中国明对虾泛素连接酶cDNA 5’端快速扩增

根据得到的泛素连接酶3’端基因片段，在其内部设计反向引物R1(5’-CCC TTG CTT CCCTTT CAT AAC-3’)。以肝胰腺cDNA为模板，以试剂盒提供的5’PCR(5’-TAC GGC TGC GAGAAG ACG ACA GAA-3’)引物和反向引物R1为引物进行PCR扩增，获得中国明对虾泛素连接酶cDNA的5’序列。

将3’和5’端序列拼接，即获得SEQ ID NO.1所示克氏原鳌虾甲壳肽cDNA基因全长核苷酸序列。

实施例2：原核重组表达载体构建、表达与纯化

(1)根据中国明对虾泛素连接酶的序列和表达载体pET30a(Novagen公司)的克隆位点，设计引物：

FcUbc ExF：5′TACTCA GAATTC ATGACGGCACTGCAGAGAATA 3′(EcoR I)

FcUbc ExR：5′TACTCA CTCGAG CGTGAGCATAGAAGGAAGGAA 3′(Xho I)

本发明选择了pET30a克隆位点的EcoR I和Xho I酶切位点，因此，设计引物时在上游引物引入了EcoR I酶切位点，下游引物上引入了Xho I酶切位点。

(2)基因扩增、克隆与重组质粒筛选

以肝胰腺cDNA为模板，用上述引物进行PCR反应，扩增条件为：94℃，2min预变性；94℃，30s，55℃，45s，72℃，45s，35个循环；72℃延伸10min。

1％的琼脂糖凝胶电泳PCR产物检测。将PCR产物作制备电泳，用申能博彩公司产品3S柱离心式琼脂糖DNA纯化试剂盒回收、纯化PCR产物，经过EcoR I和Xho I内切酶酶切，同样表达载体pET30a经过EcoR I和Xho I内切酶酶切，暴露出多克隆位点两端的Xho I和EcoR I内切酶位点。然后，将酶切后的扩增产物与表达载体用T4 DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，LB+Kana平板PCR筛选阳性克隆。挑取PCR筛到的菌落，37℃振荡扩增培养并抽提质粒，EcoR I和Xho I双酶切与测序验证后，即为重组表达质粒pET30a-FcUbc。接转化E.coli表达菌株BL21 DE3感受态细胞，涂布LB+Kana平板，37℃倒置过夜培养。

(3)筛选表达菌株

从上述LB+Kana平板上挑取5个单克隆菌落，3ml LB+Kana液体培养基37℃振荡过夜培养，次日，取30μl过夜培养液加入到3ml LB+Kana液体培养基中转培养，37℃振荡培养3h，至OD₆₀₀在0.5～0.7之间，然后加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续37℃振荡培养诱导表达4h。诱导前，从不同样品中取出0.5ml菌液，电泳检测时以未诱导菌株为对照。

表达完后，各取0.5ml菌液，6000r/min离心5min收集细胞，包括未诱导菌株的样品，重悬于100μl去离子水中，以此为电泳样品作12.5％的SDS-PGAE。根据电泳结果是否存在诱导表达的重组泛素连接酶的条带，鉴定重组表达菌株。选取表达量高的菌株进行下面的大规模表达和纯化。

(5)重组泛素连接酶表达与纯化

挑取表达菌株单克隆在LB+Kana液体培养基中37℃过夜振荡培养，次日，按照体积比1∶100加入到200ml LB+Kana培养基中转培养，37℃振荡培养3h后，再加入IPTG至终浓度为1mmol，再37℃振荡诱导培养4h。诱导前取出0.5ml的菌液，作为诱导前对照样品。诱导培养完后，菌液在合适的离心管中7000r/min离心10min收集细胞，细胞重悬于20ml预冷的1×PBS，加入200μl 20％的Triton X-100，充分混匀后冰浴中进行超声波破碎细胞，超声循环为：超声3秒(s)；间隔3s；全程15min。重复4次，每次间隙时将菌液在冰浴中混匀，避免局部温度太高，使蛋白质变性。最后，将破碎后的菌液10000r/min离心15min，收集上清液和沉淀，上清液和沉淀分别留样、备用。

重组蛋白以包涵体的形式存在，以常规方法经过包涵体变性、复性和常规的组氨酸标签亲和层析，即获得到了重组蛋白——泛素连接酶，SDS蛋白电泳(SDS-PAGE)结果如图1所示，该重组蛋白的分子量与根据序列预测的分子量大小一致。

实施例3：中国明对虾泛素连接酶重组蛋白具有抗病毒的功能

(1)半定量PCR对FcUbc的抗病毒效果进行定性分析

将日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)分为四组，分别于腹节和尾节之间的薄膜处注射Tris-HCl、WSSV、HaGK+WSSV和FcUbc+WSSV。其中FcUbc浓度为20μg/mL，WSSV浓度为3.2*10⁵/ml，每只虾注射总体积100μL。或者利用重组蛋白浸泡对虾(20mg/L)，统计对虾的死亡率(如图2所示)，并然后利用下列方法检测病毒在对虾体内的复制。

在24h、48h和72h，使用东洋纺的基因组DNA纯化试剂盒(TOYOBO，Genomic DNAPurification Kit)提取对虾鳃组织的基因组，利用此基因组为模板，首先用肌动蛋白(actin)进行定量。然后扩增WSSV的片段。结论：如图3(A)所示，在24h和48h，FcUbc+WSSV一组几乎检测不到WSSV片段；与阳性对照相比在72h，FcUbc+WSSV一组扩增的WSSV非常弱，说明了FcUbc重组蛋白具有明显的抑制WSSV复制的作用。

(2)实时定量PCR对WSSV拷贝数进行定量分析

用同样方法取得鳃组织基因组后，稀释10倍作为实时定量PCR的模板，根据本实验室已有的WSSV拷贝数绝对定量的标准曲线，对每一个样本基因组中病毒拷贝数进行绝对定量，做出柱状图分析。结论：如图3(B)所示，与前面半定量PCR相符合，FcUbc+WSSV一组在72h(即WSSV度过潜伏期开始在细胞内大量增殖时)WSSV的拷贝数显著低于两组阳性对照，说明了重组的泛素连接酶有显著的抑制病毒增殖的作用。

通过以上两种检测方式，说明中国明对虾泛素连接酶重组蛋白确实是通过抑制病毒的复制而达到降低对虾死亡率的作用。

Claims (4)

1.一种中国明对虾泛素连接酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中所示信息为：

序列描述：SEQ ID NO.1

atgacggcac tgcagagaat aaccaaggag atgcaggacc tggccgacga cccgctgggc  60

cagttctcgg tgggccccgt gggaaccgac ctcttccact gccaggcgac cgtcatgggg 120

ccccgtggct cgccctacga aggcggcctc ttcgacctca gcgtcgattt ccccaaatca 180

taccctttcc agcccccgca gattaaattt aaaactccaa tctaccacat gaacgtcggc 240

ccatacggag atatctgcct tgacatactg gataaaaact ggtcccccgc tctctctatc 300

tctaaagttc tgctggtgat ctgcgttctc atgacggacc caaatcctga cgacccgtta 360

agattcaacc tccgagacga atataagaag gacgtctcgg tctacgagaa caatgcacgc 420

cagtggacac gccagcatgc tatgtgattc cttccttcta tgctcacggg cttgtcaact 480

tgctgctcgc atgaatgtca gtatatgctc acgtggatga tgaaattata tcgaagtgaa 540

ccgtaataca gatacgatgg aaacatcatt attcctaaac atacacatca tgcttaaaac 600

aagtatgctc atatgtaaac cattatatac tcacactcat atgaggaaag gtgcttaagt 660

tgttaatttg tatatgttgg catttgttat gaaagggaag caagggtcgt tgaattgttg 720

atcttctgtt tttcttttct tcaattgaat taaaatacaa acgttaaaaa aaaaaaaaaa 780

aaaa                                                              784。

2.权利要求1所述的中国明对虾泛素连接酶基因编码的泛素连接酶多肽，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示，其中所示信息为：

序列描述：SEQ ID NO.2

Met Thr Ala Leu Gln Arg Ile Thr Lys Glu Met Gln Asp Leu Ala Asp Asp Pro Leu Gly

                 5                   10                  15                 20

Gln Phe Ser Val Gly Pro Val Gly Thr Asp Leu Phe His Cys Gln Ala Thr Val Met Gly

                25                  30                  35                   40

Pro Arg Gly Ser Pro Tyr Glu Gly Gly Leu Phe Asp Leu Ser Val Asp Phe Pro Lys Ser

                 45                 50                  55                   60

Tyr Pro Phe Gln Pro Pro Gln Ile Lys Phe Lys Thr Pro Ile Tyr His Met Asn Val Gly

                65                  70                  75                  80

Pro Tyr Gly Asp Ile Cys Leu Asp Ile Leu Asp Lys Asn Trp Ser Pro Ala Leu Ser Ile

                85                  90                  95                  100

Ser Lys Val Leu Leu Val Ile Cys Val Leu Met Thr Asp Pro Asn Pro Asp Asp Pro Leu

                105             110                     115                 120

Arg Phe Asn Leu Arg Asp Glu Tyr Lys Lys Asp Val Ser Val Tyr Glu Asn Asn Ala Arg

                125             130                     135                 140

Gln Trp Thr Arg Gln Hi s Ala Met

                145          148。

3.权利要求1所述的中国明对虾泛素连接酶基因在制备具有抗WSSV病毒活性的重组蛋白中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：其方法是：通过基因重组技术使中国明对虾泛素连接酶基因在大肠杆菌中表达，获得具有抗WSSV病毒活性的重组蛋白。

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