KR20080061582A

KR20080061582A - 흰반점 바이러스 항원 유전자의 재조합 단백질 생성 및발현방법과 이를 이용한 면역증강 사료첨가제

Info

Publication number: KR20080061582A
Application number: KR1020060136480A
Authority: KR
Inventors: 김성구; 하유미; 백남수
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2006-12-28
Filing date: 2006-12-28
Publication date: 2008-07-03

Abstract

본 발명은 새우 병원성 바이러스인 흰반점증후군바이러스(White Spot Syndrome Virus, WSSV)의 항원성 단백질에 대한 양식 새우의 면역 기능 및 재조합 항원 단백질의 고발현 시스템 구축을 통한 흰반점바이러스 제어용 사료와 유사백신 개발을 통한 양식새우의 흰반점바이러스에 대한 내성을 증가시켜 바이러스 발병으로 인한 폐사를 저하시키고 생존율을 증대시키는 사료첨가제를 제공하고자 하는 것이다.

흰반점바이러스, 면역증강, 사료첨가제

Description

흰반점 바이러스 항원 유전자의 재조합 단백질 생성 및 발현방법과 이를 이용한 면역증강 사료첨가제 {Development of immunostimulant feed-supplements using WSSV antigens}

도 1은 본 발명의 흰반점 바이러스의 적정농도를 결정하기 위한 도이다.

도 2의 (a)는 정제된 재조합 단백질 VP19의 SDS-PAGE 결과도이고

(b)는 (a)의 웨스턴 블럿 결과이며,

(c)는 흰반점 바이러스 항원 유전자인 VP19의 정제된 재조합 단백질의 항체를 토끼로부터 얻은 뒤 흰반점 바이러스와 항체와의 중화반응결과도를 나타낸다.

도 3은 본 발명의 흰반점 바이러스 항원 유전자 VP19 및 VP466의 재조합 단백질을 대하에 주사한 뒤 1주일 뒤 공격 실험을 한 것으로 새우가 흰반점 바이러스에 대한 면역효과를 도식화 한 것이다.

도 4는 본 발명의 흰반점 바이러스 항원 유전자 VP19 및 VP466의 재조합 단백질을 상업용 새우 사료 및 FCA와 섞어 재조합 사료로서 섭이 시킨 뒤 흰반점 바이러스에 대한 면역효과를 도시화 한 것이다.

현재까가지의 흰반점바이러스는 봉입체의 난형 바이러스이며 이중나선의 DNA를 가지고 있으며, 그 길이는 약 275nm이고 직경은 약 120nm 로 게, 새우, 가재와 같은 갑각류에 발병을 일으킨다. 주요 감염부위는 아가미, 림프기관, 표피층으로 감염증상으로는 움직임이 둔해지며 특징으로 표피에 흰반점 무늬가 나타난다. 1990년대 초반 아시아에서 최초로 발생한 이래 현재는 전 세계의 새우 양식장에서 발견되고 있으며, 양식장에서 발병시 7-10일 이내에 치사율이 90-100%에 이르러, 새우 양식 산업에 막대한 피해를 입히는 등의 문제점이 발생되고 있다.

상기의 흰반점바이러스에 대한 전체 유전자 서열이 2001년에 보고되었으며, 현재 국외는 물론 국내에서도 흰반점바이러스에 대한 specific primer를 이용한 흰반점바이러스 진단기술이 개발 이용되고 있다 (Yang F, He J, Lin X, Li Q, Pan D, Zhang D, Xu X (2001) Complete genome sequence of the shrimp white spot bacilliform virus. Journal of Virology, 75: 11811-11820.). 또한 흰반점증후군바이러스(White Spot Syndrome Virus, WSSV)에 감염되지 않은 새우종묘만을 모아 따로 양식을 하는 등의 방법이 현재 사용되고 있다. 하지만 이런 방법들은 근본적인 해결책이 될 수 없고, 또한 흰반점증후군바이러스에 대한 확실한 제어 기술은 아직 개발되어 있지 않은 실정이므로 앞으로의 연구가 더욱 필요하다.

국내외에 이용중인 흰반점증후군바이러스 제어기술의 취약성을 아래와 같이 설명하면,

먼저, 흰반점바이러스(WSSV)에 대한 신속진단 기술 개발은 상기에서 언급한 대로 흰반점바이러스에 대한 전체 염기서열이 보고되어 이를 토대로 specific primer를 이용한 흰반점바이러스 진단 기술이 널리 활용되고 있으나 흰반점바이러스의 질병진행 속도가 매우 빠르기 때문에 일단 발병 후의 진단은 피해 예방에 큰 역할을 하지 못하고 있는 실정이다.

WSSV-free 종묘생산기술은 PCR을 이용해 흰반점바이러스에 감염되지 않은 모하만을 이용해 종묘를 생산하여 양식하는 기술로서 국내와 국외에서 사용되고 있는 방법이다. 그러나 이러한 SPF 종묘는 새우 양식 시설이 흰반점바이러스 유입을 차단할 수 있는 순환여과방법을 이용해야만 하기 때문에 시설비용이 많이 들며, 현재 국내외에서 새우양식을 하는데 사용하고 있는 노지양식시설에서는 양식장 주변 및 생사료에 흰반점바이러스를 전파시킬 수 있는 reservoir host들이 많기 때문에 실질적인 흰반점바이러스 예방효과를 기대하기가 힘든 단점이 있다(Sahul Hameed AS, Balasubramanian G, Syed Musthaq S, Yoganandhan K (2003) Experimental infection of twenty species of Indian marine crabs with white spot syndrome virus (WSSV). Diseases of Aquatic Organisms, 57: 157-161.).

또한, 새우류는 척추동물과 달리 특이적 면역(specific immunity)이 없는 대신 비특이적 면역(non-specific immunity)이 잘 발달되어 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 비특이적 면역반응을 자극하여 흰반점바이러스에 대한 저항성을 높일 수 있는 면역증강제에 대한 연구가 β-glucan, lipopolysaccharide(LPS), 한약재등 다양한 물질을 대상으로 국내 및 국외에서 많이 진행되고 있으나, 아직까지 흰반점바이러스를 효과적으로 제어할 수 있는 면역증강제는 개발되어 있지 못한 실정이다(Roux MM, Pain A, Klimpel KR, Dhar AK (2002) The lipopolysaccharide and ß-1,3-glucan binding protein gene is upregulated in white spot virus-infected shrimp (Penaeus stylirostris). Journal of Virology, 76: 7140-7149.).

무척추동물인 새우류에서는 후천성면역반응(adaptive immune response)이 결여된 것으로 알려져 왔으나, 1980년대 말부터 백신 투여에 의해 양식 새우의 비브리오시스(vibriosis)를 예방하였다는 연구결과들이 보고되고 있다(Itami T. Takahashi Y. Nakamura Y (1989) Efficacy of vaccination against vibriosis in cultured kuruma prawns Penaeus japonicus . Journal of Aquatic Animal Health, 1: 234-242.; Teunissen OSP, Faber R, Booms GHR, Latscha T, Boon JH (1998) Influence of vaccination on vibriosis resistance of the giant black tiger shrimp Penaeus monodon (Fabricius). Aquaculture, 164: 359-366.; Alabi AO, Jones DA, Latchford JW (1999) The efficacy of immersion as opposed to oral vaccination of Penaeus indicus larvae against Vibrio harveyi . Aquaculture, 178: 1-11.).

새우 흰반점바이러스의 경우에 있어서도 흰반점바이러스에 감염된 새우 중 살아남은 새우를 재감염 시켰을 때 새우 생존력이 증대되었고, 살아남은 새우의 혈장이 감염 후 2일부터 20일까지 바이러스를 중화시켰다는 결과가 보고되었다(Flegel TW, Pasharawipas T (1998) Active viral accomodation: a new concept for crustacean response to viral pathogens. In: Flegel TW (ed) Advances in shrimp biotechnology. National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, Bangkok, p 245-250.). 이러한 결과는 새우에 있어서도 척추동물과는 종류가 다르지만 특이적 항원(specific pathogen)을 인식하여 기억할 수 있는 후천성면역반응(adaptive immune response)이 존재함을 시사하며, 이는 새우류에 있어서도 백신의 개발이 가능함을 의미한다. (Venegas1 CA, Nonaka1 L, Mushiake K, Nishizawa1 T, Muroga K (2000) Quasi-immune response of Penaeus japonicus to penaeid rod-shaped DNA virus (PRDV). Diseases of Aquatic Organisms, 42: 83-89.; Witteveldt J, Vlak JM, van Hulten MCW (2003) Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus using a WSSV subunit vaccine. Fish & Shellfish Immunology, 16: 571-579.; Witteveldt J, Cifuentes CC, Vlak JM, van Hulten MCW (2004) Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus by oral vaccination. Journal of Virology, 78: 2057-2061.).

따라서 향후 양식 새우 흰반점바이러스에 대한 제어대책은 효과적인 방어력을 유도하면서 실용적으로 새우 양식장에서 사용할 수 있는 유사백신 기술의 개발에 초점이 맞추어질 것으로 여겨지며, 흰반점바이러스에 대한 효과적인 백신기술에 대한 원천기술의 확보가 국제적으로 경쟁력을 갖출 수 있는 주 분야가 될 것으로 전망된다.

상기와 같은 문제점들을 해결하기 위하여, 본 발명은 새우 병원성 바이러스인 흰반점바이러스의 항원성 단백질에 대한 양식 새우의 면역 효과를 확인 후 재조합 항원 단백질의 고발현 시스템 구축을 통한 흰반점바이러스 제어용 사료 및 유사백신 개발을 통해 양식새우의 흰반점바이러스에 대한 내성을 증가시켜 바이러스 발병으로 인한 폐사를 저하시키고 생존율을 증대시키는 사료첨가제를 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 흰반점바이러스의 항원 유전자를 이용한 흰반점바이러스에 대한 면역증강 효과를 갖는 갑각류의 사료첨가제를 제공하는 것으로. 여기서 갑각류는 해수 및 담수를 포함하는 새우, 가재, 게 등을 의미한다.

유전자 재조합에 의한 융합 단백질 제조에 있어서, 바큘로바이러스 발현벡터계(Baculovirus expression vector system: BEVS)는 가장 강력한 진핵발현계 중의 하나로 다양한 응용이 가능한 유용한 발현계이다. 동물, 식물, 곰팡이, 세균, 바이러스 등 매우 다양한 이종 유전자의 발현에 이용되고 있다. 유전자의 발현을 위한 벡터계인 바큘로바이러스는 사람이나 척추동물에는 병원성이 없으며 오로지 곤충에만 병원성을 가지고 있는 곤충 병원성 바이러스이다. E. coli와 같은 원핵세포계를 이용할 경우 발현된 단밸질이 원래의 단백질과 다른 특성을 지니는 경우가 종종 있으나, 바큘로바이러스 발현벡터계(BEVS)는 진핵세포계를 이용함으로써 발현된 단백질이 원래의 단백질과 거의 비슷한 특성을 지니고 있으며, 또한 같은 진핵세포인 동물 세포를 이용한 다른 발현벡터계에 비해 그 생산성이나 속도면에서 월등히 우수하다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하면 다음과 같다.

[ 실시예 1] 흰반점바이러스의 구조 유전자 VP19 및 VP466 의 클로닝

흰반점바이러스(WSSV)의 VP19와 VP466 유전자의 클로닝에 사용되는 프라이머는 NCBI BLAST에 등록되어있는 VP19와 VP466 유전자의 염기서열을 참고하여 제작하였다.

프라이머의 말단에 EcoR I 과 Sal I의 제한효소 인식 부위를 포함시켰다.

[표1]

유전자부위	프라이머	염기서열 (5' 에서 3' 방향)	제한효소	크기
VP19	정방향	GAATTCATGGCCACCACGACTAACACT	EcoR I	365 bp
VP19	역방향	GTCGACCTTACTGCCTCCTCTTGGGGTA	Sal I	365 bp
VP466	정방향	GGATCCATGTCTGCATCTTTAATATTGGAC	BamHI	1381 bp
VP466	역방향	AAGCTTGTTATGACACAAACCTATTCCACAA	HindIII	1381 bp

흰반점바이러스에 감염된 보리새우의 근육조직을 분리하여 흰반점바이러스만을 정제하였다. 흰반점바이러스 DNA와 2.5mM dNTP, 5μM 씩 VP19 및 VP466 정방향 및 역방향 프라이머, 5units/㎕ Taq 혼합물 50㎕를 PCR을 수행하였다. 중합효소연쇄반응 (PCR: Poymerase Chain Reaction) 조건은 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 3분을 1회 주기로 하여 30주기를 수행하였고, PCR 생성물을 1% 아가로즈 전기영동 하에서 확인하였다.

pGEM-T easy vector(Promega)에 서브클로닝한 후, EcoR I 과 Sal I 제한효소를 처리하여 다시 pFastBac vector(Invitrogen)에 클로닝하였다. 재조합 플라스미드를 DH10Bac E. coli에 형질전환 시킨 뒤 최종적으로 곤충세포인 Sf21 cell에 트랜스펙션 하였고 트랜스펙션 시킨 곤충세포는 250ml 플라스크에서 80 rpm으로 부유 배양하였으며, 곤충세포배양에는 SFM-900 II(Gibco) 무혈청 배지를 사용하였다. 생성된 재조합 baculovirus를 MOI(Multiplicity of infection)조건 0.5에서 20까지 농도를 달리하여 1×10⁶ cells/ml의 Sf21 cell에 감염시켰고, 그 결과 rVP19는 MOI가 3일때, rVP466은 MOI가 5일때 재조합 단백질의 발현율이 높았다. 발현된 VP19와 VP466의 5일간 배양된 곤충세포(Sf21 cell)를 8,000rpm에서 10분간, 4 ℃에서 원심분리 시켜 곤충세포배양액인 SFM-900 II (Gibco) 무혈청 배지를 제거하여 cell만을 취득하였으며, 취득된 cell에 히스티딘 친화성 컬럼정제시 사용한 Binding Buffer(20mM Sodium phosphate, 0.5M NaCl, 30mM Imidazole, pH7.4)를 취한 후, 초음파파쇄기를 이용하여 cell을 깨고, 다시 원심분리(12,000rpm, 20분, 4℃)한 후, 그 상등액인 발현된 재조합 단백질을 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해 확인한 결과 VP19는 20kDa을 VP466은 50kDa의 분자량을 가지는 것을 확인하였다.

[ 실시예 2] 재조합 단백질의 정제 및 폴리클론 항체 제작

80rpm의 회전속도하에 MOI 3에서 5일 배양시킨 재조합 단백질 VP19(rVP19)를 히스티딘 친화성 컬럼 (his-tag affinity column)을 이용하여 정제하였으며 정제된 재조합 단백질 150㎍을 동량의 보조제(Freund's Complete Adjuvant; FCA)와 섞은 다음 2.5-3kg의 토끼에 근육 주사하였다. 2주 뒤 500㎍의 재조합 단백질 VP19를 불완전 보조제(Freund's Incolplete Adjuvant; FIA)와 동량으로 유화시킨 후, 추가 항원을 2주 간격으로 두 번 주입하였다. 그 후로 2주 뒤 전혈을 채취하였고 실온에서 1시간, 4℃에서 16시간 보관 후 5000 × rpm 10분 원심분리 후 상등액을 -80℃ 에 보관하였다.

[ 실시예 3] 웨스턴 블럿

상기 [실시예 2]에서 rVP19를 SDS-PAGE를 수행한 다음 분리된 단백질을 니트로셀룰로즈 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 옮기고 [실시예 2]에서 분리한 VP19 단백질의 항혈청을 500배 희석하여 제1차 항체, 알카린 포스페이트가 결합된 염소 항-토끼 혈청(IgG, Santa Cruz Biotechnology, USA)을 2000배 희석하여 제2차 항체로 사용하여 웨스턴 블럿을 실시하였다. 그 결과 약 20kD의 단백질이 확인되었다.

[ 실시예 4] 흰반점바이러스의 적정농도

본 실험에 앞서 실험에 사용할 흰반점바이러스의 농도를 결정하기 위해 그룹당 10마리씩의 새우를 준비한 뒤 정제한 흰반점바이러스를 1×10²부터 1×10⁶까지 PBS(140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 1.8mM KH₂PO₄, pH 7.3)에 희석한 후, 30-gauge 주사기로 각각 주사한 후 그 폐사율을 관찰하였다.

그 결과 1×10²과 1×10³ 그룹은 주사하고 4일 이내로 폐사율이 100%를 나타냈으며 1×10⁴은 주사한지 8일째 100%의 폐사율을 보였고 1×10⁵과 1×10⁶ 그룹은 주사하고 10일 이내에 한 마리도 죽지 않았다. 따라서 본 실험에서는 면역효과를 검증하기 위해 1×10⁴희석한 농도를 최적의 흰반점바이러스 농도로 정하고 이후 실험에 사용하였다. ([도 1] 참조)

[ 실시예 5] 중화반응

재조합 단백질의 실제 면역효과를 검증하기 위하여 체장 9-11cm 대하(Penaeus chinensis)를 대상으로 in vivo 실험을 수행하였다. [표 2]에서와 같이 15마리씩 6개의 그룹으로 나누어 흰반점바이러스와 rVP19 및 토끼항체를 섞어 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 바이러스와 항체 및 PBS 혼합액 50㎕를 새우의 두 번째 마디에 30-gauge 주사기로 주사하였다. 주사 후, 누적 폐사율을 조사하여 그 결과를 [도 2]에 나타내었다.

[도 2]로부터 rVP19를 항원으로 사용하여 토끼로부터 얻은 항체를 사용한 경우 그 항체의 농도가 높을수록 흰반점바이러스에 대한 중화율이 높게 나타났다.

[표 2]

그룹	주사액 조성 (50 ㎕ / 새우)	마리수
VP19 I	10 ㎕ WSSV + 10 ㎕ rVP19 항체 + 30 ㎕ PBS	15 × 3
VP19 II	10 ㎕ WSSV + 5 ㎕ rVP19 항체 + 35 ㎕ PBS	15 × 3
VP19 III	10 ㎕ WSSV + 1 ㎕ rVP19 항체 + 39 ㎕ PBS	15 × 3
면역전 항체 대조구	10 ㎕ WSSV + 10 ㎕ 면역전 항체 + 30 ㎕ PBS	15 × 3
양성 대조구	10 ㎕ WSSV + 40 ㎕ PBS	15 × 3
음성 대조구	50 ㎕ PBS	15 × 2

[ 실시예 6] 백신주사를 통한 면역효과 검증

일주일 동안 순치시킨 새우를 그룹당 15마리씩 나누어 rVP19와 rVP466에 대한 백신주사 실험을 수행하였다[표 3]. 주사용 시료는 다음과 같이 제조되었다. 1×10⁶ cells/ml 의 Sf21에 재조합 baculovirus를 감염 시킨 후 재조합 단백질 rVP19와 rVP466을 발현 시켰고 cell을 8,000 × rpm, 20분, 4℃에서 원심분리하여 펠렛을 취한 후, 다시 현탁하여 초음파 파쇄를 하였다. 다시 12,000 × rpm, 20분, 4℃에서 원심분리하여 상등액을 취했고 새우에 주사하기 전 0.45㎛ 필터를 하였다. 브래드포드 분석법을 통하여 cell 현탁액을 50㎍/ml로 정했으며 50㎕의 현탁액을 새우의 두 번째 마디에 주사하였다. 일주일 뒤 1×10⁴ 희석한 흰반점바이러스 10㎕를 PBS 40㎕와 섞어 공격실험에 수행한 후 그 폐사율을 측정하였다. 그 결과를 [도 3]에 나타냈다.

[표 3]

그룹	주사액 조성	공격실험 조성	마리수
VP19	50 ㎕ rVP19 protein	10 ㎕ WSSV + 40 ㎕ PBS	15 × 3
VP466	50 ㎕ rVP466 protein	10 ㎕ WSSV + 40 ㎕ PBS	15 × 3
양성 대조구	50 ㎕ PBS	10 ㎕ WSSV + 40 ㎕ PBS	15 × 3
음성 대조구	50 ㎕ PBS	50 ㎕ PBS	15 × 3

[ 실시예 7] 사료첨가제를 통한 면역효과 검증

상업용 새우 사료 25g에 상기 [실시예 6]의 재조합 단백질 현탁액(5×10⁶ cells)과 수중의 퍼짐을 막기 위해 동량의 Freund's Complete Adjuvant(FCA)를 4℃에서 섞은 뒤 실온에서 건조시켰다. 그룹당 15마리의 새우를 준비하여 재조합사료로서의 백신실험을 수행하였다[표4]. 재조합사료를 하루에 두 번씩 새우 체중의 5%로 10일 동안 섭이 시켰으며 양성 대조군과 음성 대조군은 일반 사료를 섭이시켰다. 10일 뒤 1×10⁴ 희석한 흰반점바이러스 10㎕를 PBS 40㎕와 섞어 공격실험에 수행한 후 그 폐사율을 측정하였다. 그 결과를 [도 4]에 나타냈다.

[표 4]

그룹	사료조성	공격실험 조성	마리수
VP19	새우사료 + rVP19 단백질 + FCA	10 ㎕ WSSV + 40 ㎕ PBS	15 × 3
VP466	새우사료 + rVP466 단백질 + FCA	10 ㎕ WSSV + 40 ㎕ PBS	15 × 3
양성 대조구	새우사료	10 ㎕ WSSV + 40 ㎕ PBS	15 × 3
음성 대조구	새우사료	50 ㎕ PBS	15 × 3
FCA 대조구	새우사료 + FCA	10 ㎕ WSSV + 40 ㎕ PBS	15 × 3

이상에서와 같이 본 발명은 비록 상기의 실시예에 한하여 설명하였지만 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 분자생물학적 연구를 기본으로 한 새우감염성 흰반점바이러스를 제어하기 위한 사료 첨가제개발로 흰반점바이러스 병원체에 대한 면역증강 효과를 통해 새우를 포함한 갑각류의 흰반점바이러스의 감염을 효과적으로 예방 할 수 있으며, 생물공학적 기법을 이용한 대량 배양시스템을 통한 흰반점바이러스 제어용사료의 대량 생산 및 유전공학적 기법을 이용한 흰반점바이러스 제어용 단백질 유사백신 개발과 이를 이용한 면역학적 기법을 이용한 흰반점바이러스에 대한 유사면역 메카니즘 규명 등으로 흰반점바이러스에 대한 고효율의 단백질 유사백신 개발, 제어용 사료의 대량 생산 및 효과적인 투여방법 결정하고 field test를 통해 이를 이용한 실제 양어장 환경에의 적용 가능한 효과가 기대된다.

WSSV에 대한 완전한 제어기술 개발과 산업화 도달을 의미하는 것이며, 현재 국내외적으로 양식 산업에서 발생하는 연간 천문학적인 경제적 손실을 방지하는데 크게 기여와, 양식 어민 개인의 경제적 손실뿐만 아니라 우리나라 양식 산업에 대해 막대한 경제적 손실을 유발해 온 바이러스성 질병에 의한 양식 새우의 대량 폐사를 방지함으로써 국가 경제에 기여할 수 있는 효과를 가지는 것이다.

Claims

흰반점바이러스의 구조 유전자인 VP19와 VP466을 바큘로바이러스 발현벡터계(Baculovirus expression vector system: BEVS) 시스템을 이용하여 클로닝한 후, 곤충세포배양액인 SFM-900 II (Gibco) 무혈청 배지에 넣어, 80rpm의 속도로 현탁배양 시켜, 곤충세포(Sf21 cell)를 1×10⁶ cells/ml의 농도가 될때 재조합 baculovirus를 감염시켰으며, 재조합 baculovirus VP19는 MOI(Multiplicity of infection)조건이 3 일때, 5일간 배양하였으며, 재조합 baculovirus VP466은 MOI(Multiplicity of infection)조건이 5 일때, 5일간 배양하여 재조합 단백질을 발현시키고, 발현된 재조합 단백질 VP19와 재조합 단백질 VP466이 5일간 배양된 곤충세포(Sf21 cell)를 8,000rpm에서 10분간, 4 ℃에서 원심분리시켜, 곤충세포배양액인 SFM-900 II (Gibco) 무혈청 배지를 제거하여 cell만을 취득하였으며,

상기 취득된 cell에 히스티딘 친화성 컬럼정제시 사용한 Binding Buffer(20mM Sodium phosphate, 0.5M NaCl, 30mM Imidazole, pH7.4)를 취한 후, 초음파파쇄기를 이용하여 cell을 깨고, 다시 원심분리(12,000rpm, 20분, 4℃)한 후, 그 상등액을 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해 발현되는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 생성 및 발현방법.
제 1항에 있어서,

재조합 단백질 VP19(rVP19)를 히스티딘 친화성 컬럼 (his-tag affinity column)을 이용하여 정제하였으며, 정제된 재조합 단백질 150㎍을 동량의 보조제(Freund's Complete Adjuvant; FCA)와 섞은 다음 2.5-3kg의 토끼에 근육 주사하였고, 2주 후, 500㎍의 재조합 단백질 VP19를 불완전 보조제(Freund's Incolplete Adjuvant; FIA)와 동량으로 유화시킨 후, 추가 항원을 2주 간격으로 두 번 주입하였으며, 그 후로 2주 뒤 전혈을 채취하여 실온에서 1시간, 4℃에서 16시간 보관 후, 5000rpm에서 10분 원심분리하여 상등액을 -80℃ 에 보관하여 사용하는 것을 특징으로 하는 흰반점바이러스 항원단백질 항체생성 방법.
제 1항에 의하여, 발현된 재조합 단백질의 VP19는 20 kDa의 분자량, VP466은 50 kDa의 분자량인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
제 1항에 의하여 발현된 재조합 단백질 VP19와 VP466를 이용하여 사료첨가제를 제조하는 것으로,

새우 사료 25g에 재조합 단백질 VP19와 VP466 각각의 현탁액(5×10⁶ cells) 과 동량의 보조제(Freund's Complete Adjuvant; FCA)를 4℃에서 섞은 후, 실온에서 12시간 건조시켜 재조합 사료를 제조함을 특징으로 하는 흰반점 바이러스(WSSV) 항원 유전자를 이용한 면역증강 사료첨가제의 제조 방법
제 4항에 있어서, VP19와 VP466를 이용하여 제조된 사료첨가제는, 흰반점바이러스 병원체에 대한 면역증강 효능과 새우를 포함하는 갑각류의 면역증강에 효능을 가진 것을 특징으로 하는 흰반점 바이러스(WSSV) 항원 유전자를 이용한 면역증강 사료 첨가제.